Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса

Никитина, Любовь Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса"

На правах рукописи

003490632

НИКИТИНА Любовь Сергеевна

МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ СИГНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ АПОПТОЗА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ВАЗОПРЕССИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ГИПОТАЛАМУСА

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8ЙНВЭД

Санкт-Петербург 2009

003490692

Работа выполнена в лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокринологии Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущее научное учреждение:

кандидат биологических наук Черниговская Елена Валерьевна

доктор биологических наук, профессор Аврова Наталья Федоровна

доктор биологических наук, Ордян Наталья Здуардовна

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

Защита диссертации состоится «9» февраля 2010 года в 11 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.127.01) при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44).

Автореферат разослан « М- » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

М.Н. Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Исследование сигнальных белков апоптоза в настоящее время в основном сфокусировано на анализе механизмов их взаимодействия в процессе регуляции клеточного цикла и апоптоза различных типов клеток. Особенный интерес вызывает роль белков апоптоза в нейронах, пролиферация и массовая программированная табель которых заканчивается в раннем онтогенезе, но белки апоптоза продолжают синтезироваться в дифференцированных нейронах в течение всей жизни организма. Существование экспрессии сигнальных белков апоптоза в дифференцированных жизнеспособных нейронах позволяют предположить возможность их участия в процессах напрямую с апоптозом; не связанных, однако данных об участии белков апоптоза в регуляции нейрональной активности в настоящее время чрезвычайно мало. В частности, было показано, что белки семейства BCL-2 (B-cell lymphoma 2), помимо регуляции митохондриального пути апоптоза [Kroemer et al., 1997], участвуют в регуляции роста аксонов [Jiao et al., 2005], и необходимы для осуществления синаптической пластичности [Fannjiang et al., 2003; Hickman et al., 2008; Jonas et al., 2003]. Транскрипционный фактор p53 (tumor protein 53) также является полифункциональным белком. Помимо регуляции клеточного цикла и апоптоза [Lane, 1993], р53 также участвует в регуляции экспрессии глюкокортикоидных рецепторов [Nishimura et al., 2004].

На основании результатов, полученных Черниговской с соавторами, и исходя из литературных данных, очевидно, что Вс1-2 и р53 экспрессируются в значительном количестве в нейронах ЦНС, в частности, в гипоталамических нейронах у взрослых интактных животных. Показано, что стресс, в том числе дегидратация (специфическое воздействие, вызывающее активацию вазопрессинергических нейросекреторных клеток) приводит к усилению экспрессии в них белков апоптоза (Вс1-2, р53), не вызывая гибель нейронов [Chernigovskaya et al., 2005; Nishimura et al., 2004]. Более того, показано, что нокаут генов, кодирующих р53 и Вс1-2, влияет на специфические функции вазопрессинергических и катехоламинергических нейронов на уровне синтеза и выведения нейрогормонов из тел клеток [Chernigovskaya et al., 2005], что свидетельствует о важной роли белков апоптоза в регуляции функциональной активности нейронов. Очевидно, что белки апоптоза не являются основными регуляторами функциональной активности нейронов. Более вероятно, что Вс1-2 и р53 оказывают модулирующее влияние на биосинтез нейропептидов. Однако непосредственные мишени Вс1-2 и р53 в регуляции функциональной активности нейронов мозга пока не обнаружены.

Показано, что Вс1-2 и р53 активируют ERK1/2 сигнальный каскад (киназный каскад, регулируемый внеклеточными сишалами) [Singh et al., 2007; Wang et al., 1996], который, вовлечен в регуляцию пролиферации и дифференцировки клеток [Pearson et al., 2001]. Кроме того, существуют немногочисленные данные об участии ERK1/2 каскада в регуляции биосинтеза

ряда нейрогрансмитгеров [Arima et al., 2002; Ma et al., 2005]. Взаимодействие ERKl/2 каскада с сигнальными белками апоптоза в регуляции функциональной активности нейронов не изучалось.

Вазопрессинергические нейросекреторные нейроны гипоталамуса являются хорошей моделью для изучения возможности и механизмов участия Вс1-2 и р53 в регуляции нейрональной активности в связи с высокой секреторной активностью этих нейронов, позволяющей дифференциально оценивать изменения уровня синтеза и темпов выведения вазопрессина. Механизмы регуляции транспорта и выведения вазопрессинергических секреторных гранул к настоящему времени остаются слабо изученными. Анализ малочисленных литературных данных показал, что одним из белков, непосредственно осуществляющих антероградный транспорт, может быть кинезин [Senda, Yu, 1999]. Непосредственное изучение роли кинезина в реализации антероградного транспорта вазопрессина также практически не проводилось. Механизмы регуляции биосинтеза вазопрессина исследуются уже на протяжении нескольких десятилетий, и на первый взгляд являются хорошо изученными. Одним из ключевых факторов, отвечающих за транскрипцию вазопрессина нейронами гипоталамуса, является цАМФ. Промотор гена вазопрессина содержит CRE (cAMP response element), с которым связывается транскрипционный фактор CREB (cAMP response element binding protein), который в вазопрессинергических нейросекреторных нейронах гипоталамуса регулируется преимущественно протеинкиназой A [Burbach et al., 2001]. На основании экспериментов in vitro в различных типах клеток показано, что в фосфорилировапии и активации CREB помимо протеинкиназы А, участвуют также другие протеинкиназы, в том числе относящиеся к ERK1/2 каскаду [Johannessen et al., 2004]. Более того, существуют данные об участии ERK1/2 сигнального каскада в регуляции циркадианного ритма экспрессии гена вазопрессина нейронами супрахиазматического ядра [Arima et al., 2002]. Несмотря на то, что протеинкиназа А очевидно не является единственной киназой, регулирующей транскрипцию вазопрессина за счет активации транскрипционного фактора CREB, данных о возможном участии ERK.l/2-каскада в регуляции экспрессии вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса в литературе найдено не было.

Таким образом, очевидна необходимость детального исследования взаимодействия сигнальных белков апоптоза Вс1-2 и р53 с ERKl/2-каскадом и транскрипционным фактором CREB в регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов гипоталамуса. Актуальность изучения этой проблемы основана на важности понимания механизмов взаимодействия различных белков апоптоза с другими внутриклеточными посредниками в функционировании клетки в физиологических условиях и при патологии.

Целью исследования было изучение механизмов влияния сигнальных белков апоптоза на функциональную активность вазопрессинергических нейронов гипоталамуса крыс. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить возможность участия, характер и механизмы влияния ЕШС1/2 сигнального каскада на функциональную активность вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса.

2. Исследовать характер прямого влияния антиапоптозного белка Вс1-2 на активность киназ ЕМС1/2 сигнального каскада и транскрипционных факторов Е1к1 и СПЕВ, а также на синтез и скорость выведения вазопрессина нейронами гипоталамуса.

3. Изучить характер прямого влияния проапоптозного белка р53 на активность киназ ЕЯК1/2 сигнального каскада и транскрипционных факторов Е1к1 и СЯЕВ, а также на синтез и скорость выведения вазопрессина нейронами супраоптического ядра.

Научная новизна

Впервые была выявлена активация киназ ЕИК1/2 каскада и транскрипционных факторов Е1к1 и СПЕВ в вазопрессинергических нейронах гипоталамуса при водной депривации. Впервые было установлено, что киназы Е11К1/2 сигнального каскада участвуют в регуляции синтеза и секреции вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса. Была показана зависимость распределения транспортного белка кинезина от активности ЕЖ 1/2 киназы.

Впервые было установлено активирующее влияние антиапоптозного белка Вс1-2 и транскрипционного фактора СЯЕВ на активность синтеза, вазопрессина.

Впервые было выявлено активирующее влияние р53 на секрецию вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса, выражавшееся в регуляции транспорта и выведения нейрогормона. Было показано, что р53 влияет на интенсивность секреции вазопрессина за счет активации ЕШС1/2 киназы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ЕШС1/2 сигнальный каскад вызывает активацию транскрипционных факторов Е1к1 и СКЕВ, что приводит к усилению синтеза вазопрессина нейронами гипоталамуса, а также участвует в регуляции секреции вазопрессина, вызывая увеличение синтеза транспортного белка кинезина.

2. Антиапоптозный белок Вс1-2 и транскрипционный фактор CR.EE! участвуют в активации синтеза вазопрессина независимо от Е11К1/2 сигнального каскада.

3. Проапоптозный белок р53 оказывает модулирующее активирующее действие на секрецию вазопрессина, и это влияние опосредовано ЕЯК1/2 киназой.

Теоретическая и практическая значимость

Исследование имеет фундаментальное значение для понимания роли сигнальных белков апоптоза Вс1-2 и р53 в модуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов, что открывает новые перспективы в изучении взаимозависимости функциональной активности нейронов и их жизнеснособности. Понимание механизмов взаимодействия различных белков апоптоза с внутриклеточными посредниками лежит также в основе разработки новых подходов к лечению онкологических заболеваний, а также ряда нейродегенеративных заболеваний, патогенез которых связан с нарушением баланса про- и антиапоптозных белков. Более того, к настоящему времени блокаторы Вс1-2 и р53 (НА14-1 и Pifithrin-a соответственно) используются в терапии онкологических заболеваний периферических тканей, в связи с чем необходимо учитывать возможность влияния этих фармакологических агентов на центральную нервную систему. Полученные в работе данные могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтах.

Апробация работы

Результаты исследования доложены и обсуждены на 1 Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005), на XIII международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на 5 международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения-2006» (Санкт-Петербург, 2006), на 6-th ICN (Питгсбург, США 2006), на XX съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Санкт-Петербург, 2007), на Международной конференции «Apoptosis World 2008. From mechanisms to applications» (Люксембург, 2008), на Конференции с международным участием "Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга" (С.-Петербург, 2008), на 11-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователь «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2008), на 4th Conference on Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders (Лейпциг, Германия, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 работ, 2 из которых - статьи в рецензируемых журналах, 17 тезисов докладов.

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при содействии Российского Фонда Фундаментальных исследований (проекты 05-04-48099 и 08-04-00028)

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 16 отечественных и 165 зарубежных источников. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 таблицами и 49 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для изучения возможности участия сигнальных белков апоптоза и киназ ERK1/2 сигнального каскада в регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов гипоталамуса мы провели эксперименты, в которых взрослых крыс линии Вистар подвергали водной депривации. Животных опытной группы (п=11) в течение 3-х дней содержали в клетках со свободным доступом к сухому корму, но без воды. Крысы контрольной группы (п=П) имели свободный доступ к воде и корму. Животных декапитировали по окончании водной депривации.

Для изучения механизмов влияния р53 на активность вазопрессинергических клеток супраоптического ядра были проведены эксперименты in vivo. Селективный блокатор р53 Pifithrin-a вводили крысам (n=l 1) внутрибрюшинно в концентрации 2 мг/кг. Животным контрольной группы (n=l 1) вводили растворитель блокатора диметилсульфоксид (ДМСО) на физиологическом растворе в концентрации 0,5%. Животных декапитировали через 5 часов после введения растворов.

Для исследования механизмов прямого влияния р53 и Вс1-2 были проведены опыты in vivo с внутригипоталамическим введением блокаторов Вс1-2 - НА14-1 и р53 — Pifithrin-oc. Для введения блокаторов за 7-10 дней до начала экспериментов наркотизированным крысам (нембутал в дозе бОмг/кг, интраперитонеально) вживляли проводящие канюли в область третьего желудочка мозга (API,4; LO,8; Н6,5 в мм в соответствии со стереотаксическим атласом [Paxinos, Watson, 1998]). В работе были использованы 3 группы животных (п=15). Крысам контрольной группы вводили растворитель блокаторов (физиологический раствор, содержащий 0,5% ДМСО). Крысам второй группы вводили НА14-1 - блокатор Вс1-2 (0,5 мг/кг). Животные третьей группы были подвергнуты введению Pifithrin-a в дозе 0,25 мг/кг. Фармакологические агенты вводились дважды за 36 часов и за 8 часов до забора материала. Также, через 2 часа после каждого введения блокаторов, у животных всех экспериментальных групп оценивали уровень диуреза в течение двух часов в метаболических камерах. Крыс декапитировали на 8-11 день после имплантации канюль через 8 часов после последнего введения фармакологических агентов.

Для изучения прямого влияния инактивации Вс1-2, р53 или ERK1/2 сигнального каскада на функциональную активность вазопрессинергических

нейронов супраоптического ядра, были выполнены эксперименты in vitro с использованием блокаторов НА14-1, Pifithrin-a или U0126 соответственно. Исследования in vitro проводились на переживающих срезах гипоталамуса. Животных (п=66) декапитировали, быстро извлекали мозг и в стерильных условиях из гипоталамической области иссекали срезы толщиной около 600 мкм. Для экспериментов с использованием блокаторов НА14-1 и U0126 иссекались фронтальные срезы гипоталамуса, содержащие супраоптические и паравентрикулярные ядра. Для экспериментов с применением блокатора Pifithrin-a иссекались горизонтальные срезы, содержание супраоптические, паравентрикулярные ядра и гипофиз. Срезы инкубировались в ССЬ инкубаторе в среде ДМЕМ, содержащей 20% инактивированной сыворотки крови лошади и антибиотики (пенициллин в дозе 50 мкг/мл среды и стрептомицин - 100 мкг/мл), в течение 30 минут при температуре 37°С, концентрации С02 5% и влажности 95%. Затем среду меняли на инкубационную среду такого же состава, содержащую блокаторы (НА14-1 в дозе 30 мкМ или Pifithrin-a в дозе 10 мкМ или UO 126 в дозе 25 мкМ), или растворители блокаторов (ДМСО в концентрации

0.5%) в качестве контроля. Срезы инкубировались в течение 5 часов.

По окончании всех экспериментов по 5 мозгов или срезов гипоталамуса на группу фиксировали 4% формальдегидом для дальнейшего морфологического исследования. Из другой части мозгов или срезов иссекали супраоптические ядра и заднюю долю гипофиза, которые далее гомогенизировали в буфере, содержащем блокаторы пептидаз и фосфатаз, для последующего биохимического анализа.

Иммуногистохимия

Иммуногистохимическую обработку проводили по стандартной методике:

1. Инкубация с первичными гюликлональными антителами кролика к вазопрессину (1: 200), кинезину (1:250) (Abeam), Bcl-2 (1:200) (Santa Cruz Biotechnology Inc.), p53 (1:100), фосфо-СИЕВ(8ег133) (1:100), фосфо-cRaf (Ser338) (1:100), (Cell Signaling) (1:100), фосфо-МЕК1/2(8ег217/221) (1:100), фосфо-ERKl/2(Thr202/Tyr204) (1:120), ERK (1:100), фосфо-Е1к1(8ег383) (1:30) фосфо-p90RSK(Ser380) (1:30) (Cell Signaling Technology). 2. Инкубация с вторичными биотинилированными антителами (Vector Labs). 3. Нанесение Стрепгавидин-пероксидазного комплекса 1:200 (Vector Labs). 4. Проявление реакции проводилось диаминобензидином.

Конфокальная микроскопия.

Для исследования распределения исследуемых белков апоптоза и участников ERK1/2 сигнального каскада в гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе срезы гипоталамуса обрабатывали иммуногистохимически с применением первичных поликлональных антител против кролика к вазопрессину, который выявляли с помощью вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor 568 (Invitrogen). Р53, фосфо-ERKl/2(Thr202/Tyr204), фосфо-Е1к1(8ег383) и фocфo-CREB(SerlЗЗ) выявляли на тех же срезах с помощью первичных мышиных моноклональных антител и

вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Анализ препаратов проводили на конфокальном микроскопе (Leica).

Вестерн блотт анализ

Содержание исследуемых белков в пробах, содержащих лизат супраоптического ядра или задней доли гипофиза оценивали методом Вестерн-блот. Белки, выделенные из лизатов разгоняли на SDS-PAGE, затем переносили на нитроцеллюлозу. В качестве первичных антител использовали антитела Вс1-2 (1:500, Santa-Cruz Inc.), фосфо-СЯЕВ(8ег133) (1:500, Chemicon), kinesin (1:750, Abeam); p53 (1:750), фосфо-ЕЛКШ (Thr202/Tyr204).(l:1000), ERK1/2(1:1000), фосфо-Е1к1(8ег383) (1:500), фосфо-МЕК 1 /2(Scr217/22]) (1:500), фосфо-cRafiSer 338) (1:500) - Cell Signaling, GAPDH (1:2000, Abeam). Для визуализации результатов использовали ECL plus-систему (Amersham Biosciences). Денситометрический анализ проводили с помощью программы PhotoM. Уровень экспрессии специфических белков был скорректирован по сигналу GAPDH, выявляемый для определения уровня общего количества белка в пробах.

Метод гибридизации in situ

Метод гибридизации in situ использовали для выявления мРНК вазопрессина. Меченая дигоксигенином мРНК вазопрессина была синтезирована in vitro транскрипционной реакцией с использованием линеализированной ДНК плазмиды (1 мкг), содержащей мРНК вазопрессина, с помощью коммерческого набора, содержащего дигоксигенин-меченые нуклеотиды согласно инструкции производителя (Boehringer Mannheim, Germany). Плазмида, содержащая мРНК вазопрессина, была любезно предоставлена М.В. Глазовой. Гибридизацию проводили согласно принятой методике [Campbell-Thompson et al., 1995]. Срезы ацетилировали в растворе ангидрида уксусной кислоты (0,25%), содержащем 0,1 M триэтаноламин, дегидратировали в этиловом спирте и инкубировали в течение 12 часов при температуре 50°С в гибридизационном растворе, содержащем меченную дигоксигенином рибопробу к мРНК вазопрессина. Затем срезы промывали в смеси хлорида и цитрата натрия (SSC) и формамида. Для визуализации мРНК вазопрессина, меченного дигоксигенином, срезы инкубировали с антителами к дигоксигенину (разведение 250х на блокирующем растворе). Затем на срезы наносили раствор, содержащий NBT (nitro blue tetrazolium chloride) и BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) и оставляли инкубироваться в темноте во влажных камерах при комнатной температуре до проявления реакций/Для остановки реакции срезы промывали в буфере (100 мМ TRIS-HC1, 1 мМ EDTA, рН=9,5) в течение 15 минут и, после дополнительной промывке в воде, заключали в мовиол.

Морфофункциональный анализ материала

Количественная оценка содержания мРНК вазопрессина, а также вазопрессин-, Bcl-2-, фосфо-ЕКК('ГЬг202/Туг204)-, фосфо-МЕК1/2(8ег217/221)-, фосфо-Е1к(8ег383)-, фосфо-С11ЕВ(8ег133> и фосфо-сЯаГ(8ег338)-иммунореактивного вещества в нейросекреторных клетках и волокнах срединного

возвышения и задней доли гипофиза производилась на основании измерения оптической плотности окрашенного вещества на микрофотографиях с помощью компьютерного цифрового анализатора телевизионного изображения [8то1еп, 1990; Агроскин, Папаян, 1977] и программного обеспечения РЬоЮМ на полученных от каждого животного 5-8 фотографиях супраоптического ядра и гипофиза. Измерение иммунореактивного вещества проводили на параллельных срезах гипоталамуса. Данные выражались в условных единицах оптической плотности на мкм2. Кроме оценки содержания в нейронах иммунореактивного вещества в некоторых случаях проводился подсчет количества нейронов, давших интенсивную иммуногистохимическую реакцию на выявляемые белки. Измерение количества мРНК вазопрессина в нейронах гипоталамуса позволило оценить интенсивность синтеза вазопрессина, а сопоставление этих данных с содержанием вазопрессин-иммунореактивного вещества в перикарионах позволило нам оценить интенсивность выведения вазопрессина из перикарионов. Оценка содержания вазопрессин-иммунореактивного вещества в задней доле гипофиза позволила судить об интенсивности выведения вазопрессина в общий кровоток.

Все полученные данные обрабатывались статистически по ^критерию Стьюдента. При оценке достоверности отличий между группами п = количеству срезов на группу. Данные представлены в виде среднего арифметического по каждой группе животных ± полуширина доверительного интервала для среднего значения. Достоверными считались отличия при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Локализация проапоптозного белка р53, активных форм Е11К1/2 киназы и транскрипционных факторов СИЕВ и Е1к1 в вазопрессинергических нейронах супраоптического ядра

С помощью конфокальной микроскопии мы показали, что проапоптозный белок р53, фосфо-ЕШС1/2 киназа, фосфо-СЯЕВ и фосфо-Е1к1 выявляются в телах вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра. Мы показали колокализацию вазопрессина и фосфо-ЕШСШ в терминальных отделах волокон, образующих заднюю долю гипофиза. Более того, Вестерн Блот анализом было показано, что содержание фосфо-ЕШС1/2 киназы в задней доле гипофиза значительно выше, чем в супраоптическом ядре (Рис. 1). В совокупности представленные данные мы рассматриваем как предпосылку к исследованию возможности участия Е1Ж1/2 киназы в регуляции синтеза и выведения вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса.

pERK1/2

GAPDH

Рис. 1. Вестерн Блотт анализ содержания фосфо-ЕЯКШ (рЕЯК1/2) киназы в супраоптическом ядре (СОЯ) и задней доле гипофиза (ЗДГ) интактных крыс. В качестве контроля количества белка в пробах использовали ОАРОН.

СОЯ ЗДГ

2. Влияние дегидратации на содержание антиапоптозного белка Вс1-2, проапоптозного белка р53, активных форм МЕК1/2 киназы и транскрипционных факторов Elkl и CREB.

Известно, что длительная водная депривация является адекватной функциональной нагрузкой для вазопрессинергических нейросекреторных нейронов супраоптического ядра, приводящей к усилению синтеза и выведения вазопрессина, и сопровожающейся увеличением содержания проапоптозного белка р53 и антиапоптозного белка Вс1-2 в нейронах супраоптического ядра [Chernigovskaya et al., 2005]. Мы показали, что трехдневная дегидратация также вызывает увеличение содержания Вс1-2 и р53 в нейронах супраоптического ядра (рис. 2А), не приводя к гибели нейронов.

В связи с тем, что внутриклеточные механизмы регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра на данный момент недостаточно изучены, было проанализировано влияние дегидратации на содержание в изучаемых нейронах ряда внутриклеточных посредников, транскрипционных факторов и одного из белков цитоскелета, ответственного за антероградный транспорт органелл в клетке - кинезина.

Для того чтобы оценить вклад транскрипционного фактора CREB в регуляцию активности вазопрессинергических нейронов, мы проанализировали влияние дегидратации на его активность. Известно, что основным механизмом активации CREB является его фосфорилирование по серину 133 [Johannessen et al., 2004]. Мы показали, что при дегидратации происходит увеличение содержания фосфо-CREB в нейронах супраоптического ядра (Рис. 2А). Увеличение активности транскрипционного фактора CREB в нейронах супраоптического ядра, сопровождавшее усиление синтеза вазопрессина, подтверждает данные литературы о вовлеченности CREB в регуляцию экспрессии вазопрессина.

Мы показали увеличение содержания фосфо-МЕК1/2 киназы ERK1/2-сигнального пути, а также фосфо-Elkl - транскрипционного фактора, являющегося одной из наиболее известных мишеней ERKl/2-сигнального пути, в

телах нейронов супраоптического ядра при дегидратации (Рис. 2А). Увеличение содержания фосфо-МЕК1/2 киназы наблюдалось не только в телах нейронов супраоптического ядра, но и в их отростках, которые входят в состав задней доли гипофиза (Рис. 2Б). Тот факт, что увеличение транскрипции и транспорта вазопрессина нейронами супраоптического ядра при дегидратации сопровождается активацией в этих нейронах киназ ERK1/2 сигнального пути, позволяет рассматривать возможность его участия в регуляции биосинтеза вазопрессина. Накопление в терминальных отделах аксонов нейронов гипоталамуса активных киназ ERK1/2 каскада и фосфо-Elkl при активации транспорта и выведения вазопрессина, в совокупности с данными литературы об участии ERK1/2 пути в регуляции активности нейрофиламентов [Julien, Mushynski, 1998; Veeranna et al., 1998; Veeranna et al., 2000], указывает на возможность участия киназ ERK1/2 каскада в регуляции транспорта и выведения вазопрессина. Однако обе гипотезы требуют подтверждения.

Следующим этапом нашей работы было выяснение возможных механизмов транспорта нейросекреторных гранул. Анализ распределения кинезина в вазопрессинергических клетках супраоптического ядра показал, что при дегидратации наблюдается увеличение содержания кинезина в супраоптическом ядре (Рис. 2А), тогда как в задней доле гипофиза кинезина становится меньше (Рис. 2Б). Таким образом, по-видимому, при дегидратации происходит усиление экспрессии кинезина, равно как и вазопрессина, он транспортирует гранулы с вазопрессином в нейрогемальные отделы, где вазопрессин выбрасывается в кровь, а кинезин, возможно, подвергается протеасомной деградации. Данные о перераспределении тяжелых цепей кинезина при дегидратации свидетельствуют об участии этого белка в реализации антероградного транспорта нейросекреторных гранул с вазопрессином.

А Б

Рис. 2-Содержание Вс1-2, р53, фосфо-СЯЕВ (рСЯЕВ), фосфо-МЕК1/2 (рМЕК1/2), фосфо-Е1к1 (рЕ1к1) и кинезина в нейронах Супраоптического ядра (А) и волокнах задней доли гипофиза (Б) интактных (белые столбики) и дегидратированных крыс (серые столбики).

По оси ординат: относительная оптическая плотность, выраженная в условных единицах.

*-достоверность отличия от контроля при р<0,05.

3. Влияние ERK1/2 сигнального каскада на функциональное состояние вазопрессииергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса.

Влияние ERK1/2 каскада на секреторную активность вазопрессииергических нейронов супраоптического ядра исследовали в эксперименте in vitro с использованием селективного блокатора ERK1/2 каскада -U0126. Мы показали значительное снижение содержания как мРНК вазопрессина, так и вазопрессина в нейронах супраоптического ядра под действием блокатора U0126 (Рис. ЗА), что свидетельствует о торможении синтеза вазопрессина. Мы показали, что инактивация ERK1/2 каскада вызвала снижение содержания фосфо-CREB и фосфо-EIkl в нейронах супраоптического ядра (Рис. ЗБ).

На основании данных литературы [Senda, Yu, 1999] и согласно результатам, полученным нами в экспериментах с дегидратацией, белком, ответственным за транспорт вазопрессина, по-видимому, является кинезин. Кинезин тем более является привлекательной потенциальной мишенью ERK1/2 каскада, поскольку было показано, что ERK1/2 каскад вовлечен в регуляцию активности одного из белков семейства кинезин - MS-KIF18А [Luboshits, Benayahu, 2007]. Инактивация ERK1/2 привела к снижению содержания кинезина в нейронах супраоптического ядра (Рис. ЗБ). Зависимость экспрессии кинезина от активности ERK1/2 киназы подтверждает наше предположение о возможности участия ERK1/2 каскада в регуляции антероградного транспорта вазопрессина. А Б

Рис. 3. Содержание матричной РНК вазопрессина (мРНК ВП), вазопрессина (ВП) (А), фосфо-CREB (pCREB), фосфо-EIkl (pElkl), кинезина, Bcl-2 и р53 (Б) в нейронах супраоптического ядра гипоталамических срезов, инкубировавшихся в среде, содержащей растворитель блокатора (белые столбики) и блокатор ERK1/2 каскада U0126 (серые столбики).

По оси ординат: относительная оптическая плотность, выраженная в условных единицах *-достоверность отличия от контроля при р<0,05.

На основании результатов, полученных в экспериментах in vivo с дегидратацией и in vitro с введением блокатора МЕК1/2 киназы U0126, можно заключить, что ERK1/2 сигнальный каскад принимает участие в регуляции

биосинтеза вазопрессина за счет регуляции активности транскрипционных факторов Е1к1 и СЯЕВ. ЕГЖ1 /2 каскад также вовлечен в регуляцию антероградного транспорта вазопрессина.

>- -»выведение ВП

ВП промотор \

ядро мРНК ВП

Рис. 4. Схема влияния ERK1/2 каскада на биосинтез вазопрессина.

4. Роль и механизмы участия антиапоптозного белка Вс1-2 в регуляции функционального состояния вазопрессинергических нейронов гипоталамуса

Для изучения характера прямого влияния антиапоптозного белка Вс1-2 на функциональную активность зрелых нейронов мы впервые провели эксперименты in vivo и in vitro с введением фармакологического блокатора Вс1-2 НА 14-1.

Блокатор Вс1-2 был синтезирован для изучения роли и механизмов участия Вс1-2 в апоптозе. НА 14-1 специфически ингибирует антиапоптозную активность белка Вс1-2 за счет подавления связывания Вс1-2 с проапоптозным белком Вах [Wang et al., 2000]. Несмотря на то, что воздействие введения EIA14-1 на антиапоптозную активность Вс1-2 воспроизводится во всех опубликованных работах, влияние НА 14-1 на экспрессию Вс1-2 различается в зависимости от доз этого блокатора и условий его применения [Mañero et al., 2006; Zimmermann et al., 2005].

Мы показали увеличение содержания Вс1-2 после внутригипоталамического введения блокатора НА 14-1 (Рис 5Б). Возможно, увеличение содержания Вс1-2, показанное в этом эксперименте, связано с компенсаторным увеличением синтеза Вс1-2 через 36 часов после первого введения блокатора и 8 часов после второго.

Введение НА 14-1 вызвало увеличение секреторной активности вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра как на уровне синтеза (увеличение количества мРНК вазопрессина в телах нейронов), так и на уровне выведения (снижение содержания вазопрессина в задней доле гипофиза и значительное уменьшение уровня диуреза) (Рис 5А, 6).

По данным литературы, одной из мишеней Вс1-2 является транскрипционный фактор CREB [Jiao et al., 2005]. Действительно, мы показали увеличение содержания фосфо-CREB в нейронах супраоптического ядра в ответ на внутригипоталамическое введение блокатора НА 14-1 (Рис 5Б). Возможно, активация CREB, в свою очередь, вызвала увеличение активности биосинтеза

вазопрессина нейронами супраоптического ядра. Непосредственный механизм активации CREB антиапоптозным белком Вс1-2 в данных экспериментах пока не ясен. С одной стороны, активация CREB напрямую зависит от уровня кальция в цитоплазме [Dolmetsch et al., 2001], который, регулируется, в том числе, и белком Bcl-2 [Foyouzi-Youssefi et al., 2000]. С другой стороны, CREB является одной из мишеней ERK1/2 каскада [Wang et al., 2003].

Действительно, внутригипоталамическое введение блокатора НА 14-1 вызвало увеличение содержания фосфо-МЕК1/2 киназы и фосфо-Elkl в нейронах супраоптического ядра (Рис 5Б), что свидетельствует об активации ERK1/2 каскада [Pearson et al., 2001].

А Б

Рис. 5. Содержание матричной РНК вазопрессина (м-РНК ВП), вазопрессина (ВП) (А), Вс1-2, фосфо-СЯЕВ (рСИЕВ), фосфо-МЕК1/2 (рМЕКШ) и фосфо-Е1к1(рЕ1к1) (Б) в нейронах супраоптического ядра (СОЯ) (А, Б) и в задней доле гипофиза (ЗДГ) (А) крыс, подвергнутых внутригипоталамическому введению растворителя блокатора (белые столбики) и НА 14-1 (серые столбики). По оси ординат: относительная оптическая плотность, выраженная в условных единицах.

*-достоверность отличия от контроля при р<0,05.

Рис. 6. Уровень диуреза крыс, подвергнутых внутригипоталамическому введению растворителя блокатора (белые столбики) и НА 14-1 (серые столбики). По оси абсцисс: I - измерение через 2 часа после первого введения, II -за 2 часа перед вторым введением, III - через 2 часа после второго введения. По оси ординат: усредненный объем мочи крыс выраженный в мл/час/на животное *-достоверность отличия от контроля при р<0,05.

Таким образом, увеличение Вс1-2 в нейронах супраоптического ядра сопровождается активацией ERK1/2 сигнального каскада и транскрипционных факторов Elkl и CREB, что приводит к повышению экспрессии вазопрессина. Полученные данные свидетельствуют о возможности модулирующего действия Вс1-2 на ERK1/2 каскад.

Для того, чтобы оценить прямое влияние блокатора Вс1-2 НА 14-1 на активность изучаемых нейронов при нарушении экспрессии Вс1-2, мы провели эксперимент in vitro.

Мы показали, что 5-часовая инкубация срезов с блокатором НА 14-1 вызывает значительное снижение содержания Вс1-2 в нейронах супраоптического ядра (Рис. 7Б). При этом мы наблюдали снижение количества мРНК вазопрессина в телах нейронов супраоптического ядра, сопровождавшееся некоторым увеличением содержания иммунореактивного вазопрессина в них (Рис 7А), что свидетельствуют об уменьшении уровня синтеза и, предположительно, торможении выведения вазопрессина нейронами супраоптического ядра.

Мы также показали снижение содержания фосфо-CREB в нейронах супраоптического ядра (Рис. 7Б), что согласуется со снижением экспрессии как Вс1-2, так и вазопрессина.

Таким образом, данные наших экспериментов in vivo и in vitro четко продемонстрировали зависимость синтеза вазопрессина от экспрессии Вс1-2 и активности транскрипционного фактора CREB. Полученные данные подтверждают наше предположение, что в эксперименте in vivo эффекты введения блокатора в область гипоталамуса на биосинтез вазопрессина обусловлены компенсаторным увеличением экспрессии Вс1-2.

2,5

1,5

0,5

* ■

11] 1 ь1

Bcl-2 pCREB pERKI/2 pEíkl

Рис. 7. Содержание матричной РНК вазопрессина (м-РНК ВП), вазопрессина (ВП) (А), Вс1-2, фосфо-ОШВ (рСЯЕВ), фосфо-ЕЯК1/2 (рЕ11К1/2) и фосфо-Е1к1 (рЕ1к1) (Б) в нейронах супраоптического ядра гипоталамических срезов, инкубировавшихся в среде, содержащей растворитель блокатора (белые столбики) и блокатор Вс1-2 НА 14-1 (серые столбики).

По оси ординат: относительная оптическая плотность, выраженная в условных единицах.

*-достоверность отличия от контроля при р<0,05.

Мы показали значительное увеличение содержания как фосфо-ЕЯКШ киназы, так и фосфо-Elkl, в нейронах супраоптического ядра после 5-часовой инкубации с НА 14-1 (Рис 7Б). В связи с тем, что в эксперименте in vitro уровень синтеза вазопрессина нейронами супраоптического ядра снижался, повышение активности ERK1/2 киназы свидетельствует о вовлечения этого каскада в другие процессы в нейронах супраоптического ядра, не связанные с модуляцией синтеза вазопрессина в условиях недостатка антиапоптозного белка Вс1-2.

Одной из функций ERK1/2 каскада является регуляция выживания и регенерации аксонов [Jiao et al., 2005; Pearson et al, 2001]. В эксперименте in vitro мы инкубировали срезы, содержащие медиальный гипоталамус от уровня хиазмы до начала срединного возвышения. При этом аксоны нейронов супраоптического ядра, входящие в состав гипофиза, были повреждены. По-видимому, повреждение нейронов супраоптического ядра в сочетании с подавлением активности антиапоптозного белка Вс1-2 вызвало активацию ERK1/2 каскада.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что активность синтеза вазопрессина нейронами супраоптического ядра зависит от активации транскрипционного фактора CREB и содержания антиапоптозного белка Вс1-2. При этом влияние Вс1-2 на биосинтез вазопрессина нейронами супраоптического ядра, скорее всего, не зависит от его влияния на активность ERK1/2 сигнального каскада.

Bci-2-

CREB

CRE

p. Raf

МЕЮ/2

ERK1/2

ВП промотор'

ядро \ мРНК В П ■

Рис. 8. Схема регуляции биосинтеза вазопрессина антиапоптозным белком Вс1-2 и транскрипционным фактором CREB

5. Влияние р53 на функциональную активность вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра.

Для выяснения роли р53 в регуляции биосинтеза вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса мы провели эксперимент in vivo с внутрибрюшинным введением блокатора р53 Pifithrin-a. Системное введение блокатора Pifithrin-a не повлияло на уровень мРНК вазопрессина и вызвало накопление вазопрессина как в телах нейронов супраоптического ядра, так и в их отростках, образующих заднюю долю гипофиза (Рис. 9А), что свидетельствует о

торможении секреции вазопрессина. Полученные данные указывают на участие р53 в регуляции аксонального транспорта и/или экзоцитоза секреторных гранул вазопрессина. В последние годы появились публикации, касающиеся стимулирующего действия р53 на базальную и индуцированную различными фармакологическими агентами активность ERK1/2 каскада [Gulati et al., 2006; Singh et al., 2007]. Известно, что ERK1/2 участвует в фосфорилировании нейрофиламентов - белков цитоскелета, ответственных за формирование структуры аксонов и участвующих в реализации экзоцитоза синаптических везикул [Julien, Mushynski, 1998; Veeranna et al., 1998; Veeranna et al, 2000].

Действительно, мы показали, что инактивация р53 приводит к снижению содержания фосфо-ЕЯК1/2 киназы в телах нейронов супраоптического ядра и их волокнах, входящих в состав задней доли гипофиза (Рис. (9Б). На основании полученных данных можно предположить, что снижение содержания активной формы ERK1/2 киназы, наблюдаемое нами в супраоптическом ядре и в задней доле гипофиза при подавлении активности р53, может приводить к уменьшению активности ответственных за транспорт в аксонах белков. Таким образом, ERK1/2 каскад, возможно, опосредует влияние р53 на антероградный аксональный транспорт гранул вазопрессина.

А Б

_______1

* *

У i

I - ¡

1 1 pERKl/2 I pCREB pERKI/2 СОЯ ЗДГ

Рис. 9. Содержание матричной РНК вазопрессина (м-РНК ВП), вазопрессина (ВП) (А), фосфо-ЕЯК1/2 (pERKl/2), фосфо-CREB (pCREB) (Б) в нейронах супраоптического ядра (СОЯ) и задней доли гипофиза (ЗДГ) крыс, подвергнутых внутрибрюшинному введению растворителя блокатора (белые столбики) и блокатора р53 Pifithrin-a (серые столбики).

Но оси ординат: относительная оптическая плотность, выраженная в условных единицах.

*-достоверность отличия от контроля при р<0,05.

Очевидно, что системное введение блокатора Pifithrin-a вызывает изменение активности р53 не только в нервной системе, но и в периферических тканях. Чтобы оценить непосредственное влияние инактивации р53 на вазопрессинергические нейроны, мы провели эксперимент in vivo с внутригипоталамическим введением Pifithrin-a. Мы показали, что инактивация

р53 в этом эксперименте также приводит к повышению содержания вазопрессина в телах нейронов супраоптического ядра, при неизменяющемся уровне синтеза вазопрессина (Рис. 10А) и к увеличению уровня диуреза (Рис. 11), что указывает на торможение выведения вазопрессина из тел гипоталамических клеток. Снижение содержания фосфо-МЕК1/2 киназы в вазопрессинергических нейронах при инактивации проапоптозного белка р53 (Рис. 10Б) также указывают на вовлеченность Е11К1/2 киназы в регуляцию транспорта вазопрессина белком р53.

1,6--—

1,4 ----------

1.2----И-

0,8 — ■— Нг 0,6 м- ш

0,4 4— Н- щШ

1-4 1

мРНК вп | вп соя

Рис. 10. Содержание матричной РНК вазопрессина (м-РНК ВП), вазопрессина (ВП) (А), фосфо-ЕМС1/2 (рЕШСШ), фосфо-СКЕВ (рСЖЕВ) (Б) в нейронах супраоптического ядра (СОЯ) и задней доле гипофиза (ЗДГ) крыс, подвергнутых внутригипоталамическому введению растворителя блокатора (белые столбики) и блокатора р53 РШЙшп-сс (серые столбики).

По оси ординат: относительная оптическая плотность, выраженная в условных единицах.

*-достоверность отличия от контроля при р<0,05.

Рис. 11. Уровень диуреза крыс, подвергнутых внутригипоталамическому введению растворителя блокатора (белые столбики) и Р1ЙЛгт-а (серые столбики). По оси абсцисс: I - измерение через 2 часа после первого введения, II —за 2 часа перед вторым введением, III - через 2 часа после второго введения.

По оси ординат: усредненный объем мочи крыс выраженный в мл/час/на животное *-достоверность отличия от контроля при р<0,05.

Для того чтобы выявить влияние инактивации р53 на секреторную активность нейронов супраоптического ядра и исключить влияния проекций других отделов ЦНС и влияний периферических органов на активность

диурез

исследуемых гипоталамических центров, мы провели эксперимент in vitro, в котором срезы гипоталамуса инкубировали в среде, содержащей Pifithrin-a. Мы показали увеличение содержания вазопрессина в телах нейронов супраоптического ядра и снижение содержания изучаемого нейрогормона в задней доле гипофиза, что в совокупности с данными о неизменности синтеза вазопрессина свидетельствует о торможении его выведения из тел нейронов супраоптического ядра (Рис 12А). Снижение содержания фосфо-ЕШ<1/2 киназы в .задней доле гипофиза, в ответ на инактивацию р53 (Рис. 12Б) подтверждает данные, полученные нами в экспериментах in vivo о вовлеченности ERK1/2 киназы в регуляцию транспорта вазопрессина белком р53.

мРНК ВП¡ ВП СОЯ

ВП

ЗДГ ¡

1,6 1,4 1,2 -1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

:Íft

pERK1/2 | pCREB СОЯ

pERKI/2 ЗДГ

Рис. 12. Содержание матричной РНК вазопрессина (м-РНК ВП), вазопрессина (ВП) (А), фосфо-СЯЕВ (рСЯЕВ), фосфо-ЕИКШ (рЕЯКШ) (Б) в нейронах супраоптического ядра (СОЯ) и волокнах задней доли гипофиза (ЗДГ) гипоталамических срезов, инкубировавшихся в среде, содержащей растворитель блокатора (белые столбики) и блокатор р53 Р1й1;Ьпп-а (серые столбики). По оси ординат: относительная оптическая плотность, выраженная в условных единицах.

*-достоверность отличия от контроля при р<0,05.

белки цитоскелета 1

аксональный транспорт

Рис. 13. Схема регуляции секреции вазопрессина проапоптозным белком р53.

Таким образом, на основании данных, полученных в экспериментах с введением блокатора Р1йЛпп-а, можно заключить, что р53 участвует в регуляции транспорта и/или выведения вазопрессина, и его влияние опосредовано ЕЯК1/2 каскадом.

ВЫВОДЫ

1. Усиление синтеза и выведения вазопрессина нейронами гипоталамуса при дегидратации сопровождается активацией в них ERK1/2 киназы и транскрипционных факторов CREB и Elkl. Снижение активности транскрипционных факторов CREB и Elkl в вазопрессинергических нейронах гипоталамуса при инактивации ERK1/2 каскада блокатором U0126 сопровождается снижением уровня синтеза вазопрессина, что свидетельствует об активирующем влиянии ERKl/2-зависимых транскрипционных факторов на экспрессию вазопрессина.

2. Увеличение содержания кинезина в супраоптическом ядре и его уменьшение в задней доле гипофиза при дегидратации свидетельствует об участии кинезина в реализации антероградного транспорта вазопрессина. Уменьшение содержания кинезина в супраоптическом ядре, вызванное снижением активности ERK1/2 киназы в результате действия U0126, свидетельствует об участии ERK1/2 сигнального каскада в регуляции антероградного транспорта вазопрессина кинезином.

3. Внутригипоталамическое введение НА14-1 - блокатора антиапоптозного белка Вс1-2 и его добавление в инкубационную среду показали прямую зависимость уровня экспрессии вазопрессина от количества Вс1-2 и от активности транскрипционного фактора CREB в нейронах супраоптического ядра гипоталамуса. Воздействие Вс1-2 на активность синтеза вазопрессина не зависит от активности ERK1/2 киназы и транскрипционного фактора Elkl.

4. В эксперименте in vitro с использованием блокатора проапоптозного белка р53 Pifithrin-a и в экспериментах in vivo с его внутрибрюшинным и внутригипоталамическим введением показано, что проапоптозный белок р53 оказывает активирующее действие на секрецию вазопрессина, опосредованное ERK1/2 киназой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Никитина Л.С., Глазова М.В., Дорофеева H.A., Черниговская Е.В. Влияние белков апоптоза на функцию вазопрессин-и дофаминергических нейронов гипоталамуса // Ж. эвол. биохим. и физиол. - 2008, - Т.44. - N.3. - С. 311-7.

2. Chernigovskaya Е., Nikitina L., Dorofeeva N., Glazova M. Effects of selective Bcl-2 inhibitor HA14-1 treatments on functional activity of magnocellular

vasopressinergic neurons of rat hypothalamus. // Neurosci Lett. - 2008. - V.437. -N.l. -P.59-64.

Тезисы докладов

1. Черниговская E.B., Никитина U.C., Дорофеева H.A., Романова И.В., Аристакесян Е.А. Участие сигнальных белков апоптоза в регуляции функциональной активности нейронов мозга крыс. // Научные труды 1 Съезда физиологов СНГ. - Дагомыс. - 2005. -Т.2. - С.53.

2. Никитина JI.C., Дорофеева H.A. Участие сигнальных белков апоптоза в организации цикла сон-бодрствование за счет регуляции функциональной активности нейронов мозга крыс. // Тезисы третьей российской школы-конференции (с международным участием) «Сон-окно в мир бодрствование». - Ростов-на-Дону. - 2005. - С.73-74.

3. Никитина Л.С., Черниговская Е.В., Романова И.В., Дорофеева H.A., Алтухова И.М., Оганесян Г.А. Влияние ингибиторов белков апоптоза на нейрональную активность вазопрессин- и дофаминергических систем мозга. // Тезисы докладов 13 международного совещания по эволюционной физиологии. - Санкт-Петербург. - 2006. - С.155-156.

4. Никитина Л.С., Дорофеева H.A., Глазова М.В., Романова И.В., Черниговская Е.В. Участие белков апоптоза в регуляции активности нейронов мозга. // Тезисы 5 международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения-2006». - Санкт-Петербург. - 2006.- С. 66.

5. Черниговская Е.В., Никитина JI.C., ДорофееваН.А., Глазова М.В., Романова И.В. Механизмы регуляции белками апоптоза вазопрессинергических и катехоламинергических нейронов мозга крыс. // Свободные радикалы, антиоксиданты и старение. - Астрахань. - 2006. - С.38-39.

6. EV Chernigovskaya, LS Nikitina, NA Dorofeeva, MV Glazova, I.V.Romanova Participation of apoptotic proteins in regulation of neuronal activity in rat brain. // Abs. 6-th ICN. - Fron, inNeuroendocrinol. - V.27.-N.l. - P.148.

7. Никитина JI.C., Дорофеева H.A., Глазова M.B., Черниговская E.B. Регуляция белками апоптоза вазопрессинергических нейронов гипоталамуса //XX съезд физиологического общества имени И.П. Павлова. - Москва. - 2007. -С.67.

8. Черниговская Е.В., Никитина Л.С., Дорофеева H.A., Глазова М.В. Взаимодействие белков апоптоза Вс1-2 и р53 и ERK1/2 модуля МАРК сигнального каскада в регуляции активности вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра // тезисы Всероссийский симпозиум с международным участием "Гормональные механизмы адаптации". - Санкт-Петербург. - 2007. - С.90-91.

9. Никитина Л.С. ERK1/2 модуль МАРК сигнального каскада опосредует влияние сигнальных белков апоптоза Вс1-2 и р53 на секреторную активность вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса // Всероссийский симпозиум с международным участием "Гормональные механизмы адаптации". - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 58.

10.Nikitina L., Glazova M., Dorofeeva N.. Chernigovskaya E. Inhibition of Bcl-2 and p53 alter the functional activity of hypothalamic magnocellular neurons and affect the MAPK/ERK pathway. // Abstr. of conf. Apoptosis World 2008. From mechanisms to applications. - 2008. - Luxembourg. - P. 413.

П.Никитина JI.C., Глазова M.B., Дорофеева H.A., Губарева Е.А. Кириллова О.Д., Черниговская Е.В. Внутриклеточные механизмы регуляции активности вазопрессинергических нейронов гипоталамуса в условиях водной депривации. // Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга: Конференция с международным участием. Тезисы докладов. - 2008. - С.-Петербург. - С.101.

12.Губарева Е.А. Никитина Л.С., Дорофеева Н.А., Кириллова О.Д. Глазова М.В., Черниговская Е.В. Влияние Вс1-2 на активность ERK-модуля МАРК каскада в нейронах супраоптического ядра гипоталамуса крыс. // Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга: Конференция с международным участием. Тезисы докладов. - 2008. - С.-Петербург. - С.36-37.

13.Дорофеева Н.А., Никитина Л.С., Глазова М.В., Кириллова О.Д., Черниговская Е.В. Механизмы взаимодействия Вс1-2 и членов ERK1/2 модуля МАРК сигнального каскада в регуляции секреции вазопрессина. // Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга: Конференция с международным участием. Тезисы докладов. - 2008. - С.-Петербург. - С.43-44.

14.Н.А.Дорофеева, Е.А. Губарева, Л.С.Никитина Внутриклеточные механизмы регуляции секреции вазопрессина при дегидратации. // Фундаментальная и клиническая медицина. Одиннадцатая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователь «Человек и его здоровье». Тезисы докладов. - СПб-2008. - С. 109-110.

15.Е.А.Губарева, Н.А.Дорофеева, Л.С.Никитина Влияние Вс1-2 на активность ERK модуля МАРК каскада в нейронах супраоптического ядра гипоталамуса крыс. Фундаментальная и клиническая медицина. Одиннадцатая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователь «Человек и его здоровье». Тезисы докладов. - СПб - 2008. - С.95-96.

16. L. Nikitina, N. Dorofeeva, М. Glazova, О. Kirllova Е. Chernigovskaya Bcl-2

modulates hypothalamic vasopressinergic neurons activity // Abstracts of 4 ESN Conference on Advances in Molecular Mechansims of Neurological Disorders.- J. Neurochem. - 2009. - P. 91-92.

17. N. Dorofeeva, L. Nikitina, M. Glazova, E. Chernigovskaya Involvement of p53 and ERK 1/2 in the regulation of vasopressin secretion // Abstracts of 4 ESN Conference on Advances in Molecular Mechansims of Neurological Disorders.- J. Neurochem.-110 (Suppl. 1) - 2009. - P. 93.

Подписано в печать 23.12.09. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 96 .

Отпечатано с готового оригинал-макета. ООО "ПиФ.сот" 197101, С.-Пегербург, ул. Большая Монетная, 3 лит. А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никитина, Любовь Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вазопрессинергическая система.

1.1.1. Биосинтез вазопрессина.

1.1.2. Морф о функциональная характеристика вазопрессинергических нейронов гипоталамуса.

1.1.3. Регуляция биосинтеза вазопрессина.

1.2. Митоген-активируемый протеинкиназный каскад.

1.2.1. Общая характеристика сигнального каскада.

1.2.2. Механизмы регуляции функции клетки киназами митоген-активируемого протеинкиназного каскада.

1.2.3. Роль ЕЮС1/2-каскада в нервной системе.

1.3. Антиапоптозный белок Вс1-2.

1.3.1. Строение белков семейства ВСЬ-2.

1.3.2. Механизмы антиапоптозного действия белка Вс1-2.

1.3.3. Механизмы действия Вс1-2, не связанные с регуляцией апоптоза. Вс1-2 в нейронах.

1.4. Проапоптозный белок Р53.

1.4.1. Структурно-функциональная характеристика проапоптозного белка р

1.4.2. Механизмы проапоптозного действия р53.

1.4.3. р53 в нервной системе. Функции р53 не связанные с апоптозом и клеточным циклом.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Использованные блокаторы.

2.1.1. Блокатор антиапоптозного белка Вс1-2 - НА14-1.

2.1.2. Блокатор проапоптозного белка р53 - Р1Мтп-а.

2.1.3. Блокатор ЕЯК1/2 каскада - 1Ю126.

2.2. Экспериментальные модели.

2.2.1. Эксперимент in vivo с водной депривацией.

2.2.2. Эксперименты in vivo с внутригипоталамическим введением блокаторов Вс1-2 или р53 - НА 14-1 или Pifithrin-a соответственно.

2.2.3. Эксперименты in vivo с внутрибрюшинным введением блокатора Pifithrin-a.

2.2.4. Эксперименты in vitro с инкубацией переживающих срезов гипоталамуса в питательных средах, содержащих блокаторы Вс1-2, р53 или ERK1/2 каскада — НА14-1, Pifithrin-a или U0126 соответственно.

2.3. Обработка материала.

2.3.1. Иммуногистохимический метод.

2.3.2. Конфокальная микроскопия.

2.3.3. Western blotting анализ.

2.3.4 Метод гибридизации in situ.

2.4. Морфофункциональный анализ материала.

2.5. Статистический анализ результатов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Внутриклеточные механизмы регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра при дегидратации.

3.1.1. Влияние дегидратации на активность ERK1/2 сигнального каскада, транскрипционных факторов CREB и Elkl.

3.1.2. Влияние дегидратации на Вс1-2 и р53.

3.1.3. Влияние дегидратации на кинезин.

3.2. Участие ERK1/2 сигнального каскада в регуляции функциональной активности нейронов гипоталамуса.

3.2.1. Влияние введения блокатора ERK1/2 каскада - U0126 на функциональное состояние нейронов гипоталамуса.

3.2.2. Влияние введения блокатора ERK1/2 каскада - U0126 на ERK1/2 и Elkl

3.2.3. Влияние введения блокатора ERK1/2 каскада - U0126 на биосинтез вазопрессина.

3.2.4. Влияние введения блокатора ERK1/2 каскада U0126 на активность транскрипционного фактора CREB.

3.2.5.Влияние введения блокатора ERK1/2 каскада - U0126 на кинезин.

3.2.6. Влияние введения блокатора ERK1/2 каскада - U0126 на Вс1-2 и р53.

3.3. Влияние антиапоптозного белка Вс1-2 на функциональное состояние нейронов гипоталамуса.

3.3.1. Влияние блокатора Вс1-2 на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра при центральном введении НА 14-1 in vivo.

3.3.1.1. Влияние НА 14-1 на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра.

3.3.1.2.Влияние блокатора НА14-1 на содержание Bcl-2 в нейронах супраоптического ядра.

3.3.1.3. Влияние блокатора НА14-1 на содержание активных форм МЕК1/2 киназы, транскрипционных факторов Elkl и CREB в нейронах супраоптического ядра.

3.3.2. Влияние блокатора Bcl-2 - НА14-1 на вазопрессинергические нейроны супраоптического ядра in vitro.

3.3.2.1. Влияние НА14-1 на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра.

3.3.2.2. Влияние НА 14-1 на содержание антиапоптозного белка Bcl-2 в нейронах супраоптического ядра.

3.3.2.3. Влияние НА14-1 на активность cRaf-кинозы, ERK1/2 киназы и транскрипционных факторов Elkl и CREB в нейронах супраоптического ядра.

3.4. Влияние проапоптозного белка р53 на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса

3.4.1. Влияние введения Pifithrin-a на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса in vivo при центральном введении блокатора.

3.4.1.1. Влияние введения Pifithrin-a на синтез и выведение вазопрессина нейронами супраоптического ядра.

3.4.1.2. Влияние введения Pifithrin-a на содержание р53 в нейронах супраоптического ядра.

3.4.1.3. Влияние введения Pifithrin-a на активность МЕК1/2 киназы и транскрипционных факторов CREB, Elkl.

3.4.1.4. Влияние введения Pifithrin-анараспределение кинезина в нейронах супраоптического ядра.

3.4.2. Влияние введения Pifithrin-a на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса in vivo при системном введении блокатора.

3.4.2.1. Влияние введения Pifithrin-a на синтез и выведение вазопрессина нейронами супраоптического ядра.

3.4.2.2. Влияние введения Pifithrin-a па активность ERK1/2 киназы и транскрипционных факторов CREB, Elkl в нейронах супраоптического ядра

3.4.2.3. Влияние введения Pifithrin-ана кинезин в нейронах супраоптического ядра.

3.4.3. Влияние введения Pifithrin-oc на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса in vitro.

3.4.3.1. Влияние введения Pifithrin-ана синтез и выведение вазопрессина.

3.4.3.2. Влияние введения Pifithrin-ана активность ERK1/2 и CREB в нейронах супраоптического ядра.

3.4.3.3. Влияние введения Pifithrin-ана кинезин в нейронах супраоптического ядра.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Механизмы регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра при дегидратации.

4.1.1. Влияние дегидратации на активность транскрипционного фактора СЯЕВ.

4.1.2. Влияние дегидратации на активность ЕЯК1/2 сигнального каскада и транскрипционного фактора Е1к

4.1.3. Влияние дегидратации на распределение кинезина.

4.2. Влияние ЕКК1/2 сигнального каскада на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса

4.2.1. Участие ЕЮС1/2 каскада в регуляции биосинтеза вазопрессина.

4.2.2. Влияние ЕИК1/2 сигнального каскада на активность транскрипционного фактора СЯЕВ.

4.2.3. Участие Е11К1/2 каскада в регуляции кинезина.

4.3. Роль и механизмы участия антиапоптозного белка Вс1-2 в регуляции функционального состояния вазопрессинергических нейронов гипоталамуса.

4.3.1. Влияние Вс1-2 на биосинтез вазопрессина.

4.3.2. Влияние Вс1-2 на активность транскрипционного фактора СЯЕВ.

4.3.2. Влияние Вс1-2 на активность Е11К1/2 каскада.

4.4. Влияние р53 на функциональную активность вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра.

4.4.1. Влияние р53 на биосинтез вазопрессина.

4.4.2. Влияние р53 на активность ЕИКШ сигнального каскада.

4.4.3. Влияние р53 на активность транскрипционного фактора СЯЕВ.

4.4.4. Влияние р53 на кинезин.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса"

Актуальность проблемы

Исследование сигнальных белков апоптоза в настоящее время в основном сфокусировано на анализе механизмов их взаимодействия в процессе регуляции клеточного цикла и апоптоза различных типов клеток. Особенный интерес вызывает роль белков апоптоза в нейронах, пролиферация и массовая программированная гибель которых заканчивается в раннем онтогенезе, но белки апоптоза продолжают синтезироваться в дифференцированных нейронах в течение всей жизни организма. Существование экспрессии сигнальных белков апоптоза в дифференцированных жизнеспособных нейронах позволяют предположить возможность их участия в процессах напрямую с апоптозом не связанных, однако данных об участии белков апоптоза в регуляции нейрональной активности в настоящее время чрезвычайно мало. В частности, было показано, что белки семейства BCL-2 (B-cell lymphoma 2), помимо регуляции митохондриального пути апоптоза [Kroemer et al., 1997], участвуют в регуляции роста аксонов [Jiao et al., 2005], и необходимы для осуществления синаптической пластичности [Fannjiang et al., 2003; Hickman et al., 2008; Jonas et al., 2003]. Транскрипционный фактор p53 (tumor protein 53) также является полифункциональным белком. Помимо регуляции клеточного цикла и апоптоза [Lane, 1993], р53 также участвует в регуляции экспрессии глюкокортикоидных рецепторов [Nishimura et al., 2004].

Показано, что Вс1-2 и р53 активируют ERK1/2 сигнальный каскад (киназный каскад, регулируемый внеклеточными сигналами) [Singh et al., 2007; Wang et al., 1996], который, вовлечен в регуляцию пролиферации и дифференцировки клеток [Pearson et al., 2001]. Кроме того, существуют немногочисленные данные об участии ERK1/2 каскада в регуляции биосинтеза ряда нейротрансмиттеров [Arima et al., 2002; Ma et al., 2005]. Взаимодействие ERK1/2 каскада с сигнальными белками апоптоза в регуляции функциональной активности нейронов не изучалось.

Вазопрессинергические нейросекреторные нейроны гипоталамуса являются хорошей моделью для изучения возможности и механизмов участия Вс1-2 и р53 в регуляции нейрональной активности в связи с высокой секреторной активностью этих нейронов, позволяющей дифференциально оценивать изменения уровня синтеза и темпов выведения вазопрессина. Механизмы регуляции транспорта и выведения вазопрессинергических секреторных гранул к настоящему времени остаются слабо изученными. Анализ малочисленных литературных данных показал, что одним из белков, непосредственно осуществляющих антероградный транспорт, может быть кинезин [Senda, Yu, 1999]. Непосредственное изучение роли кинезина в реализации антероградного транспорта вазопрессина также практически не проводилось. Механизмы регуляции биосинтеза вазопрессина исследуются уже на протяжении нескольких десятилетий, и на первый взгляд являются хорошо изученными. Одним из ключевых факторов, отвечающих за транскрипцию вазопрессина нейронами гипоталамуса, является цАМФ. Промотор гена вазопрессина содержит CRE (cAMP response element), с которым связывается транскрипционный фактор CREB (cAMP response element binding protein), который в вазопрессинергических нейросекреторных нейронах гипоталамуса регулируется преимущественно протеинкиназой А [Burbach et al., 2001]. На основании экспериментов in vitro в различных типах клеток показано, что в фосфорилировании и активации CREB помимо протеинкиназы А, участвуют также другие протеинкиназы, в том числе относящиеся к ERK1/2 каскаду [Johannessen et al., 2004]. Более того, существуют данные об участии ERK1/2 сигнального каскада в регуляции циркадианного ритма экспрессии гена вазопрессина нейронами супрахиазматического ядра [Arima et al., 2002]. Несмотря на то, что протеинкиназа А очевидно не является единственной киназой, регулирующей транскрипцию вазопрессина за счет активации транскрипционного фактора CREB, данных о возможном участии ERK1/2-каскада в регуляции экспрессии вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса в литературе найдено не было.

Цели и задачи

1. Оценить возможность участия, характер и механизмы влияния ЕЯК1/2 сигнального каскада на функциональную активность вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса.

2. Исследовать характер прямого влияния антиапоптозного белка Вс1-2 на активность киназ ЕЯК 1/2 сигнального каскада и транскрипционных факторов Е1к1 и СКЕВ, а также на синтез и скорость выведения вазопрессина нейронами гипоталамуса.

3. Изучить характер прямого влияния проапоптозного белка р53 на активность киназ ЕЮС1/2 сигнального каскада и транскрипционных факторов Е1к1 и С11ЕВ, а также на синтез и скорость выведения вазопрессина нейронами супраоптического ядра.

Научная новизна

Впервые была выявлена активация киназ ЕЫК1/2 каскада и транскрипционных факторов Е1к1 и СЯЕВ в вазопрессинергических нейронах гипоталамуса при водной депривации. Впервые было установлено, что киназы Е11К1/2 сигнального каскада участвуют в регуляции синтеза и секреции вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса. Была показана зависимость распределения транспортного белка кинезина от активности ЕМС1/2 киназы.

Впервые было установлено активирующее влияние антиапоптозного белка Вс1-2 и транскрипционного фактора СИЕВ на активность синтеза вазопрессина.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ЕЯК1/2 сигнальный каскад вызывает активацию транскрипционных факторов Е1к1 и СЯЕВ, что приводит к усилению синтеза вазопрессина нейронами гипоталамуса, а также участвует в регуляции секреции вазопрессина, вызывая увеличение синтеза транспортного белка кинезина.

2. Антиапоптозный белок Вс1-2 и транскрипционный фактор С11ЕВ участвуют в активации синтеза вазопрессина независимо от ЕКК1/2 сигнального каскада.

3. Проапоптозный белок р53 оказывает модулирующее активирующее действие на секрецию вазопрессина, и это влияние опосредовано Е11К1/2 киназой.

Теоретическая и практическая значимость

Исследование имеет фундаментальное значение для понимания роли сигнальных белков апоптоза Вс1-2 и р53 в модуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов, что открывает новые перспективы в изучении взаимозависимости функциональной активиости нейронов и их жизнеспособности. Понимание механизмов взаимодействия различных белков апоптоза с внутриклеточными посредниками лежит также в основе разработки новых подходов к лечению онкологических заболеваний, а также ряда нейродегенеративных заболеваний, патогенез которых связан с нарушением баланса про- и антиапоптозных белков. Более того, к настоящему времени блокаторы Вс1-2 и р53 (НА14-1 и Р1ИЙ1гт-а соответственно) используются в терапии онкологических заболеваний периферических тканей, в связи с чем необходимо учитывать возможность влияния этих фармакологических агентов на центральную нервную систему. Полученные в работе данные могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтах.

Апробация работы

Результаты исследования доложены и обсуждены на 1 Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005), на XIII международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на 5 международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения-2006» (Санкт-Петербург, 2006), на 6-th ICN (Питтсбург, США 2006), на XX съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Санкт-Петербург, 2007), на Международной конференции «Apoptosis World 2008. From mechanisms to applications» (Люксембург, 2008), на Конференции с международным участием "Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга" (С.-Петербург, 2008), на 11-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователь «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2008), на 4th Conference on Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders (Лейпциг, Германия, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 работ, 2 из которых — статьи в рецензируемых журналах, 17 тезисов докладов. '

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при содействии Российского Фонда Фундаментальных исследований (проекты 05-04-48099 и 08-04-00028)

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 12 отечественных и 163 зарубежных источника. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 таблицами и 49 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Никитина, Любовь Сергеевна

выводы

3. Внутригипоталамическое введение НА14-1 — блокатора антиапоптозного белка Вс1-2 и его добавление в инкубационную среду показали прямую зависимость уровня экспрессии вазопрессина от количества Вс1-2 и от активности транскрипционного фактора CREB в нейронах супраоптического ядра гипоталамуса. Воздействие Вс1-2 на активность синтеза вазопрессина не зависит от активности ERK1/2 киназы и транскрипционного фактора Elkl.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никитина, Любовь Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Агроскин Л.С., Папаян Г.В. Цитофотометрия. // JL: Наука. 1977. 273 с.

2. Алешин Б.В. Гистофизиология гипоталамо-гипофизарной системы. // М.: Медицина. 1971. 439 с.

3. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. // Москва: Товарищество научных изданий КМК. 2003. 160 с.

4. Красновская И.А., Кузик В.В. Гомориположительные элементы гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы крыс (иммуногистохимическое исследование) // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1985. Т.89. С.38-44.

5. Луцик Е.А. Эфферентные и афферентные связи нейросекреторных центров гипоталамуса. Афферентные связи. // Нейроэндокринология. (под ред. А. Л. Поленов) СПб. 1993. 4.1. С.270-299.

6. Никитина Л.С., Глазова М.В., Дорофеева H.A., Черниговская Е.В. Влияние белков апоптоза на функцию вазопрессин- и дофаминергических нейронов гипоталамуса крысы // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2008. Т.44. N.3. С.311-317.

7. Поленов А.Л. Эволюция гипоталамо-гипофизарного нейроэндокринного комплекса. // Руководство по физиологии. Эволюционная физиология. Л.: Наука. 1983. Т.2. С.53-109.

8. Поленов А.Л., Константинова М.С., Гарлов П.Е. Гипоталамо-гипофизарный нейроэндокринный комплекс. // Нейроэндокринология (под ред. А. Л. Поленова) С-Пб: РАН. 1993. 4.1 С.139-187.

9. Угрюмов М.В. Нейроэндокринная регуляция в онтогенезе (структурно-функциональные основы). // М.: Наука. 1989. 247 с.

10. Ю.Филаретова Л.П. Значение паравентрикулярных и вентромедиальных ядер гипоталамуса в активации гипоталамо-адренокортикальной системы// Физиол. Ж. СССР. 1985. Т.71. С.1063-1066.

11. П.Чернышева М.П. Эфферентные и афферентные связи нейросекреторных центров гипоталамуса. Эфферентные проекции. // Нейроэндокринология (под ред. А. Л. Поленова). С-Пб. 1993. 4.1. С. 230-270.

12. Чернышева М.П. Гормоны животных. Введение в физиологическую эндокринология:учебное пособие. // С-Пб.: Глаголъ. 1995. 296 с.

13. Allan V.J., Thompson Н.М., McNiven М.А. Motoring around the Golgi // Nat Cell Biol. 2002. Vol.4. N.10. P.E236-242.

14. Appella E., Anderson C.W. Post-translational modifications and activation of p53 by genotoxic stresses // Eur J Biochem. 2001. Vol.268. N.10. P.2764-2772.

15. Arima H., House S.B., Gainer H., Aguilera G. Neuronal activity is required for the circadian rhythm of vasopressin gene transcription in the suprachiasmatic nucleus in vitro // Endocrinology. 2002. Vol.143. N.ll. P.4165-4171.

16. Armstrong W.E., Warach S., Hatton G.I., McNeill Т.Н. Subnuclei in the rat hypothalamic paraventricular nucleus: a cytoarchitectural, horseradish peroxidase and immunocytochemical analysis //Neuroscience. 1980. Vol.5. N.ll. P.1931-1958.

17. Banasiak K.J., Haddad G.G. Hypoxia-induced apoptosis: effect of hypoxic severity and role of p53 in neuronal cell death // Brain Res. 1998. Vol.797. N.2. P.295-304.

18. Bannasch P. Cell growth and oncogenesis. // Basel. Birkh?user. 1998. xiv. 312 p.

19. Beom S., Cheong D., Torres G., Caron M.G., Kim K.M. Comparative studies of molecular mechanisms of dopamine D2 and D3 receptors for the activation of extracellular signal-regulated kinase // J Biol Chem. 2004. Vol.279. N.27. P.28304-28314.

20. Berman D.E., Hazvi S., Rosenblum K., Seger R., Dudai Y. Specific and differential activation of mitogen-activated protein kinase cascades by unfamiliar taste in the insular cortex of the behaving rat // J Neurosci. 1998. Vol.18. N.23. P.10037-10044.

21. Blume A., Bosch O.J., Miklos S., Torner L., Wales L., Waldherr M., Neumann I.D. Oxytocin reduces anxiety via ERK1/2 activation: local effect within the rat hypothalamic paraventricular nucleus // Eur J Neurosci. 2008. Vol.27. N.8. P.1947-1956.

22. Bonnefoy-Berard N., Aouacheria A., Verschelde C., Quemeneur L., Marcais A., Marvel J. Control of proliferation by Bcl-2 family members // Biochim Biophys Acta. 2004. Vol.1644. N.2-3. P. 159-168.

23. Brunet A., Roux D., Lenormand P., Dowd S., Keyse S., Pouyssegur J. Nuclear translocation of p42/p44 mitogen-activated protein kinase is required for growth factor-induced gene expression and cell cycle entry // Embo J. 1999. Vol.18. N.3. P.664-674.

24. Budhram-Mahadeo V., Morris P.J., Smith M.D., Midgley C.A., Boxer L.M., Latchman D.S. p53 suppresses the activation of the Bcl-2 promoter by the Brn-3a POU family transcription factor // J Biol Chem. 1999. Vol.274. N.21. P.15237-15244.

25. Buijs R.M. Intra- and extrahypothalamic vasopressin and oxytocin pathways in the rat. Pathways to the limbic system, medulla oblongata and spinal cord // Cell Tissue Res. 1978. Vol.192. N.3. P.423-435.

26. Burbach J.P., Luckman S.M., Murphy D., Gainer H. Gene regulation in the magnocellular hypothalamo-neurohypophysial system // Physiol Rev. 2001. Vol.81. N.3.P.1197-1267.

27. Caldwell H.K., Lee H.J., Macbeth A.H., Young W.S., 3rd Vasopressin: behavioral roles of an "original" neuropeptide // Prog Neurobiol. 2008. Vol.84. N.l.P.1-24.

28. Chen D.F., Schneider G.E., Martinou J.C., Tonegawa S. Bcl-2 promotes regeneration of severed axons in mammalian CNS // Nature. 1997. Vol.385. N.6615. P.434-439.

29. Chen J., Freeman A., Liu J., Dai Q., Lee R.M. The apoptotic effect of HA 14-1, a Bcl-2-interacting small molecular compound, requires Bax translocation and is enhanced by PK11195 // Mol Cancer Ther. 2002. Vol.1. N.12. P.961-967.

30. Chen J., Sadowski I. Identification of the mismatch repair genes PMS2 and MLH1 as p53 target genes by using serial analysis of binding elements // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. Vol.102. N.13. P.4813-4818.

31. Chen X., Ko L.J., Jayaraman L., Prives C. p53 levels, functional domains, and DNA damage determine the extent of the apoptotic response of tumor cells // Genes Dev. 1996. Vol.10. N.19. P.2438-2451.

32. Chopp M., Li Y., Zhang Z.G., Freytag S.O. p53 expression in brain after middle cerebral artery occlusion in the rat // Biochem Biophys Res Commun. 1992. Vol.182. N.3. P.1201-1207.

33. Cowan K.J., Storey K.B. Mitogen-activated protein kinases: new signaling pathways functioning in cellular responses to environmental stress // J Exp Biol. 2003. Vol.206. N.Pt 7. P.l 107-1115.

34. Davie J.R., Spencer V.A. Signal transduction pathways and the modification of chromatin structure // Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 2001. Vol.65. P.299-340.

35. Dolmetsch R.E., Pajvani U., Fife K., Spotts J.M., Greenberg M.E. Signaling to the nucleus by an L-type calcium channel-calmodulin complex through the MAP kinase pathway // Science. 2001. Vol.294. N.5541. P.333-339.

36. Donehower L.A., Harvey M., Slagle B.L., McArthur M.J., Montgomery C.A., Jr., Butel J.S., Bradley A. Mice deficient for p53 are developmentallynormal but susceptible to spontaneous tumours // Nature. 1992. Vol.356. N.6366. P.215-221.

37. Foyouzi-Youssefi R., Arnaudeau S., Borner C., Kelley W.L., Tschopp J., Lew D.P., Demaurex N., Krause K.H. Bcl-2 decreases the free Ca2+ concentration within the endoplasmic reticulum // Proc Natl Acad Sci U S A. 2000. Vol.97. N.ll. P.5723-5728.

38. Fuchs S.Y., Adler V., Buschmann T., Yin Z., Wu X., Jones S.N., Ronai Z. JNK targets p53 ubiquitination and degradation in nonstressed cells // Genes Dev. 1998. Vol.12. N.17. P.2658-2663.

39. Fuchs S.Y., Xie B., Adler V., Fried V.A., Davis R.J., Ronai Z. c-Jun NH2-terminal kinases target the ubiquitination of their associated transcription factors // J Biol Chem. 1997. Vol.272. N.51. P.32163-32168.

40. Fukuda M., Gotoh I., Adachi M., Gotoh Y., Nishida E. A novel regulatory mechanism in the mitogen-activated protein (MAP) kinase cascade. Role of nuclear export signal of MAP kinase kinase // J Biol Chem. 1997. Vol.272. N.51. P.32642-32648.

41. Gainer H., Chin H. Molecular diversity in neurosecretion: reflections on the hypothalamo-neurohypophysial system // Cell Mol Neurobiol. 1998. Vol.18. N.2. P.211-230.

42. Gary R.K., Jensen D.A. The p53 inhibitor pifithrin-alpha forms a sparingly soluble derivative via intramolecular cyclization under physiological conditions // Mol Pharm. 2005. Vol.2. N.6. P.462-474.

43. Girault J.A., Greengard P. The neurobiology of dopamine signaling // Arch Neurol. 2004. Vol.61. N.5. P.641-644.

44. Grace C.O., Fink G., Quinn J.P. Characterization of potential regulatory elements within the rat arginine vasopressin proximal promoter // Neuropeptides. 1999. Vol.33. N.l. P.81-90.

45. Gross A., McDonnell J.M., Korsmeyer S.J. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis // Genes Dev. 1999. Vol.13. N.l5. P.1899-1911.

46. Harper J.W., Adami G.R., Wei N., Keyomarsi K., Elledge S.J. The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases // Cell. 1993. Vol.75. N.4. P.805-816.

47. Hershko A., Ciechanover A. The ubiquitin system // Annu Rev Biochem. 1998. Vol.67. P.425-479.

48. Hickman J.A., Hardwick J.M., Kaczmarek L.K., Jonas E.A. Bcl-xL inhibitor ABT-737 reveals a dual role for Bcl-xL in synaptic transmission // J Neurophysiol. 2008. Vol.99. N.3. P. 1515-1522.

49. Hirokawa N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport // Science. 1998. Vol.279. N.5350. P.519-526.

50. Hockenbery D., Nunez G., Milliman C., Schreiber R.D., Korsmeyer S.J. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death//Nature. 1990. Vol.348. N.6299. P.334-336.

51. Hood J.K., Silver P.A. In or out? Regulating nuclear transport // Curr Opin Cell Biol. 1999. Vol.11. N.2. P.241-247.

52. Jamal S., Ziff E.B. Raf phosphorylates p53 in vitro and potentiates p53-dependent transcriptional transactivation in vivo // Oncogene. 1995. Vol.10. N.ll. P.2095-2101.

53. Johannessen M., Delghandi M.P., Moens U. What turns CREB on? // Cell Signal. 2004. Vol.16. N.l 1. P.1211-1227.

54. Jonas E.A., Hoit D., Hickman J.A., Brandt T.A., Polster B.M., Fannjiang Y., McCarthy E., Montanez M.K., Hardwick J.M., Kaczmarek L.K. Modulation of synaptic transmission by the BCL-2 family protein BCL-xL // J Neurosci. 2003. Vol.23. N.23. P.8423-8431.

55. Julien J.P., Mushynski W.E. Neurofilaments in health and disease // Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1998. Vol.61. P.l-23.

56. Kaplan D.R., Miller F.D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system // Curr Opin Neurobiol. 2000. Vol.10. N.3. P.381-391.

57. Kelly K.J., Plotkin Z., Vulgamott S.L., Dagher P.C. P53 mediates the apoptotic response to GTP depletion after renal ischemia-reperfusion: protective role of a p53 inhibitor // J Am Soc Nephrol. 2003. Vol.14. N.l. P.128-138.

58. Khokhlatchev A.V., Canagarajah B., Wilsbacher J., Robinson M., Atkinson M., Goldsmith E., Cobb M.H. Phosphoiylation of the MAP kinase ERK2 promotes its homodimerization and nuclear translocation // Cell. 1998. Vol.93. N.4. P.605-615.

59. Kholodenko B.N. MAP kinase cascade signaling and endocytic trafficking: a marriage of convenience? // Trends Cell Biol. 2002. Vol.12. N.4. P.173-177.

60. Klemke R.L., Cai S., Giannini A.L., Gallagher P.J., de Lanerolle P., Cheresh D.A. Regulation of cell motility by mitogen-activated protein kinase // J Cell Biol. 1997. Vol.137. N.2. P.481-492.

61. Ko L.J., Prives C. p53: puzzle and paradigm // Genes Dev. 1996. Vol.10. N.9. P. 1054-1072.

62. Komarov P.G., Komarova E.A., Kondratov R.V., Christov-Tselkov K., Coon J.S., Chernov M.V., Gudkov A.V. A chemical inhibitor of p53 that protects mice from the side effects of cancer therapy // Science. 1999. Vol.285. N.5434. P.1733-1737.

63. Komarova E.A., Gudkov A.V. Chemoprotection from p53-dependent apoptosis: potential clinical applications of the p53 inhibitors // Biochem Pharmacol. 2001. Vol.62. N.6. P.657-667.

64. Kroemer G., Zamzami N., Susin S.A. Mitochondrial control of apoptosis // Immunol Today. 1997. Vol.18. N.l. P.44-51.

65. Kuribayashi K., El-Deiry W.S. Regulation of programmed cell death by the p53 pathway // Adv Exp Med Biol. 2008. Vol.615. P.201-221.

66. Lane D.P. Cancer. A death in the life of p53 // Nature. 1993. Vol.362. N.6423. P.786-787.

67. Lewis T.S., Shapiro P.S., Ahn N.G. Signal transduction through MAP kinase cascades // Adv Cancer Res. 1998. Vol.74. P.49-139.

68. Li Y., Chopp M., Zhang Z.G., Zaloga C., Niewenhuis L., Gautam S. p53-immunoreactive protein and p53 mRNA expression after transient middle cerebral artery occlusion in rats // Stroke. 1994. Vol.25. N.4. P.849-855; discussion 855-846.

69. Lin X., Conn P.M. Transcriptional activation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor gene by GnRH: involvement of multiple signal transduction pathways // Endocrinology. 1999. Vol.140. N.l. P.358-364.

70. Liu D., Huang Z. Synthetic peptides and non-peptidic molecules as probes of structure and function of Bcl-2 family proteins and modulators of apoptosis // Apoptosis. 2001. Vol.6. N.6. P.453-462.

71. Loregian A., Palu G. Disruption of protein-protein interactions: towards new targets for chemotherapy // J Cell Physiol. 2005. Vol.204. N.3. P.750-762.

72. Luboshits G., Benayahu D. MS-KIF18A, a kinesin, is associated with estrogen receptor // J Cell Biochem. 2007. Vol.100. N.3. P.693-702.

73. Ludwig R.L., Bates S., Vousden K.H. Differential activation of target cellular promoters by p53 mutants with impaired apoptotic function // Mol Cell Biol. 1996. Vol.16. N.9. P.4952-4960.

74. Marshall C.J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation // Cell. 1995. Vol.80. N.2. P.179-185.

75. Massaad C.A., Portier B.P., Taglialatela G. Inhibition of transcription factor activity by nuclear compartment-associated Bcl-2 // J Biol Chem. 2004. Vol.279. N.52. P.54470-54478.

76. Mattson M.P., Gleichmann M., Cheng A. Mitochondria in neuroplasticity and neurological disorders // Neuron. 2008. Vol.60. N.5. P.748-766.

77. Mayr B., Montminy M. Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependent factor CREB // Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. Vol.2. N.8. P.599-609.

78. McGahan L., Hakim A.M., Robertson G.S. Hippocampal Myc and p53 expression following transient global ischemia // Brain Res Mol Brain Res. 1998. Vol.56. N.l-2. P.133-145.

79. Meyer-Spasche A., Piggins H.D. Vasoactive intestinal polypeptide phase-advances the rat suprachiasmatic nuclei circadian pacemaker in vitro via protein kinase A and mitogen-activated protein kinase // Neurosci Lett. 2004. Vol.358. N.2. P.91-94.

80. Mohr E., Richter D. Sequence analysis of the promoter region of the rat vasopressin gene // FEBS Lett. 1990. Vol.260. N.2. P.305-308.

81. Morrison R.S., Kinoshita Y., Johnson M.D., Guo W., Garden G.A. p53-dependent cell death signaling in neurons // Neurochem Res. 2003. Vol.28. N.l.P. 15-27.

82. Murphy A.N., Fiskum G. Bcl-2 and Ca(2+)-mediated mitochondrial dysfunction in neural cell death // Biochem Soc Symp. 1999. Vol.66. P.33-41.

83. Musti A.M., Treier M., Bohmann D. Reduced ubiquitin-dependent degradation of c-Jun after phosphorylation by MAP kinases // Science. 1997. Vol.275. N.5298. P.400-402.

84. Negro-Vilar A. The median eminence as a model to study presynaptic regulation of neural peptide release // Peptides. 1982. Vol.3. N.3. P.305-310.

85. Oltvai Z.N., Milliman C.L., Korsmeyer S.J. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death // Cell. 1993. Vol.74. N.4. P.609-619.

86. Oppenheim R.W. Cell death during development of the nervous system//AnnuRevNeurosci. 1991. Vol.14. P.453-501.

87. Park J.J., Koshimizu H., Loh Y.P. Biogenesis and transport of secretory granules to release site in neuroendocrine cells // J Mol Neurosci. 2009. Vol.37. N.2. P.151-159.

88. Paxinos G., Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. // San Diego. Acad. Press. 1998.

89. Pearson G., Robinson F., Beers Gibson T., Xu B.E., Karandikar M., Berman K., Cobb M.H. Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions // Endocr Rev. 2001. Vol.22. N.2. P.153-183.

90. Pernet V., Hauswirth W.W., Di Polo A. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 mediates survival, but not axon regeneration, of adult injured central nervous system neurons in vivo // J Neurochem. 2005. Vol.93. N.l. P.72-83.

91. Reszka A.A., Seger R., Diltz C.D., Krebs E.G., Fischer E.H. Association of mitogen-activated protein kinase with the microtubule cytoskeleton // Proc Natl Acad Sei USA. 1995. Vol.92. N.19. P.8881-8885.

92. Robles A.I., Bemmels N.A., Foraker A.B., Harris C.C. APAF-1 is a transcriptional target of p53 in DNA damage-induced apoptosis // Cancer Res. 2001. Vol.61. N.18. P.6660-6664.

93. Saini K.S., Walker N.I. Biochemical and molecular mechanisms regulating apoptosis // Mol Cell Biochem. 1998. Vol.178. N.l-2. P.9-25.

94. Sakhi S., Sun N., Wing L.L., Mehta P., Schreiber S.S. Nuclear accumulation of p53 protein following kainic acid-induced seizures // Neuroreport. 1996. Vol.7. N.2. P.493-496.

95. Sapieha P.S., Hauswirth W.W., Di Polo A. Extracellular signalregulated kinases 1/2 are required for adult retinal ganglion cell axon regeneration induced by fibroblast growth factor-2 // J Neurosci Res. 2006. Vol.83. N.6. P.985-995.

96. Sawchenko P.E., Swanson L.W. Immunohistochemical identification of neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus that project to the medulla or to the spinal cord in the rat // J Comp Neurol. 1982. Vol.205. N.3. P.260-272.

97. Sawchenko P.E., Swanson L.W. The organization of forebrain afferents to the paraventricular and supraoptic nuclei of the rat // J Comp Neurol. 1983. Vol.218. N.2. P.121-144.

98. Scalettar B.A. How neurosecretory vesicles release their cargo // Neuroscientist. 2006. Vol.12. N.2. P.164-176.

99. Schaeffer H.J., Weber M.J. Mitogen-activated protein kinases: specific messages from ubiquitous messengers // Mol Cell Biol. 1999. Vol.19. N.4. P.2435-2444.

100. Senda T., Yu W. Kinesin cross-bridges between neurosecretory granules and microtubules in the mouse neurohypophysis // Neurosci Lett. 1999. Vol.262. N.l. P.69-71.

101. Sharrocks A.D. The ETS-domain transcription factor family // Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. Vol.2. N.ll. P.827-837.

102. Shinoura N., Sakurai S., Shibasaki F., Asai A., Kirino T., Hamada H. Co-transduction of Apaf-1 and caspase-9 highly enhances p53-mediated apoptosis in gliomas // Br J Cancer. 2002. Vol.86. N.4. P.587-595.

103. Singh S., Upadhyay A.K., Ajay A.K., Bhat M.K. p53 regulates ERK activation in carboplatin induced apoptosis in cervical carcinoma: a novel target of p53 in apoptosis // FEBS Lett. 2007. Vol.581. N.2. P.289-295.

104. Sladek C.D., Fisher K.Y., Sidorowicz H.E., Mathiasen J.R. cAMP regulation of vasopressin mRNA content in hypothalamo-neurohypophysial explants //Am J Physiol. 1996. Vol.271. N.3 Pt 2. P.R554-560.

105. Smith A., Ramos-Morales F., Ashworth A., Collins M. A role for JNK/SAPK in proliferation, but not apoptosis, of IL-3-dependent cells // Curr Biol. 1997. Vol.7. N.ll. P.893-896.

106. Smolen A. Image analytic techniques for quantification of immunohistochemical staining in the nervous system // Methods Neurosci. 1990. Vol.3. P.208-229.

107. Soane L., Fiskum G. Inhibition of mitochondrial neural cell death pathways by protein transduction of Bcl-2 family proteins // J Bioenerg Biomembr. 2005. Vol.37. N.3. P.179-190.

108. Strosznajder R.P., Jesko H., Banasik M., Tanaka S. Effects of p53 inhibitor on survival and death of cells subjected to oxidative stress // J Physiol Pharmacol. 2005. Vol.56 Suppl 4. P.215-221.

109. Swanson L.W., Sawchenko P.E. Hypothalamic integration: organization of the paraventricular and supraoptic nuclei // Annu Rev Neurosci. 1983. Vol.6. P.269-324.

110. Tedeschi A., Di Giovanni S. The non-apoptotic role of p53 in neuronal biology: enlightening the dark side of the moon // EMBO Rep. 2009. Vol.10. N.6. P.576-583.

111. Tedeschi A., Nguyen T., Puttagunta R., Gaub P., Di Giovanni S. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration // Cell Death Differ. 2009. Vol.16. N.4. P.543-554.

112. Tendler Y., Weisinger G., Coleman R., Diamond E., Lischinsky S., Kerner H., Rotter V., Zinder O. Tissue-specific p53 expression in the nervous system // Brain Res Mol Brain Res. 1999. Vol.72. N.l. P.40-46.

113. Tribollet E., Armstrong W.E., Dubois-Dauphin M., Dreifuss J.J. Extra-hypothalamic afferent inputs to the supraoptic nucleus area of the rat as determined by retrograde and anterograde tracing techniques // Neuroscience. 1985. Vol.15. N.l. P.135-148.

114. Van H., II, Banihashemi В., Wilson A.M., Jacobsen K.X., Czesak M., Albert P.R. Differential signaling of dopamine-D2S and -D2L receptors to inhibit ERK1/2 phosphorylation // J Neurochem. 2007. Vol.102. N.6. P. 1796-1804.

115. Vaseva A.V., Moll U.M. The mitochondrial p53 pathway // Biochim Biophys Acta. 2009. Vol.1787. N.5. P.414-420.

116. Vaux D.L., Cory S., Adams J.M. Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells // Nature. 1988. Vol.335. N.6189. P.440-442.

117. Veeranna, Amin N.D., Ahn N.G., Jaffe H., Winters C.A., Grant P., Pant H.C. Mitogen-activated protein kinases (Erkl,2) phosphorylate Lys-Ser-Pro (KSP) repeats in neurofilament proteins NF-H and NF-M // J Neurosci. 1998. Vol.18. N.ll. P.4008-4021.

118. Veeranna, Shetty K.T., Takahashi M., Grant P., Pant H.C. Cdk5 and МАРК are associated with complexes of cytoskeletal proteins in rat brain // Mol Brain Res. 2000. Vol.76. N.2. P.229-236.

119. Waldman Т., Kinzler K.W., Vogelstein B. p21 is necessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancer cells // Cancer Res. 1995. Vol.55. N.22. P.5187-5190.

120. Wang H.G., Takayama S., Rapp U.R., Reed J.C. Bcl-2 interacting protein, BAG-1, binds to and activates the kinase Raf-1 // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. Vol.93. N.14. P.7063-7068.

121. Wang Z., Zhang B., Wang M., Carr B.I. Persistent ERK phosphorylation negatively regulates cAMP response element-binding protein (CREB) activity via recruitment of CREB-binding protein to pp90RSK//J Biol Chem. 2003. Vol.278. N.13. P.l 1138-11144.

122. Weitzman R.E., Kleeman C.R. The clinical physiology of water metabolism. Part I: The physiologic regulation of arginine vasopressin secretion and thirst// West J Med. 1979. Vol.131. N.5. P.373-400.

123. Whitmarsh A.J., Davis R.J. Structural organization of MAP-kinase signaling modules by scaffold proteins in yeast and mammals // Trends Biochem Sci. 1998. Vol.23. N.12. P.481-485.

124. Wilson B.E., Mochon E., Boxer L.M. Induction of bcl-2 expression by phosphorylated CREB proteins during B-cell activation and rescue from apoptosis // Mol Cell Biol. 1996. Vol.16. N.10. P.5546-5556.

125. Wu Z., Wu L.J., Tashiro S., Onodera S., Ikejima T. Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase up-regulated p53 expression inshikonin-induced HeLa cell apoptosis // Chin Med J (Engl). 2005. Vol.118. N.8. P.671-677.

126. Xiong Y., Hannon G.J., Zhang H., Casso D., Kobayashi R., Beach D. p21 is a universal inhibitor of cyclin kinases // Nature. 1993. Vol.366. N.6456. P.701-704.

127. Yamaguchi K., Hama H., Watanabe K., Yamaya K. Effect of 6-hydroxydopamine injection into the arcuate hypothalamic nucleus on the osmotic release of vasopressin in conscious rats // Eur J Endocrinol. 1994. Vol.131. N.6. P.658-663.

128. Yang S.H., Sharrocks A.D., Whitmarsh A.J. Transcriptional regulation by the MAP kinase signaling cascades // Gene. 2003. Vol.320. P.3-21.

129. Yin X.M., Oltvai Z.N., Korsmeyer S.J. BH1 and BH2 domains of Bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with Bax // Nature. 1994. Vol.369. N.6478. P.321-323.

130. Yoshida M., Iwasaki Y., Asai M., Takayasu S., Taguchi T., Itoi K., Hashimoto K., Oiso Y. Identification of a functional API element in the rat vasopressin gene promoter // Endocrinology. 2006. Vol.147. N.6. P.2850-2863.

131. Yu C., Yap N., Chen D., Cheng S. Modulation of hormone-dependent transcriptional activity of the glucocorticoid receptor by the tumor suppressor p53 // Cancer Lett. 1997. Vol.116. N.2. P.191-196.

Информация о работе

Никитина, Любовь Сергеевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.03.01

Диссертация

Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы