Сигнальные пути ядерного транскрипционного фактора Каппа в (NF-kB) в чувствительных нейронах

Гущина, Светлана Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сигнальные пути ядерного транскрипционного фактора Каппа в (NF-kB) в чувствительных нейронах
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Сигнальные пути ядерного транскрипционного фактора Каппа в (NF-kB) в чувствительных нейронах"

На правах рукописи

Гущина Светлана Валентиновна

СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ ЯДЕРНОГО ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА КАППА В (№кВ) В ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ НЕЙРОНАХ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

3 0 СЕН 2010

Саранск-2010

004609614

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Центре нейронаук Университета Лондона

Научные консультанты:

доктор медицинских наук академик РАМН, профессор

Волкова Ольга Касильсвна

доктор биологических наук, профессор

Кругляков Павел Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Ермолин Игорь Леонидович

доктор медицинских наук, профессор

Челышсв Юрий Александрович

доктор медицинских наук, профессор

Шпалев Вадим Николаевич

Ведущая организация:

Научный центр неврологии РАМН

„Ж"»

Защита состоится « ^ » 2010 года в 10.00 часов на

заседании диссертационного совета Д 212.117.01 при ГОУ В ПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» (430000, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ В ПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» (430000, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68). ,

Автореферат разослан« »__2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета __^ р

доктор биологических наук, профессор ^---/ Балашов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Раскрытие молекулярных механизмов регуляции нейродегенеративных/нейрорегенеративных процессов при травмах головного и спинного мозга, а также различных повреждениях периферических нервов - одна из важнейших проблем современных нейронаук, решение которой связано с разработкой новейших подходов к лечению этих тяжелых состояний. Одним из важных направлений исследований в этой области остается изучение клеточных и молекулярных процессов, лежащих в основе регенерации периферического нерва, понимание которых поможет решить фундаментальные проблемы регенерации нервной ткани.

Выживание нейронов является ведущим фактором, обеспечивающим успешную регенерацию периферического нерва и восстановление функций иннервируемой ткани после его повреждения (Рагинов, Челышев, 2003). Известно, что выживание нейронов зависит от снабжения их нейротрофическими факторами, поставляемыми в том числе иннервируемой тканью. Зрелые чувствительные нейроны проявляют способность выживать после аксотомии и потери связи с иннервируемой тканыо. Более того, эти клетки могут находиться in vitro при полном отсутствии в питательной среде нейротрофических факторов (Lindsay et al., 1994), в отличие от эмбриональных чувствительных нейронов, которым нейротрофическая поддержка необходима для выживания (Davies, 2000; Middleton et al., 2000), как и активация ядерного транскрипционного фактора NF-kB.

Многочисленные молекулярные и клеточные изменения в спинномозговых ганглиях после повреждения периферического нерва изучены достаточно глубоко (Baldwin, 1996; Koliatsos, Price, et al., 1996). Особое внимание в настоящее время уделяется исследованию процессов, происходящих в клетках на молекулярном уровне и включающих индукцию транскрипционных факторов, регулирующих последующую активацию и транскрипцию специфических генов регенерации.

Было обнаружено, что стимулирующим фактором при регенерации периферического нерва может служить развитие воспалительной реакции вокруг перикарионов нейронов спинномозговых узлов (Lu, Richardson, 1991), молекулярные механизмы которой связаны в том числе с индукцией цитокинов, таких, как интерлейкин-6 (Murphy et al., 1999), фактор некроза опухоли альфа (TNF-ct) (Schafers et al., 2003) и др. Ядерный транскрипционный фактор NF-kB является классическим мессенджером, регулирующим каскады реакций, связанные с различными цитокинами и клеточной гибелью.

Camandola, 2001). Однако его роль в выживании зрелых нейронов ЦНС оказалась противоречивой. Так, было обнаружено, что ингибирование NF-kB в нейронах переднего мозга приводит к их апоптозу в результате нейротоксического поражения (Fridmacher et al., 2003), а в кортикальных нейронах может предотвратить апоптоз при экспериментальной ишемии мозга (Herrmann et al., 2005).

В нейронах спинномозговых ганглиев NF-kB исследовали для выявления его потенциальной нейропротекторной роли после травмы периферического нерва (Doyle, Hunt, 1997; Fernyhough et al., 2005). Зрелые чувствительные нейроны по своей природе относительно устойчивы к апоптозу, вызванному перерезкой периферического нерва (Koliatsos, Price, 1996). В противоположность этому гибель нейронов происходит гораздо быстрее после травмы в эмбриональном или раннем постнатальном периоде (Whiteside et al., 1998). Нейропротекторная роль NF-кВ в зрелых чувствительных нейронах описана в экспериментах на культуре спинномозговых нейронов in vitro (Fernyhough et al., 2005). Однако сложность этого фактора обусловливает противоречивость заключений о сигнальных путях NF-кВ в поврежденных нейронах.

До настоящего времени все еще дискутируется (Memet, 2006) вопрос о роли NF-кВ в процессах контроля выживаемости и гибели нейронов после травмы периферического нерва в условиях in vivo. Это отчасти связано с тем, что сложно четко разграничить in vivo два не исключающих друг друга потенциальных механизма действия NF-кВ: непрямое влияние на нейроны, опосредованное активацией NF-кВ в глиальных клетках, или непосредственное участие этого фактора в регуляции активности нейрональных генов. В существующих генетических линиях нокаутных мышей не происходит инактивации гена NF-кВ в каком-то одном типе клеток, что делает невозможным разделение дейстия NF-кВ в глиальных клетках и нейронах (Pasparakis et al., 2006). В связи с этим возникла необходимость генерировать трансгенную линию мышей, в которых активность NF-кВ ингибирована исключительно в зрелых нейронах, для дальнейшего изучения функциональной роли нейрональной NF-icB.

Цели исследования. Цель настоящей работы - изучить биологическую роль ядерного транскрипционного фактора NF-кВ и молекулярных механизмов, регулирующих его активность в зрелых чувствительных нейронах спинальных ганглиев после травмы периферического нерва.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд конкретных задач.

1. Выяснить, повышается ли постгравматическая экспрессия NF-kB-зависимых генов МСР-1 (протеин хемоаттракции моноцитов 1 - monosyte chemoattractant protein-1) и 1кВа (ингибитор NF-кВ - inhibitor of NF-кВ) в зрелых нейронах спинальных ганглиев in vivo и при стимуляции культуры чувствительных нейронов провоспалительными цитокинами (TNF-a) in viíro.

2. Провести анализ ДНК-связывающей активности NF-кВ в постгравматических нейронах in vivo и при стимуляции культуры чувствительных нейронов TNF-a in vitro.

3. Создать трансгенную линию мышей с модифицированной активностью транскрипционного фактора NF-кВ in vivo специфически в зрелых нейронах и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий.

4. Изучить на трансгенной модели животных биологический эффект ингибирования нейрональной активности NF-кВ, оказываемый на основные физиологические параметры и посттравматическую выживаемость зрелых чувствительных нейронов.

5. Выявить транскрипционную активность NF-кВ в зрелых чувствительных нейронах in vivo и in vitro с использованием трансгенной линии репортерных мышей NF-KB/LacZ.

6. Определить регуляторное влияние процессов ацетилирования на активацию сигнальных путей NF-кВ в нейронах спинальных ганглиев трансгеиных мышей репортерной линии NF-KB/LacZ in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Посттравматические молекулярные изменения зрелых чувствительных нейронов крыс породы Вистар включают в себя изменения уровня экспрессии ряда NF-кВ-зависимых генов и ДНК-связывающей активности NF-кВ in vivo и in vitro.

2. Созданная генетически модифицированная линия мышей ТЬу*1кВа-Б1 проявляет специфическую нейрональную экспрессию суперингибитора NF-kB.

3. Травма седалищного нерва in vivo и стимуляция культуры чувствительных нейронов TNF-a in vitro вызывает транслокацию р65-иммунореактивности в ядро нейронов у мышей дикого типа, в то время как трансгенная линия Thy*lKBa-SI мышей проявляет пониженную способность NF-кВ к перемещению в ядро при повреждении периферического нерва in vivo и активации цитокинами in vitro.

4. Трансгенное ингибирование активности NF-кВ в зрелых нейронах модифицированных мышей не влияет на основные физиологические параметры и посттравматическую выживаемость зрелых чувствительных нейронов in vivo.

5. Мониторинг экспрессии репортерного гена в трансгенной линии мышей NF-KB/LacZ, отражающей реальную транскрипционную активность NF-кВ, показывает ее отсутствие как в интактных, так и в постгравматических нейронах спинномозговых ганглиев in vivo, в отличие от нейронов ЦНС.

6. Активность сигнальных путей NF-кВ в чувствительных нейронах регулируется процессами ацетилирования/деацетилирования, и отсутствие влияния NF-кВ в зрелых нейронах спинальных ганглиев объясняется процессами деацетилирования, подавляющими транскрипционную активность ядерного фактора.

Научная новизна. Несмотря на обилие в мировой литературе данных, показывающих важную роль ядерного транскрипционного фактора кВ (NF-кВ) в процессах нейродегенеративных состояний нервной системы, публикации, посвященные практическим вопросам создания и экспериментального применения моделей животных с генетически модифицированной активностью NF-кВ специфически в зрелых нейронах, единичны. До настоящего времени это единственная трансгенная модель, в которой целенаправленно ингибируется активность NF-кВ в зрелых нервных клетках in vivo. Для создания модели Thy*lKBct-SI была использована мутантная форма ингибитора NF-кВ ~ IkBoi-SI, которая не подвержена деградации и поэтому действует как суперрепрессор NF-кВ активности, удерживая и изолируя в цитоплазме каждый NF-fcB/RdA комплекс, предотвращая связывание с ДНК и активацию транскрипции. Результаты анализа показали, что ген мутантной формы ингибитора NF-кВ успешно экспрессируется исключительно в нейронах трансгенных мышей.

1 Предложенная нами модель выгодно отличается тем, что ТИу-1.2-промотор, под регуляторным действием которого находится ген суперингибитора NF-кВ, активируется строго специфически в зрелых нейронах трансгенных мышей на 8 день постнатального развития и не затрагивает механизмы нейронального развития.

С помощью созданной нами модели впервые показано, что трансгенное репрессирование NF-кВ не влияет на основные физиологические свойства чувствительных нейронов in vivo, а также на их количество в спинномозговых ганглиях в норме и не ведет к изменениям выживаемости нейронов после травмы периферического нерва in viva.

В данной работе предлагается также новый подход к регистрации транскрипционной активности NF-кВ in vivo с использованием трансгенной репортерной линии мышей NF-KB/LacZ. Полученные данные впервые показывают, что даже при активации NF-кВ-ДНК-связывающей активности в чувствительных нейронах, реальная транскрипционная активность может быть репрессирована действием гистоновых деацетилаз.

Практическое и теоретическое значение работы. Важность данной работы для фундаментальной науки и практической медицины обусловлена необходимостью понимания молекулярных и генетических программ, контролирующих процессы выживаемости нейронов и нейронапьной регенерации. Результаты исследования позволяют расширить представления о сложноорганизованной системе регуляции транскрипционного фактора NF-кВ в чувствительных нейронах. Выявленный молекулярный механизм, опосредованный гистоновыми деацетилазами объясняет транскрипционную репрессию NF-кВ в нейронах спинномозговых ганглиев, что позволяет говорить об ограничении функций NF-кВ in vivo в зрелой ПНС в отличие от таковых в ЦНС.

изучить процессы ацетилирования/деацетилирования гистонов в чувствительных нейронах, в частности их участие в регенерации.

Использование созданной линии мышей Thy*lKBa-SI в экспериментальных моделях травмы, стресса и др. дает широкую возможность для изучения биологической роли NF-кВ в зрелых нейронах как центральной, так и периферической нервной системы.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры гистологии и эмбриологии педиатрического факультета Российского государственного медицинского университета, кафедры гистологии Московской медицинской академии им. Сеченова, и служат обоснованием для продолжения исследования молекулярных механизмов регуляции нейродегенеративных/нейрорегенеративных процессов при травмах периферического нерва, а также головного и спинного мозга.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на различных отечественных и международных конференциях, в том числе на William Harvey Day Conference (Queen Mary's School of Medicine and Dentistry, University of London (Великобритания, Лондон, 2003, 2004, 2005), международной конференции Society for Neuroscience, 34th Annual Meeting San Diego (США, Сан-Диего, 2004), Всероссийской конференции «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток» (Самара, 2008), международной конференции «Проблемы современной морфологии человека» (Москва, 2008), VI съезде ВНОАГЭ (Саратов, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 235 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, библиографического списка, включающего 347 источников. Работа иллюстрирована 48 рисунками и 1 таблицей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. Животные содержались в виварии колледжа Queen Mary Университета Лондона (the Biological Service Unit (BSU) of Queen Mary), все эксперименты были проведены в соответствии с этическими правилами по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей, установленными «the Ноше Office» (Великобритания). У зрелых мышей (возраст 2-5 месяцев) или зрелых крыс породы вистар (массой 200-250 г) под изофлюрановым наркозом в асептических условиях перерезали левый седалищный нерв на уровне середины бедра. Правый контралатеральный седалищный нерв не оперировали. Интактные (неоперированные) животные использовались как контроль. В подопытной группе через б, 12,24,48 часов и 1 неделю после травмы нерва и у 10 интактных животных под изофлюрановым наркозом после ламинэктомии выделяли спинномозговые узлы на уровне L[V-LV с левой

стороны для последующей экстракции РНК или фракции ядерных белков, а также гистологического анализа (X-gal, TUNEL, иммуногистохимия)

Экспериментальная модель воспаления периферического нерва. Воспаление периферического нерва моделировали на трансгенных репортерных мышах NF-KB/LacZ в условиях изофлюранового наркоза путем введения полной формы адъюванта Фройнда (complete Freund's adjuvant -CFA; «Sigma», Великобритания). Для этого анестезированным мышам были сделаны инъекции 200 мкл CFA в физиологическом растворе (1:1) в подошвенную область левой задней конечности. Контрольные животные получали инъекции 200 мкл физиологического раствора. У животных подопытной и контрольной групп через 24 часа после инъекции под изофлюрановым наркозом после ламинэктомии выделяли спинномозговые узлы на уровне Liy-Ly с левой стороны для последующего X-gal-анализа.

Полупение первичной культуры чувствительных нейронов. Спинномозговые узлы выделяли в стерильных условиях у взрослых крыс или зрелых трансгенных мышей на уровне L1V - Lv и помещали в среду Хэнкса («Sigma», Великобритания) на льду. В дальнейшем диссоциацию и культивирование нейронов осуществляли, как описано Holmes с соавторами (2000). Плотность клеточной популяции составляла примерно 800 клеток на 1 плашку. Клетки инкубировали в среде роста в инкубаторе при 37 °С и 5 % С02.

Индукция активности NF-кВ. Для стимуляции активности NF-kB нейроны спинномозговых ганглиев культивировали 48 часов и затем подвергали действию TNF-a (30 нг/мл), липополисахарида (10 мг/мл) или трихостатина А (5 |iM) (все производства «Sigma», Великобритания). В частности, нейроны культивировали в плашках в среде роста F-12 в течение 16 часов, после чего в среду добавляли TNF-a («Sigma», Великобритания) (30 нг/мл), клетки инкубировали дополнительно 10, 20 и 30 минут и нейроны обрабатывали для последующего X-gal-анализа или собирали дня дальнейшей экстракции РНК или ядерных белков.

Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени. Для эксперимента in vivo оперированные крысы были убиты через 6, 12, 24, 48 часов и 1 неделю после перерезки седалищного нерва. Два пула Liv-Lv спинномозговых ганглиев (оперированной и контралатеральной сторон) были собраны вместе для последующей экстракции РНК, которую в эксперименте in vitro осуществляли из первичной культуры чувствительных нейронов (контрольной и после соответствующей TNF-a-стимуляции).

Для экстракции РНК использовали метод с тризолом (The TRIzol protocol, «Life Technologies», США). Для определения количества выделенной РНК 1 мкл растворенной РНК брали для обработки на спектрофотометре (Biorad SMARTSPECTRUM 3000, CA, США). Оставшийся раствор РНК хранили при -70 °С до дальнейшего использования.

Обратную транскрипцию осуществляли в амплификаторе («Biometra», Дания) с использованием фермента обратной транскриптазы (The SuperScript™ III RNA ase H Reverse Transcriptase, «Life Technologies», США)

следуя протоколу, предоставленному компанией-производителем. Режим инкубации: 5 мин при 25 °С, 60 мин при 50 °С, 15 мин при 70 °С. После окончания реакции пробирки с реакционной смесью хранили при -70 °С.

Выбор праймеров для ГЩР проводили на основании данных GeneBank. Для дизайна праймеров были использованы известные последовательности генов: для гена (кВа крысы - номер в каталоге GeneBank ХМ_234230, для гена МСР-1 крысы - NM_031530. Праймеры и пробы для генов 1кВа и МСР-1 были разработаны с помощью программы «Primer 3» в соответствии с требованиями, представленными компанией «Corbett research» (Австралия). Праймеры были изготовлены в компании «Invitrogen» (Великобритания), TaqMan-npo6a для гена 1кВа - в компании «MWG-Biotech AG» (Великобритания) и для гена МСР-1 крысы - в компании «Applied Biosystems» (Великобритания). Нуклеотидные последовательности использовавшихся праймеров (прямой/обратный) в направлении 5' - 3' приведены ниже: 1кВа - TGAGGAGAGCTATGACACGG (5'-primer) и TGGCCTCCAAACACACAGT (3'-primer) и TaqMan-пробы соответственно CACGGAAGATGAGTT-CCCTACGA; МСР-1 - CACTCACCTGCTGCTACTC (5'-primer) и CTGCTGCTGGTGATTCTCTT (З'-primer) и TaqMan-пробы соответственно TCCCAATGAGTCGGCTGGAGAA. 5'-конец каждой пробы и lSS-рРНК-контроля были помечены флуоресцентными метками FAM и VIC соответственно, тогда как З'-концы - гасителем флуоресценции TAMRA.

Количественная ПЦР в реальном времени. Экспрессию генов 1кВа и МСР-1 изучали в каждом пуле спинальных ганглиев: 1) относящихся к левому перерезанному седалищному нерву, 2) контралатерально располагающихся, 3) контрольных и 4) TNF-a-стимулированных пулах культуры чувствительных нейронов. Количественную ПЦР в реальном времени проводили одновременно для всех экспериментальных образцов с использованием одинаковых условий и компонентов. Все образцы загружали в трехкратном повторении. Для качественной оценки уровня экспрессии исследуемых генов в каждой реакции одновременно использовали сравнение с уровнем экспрессии референсного гена -188-рРНК-контроль.

Для построения контрольной стандартной кривой 5 разведений кДНК селезенки включали в каждую реакцию. Наиболее концентрированным считалось кДНК селезенки (1:0). Каждая последующая концентрация достигалась разведением 1:10 предыдущего стандарта. При этом во все серии реакций включали безматричный контроль, в котором экспериментальный образец заменяла вода. Все образцы, стандарты и безматричный контроль загружали в трехкратном повторении в каждой серии ПЦР в реальном времени. Для контроля каждой реакции использовали праймеры и пробы референсного гена 18S-pPHK.

2 мкл матрицы добавляли к следующей смеси: 1,5 мкл 1кВа-праймера 1; 1,5 мкл 1кВа-праймера 2; 1 мкл 1кВа TaqMan-пробы; 0,25 мкл 18S-pPHK-праймера 1; 0, 25 мкл 18Б-рРНК-праймера 2; 0, 25 мкл 18S-pPHK TaqMan-пробы; 25 мкл TaqMan Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG («Abgene», Германия) и 16,25 мкл очищенной от нуклеаз НгО. Образцы

помещали в амплификатор в реальном времени (the Rotogene 3000 quantitative real-time PCR machine, «Corbett Research», Австралия) и задавали следующую программу нагрева: 10 мин при 95 °С (для активизации Hot-Start Taq-фермента), 1 мин при 60 °С (для стимуляции и обнаружения флуоресценции), 15 с при 95 "С. Этот цикл повторялся 45 раз. По окончании эксперимента данные обрабатывали программой «Rotogene software. Version 4.6» («Corbett Research», Австралия). Рассчитанная концентрация образцов (число копий/мкл) была нормализирована к концентрации 18S-pPHK. Полученную относительную величину использовали для определения количества продукта исследуемых генов в каждом образце.

Метод сдвига электрофоретической подвижности (EMSA -clectroplioretic mobility shift assay). Для приготовления клеточного экстракта первичную культуру нейронов спинномозговых ганглиев (в концентрации 2-4 х106) осаждали центрифугированием, отмывали охлажденным до 0 "С PBS и затем рееуспендировали в 200 мкл низкосолевого буфера (10 мМ HEPES, pH 7,9, 10 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 0,1 мМ EDTA, 10 мМ NaF, 10 мМ Na4p207, 2 мМ Na3VO., с добавлением ингибиторов протеаз - 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл леупептина, 100 цМ AEBSF).

Для приготовления клеточного экстракта спинальных ганглиев 6 из них объединили, суспендировали в 200 мкл низкосолевого буфера и гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора 15 раз. Подобную процедуру провели и с другими образцами (селезенка крысы, зрелый мозг крысы, мозг новорожденных крысят). После 15-минутной инкубации на льду добавляли NP40 в конечной концентрации 0,6 % и в дальнейшем придерживались методике, описанной Yousaf с соавторами (2005).

Трансгенная линия мышей Thy*lKBa-SI

1. Генерация траисгенпой линии мышей Thy*lKBaSl, Для создания трансгенной линии мышей Thy*lKBa-SI был использован мощный трансдоминантный ингибитор NF-кВ (IkBoi-SI) (Voll et al., 2000), являющийся мультимутантной формой ингибиторного протеина 1кВа. Суперингибитор NF-кВ - IkBoi-SI был включен в Xhol-участок специфической нейральной Thy-l-2-кассеты (Caroni, 1997), обеспечивающей экспрессию трансгена строго в зрелых нейронах трансгенных животных (tg). В частности, 1кВа-Щ-кодирующий участок был амплифицирован из плазмиды IkBoiRR (Voll et al., 2000), с помощью прямой ПЦР, присоединивший фланкирующий сайт узнавания рестриктазы Sali к Xhol-участку Thy-l-2-кассеты. Праймеры для ПЦР: forward - 5'-gacgcgtcgacgcggccgccaccATGGACTACCCCTACGACGTC-CCCGACTAC-3', reverse: 5 '-gacgcgtcgacgcggccgcTCATA ACGTCAGACGCTGGCC-

TCCAAACAC-3' (прописные буквы- последовательность, комплементарная кодирующему участку мутантной формы 1кВа, подчеркнутые - сайт узнавания рестриктазы Sali, полужирные - сайт узнавания рестриктазы Notl). В реакции использовали фермент «Patinum Pfx DNA Polymerase»

(«Invitrogen», Великобритания). Режим ПЦР: 94 °С - 30 с, 50 °С - 30 с, 72 °С - 3 мин в течение 30 циклов.

Амплифицированный ДНК-фрагмент очищали с использованием набора «Qiagen-II agarose gel extraction method», разрезали с помощью Sall-эндонуклеазы и встраивали в комплементарный Xhol-участок Thy.l-кассеты. Полученную конструкцию Thy*IicBa-S[ использовали для генерации трансгенных животных путем пронуклеарной микроинъекции генетической конструкции в зиготу гибридной линии CBAxC57BL/10. В поколении Fl обнаружили 7 позитивных животных, которых затем использовали для скрещивания с мышами линии СВА. 3 трансгенные линии были получены и зарегистрированы в FESA (Frozen Embiyo & Sperm Archive, MRC Harwell) как Tg(Thy-mutlkB)74-3, -5 и -7.

2. Геиотипировапие мышей трансгенной линии Thy ЧкВа-SL Трансгенных животных генотипировали с помощью ПЦР, которая одновременно выявляла и трансген, и его эндогенный гомолог (см. рис. 16, Б). Геномную ДНК выделяли из образца ткани уха животного с помощью набора реагентов «Direct PCR Lysis Reagent» («Viagen Biotech, Inc», Великобритания) следуя протоколу компании, и подвергали амплификации методом ПЦР (Thermo-start High Performance PCR Master Mix («Abgene», Великобритания)) (праймеры: 5'-TTGCCTGTGAGCAGGGCTGCCT-3' (Pr-1, forward) и 5 '-GTCAGCTGGCCCAGCTGCTGCT-3 ' (Pr-2, reverse), режим нагрева: однократно 95 °С в течение 15 мин и 30 циклов 95 °С - 30 с, 60 °С -30 с и 72 °С - 90 с).

3. Анализ экспрессии трансгена.

3.1. Метод ПЦР с предварительным использованием обратной транскрипции (Reverse Transcription, RT-PCR). Экспрессию трансгена 1кВа-S1 выявляли в различных тканях методом ПЦР с предварительным использованием обратной транскрипции. Общую РНК выделяли методом с применением тризола (Trizol method, «Life Technologies», GibcoBRL), следуя протоколу производителя. В частности, 25 нг общей РНК подвергали обратной транскрипции с использованием фермента обратной транскриптазы (ImPromll Reverse Transcriptase) (протокол «Promega», Великобритания). В реакционную смесь вносили праймеры, специфические к последовательности человеческого 1кВа-трансгена: 5'-GGGAGGGAGTCAGCTGACCG-3' (прямой) и 5'-AGGGCTGCCTGGCCAGCTTG-3' (обратный), режим ПЦР: 95 °С - 15 с, 60 °С - 30 с и 72 °С - 1 мин, 30 циклов. В качестве позитивного контроля использовали ген GAPDH (5 '-TGAAGGTCGGTGTGAACGGAT-TTGGC-3' (forward) и 5'-GCTAAGCAGTTGGTGGTGАС-3' (reverse).

3.2. Метод гибридизации in situ ( in situ hybridization). Экспрессию трансгена IkBu-SI в нервной системе определяли методом гибридизации радиоактивно меченной пробы на криостатных срезах in situ (in situ hybridization), как описано Michael с соавторами (1997). Олигонуклеотидная проба 5'-AGGCGTAGTCGGGGACGTCGTAGGGGTA-GTCCAT-3' была создана комплементарной к НА (гемагглютинин)-эпитопу tag (НА epitope tag) lKBa-SI-трансгена и была мечена по 3'-концу с помощью "S-dATP (Dupont

NEN, Wilmington) и фермента терминальной трансферазы (terminal transferase («Promega», Великобритания) со специфической активностью ~5000 Ci/ммоль.

После гибридизации срезы промывали 2 раза по 15 мин при комнатной температуре в 2х SSC, 2 раза при 50 °С в lx SSC и 1 раз при 50 °С в 0,2х SSC, затем дополнительно в течение 2 часов в lx SSC при комнатной температуре. После этого их дегидратировали в этаноле и погружали в авторадиографическую эмульсию (Amersham LM1) и экспонировали в течение 4-8 недель. После этого срезы окрашивали толуидиновым синим, дегидратировали и покрывали покровными стеклами.

3.3. Экспрессию IxBa-St протеина в экстрактах спинного мозга определяли методом вестерн-блот-анализа, как описано Voll с соавторами (2000), используя антитела к 1кВа (С21, «Santa Gruz», США) в разведении (1:100).

Анализ периферических сенсорных функций. Температурную чувствительность анализировали с применением теста Харгривса (the Hargreaves test). Тестируемую мышь помещали в индивидуальный пластиковый ящик с выдвигающимся пластиковым полом и оставляли акклиматизироваться в течение 30 минут перед тестом. Источник тепла помещали под пол ящика непосредственно под подошвенную область задней конечности мыши. Время, проходящее до того, как животное отдергивало конечность от источника тепла, измерялось с помощью цифрового таймера. Отсутствие рефлекса в течение 15 с и более расценивали как ошибку ответа вследствие перемещения источника.

Чувствительность к холоду анализировали методом нанесения капли ледяного ацетона на заднюю конечность и определения времени до ответной реакции. Каждую конечность тестировали 3 раза с интервалом 5 минут; затем рассчитывали среднюю величину времени латентного периода.

Тактильную чувствительность оценивали с помощью калиброванных волосков по методу фон Фрея (von Frey hairs - VFH). Тестируемую мышь помещали в индивидуальный прозрачный ящик с ячеистым полом, обеспечивающим свободный доступ к конечностям, и оставляли в покое на 30 минут для акклиматизации. Порог восприятия тактильного стимула определяли путем измерения величины приложенной силы, вызывающей отдергивание конечности тестируемого животного. Если ответа не наблюдалось, что силу VFH увеличивали до тех пор, пока животное не начинало реагировать. Каждую конечность тестировали 3 раза с интервалом 2 минуты, после чего рассчитывали среднюю величину приложенной силы, вызывающей рефлекс отдергивания конечности.

Оценка численности нейронов спинномозговых узлов. У животных после ламинэктомии выделяли спинальные ганглии на уровне Ly, фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали и заливали в парафин. Каждый восьмой серийный срез (толщина 4 мкм) окрашивали метиленовым синим, подсчитывали количество чувствительных нейронов с видимыми ядрышками, как описано в работе Holmes с соавторами (2000).

Трансгенная линия репортерных мышей NF-KB/LacZ

Трансгенная линия репортерных мышей NF-KB/LacZ была создана и любезно предоставлена профессором Филипом Баркером (Мак-Гил Университет, г. Монреаль, Канада) и описана ранее в работе Bhakar с соавторами (2002). Данные трансгенные репортерные мыши показывали конститутивную активность NF-кВ в ЦНС как в период эмбрионального развития, так и в зрелом возрасте (Bhakar et al., 2002).

Для генотипирования NF-xrB/LacZ-мышей геномную ДНК выделяли из образцов хвостов трансгенных мышей по методике, предоставленной компанией-производителем набора для выделения ДНК («Sigma», Великобритания). Трансгенных мышей, несущих конструкцию, описанную выше, идентифицировали методом ПЦР. Для реакции использовали праймеры к определенным участкам гена lacZ и следующим нуклсотидным последовательностям: к участку 595-572 (CTTCCAGATAACTGCCGTCAC-ТСС) и к участку 70-92 (CTTAATCGCCTTGCAGC АСАТСС).

Определение р-галактозидазы в тканях и первичной культуре чувствительных нейронов трансгенных репортерных мышей NF-KB/LacZ проводили методом окраски с X-gal, используя протокол, описанный в работе Bhakar с соавторами (2002).

Гистохимический анализ спинномозговых ганглиев

Спинальные ганглии Lv анализировали для подсчета количества нормальных и апоптических нейронов методом TUNEL (the doxynucleotidyl transferase dUTP nick end-labelling), используя набор реактивов и методику компании «Promega» (Великобритания).

Для детекции нейрональных антигенных маркеров использовали антитела к NPY (Affmiti Nal233, разведение 1:2000) и к CGRP (Affiniti, CAI 134, разведеиие 1:3000).

Для анализа ядерной локализации NF-кВ срезы спинальных ганглиев и культуру нейронов фиксировали с помощью параформальдегида (4%) и иммунногистохимшо проводили согласно протоколу, описанному Herrmann с соавторами (2005), с использованием моноклональных специфических антител к субъединице р65 (Chemicon, МАВ3026) и вторичных ослиных антимышиных антител, связанных с FITC (fluorescein isothiocyanate) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Для контроля специфичности антител одну серию срезов окрашивали в отсутствие первичных антител, которые были заменены раствором фосфатного буфера (PBS).

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку данных проводили в парных выборках, применяя t-критерий Стыодента или two way ANOVA (GraphPads Prism). Для анализа использовали данные 4-6 независимых экспериментов. Различия считали достоверными при р<0,05, п - число независимых экспериментов. В таблицах и на графиках данные представлены в виде М ± т, где М - среднее значение, га - ошибка среднего значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

J, Анализ экспрессии NF-кВ-зависимых генов в спинномозговых ганглиях in vivo и in vitro

Наиболее распространенный метод изучения активности сигнального каскада NF-кВ - измерение уровней мРНК генов, содержащих NF-kB-рвязывавдщие сайты на промоторах. Анализ экспрессии генов, которые регулируются данным транскрипционным фактором, позволит понять, как функционируют сигнальные пути NF-кВ и, возможно, обнаружить связи с другими сигнальными каскадами.

Методом количественной ПЦР в реальном времени была изучена экспрессия двух генов, которые известны как NF-кВ-зависимые в различных типах клеток. Один из генов - 1кВа, цитоплазматический ингибитор, который играет значимую роль в регуляции активности NF-кВ. Другой ген -МСР-1 (monocyte chemoattractant protein-1 - протеин хемоатгракции моноцитов 1) - важный участник воспалительного процесса после травмы периферического нерва (Subang, Richardson, 2001).

Для анализа экспрессии данных генов экстракцию РНК производили из спинальных ганглиев Liy-Ly взрослых крыс, взятых в период от б часов до 8 дней после перерезки периферического нерва, а также из чувствительных нейронов, культивированных в течение 16 часов и стимулированных добавлением в питательную среду TNF-a в концентрации 10 нг/мл в течение от 10 минут до 2 часов. РНК была подвергнута обратной транскрипции, и число образованных копий мРНК 1кВа и МСР-1 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени (quantitative Real-Time PCR). Контролем служила lSS-рибосомальная РНК (18S-pPHK).

Было обнаружено, что in vivo после травмы периферического отростка и in vitro после стимуляции TNF-a - активатором NF-кВ в различных типах клеток нейроны спинальных ганглиев экспрессируют NF-кВ-зависимые гены, такие, как МСР-1 и 1кВа. Однако профиль изменений экспрессии этих NF-кВ-зав'исимых генов и аккумуляции их мРНК в спинальных ганглиях был различен как после перерезки нерва in vivo, так и в культуре нейронов спинальных ганглиев после стимуляции их TNF-a in vitro.

После перерезки седалищного нерва повышенный уровень экспрессии МСР-1 мРНК наблюдался в поврежденных спинномозговых узлах уже к первым 6 часам после травмы и достигал максимальной величины, в 5 раз превышающей уровень экспрессии в контралатеральных узлах через 12 часов после аксотомии. Однако лишь двукратное увеличение уровня экспрессии 1кВа мРНК наблюдалось в узлах через 24 часа после аксотомии.

Синтез и аккумуляция МСР-1 мРНК при TNF-a-стимуляции культуры спинномозговых нейронов были также более быстрые и интенсивные, чем 1кВа мРНК при тех же условиях. Инкубация чувствительных нейронов в течение 1 часа с TNF-a повышала уровень 1кВа мРНК в 5 раз, тогда как МСР-1 мРНК в 10 раз в сравнении с нестимулированными нейронами.

Таким образом, наши данные показывают, что изменения 1кВа и МСР-1 мРНК имеют различную динамику в постгравматических спинальных ганглиях и в культуре чувствительных нейронов после TNF-a-стимуляции. Это отражает тот факт, что активирующиеся в клетке сигнальные каскады, которые регулируют экспрессию NF-кВ-зависимых генов, возможно, различаются в условиях in vivo и in vitro. В научной литературе отмечается, что временные промежутки до начала индукции разных NF-кВ-зависимых генов неодинаковы (Saccani et al., 2001). Это может отражать факт участия других транскрипционных факторов, кофакторов или изменений конформации хроматина, специфичных для активации каждого промотора.

2. Анализ ДНК-связывагощей активности NF-кВ в зрелых чувствительных нейронах крысы в ответ на TNF-a-стимуляцию in vitro и после перерезки периферического нерва in vivo Одновременно с изучением изменения экспрессии NF-кВ-зависимых генов был проведен анализ способности транскрипционного фактора NF-kB соединяться с фрагментами ДНК, несущими специфическую консенсусную последовательность нуклеотидов, что характеризует активность транскрипционного фактора и рассматривается как потенциальная способность активизировать экспрессию зависимых генов.

Активация NF-кВ в зрелых чувствительных нейронах крысы в ответ на TNF-a-стимуляцию была исследована в экстракте ядерных белков методом сдвига электрофоретической подвижности фрагментов ДНК в геле (EMSA - electrophoretic mobility shift assay). Метод EMSA позволяет определить способность белков связываться с ДНК и характеризует их транскрипционную активность. Первоначально он использовался для кинетической характеристики очищенных прокариотических транскрипционных факторов (Garner, Revzin, 1981) и в последующем был значительно модифицирован для идентификации ДНК-связывающих белков, присутствующих в целом ядерном экстракте. В основе метода лежат 2 принципа электрофореза через низкомолекулярный полиакриламидный гель: во-первых, неприсоединенные фрагменты ДНК мигрируют быстрее, чем ДНК-белковые комплексы, и, во-вторых, последние стабилизируются при прохождении через гель, что позволяет отследить даже нестабильные комплексы с коротким периодом полураспада (half-lives).

Месторасположение комплекса радиоактивно меченной ДНК с присоединенным белком визуализируется путем авторадиографии. Если белок не присоединился к радиоактивно меченной пробе, последняя будет двигаться сквозь гель быстрее и определится внизу него. В случае если образовались ДНК-белковые комплексы, они будут выявляться ближе к верхней части геля ввиду их медленной миграции. Так как миграция комплексов в целом определяется мобильностью белка, многочисленные белковые комплексы из единого ядерного экстракта, которые присоединяются к одной пробе, могут быть разделены методом EMSA. Более того, компетитивный контроль (competition assays) позволяет определить

специфичность присоединения белков к определенной нуклеотидной последовательности. Для этого в реакционную смесь добавляют избыток немеченых «холодных» олигонуклеотидов, к которым присоединяются белки, и радиоактивно меченный комплекс при этом не выявляется.

Для контроля и идентификации комплексов NF-кВ-ДНК был проведен EMSA селезенки и мозга зрелых крыс. NF-кВ имеется в цитоплазме в неактивной форме в большинстве клеток, однако его высокая конститутивная активность определяется в ядрах различных клеток иммунной системы и иммунокомпетентных органов (Baeuerle, Henkel, 1994; Li, Verma, 2002). Высокий уровень NF-кВ-активности также описан в нейронах различных регионов мозга, особенно гиппокампа, коры мозга, зернистого слоя мозжечка (Kaltschmidt et al., 1994), причем максимальный фиксиров;шся в поздний пренатальный и ранний постнатальний периоды (Schmidt-Ullrich et al., 1996). Как и ожидалось, EMSA-анапиз ядерного экстракта селезенки крыс выявил интенсивную полосу комплекса NF-кВ-ДНК (рис. 1, дорожка 1).

Мы также обнаружили более высокий уровень. NF-кВ-ДНК-связывающей активности в экстракте коры мозга (рис. 1, дорожка 2), чем в экстракте интактных спинномозговых ганглиев (рис. 1, дорожка 4). Интересно, что профиль EMS А мозга 1-дневных крысят отличался от полученного для зрелой кортикальной ткани и выявил мощную экстраполосу комплекса NF-кВ-ДНК (рис. 1, дорожка 3). Этот комплекс был полностью нивелирован добавлени-ем в 25-кратном молярном избытке немеченых «холодных» консенсусных ДНК-олигонуклеотидов к NF-кВ (рис. 2, дорожка 9). Причем добавление немеченых ДНК-олигонуклеотидов к АР-1 при тех же условиях не оказало никакого эффекта на проявление NF-кВ-ДНК-комплекса (рис. 2, дорожка 10), что доказывает образование этого комплекса именно ДНК-олигонуклеотидами к NF-kB.

В качестве позитивного контроля NF-кВ-ДНК-связывающей активности использовался экстракт ядерных белков, выделенных из культуры клеток линии 293Т, стимулированных TNF-a в концентрациях 20 или 100 нг/мл (рис. 1, дорожки 5-7).

На следующем этапе изучался эффект перерезки седалищного нерва на NF-кВ-ДНК-связывающую активность в нейронах люмбальных спинальных ганглиев методом EMSA после 6 часов аксотомии. Для получения одного ядерного экстракта ганглии Ljv-Lv были выделены у крыс и объединены вместе следующим образом: 1 - шесть ганглиев, относящихся к перерезанному нерву (ипсилатеральные); 2 - шесть ганглиев относящихся к интактному нерву (контралатеральные); 3 - шесть ганглиев контрольных животных.

Сгруппированные ганглии подвергались гомогенизированию в низкосолевом буфере с помощью гомогенизатора. Клеточные гомогенаты ипсилатерапьных, контралатеральных и контрольных ганглиев были лизированы с использованием ядерного экстракционного буфера и затем анализировались методом EMSA для выявления специфического присоединения NF-кВ к консенсусным ДНК-олигоуклеотидам.

293Т-клетки/Г NF- «

С М N11 СГ _ 20 100

Рис. 1. EMSA-анализ ДНК-связывающсй активности NF-кВ в различных тканях крысы. Дорожка 1 - ядерный экстракт селезенки; 2 - коры мозга; 3 - мозга 1-дневных крысят; 4 - интактных спинномозговых узлов; дорожки 5-7 - EMSA-анализ ядерного экстракта культуры клеток линии 293Т, стимулированной TNF-a in vitro 10 минут в указанной концентрации: дорожка 5 - иестимулированная культура, дорожка 6-20 нг/мл, дорожка 7 - 100 нг/мл. Позиция комплекса NF-кВ-ДНК обозначена стрелкой. Позиция TNF-a-индуцированного экстракомплекса NF-кВ-ДНК в культуре клеток 293Т обозначена треугольником

"холодные"

олкго 2f™

СГ ипсилат СГ контра

нг-*в am - hf-чв afl

Мозг 1 Iff-кв AT I

Рис. 2. Конкурентный анализ 1\Р-кВ-ДНК-комплексов спинальных ганглиев крыс после аксотомии. Ядерный экстракт был выделен из спинальпых ганглиев через 6

часов после перерезки седалищного нерва. ДНК-связывающая активность ОТ-кВ анализирована методом ЕМ.ЧА. Пробоспецифичность комплексов определялась путем инкубации реакционной смеси с копсенсуснымпи «холодными» немечеными олигонуклеотидами к ОТ-кВ или АР-1, добавленными в соответствующие пробы в 25-кратном превышении концентрации, «холодные» олиго 25х - 25-кратный молярный избыток немеченых «холодных» ЫР-кВ или АР-1 олигонуклеотидов. Дорожка 1 -негативный контроль в отсутствии ядерного экстракта, дорожки 2-4 (СГ ипсилат) -ядерный экстракт спинальных ганглиев со стороны поврежденного нерва, дорожки 5-7 (СГ контра) - спинальные ганглии с неповрежденной контралатеральной стороны, дорожки 8-10 (мозг 1) - ядерный экстракт мозга новорожденных крысят. Позиция кВ-ДНК-комплекса обозначена стрелкой

На полученных авторадиограммах проявилась достаточно выраженная полоса задержки в геле комплекса NF-кВ-ДНК в ядерных экстрактах как из ипсилатеральных, так и из контралатеральных ганглиев (рис. 3, дорожки 6, 7, 9, 10). Только очень бледная полоса визуализировалась на этой же позиции в экстрактах, полученных из ганглиев интактных животных (рис. 3, дорожки 5, 8).

Специфичность NF-кВ-ДНК-комплексов, образующихся после перерезки нерва (рис. 2, дорожки 2, 5), была подтверждена вытеснением радиоактивно меченных олигонуклеотидов и нивелированием специфической полосы задержки в геле комплекса NF-кВ-ДНК уже при 25-кратном молярном избытке немеченых «холодных» консенсусных ДНК-олигонуклеотидов к NF-кВ (рис. 2, дорожки 3, 6). Причем добавление немеченых ДНК-олигонуклеотидов к API при тех же условиях не повлияло на проявление полосы NF-кВ-ДНК-комплекса (рис. 2, дорожки 4,7).

Для изучения влияния TNF-a на способность NF-кВ присоединяться к ДНК чувствительные нейроны зрелых крыс культивировали в течение 16 часов и стимулировали добавлением в питательную среду TNF-a в концентрации 30 нг/мл в течение 10, 20 и 30 минут. После этого нейроны вместе с питательной средой переносили в центрифужную пробирку и осаждали центрифугированием. Затем осадок промывали PBS, ресуспендировали в низкосолевом буфере и лизировали, используя ядерный экстракционный буфер. Полученный ядерный экстракт анализировали методом EMS А на специфическое присоединение NF-кВ к ДНК. Рис. 15 дорожка 1 иллюстрирует, что EMSA экстракта ядерных белков культуры чувствительных нейронов выявил одиночную полосу задержки в геле, сходную с той, что наблюдалась в интактных спинальных ганглиях in vivo, но большей интенсивности. Инкубация с TNF-a значительно повысила ДНК-связывающую активность NF-кВ уже через 10 минут. Однако 20-минутная инкубация приводит к снижению интенсивности проявления полосы, а 30-минутная - к максимальному проявлению полосы задержки в геле NF-kB-ДНК-комплекса (рис. 3, дорожки 2,3,4).

Таким образом, полученные нами результаты EMSA свидетельствуют о том, что зрелые чувствительные нейроны в интактных люмбальных спинальных ганглиях in vivo имеют очень низкую NF-кВ-ДНК-связывающую активность (Wood, 1995; Fernyhough et al., 2005). Это указывает на отсутствие необходимости участия NF-кВ во внутриклеточных механизмах, поддерживающих жизнеобес-печение нейронов в норме. В противоположность этому показано, что кортикальным нейронам и нейронам гиппокампа для выживания необходимо присутствие активного NF-кВ (Bhakar et al., 2002). Мы также определили более высокий уровень NF-kB-ДНК-связывающей активности в интактной кортикальной ткани, чем в интактных спинальных ганглиях. В некоторых работах выявлено, что пик активности NF-kB приходится на поздний постнатальный и ранний пренатальный периоды (Schmidt-Ullrich et al., 1996), что коррелирует с полученными нами данными EMSA мозга однодневных крысят.

Наши результаты показали, что уже через 6 часов после перерезки седалищного нерва ДНК-связывающая активность МР-кВ была заметно увеличена в поврежденном ганглии. Однако уже к этому времени выявлялась менее интенсивная полоса задержки в геле комплекса ОТ-кВ-ДНК в неповрежденном контралатеральном ганглии, что свидетельствует о паракринном эффекте. В отдельных работах также отмечены раннее повышение ДНК-связывающей активности ЫР-кВ в модели передавливания нерва и проявление паракринного эффекта к 24 часам после травмы (РегпуЬо^Ь а а1., 2005).

Ч*ль»ур» и«*кмое /ГЛГ-я пер«р»жа мера»

1*34 5 « Т » 9 10

Рис. 3. ДНК-связывающая активность №-кВ в культуре чувствительных нейронов и сшшальном ганглии после перерезки периферического нерва. Дорожки 1-4: ЁМЭА-анализ ДНК-связывающей активности ЫР-кВ в культуре чувствительных нейронов после обозначенного времени инкубации с ТЫР-а (30 нг/мл). Ядерный экстракт был выделен из культуры спинномозговых нейронов, стимулированных ЮТ-а в течение обозначенного времени (10-30 минут). Дорожка 1 - нестимулированная культура чувствительных нейронов; 1 мкг общего протеина использовался для ЕМвА. Дорожки 5-10; ДНК-связывающая активность ОТ-кВ через 6 часов после повреждения седалищного нерва. Ядерный экстракт был выделен из спинальных ганглиев Ь^-Ьу через 6 часов после перерезки седалищного нерва, и ДНК-связывающая активность №-кВ анализирована методом ЕМ8А. Количество общего протеина ядерного экстракта, взятого для анализа: дорожки 5-7: 1 мкг, дорожки 8-10: 2 мкг. п - ядерный экстракт интактных неоперированных спинальных ганглиев, 1 - ипсилатерапьных спинальных ганглиев со стороны поврежденного нерва, с - контралатеральных спинальных ганглиев с неповрежденной стороны. Позиция ЫР-кВ-ДНК-комплекса обозначена сгрелкой

В ходе экспериментов мы обнаружили, что в экстракте ядерных белков чувствительных нейронов, культивируемых в течение 17 часов, полоса ДНК-связывающей активности №-кВ характеризовалась более высокой интенсивностью, чем в интактных спинальных ганглиях. Последующая инкубация с ТОТ-а повышала интенсивность полосы через 10 минут с максимумом проявления через 20 минут.

Выделение спинальных ганглиев и диссоциация нейронов во время процедуры культивирования могут имитировать в какой-то

степени аксотомию и запускать сходные молекулярные процессы, включая изменение ДНК-связывающей активности NF-кВ в культуре чувствительных нейронов. Цитокин TNF-a является потенциальным активатором NF-кВ в различных типах клеток (Baldwin, 1996; Barger et al., 2005). Показано, что после травмы периферического нерва IL-6 мРНК аккумулируется в популяциях средних и крупных нейронов с последующим выявлением в них же протеина TNF-a (Murphy et al., 1995; Schafers et al., 2003). Более того, рецепторы к TNF - TNFR1 и TNFR2 - выявлялись на зрелых чувствительных нейронах интактных спинальных ганглиев (Shubayev, Myers, 2001).

Метод EMSA широко используется для изучения активности регуляторных- элементов генов, которые распознаются и связываются специфическими транскрипционными факторами. Следует, однако, отметить, что этот метод не в состоянии показать, способен ли изучаемый фактор на самом деле активировать транскрипцию, так как большинство из них обычно подвергаются дополнительной модуляции уже после того, как связываются с ДНК, в том числе NF-кВ (Vermeiden et al., 2002).

Таким образом, полученные нами данные EMSA свидетельствуют, что ДНК-связывающая активность NF-кВ в ядерных экстрактах спинальных ганглиев усиливается после перерезки седалищного нерва и TNF-a-стимуляции. Однако в связи с тем, что в последнее время появились работы, в которых говорится об изменении транскрипционной активности NF-кВ даже при неизменной способности связываться с ДНК, требуются дополнительные исследования функциональной роли NF-кВ в чувствительных нейронах. Результаты EMSA недостаточны для подтверждения способности NF-кВ активировать транскрипцию генов, так как для этого необходимы дополнительные модификации фактора(ов) как до, так и после присоединения к ДНК (Saha et al., 2007), а также взаимодействия NF-кВ с дополнительными протеинами - коактиваторами и корепрессорами (Ashburner et al., 2001).

Для того чтобы показать транскрипционную активность NF-кВ in vivo и выяснить его биологическую роль, необходимо создание экспериментальной генетически модифицированной модели для изучения сложнорегулируемого сигнального каскада NF-kB.

3. Изучение роли NF-кВ в чувствительных нейронах на трансгенной линии мышей Thy*lKBa-SI

Для изучения функционального значения NF-кВ в зрелых чувствительных нейронах \п vivo мы создали трансгенную линию мышей Thy*ÍKBa-SI, нейроны которых специфически экспрессируют

суперингибитор NF-кВ - ГкВа-SI, являющийся мультимутантной формой ингибиторного протеина 1кВа (Voll et al., 2000) (рис. 4).

569 nt

А нейрон-специфический энхансер 5? .-1-,т

I If

Thy-1.2: |

«Из

Р: кодирующий участок

ЭКЗОНЫ

bcBct-SI:

260 nt 104 nt

369

—Y~~

733 nt

733

НшкВа

геномный локус

Рнс. 4. Создание генетической конструкции Thy*lKBa-SI. А - схема полученной генетической конструкции Thy*lKBa-SI для генерации трансгенных животных. Мышиная ТЬу-1.2-трансгенная кассета содержит си-действующий элемент для нейрон-специфической экспрессии после 8-го дня постнаталыюго периода (Caroni, Becker, 1992). Двойными стрелками показаны замещенные аминокислоты в мутантной форме 1кВа -IfcBa-SI. НА - гемагглютинина tag; Б - генотипирование трансгенных мышей. Рг-1 и Рг-2 -праймеры, амплифицирующие фрагмент трансгена (369 п.н.) и мышиного геномного 1кВа (733 п.н.)

Мощный гранедоминантный ингибитор IicBa-SI был использован для целенаправленной экспрессии в зрелых нейронах трансгенных животных (tg) и ингибирования в этих клетках активности NF-кВ. В мутантной форме 1кВа серия аминокислот, чувствительных к сигналам для убиквитинирования, фосфорилирования и тирозин-фосфорилирования, замещена нечувствительными аминокислотами (рис. 4, А). Эта форма протеина не подвержена деградации и действует как суперрепрессор NF-кВ-активности, удерживая и изолируя в цитоплазме каждый NF-KB/RelA-комплекс, предотвращая связывание с ДНК и активацию транскрипции. NF-кВ-суперингибитор -iKBa-SI был включен в Xhol-сайт специфической нейральной Thy-1.2-кассеты (Caroni, 1997) для последующей генерации трансгенных мышей линии Thy*lKBa-SI.

Экспрессия 7Ъу-1.2-кассеты, извлеченной из мышиного гена Thy-1.2 (Gordon et al., 1987) обнаруживает мощную экспрессию трансгена специфически в нейронах зрелых трансгенных животных. Мышиная трансгенная кассета Thy-1.2 (рис. 4, А) содержит содействующий элемент (c/i-acting elements) для нейрон-специфической экспрессии после 8-го дня постнатального периода, и поэтому экспрессия трансгена начинается на 9 -10-й день постнатального развития.

Известно, что интенсивность экспрессии трансгена под влиянием Thy-1.2-промотора может варьировать между несколькими трансгенными линиями мышей, вероятно, в результате воздействия ядерного генетического окружения на трансгенную конструкцию. Таким образом, по степени проявления экспрессии нейроны могут быть разделены на несколько групп. В одной группе значительная экспрессия трансгена наблюдалась во всех тестируемых линиях мышей, в другой - зависела от трансгенной линии. Однако в большинстве таких линий с использованием ТЬу-1.2-кассеты обнаруживается достаточно генерализованная экспрессия в нейронах. Эти свойства могут использоваться для изучения эффекта трансгена в нервной системе в позднем периоде развития и в зрелом состоянии. В том числе появляется возможность анализировать эффекты различных комбинаций экспрессирующих и неэкспрессирующих нейронов трансгенных животных, взятых от нескольких линий (Caroni, Becker, 1992).

Полученную конструкцию - Thy*lKB<x-SI — использовали для генерации трансгенных животных путем пронуклеарной микроинъекции эмбрионов гибридной линии CBAxC57BL/10 (Fl). Все эксперименты были проведены с линией Tg(ThymutIkB)74-3. Трансгенные животные определялись с помощью ПЦР, которая выявляла позитивных и негативных особей с использованием одной пары праймеров (рис. 4, Б). Эти праймеры амплифицировали фрагмент длиной 733 пар нуклеотидов (п.н.) мышиного эндогенного геномного 1кВа-локуса, содержащего экзоны III и IV кодирующего участка, а также интроны. Эти же праймеры соответствовали кодирующему участку человеческого lKBa-SI-трансгена, в котором интроны были удалены, и поэтому у позитивных мышей амплифицируемый фрагмент был короче (369 п.н.).

3.1. Анализ экспрессии IicBa-SI в трансгенной линии мышей. Был проведен молекулярный анализ генерированных трансгенных животных линии Tg(Thy-mutlKB)74-3 для того, чтобы определить, действительно ли трансген и его продукт (белок IicBa-SI) экспрессируются в нервной системе, в частности в зрелых нейронах спинномозговых ганглиев.

Во-первых, методом ПЦР с предварительным использованием обратной транскрипции (RT-PCR) было показано, что трансген экспрессируется только в нервной системе (головной мозг, мозжечок, спинной мозг и спинномозговые ганглии).

Затем методом вестерн-блот-анализа была изучена экспрессия продукта встроенного трансгена в экстрактах спинного мозга с использованием антител, специфичных к 1кВа, позволяющие отличить

эндогенную форму 1кВа от ее мутантной формы (IkBo-SI). Результаты анализа показали, что протеин, соответствующий размеру IicBa-SI, выявлялся в экстрактах спинного мозга у животных трех трансгенных линий. Это доказывает, что данные животные несут активно экспрессирующийся трансген.

3.2. Гибридизация In situ. Вестерн-блот-анализ и ПЦР с предварительным использованием обратной транскрипции (RT-PCR), подтвердившие экспрессию трансгена, проводились на гомогенатах целых органов трансгенных животных (головной мозг, спинной мозг, спинальный ганглий) и не позволяли выяснить, экспрессируется ли интересую-щий нас трансген строго в нейронах или также в других ненейрональных клетках. Для ответа на этот вопрос, а также для того, чтобы сравнить трансгенные линии и выбрать более подходящую для наших целей, была проанализирована экспрессия трансгена в нервной системе двух полученных трансгенных линий Tg(Thy-mutlKB)74-3 и Tg(Thy-mutIicB)74-5 методом гибридизации in situ (in situ hybridisation).

Гибридизация in situ была выполнена на криостатных срезах органов трансгенных животных двух полученных линий. Этот метод позволяет локализовать положение мРНК в цитоплазме клеток и дает возможность получить четкую морфологическую картину распределения продукта экспрессии трансгена (мРНК) в популяциях клеток этих трансгенных линий. Криостатные срезы нервной ткани (головной мозг, спинной мозг и спинальные ганглии) были подвергнуты гибридизации с "Б-дАТФ-радиоактивно меченной олигонуклеотидной пробой (35S-dATP radiolabeled oligonucleotide probe), специфичной к трансгену. Благодаря характеристикам трансгенной конструкции этот метод позволяет определить транскрипционную активность трансгена.

Гибридизация in situ показала, что обе линии имеют обширную экспрессию трансгена в нейронах, однако, с индивидуальными особенностями. В линии 5 отмечается высокая степень экспрессии в ограниченном количестве нейронов. Значительное сосредоточение гранул серебра было обнаружено в некоторых мотонейронах спинного мозга, в популяции крупных нейронов спинальных ганглиев (рис. 5), в CAI- и САЗ-зонах гиппокампа и зубчатой извилине, а также в небольшом количестве нейронов коры мозга. В других нейронах экспрессия либо слабо проявлялась, либо полностью отсутствовала.

Линия 3 демонстрировала высокую экспрессию трансгена примерно одинаковой выраженности во всех типах нейронов. В частности, гранулы серебра были сосредоточены во всех нейронах головного и спинного мозга, а также во всех популяциях нейронов спинального ганглия (рис. 6). Большое значение имеет следующее наблюдение: в нервной системе не было обнаружено ненейрональной экспрессии трансгена. Негативные образцы включали клетки глии, входящие в состав периферического нерва, и клетки белого вещества ЦНС. Это доказывает, что экспрессия Thy*lKBa-SI-Tpaiicrena специфична и ограничена нейронами.

Рис. 5. Гибридизация in situ срезов спинномозгового ганглии мышей трансгенной линии Tg(Thy-mutrKB)74-5. Криосгатные срезы спинномозгового ганглия мышей были подвергнуты гибридизации с 355-дАТФ-радиоактишю меченной слигонуклеотидной пробой, специфичной к трансгену. А, Б - срез спинномозгового ганглия в светлом поле (А) и (Б) поляризационной эпифлюоресценции. В, Г - увеличенный участок тела нейрона с гранулами серебра в светлом поле (В) и при поляризационной эпифлюоресценции (Г). Отмечается концентрация гранул серебра в ограниченной группе нейронов. Множество нейронов не показывают экспрессии трансгена

Для контроля результатов гибридизация in situ была; выполнена на образцах ткани, взятой от линии мышей дикого типа (wt). В этом случае на препаратах отмечались лишь низкий радиоактивный фон и гомогенно распределенные гранулы серебра, которые не были связаны с конкретными клетками и покрывали равномерно весь образец ткани (рис. 7).

Основываясь на полученных результатах, все дальнейшие эксперименты были выполнены на трансгенной линии мышей Tg(Thy-тиНкВ)74-3 как наиболее отвечающей целям и задачам данной работы.

Рис. 7. Гибридизация in situ срезов спинномозгового ганглия мышей дикого типа.

Криостатные срезы спинномозгового ганглия мышей были подвергнуты гибридизации с 338-дАТФ-радиоактивно меченой олигонуклеотидной пробой, специфичной к трансгену. А, Б - срез спинномозгового ганглия в светлом поле (А) и при поляризационной эпифлюоресценции (Б). Отмечается гомогенное распределение гранул серебра, не связанных с клетками

Рис. 6. Гибридизация in situ срезов спинномозгового ганглия мышей трансгенной линии Tg(Thy-mutlKB)74-3.

Криостатные срезы спинномозгового ганглия мышей были подвергнуты гибридизации с 358-дАТФ-радиоактивно меченой олигонуклеотидной пробой, специфичной к трансгену. А, Б - срез спинномозгового ганглия при

поляризационной эпифлюресценции (А) и светлопольной микроскопии (Б); В -увеличенный участок спинального ганглия с гранулами серебра в телах нейронов. Отмечается концентрация гранул серебра во всех группах нейронов. Практически все нейроны имеют высокий уровень экспрессии трансгена

33. Влияние Thy*lKBa-SI трансгена на выживаемость и физиологические функции зрелых нейронов спинальных ганглиев В данной часта работы была проведена оценка численности нейронов спинальных ганглиев трансгенных'животных в сравнении с диким типом. Был произведен подсчет общего количества нейронов в спинальном ганглии на уровне Lv и выполнен иммуногистохимический анализ нейронов спинальных ганглиев с применением антител к широко распространенному белку CGRP для оценки CGRP+-HeñponoB у трансгеннных животных в сравнении с диким типом, как описано ранее (Holmes et al., 2000; Shi etal., 2001). Результаты подсчета показали, что количество чувствительных нейронов, экспрессируемых CGRP, общего количества, нейронов в , спинальном ганглии не были изменены у трансгенных животных. ' ' В заключение были исследованы основные функции чувствительных

нейронов, такие, как чувствительность температурная, к холоду и тактильная у взрослых мышей трансгенной линии и дикого типа. Было показано, что • экспрессия суперингибитора NF-кВ в нейронах спинальных ганглиев не ' оказывает какого-либо эффекта на поддержание физиологических функций у мышей трансгенной линии Thy*IidBa-SI.

3.4. Ингибирование ядерной транслокации NF-kB в нейронах мышей Thy*lKBa-SI трансгеиной линии Активная форма NF-кВ локализуется в ядре, поэтому был произведен иммуногистохимический анализ с использованием моноклональных специфических антител к субъединице р65 для выявления внутриклеточной локализации NF-кВ в нейронах мышей трансгенной линии Thy*lKBa-SI. В ,. задачу данного этапа экспериментов входило выяснение влияния трансгена iKBa-SI на внутриядерную локализацию NF-кВ в нейронах спинальных ганглиев после TNF-a-стимуляции in vitro и после перерезки седалищного нерва in vivo.

При иммуногистохимическом анализе культуры нейронов спинномозговых ганглиев V внутриядерная локализация NF-кВ (р65) обнаруживалась:в небольшом количестве чувствительных нейронов мышей дикого типа (5 ,%). уже после 1-го дня in vitro и у 60 % нейронов спинальных ганглиев после TNF-a-стимуляции. Однако ядерное перемещение NF-kB, стимулированное TNF-a, подверглось значительному ингибированию в нейронах Спинальных ганглиев трансгенных животных (до 92 % нейронов) (рис. 8). '

На следующем этапе исследования ' был проведен иммуногистохимический анализ NF-кВ в спинальных ганглиях на уровне Lv через 4 часа и 1 день после перерезки периферического нерва. Полученные результаты свидетельствуют о том, что р65 перемещается в ядра примерно у 25 % нейронов спинальных ганглиев через 4 часа после аксотомии и выявляется там же через 1 день после перерезки. Оценка численности нейронов с ядерной локализацией р65 у tg- и wt-мышей до и после перерезки периферического нерва показала, что вызванное аксотомией ядерное

перемещение р65 значительно уменьшено (на 90 %) у мышей трансгенной линии (рис. 9).

Рис. 8. Ингибированис ядерного перемещения ДОР-кВ в нейронах спинальных ганглиев трансгенных мышей линии ТЬу*1кВа-81. Редукция ядерного перемещения р65 в культуре нейронов мышей трансгенной линии (1§) в сравнении с диким типом (М) после стимуляции их ТЫР-а.

Рис. 9. Редукция ядерной локализации NF-кВ в нейронах поврежденных спинальных ганглиев (инсилат) у мышей трансгснной линии (tg).

Контралат - конгралатеральные (неповрежденные) ганглии. М ± ш, где М -среднее значение, ш - ошибка среднего значения, п=6 (число животных в группах), ***р<0,001 (two way ANOVA)

3.5. Выживание нейронов спинальных ганглиев после перерезки периферического нерва у мышей трансгенной линии

Thy*lKBa-SI

Выживаемость нейронов спинальных ганглиев в условиях травмы in vivo была изучена на модели экспериментальной перерезки седалищного нерва. TUNEL-анализ был выполнен на спинальных ганглиях Lv через 2 и 14 дней после перерезки периферического нерва. Результаты анализа показали, что лишь единичные нейроны (4-5 в одном спинальном ганглии) были TUNEL-положительные. Не было выявлено значительных различий в количестве TUNEL'-нейронов в спинальных ганглиях между мышами дикого типа (wt) и трансгенными (tg) животными (рис. 10)

Выживаемость нейронов спинальных ганглиев также определяли путем оценки общего количества нейронов в спинальном ганглии. Через 2 дня после перерезки периферического нерва их число было одинаково в ганглиях, располагающихся со стороны как перерезанного, так и интактного нерва у мышей дикого типа (wt) и у трансгенных (tg) животных (рис. 11). Однако после двух недель аксотомии, общее количество нейронов уменьшилось на 25 % в спинальных ганглиях Lv как у трансгенного, так и у дикого типа мышей.

Рис. 10. Анализ количества 'ГШЕЬ-позитивных нейронов спинальных ганглиев Ьу через 2 и 14 дней после перерезки седалищного нерва у мышей дикого типа и трансгенной линии ТЬу*1кВа-81. аксот СГ -ганглии, располагающиеся со стороны перерезанного нерва, контр СГ- ипгактного нерва

аксо* СГ ■ контр СГ □

Было также произведено сравнение процентного соотношения нейронов, экспрессирующих маркеры CGRP и NPY, в спинальных ганглиях мышей дикого типа (wt) и трансгенных (tg) животных после травмы нерва. Известно, что эти нейрональные маркеры имеют различную динамику экспрессии в чувствительных нейронах после аксотомии (Shi et al., 2001). Как и ожидалось, в поврежденном ганглии количество CGRP-экепрессирующих нейронов уменьшилось, а количество NPY- - увеличилось, причем не наблюдалось различий в

распределении данных нейрональных популяций в ганглиях трансгенного (tg) и дикого типов мышей (wt) (рис.11).

Рис. 11. Анализ выживания чувствительных нейронов после травмы седалищного нерва у мышей дикого типа (wt) и трансгенной линии (tg) путем оценки общей численности нейронов спи-налыюго ганглия (СГ), процентного отношения субпонуляций CGRP- и NPY-экспрессирующих нейронов еппнального ганглия. М ± S.E.M, п=6 {число животных в группах), *** -р<0.001, * - р<0,1 (two way ANOVA)

Таким образом, для изучения функционального значения NF-кВ в зрелых чувствительных нейронах in vivo мы создали и клонировали

трансгенную линию мышей Thy*lKBa-SI, нейроны которых эксирессируют суперингибитор NF-kB - IkBo-SI. До настоящего времени это единственная трансгенная модель, в которой целенаправленно угнетается активность NF-кВ строго в зрелых нервных клетках (Memet, 2006; Pasparakis et al., 2006). Была выявлена значительная редукция ядерной транслокации NF-кВ в зрелых нейронах спинального ганглия мышей этой трансгенной линии в ответ на такие известные сигналы-активаторы NF-кВ как TNF-a (Fernyhough et al., 2005) и аксотомия (Doyle, Hunt, 1997b; Ma, Bisby, 1998). Хотя трансгенные мыши линии ТЬу*1кВа-81 показывали пониженную способность к активации NF-кВ в нейронах, подтвержденную уменьшением ядерной рб5-иммунореактивности, основные физиологические свойства чувствительных нейронов и их количество не были изменены. Это указывает на то, что NF-kB не является обязательным транскрипционным фактором для функционирования нейронов спинномозговых ганглиев в нормальных физиологических условиях.

В некоторых работах выдвинуты предположения о вовлечении NF-кВ в процессы, необходимые для выживания зрелых чувствительных нейронов после повреждения периферического нерва (Doyle, Hunt, 1997b; Fernyhough et al., 2005; Ma, Bisby, 1998). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что перерезка седалищного нерва не вызывает апоптоза в чувствительных нейронах через 2 дня после травмы в спинальных Ганглиях мышей ни дикого типа, ни линии Thy*lKBa-SI. В частности, мы показали, что одинаково небольшое количество нейронов спинномозговых ганглиев дает положительную окраску при использовании метода TUNEL как у животных дикого типа, так и у трансгенных мышей. Для контроля результатов TUNEL параллельно выполнялась окраска срезов спинного мозга, полученных после его компрессионного повреждения, которая выявила значительное количество TUNEL-положительных нейронов (Chew et al., 2008), что подтверждает достоверность реакции на срезах спинального ганглия.

Для оценки эффективности модели перерезки седалищного нерва в нашем эксперименте произведен подсчет субпопуляций нейронов спинальных ганглиев, экспрессирующих маркеры NPY или CGRP. Известно, что после периферической аксотомии количество нейронов, экспрессирующих NPY повышается, a CGRP - снижается (Holmes et al., 2000; Shi et al., 2001). Наши результаты также подтверждаются в работе, авторы которой отмечают минимальный уровень апоптической смерти нейронов в первые дни после травмы периферического нерва (Koliatsos, Price, 1996; Shi et al., 2001). Однако через 2 недели после аксотомии нами мы обнаружили значительный уровень гибели нейронов (25 %). Это несоответствие между отсутствием апоптических нейронов и уменьшением общей численности нейронов может объясняться, вероятно, очень коротким временным промежутком, в течение которого метод TUNEL способен регистрировать изменения в нейронах, или тем, что в гибели нейронов через 2 недели после аксотомии участвовали неапоптические механизмы. Вместе с тем эти изменения в количестве нейронов спинальных ганглиев были практически

одинаково выражены как у трансгенных животных, так и у мышей дикого типа. В другой работе существенное снижение общей численности нейронов было зарегистрировано в более отдаленном периоде после травмы (30-90 дней) (Рагинов, Челышев, 2003), причем степень нейронапьной гибели имела прямую зависимость от экспериментальных животных и используемой методологии (McKay et al., 2002; Pierucci, Oliveira, 2006).

Следовательно, полученные результаты не поддерживают нашу изначальную гипотезу о том, что трансгенное ингибирование ядерной транслокации NF-кВ может приводить к гибели нейронов спинальных ганглиев после аксотомии. Экспериментальные данные показывают, что NF-кВ не определяет внутреннюю устойчивость зрелых нейронов спинальных ганглиев к апоптической смерти в результате аксотомии, которая не изменилась, несмотря на трансгенное ингибирование внутриядерной транслокации NF-кВ в ответ на TNF-a-стимуляцию или травму нерва.

Наши данные косвенно подтверждаются в опубликованном в научном журнале «Nature» исследовании (Nickols et al., 2003), в котором показано, что в седалищном нерве крыс in vitro и в кокультуре шванновских клеток и чувствительных нейронов in vivo активация NF-кВ происходит параллельно с процессами миелинизации. Блокирование NF-кВ-активности в кокультуре с помощью ингибитора SN50 или использование клеток генетически модифицированных мышей сильно ингибирует миелинизацию, но при этом не выявляется высокий уровень апоптоза (методом TUNEL) несмотря на полное отсутствие миелина. Более того, обратимость процессов блокирования миелинизации после удаления из среды SN50 может поставить под сомнение наличие апоптоза в нейронах и шванновских клетах. Авторами также показано одинаковое количество нейронов в кокультуре, полученной от генотипов

р65*л, рб5"\ р65-'\ что ис-ключает возможность объяснения дефектов миелинизации различиями в способности к выживанию между нейронами дикого типа ир65'~(Nickols et al., 2003).

Предыдущие предположения о вовлечении транскрипцион-ного фактора NF-кВ в процесс выживания зрелых чувствительных нейронов были сделаны только на основе его ядерной транслокации методом иммуногистохимии и EMSA ядерного экстракта спинальных ганглиев в ответ на травму седалищного нерва (Doyle, Hunt, 1997; Fernyhough et al., 2005; Ma, Bisby, 1998). Однако в работах последних лет показано, что анализ лишь ядерной локализации NF-кВ и ее последующее связывание с фрагментами ДНК не обязательно отражают активацию именно транскрипционной активности NF-кВ. Другими словами, если NF-кВ находится в ядре и далее «села» на участок ДНК, необходимы другие компоненты и условия, чтобы этот фактор инициировал траскрипцию гена-мишени. Например, некоторые сигнальные каскады (р38МАРК) могут угнетать транскрипционную активность NF-кВ в культуре астроцитов даже без изменения его внутриядерной ДНК-связывающей активности, лишь регулируя

ацетилирование р65-субчастицы путем модулирования ацетилтрансфсразной активности рЗОО с помощью фосфорилироваиия (Saha et al., 2007). В других описанных случаях индуцированная цитокинами ДНК-связывающая активность NF-кВ может угнетать, а не активировать NF-кВ-зависимую транскрипцию (Campbell et al., 2004; Но et al., 2005).

4. Выявление транскрипционной активности NF-кВ с использованием трансгенной линии репоргерпых мышей NF-KB/LacZ

4.1. Трансгенная линия репоргерпых мышей NF-xB/LacZ. Мы оценивали транскрипционную активность NF-кВ в зрелых чувствительных нейронах, используя трансгенную линию репортерных мышей NF-KB/LacZ. Эта линия обладает способностью экспрессировать ядерную форму фермента ß-галактозидазы Е. coli, кодируемую геном lacZ, находящимся под транскрипционным контролем NF-кВ. В качестве положительного контроля акгивности ß-гапактозидазы производилась окраска срезов головного мозга, где нейроны проявляли конститутивную активность NF-kB.

4.2. Отсутствие экспрессии ß-галактозидазы в нейронах спинномозговых ганглиев после травмы периферического нерва и при экспериментальном воспалении. Параллельно с контролем для выявления активности ß-галактозидазы окрашивали спинномозговые ганглии Lv через 2 дня после перерезки седалищного нерва, ß-gal-позитивные нейроны не были обнаружены как в ганглиях, относящихся к поврежденному нерву, так и с контралатеральной (неповрежденной) стороны (рис. 12, А, Б). Тот же результат получен после анализа экспрессии гена lacZ через 7 дней после травмы.

Кроме этого, для выявления активности ß-галактозидазы мы исследовали образцы мышечной ткани, окружающей участок повреждения и проксимальный отрезок перерезанного нерва. На срезах образцов мышечной ткани, взятой на уровне верхней части бедра в участке повреждения, была выявлена яркая экспрессия репортерного гена lacZ (рис. 13, А, Б), в то время как в неповрежденной мышце на контралатеральной стороне она отсутствовала (см. рис. 13, В), ß-gal-позитивные клетки были также обнаружены в проксимальном отрезке рассеченного нерва (см. рис, 12, В).

На следующем этапе работы активность NF-кВ в нейронах спинномозговых ганглиев индуцировали путем экспериментально вызванного воспаления. Для этого в левую заднюю конечность мышей трансгенной линии NF-KB/lacZ была сделана инъекция адъюванта Фройнда (complete Freund's adjuvant). На срезах спинномозговых ганглиев и мышечной ткани задней части бедра через 2 дня после инъекции была визуализирована морфологическая картина воспаления, характеризующаяся массивной клеточной инфильтрацией. Однако даже в этом случае экспрессия репортерного гена lacZ не обнаружена в клетках спиналыюго ганглия и в нерве. Только единичные ß-gal-позитивные ядра выявлялись в бедренной мышечной ткани конечности, в которую была сделана инъекция.

икм

■ ■ * и 1

Рис. 12. Отсутствие экспрессии ¡ас/ в спинномозговых ганглиях трансгенных №-кВ/Ьас2-репортерных мышей после травмы периферического нерва.

Экспрессия репортерного гена 1ас2 отсутствует как в ганглии со стороны повреждения (Б), так и с контра-латеральной стороны (А). р-ца1-позитивные клетки выявляются в проксимальном сегменте поврежденного седалищного нерва (В); А, И - масштабная линия 50 мкм, Б - масштабная линия 25

- ~

■М

■ ;»

■

ь л О

, I '» ... ч )

V4' ■ ■ 1 ' /л

(неповрежденной) стороне; масштабная линия 10 мкм

Рис. 13. (3^а1-экспрессия в мышечной ткани нормальных и оперированных трансгенных мышей. А - мощная экспрессия репортерного гена !ас2 в мышечной ткани, окружающей участок повреждения в верхней части бедра; масштабная линия 50рт. Б - большое увеличение участка мышцы, показывающее яркое |3-§а1-окрашивание в ядрах поврежденной мышечной ткани,

обозначенной в рамке на А; масштабная линия 10 мкм. В — отсутствие экспрессии 1асХ в мышце на контралатеральной

4.3. Трихостатин А способствует экспрессии (З-gaI в культуре чувствительных нейронов, стимулированных TNF-a и LPS. На данном этапе мы исследовали активность NF-кВ in vitro в культуре чувствительных нейронов, выделенных из спинальных ганглиев трансгенных мышей линии NF-KB/lacZ. Необходимо было выяснить, активируется ли экспрессия репортерного гена в зрелых нейронах спинальных ганглиев in vitro при действии классических активаторов NF-кВ, таких, как TNF-a и LPS. Для этого культуру трансгенных нейронов инкубировали в течение 16 часов на стерильных покровных стеклах, стимулировалали добавлением TNF-a (30 нг/мл) или LPS (10 нг/мл) на следующие 24 часа инкубации и затем анализировали на p-gal-зккумуляцню методом окрашивания с X-gal.

Рис. 14. Отсутствие экспрессии 1ас/! в культуре нейронов спинномозговых ганглиев !ЧТ-кВ/1ас/.-рснортсрпых мышей. А - р-§а1-нозигивные клетки не обнаружены в контрольной нестимулированной культуре чувствительных нейронов, масштабная линия 25 мкм; Б - культивируемые в течение 16 часов нейроны спинномозговых ганглиев были стимулированы Т№-а (30 нг/мл). Отмечается экспрессия репортерного гена в большинстве ненейрональных клеток, окружающих нейроны, но не в самих чувствительных нейронах, масштабная линия 10 мкм

Как видно из рис. 14, транскрипционная активность №-кВ в нейронах, культивируемых в нормальной среде роста, отсутствует. Отметим, что встречались единичные р-§а]-позитивные ненейрональные клетки, предположительно, клетки-сателлиты, которые были связаны с телами нейронов и могли попасть в культуру в результате неполного ресуспендирования гангиев. После ТК'Р-а-стимуляции культуры чувствительных нейронов р-«а!-экспрессия выявлялась в большинстве ненейрональных клеток, окружающих тела нейронов. Эти клетки можно интерпретировать как клетки-сателлиты, основываясь на их морфологии и местоположении. Однако в нейронах спинномозговых ганглиев, культивируемых с добавлением Т№-а (30 нг/мл), не обнаружено значительной транскрипционной активности №-кВ (рис. 14, Б).

В ходе исследования мы выявили эффект трихостатина А (ТпсЫ^айп А - ТЭА) (5 цМ) на экспрессию репортерного гена /ас'/ в нейронах, одновременно стимулированных ТЫР-а. Трихостатин А один из наиболее

эффективных и хорошо изученных ингибиторов гистоновых деацетилаз (histone deacetylases - HDAC) (Yoshida et al., 1990; Yoshida et al., 1995).

Рис. 15. Транскрипционная активность NF-кВ индуцируется трихостатином А в культуре нейронов спинномозговых ганглиев NF-Kli/lacZ-рспортерных мышей. А -

нейроны спинномозговых ганглиев зрелых мышей трансгенной репортерной линии NF-кВ/LacZ находились in vitro в течение 16 часов. Трихостатин А (5 рМ) был добавлен в культуральную среду на следующие 24 часа инкубации. Отмечается индукция lacZ-активности в ненейрональных клетках и в части чувствительных нейронов, масштабная лини 25 мкм. Б - нейроны спинномозговых ганглиев культивировали в течение 16 часов. TSA (5 цМ) одновременно с TNF-a (30 пг/мл) (Б) или LPS (10 мкг/мл) (В) были добавлены в культуральную среду на следующие 24 часа инкубации. Обнаруживается усиление экспрессии репортерного гена в ненейрональных клетках и чувствительных нейронах. Б, В - масштабная линия 25 мкм

Так, при 24-часовой инкубации культуры нейронов с ТБА только 3-5 % клеток проявляли р-^а1-активность (рис. 15, А). Однако у значительного количества чувствительных нейронов отмечалась положительная окраска, когда культуру нейронов инкубировали с добавлением одновременно ТБА и Т№-а (рис. 15, Б). Сходный эффект ТБА наблюдался при стимуляции клеток ЕР 8 (10 мкг/мл) (рис. 15, В), другим известным стимулятором №-кВ в различных типах клеток. Увеличение времени инкубации с Т8А до 40 часов не привело к повышению количества р-§а1-положигельных клеток.

Еще ярче эффект ТБА проявлялся, когда культуру нейронов преинкубировали в присутствии ТБА в течение 16 часов, а затем стимулировали ТЫР-а или ЕР 8 (рис. 16). В этом случае практически у всех нейронов наблюдалась мощная ядерная р-§а1-активность.

Рис. 16. Экспрессия lacZ в культуре нейронов спинномозговых ганглиев, прсиикубироваиных с TSA и стимулированных TNF-a или LPS. Нейроны спинномозговых ганглиев зрелых мышей трансгенной репортерной линии NF-icB/LacZ находились в культуре в течение 16 часов в присутствии TSA (5 рМ). Загем TNF-a (30 нг/мл) (А) или LPS (10 мкг/мл) (Б) были добавлены к культуре на следующие 24 часа инкубации. Отмечается мощная экспрессия репоргерного гена в большинстве чувствительных нейронов. А, Б - масштабная линия 25 мкм

Рис. 17. Процентное соотношение |l-gal-

положи1тельных нейронов при действии различных комбинаций моди-

фикаторов (TSA, TNF-a, LPS и SN50) активности NF-кВ in vitro. TSA усиливает проявление

индуцирующего действия TNF-a и LPS на экспрессию NF-кВ-репортерного гена, и этот ответ блокируется SN50. Более того, мощная индукция транскрипционной активности NF-kB

выявляется, когда культура нейронов спинномозговых ганглиев преинкубируется с TSA в течение 16 часов перед действием TNF-a и LPS, содержание p-gal-положительных нейронов повышается до 90 %

Было также показано, что индуцированная экспрессия lacZ в чувствительных нейронах ингибируется при добавлении в среду олигопептида SN50 - специфического ингибитора ядерной транслокации NF-кВ в клетках. После проникновения в клетку SN50 блокирует систему импорта, необходимую для перемещения NF-кВ в ядро, не вступая во взаимодействие с цитоплазматическими процессами, ведущими к активации NF-кВ. Лишь единичные клетки были ß-gal-положительны (3 %), когда SN50 добавляли в среду одновременно с TSA и TNF-a. Более того, экспрессия lacZ в чувствительных ' нейронах полностью исчезала, когда нейрональная культура была преинкубирована с SN50 в течение 16 часов перед добавлением TS А и TNF-a .

На рис. 17 представлено процентное соотношение ß-gal-положительных чувствительных нейронов после действия in vitro различных комбинаций TSA, TNF-a, LPS и SN50.

4.4. Регуляция активности NF-кВ в чувствительных нейронах. Результаты, полученные в ходе экспериментов с использованием трансгенной репортерной линии мышей NF-KB/LacZ,. показали, что NF-кВ транскрипционно не активен как в норме, так и после повреждения периферического нерва, что было подтверждено неспособностью NF-kB транскрибировать репортер-ный ген lacZ в нейронах спинномозговых ганглиев. Мы обнаружили, что NF-кВ не активен в чувствительных нейронах после экспериментально вызванного воспаления периферического нерва, хотя эта модель Способна индуцировать молекулы NF-кВ сигнального каскада в других типах Клеток (Inglis et al., 2005).

Мы показали, однако, что конститутивная транскрипционная активность NF-кВ выявляется в нейронах головного мозга, как было отмечено ранее-- (Bhakar et al., 2002). Это свидетельствует о том, что отсутствие активности NF-кВ в спинальных ганглиях регистрируется не вследствие неадекватного X-gal окрашивания .в нашем эксперименте. Более того, мы выявили ß-gal-положительные ненейрональные клетки в месте повреждения седалищного нерва. Особенно ярко репортерный ген lacZ проявлялся в ядрах поврежденной мышечной ткани, вероятно, в результате индукции NF-кВ цитокинами воспаления и/или регенерации мышечной ткани.

Мы не исключали возможности, что отсутствие детекции транскрипционной активности в зрелых чувствительных нейронах связано с особенностями линии репортерных мышей, используемых в нашем эксперименте. . Однако в исследованиях, проводимых с другими линиями трансгенных NF-кВ-репортерных мышей также не отмечалась активность NF-кВ в зрелых чувствительных нейронах (Meinet 2006). В частности, сходная линия трансгенных репортерных мышей была генерирована с использованием промотора р105, который содержал NF-кВ-связывающий участок для экспрессии репортерного гена lacZ (Schmidt-Ullrich et al., 1996). Перерезка седалищного нерва приводила к активации транскрипционной активности NF-кВ в некоторых мотонейронах, которая не была показана в

чувствительных нейронах (Pollock et al., 2005). Не была выявлена транскрипционная активность NF-кВ в периферической нервной системе и другой трансгенной линии мышей, в которой репортерный ген люциферазы находился под контролем NF-кВ (Carlsen et al., 2002).

Мы продемонстрировали, что отсутствие активности NF-кВ в зрелых нейронах спинальных ганглиев регистрируется в результате действия репрессионного механизма, регулируемого процессами ацетилирования и деацетилирования. В частности, мы показали, что трихостатин А, являющийся ингибитором гистоновых деацетилаз (Quivy, Van Lint, 2004), значительно усиливает индукцию NF-кВ-активности, вызванную TNF-a и LPS в культуре спинномозговых нейронов. Подобные результаты отражены в работе Chen с соавторами (2001) на других типах клеток.

Согласно полученным нами данным, наблюдаемое действие TSA специфично для NF-кВ-активности, так как ингибитор ядерного перемещения NF-кВ - SN50 нивелирует дерепрессивный эффект TSA в культуре спинномозговых нейронов. Следовательно, полученные данные объясняют, что влияние NF-кВ в зрелых спинальных ганглиях не отмечается в результате процессов деацетилирования, подавляющих транскрипционную активность ядерного фактора.

Таким образом, появившиеся в последнее время сообщения о том, что процессы ацетилирования и деацетилирования на клеточном и молекулярном уровнях, в том числе в ядре, вовлечены в регуляцию транскрипционной активности NF-кВ (Natoli, 2006; Quivy, Van Lint, 2004), расширили наши представления о многоуровневой регуляции активности этого фактора. Во-первых, ацетилирование гистонов регулирует доступность NF-кВ-зависимых генов. Во-вторых, неидентифицированные процессы ацетилирования временно модулируют IKK-активность, а следовательно, длительность присутствия и ДНК-связывания NF-кВ в ядре. В-третьих, прямое ацетилирование р65- и р50-субъединиц рейдирует различные функции NF-кВ, включая транскрипционную и ДНК-связывающую активность, а также присоединение 1кВа. В заключение отметим, что ацетилтрансферазы и деацетилазы взаимодействуют напрямую с несколькими протеинами, вовлеченными в сигнальные каскады NF-кВ, в том числе с самим NF-kB, другими транскрипционнми факторами и гистонами, ассоциированными с NF-кВ-регулируемыми генами (Quivy, Van Lint, 2004) (см. рис. 45).

Проведенный нами эксперимент с SN50 - ингибитором ядерной транслокации NF-кВ выявил зависимость степени экспрессии репортерного гена в культуре нейронов спинномозгового узла от продолжительности действия ингибитора. Это можно объяснить, если принять во внимание следующее: деацетилирование и конденсация хроматина, окружающего промотор репортерного гена lacZ, могут не допустить экспрессии этого гена в чувствительных нейронах, хотя сам транскрипционный фактор присутствует в клетках (Kaltschmidt et al., 1994). Когда нейроны подвергаются действию TSA, гистоновые деацетилазы ингибируются, что влечет за собой ацетилирование и деконденсацию (расслабление) хроматина.

Это в свою очередь делает промотор доступным для NF-кВ и других кофакторов после стимуляции нейронов TNF-a. В то же время 1кВа входит в ядро и переносит NF-кВ в цитоплазму. Известно, что через 60-75 мин после начала стимуляции ни одного NF-кВ-комплекса не остается в ядре (Lipniacki et al., 2004), а так как новые молекулы NF-кВ не могут быть транслоцированы в него в связи с блокадой специфическим ингибитором SN50, ядерный пул NF-кВ исчерпывается.

При одновременном действии SN50, TSA и TNF-a на нейроны in vitro молекулы NF-кВ, которые конститутивно представлены в ядре, связываются с промотором репортерного гена NF-кВ, и в результате мы наблюдаем небольшое количество клеток, экспрессирующих p-gal в первые минуты стимуляции. В связи с присутствием ингибитора ядерная транслокация NF-кВ и соответственно экспрессия P-gal прекращаются, но все еще регистрируются в отдельных клетках. Однако когда мы инкубируем клетки в присутствии SN50 в течение 16 часов, ядерный пул NF-кВ истощается вследствие ингибирования способности фактора транслоцироваться в ядро. Следовательно, даже после добавления в среду роста TSA и TNF-a экспрессия p-gal не наблюдается ни в нейронах, ни в клетках-сателлитах, потому что ни в ядре, ни в цитоплазме нет молекул NF-кВ, способных связаться с промотором.

Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что гистоны в высшей степени деацетилированы в зрелых чувствительных нейронах, поэтому присутствующий в ядре комплекс NF-кВ не может связаться со специфическим промотором и активировать NF-кВ-зависимые гены.

Таким образом, механизм, с помощью которого рЗОО/СВР и другие коактиваторы усиливают, a HDAC и остальные корепресссры ингибируют транскрипционную активность NF-кВ, является многофакторным (см. рис. 45) и включает действие непосредственно на этот транскрипционный фактор и изменения в структуре хроматина. В общем роль деацетилирования гистонов заключается в ингибировании NF-кВ путем молекулярных механизмов, специфичных для конкретного стимула и отдельно взятого промотора.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что NF-kB не является обязательным внутренним нейропротекторным фактором в зрелых чувствительных нейронах в условиях перерезки периферического нерва. Более того, мы выявили молекулярный механизм, который опосредован гистоновыми деацетилазами и может объяснить транскрипционную репрессию NF-кВ в нейронах спинномозговых ганглиев. Это позволяет предположить, что in vivo функции NF-кВ ограничены в зрелой ПНС в отличие от таковых в ЦНС.

изучить процессы ацетилироваиия/деацетилироваиия гистоиов в чувствительных нейронах, в частности их участие в регенерации.

Выводы:

1. В спинномозговых ганглиях зрелых крыс происходит посттравматическое увеличение экспрессии NF-кВ-зависимых генов МСР-1 и 1кВа in vivo и после стимуляции первичной культуры чувствительных нейронов TNF-a in vitro. Динамика экспрессии и аккумуляции МСР-1 и /кВа мРНК различается как между МСР-1 и 1кВа генами, так и для одного гена в зависимости от используемой модели in vivo и in vitro.

2. Интактные спинномозговые ганглии показывают низкую NF-kB-ДНК-связываюшую активность. Аксотомия нейронов спинномозговых ганглиев приводит к увеличению NF-кВ-ДНК-связывающей активности ядерных экстрактов поврежденных спинальных ганглиев крыс по сравнению с контрольными через 6 часов после травмы. Первичная культура чувствительных нейронов в норме проявляет заметную NF-кВ-ДНК-связывающую активность, которая значительно увеличивается после стимуляции нейронов TNF-a in vitro.

3. После травмы периферического нерва внутриядерную р65-иммунореактивность через 24 часа проявляют 25% нейронов спинномозгового ганглия, что подтверждает активацию и перемещение NF-кВ комплекса в ядро. Первичная культура чувствительных нейронов на действие TNF-a in vitro реагирует увеличением количества нейронов с внутриядерной р65 иммунореактивностью до 60 % .

4. Впервые созданная линия генетически модифицированных мышей Thy*lKBa-SI со специфическим нейронапьным суперингибитором NF-kB является достоверной моделью для изучения биологической роли сигнальных путей NF-kB в зрелых нейронах. Животные Thy*lKBa-SI трансгенной линии демонстрирует экспрессию мутантной формы 1кВа -[кВа-SI - исключительно в нейронах. Вызванное аксотомией ядерное перемещение р65-иммунореактивности после травмы периферического нерва мышей трансгенной линии Thy*lKBa-SI значительной снижено по сравнению с диким типом. Ядерное перемещение NF-kB, стимулированное TNF-a in vitro, также значительно ингибируется в нейронах спинальных ганглиев трансгенных животных.

5. Модель генетически модифицированных мышей Thy*IicBa-SI со специфическим нейронапьным суперингибитором NF-kB показывает отсутствие какого-либо эффекта на основные физиологические функции и выживаемость зрелых чувствительных нейронов in vivo после аксотомии.

6. Трансгенная линия репортерных мышей NF-KB/LacZ демонстрирует отсутствие экспрессии NF-кВ-зависимого репортерного гена lacZ в нейронах спинномозговых ганглиев in vivo после аксотомии и in vitro после стимуляции TNF-a.

7. Репрессия транскрипционной активности NF-kB в зрелых чувствительных нейронах осуществляется на уровне регуляции

внутриядерного ацетилирования/деацетилирования белков. Увеличение уровня ацетилирования с помощью блокатора гистоновых деацегилаз (HDAC) снимает репрессию репортерного гена и запускает экспрессию NF-кВ-зависимого гена.

8. NF-кВ не является жизненно необходимым внутренним нейропротекторным фактором зрелых чувствительных нейронов при травме. Молекулярные механизмы, опосредованные гистоновыми деацетилазами, регулируют транскрипционную репрессию NF-кВ в этих нейронах, тем самым, ограничивая функции NF-кВ in vivo в нейронах ПНС в отличие от нейронов ЦНС.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Gushchina, S. Transgenic approaches for studying inflammatory signaling pathway in the nervous system: NF-кВ in neuronal repair after peripheral nerve injury / S. Gushchina, D Wu, G. Michael, P. Barker, P. Richardson, C. Magoulas // William Harvey Day Conference Materials, Barts and the London, Queen Mary's School of Medicine and Dentistry, University of London - London, 2003 - p.9-10

2. Gushchina, S.V. Nuclear factor kappa В signaling in injured neurons / S.V Gushchina, K. S. Karanth, C. Magoulas, P.M. Richardson // William Harvey Day Conference Materials, Barts and the London, Queen Mary's School of Medicine and Dentistry, University of London - London, 2004 - P.11-12.

3. Gushchina, S.V. Nuclear factor kappa В signaling in injured DRG neurons. / S.V Gushchina, K. S. Karanth, C. Magoulas, P.M. Richardson // Program No 38.10.2004. Society for Neuroscience, 34th Annual Meeting San Diego, CA. Abstract Viewer Itinerary Planner, Washington, DC: Society for Neuroscience, 2004, Online.

4. Gushchina, S.V. NF-кВ signaling in DRG neurons after sciatic nerve injury / S.V Gushchina, K. S. Karanth, C. Magoulas, P.M. Richardson // William Harvey Day Conference Materials, Barts and the London, Queen Mary's School of Medicine and Dentistry, University of London - London, 2005 -P.13-14.

5. Ховряков, A.B. Ультраструктурные изменения нейроглиальных клеток некоторых отделов головного мозга экспериментальных животных при стрессе / А. В. Ховряков, В.П. Балашов, Е.П. Подрезова, С.В. Гущина, Н.В. Семибратова, Н.П. Шиханов, П.П. Кругляков, А.А. Сосунов // Морфология,-2008,-Т. 133, №3.-С. 59-60.

6. Шиханов, Н.П. Иммуногистохимическое исследование нейрогенеза в головном мозге генетически модифицированных мышей при

экспериментальном перевозбуждении / Н.П. Шиханов, Е.П. Подрезова, С.В Гущина, A.B. Ховряков, Н.В. Семибратова, И.В. Уткина-Сосунова, Г-Н МакКханн, П.П. Кругляков, A.A. Сосунов // Материалы Всероссийской конференции «Инновацион-ные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток» Изд-во Офорт., Самара-2008. - С. 194-196

7. Сосунов, A.A. Активация нейрогенеза в зубчатой извилине при экспериментальном перевозбуждении в головном мозге мышей / A.A. Сосунов, П.П Кругляков, Г-Н МакКханн, Н.П Шиханов, Е.П. Подрезова, С.В Гущина, A.B. Ховряков, Н.В. Семибратова, И.В. Уткина-Сосунова // Материалы международной конференции «Проблемы современной морфологии человека». М.-2008.-С. 269-271

8. МакКханн, Г-П. Нарушения митотического деления в реактивных астроцитах приводят к развитию полиплоидии / Г-Н МакКханн, Е.П. Подрезова, С.В Гущина, A.B. Ховряков, Н.В. Семибратова, Н.П Шиханов, П.П Кругляков, A.A. Сосунов, // Морфология- 2008-Т.133, №2.-С. 70.

9. Подрезова, Е.П. Активация m-TOR-ферментного каскада в нейронах и нероглии характерна для стрессорных поражений головного мозга / Е.П. Подрезова, A.A. Сосунов, Г-П МакКханн, Ч.Б Майкелл, A.B. Ховряков, С.В. Гущина, Н.П. Шиханов, П.П. Кругляков, A.B. Карпова //Морфология,-2008,-Т. 133,№4.-С. 88-89

10. Гущина, С.В. Сигнальные пути ядерного фактора каппа В (NF-кВ) в поврежденных нейронах / С.В. Гущина, П.П. Кругляков, К. Магулас, П.М. Ричардсон // Морфология.- Т.134, №5 - С. 65.

11.Подрезова, Е.П. Иммуногистохимическое исследование реактивных изменений NG2-kjictok при патологии головного мозга человека / Е.П. Подрезова, A.A. Сосунов, Г-П МакКханн, A.B. Ховряков, В.П. Балашов, Н.П. Шиханов, С.В. Гущина // Морфология - 2008. - Т. 134, №5.-С. 87.

12.Gushchina, S. Observations on the function of nuclear factor kappa В (NF-kB) in the survival of adult primary sensory neurons after nerve injury / S. Gushchina, V. Leinster, A. Jasim, M. Demestre, L. Lopez de Heredia, G. Michael, P. Barker, P. Richardson, C. Magoulas // Molecular and Cellular Neuroscience. - 2009. - V.40, №2. - P. 207-216.

13.Гущина, С.В. Роль ядерного транскрипционного фактора каппа В (NF-кВ) в выживании зрелых чувствительных нейронов при повреждении периферического нерва / С.В Гущина, П.П. Кругляков, О.В. Волкова,

П.М. Ричардсон, Б. Магоулас // Морфология. - 2009,- Т. 136, № 4.- С. 47

14. Кругляков, П.П. NG2-icnetkh - особый тип макроглиальных элементов как возможный источник нейрональных предшественников в головном мозгу человека / П.П. Кругляков, Е.П. Подрезова, С.А. Сосунов, A.B. Ховряков, Н.П. Шиханов, C.B. Гущина, В.А. Нуянзина, Г-П МакКханн, A.A. Сосунов // Морфология - 2009 - Т. 136, № 4,- С. 84.

15.Гущина, C.B. Посттравматическая активность сигнальных путей ядерного фактора каппа В (NF-kB) в зрелых чувствительных нейронах / C.B. Гущина, К. Б. Магоулас, Н. Юсаф, П.М. Ричардсон и О.В. Волкова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины-2010,- т. 148, №4 - С. 460-465.

16.Гущина, C.B. Транскрипционная активность ядерного фактора каппа В (NF-кВ) в посттравматических чувствительных нейронах (гистохимическое исследование) / C.B. Гущина, О.В. Волкова, П.П. Кругляков, К.Б. Магоулас // Морфология. - 2010.-Т. 137, № 2 - С. 1822

17. Гущина, C.B. Клеточные аспекты регуляции транскрипционной активности ядерного фактора каппа В (NF-кВ) в чувствительных нейронах in vitro / C.B. Гущина, О.В. Волкова, П.П. Кругляков, К.Б. Магоулас // Морфология. - 2010 - Т. 137, № 3 - С. 22-26

18. Гущина, C.B. Кругляков П.П. К вопросу о морфогенетических перестройках в посттравматических чувствительных нейронах // Морфологические ведомости- 2010. -№2. - С. 88-92.

19.Гущина, C.B. Создание и характеристика трансгенной линии мышей Thy*lKBa-SI / C.B. Гущина, Г. Майкл, О.В. Волкова и К. Б. Магоулас // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2010 — т. 150, №8- С. 233-237

20. Гущина, C.B. Транскрипционный фактор каппа В (NF-кВ) в постгравматических нейронах// C.B. Гущина, О.В. Волкова П.П. Кругляков, К. Б. Магоулас,- Саранск, 2010. - Изд-во Мордов. ун-та. -144 с. (монография)

Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Тайме. Печать способом ризографии. Усл. псч. л. 2,96. Уч.- изд. л. 2,38. Тираж 100 экз. Заказ № 60.

Отпечатано с оригинала-макета заказчика в ООО «Референт» 430000, г. Саранск, пр. Ленина, 21. тел. (8342) 48-25-33

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сигнальные пути ядерного транскрипционного фактора Каппа в (NF-kB) в чувствительных нейронах"

Актуальность темы

Раскрытие молекулярных механизмов регуляции нейродеге-неративных/нейрорегенеративных процессов при травмах головного и спинного мозга, а также различных повреждениях периферических нервов - одна из важнейших проблем современных нейронаук, решение которой связано с разработкой новейших подходов к лечению этих тяжелых состояний. Одним из важных направлений исследований в этой области остается изучение клеточных и молекулярных процессов, лежащих в основе регенерации периферического нерва, понимание которых поможет решить фундаментальные проблемы регенерации нервной ткани.

Выживание нейронов является ведущим фактором, обеспечивающим успешную регенерацию периферического нерва и восстановление функций иннервируемой ткани после его повреждения (Рагинов, Челышев, 2003). Известно, что выживание нейронов зависит от снабжения их нейротрофическими факторами, поставляемыми в том числе иннервируемой тканью. Зрелые чувствительные нейроны являются заметным исключением из этого правила. Они проявляют способность выживать после аксотомии и потери связи с иннервируемой тканью. Более того, эти клетки могут находиться in vitro при полном отсутствии в питательной среде нейротрофических факторов (Lindsay et al., 1994), в отличие от эмбриональных чувствительных нейронов, которым нейротрофическая поддержка необходима для выживания (Davies, 2000; Middleton et al., 2000), как и активация ядерного транскрипционного фактора NF-kB.

Было обнаружено, что стимулирующим фактором при регенерации периферического нерва может служить развитие воспалительной реакции вокруг перикарионов нейронов спинномозговых узлов (Lu, Richardson, 1991), молекулярные механизмы которой связаны в том числе с индукцией цитокинов, таких, как интерлейкин-6 (Murphy et al., 1999), фактор некроза опухоли альфа (TNF-a) (Schafers et al., 2003) и др. Ядерный транскрипционный фактор NF-кВ является классическим мессенджером, регулирующим каскады реакций, связанные с различными цитокинами и клеточной гибелью.

Со времени открытия NF-кВ (Sen and Baltimore, 1986) и его роли медиатора апоптоза в клетках иммунной системы (Beg et al., 1995) ученые активно изучали его функции и в нервной системе. В последние годы наблюдается стремительный рост числа работ, посвященных его участию в процессах развития, пластичности, нейродегенерации и травмы (Mattson, Camandola, 2001). Однако его роль в выживании зрелых нейронов ЦНС оказалась противоречивой. Так, было обнаружено, что ингибирование NF-кВ в нейронах переднего мозга приводит к их апоптозу в результате нейротоксического поражения (Fridmacher et al., 2003), а в кортикальных нейронах может предотвратить апоптоз при экспериментальной ишемии мозга (Herrmann et al., 2005).

В нейронах спинномозговых ганглиев NF-кВ исследовали для выявления его потенциальной нейропротекторной роли после травмы периферического нерва (Doyle, Hunt, 1997; Fernyhough et al., 2005).

Зрелые чувствительные нейроны по своей природе относительно устойчивы к апоптозу, вызванному перерезкой периферического нерва (Koliatsos, Price, 1996). В противоположность этому гибель нейронов происходит гораздо быстрее после травмы в эмбриональном или раннем постнатальном периоде (Whiteside et al., 1998). Нейропротекторная роль NF-кВ в зрелых чувствительных нейронах описана в экспериментах на культуре спинномозговых нейронов in vitro (Fernyhough et al., 2005). Однако сложность этого фактора обусловливает противоречивость заключений о сигнальных путях NF-кВ в поврежденных нейронах.

До настоящего времени все еще дискутируется (Memet, 2006) вопрос о роли NF-кВ в процессах контроля выживаемости и гибели нейронов после травмы периферического нерва в условиях in vivo. Это отчасти связано с тем, что сложно четко разграничить in vivo два не исключающих друг друга потенциальных механизма действия NF-kB: непрямое влияние на нейроны, опосредованное активацией NF-кВ в глиальных клетках, или непосредственное участие этого фактора в регуляции активности нейрональных генов. В существующих генетических линиях нокаутных мышей не происходит инактивации гена NF-кВ в каком-то одном типе клеток, что делает невозможным разделение дейстия NF-кВ в глиальных клетках и нейронах (Pasparakis et al., 2006). В связи с этим возникла необходимость генерировать трансгенную линию мышей, в которых активность NF-кВ ингибирована исключительно в зрелых нейронах, для дальнейшего изучения функциональной роли нейрональной NF-kB.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы — изучить биологическую роль ядерного транскрипционного фактора NF-кВ и молекулярных механизмов, регулирующих его активность в зрелых нейронах спинальных ганглиев после травмы периферического нерва.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд конкретных задач:

1. Выяснить, повышается ли посттравматическая экспрессия NF-кВ-зависимых генов МСР-1 (monosyte chemoattractant protein-1) и 1кВа (inhibitor of NF-кВ) в зрелых нейронах спинальных ганглиев in vivo и при стимуляции культуры чувствительных нейронов провоспалительными цитокинами (TNF-a) in vitro.

2. Провести анализ ДНК-связывающей активности NF-кВ в посттравматических нейронах in vivo и при стимуляции культуры чувствительных нейронов TNF-a in vitro.

6. Определить регуляторное влияние процессов ацетил ирования на активацию сигнальных путей NF-кВ в нейронах спинальных ганглиев трансгенных мышей репортерной линии NF-KB/LacZ in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Созданная генетически модифицированная линия мышей Thy*lKBa-SI проявляет специфическую нейрональную экспрессию суперингибитора NF-kB.

3. Травма седалищного нерва in vivo и стимуляция культуры чувствительных нейронов TNF-a in vitro вызывает транслокацию р65-иммунореактивности в ядро нейронов у мышей дикого типа, в то время как у трансгенной линии мышей Thy*lKBa-SI проявляется пониженная способность NF-кВ к перемещению в ядро нейронов при повреждении периферического нерва in vivo и активации цитокинами in vitro.

4. Трансгенное ингибирование активности NF-кВ в - зрелых нейронах модифицированных мышей не влияет на основные физиологические параметры и посттравматическую выживаемость зрелых чувствительных нейронов in vivo.

5. Мониторинг экспрессии репортерного гена в NF-KB/LacZ трансгенной линии мышей, отражающей реальную транскрипционную активность NF-кВ, показывает ее отсутствие как в интактных, так и в посттравматических нейронах спинномозговых ганглиев in vivo, в отличие от нейронов ЦНС.

Научная новизна

Несмотря на обилие в мировой литературе экспериментальных данных, показывающих важную роль ядерного транскрипционного фактора кВ в процессах нейродегенеративных состояний нервной системы, публикации, посвященные практическим вопросам создания и экспериментального применения линий животных с генетически модифицированной активностью NF-кВ специфически в зрелых нейронах единичны. До настоящего времени это единственная трансгенная модель, в которой целенаправленно угнетается активность NF-кВ строго в зрелых нервных клетках in vivo. Для создания модели Thy*lKBa-SI была использована мутантная форма ингибитора NF-кВ -IkBü-SI, которая не подвержена деградации и поэтому действует как супер-репрессор NF-кВ активности, удерживая и изолируя в цитоплазме каждый NF-icB/RelA комплекс, предотвращая связывание с ДНК и активацию транскрипции. Результаты анализа показали, что ген мутантной формы ингибитора NF-кВ успешно экспрессируется исключительно в нейронах трансгенных мышей. Предложенная нами модель выгодно отличается тем, что Thy-1.2 промотор, под которым находится ген суперингибитора NF-кВ, активируется строго специфически в зрелых нейронах трансгенных мышей на 8 день постнатального развития и не затрагивает механизмы развития.

С помощью созданной нами модели впервые показано, что трансгенное репрессирование активации NF-кВ не влияет на основные физиологические свойства чувствительных нейронов in vivo, а также на их количество в спинномозговых ганглиях в норме и не ведет к изменениям выживаемости нейронов после травмы периферического нерва in vivo.

В данной работе предлагается также новый подход к регистрации транскрипционной активности NF-кВ in vivo с использованием трансгенной NF-icB/LacZ репортерной линии мышей. Полученные данные впервые показывают, что даже при активации NF-кВ-ДНК-связывающей активности в чувствительных нейронах, реальная транскрипционная активность может быть репрессирована действием гистоновых деацетилаз.

Практическое и теоретическое значение работы Важность данной работы для фундаментальной науки и практической медицины обусловлена необходимостью понимания молекулярных и генетических программ, контролирующих процессы выживаемости нейронов и нейрональной регенерации. Результаты исследования позволяют расширить представления о сложноорганизованной системе регуляции транскрипционного фактора NF-кВ в чувствительных нейронах. Выявленный молекулярный механизм, опосредованный гистоновыми деацетилазами объясняет транскрипционную репрессию NF-кВ в нейронах спинномозговых ганглиев, что позволяет говорить об ограничении функций NF-klB in vivo в зрелой ПНС в отличие от таковых в ЦНС.

Результаты наших исследований указывают на необходимость дальнейших изысканий в области раскрытия роли транскрипционных механизмов в нейрональной репарации. Так, необходимо более детально изучить процессы ацетилирования/деацетилирования гистонов в чувствительных нейронах, в частности их участие в регенерации.

Использование созданной линии мышей Thy*lKBa-SI в экспериментальных моделях травмы, стресса и др. дает широкую возможность для изучения биологической роли ОТ-кВ в зрелых нейронах как центральной, так и периферической нервной системы. гЭПС цАМФ АР-1 АРР

C/EBPß

СВР CGRP

CNTF

СОХ CR ЕВ

DMEM

ECGF

EGF

EGFP

EMSA

FGF

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ гранулярная эндоплазматическая сеть циклический аденозинмонофосфат активаторный протеин-1 (activator protein-1) предшественник амилоидного белка (amyloid precursor protein) протеин, связывающийся с ССАТ-энхансером (CCAT-enhancer binding protein) CREB-связанный протеин (CREB binding protein) белок, относящийся к гену кальцитонина (calcitonin gene-related peptide) цилиарный нейротрофический фактор (ciliary neurotriphic factor) циклооксигеназа (cyclooxygenase) белок, связанный с элементом ответа на сАМР (cAMP response element binding protein) модифицированная среда Dulbeco (Dulbeco's modified eagles media) фактор роста эндотелиальных клеток (endothelial cell growth factor) эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor) усиленный зеленый флуоресцирующий протеин enhanced green fluorescent protein) метод сдвига электрофоретической подвижности electrophoretic mobility shift assay) фактор роста фибробластов

P-gal G-CSF

GM-CSF

HDAC IAP

IFN IgG IKK IL

1кВа JNK LIF

LPS MAG

MAP

МАРК

MCP-1 fibroblast growth factor) бетта-галактозидаза ((3-galactosidase) колониестимулирующий фактор гранулоцитов (granulocyte colony stimulating factor) гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor гистоновые деацетилазы (histone deacetylases) белки-ингибиторы апоптоза (inhibitor-of-apoptosis proteins) интерферон (interferon) иммуноглобулин G 1кВ-киназа (IkB kinase) интерлейкин (interleukin) ингибитор NF-кВ (inhibitor of NF-кВ) киназа Jun N (Jun N terminal kinase) ингибирующий фактор лейкемии (leukaemia inhibitory factor) липополисахарид (lipopolysaccharide) миелин-ассоциированный гликопротеин (myelin-assotiated glycoprotein) митоген-активируемый протеин (Mitogen activating protein) митоген-активируемая протеинкиназа (MAP kinase) протеин хемоаттракции моноцитов (Monosyte chemoattractant protein)

MEKK Erk киназа киназа (Erk kinase kinase)

MKK митоген-активируемая протеинкиназа киназа

MAP kinase kinase) NF-кВ ядерный фактор кВ (nuclear factor NF-кВ)

NGF фактор роста нервов (nerve growth factor)

NPY нейропептид Y (neuropeptide Y)

NTF нейротрофический фактор (neurotrophic factor)

РКА протеинкиназа A (protein kinase A)

PKC протеинкиназа С (protein kinase C)

RHD Rel-гомологичный домен (Rel homology domain)

STAT переключатель сигнала и активатор транскрипции (signal transducer and activator of transcription)

TNF-R фактор некроза опухоли-рецептор tumour necrosis factor receptor) TNF-a фактор некроза опухоли альфа tumour necrosis factor alpha) TSA трихостатин A (tricho statin A)

TUNEL Doxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End

Labelling

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.10

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Гущина, Светлана Валентиновна

Выводы:

1. В спинномозговых ганглиях зрелых крыс происходит посттравматическое увеличение экспрессии NF-кВ-зависимых генов МСР-1 и 1кВа in vivo и после стимуляции первичной культуры чувствительных нейронов TNF-a in vitro. Динамика экспрессии и аккумуляции МСР-1 и 1кВа мРНК различается как между МСР-1 и 1кВа генами, так и для одного гена в зависимости от используемой модели in vivo или in vitro.

2. Интактные спинномозговые ганглии показывают низкую NF-кВ-ДНК-связывающую активность. Аксотомия нейронов спинномозговых ганглиев приводит к увеличению NF-кВ-ДНК-связывающей активности ядерных экстрактов поврежденных спинальных ганглиев крыс по сравнению с контрольными через 6 часов после травмы. Первичная культура чувствительных нейронов в норме проявляет заметную NF-кВ-ДНК-связывающую активность, которая значительно увеличивается после стимуляции нейронов TNF-a in vitro.

3. После травмы периферического нерва внутриядерную р65-иммунореактивность через 24 часа проявляют 25% нейронов спинномозгового ганглия, что подтверждает активацию и перемещение комплекса NF-кВ в ядро. Первичная культура чувствительных нейронов на действие TNF-a in vitro реагирует увеличением количества нейронов с внутриядерной р65-иммунореактивностью до 60 % .

4. Впервые созданная линия генетически модифицированных мышей Thy*lKBa-SI со специфическим нейрональным суперингибитором NF-кВ является достоверной моделью для изучения биологической роли сигнальных путей NF-кВ в зрелых нейронах. Животные Thy*IicBa-SI трансгенной линии демонстрирует экспрессию мутантной формы 1ква - IkBü-SI -исключительно в нейронах. Вызванное аксотомией ядерное перемещение р65-иммунореактивности после травмы периферического нерва мышей трансгенной линии Thy*lkba-SI значительной снижено по сравнению с диким типом. Ядерное перемещение NF-кВ, стимулированное TNF-a in vitro, также значительно ингибируется в нейронах спинальных ганглиев трансгенных животных.

5. Линия генетически модифицированных мышей Thy*lKBa-SI со специфическим нейрональным суперингибитором NF-kB показывает отсутствие какого-либо эффекта на основные физиологические функции и выживаемость зрелых чувствительных нейронов in vivo после аксотомии.

6. Трансгенная линия репортерных мышей NF-кВ/LacZ демонстрирует отсутствие экспрессии NF-кВ-зависимого репортерного гена lacZ в нейронах спинномозговых ганглиев in vivo после аксотомии и in vitro после стимуляции TNF-a.

7. Репрессия транскрипционной активности NF-кВ в зрелых чувствительных нейронах осуществляется на уровне регуляции внутриядерного ацетилирования/деацетилирования белков. Увеличение уровня ацетилирования с помощью блокатора гистоновых деацетилаз (HDAC) снимает репрессию репортерного гена и запускает экспрессию NF-кВ-зависимого гена.

ГЛАВА 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

С тех пор как в 1986 году впервые описан транскрипционный фактор NF-кВ, проведено большое количество исследований для определения его патофизиологической роли (Singh et al., 1986). К настоящему времени известно, что он регулирует экспрессию многих провоспалительных генов и, следовательно, играет важную роль в различных воспалительных процессах. Обнаружено, что NF-кВ может выполнять как антиапоптические, так и проапоптические функции. Однако большинство исследований, посвященных NF-кВ, выполнены на клетках иммунной системы или соединительной ткани. В ЦНС активация NF-кВ была описана при различных нейропатологических состояниях. Роль NF-кВ в поддержании репаративной способности периферического нерва после травмы недостаточно ясна. Таким образом, в данном исследовании была поставлена цель выяснить, вовлечен ли этот фактор в транскрипционную регуляцию генов чувствительных нейронов, и определить in vivo его функциональное значение в спинномозговых ганглиях после травмы седалищного нерва.

Со времени первых попыток понять механизмы репарации нерва, механизм, регулирующий экспрессию генов, был выдвинут как наиболее привлекательный и объясняющий процесс регенерации нервных проводников. По этой гипотезе изменения в экспрессии генов и их координации могут быть необходимы для значительных структурных изменений, таких, как рост регенерирующего аксона. Аксотомия зрелых периферических нейронов стимулирует синтез ряда нейропротекторных цитокинов (IL-6, LIF, TNF-a, МСР-1), гены которых в свою очередь «запускаются» с участием транскрипционного фактора NF-кВ. Таким образом, эти цитокин-опосредованные воспалительные процессы ассоциируются с активацией NF-кВ, что и поднимает вопрос о необходимости определения роли NF-кВ в периферической нервной системе при травме.

В настоящей работе показано, что нейроны спинальных ганглиев экспрессируют NF-кВ-зависимые гены - МСР-1 и 1кВа in vivo после перерезки седалищного нерва и in vitro после TNF-a- стимуляции. Аккумуляция мРНК этих генов в спинальных ганглиях изменяется в разной степени после перерезки седалищного нерва и в культуре нейронов. Эти различия указывают на влияние дополнительных сигнальных каскадов или неканонических сигнальных путей в регуляции экспрессии некоторых NF-кВ-зависимых генов в нейронах спинальных ганглиев. Используя трансгенную линию мышей Thy*IicBa-SI, мы показали, что NF-кВ не является необходимым транскрипционным фактором для функционирования нейронов спинномозговых ганглиев in vivo, в частности для поддержания их внутренней способности к выживанию.

В предшествующих работах для выявления активности NF-кВ в нейронах спинномозговых ганглиев после травмы использовался иммуногистохимический метод, который позволяет определить ядерную локализацию NF-кВ, но не способен выявить, присоединился ли транскрипционный фактор к промотору гена и проявляет ли он транскрипционную активность. Чтобы получить дополнительную информацию для решения этой задачи, мы использовали трансгенные технологии, в частности линию мышей NF-KB/lacZ, несущих NF-kB-репортерный ген. Транскрипционная активность NF-кВ в нейронах спинальных ганглиев in vivo после аксотомии и in vitro после TNF-aстимуляции не была обнаружена. Мы показали, что ингибирование активности NF-кВ в нейронах спинальных ганглиев происходит в результате гистондеацетилирующих процессов.

По материалам нашего исследования можно сделать следующее заключение: транскрипционный фактор NF-кВ не вовлечен в процессы протекции нейронов спинномозговых ганглиев после травмы периферического нерва. Предположим, что так как NF-кВ в принципе проапоптотик, то отсутствие нейрональной гибели в наших экспериментах наблюдалось в результате низкого содержания в нейронах транскрипционно активного NF-кВ. Следовательно, транскрипционная активность NF-кВ должна была проявиться в спинальных ганглиях через длительное время после травмы (2 недели), когда и отмечалась клеточная гибель. Однако повышение активности не было обнаружено и через 2 недели после перерезки периферического нерва. Более того, в других регионах нервной системы, таких, как мозг, в норме выявлялась высокая транскрипционная активность. Тем не менее отметим, что механизмы нейропротекции и проапоптические каскады, в которых участвует NF-кВ, могут значительно различаться в нейронах ПНС и ЦНС.

Данные нашей работы согласовываются и с результатами другого in vivo наблюдения после травмы нерва. Так, ингибирование транслокации NF-кВ сульфасалазином ускоряет дегенерацию ганглионарных клеток сетчатки после перерезки оптического нерва (Choi et al. 2000). Фармакологическое применение NF-кВ ингибитора, однако, может влиять и на ненейрональные глиальные клетки, в которых потенциальные нейропротекторные процессы регулируются NF-кВ (Nickols et al. 2003; Reinecke et al. 2003). Таким образом, наши результаты согласуются с другой гипотезой, по которой активность NF-кВ скорее в шванновских клетках, чем в нейронах, способствует нейрональной репарации после травмы седалищного нерва (Nickols et al. 2003). Нами также было выявлено, что перерезка периферического нерва трансгенных NF-KB/lacZ репортерных мышей индуцирует NF-кВ в клетках проксимального отрезка нерва. Эти наблюдения требуют дальнейшего исследования для объяснения роли NF-кВ в ненейрональных клетках в свете нейрональной регенерации.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что NF-кВ не является обязательным внутренним нейропротекторным фактором в зрелых чувствительных нейронах в условиях перерезки периферического нерва. Более того, мы выявили молекулярный механизм, который опосредован гистоновыми деацетилазами и может объяснить транскрипционную репрессию NF-кВ в нейронах спинномозговых ганглиев. Это позволяет предположить, что in vivo функции NF-кВ ограничены в зрелой ПНС в отличие от таковых в ЦНС.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гущина, Светлана Валентиновна, Саранск

1. Лаврентьев Б.И. Стенограмма доклада на научной сессии ВИЭМ 25/XII 1941 г., Томск. Цит. по «Теория строения вегетативной нервной системы». М.: Медицина. 1983. - С. 4961.

2. Рагинов И.С. и Челышев Ю. А. Посттравматическое выживание чувствительных нейронов 1 различных субпопуляций // Морфология. 2003. - Т. 124, №4. - С. 47-50.

3. Akama К. T. Amyloid beta-peptide stimulates nitric oxide production in astrocytes through an NFkappaB-dependent mechanism / Akama К. Т., Albanese C., Pestell R. G., Van Eldik L. J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. - V. 95, № 10. - P. 57955800.

4. Albensi В. C. Potential roles for tumor necrosis factor and nuclear factor-kappaB in seizure activity // J. Neurosci. Res. 2001. - V. 66, №2. - P. 151-154.

5. Almawi W. Y., Melemedjian О. K. Negative regulation of nuclear factor-kappa В activation and function by glucocorticoids // J. Mol. Endocrinol. 2002. - V. 28, № 2. - P. 69-78.

6. Ambron, R. T. Intrinsic injury signals enhance growth, survival, and excitability of Aplysia neurons / Ambron R.T., Zhang X.P., Gunstream J. D., Povelones M., Walters E. T. // J Neurosci, 1996. -V. 16, №23. - P. 7469-7477.

7. Ansel J. C. Substance P selectively activates TNF-alpha gene expression in murine mast cells / Ansel, J. C., Brown, J. R., Payan D. G., Brown M. A. // J. Immunol. 1993. - V. 150, № 10. - P. 44784485.

8. Argiro V., Johnson M. I. Patterns and kinetics of neurite extension from sympathetic neurons in culture are age dependent // J. Neurosci. 1982. - V. 2, № 4. - P. 503-512.

9. Averill, S. Immunocytochemical localization of trkA receptors in chemically identified subgroups of adult rat sensory neurons /

10. Averill S., McMahon S. B., Claiy D. O., Reichardt L. F., Priestley J. V. // Eur. J. Neurosci. 1995. - V. 7, № 7. - P. 1484-1494.

11. Baeuerle P. A., Henkel T. Function and activation of NF-kappa B in the immune system // Annu. Rev. Immunol. 1994. - V. 12. - P. 141 -179.

12. Baizer L., Fishman M. C. Recognition of specific targets by cultured dorsal root ganglion neurons // J. Neurosci. 1987. - V. 7, № 8. - P. 2305-2311.

13. Bakalkin G., Yakovleva T., Terenius L. NF-kappa B-like factors in the murine brain. Developmentally-regulated and tissue-specific expression // Brain. Res. Mol. Brain. Res. 1993. - V. 20, № 1-2. -P. 137-146.

14. Baldwin A. S., Jr. The NF-kappa B and I kappa B proteins: new discoveries and insights // Annu. Rev. Immunol. 1996. - V. 14. - P. 649-683.

15. Barger S. W., Mattson M. P. Induction of neuroprotective kappa B-dependent transcription by secreted forms of the Alzheimer's betaamyloid precursor // Brain. Res. Mol. Brain. Res. 1996. - V. 40, № l.-P. 116-126.

16. Barger S. W., Moerman A. M., et al. Molecular mechanisms of cytokine-induced neuroprotection: NFkappaB and neuroplasticity // Curr Pharm. Des. 2005. - V. 11, № 8. - P. 985-998.

17. Bartsch U. Neural CAMS and their role in the development and organization of myelin sheaths // Front Biosci. 2003. - V. 8. - P. 477-490.

18. Bates C. A., Meyer R. L. The neurite-promoting effect of laminin is mediated by different mechanisms in embryonic and adult regenerating mouse optic axons in vitro // Dev. Biol. 1997. - V. 181,№ l.-P. 91-101.

19. Beg A. A. Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the RelA component of NF-kappa B / Beg A. A., Sha W. C., Bronson R. T., Ghosh S., Baltimore D. // Nature 1995. - V. 376, № 6536.-P. 167-170.

20. Berger S. L. Gene activation by histone and factor acetyltransferases // Curr Opin. Cell Biol. 1999. - V. 11, № 3. - P. 336-341.

21. Bethea, J. R. Traumatic spinal cord injury induces nuclear factor-kappaB activation / Bethea J. R., Castro M., Keane R. W., Lee T. T., Dietrich W. D., Yezierski R. P. // J. Neurosci. 1998. - V. 18, № 9. -P. 3251-3260.

22. Bisby M. A. Dependence of GAP43 (B50, Fl) transport on axonal regeneration in rat dorsal root ganglion neurons // Brain Res. 1988.- V. 458, № l.-P. 157-161.

23. Blesch A., Tuszynski M. H. Nucleus hears axon's pain // Nat. Med. -2004. V. 10, № 3. - P. 236-237.

24. Blottner D., Herdegen T. Neuroprotective fibroblast growth factor type-2 down-regulates the c-Jun transcription factor in axotomized sympathetic preganglionic neurons of adult rat // Neuroscience -1998. V. 82, № 1. - P. 283-292.

25. Bodeutsch, N. Unilateral injury to the adult rat optic nerve causes multiple cellular responses in the contralateral site / Bodeutsch N.,

26. Siebert H., Dermon C., Thanos S. I I J. Neurobiol. 1999. - V. 38, № l.-P. 116-128.

27. Bomze H. M. Spinal axon regeneration evoked by replacing two growth cone proteins in adult neurons / Bomze H. M., Bulsara K. R., Iskandar B. J., Caroni P., Skene J. H. //Nat. Neurosci. 2001. - V. 4, № l.-P. 38-43.

28. Boyle, K. TNFalpha mediates Schwann cell death by upregulating p75(NTR) expression without sustained activation of NfkappaB / Boyle K., Azari M. F., Cheema S. S., Petratos S. // Neurobiol. Dis. -2005.

29. Brain S. D., Williams T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide // Nature 1988. - V. 335, №6185. -P. 73-75.

30. Broude E. C-Jun expression in adult rat dorsal root ganglion neurons: differential response after central or peripheral axotomy / Broude E., McAtee M., Kelley M. S., Bregman B. S. // Exp. Neurol.- 1997. V. 148, № 1. - P. 367-377.

31. Brown R. T., Ades I. Z., Nordan, R. P. An acute phase response factor/NF-kappa B site downstream of the junB gene that mediates responsiveness to interleukin-6 in a murine plasmacytoma // J. Biol. Chem. 1995.-V. 270, № 52. - P. 31129-31135.

32. Cafferty, W. B. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice / Cafferty W. B., Gardiner N. J., Das P., Qiu J., McMahon S. B., Thompson S. W. // J. Neurosci. 2004. - V. 24, № 18. - P. 4432-4443.

33. Cai D. Arginase I and polyamines act downstream from cyclic AMP in overcoming inhibition of axonal growth MAG and myelin in vitro / Cai D., Deng K., Mellado W., Lee J., Ratan R. R., Filbin M. T. // Neuron 2002. - V. 35, № 4. - P. 711-719.

34. Campbell D. S., Holt C. E. Apoptotic pathway and MAPKs differentially regulate chemotropic responses of retinal growth cones // Neuron 2003. - V. 37, № 6. - P. 939-952.

35. Campbell K. J., Rocha S., Perkins N.D. Active repression of antiapoptotic gene expression by RelA(p65) NF-kappa B // Mol. Cell 2004. - V. 13, № 6. - P. 853-865.

36. Carlsen H. In vivo imaging of NF-kappa B activity / Carlsen H., Moskaug J. O., Fromm S. H., Blomhoff R. // J. Immunol. 2002. -V. 168,№3.-P. 1441-1446.

37. Caroni P., Becker M. The downregulation of growth-associated proteins in motoneurons at the onset of synapse elimination is controlled by muscle activity and IGF1 // J. Neurosci. 1992. - V. 12, № 10. - P. 3849-3861.

38. Castagne V., Lefevre K., Clarke P.G. Dual role of the NF-kappaB transcription factor in the death , of immature neurons // Neuroscience -2001.-V. 108,№3.-P. 517-526.

39. Cavalli V. Sunday Driver links axonal transport to damage signaling / Cavalli V., Kujala P., Klumperman J., Goldstein L. S. // J. Cell Biol. 2005. - V. 168, № 5. - P. 775-787.

40. Chang F. Signal transduction mediated by the Ras/Raf/MEK/ERK pathway from cytokine receptors to transcription factors: potential targeting for therapeutic intervention / Chang F., Steelman L. S., Lee

41. J. T., Shelton J. G., Navolanic P. M., Blalock W. L., Franklin R. A., McCubrey, J. A. //Leukemia-2003. V. 17, № 7. - P. 1263-1293.

42. Chen D. F., Jhaveri S., Schneider G. E. Intrinsic changes in developing retinal neurons result in regenerative failure of their axons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. - V. 92, № 16. - P. 7287-7291.

43. Chen H., Tini M., Evans, R. M. HATs on and beyond chromatin // Curr Opin. Cell Biol. 2001. - V. 13, № 2. - P. 218-224.

44. Chen L. Duration of nuclear NF-kappaB action regulated by reversible acetylation / Chen L., Fischle W., Verdin E., Greene W. C. // Science 2001. - V. 293, № 5535. - P. 1653-1657.

45. Chen L. F., Greene W. C. Regulation of distinct biological activities of the NF-kappaB transcription factor complex by acetylation // J. Mol. Med. 2003. - V. 81, № 9. - P. 549-557.

46. Chen L. F., Greene W. C. Shaping the nuclear action of NF-kappaB //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. - V. 5, № 5. - P. 392-401.

47. Chen L. F., Mu Y., Greene W. C. Acetylation of RelA at discrete sites regulates distinct nuclear functions of NF-kappaB // Embo. J. -2002. V. 21, № 23. - P. 6539-6548.

48. Chen Z. L., Yu W. M., Strickland S. Peripheral regeneration // Annu. Rev. Neurosci. 2007. - V. 30. - P. 209-233.

49. Cheung P. C. Feedback control of the protein kinase TAK1 by SAPK2a/p3 8alpha / Cheung P. C., Campbell D. G., Nebreda A. R., Cohen P. // Embo. J. 2003. - V. 22, № 21. - P. 5793-5805.

50. Cheung W. L., Briggs S. D., Allis C.D. Acetylation and chromosomal functions // Curr Opin. Cell Biol. 2000. - V. 12, № 3. - P. 326-333.

51. Chew D. J. Cell death after dorsal root injury / Chew D. J., Leinster V. H., Sakthithasan M., Robson L. G., Carlstedt T., Shortland P. J. // Neurosci. Lett 2008. - V. 433, № 3. - P. 231-234.

52. Chierzi S. The ability of axons to regenerate their growth cones depends on axonal type and age, and is regulated by calcium, cAMP and ERK / Chierzi S., Ratto G. M., Verma P., Fawcett J. W. // Eur. J. Neurosci. 2005. - V. 21, № 8. - P. 2051-2062.

53. Choi J. S. Failure to activate NF-kappaB promotes apoptosis of retinal ganglion cells following optic nerve transection / Choi J. S., Kim J. A., Kim D. H., Chun M. H., Gwag B. J., Yoon S. K., Joo C. K. // Brain Res. 2000. - V. 883, № 1. - P. 60-68.

54. Choi J. S., Sungjoo K. Y., Joo C. K. NF-kappa B activation following optic nerve transection // Korean J. Ophthalmol. 1998. -V. 12, № l.-p. 19-24.

55. Chu, G. K., Tator C. H. Calcium influx is necessary for optimal regrowth of transected neurites of rat sympathetic ganglion neurons in vitro //Neuroscience 2001. - V. 102, № 4. - P. 945-957.

56. Clemens, J. A. Cerebral ischemia: gene activation, neuronal injury, and the protective role of antioxidants // Free Radic. Biol. Med. -2000. V. 28, № 10. - P. 1526-1531.

57. Cohen P. Dissection of protein kinase cascades that mediate cellular response to cytokines and cellular stress // Adv. Pharmacol. 1996. -V. 36.-P. 15-27.

58. Cosgaya J. M., Chan J. R., Shooter E. M. The neurotrophin receptor p75NTR as a positive modulator of myelination // Science 2002. -V. 298, № 5596. - P. 1245-1248.

59. Curtis R. Retrograde axonal transport of ciliary neurotrophic factor is increased by peripheral nerve injury / Curtis R., Adryan K. M., Zhu Y., Harkness P. J., Lindsay R. M., DiStefano P. S. // Nature -1993. V. 365, № 6443. - P. 253-255.

60. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance // Nature 1989. - V. 337, № 6207. -P. 553-555.

61. Davies A. M. Neurotrophins: more to NGF than just survival // Curr Biol. 2000. - Y. 10, № 10. - P. 374-376.

62. Deng W. G., Wu K. K. Regulation of inducible nitric oxide synthase expression by p300 and p50 acetylation // J. Immunol. 2003. - V. 171, № 12. - P. 6581-6588.

63. Deng W. G., Zhu Y., Wu K. K. Up-regulation of p300 binding and p50 acetylation in tumor necrosis factor-alpha-induced cyclooxygenase-2 promoter activation // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278, № 7. - P. 4770-4777.

64. Dodge M. E. Stress-induced heat shock protein 27 expression and its role in dorsal root ganglion neuronal survival / Dodge M. E., Wang J., Guy C., Rankin S., Rahimtula M., Mearow K. M. // Brain Res. -2006. V. 1068, № 1. - P. 34-48.

65. Doyle C. A., Hunt S. P. Reduced nuclear factor kappaB (p65) expression in rat primary sensory neurons after peripheral nerve injury // Neuroreport 1997. - V. 8, № 13. - P. 2937-2942.

66. Duran A., Diaz-Meco M. T., Moscat J. Essential role of RelA Ser311 phosphorylation by zetaPKC in NF-kappaB transcriptional activation // Embo. J. 2003. - V. 22, № 15. - P. 3910-3918.

67. Eberharter A., Becker P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics // EMBO Rep. 2002. - V. 3, № 3. - P. 224229.

68. El Kharroubi A. Transcriptional activation of the integrated chromatin-associated human immunodeficiency virus type 1 promoter / El Kharroubi A., Piras G., Zensen R., Martin M. A. // Mol. Cell Biol. 1998. - V. 18, № 5. - P. 2535-2544.

69. Elde R. Prominent expression of acidic fibroblast growth factor in motor and sensory neurons / Elde R., Cao Y. H., Cintra A., Brelje T. C., Pelto-Huikko M., Junttila T., Fuxe K., Pettersson R. F., Hokfelt T. // Neuron 1991. - V. 7, № 3. - P. 349-364.

70. Ernfors P. Identification of cells in rat brain and peripheral tissues expressing mRNA for members of the nerve growth factor family / Ernfors P., Wetmore C., Olson L., Persson H. // Neuron 1990. - V. 5, №4. - P. 511-526.

71. Fagerlund R. NF-{kappa}B is transported into the nucleus by importin (alpha}3 and importin {alpha}4 / Fagerlund R., Kinnunen L., Kohler M., Julkunen I., Melen K. // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280,№ 16.-P. 15942-15951.

72. Farr M. Direct interactions between immunocytes and neurons after axotomy in Aplysia / Farr M., Zhu D. F., Povelones M., Valcich D., Ambron R. T. // J. Neurobiol. 2001. - V. 46, № 2. - P. 89-96.

73. Filbin M. T. Myelin-associated inhibitors of axonal regeneration in the adult mammalian CNS //Nat. Rev. Neurosci. 2003. - V. 4, № 9. - P. 703-713.

74. Frey D. Shared and unique roles of CAP23 and GAP43 in actin regulation, neurite outgrowth, and anatomical plasticity / Frey D., Laux T., Xu L., Schneider C., Caroni P. // J. Cell Biol. 2000. - V. 149, №7. - P. 1443-1454.

75. Fridmacher V. Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection / Fridmacher V., Kaltschmidt B., Goudeau B'., Ndiaye D., Rossi F. M., Pfeiffer J.,

76. Kaltschmidt C., Israel A., Memet S. // J. Neurosci. 2003. - V. 23,i28. P. 9403-9408.

77. Fu S. Y., Gordon T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration // Mol. Neurobiol. 1997. - V. 14, № 1-2.-P. 67-116.

78. Gadient R. A., Otten U. H. Interleukin-6 (IL-6)~a molecule with both beneficial and destructive potentials // Prog. Neurobiol. 1997. - V. 52, № 5. - P. 379-390.

79. Gerondakis S. Unravelling the complexities of the NF-kappaB signalling pathway using mouse knockout and transgenic models /

80. Gerondakis S., Grumont R., Gugasyan R., Wong L., Isomura I., Ho W., Banerjee A. // Oncogene 2006. - V. 25, № 51. - P. 6781-6799.

81. Gerritsen M. E. CREB-binding protein/p300 are transcriptional coactivators of p65 / Gerritsen M. E., Williams A. J., Neish A. S., Moore S., Shi Y., Collins T. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. -V. 94, № 7. - P. 2927-2932.

82. Ghosh S., Karin M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle // Cell-2002. V. 109 Suppl. - P. 81-96.

83. Ghosh S., May M. J., Kopp E. B. NF-kappa B and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses // Annu. Rev. Immunol. 1998. - V. 16. - P. 225-260.

84. Giulian D. The role of mononuclear phagocytes in wound healing after traumatic injury to adult mammalian brain / Giulian D., Chen J., Ingeman J. E., George J. K., Noponen M. // J. Neurosci. 1989. -V. 9, № 12. - P. 4416-4429.

85. Glazner G. W., Camandola S., Mattson M. P. Nuclear factor-kappaB mediates the cell survival-promoting action of activity-dependent neurotrophic factor peptide-9 // J. Neurochem. 2000. -V. 75, № l.-P. 101-108.

86. Goebeler M. The MKK6/p38 stress kinase cascade is critical for tumor necrosis factor-alpha-induced expression of monocyte-chemoattractant protein-1 in endothelial cells/ Goebeler M., Kilian

87. K., Gillitzer R., Kunz M., Yoshimura T., Brocker E. B., Rapp U. R., Ludwig S. // Blood 1999. - V. 93, № 3. - P. 857-65.

88. Goldberg J. L. Amacrine-signaled loss of intrinsic axon growth ability by retinal ganglion cells / Goldberg J. L., Klassen M. P., Hua Y., Barres B. A. // Science 2002. - V. 296, № 5574. - P. 18601864.

89. Gordon J. W. Regulation of Thy-1 gene expression in transgenic mice / Gordon J. W., Chesa P. G., Nishimura H., Rettig W. J., Maccari J. E., Endo T., Seravalli E., Seki T., Silver J. // Cell 1987. - V. 50, № 3. - P. 445-452.

90. Gray S. G., Teh B.T. (2001) Histone acetylation/deacetylation and cancer: an "open" and "shut" case? // Curr. Mol. Med., 2001. -V. 1, № 4. - P. 401-429.

91. Greene W. C., Chen L. F. Regulation of NF-kappaB action by reversible acetylation // Novartis Found Symp. 2004. - V. 259. - P. 208-217; discussion 218-225.

92. Gronroos E. Control of Smad7 stability by competition between acetylation and ubiquitination / Gronroos E., Hellman U., Heldin C. H., Ericsson J. // Mol. Cell 2002. - V. 10, № 3. - P. 483-493.

93. Gross S., Piwnica-Worms D. Real-time imaging of ligand-induced IKK activation in intact cells and in living mice // Nat. Methods 2005. - V. 2, № 8. - P. 607-614.

94. Hannila S. S., Filbin M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury // Exp. Neurol. 2008. - V. 209, № 2. - P. 321-332.

95. Hanz S., Fainzilber M. Integration of retrograde axonal and nuclear transport mechanisms in neurons: implications for therapeutics //Neuroscientist. 2004. - V. 10, № 5. - P. 404-408.

96. Hanz S., Fainzilber M. Retrograde signaling in injured nerve—the axon reaction revisited // J. Neurochem. 2006. - V. 99, № 1. - P. 13-19.

97. Harper A. A., Lawson S. N. Conduction velocity is related to morphological cell type in rat dorsal root ganglion neurones // J. Physiol. 1985. - V. 359. - P. 31-46.

98. Heinrich P. C., Behrmann I., et al. Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation / Heinrich P. C., Behrmann I., Haan S., Hermanns H. M., Muller-Newen G., Schaper F. // Biochem. J. 2003. - V. 374, № Pt 1. - P. 1-20.

99. Heinrich P. C. Interleukin-6-type cytokine signalling through the gp 130/Jak/STAT pathway / Heinrich P. C., Behrmann I., Muller

100. Newen G., Schaper F., Graeve L. I I Biochem. J. 1998. - V. 334, № Pt 2. - P. 297-314.

101. Herdegen T., Leah J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins // Brain Res. Brain Res. Rev. 1998. - V. 28, № 3. - P. 370-490.

102. Herdegen T., Skene P., Bahr, M. The c-Jun transcription factor— bipotential mediator of neuronal death, survival and regeneration // Trends Neurosci. 1997. - V. 20, № 5. - P. 227-231.

103. Herdegen T., Waetzig V. The JNK and p38 signal transduction following axotomy // Restor. Neurol. Neurosci. 2001. - V. 19, № 12. - P. 29-39.

104. Hirata K. HSP27 is markedly induced in Schwann cell columns and associated regenerating axons / Hirata K., He J., Hirakawa Y., Liu W., Wang S., Kawabuchi M. // Glia 2003. - V. 42, № 1. - P. 111.

105. Hirota H. Accelerated Nerve Regeneration in Mice by upregulated expression of interleukin (IL) 6 and IL-6 receptor after trauma / Hirota H., Kiyama H., Kishimoto T., Taga T. // J. Exp. Med. 1996. - V. 183, № 6. - P. 2627-2634.

106. Hoffmann A. The IkappaB-NF-kappaB signaling module: temporal control and selective gene activation / Hoffmann A., Levchenko A., Scott M. L., Baltimore D. // Science 2002. - V. 298, №5596.-P. 1241-1245.

107. Hokfelt T., Zhang X., Wiesenfeld-Hallin Z. Messenger plasticity in primary sensory neurons following axotomy and its functional implications // Trends Neurosci. 1994. - V. 17, № 1. - P. 22-30.

108. Hopkins S. J., Rothwell N. J. Cytokines and the nervous system. I: Expression and recognition // Trends Neurosci. 1995. - V. 18, № 2. - P. 83-88.

109. Horton A.R. Cytokines promote the survival of mouse cranial sensory neurones at different developmental stages / Horton A. R., Barlett P. F., Pennica D., Davies A. M. // Eur. J. Neurosci., 1998. -V. 10, № 2. - P. 673-679.

110. Huang C. J. Tumor necrosis factor modulates transcription of myelin basic protein gene through nuclear factor kappa B in a human oligodendroglioma cell line / Huang C. J., Nazarian R., Lee J., Zhao

111. P. M., Espinosa-Jeffrey A., de Vellis J. // Int. J. Dev. Neurosci. -2002. V. 20, № 3-5. - P. 289-296.

112. Huxford T. The crystal structure of the IkappaBalpha/NF-kappaB complex reveals mechanisms of NF-kappaB inactivation / Huxford T., Huang D. B., Malek S., Ghosh G. // Cell 1998. - V. 95, № 6. -P. 759-770.

113. Imhof A., Wolffe A. P. Transcription: gene control by targeted histone acetylation // Curr Biol. 1998. - V. 8, № 12. - P. 422-424.

114. Ito K., Adcock I. M. Histone acetylation and histone deacetylation // Mol. Biotechnol. 2002. - V. 20, № 1. - P. 99-106.

115. Julius D., Basbaum A. I. Molecular mechanisms of nociception // Nature 2001. - V. 413, № 6852. - P. 203-210.

116. Kaltschmidt B., Kaltschmidt C. Constitutive NF-kappa B activity is modulated via neuron-astroglia interaction // Exp. Brain Res. -2000. V. 130, № 1. - P. 100-104.

117. Kaltschmidt C. Constitutive NF-kappa B activity in neurons / Kaltschmidt C., Kaltschmidt B., Neumann H., Wekerle H., Baeuerle P. A. //Mol. Cell Biol. 1994. - V. 14, № 6. - P. 3981-3992.

118. Kataoka K., Kanje M., Dahlin, L.B. Induction of activating transcription factor 3 after different sciatic nerve injuries in adult rats // Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand Surg. 2007. - V. 41, № 4. -P. 158-166.

119. Kirsch M., Terheggen U., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor is an early lesion-induced retrograde signal for axotomized facial motoneurons // Mol. Cell Neurosci. 2003. - V. 24, № 1. - P. 130-138.

120. Koliatsos V. E., Price D. L. Axotomy as an experimental model of neuronal injury and cell death // Brain Pathol. 1996. - V. 6, № 4. - P. 447-465.

121. Kordula T., Travis J. The role of Stat and C/EBP transcription factors in the synergistic activation of rat serine protease inhibitor-3 gene by interleukin-6 and dexamethasone // Biochem. J. 1996. - V. 313, № Pt 3. - P. 1019-1027.

122. Krushel L. A. NF-kappaB activity is induced by neural cell adhesion molecule binding to neurons and astrocytes / Krushel L. A., Cunningham B. A., Edelman G. M., Crossin K. L. // J. Biol. Chem. -1999. V. 274, № 4. - P. 2432-2439.

123. Lawson S. N., Waddell P. J. Soma neurofilament immunoreactivity is related to cell size and fibre conduction velocity in rat primary sensory neurons // J. Physiol. 1991. - V. 435. - P. 4163.

124. Lee S. H., Hannink M. Characterization of the nuclear import and export functions of Ikappa B(epsilon) // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277, № 26. - P. 23358-23366.

125. Lernbecher T., Muller U., Wirth, T. Distinct NF-kappa B/Rel transcription factors are responsible for tissue-specific and inducible gene activation // Nature 1993. - V. 365, № 6448. - P. 767-770.

126. Levi-Montalcini R. The nerve growth factor 35 years later // Science — 1987. V. 237, № 4819. - P. 1154-1162.

127. Li Q., Verma I. M. NF-kappaB regulation in the immune system //Nat. Rev. Immunol. 2002. - V. 2, № 10. - P. 725-734.

128. Lindholm D. Interleukin-1 regulates synthesis of nerve growth factor in non-neuronal cells of rat sciatic nerve / Lindholm D., Heumann R., Meyer M., Thoenen H. // Nature 1987. - V. 330, № 6149.-P. 658-659.

129. Lindsay R. M. Neurotrophic factors: from molecule to man / Lindsay R. M., Wiegand S. J., Altar C. A., DiStefano P. S. // Trends Neurosci. 1994. - V. 17, № 5. - P. 182-190.

130. Lindwall C. Inhibition of c-Jun phosphorylation reduces axonal outgrowth of adult rat nodose ganglia and dorsal root ganglia sensory neurons / Lindwall C., Dahlin L., Lundborg G., Kanje M. // Mol. Cell Neurosci. 2004. - V. 27, № 3. - P. 267-279.

131. Lindwall C., Kanje M. Retrograde axonal transport of JNK signaling molecules influence injury induced nuclear changes in p-c-Jun and ATF3 in adult rat sensory neurons // Mol. Cell Neurosci. -2005. V. 29, № 2. - P. 269-282.

132. Lipniacki T. Mathematical model of NF-kappaB regulatory module / Lipniacki T., Paszek P., Brasier A. R., Luxon B., Kimmel M. // J. Theor. Biol., 2004. - V. 228, № 2. - P. 195-215.

133. Lu J. Interleukin-12 p40 promoter activity is regulated by the reversible acetylation mediated by HDAC1 and p300 / Lu J., Sun H., Wang X., Liu C., Xu X., Li F., Huang B. // Cytokine 2005. - V. 31, № l.-p. 46-51.

134. Lu X., Richardson P. M. Inflammation near the nerve cell body enhances axonal regeneration // J. Neurosci. 1991. - V. 11, № 4. -P. 972-978.

135. Lu X., Richardson P. M. Responses of macrophages in rat dorsal root ganglia following peripheral nerve injury // J. Neurocytol. -1993.-V. 22, №5.-P. 334-341.

136. Lu X., Richardson P. M. Changes in neuronal mRNAs induced by a local inflammatory reaction // J. Neurosci. Res. 1995. - V. 41, № 1. - P. 8-14.

137. Ma W., Bisby M. A. Increased activation of nuclear factor kappa B in rat lumbar dorsal root ganglion neurons following partial sciatic nerve injuries // Brain Res. 1998. - V. 797, № 2. - P. 243-254.

138. Maggirwar S. B. Nerve growth factor-dependent activation of NF-kappaB contributes to survival of sympathetic neurons / Maggirwar S. B., Sarmiere P. D., Dewhurst S., Freeman R. S. // J. Neurosci. 1998. - V. 18, № 24. - P. 10356-10365.

139. Makwana M., Raivich G. Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration // Febs. J. 2005. - V. 272, № 11. - P. 26282638.

140. Malek S., Huxford T., Ghosh G. Ikappa Balpha functions through direct contacts with the nuclear localization signals and the DNA binding sequences of NF-kappaB // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273, № 39. - P. 25427-25435.

141. Marks P. A., Richon V. M., et al. Histone deacetylase inhibitors as new cancer drugs // Curr Opin. Oncol. 2001. - V. 13, № 6. - P. 477-483.

142. Martinez-Balbas M. A. Regulation of E2F1 activity by acetylation / Martinez-Balbas M. A., Bauer U. M., Nielsen S. J., Brehm A., Kouzarides T. // Embo. J. 2000. - V. 19, № 4. - P. 662671.

143. Matsusaka T. Transcription factors NF-IL6 and NF-kappa B synergistically activate transcription of the inflammatory cytokines, interleukin 6 and interleukin 8 / Matsusaka T., Fujikawa K., Nishio

144. Y., Mukaida N., Matsushima K., Kishimoto T., Akira S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. - V. 90, № 21. - P. 10193-10197.

145. Mattson M. P. Insulating axons via NF-kappaB // Nat. Neurosci. -2003.-V. 6, №2.-P. 105-6.

146. Mattson M. P., Camandola S. NF-kappaB in neuronal plasticity and neurodegenerative disorders // J. Clin. Invest. 2001. - V. 107, № 3. - P. 247-254.

147. May M. J., Ghosh S. (1997) Rel/NF-kappa B and I kappa B proteins: an overview // Semin. Cancer Biol. 1997. - V. 8, № 2. - P. 63-73.

148. McKay Hart A. Primary sensory neurons and satellite cells after peripheral axotomy in the adult rat: timecourse of cell death and elimination / McKay Hart A., Brannstrom T., Wiberg M., Terenghi G. // Exp. Brain. Res. 2002. - V. 142, № 3. - P. 308-318.

149. Meberg P. J. Gene expression of the transcription factor NF-kappa B in hippocampus: regulation by synaptic activity / Meberg P. J., Kinney W. R., Valcourt E. G., Routtenberg A. // Brain. Res. Mol. Brain. Res. 1996. - V. 38, № 2. - P. 179-190.

150. Meffert M. K., Baltimore D. Physiological functions for brain NF-kappaB // Trends Neurosci. 2005. - V. 28, № 1. - P. 37-43.

151. Meffert M. K. NF-kappa B functions in synaptic signaling and behavior / Meffert M. K., Chang J. M., Wiltgen B. J., Fanselow M. S., Baltimore D. // Nat. Neurosci. 2003. - V. 6, № 10. - P. 10721078.

152. Memet S. NF-kappaB functions in the nervous system: from development to disease // Biochem. Pharmacol. 2006. - V. 72, № 9. -P. 1180-1195.

153. Menager C. PIP3 is involved in neuronal polarization and axon formation / Menager C., Arimura N., Fukata Y., Kaibuchi K. // J. Neurochem. 2004. - V. 89, № 1. - P. 109-118.

154. Millan M. J. The induction of pain: an integrative review // Prog. Neurobiol. 1999. - V. 57, № 1. - P. 1-164.

155. Mosialos G., Gilmore T. D. V-Rel and c-Rel are differentially affected by mutations at a consensus protein kinase recognition sequence // Oncogene 1993. - V. 8, № 3. - P. 721-730.

156. Murphy P. G. Nature of the retrograde signal from injured nerves that induces interleukin-6 mRNA in neurons / Murphy P. G., Borthwick L. S., Johnston R. S., Kuchel G., Richardson P. M. // J. Neurosci. 1999. - V. 19, № 10. - P. 3791-3800.

157. Murphy P. G. Induction of interleukin-6 in axotomized sensory neurons / Murphy P. G., Grondin J., Altares M., Richardson P. M. // J. Neurosci. 1995. - V. 15, № 7 Pt 2. - P. 5130-5138.

158. Myers R. R. Inhibition of p38 MAP kinase activity enhances axonal regeneration / Myers R. R., Sekiguchi Y., Kikuchi S., Scott B., Medicherla S., Protter A., Campana W. M. // Exp. Neurol. -2003. V. 184, № 2. - P. 606-614.

159. Nadeau S. A transcriptional role for C/EBP beta in the neuronal response to axonal injury / Nadeau S., Hein P., Fernandes K. J., Peterson A. C., Miller F. D. // Mol. Cell Neurosci. 2005. - V. 29, № 4. - P. 525-535.

160. Nagy J. I. Fluoride-resistant acid phosphatase-containing neurones in dorsal root ganglia are separate from those containing substance P or somatostatin //Neuroscience 1982. - V. 7, № 1. - P. 89-97.

161. Natoli G. Tuning up inflammation: how DNA sequence and chromatin organization control the induction of inflammatory genes by NF-kappaB // FEBS Lett. 2006. - V. 580, № 12. - P. 2843-2849.

162. Neumann S. Regeneration of sensory axons within the injured spinal cord induced by intraganglionic cAMP elevation / Neumann S., Bradke F., Tessier-Lavigne M., Basbaum A. I. // Neuron 2002.- V. 34, № 6. P. 885-893.

163. Neumann S., Woolf C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury // Neuron 1999.-V. 23, № l.-P. 83-91.

164. Nickols J. C. Activation of the transcription factor NF-kappaB in Schwann cells is required for peripheral myelin formation / Nickols J. C., Valentine W., Kanwal S., Carter B. D. //Nat. Neurosci. 2003.- V. 6, №2.-P. 161-167.

165. Nonaka M. Prolonged activation of NF-kappaB following traumatic brain injury in rats / Nonaka M., Chen X. H., Pierce J. E., Leoni M. J., Mcintosh T. K., Wolf J. A., Smith D. H. // J. Neurotrauma 1999. - V. 16, № 11. - P. 1023-1034.

166. Norlin S., Ahlgren U., Edlund H. Nuclear factor-{kappa}B activity in {beta}-cells is required for glucose-stimulated insulin secretion // Diabetes 2005. - V. 54, № 1. - P. 125-132.

167. Ohmori Y., Hamilton T. A. The interferon-stimulated response element and a kappa B site mediate synergistic induction of murine IP-10 gene transcription by IFN-gamma and TNF-alpha // J. Immunol. 1995. - V. 154, № 10. - P. 5235-5244.

168. O'Keeffe G. W. NGF-promoted axon growth and target innervation requires GITRL-GITR signaling / O'Keeffe G. W., Gutierrez H., Pandolfi P. P., Riccardi C., Davies A. M. // Nat. Neurosci. 2008. - V. 11, № 2. - P. 135-142.

169. O'Neill L. A., Kaltschmidt C. NF-kappa B: a crucial transcription factor for glial and neuronal cell function // Trends Neurosci. 1997.- V. 20, № 6. P. 252-258.

170. Pasparakis M., Luedde T., Schmidt-Supprian M. Dissection of the NF-kappaB signalling cascade in transgenic and knockout mice // Cell Death Differ 2006. - V. 13, № 5. - P. 861-872.

171. Pearson A. G. ATF3 enhances c-Jun-mediated neurite sprouting / Pearson A. G., Gray C. W., Pearson J. F., Greenwood J. M., During M. J., Dragunow M. // Brain Res. Mol. Brain Res. 2003. - V. 120, № l.-P. 38-45.

172. Pennypacker K. R. NF-kappaB p50 is increased in neurons surviving hippocampal injury / Pennypacker K. R., Kassed C. A.,

173. Eidizadeh S., Saporta S., Sanberg P. R., Willing A. E. // Exp. Neurol. 2001. - V. 172, № 2. - P. 307-319.

174. Perkins N. D. Regulation of NF-kappaB by cyclin-dependent kinases associated with the p300 coactivator / Perkins N. D., Felzien L. K., Betts J. C., Leung K., Beach D. H., Nabel G. J. // Science -1997. V. 275, № 5299. - P. 523-527.

175. Perlson E. From snails to sciatic nerve: Retrograde injury signaling from axon to soma in lesioned neurons / Perlson E., Hanz S., Medzihradszky K. F., Burlingame A. L. Fainzilber M. // J. Neurobiol. 2004. - V. 58, № 2. - P. 287-294.

176. Perry V. H., Brown M. C. Macrophages and nerve regeneration // Curr Opin. Neurobiol. 1992. - V. 2, № 5. - P. 679-682.

177. Phelps C. B. Mechanism of I kappa B alpha binding to NF-kappa B dimers / Phelps C. B., Sengchanthalangsy L. L., Huxford T., Ghosh G. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275, № 38. - P. 29840-29846.

178. Phelps C. B. Mechanism of kappa B DNA binding by Rel/NF-kappa B dimers / Phelps C. B., Sengchanthalangsy L. L., Malek S., Ghosh G. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275, № 32. - P. 24392-24399.

179. Pierucci A., de Oliveira A. L. Increased sensory neuron apoptotic death 2 weeks after peripheral axotomy in C57BL/6J mice compared to A/J mice //Neurosci. Lett. 2006. - V. 396, № 2. - P. 127-131.

180. Ping D. Nuclear factor-kappa B p65 mediates the assembly and activation of the TNF-responsive element of the murine monocyte chemoattractant-1 gene / Ping D., Boekhoudt G. H., Rogers E. M., Boss J. M. // J. Immunol. 1999. - V. 162, № 2. - P. 727-734.

181. Plunet W., Kwon B. K., Tetzlaff W. Promoting axonal regeneration in the central nervous system by enhancing the cellbody response to axotomy // J. Neurosci. Res. 2002. - V. 68, № 1. -P. 1-6.

182. Pollock G. Activation of NF-kappaB in the mouse spinal cord following sciatic nerve transection / Pollock G., Pennypacker K. R., Memet S., Israel A., Saporta S. // Exp. Brain. Res. 2005. - V. 165, № 4. - P. 470-477.

183. Povelones M. An NF-kappaB-like transcription factor in axoplasm is rapidly inactivated after nerve injury in Aplysia / Povelones M., Tran K., Thanos D., Ambron R. T. // J. Neurosci. -1997. V. 17, № 13. - P. 4915-4920.

184. Qin Z. H. Nuclear factor-kappa B contributes to excitotoxin-induced apoptosis in rat striatum / Qin Z. H., Wang Y., Nakai M., Chase T. N. // Mol. Pharmacol. 1998. - V. 53, № 1. - P. 33-42.

185. Qiu J. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration requires signal transducer and activator of transcription 3 activation / Qiu J., Cafferty W. B., McMahon S. B., Thompson S. W. // J. Neurosci. 2005. - V. 25, № 7. - P. 1645-1653.

186. Qiu J. Spinal axon regeneration induced by elevation of cyclic AMP / Qiu, J., Cai D., Dai H., McAtee M., Hoffman P. N., Bregman B. S., Filbin M. T. // Neuron 2002. - V. 34, № 6. - P. 895-903.

187. Quivy V., Van Lint C. Regulation at multiple levels of NF-kappaB-mediated transactivation by protein acetylation // Biochem. Pharmacol. 2004. - V. 68, № 6. - P. 1221-1229.

188. Ueno M. Differential induction of JE/MCP-1 in subclones from a murine macrophage cell line, RAW 264.7: role of kappaB-3 binding protein / Ueno M., Sonoda Y., Funakoshi M., Mukaida N., Nose K., Kasahara T. // Cytokine 2000. - V. 12. - P. 207-219.

189. Rahman I., Marwick J., Kirkham P. Redox modulation of chromatin remodeling: impact on histone acetylation and deacetylation, NF-kappaB and pro-inflammatory gene expression // Biochem. Pharmacol., 2004. - V. 68, № 6. - P. 1255-1267.

190. Raivich G., Hellweg R., Kreutzberg G. W. NGF receptor-mediated reduction in axonal NGF uptake and retrograde transport following sciatic nerve injury and during regeneration // Neuron -1991. -V. 7, № 1. P. 151-164.

191. Raivich G., Makwana M. The making of successful axonal regeneration: genes, molecules and signal transduction pathways // Brain Res. Rev. 2007. - V. 53, № 2. - P. 287-311.

192. Rannie S. S. a. D., Clarke A. R. Analysis of Transgenic Mice // Transgenic techniques, Principles and Protocols. 2002. - P. 305343.

193. Richardson P. M., Issa V. M., Aguayo A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat // J. Neurocytol. 1984. - V. 13, № 1. - P. 165-182.

194. Richardson P. M., Lu X. Inflammation and axonal regeneration // J. Neurol. 1994. - V. 242, № 1 Suppl 1 . - P. 57-60.

195. Ritter A. M. Requirement for nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors in vivo / Ritter A. M., Lewin G. R., Kremer N. E., Mendell L. M. // Nature 1991. - V. 350, № 6318. - P. 500-502.

196. Rong Y., Baudry M. Seizure activity results in a rapid induction of nuclear factor-kappa B in adult but not juvenile rat limbic structures // J. Neurochem. 1996. - V. 67, № 2. - P. 662-668.

197. Rossi F., Gianda S., Corvetti L. Regulation of intrinsic neuronal properties for axon growth and regeneration // Prog. Neurobiol. -2007. -V. 81, №1. -P. 1-28.

198. Rothwell N. J., Hopkins S. J. Cytokines and the nervous system II: Actions and mechanisms of action // Trends Neurosci. 1995. -V. 18, № 2. - P. 130-136.

199. Ryan C. M. Functional interaction of CREB binding protein (CBP) with nuclear transport proteins and modulation by HDAC inhibitors / Ryan C. M., Harries J. C., Kindle K. B., Collins H. M., Heery D. M. // Cell Cycle 2006. - V. 5, № 18. - P. 2146-2152.

200. Saccani S., Natoli G. Dynamic changes in histone H3 Lys 9 methylation occurring at tightly regulated inducible inflammatory genes // Genes Dev. 2002. - V. 16, № 17. - P. 2219-2224.

201. Saccani S., Pantano S., Natoli G. Two waves of nuclear factor kappaB recruitment to target promoters // J. Exp. Med. 2001. - V. 193, № 12.-P. 1351-1359.

202. Saha R. N., Jana M., Pahan K. MAPK p38 regulates transcriptional activity of NF-kappaB in primary human astrocytes via acetylation of p65 // J. Immunol. 2007. - V. 179, № 10. - P. 7101-7109.

203. Sakurai H. IkappaB kinases phosphoiylate NF-kappaB p65 subunit on serine 536 in the transactivation domain / Sakurai H.,

204. Chiba H., Miyoshi H., Sugita T., Toriumi W. // J. Biol. Chem. -1999. V. 274, № 43. - P. 30353-30356.

205. Sanz O. NF-kappaB and IkappaBalpha expression following traumatic brain injury to the immature rat brain / Sanz O., Acarin L., Gonzalez B., Castellano B. // J. Neurosci. Res. 2002. - V. 67, № 6. -P. 772-780.

206. Schafer M. Disruption of the gene for the myelin-associated glycoprotein improves axonal regrowth along myelin in C57BL/Wlds mice / Schafer M., Fruttiger M., Montag D., Schachner M., Martini R. // Neuron 1996. - V. 16, № 6. - P. 1107-1113.

207. Schmidt-Ullrich R. Requirement of NF-kappaB/Rel for the development of hair follicles and other epidermal appendices / Schmidt-Ullrich R., Aebischer T., Hulsken J., Birchmeier W.,

208. Klemm U., Scheidereit C. // Development 2001. - V. 128, № 19. -P. 3843-3853.

209. Schmidt-Ullrich R. NF-kappaB activity in transgenic mice: developmental regulation and tissue specificity / Schmidt-Ullrich R., Memet S., Lilienbaum A., Feuillard J., Raphael M., Israel A. // Development 1996. - V. 122, № 7. - P. 2117-2128.

210. Schroeter M., Kury P., Jander S. Inflammatory gene expression in focal cortical brain ischemia: differences between rats and mice // Brain Res. Mol. Brain Res. 2003. - V. 117, № 1. - P. 1-7.

211. Schneider A. NF-kappaB is activated and promotes cell death in focal cerebral ischemia / Schneider A., Martin-Villalba A., Weih F., Vogel J., Wirth T., Schwaninger M. // Nat. Med. 1999. - V. 5, № 5. - P. 554-559.

212. Schweizer, U. Conditional gene ablation of Stat3 reveals differential signaling requirements for survival of motoneurons during development and after nerve injury in the adult / Schweizer U., Gunnersen, J., Karch C., Wiese S., Holtmann B., Takeda K.,

213. Akira S., Sendtner M. // J. Cell Biol. 2002. - V. 156, № 2. - P. 287297.

214. Seijffers R., Mills C. D., Woolf C. J. ATF3 increases the intrinsic growth state of DRG neurons to enhance peripheral nerve regeneration // J. Neurosci. 2007. - V. 27, № 30. - P. 7911-7920.

215. Seitz C. S. Alterations in NF-kappaB function in transgenic epithelial tissue demonstrate a growth inhibitory role for NF-kappaB / Seitz C. S., Lin Q., Deng H., Khavari P. A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. - V. 95, № 5. - P. 2307-2312.

216. Sen R., Baltimore D. Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein Nf-kappa B by a posttranslational mechanism // Cell 1986. - V. 47, № 6. - P. 921-928.

217. Sendtner M. Ciliary neurotrophic factor / Sendtner M., Carroll P., Holtmann B., Hughes R. A., Thoenen H. // J. Neurobiol. 1994. - V. 25, № 11.-P. 1436-1453.

218. Sendtner M., Gotz R., Thoenen H. Endogenous ciliary neurotrophic factor is a lesion factor for axotomized motoneurons in adult mice // J. Neurosci. 1997. - V. 17, № 18. - P. 6999-7006.

219. Shadiack A. M. Interleukin-1 induces substance P in sympathetic ganglia through the induction of leukemia inhibitory factor (LIF) / Shadiack A.M., Hart R. P., Carlson C. D., Jonakait G. M. // J. Neurosci. 1993. - V. 13, № 6. - P. 2601-2609.

220. Shadiack A. M., Sun Y., Zigmond R. E. Nerve growth factor antiserum induces axotomy-like changes in neuropeptide expression in intact sympathetic and sensory neurons // J. Neurosci. 2001. - V. 21,№2.-P. 363-371.

221. Shaffer A. L. Signatures of the immune response / Shaffer A. L., Rosenwald A., Hurt E. M., Giltnane J. M., Lam L. T., Pickeral O. K., Staudt L. M. // Immunity 2001. - V. 15j № 3. - P. 375-385.

222. Sheu J. Y., Kulhanek D. J., Eckenstein F. P. Differential patterns of ERK and STAT3 phosphorylation after sciatic nerve transection in the rat // Exp. Neurol. 2000. - V. 166, № 2. - P. 392-402.

223. Shewan D., Berry M., Cohen J. Extensive regeneration in vitro by early embryonic neurons on immature and adult CNS tissue // J. Neurosci. 1995. - V. 15, № 3 Pt 1 . - P. 2057-2062.

224. Shubayev V. I., Myers R. R. Axonal transport of TNF-alpha in painful neuropathy: distribution of ligand tracer and TNF receptors // J. Neuroimmunol. 2001. - V. 114, № 1-2. - P. 48-56.

225. Simeonidis S. Mechanisms by which IkappaB proteins control NF-kappaB activity / Simeonidis S., Stauber D., Chen G., Hendrickson W. A., Thanos D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. - V. 96, № l.-p. 49-54.

226. Singh H. A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes / Singh H., Sen R., Baltimore D., Sharp P. A. // Nature 1986. - V. 319,№6049.-P. 154-158.

227. Skene J. H. Axonal growth-associated proteins // Annu. Rev. Neurosci. 1989. - V. 12. - P. 127-156.

228. Smith D. S., Skene J. H. A transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth // J. Neurosci. 1997. - V. 17, № 2. - P. 646-658.

229. Snider W. D. Signaling the pathway to regeneration / Snider W. D., Zhou F. Q., Zhong J., Markus A. // Neuron 2002. - V. 35. № 1. -P. 13-16.

230. Sterner D. E., Berger S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. -V. 64, № 2. - P. 435-459.

231. Subang M. C., Richardson P. M. Influence of injury and cytokines on synthesis of monocyte chemoattractant protein-1 mRNA in peripheral nervous tissue // Eur. J. Neurosci. 2001. - V. 13, №3.-P. 521-528.

232. Sung Y. J., Chiu D. T., Ambron R. T. Activation and retrograde transport of protein kinase G in rat nociceptive neurons after nerveinjury and inflammation // Neuroscience 2006. - V. 141, № 2. - P. 697-709.

233. Suuronen T. Regulation of microglial inflammatory response by histone deacetylase inhibitors / Suuronen T., Huuskonen J., Pihlaja R., Kyrylenko S., Salminen A. // J. Neurochem. 2003. - V. 87, № 2. -P. 407-416.

234. Thanos P. K., Okajima S., Terzis J. K. Ultrastructure and cellular biology of nerve regeneration // J. Reconstr. Microsurg. 1998. - V. 14, № 6. - P. 423-436.

235. Ueno M. Differential induction of JE/MCP-1 in subclones from a murine macrophage cell line, RAW 264.7: role of kappaB-3 binding protein / Ueno M., Sonoda Y., Funakoshi M., Mukaida N., Nose K., Kasahara T. // Cytokine 2000. - V. 12, № 3. - P. 207-19.

236. Van Lint C., Emiliani S., Verdin E. The expression of a small fraction of cellular genes is changed in response to histone hyperacetylation // Gene Expr. 1996. - V. 5, № 4-5. - P. 245-253.

237. Verge V. M. K. Neurotrophin and nerve injury in the adult / Verge V. M. K., K. A. G., Karchewski L. A., Richardson P.M. // Phil.Trans.R.Soc.Lond 1996. - V. 351. - P. 423-430.

238. Verma I. M. Rel/NF-kappa B/I kappa B family: intimate tales of association and dissociation. / Verma I. M., Stevenson J. K., Schwarz E. M., Van Antwerp D., Miyamoto S. // Genes Dev. 1995. - V. 9, № 22. - P. 2723-2735.

239. Verma P. Axonal protein synthesis and degradation are necessary for efficient growth cone regeneration / Verma P., Chierzi S., Codd A. M., Campbell D. S., Meyer R. L., Holt C. E., Fawcett J. W. // J. Neurosci. 2005. - V. 25, № 2. - P. 331-342.

240. Vermeulen L. Regulation of the transcriptional activity of the nuclear factor-kappaB p65 subunit / Vermeulen L., De Wilde G., Notebaert S., Vanden Berghe W., Haegeman G. // Biochem. Pharmacol. 2002. - V. 64, № 5-6. - P. 963-970.

241. Vermeulen L. Transcriptional activation of the NF-kappaB p65 subunit by mitogen- and stress-activated protein kinase-1 (MSK1) / Vermeulen L., De Wilde G., Van Damme P., Vanden Berghe W., Haegeman G. // Embo. J. 2003. - V. 22, № 6. - P. 1313-1324.

242. Voytik S. L. Differential expression of muscle regulatory factor genes in normal and denervated adult rat hindlimb muscles / Voytik S. L., Przyborski M., Badylak S. F., Konieczny S. F. // Dev. Dyn. -1993. V. 198, № 3. - P. 214-224.

243. Wang C. Y. NF-kappaB antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAPl and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation / Wang C. Y., Mayo M. W., Korneluk R. G., Goeddel D. V., Baldwin A. S., Jr. // Science 1998. - V. 281, № 5383. - P. 1680-1683.

244. Ward N. L., Hagg T. SEK1/MKK4, c-Jun and NFKappaB are differentially activated in forebrain neurons during postnatal development and injury in both control and p75NGFR-deficient mice // Eur. J. Neurosci. 2000. - V. 12, № 6. - P. 1867-1881.

245. Weis K. Regulating access to the genome: nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle // Cell 2003. - V. 112, № 4. - P. 441-451.

246. Wellmann H., Kaltschmidt B., Kaltschmidt C. Retrograde transport of transcription factor NF-kappa B in living neurons // J. Biol. Chem.-2001.-V. 276, № 15.-P. 11821-11829.

247. Werbajh S. RAC-3 is a NF-kappa B coactivator / Werbajh S., Nojek L, Lanz R., Costas M. A. // FEBS Lett. 2000. - V. 485, № 2-3.-P. 195-199.

248. Werner A. Impaired axonal regeneration in alpha7 integrin-deficient mice / Werner A., Willem M., Jones L. L., Kreutzberg G. W., Mayer U., Raivich G. // J. Neurosci. 2000. - V. 20, № 5. p. 1822-1830.

249. Whiteside G. Differential time course of neuronal and glial apoptosis in neonatal rat dorsal root ganglia after sciatic nerve axotomy / Whiteside G., Doyle C. A., Hunt S. P., Munglani R. // Eur. J. Neurosci. 1998. - V. 10, № 11. - P. 3400-3408.

250. Wood J. N. Regulation of NF-kappa B activity in rat dorsal root ganglia and PC 12 cells by tumour necrosis factor and nerve1 growth factor //Neurosci. Lett. 1995. - V. 192, № 1. - P. 41-44.

251. Wu R. C. Regulation of SRC-3 (pCIP/ACTR/AIB-l/RAC-3/TRAM-l) Coactivator activity by I kappa B kinase / Wu R. C., Qin J., Hashimoto Y., Wong J., Xu J., Tsai S. Y., Tsai M. J., O'Malley B. W. // Mol. Cell Biol. 2002. - V. 22, № 10. - P. 3549-3561.

252. Yoo S. Plasmalemmal sealing of transected mammalian neurites is a gradual process mediated by Ca(2+)-regulated proteins / Yoo S., Nguyen M. P., Fukuda M., Bittner G. D., Fishman H. M. // J. Neurosci. Res. 2003. - V. 74, № 4. - P. 541-551.

253. Yoshida M., Horinouchi S., Beppu T. Trichostatin A and trapoxin: novel chemical probes for the role of histone acetylation in chromatin structure and function // Bioessays 1995. - V. 17, № 5. -P. 423-430.

254. Yoshida M. Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A / Yoshida M., Kijima M., Akita M., Beppu T. // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265, № 28. - P. 17174-17179.

255. Zhang X. Interacting regions in Stat3 and c-Jun that participate in cooperative transcriptional activation / Zhang X., Wrzeszczynska M. H., Horvath C. M., Darnell J. E., Jr. // Mol. Cell Biol. 1999. - V. 19, № 10. - P. 7138-7146.

256. Zhong H. The phosphorylation status of nuclear NF-kappa B determines its association with CBP/p300 or HDAC-1 / Zhong H., May M. J., Jimi E., Ghosh S. // Mol. Cell 2002. - V. 9, № 3. - P. 625-636.

257. Zhong H., Voll R. E., Ghosh S. Phosphorylation of NF-kappa B p65 by PKA stimulates transcriptional activity by promoting a novel bivalent interaction with the coactivator CBP/p300 // Mol. Cell -1998.-V. 1, № 5. P. 661-671.

258. Zhong J. Sensory impairments and delayed regeneration of sensory axons in interleukin-6-deficient mice / Zhong J., Dietzel I.

259. D., Wahle P., Kopf M., Heumann R. // J. Neurosci. 1999. - V. 19, № 11. - P. 4305-4313.

260. Zhou F. Q., Snider W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth // Philos. Trans. R Soc. Lond В Biol. Sci. 2006. - V. 361, № 1473. - P. 1575-1592.

261. Zhou F. Q., Walzer M. A., Snider W. D. Turning on the machine: genetic control of axon regeneration by c-Jun // Neuron 2004. - V. 43, № 1. - P. 1-2.

Информация о работе

Гущина, Светлана Валентиновна
доктора биологических наук
Саранск, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Сигнальные пути ядерного транскрипционного фактора Каппа в (NF-kB) в чувствительных нейронах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы