Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез ДНК на эндогенных и экзогенных матрицах в системе изолированных митохондрий кукурузы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Синтез ДНК на эндогенных и экзогенных матрицах в системе изолированных митохондрий кукурузы"

'6 Ом РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

П ЛОГ 1993 ОРДЕНА ЛЕНИНА

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ СИБИРСКИМ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИИ

На правах рукописи УДК 581.17:577.113

Подсосснный Владимир Александрович

СИНТЕЗ ДНК НА ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ МАТРИЦАХ В СИСТЕМЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ МИТОХОНДРИЙ КУКУРУЗЫ

03.00.12 - Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертацк- на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск. 1993

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии растений Сибирского : чститута физиологии- и биохимии растений Сибирского отделения РАН, Иркутск

Научный руководитель: кандидат биологических нзук,

старший научный сотрудник, Константинов Юрий Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

B.К.Войников,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник,

C.Я.Слободянюк

Ведущее учреждение: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита диссертации состоится "/х/" 1993 г. в

/Очас, на заседании специализированного совета по защитам кандидатских диссертаций при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растер'й СО РАН.

Автореферат разослан " 7 "_£

" </" 1993 г.

Ученый секретарь иализированного сс кандидат биологических наук г.П.Акимова

специализированного совета, /? /

оль.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Выяснение принципов структурной и функциональной организации штохондриального генома, выступающего как часть единой генетической системы клетки, является одной из важных задач современной биологии растений. Дополнительные генетические системы, представленные митохондриями и хлоропласта;,®, контролируют ватте признаки растения - эффективность дыхания и фотосинтеза, устойчивость к ряду заболеваний и гербицидам, к стрессовым физиологическим факторам (Douce, 1985). Признак цитоплззмэтической мужской стерильности (ЦМС), обнаруженный у большого тесла высших растений, наряду с ядерной зависимостью, находится также и под митохондриальнш контролем (Levlngs, 1983; Levings, Dewey, 1988).

Митсхондризльний геном растений представляет собой сложное структурное образование, состоящее из основной хромосомы в виде субгенсмных кольцевых молекул ДНК и видоспецифичного набора плазмидоподобяых ДНК (ппДНК). Имеются основания полагать, что ппДНК обладают свойствами автономного репликона (Smith et al., 1987). •

Вместе с тем, до настоящего Бремени многие физико-химические свойства и генетические функции митохондриальной хромосомы и ппДНК остаются невыясненными. Неизвестны способы репликации митохондриальных ДНК (мтДНК) высших растений, имеется очень мало сведений о биосинтезе мтДНК in organella (Brown, Kemble, 1989). Остаются неизученными вопрос, транспорта генетического материала в митохондриях растений-.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение матричных функций нуклеиновых кислот в системе изолированных митохондрий кукурузы (Zea туз L.).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Изучить условия синтеза ДНК in organella в изолированных митохондриях кукурузы.

- А -

2. Определить матричную активность в отношении биосинтеза ДНК отдельных репликонов, входящих в состав митохондриального генома кукурузы (высокомолекулярной и плазмидоподобных ДНК).

3. Выяснить генотипические особенности биосинтеза мтДНК у разных линий и гибридов кукурузы.

4. Исследовать полиморфизм плазмидоподобных ДНК в митохондриях различных генотипов кукурузы (гибрида и линии с разными типами 1ДОС).

5. Выяснить возможность транслокации и матричной активности чужеродного полинуклеотидного материала в системе изолированных митохондрий кукурузы.

Научная новизна. В работе установлены оптимальные условия получения и функционирования системы матричного биосинтеза ДНК в изолированных митохондриях кукурузы (Zea maya L.). Обнаружено, что матричной активностью в отношении синтеза ДНК 1п orgcmello обладают все размерные классы митохондриальных ДНК. Наибольшую решшкативную активность проявляет кольцевая ппДНК размером 1,9 т.п.н. На примере гибридов Краснодарский ЗОЗАТВ и Беккв ЛЛО показано, что спектры пдЦНК варьируют в процессе развития этиолированного проростка. Впервые установлена возможность транслокации с последующим использованием в качестве матриц для синтеза ДНК чужеродного генетического материала в изолированных, митохондриях кукурузы. Методами ингибиторного анализа установлен энергозргаисимый характер транспорта поли-нуклвотидов в растительные митохондрии. Впервые Показано, что параметры кинетики синтеза мтДНК могут быть использованы для генетического маркирования растительных генотипов. Обнаружена линейная положительная корреляционная связь между активностью митохондриального биосинтеза ДНК и урожайностью зерна у линий кукурузы.

Научная и практическая ценность работы. Настоящая работа направлена на изучение матричных функций нуклеиновых кислот в системе изолированных митохондрий еысших растений. Получена новая информация о генетической активности митохондриальных

u чужеродных решшконов in organelle, которая может быть использована в генно-инженерных экспериментах и гекатгасо-се-лекционных работах.

Разработан и защищен авторским свидетельством способ определения потенциальной продуктивности у зерновых и зернобобовых растений. Способ основан на регистрации генетических характеристик изолированных митохондрий растений на ранних стадиях онтогенеза.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 20 работ. Результаты исследований по теме диссертации были представлены на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", (г.Пущино, 1988, 1990), на Мездуна-родной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (г.Новосибирск, 1988), на Республиканской научной конференции "Современные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (г.Алма-Ата, 1989), на Вторам сьезде Всесоюзного общества физиологов растений (г.Минск, 1990), на Всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды" (Иркутск, 1991).

Структура и объем диссертации, Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, главы с результатами и их обсуждением, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц и 17 рисунков. Список литературы содержит 122 наименования,.из них 30 на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛУ

В работе использовали трех- и пятисуточные этиолированные проростки различных генотипов кукурузы (Zea maya íj. Семена кукурузы .пиний W64M, W64T, W640, V168M, V168T, V158Ü и гибридов Российская 1, Краснодарский ЗОЗАТВ, Краснодарский 362АТВ, получали из Краснодарского НИИСХ, а также в Иркутском управлении хлебопродуктов (гибриды ВИР 42МВ, ВИР 46МВ, Одесс.лй 80МВ,

Жеребковский 86МВ, Еегхе ЛЛО, Узбекская зубовидная, Коллективный 244ЫВ).

Митохондрии выделяли из трехсуточных этиолированных проростков кукурузы методом дифференциального центрифугирования с последующей очисткой в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (Войников, 1930; Вечер, 1977).

Синтез ДНК в изолированных митохондриях осуществляли при 30°С по методу иредложеному Сеггетом и Еорстом (Schegget, Borst, 1971) с использованием радиоактивных дезоксирибонуклео-зидтрифосфатов (3Н-дАТФ, 32Р-дАТФ, Э2Р-ТТФ).

Выделение и очистку ДНК из органелл проводили согласно процедуре, предложенной Кемблом с соавт.- (КешЫ et al., 1983) с нашими модификациями.

Электрофорез нуклеиновых кислот проводили в 1% агарозном гел9 с использованием трис-боратного электродного буфера.

Для определение концентрации митохондриального белка использоезли метод Лоури ( Lowry et al., 1951).

Радиоактивность образцов измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика "RACKBETA 1219" (LKB, Швеция) с использованием диоксановй сцинтилляционной жидкости Брея.

Для выявления на электрофореграммах зон меченой нуклеиновой кислоты агарозные гели высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой РМ-В.

В работе были использованы бактериальные штаммы Е. coll JM103, НВ101, JC5183 из коллекции микроорганизмов лаборатории генетической инженерии растений 01ШБР СО РАН.

Плазмидную ДНК выделяли из трансформированных бактериальных клеток по методу Бирнбойма и Доли (Rirnboim, Doly, 1979) с дополнительной очисткой путем хроматографии на колонке с сзфа-розой CL-4B и обработкой фенолом.

Перенос ДНК на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизацию с радиоактивными зондами Проводили по стандартным методам (Мэни-атис, 1984).

Результаты экспериментов обрабатывались методами пэрамет-

рической статистики с использованием пакетов программ GRAPIIPAD (версия 2,0; 1987; Н.J.Motulsky) и АРМ (версия 1.9; 30.07.87; С.В.Мизрохи) реализова1шых на персональной ЭВМ IBM PC/AT.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование системы синтеза митохондриальной ДНК кукурузы in organelle)

Основной задачей настоящего раздела работы была разработка системы синтеза .ДНК митохондрий кукурузы in organelle и определение оптимальных условий ее функционирования (состав среды, рН, температура). Эффективность биосинтеза ДНК в изолированных растительных митохондриях определяли по чувствительному к ингибиторам включению радиоактивных предшественников в кислотонерастворимую фракцию митохондрий.

Было установлено, что включение метки из 32Р-дАТФ в мтДНК является практически линейным, по крайней мере, в течение 1 часа. Однако, анализ изменений функциональной активности митохондрий, наступающих при хранении препарата изолированных ор-ганелл, показал, что определение кинетики синтеза мтДНК необходимо производить в течение первых 30 минут после выделения митохондрий. В течении этого времени используемый нами состав среды инкубации позволял поддерживать митохондрии в энергизо-ванном состоянии. Температурные.условия синтеза (30°С) и рН реакционной среды (7,5) были выбраны из ¿эр^ктера зависимости включения меченого предшественника в мтДНК от этих факторов.

В таблице 1 приведены обобщенные сведения, полученные для системы синтеза ДНК изолированных митохондрий кукурузы.

Расчеты показали, что скорость синтеза, при использованных нами экспериментальных условиях, составила от 20 до 100 пикомолей дЦ'ГФ на I мг митохондриального белка за 10 мин.

Таблица 1.

Основные характеристики ДНК-синтезирующей системы изолированных митохондрий кукурузы (Zea mays L.}

температурный оптимум 20-35°С

оптимум рН 7,5-8,0

чувствительность.к ингибитору матричной

активности ДНК етидаум-бромиду (2 мкг/мл) высокая

потребность в субстрате дыхания

митохондрий +

потребность в ионах %2+ +

Км для дАТФ 3 - 7 мкМ

Примечание: Км - константа Михаэлиса.

2. Матричная активность плазмидоподобных ДНК линий и гибридов кукуруза в отношении синтеза ДНК

Принципиальной особенностью синтеза ДНК в изолированных митохондриях проростков кукурузы было то, что матричной активностью в отношении синтеза ДНК обладали как высокомолекулярная ДНК, так плазмидоподобные ДНК разных размерных классов (рис.1). Положение пиков поглощения на профилях распределения радиоактивности и нуклеотидного материала митохондрий при сравнении результатов радиоевтографического й электрофоретического анализа совпадали. В то же бремя, наблюдаются существенные различия в соотношениях величин поглощения. В таблице 2 представле- . ны результаты расчетов относительного уровня включения йЦТФ в различные митохондриальныб рвпликонн. Видно, что все плазмидо-подобные матрицы включают радиоактивный материал с большей эффективностью, чем хромосомная ДНК. Особенно значительное включение происходит в кольцевую плазмид размером 1,9 т.п.н., которая присутствует во всех стерильных цитоплазмах и гибриде

«а

а®»-» ((II (|

К""-*' ■»(III «I

МП II

©

лЛ-ЛЛД^

Рис.1. Денситограммы негативов с окрашенных этидкй бромидом гелей (1) и радиоавтографов гелей (2) после электрофоретичьского анализа мтДНК линии кукурузы №64А с различными типами ЩС. Синтез 1п ог^теНо проведен с Э2Р-дЦТФ. А - Б-тип ЦМС, Б - Т-тип ЦМО, В - С-тип ЩС.

Таблица 2.

Относительный уровень синтеза ппДШ{ разных размерных классов в митохондриях проростков кукурузы

Источник Размерный класс митохондриалвной ДНК, т.п.н. митохондрий 1,9 2,3 (2,3) 5,4 '6,4 вм мтДНК

№64 АБ П 14 2,2 1,3 1

W64AC 9,6 10 - - 1

1(?64АТ 33 - - - 1

№64АТхСг25ТВ 5,2 6,3 - - 1

Примечание: ем мтДНК - высокомолекулярная митохондриальная ДНК.

Краснодарский ЗОЗТВ (№64АТхСг25ТВ). Так для Б-цитсплэзми оно в 13 раз, для С- в 10 раз, а для Т- в 33 раза выше в плазмиду, чем в высокомолекулярную мтДНК. У простого гибрида на основе лиши У/64А относительная скорость синтеза ДНК плазмид несколько шике, чем у линий с ЦМС. Тем не менее, превышение над вм мтДНК составляло 5-6 раз.

Преимущественный синтез ппДНК может быть обусловлен двумя основными взаимозависимыми причинами - числом копий ДКК матриц и активностью биосинтеза ДНК. Однако, в любом случае, многократное относительное превышение включения радиоактивности в эту плазмиду свидетельствует о еысокой активности репликона и дает основание рекомендовать его для использования при конструировании генетических векторов для цитоплазмы злаковых растений.

3. Полиморфизм плазмидоподобных ДНК различных генотипов кукурузы

Несмотря на более чем десятилетнюю историю изучешя ппДНК митохондрий еысших растений, все еще остаются невыясненными их генетические функции и физиологическая роль, недостаточно изучена структура и свойства, мало известно о копийности мито-хондриалького генома, о качественных и количественных изменениях митохондриальных ДНК в процессе развития растения.

При электрофоретическом анализе митохондриальной ДНК линии кукурузы VI58 наш показано наличие Б-плазмид в Т-тше цитоплазмы (рис. 2, тр.4). Интересно, что и Б2 плазмэды из этих митохондрий оказались неактивным1* матрицами в отношении синтеза ДНК в системе 1п ог£сте11о. Это проявлялось в отсутствии пятен засветки соответствующих этим ДНК при ради-оавтографичэском анализе.

О целью изучения изменений в наборе ппДНК в процессе роста этиолированного проростка был проведен электрофорети-ческий анализ мтДНК девяти генотипов кукурузы. В таблице 3

- И -

11. 60 — &

б. ов

75 4, 51 2. 84 2. 56 2. 46

г. 44

2. 14 1. 99 1. 70

щ

в

&

ш

щ

.„ .'г. §§

— вы мтДНЕ

,61 .52

ппДШС ппДНК

Рис.2. Электрофоретический анализ мтДНК проростков кукурузы линии VI58. 1 - Рэ1;1 -фрагменты ДНК фага лямбда, используемые в качестве маркеров. Цифры слева - размеры фрагментов в т.п.н., 2 - Б-тип цитоплазмы, 3 - С-тип цитоплазмы, 4 - Т-тип цитоплазмы

представлены обобщенные результаты этого аначза.

Изменения в наборе ппДНК в митохондриях трех- и пятису-точных этиолированных проростков были отмечены у двух гибридов кукурузы: Краснодарский ЗОЗАТВ и Бекке ЛЛО. В первом случав это проявлялось в появлении Б-плазмид в составе митохондриаль-ного генома пятисуточных проростков в отличие от трехсуточных. Во втором - з элиминации плазмиды размером 2,3 т.п.н. в митохондриях пятисуточных проростков.

Таблица 3.

Содержание плазмидоподобных ДКК в митохондриях 3-х и 5-ти суточных этиолированных проростков кукурузы

ПцЦНК, Т.П.Н. 6,4 5,4 2,3 2,1

Гибрид, сорт (S1) (S2)

Одесский-вО MB 3-сут. + + +

5-сут. + + + -

ВМР-42 MB 3-сут. + + + -

5-сут. + + +

БИР-46 MB 3-сут. + + +

5-сут. + + + -

Коллективный- 3-сут. + + + -

244 MB 5-сут. + + + -

Российский-1 3-сут. - - - +

5-сут. - - - +

Краснодарский- 3-сут. +

362 АТВ 5-сут. •*

Краснодарский- 3-сут. *

ЗОЗАТВ 5-сут. + + +

Бекке 1Л0 3-сут. + +

5-сут. +

Узбекская 3-сут. + + + -

зубовидная 5-сут. + + +

Таким образом, в отличие от устоявшееся в литературе точки зрения, впервые показано, что спектр п;:ДНК митохондрий проростков кукурузы имеет тенденции к изменению. Эти изменения могут происходить как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения разнообразия ппДНК з митохондриальном геноме. Причины этих изменений неизвестны. Однако, по аналогии с клетками грибов и культурой клеток кукурузы (Rabinowlch et al., 1969; Wright, Cummings, 1983; Smith et al., ¡987), можно предполагать, что они связаны с процессами'генетической регуляции метаболизма в клетках проростка.

4. Использование системы синтеза ДНК in organella для изучения матричной активности чужеродного генетического материала в изолированных растительных митохондриях

4.1. Изучение условий транспорта полшуклеотидов

С учетом существования определенного структурного сходства между плазмидоподобными ДНК и плазмидами микроорганизмов значительный теоретический интерес представляет изучение вопроса о возможности использование их в качестве матриц для синтеза ДНК внутри растительных органелл. Такие эксперименты важны и с практической точки зрения, так как дают возможность применять пнтактные органеллы и митохондриальную ДНК в экспериментах но генетической и клеточной инженерии.

Первоначально в работе была исследована транслокация по-линуклеотидного материала внутрь растительных органелл.

Результата электрофоретического анализа ДНК митохондрий, инкубированных с бактериальным плазмидным вектором рВЕ327 с последующей обработкой ДНКазой, представ эны на рис. 3. Можно видеть, что для митохондрий, инкубированных 'с плазмидой, характерно появление на электрофореграмме дополнительных полос, соответствующих по подвижности некоторым формам плазмидиой ДНК.

12 3 4

«щ

шя

шш

А

Б

Рис.3. Эл хтрофоретический (А) и гибридмзационный (Е) анализ ДНК митохондрий кукурузы, инкубированных с плазмидным вектором рВИ327. 1 - Рзи-фрагменты ДНК фага лямбда, используемые в качестве маркеров длины, 2 - ДНК плазмиды рВй327, 3 - ДНК контрольных митохондрий, 4 - ДНК митохондрий инкубированных с плазмидой рВН327, (Б) - радиоавтограф результатов гибридизации блота А с плазмидой рВИ327, меченой Э2Р в реакции ник-трансляции.

Обработка изолированных митохондрий панкреатической ДНКазой не-приводила к исчезновению обнаруживаемых в опытном варианте полос ДНК. О помощью блст-гибридизации было установлено, что препарат ДНК митохондрий, инкубированных с плазмидой, обнаруживал значительный сигнал при использовании в качестве зонда меченой рВ11327. При этоь полоса связывания зонда

соответствовала по электрофоретической по'/вижности ДНК рВН327.

С использованием дигитонина для удаления внешней мито-хондриальной мембраны (Бс'ппаишап е1 а1., 1967), было показано, что сколо 303 меченого материала, после обработки ДККазой, обнаруживается в мета.ембранном пространстве, а остальные 70% в матриксе органелл.

4.2. Синтез чужеродной ДНК 1п "о

При инкубации обработанных плазмидсЯ рВЯ322 митохондрий в условиях, благоприятствующих протеканию з них синтеза ДНК, было зарегистрировано появление несколько фракций радиоактивно-меченной нуклзиновой кислоты (рис. 4). Электрофоретичеекая подвижность этих фракций соответствовала высокомолекулярной митохондриалыюй ДНК, ковэлентко-замкаугой форме гглззмзды рЕБ322 и фракции плазмидоподобных ДНК.

Следовательно, при подобранных экспериментальных условиях происходила трэнслокацня плазмидной ДНК во внутреннее пространство митохондрий, что делало ее доступной для мптохондри-альной ДНК-полимеразы. То, что з митохондриальной системе обнаруживается только ковалентно-замкнутая форма бактериальной плазмиды может, по-видимому, служить указанием на преимущественную транслокацию этой молекулярной Формы плззмиды или предпочтительное, по сравнению с остальными формами, вовлечение ее в процесс мятохондризльного синтеза ДНК.

Обобщенные результаты изучения транслокации и синтеза по-линуклеотидного материала в изолированных митохондриях кукурузы представлены в таблице 4.

Таким образом, результаты проведенных экпериментов показывают, что ДНК бактериального плазмидного вектора рЕН322 и рекомбинантных плазмид с фрагментами митсондриалыюй ДНК обладают заметкой матричной активностью в отношении синтеза ДНК 1п cгgaJ1ello в митохондриях проростков кукурузы. Не исклю.эно, что проявление матричных свойств бактериальных илазмид в

ем мтДНК к

днк рвязгге

пи мтДНК »>

23 7

■ 9 5

■ В 7

• 43

г.з

196

I г з

Рис.4. Электрофоретический (А) и гибридизационный (Б) анализ ДНК контрольных и инкубированных с плазмидой рВЙ322 митохондрий кукурузы. 1 - ДНК контрольных митохондрий, 2 - ДНК митохондрий инкубированных с плазмидой, 3 - ДНК-плазмиды рВй322. Справа указано положение Н1п<Ш1-фрагментов ДНК фага лямбда, используемых в качестве маркеров длины; вм мтДНК, пп мтДНК - соответственно, Фракция высокомолекулярной и плазмидоподобной митохондриальной ДНК.

системе изолированных митохондрий связано в определенной мере с наличием в составе генома этих органелл набора ппЦНК (Ки2Гп1п, ЬетсЬепко, 1987; Кагакоуа, 19Р°).

Таблица 4.

Транслокация и матричная антивнооть гетэрслогичного и гомологичного генетического материала в изолированных митохондриях кукурузы

Происхождение ДНИ

Способность к транслокации в митохондрии

Способность к синтезу ДНК в митохондриях

Бактериальная векторная

плазмида pBR322 Бактериальная векторная

плазмида pBR327 Плазмидоподобные мито-

хондриальные ДНК S1+S2 Рекомбинантнэя плазмида

pZm32.1 Рекомбинантнвя плазмида

pZmS2.5 Рекомбинаншая плазмида YEcoxI

не определяли

не опредрпялп

не определяли

5. Изучение характера связи менду синтезом ДНК в изолированных митохондриях и продуктивностью растений кукурузы

Общепринято считать, что ДНК-сшивзирующая система является ваанейшей составной частью генетической системы митохондрия (Гвузе, 1977; Douce, 1985). Наиболее ярко ее роль должна проявляться, по-видимому, на ранних сталях Ьнтогенеза растения, когда происходи-!' интенсивное деление клеток и-имеется повышенная потребность в формировании функционально-активны* ор-ганелл. О учетом этого, нами сделана попытка изучения связи

между генетическими характеристиками изолированных митохондрий проростков и продуктивностью растений. Оказалось, что каждый исследованный генотип характеризовался собственным видом кинетики синтеза мтДНК 1п ог(рпе\1о. Определение вида зависимости мевду активностью митохондриального биосинтеза ДНК и величиной урожайности зерна изученных линий показало существование линейной положительной корреляционной сеязи между этими параметрами (рис.5) с коэффициентом корреляции г=0,83-0,21 (Р<0,05).

га ?5

Урон/шссть, ц/га

Рис.5. Корреляционная связь между активностью синтеза ДНК (п о^апеПо и урожайностью семян у линий кукурузы. 1 - Сг25 0£/02, 2 - Сг25ВТ, 3 - В73зак.Т, 4 - В84закТ, 5 - М017ТВ, б - Сг25а1п/з1п, 7 - 1б5закТ.

Молекулярные механизмы, обусловливающие обнаруженную корреляционную связь между активностью ДНК-синтэзирующей системы растительных митохондрий и урожайностью генотипа остаются пока неизвестными. Тем не менее, методический прием, основанный на

измерении ДНК-синтезирующей активности изолированных митохондрий на ранних стадиях онтогенеза, по нашег/у мнению, может быть использован для предварительной оценки признака продуктивности растений. Благодаря относительной простоте и незначительной продолжительности осуществления, этот способ может быть применен для большого числа новых селекционных образцов, получаемых методами отдаленней гибридизации, химического мутагенеза, генетической и клеточной инженерии, традиционной селекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования митохондриального генома растений, проводимые до настоящего времени, были, в основном, направлены на изучение его структурной организации '.Douce, 1985; Негрук, 1987). В настоящей работе проведено изучение свойств ДНК-син-тезирующей системы митохондрий кукурузы. Впервые показано, что матричной активностью в отношении синтеза ДНК обладают все ми-тохондриальяые релликоны - высокомолекулярная и плазмидоподоб-ные ДНК- Как удалось установить, важней особенностью митохонд-риальной системы биосинтеза нуклеиновых кислот in organello является способность использовать в качестве генетических матриц как эндогенный, так и экзогенный полинуклеотидный материал. Это создает предпосылки для разработки системы генетической трансформации митохондрий с целью использования их при генно-инженерном конструировании растений.

В работе установлено также, что у исследованных линий и гибридов . кукурузы кинетические параметры синтеза мтДНК in organello могут служить з качестве альтернативной характеристики генотипа. По нашему мнению, определение кинетики синтеза мтДНК в изолированных митохондриях растений может быть использовано в дальнейшем в генетико-селе'"'даонных и молекуляр-но-биологических исследованиях в качестве нового подхода для идентификации растительных генотипов.

вывода

1. Исследованы условия получения и основные характеристиг ки системы матричного биосинтеза ДНК в изолированных митохондриях кукурузы (Zea ту а Ъ.).

2. Установлено, что матричной активностью в отношении синтеза ДНК tn organello обладают как высокомолекулярная, так и плазмидоподобные ДНК. Линейные (Sí, S2, 2,3 и 2,1 т.п.и.) и кольцевая (1,9 т.п.н.) ппДНК в качестве генетических матриц проявляют более высокую активность по сравнению с митохондри-альной хромосомой. Наибольшей репликативной активностью обладает кольцевая ппДНК размером 1,9 т.п.н.

3. В процессе развития этиолированных проростков гибрида Краснодарский 3Q3AT8 на 5-ые сутки в спектра ппДНК обнаруживаются не регистрируемые у трехсуточных проростков S1 и S2 плазмида. У гибрида Бекке ЛЛО происходит элиминация линейной мито-хондриальной плазмида размером 2,3 т.п.н. в тот жэ период развития.

4. Впервые установлена возможность транслокации чужеродного полинуклеотидного материала через внутреннюю мембрану ин~ тактных митохондрий кукурузы. Показано, что способностью проникать во внутреннее пространство органелл обладают лишь отдельные физические формы плазмидной ДНК. Процесс транспорта полинуклеотидов в растительные митохондрии имеет энергозависимый характер.

5. О использованием разработанной системы изолированных митохондрий кукурузы, показано, что ДНК бактериальных векторных плазмид серии pBR и рекомбинантных плазмид с фрагментами митохондриальной ДНК может использоваться в качестве матриц для синтеза ДНК ln organello.

6. Впервые установлено, что кинетические кривые синтеза мтДНК могут быть использованы для генетического маркирования растительных генотипов. Обнаружена линейная положителптя кор-реляциопная связь между активностью митОхондриального биосинтеза ДНИ и урожайностью sepia у линий кукурузы.

Осноеныо публикациш по теме диссертации

1. Подсосошшй В.А., Стрельникова if.If., Константинов В.М. Модифицированный метод препаративного выделения плазмидоподоб-ной ДНК из микроорганизмов// Физиология растительной клетки, минерального и светового питания. -Иркутск, СЙФИБР СО АН СССР. -1987. -С.41-43.

2. Константинов Ю.М., Подсосонный З.А., Луценко Г.Н.Синтез ДНК бактериальной векторной плазмиды рВЯ322 в изолированных митохондриях кукуруза// Докл.АН СССР. -1988. -Т.298, N.2. -С.502-504.

3. Константинов Ю.М., Подсосонный В.А.,Луценко Г.Н., Арзи-ев А.Ш. Возможности и перспективы клонирования генетического материала в митохондриях растений// Тезисы Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии". -Пущино, 1988. -С.71-72.

4. Константинов Ю.М., Подсосонный В.А., Луценко Г.Н., Стрельникова И.И. Изучение возможности клонирования бактериальной векторной плазмиды pBR322 в изолированных митохондриях кукурузы // Тезисы докладов на международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология". -Новосибирск, 1988. -Т.1. -С.199.

5. Константинов Ю.М., Подсосонный В.А., Луценко Г.Н., Рив-кин М.И. Транслокация бактериальных векторных плазмид в митохондрии проростков кукурузы // Биохимия. -1989. -Т.54, N.1. -0.154-158.

6. Konstantinov Y.M., Podsosomiy V.A., Lutcenko Q.N., Tauson E.L. Translocation and matrix activity of foreign genetic material in isolated mitochondria of cereals // Materials of republican scientific conference "Modern problems of phislco-chemlcal biology and biotechnology". -Alma-Ata: Nauka, 1989. -P.67.

7. Константинов Ю.М., Подсосонный В.А., Луценко Г.Н., Лга-кин М.И. Синтез ДНК в интактных митохондриях кукурузы, сбрабо-

таншх бактериальными вэкторными плазмидчми серии pBR// Биополимеры и клетка. -1SS9. -Т.5, N.4. -С.98-!02.

8. Константинов Ю.М., Луценко Г.Н., Подсосонный Б.А., Та-усон Е.Л. Влияние обработки митохондрий плазмидной ДНК на генетическую систему изолированных митохондрий растений// Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" .-Пущино, 1990. -0.11.

9. Константинов Ю.М., Подсосонный В.А., Луценко Г.Н., Та-усон Е.Л. Транслокация и матричная активность чужеродного генетического материала в изолированных митохондриях злаковых растений// Тезисы докладов второго сьезда Всесоюзного общества физиологов растений. -Москва, 1990. -0.46.

10. Константинов Ю.М., Подсосонный В.А., Луценко Г.Н. Использование систем синтеза ДНК и РНК in organello для изучения активности митохондриалыюго генома растений на ранних стадиях онтогенеза// Тезисы докладов второго Всесоюзного совещания "Генетика развития". -Ташкент, 1990. -Т.2. -0.79-80.

11. Konstantlnov Y.M., Podsosonny V.A., Lutcenko G.N. Translocation of bacterial vector plasmids Into Intact mitochondria of seedlings// Maize Genet. Coop. Newslet. -1990. -V.64. -P.67-68.

12. Константинов Ю.М., Подсосонный Б.А., Луценко Г.Н., Стрельникова И. И. Транспорт ДНК бактериальной векторной пл8з-«миды pBR322 в митохондрии проростков кукурузы // Мембранный

транспорт и биоэлектрическая активность растений. - -Горький, 1990. -С.85-88.

13.Константинов Ю.М., Луценко Г.Н., Подсосонный В.А. Способ определения потенциальной урожайности линий кукурузы // A.c. СССР N 1677888. -1991.- 2с.

14. Константинов Ю.М., Подсосонный В.А., Луценко Г.Н. Исследование синтеза ДНИ в митохондриях цитоплазматических типов кукурузы, различающихся по устойчивости к поражению Bipolaris maydls // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприят-

ним факторам среды" (Иркутск, 8-12 июля 1991 г.). -Новосибирск, 1991. -С.97.

15. Konstaritlnov Y.M., Podsosonny v.д., Lutcenko G.K. Tauson E.L. Translocation and template activity of foreign genetic material in isolated maize mitochondria // Molecular Biology of Plant Growth and Development: Abstracts of Third International Congress of The International Society for Plant Molecular Biology (Tucson, Arlsona 6-1: Oct.1991), -Univ. of Arisona, USA, 1991. -Abstr. N.2077.

16.Константинов Ю.М., Машненков А.С., , Луценко Г.Н., Подсосонный В.А. Реципрокнэя зависимость между активностями синтеза РНК и ДНК в митохондриях разных генотипов кукурузы // Докл. РАН - 1993. -Т.328, N.6. -С.747-7''-9.

Отпечатано на множит, уч-ке ИСЗФ. Зак.№595.0т 13.07.93.Объём 23стр.Тир.ЮОэка.