Экспрессия сигнальных белков апоптоза в нонапептидергических нейронах гипоталамуса

Таранухин, Андрей Григорьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия сигнальных белков апоптоза в нонапептидергических нейронах гипоталамуса
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия сигнальных белков апоптоза в нонапептидергических нейронах гипоталамуса"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт эволюционной физиологии и биохимии имени ЯМ. Сеченова

На правах рукописи

Таранухин Андрей Григорьевич

ЭКСПРЕССИЯ СИГНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ А ПО ПТОЗА В НОНАПЕПТИДЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНАХ ГИПОТАЛАМУСА

03.00.13. - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2003

Работа выполнена в лаборатории сравнительной со миологии и нейроэндокринологни Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научные руководители: д.м.н. Г. А. Оганесян,

к.б.н. Б.В. Черниговская

Официальные оппоненты: к.б.н. .М.П. Чернышева

д.б.н. ЛЛ. Филаретова

Ведущее учреждение: НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита состоится "Ц" ноября 2003 г. в Д часов на заседании диссертационного совета по защите кандидатских диссертаций Д 002.127.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова

Автореферат разослан октября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета // /У . доктор биологических наук, профессор л РеЛ/^й^ МН.Маслова

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а-МПТ—альфа-метил-п-тирозин

ВП-вазопрессин

ДА-дофамин

ИР - иммунореактивный

КА - катехоламины

НА - норадреналин

ПВЯ - паравентрикулярнос ядро

СОЯ - супраоптическое ядро

nNOS - нейрональная NO-синтаза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Общепризнано, что гипоталамо-пшофизарный нейроэндокринный комплекс у позвоночных животных играет ведущую роль в интеграции систем организма, поддержании гомеостаза, а также в реализации разнообразных адаптивных функций. Существенную роль в регуляции этих процессов отводят нонапептидергической шпоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе, продуцирующей нонапептидные гормоны - вазопрессин (ВП) и окситоцин [Scharrer, Scharter, 1963; Поленов, 1968, 1983]. Окситоцин и ВП являются основными участниками регуляции водно-солевого обмена и тонуса сосудов. Показано участие этих нейрогормонов в терморегуляции, регуляции поведения, обучения и памяти. Кроме того, нонапептидные гормоны, поступая в портальный кровоток передней доли гипофиза, действуют наряду с аденогипофизотропными гормонами, оказывая влияние на выделение тройных гормонов [Поленов, 1986].

Крупноклеточные ВП- и окситоцин-ергические нейроны являются удобной моделью для изучения цитофизиологических аспектов синтеза и выделения нейрогормонов. Их относительно крупные размеры, хорошо известная локализация и способность изменять свою функциональную активность адекватно применяемым нагрузкам позволяет использовать их для изучения процессов внутриклеточной регуляции функционального состояния и апоптоза.

Проблема апоптоза активно изучается последние 30 лет и за это время накоплено большое количество данных о факторах, вызывающих алоптоз нейронов и подробно описаны сигнальные пути инициации и реализации апоптоза [Eamshaw et al., 1999; Budihardjo et al., 1999]. Известно, что в формирующейся нервной системе большую роль играет программированная клеточная гибель нейронов, которая является необходимым условием нормального развития центральной и периферической нервной системы [Oppenheim, 1991; Johnson, Deckwerth, 1993; Henderson, 1996]. Усиление или ослабление интенсивности апоптоза нейронов могут приводить к различным нарушениям я аномалиям развития структур головного мозга. Однако до сих пор остается без внимания роль апоптоза в формировании нонапептидергической нейросекреторной системы гипоталамуса.

Катехоламины (КА) и N0 - факторы, участвующие в регуляции функционального состояния нонапептидергических нейронов взрослых животных. В ряде работ на различных типах нейронов показано, что КА и N0 принимают участие в регуляции программированной клеточной гибели, при этом действие этих веществ на алоптоз не является однозначным и во многом зависит от типа клеток и условий опыта [Noh et al., 1999; Brune et al., 1998]. Однако практически ничего не известно об участии КА и NO в регуляции апоптоза нонапептидергических нейронов. Показано, что КА оказывают морфогенетическое влияние на развивающиеся гипоталамические нейроны, в том числе и нонапептидергические [Lauder, Bloom, 1974; Wray, Hoffman, 1986], но только единичные работы связывают морфогенетическое влияние КА на формирующиеся нейросейретошда1кдатаиМ!й1Щ<^уса с программированной клеточной гибелью [Pabbalhi et al., 199 ]. БИБЛИОТЕКА

С Петербург ' 09

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение влияния КА на экспрессию сигнальных белков апоптоза в нонапептидергических нейронах гипоталамуса крыс находящихся на разных стадиях постнатального онтогенеза, а также выяснение возможного участия специфических сигнальных белков апоптоза в регуляции функционального состояния вазопрессинергических нейронов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить характер влияния изменений уровня КА в мозге на содержание nNOS, проапоптозного белка каспазы-9 и антиапоптозного белка Ьс1-2 в нонапептидергических нейронах взрослых крыс.

2. Оценить динамику экспрессии каспазы-9 и bcl-2 в нонапептидергических нейронах крысят, подвергавшихся пренатальной блокаде синтеза КА и интактных крысят на ранних этапах постнатального онтогенеза.

3. Оценить функциональное состояние ВП-ергических нейронов у мышей-нокаутов по генам р21, р53 и bcl-2, и у мышей с повышенной экспрессией генас-Raf-l.

Научная новизна результатов исследования.

В данной работе впервые продемонстрировано, что значительные изменения уровня КА в мозге сопровождаются увеличением внутриклеточного содержания nNOS и приводят к повышению экспрессии каспазы-9 и bcl-2 в нонапептидергических нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса. Динамика экспрессии каспазы-9 и bcl-2 в течение раннего постнатального онтогенеза существенно различается в нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса интактных крысят, указывая на более раннее завершение формирования СОЯ. Пренатальное снижение уровня КА в мозге вызывает значительное усиление механизмов как инициирующих, так и подавляющих апоптоз в нонапептидергических клетках у крысят на ранних сроках постнатального развития, что свидетельствует о морфогенетическом влиянии КА на развивающиеся нонапептидергические нейросекреторные центры.

Также впервые показано, что сигнальные белки апоптоза - р21, р53, bcl-2 и митогенный фактор - с-Raf-l участвуют в регуляции синтеза и выведения ВП нейронами СОЯ и ПВЯ гипоталамуса.

Нами были выявлены значительные различия между нейронами СОЯ и ПВЯ как в путях реализации программированной клеточной гибели, так и в регуляции функционального состояния этих нейронов сигнальными белками апоптоза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изменение уровня КА в мозге повышает экспрессию сигнальных белков апоптоза в нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса.

2. На ранних стадиях постнатального онтогенеза КА модулируют апоптоз нейронов СОЯ и ПВЯ, оказывая, таким образом, морфогенетическое влияние на формирующиеся нонапептидергические нейросекреторные центры.

3. Сигнальные белки апоптоза участвуют в регуляции функционального состояния ВП-ергических нейронов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Анализ полученных результатов позволил сформулировать научную гипотезу о зависимости апоптоза нонапептидергических нейронов от факторов, принимающих участие в регуляции функциональной активности этих нейронов (катехоламины, NO), а также о зависимости функциональной активности нонапептидергических нейронов от экспрессии в них сигнальных белков апоптоза.

Полученные результаты важны для понимания механизмов апоптоза нонапептидергических нейросекреторных клеток в условиях их хронической активации.

Кроме того, полученные данные позволяют оценить роль апоптоза в ходе формирования нонапептидергических нейросекреторных центров. Выяснение роли КА в регуляции апоптоза развивающихся ВП-ергических нейронов может иметь практическое значение в клинике при лечении несахарного диабета, а также при исследовании приспособляемости организма к условиям длительного стресса.

Материалы настоящего исследования используются при чтении лекций спецкурса по сравнительной гистофизиологии эндокринной системы в Санкт-Петербургском государственном университете.

Работа выполнена по плану научных исследований лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокринолопш Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН в рамках проекта РФФИ (01-04-48825).

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены яа ХП Международном совещании и V школе по эволюционной физиологии (С-Петербург, 2001), на 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пупщно, 2002), на Второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме в патологии" (Новосибирск, 2002), на международном симпозиуме "Neuron differentiation and plasticity - regulation by intercellular signals" (Москва, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием "Нейроэндокринология-2003" (С-Петербург, 2003). По материалам диссертации опубликовано 8 тезисов докладов на Российских и международных конференциях и две научные статьи в рецензируемых российских журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на /К страницах машинописного текста, содержит.?/ рисунков и 14 таблиц. Список литературы включает 270 источников, в том числе 247 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Инкубация переживающих срезов гипоталамуса в средах с добавлением норадреналина и дофамина.

Для изучения влияния повышенного уровня НА и ДА на апоптоз нонапептидергических нейронов были проведены опыты in vitro - инкубация переживающих срезов гипоталамуса в средах, содержащих НА или ДА. Проведение опытов in vitro позволило исключить влияния других нейрогормонов и нейротрансмиттеров мозга на изучаемые нами пшоталамические центры и определить характер прямого влияния КА на инициацию апоптоза этих нейронов.

В эксперименте использовали половозрелых самцов линии Вистар массой 120140 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при естественном освещении. Опыты начинались в 12-13 часов дня. В каждой экспериментальной группе было по 5 животных.

Взрослых самцов крыс декапитировали, быстро извлекали мозг и в стерильных условиях из гипоталамической области иссекали срезы толщиной 400-500 мкм, содержащие СОЯ и ПВЯ. Срезы помещали в питательную среду 199 яа растворе Хенкса, предварительно насыщенную карбогеном (95% 0*+ 5% СО2), и прединкубировали в течение 60 минут при 37° С. После прединкубации срезы помещали в питательную среду, содержащую ДА в концентрации 100 нМ или НА в концентрации 10нМ на 30 мин, а затем переносили на 2.5 часа в среду без добавления КА. Контролем служили срезы гипоталамуса, инкубированные в течение 4-х час в среде, не содержащей КА. Интактным контролем служили гипоталамусы крыс, выделенные и зафиксированные непосредственно после декапитации. После

инкубации срезы фиксировали 4%-ным параформальдегидом в течение 1 сут, затем после стандартной обработки заливали в парафин.

2. Фармакологическое ингибярование синтеза катехоламинов.

Для изучения влияния пониженного уровня КА на апоптоз ноналептидергических нейронов гипоталамуса проводилось фармакологическое ингибирование синтеза КА (ТгетЫеаи е1 а!., 1995). В качестве блокатора синтеза КА мы использовали а-метил-п-тнрозин (а-МПТ) - вещество, которое препятствует образованию тирозингидроксилазы -основного фермента синтеза КА.

Блокада синтеза катехоламинов на фоне специфической физиологической нагрузки у взрослых крыс.

Опыты проводили на взрослых самцах крыс линии Вистар массой 170-200г. Были использованы 4 группы животных по 5 крыс в каждой. 1-я группа - контрольная - включала интактных животных. Крысам 2-й группы перед фиксацией ежедневно в течение 3-х дней в утренние часы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор в количестве 0,25 мл/100г веса животного. Введение физиологического раствора позволило оценить реакцию нейронов СОЯ и ПВЯ на инъекцию как на стрессорный фактор. Животные 3-й группы были подвергнуты дегидратации (солевая диета и водная депривация в течение 5 суток), что должно было обеспечить сильную активацию вазопрессинергической системы гипоталамуса. Для выяснения характера влияния КА на программированную гибель нейронов гипоталамуса в условиях жесткой дегидратации животным 4-й группы на фоне дегидратации в течение 3-х последних дней опыта внутрибрюшинно вводился блокатор синтеза КА - а-МПТ, из расчета 200 мг/кг веса животного ["М(1ег1бу, 1979].

Снижение уровня катехоламинов мозга в ходе эмбрионального развития крысят.

Для изучения возможности участия КА в регуляции программированной клеточной гибели в СОЯ и ПВЯ в ходе эмбрионального развития, самкам ежедневно с 13-го по 20-й дни беременности (1-й днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках самок) делали внутрибрюшинные инъекции а-МПТ - блокатора синтеза КА. Первую инъекцию (13-й день беременности) делали из расчета 200 мг/кг веса животного, далее по 100 мг/кг. а-МПТ разводили на физиологическом растворе. Объем инъекции составлял 0,5-0,6 мл. Второй группе с 13-го по 20-й дни беременности вводили физиологический раствор в том же объеме. Третью группу составляли интактные животные. Родившихся крысят разделили на две группы. Первую группу декапитировали на 3-й день, а вторую - на 15-й день жизни.

3. Изучение влияния сигнальных белков апоптоза на функциональную активность вазопрессинергических нейронов.

Для проверки предположения о способности сигнальных белков апоптоза влиять на функциональную активность вазопрессинергических нейронов мы использовали трансгенных мышей по генам р21, р53, Ьс1-2 и с-Яа£-1, а также контрольных мышей тех же линий, от которых были получены мыши-нокауты. Мыши были получены в Институте радиационной биологии и клеточных исследований Университета г. Вюрзбурга, Германия, гипоталамусы которых любезно предоставил нам сотрудник др. Л.М.Федоров. Выявление и-РНК ВП в перикарионах нейронов СОЯ и ПВЯ гипоталамуса позволило нам оценить уровень синтеза ВП, а сопоставление количества иРНК ВП с содержанием иммунореактивного ВП в этих клетках позволило оценить интенсивность выведение ВП у нокаутных мышей, а также сделать вывод о влиянии сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов.

Обработка ткани.

По окончанию опытов животных декапитировали, аккуратно и быстро извлекали гипоталамус и помещали его в фиксатор - 2 %-ный (для крысят) и 4 %-ный (для взрослых

1фыс) раствор параформальдегида в 0,01 M фосфатном буфере. Фиксацию проводили при t = 4 °С в течение 3-4 дней. Затем гипоталамусы отмывали от фиксатора дистилированной водой в течение 2 ч. Далее материал проводили по спиртам - этанол: 70° I - 24 ч, 70° II -24 ч, 80° -1 ч, 90° -1 ч, 96° I - 1 ч, 96° II - 1 ч, бутанол I -1 ч, бутанол П - ночь, ксилол I, II, Ш, IV по 30 мин в каждом; парафин I, II по 1,5 ч. Затем материал заливали в парафиновые блоки.

Изготавливали фронтальные чередующиеся срезы гипоталамуса толщиной 8 мкм -для гибридизации in situ, 5 мкм - для иммуногистохимии. Таким образом, можно было выявлять на параллельных срезах и-РНК ВП, ВП, каспазу-9, bcl-2 и nNOS.

Методики исследований.

Иммуногистохимия.

Иммуногистохимическую обработку проводили по стандартной методике: 1. Инкубация с первичными поликлональными антителами кролика к ВП (1: 200) (Research Diagnostic Inc.), каспазе-9 (1: 50), bcl-2 (1: 500) (Santa Kruz Biotechnology Inc.) или nNOS (1: 150) (Transduction Lab.). 2. Инкубация со вторичными биотинилированными антителами при выявлении каспаза-9, bcl-2 и nNOS или с антителами к IgO кролика на PBS при выявлении BE 3. Нанесение авидин-биотинового комплекса 1:200 (Vectastain, Vector Labs) при выявлении каспаза-9, bcl-2 и nNOS или пероксидаза-антипероксидазного комплекса 1:100 (Sigma) при выявлении ВП. 4. Проявление реакции проводилось диаминобензидином.

Выявление ВП позволяло оценить функциональное состояние ВП-ергических нейронов, а выявление тирозингидроксилазы в СОЯ и ПВЯ позволяло оценить изменение уровня КА-ергяческой иннервации нонапептидергических нейронов при экспериментальных воздействиях, используемых в нашей работе. По уровню содержания проапоптозного сигнального бежа каспазы-9 в нонапептидергических нейронах гипоталамуса мы могли судить об инициации апоптоза в этих клетках. Содержание bcl-2 в нейронах служило нам показателем активации в клетках защитных антиапоптотических механизмов. Выявляя нейрональную NO-синтазу (nNOS) в нонапептидергических нейронах гипоталамуса, мы могли судить об уровне NO в этих клетках, а сопоставление этих данных с уровнем про- и антиапоптозных белков позволило выяснить роль NO, как возможного модулятора апоптоза.

Гибридизация in situ.

Синтез пробы РНК (рибопроба).

Меченая дигоксигенином и-РНК ВП была синтезирована in vitro транскрипционной реакцией с использованием линейной ДНК плазмиды (1 мкг), комплекса РНК, меченых дигоксигенином (Boehringer Mannheim, Germany), Т7 РНК-полимеразы, транскрипционного буфера и ингибитора РНКазы (Boehringer Mannheim, Germany) согласно инструкции производителя (Campbell-Thompson M.L. et al., 1995). Для оценки соответствия длины полученной пробы и-РНК ВП длине соответствующего транскрипта была проведена проверка в 1%-ном агарозном геле с добавлением этидиум-бромида; результаты оказались положительными. Меченая дигоксигенином и-РНК ВП не хранилась и использовалась для гибридизации сразу после синтеза.

Пердварительная обработка.

Срезы обрабатывали 0,1 M HCl в течение 10 минут (депротеинизация). Для блокирования областей неспецифического связывания РНК на срезы наносили 0,1 M раствор триэтаноламина (рН=8,0) (triethanolamine, SIGMA) с добавлением ангидрида уксусной кислоты (0,25%) на 20 минут. Предварительная обработка завершалась дегидратацией, стекла промывали по 5 минут в 70%, 80% и 95% этаноле, затем стекла подсушивали. Между всеми основными этапами стекла промывали в PBS (2 раза по 10 минут).

Гибридизация.

Все последующие этапы реакции проводились во влажных камерах.

Гибридизацию проводили согласно принятой методике (Campbell-Thompson M.L. et. al., 1995). Срезы инкубировали в течение 1 часа при температуре 37®С в прегибридизационном растворе (50 мл формами да, 30,5 мл дистиллированной воды, 5 мл

раствора Денхарта (50х Denhardt's solution, SIGMA), 5 мл EDTA (0,5 М), 5 мл TRIS-HC1 (1 М, рН=7,6), 2,5 мл тРНК (10 мг/мл), NaCl (1 М). Затем на срезы был нанесен гибридизационный раствор (формамид 50%, основной гибридизационный раствор (1х), рибопроба к ВП (0,5 нг/мкл), NaCl (0,33 М), декстран сульфат (10%)). Основной гибридизационный раствор (10х): 2 мл TRIS-HC1 (1 М, рН=7,5), 200 мкл EDTA (0,5 М), 0,5 мл ДНК (25 мг/мл), 2 мл раствора Денхарта (50х), 5,5 мл HjO. Инкубация срезов в гибридизационном растворе продолжалась 12 часов при температуре 50°С.

Для промывки срезов использовали смесь хлорида и цитрата натрия (SSC: 8,77 г NaCl, 4,4 г Na-цитрэт на 1 л): 30 мин. SSC (2х), 60°С; 60 мин. SSC (1х), 50% формамид, 60°С; 90 мин. SSC (0,5х), 50% формамид, 40°С; 60 мин. SSC (0,1х), 50% формамид, 37°С; 3 раза по 10 мин. SSC (0,1х) без формамида при комнатной температуре.

Визуализация гибридизации рибопроб, меченых дигоксигенином.

Промывка 10 мин. в буфере А (100 мМ TRIS-HC1, 150 мМ NaCl, рН=7,5). Для блокирования неспецифического связывания белка срезы инкубировали в течение 30 мин. при комнатной температуре в специальном блокирующем растворе, содержащем 1% блокирующего реагента и 0,5% альбумина бычьей сыворотки, разведенных на буфере А. Излишки блокирующего раствора удаляли и на срезы наносили алкапин-фосфатазу, связанную с анти-дигоксигенин антителами (разведение 250х на блокирующем растворе). Инкубация с алкалин-фосфатазой проводилась во влажной камере в течение 12 часов при температуре 4°С. Далее срезы промывали несколько раз по 5 мин. в буфере А и 3 мин в буфере В (100 мМ TRIS-HC1, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl2, рН=9,5). Для выявления алкалин-фосфатазы на срезы наносили раствор, содержащий NBT (nitro blue solution) и X-phosphate solution и оставляли инкубироваться в темноте во влажных камерах при комнатной температуре до проявления реакции. Для остановки реакции использовался буфер С (100 мМ TRIS-HC1, 1 мМ EDTA, рН=9,5).

Микроскопия и анализ изображений.

Количественная оценка содержания и-РНК ВП, меченой дигоксигенином, а также ВП-, тирозингидроксилаза-, каспаза-9-, bcl-2- и nNOS-иммунореактивных (ИР) веществ, в нейросекреторных клетках производилась на основании измерения оптической плотности окрашенного вещества в перикарионах с помощью компьютерного цифрового анализатора телевизионного изображения и программного обеспечения PhotoM [Черниговский, http://t_lambda.chat.ru] на 5-6 срезах СОЯ и крупноклеточной части ПВЯ, полученных от каждого животного. Оптическая плотность измерялась приблизительно в 50 клетках каждого среза ядра. Измерение ИР ВП, тирозин гидроксилазы, каспазы-9, bcl-2 и nNOS проводили при длине волны 550 нм; оптическую плотность дигоксигениновой метки и-РНК ВП измеряли при длине волны 650 нм на параллельных срезах гипоталамуса в СОЯ и ПВЯ. При каждом измерении оптическую плотность фона оценивали на том же срезе на участке ткани мозга, не содержащем ИР вещества. Данные выражены в условных единицах оптической плотности на мкм . Измерение оптической плотности позволило нам оценить степень активации в клетке синтеза выявляемых белков. Кроме оценки содержания в нейронах ИР каспазы-9, bcl-2 и nNOS на основании измерения оптической плотности проводился также подсчет количества ИР нейронов давших интенсивную иммуногистохимическую реакцию на эти белки. Это позволило нам определить число клеток в гипоталамических ядрах в которых наблюдалась повышенная экспрессия изучаемых про- и антиапоптозных белков.

Статистический анализ результатов.

Полученные результаты статистически оценивали по t-критерию Стьюдента, используя коммерческую программу Microsoft Exel 5.0а. Данные представлены в виде среднего арифметического по каждой группе животных +/- стандартное отклонение. Достоверными считались отличия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние повышенного уровня дофамина и норадреналина на содержание nNOS, каспазы-9 и be 1-2 в нонапептидергических нейронах.

Влияние условий инкуб»ш»я.

Инкубация срезов гипоталамуса в "чистой" среде в течение 4-х часов приводила к увеличению числа нейронов, экспрессирующих каспазу-9 в нейронах СОЯ по сравнению с интактным контролем, т.е. денервация вызывала индукцию апоптоза (рис. 1А). Это хорошо согласуется с данными других авторов, которые на взрослых крысах показали, что денервация вызывает апоптоз нейронов [Capurso et al., 1997; Kolasa, Harrel, 2000], причем также через активацию каспазы-9 [Kermer et al., 2000].

Известно, что перерезка нервных волокон вызывает повышенную экспрессию антиапоптозного белка bcl-2 в значительном числе нейронов и тем самым предотвращает их апоптотическую гибель [Zhou et al., 1999]. В нашей работе в лишенных иннервации нейронах СОЯ также наблюдалось повышение экспрессии антиапоптозного белка bcl-2, что указывает на активацию защитаых механизмов в этих клетках (рис. 1А). Так как уровень экспрессии nNOS при денервации не менялся, а уровень экспрессии каспазы-9 и bcl-2 значительно возрастал, то очевидно, что инициация и про- и антиапоптозных механизмов, вызваная денервацией, не связана с влиянием NO.

В нейросекреторных клетках ПВЯ, в отличие от СОЯ, денервация вызывала значительное усиление экспрессии nNOS (рис. 1Б). При этом следует отметить, что число клеток экспрессирующих проапоптозный белок каспазу-9 и антиапоптозный белок bcl-2 в ПВЯ после 4-х час инкубации не отличалось от числа клеток у интактных животных. Т.е. лишение клеток ПВЯ иннервации не приводило к инициации апоптоза в этих клетках.

Таким образом, исследуемые нами нейроны двух нонапептидергических ядер - СОЯ и ПВЯ - проявляют различную реакцию на денервацию. В нейронах СОЯ наблюдается индукция апоптоза, о чем свидетельствует повышение в них содержания проапоптозного белка каспазы-9. В нейронах же ПВЯ содержание каспазы-9 не меняется по сравнению с интактным контролем, т.е. индукции апоптоза не происходит.

Влияннедо+амииа.

О влиянии ДА на апоптоз нервных клеток имеются довольно противоречивые данные. С одной стороны, на культурах клеток стриатума [McLaughlin et al., 1998], нейробластомы человека [Simantov et al., 1996] показано, что добавление в инкубационную среду ДА приводит к апоптозу нейронов. Предполагают, что проапоптозное действие ДА опосредуется генерацией свободных радикалов [McLaughlin et al., 1998; Alagarsamy et al., 1997; Cheng et al., 1996]. С другой стороны имеются данные, что ДА и его предшественник L-DOPA могут защищать нейроны от гибели, активируя анти-оксидантные механизмы [Han et al., 1996; Liu, Могу, 1993; Miura et al., 1996].

В наших экспериментах, судя по повышенной экспрессии каспазы-9 в нейронах ПВЯ, преобладало токсическое влияние ДА на эти клетки, хотя при этом мы не наблюдали значительной гибели клеток (рис. 1Б). Добавление в инкубационную среду ДА не приводило к активации экспрессии антиапоптозного белка bcl-2. Можно предположить, что апоптоз блокируется другими защитными механизмами, которые действуют на более поздних этапах апоптоза - уже после активации каспазы-9.

Мы показали, что ДА индуцирует апоптоз только в нейронах ПВЯ. При этом активация ДА каспазы-9, очевидно, не связана с NO. Таким образом, мы продемонстрировали различия реакции нейронов СОЯ и ПВЯ гипоталамуса на ДА.

Влияние нпрадрриалина.

В нашем исследовании инкубация переживающих срезов гипоталамуса в среде с добавлением НА приводила к достоверному увеличению экспрессии nNOS по сравнению с контролем в нейросекреторных клетках СОЯ, а также к значительному увеличению экспрессии проапоптозного белка каспазы-9 (рис. 1А). Это совпадает с данными других исследователей, также показавших, что НА вызывает увеличение синтеза nNOS в

люлиберинергических нейронах, а также повышает ее активность [McCann et al., 1998; Canteros et al., 1996]. Также очевидно, что НА вызывает инициацию апоптоза в нонапептидергических нейронах СОЯ и это вполне согласуется с уже имеющимися данными литературы, полученными на других клетках [Noh et al., 1999; Zilkha-Falb et al., 1997]. Известно, что активация каспазы-9, т.е. переход ее из неактивной формы в активную происходит под действием NO, который взаимодействует с мембраной митохондрий и способствует высвобождению цитохрома С, а цитохром С в свою очередь участвует в дальнейшей цепи реакций и приводит к активации каспазы-9 [Uehara et al., 1999; Moriya et al., 2000]. Наблюдаемая нами в нейронах СОЯ под влиянием НА высокая корреляция между повышенной экспрессией nNOS и повышенной экспрессией каспазы-9, также позволяет предположить, что НА приводит к увеличению внутриклеточного содержания NO, который далее приводит к активации каспазы-9, т.е. приводит к инициации апоптоза.

Наряду с увеличением содержания каспазы-9 в нейронах СОЯ под влиянием НА наблюдалось также значительное повышение экспрессии антиапоптозного белка Ьс1-2 (рис. 1А), что свидетельствует об инициации в этих клетках защитных антиапоптозных механизмов. Белок bcl-2 препятствует выходу цитохрома С из митохондрий и тем самым подавляет активацию каспазы-9 и инициацию апоптоза [Kroemer et al., 1997]. Однако, в нашей работе наблюдалась повышенная экспрессия каспазы-9 и повышенная экспрессия bcl-2. Вероятно, bcl-2 участвует в подавлении апоптоза на более позднем этапе активации каскада каспаз [Rosse et al., 1998]. Увеличение содержания антиапоптозного белка bcl-2 также может быть связано с повышенной продукцией N0, так как известно, что N0 может инактивировать активные каспазы, в частности каспазу-3, субстратом которой является bcl-2 [Kim et al., 1997; Li et al., 1997].

В нейронах ПВЯ добавление в инкубационную среду НА не вызывало изменения в экспрессии nNOS по сравнению с нейронами инкубируемыми в чистой среде (рис. 1Б). С одной стороны можно предположить, что НА не влияет на экспрессию nNOS в нейронах ПВЯ. А с другой стороны, и это кажется нам более вероятным, лишение клеток ПВЯ всей иннервации при иссечении срезов и их инкубации в чистой среде уже привело к максимальному повышению экспрессии nNOS в клетках и поэтому добавление НА не могло привести к еще большему, увеличению экспрессии nNOS,

Добавление в инкубационную среду НА приводило к значительному увеличению экспрессии проапоптозного белка каспазы-9 в нейросекреторных клетках ПВЯ (рис. 1Б), т.е. НА индуцирует апоптоз и в нейронах ПВЯ. Итак, в нашем опыте экспрессия nNOS под воздействием НА не отличалась от контроля, а экспрессия каспазы-9 была значительно выше контроля. Следовательно, НА приводил к инициации апоптоза не зависимо от влияния N0. При этом, как и в нейронах СОЯ, в нейронах ПВЯ наблюдалось увеличение экспрессии антиапоптозного белка bcl-2. Очевидно, что активация в клетках ПВЯ про- и антиапоптозных механизмов под воздействием НА не связана с внутриклеточным содержанием N0.

Таким образом, мы продемонстрировали, что КА индуцируют апоптоз в нонапептидергических нейронах СОЯ и ПВЯ. При этом наблюдается также активация защитных механизмов, на что указывает повышенная экспрессия антиапоптозного белка bcl-2 в этих клетках. Мы показали различную чувствительность нейронов СОЯ и ПВЯ к ДА, проявляющуюся в том, что ДА индуцировал апоптоз только в нейронах ПВЯ, а также различия в реализации программы апоптоза - в нейронах СОЯ активация про- и антиапоптозных механизмов, вызванная НА опосредовалась возрастающей концентрацией N0, в нейронах ПВЯ - внутриклеточное содержание N0 не влияло на уровень экспрессии белков апоптоза.

Сулраоптическое ядро Паравентрикулярное ядро

Рис. 1. Влияние ДА и НА на количество каспаза-9- (белые столбики), bcl-2- (черные столбики), nNOS- (серые столбики) ИР нейронов: А - в СОЯ, Б - в ПВЯ. Mim. Достоверность различий: * - от контроля in vitro; # - между интактным контролем in vivo и контролем in vitro, р < 0,05.

2. Влияние сниженного уровня катехолямннов на содержание nNOS, каспазы-9 и bcl-2 в нейронах СОЯ и ПВЯ.

Влияние ииъекпий Физиологического раствора.

Нам удалось показать различную реакцию нонапептидергических нейронов СОЯ н ПВЯ взрослых животных на инъекции физиологического раствора (рис. 2А, 2Б). Введение физиологического раствора приводит к инициации апоптоза только в нейросекреторных клетках ПВЯ. Это возможно связано с участием вазопрессинергических нейронов ПВЯ в регуляции стрессорного ответа [Krisch, 1986]. Так как повышение экспрессии nNOS в нейронах ПВЯ совпадало с увеличением экспрессии каспазы-9 и bcl-2, можно предположить, что именно возрастающая концентрация N0 в клетках приводит к активации про- и антиапопгозных механизмов.

Влияние депедрятяции.

Известно, что дегидратация прнэоднт к увеличению экспрессии nNOS, а также повышает ее активность в нейронах СОЯ и ПВЯ [Calka et al., 1994; Soinila, 1999]. В наших опытах у крыс, подвергнутых дегидратации, в нейронах СОЯ и ПВЯ также наблюдалось достоверное увеличение экспрессии nNOS по сравнению с контролем (рис. 2А, 2Б). Таким образом, дегидратация приводит к возрастанию внутриклеточного содержания NO в нонапептидергических клетках.

Мы не обнаружили прямых данных о влиянии дегидратации на апоптоз нейронов. Однако, имеющиеся данные о глубоких структурных перестройках нейронов СОЯ и ПВЯ под влиянием дегидратации [Kalimo, 1975; Miyata et al., 1994], позволили нам предположить, что подобные морфологические изменения могут сопровождаться экспрессией сигнальных белков апоптоза. В нашей работе дегидратация вызывала достоверное увеличение числа нейронов с повышенным содержанием каспазы-9 в СОЯ и ПВЯ. А увеличение содержания в клетках антиапоптозного белка bcl-2 под влиянием дегидратации наблюдалось только в ПВЯ (рис. 2А, 2Б). Повышенная экспрессия bcl-2 в нейронах ПВЯ, как и активация каспазы-9 в СОЯ и ПВЯ может бьггь опосредована повышенной продукцией N0, вызываемой дегидратацией [Kim et al., 1997; Li et al., 1997; Uehara et al„ 1999; Moriya et al., 2000].

Таким образом, как в нейронах СОЯ, так и в нейронах ПВЯ дегидратация вызывает инициацию программированной клеточной гибели по каспаза-9-зависимому пути. Активация каспазы-9, вероятно, опосредуется повышенной концентрацией NO. Мы также показали

различия в активации клеточных защитных механизмов, опосредованных повышением экспрессии антиалоптозного белка Ьс1-2 в клетках СОЯ и ПВЯ дегидратированных крыс. Так, активация Ьс1-2-зависимых механизмов наблюдалась только в нейронах ПВЯ и, возможно, была также опосредована повышенной концентрацией N0.

Влияние сниженного уровня катехоламииов на Фоне дегидратации.

Блокада синтеза КА на фоне дегидратации приводила в нейронах СОЯ к достоверному увеличению уровня экспрессии пЫОЭ даже по сравнению с уровнем, характерным для дегидратированных крыс (рис. 2А). Таким образом, понижение уровня КА приводило к дальнейшему увеличению синтеза пЫ08 и соответственно к дальнейшему росту концентрации N0 в клетках СОЯ. Так как известно, что N0 опосредует активацию каспазы-9, то можно было бы предположить, что дальнейшее повышение концентрации N0 приведет к дальнейшему повышению экспрессии проапоптозного белка каспазы-9. Однако этого не происходило и экспрессия каспазы-9 у крыс подвергнутых блокаде синтеза КА на фоне дегидратации практически совпадало с уровнем экспрессии каспазы-9 у дегидратированных крыс. При этом снижение уровня КА мозга у дегидратированных крыс приводило к увеличению содержания антиалоптозного белка Ьс1-2 в нейронах СОЯ. Известно, что белок Ьс1-2 препятствует активации каспазы-9 [Кгоетег е» а1., 1997]. Вероятно, в этом случае именно повышенная экспрессия антиалоптозного белка Ьс1-2 препятствует дальнейшему увеличению содержания каспазы-9 и тем самым предохраняет клетки от гибели.

60 -, 50 -! 40 ■!

| 10

Сувраоптичсское ядро

Фич.р-р.

ДГ

ДГ+а-

мпт

Паравентрнкулярное ядро

Физ.р-р. ДГ ДГ+а-

мпт

Рис. 2. Влияние инъекций физиологческого раствора, дегидратации (ДГ) и снижения уровня КА на фоне дегидратации (ДГ+а-МПТ) на количество каспаза-9- (белые столбики), Ьс1-2-(черные столбики), пЬТОЭ- (серые столбики) ИР нейронов: А - в СОЯ, Б - в ПВЯ. М±ш. Достоверность различий: * - от контроля; ** - между ДГ и ДГ+а-МПТ. р < 0,05.

В нейронах ПВЯ блокада синтеза КА на фоне дегидратации также как и в нейронах СОЯ приводила к достоверному увеличению экспрессии пМОБ по сравнению с экспрессией пЖ)8 у животных подвергнутых дегидратации (рис. 2Б). Введение блокатора синтеза КА приводило также к увеличению экспрессии каспазы-9, свидетельствующее о том, что снижение уровня КА на фоне дегидратации приводит к инициации апоптоза большего количества клеток, чем просто дегидратация. Повышенная экспрессия пИОЭ коррелировала с возросшим содержанием каспазы-9 в нейронах ПВЯ и можно предположить, что снижение уровня КА приводило к дальнейшей активации синтеза каспазы-9 за счет возрастающей концентрации N0. Интересно отметить, что в нейронах ПВЯ наряду с повышенным содержанием каспазы-9 наблюдалось также повышенное содержание антиалоптозного бежа

bcl-2. Вероятно, что bcl-2 участвует в защите нейронов от гибели на более поздних этапах активации каскада каспаз [Rosse et al., 1998].

Таким образом, мы показали, что снижение уровня КА в мозге приводит к повышению экспрессии проапоптозного белка каспазы-9, т.е. индуцирует программированную клеточную гибель в нонапептидергических нейронах гипоталамуса. И в нейронах СОЯ, и в нейронах ПВЯ инициация апоптоза опосредуется повышением внутриклеточной концентрации NO. Интересно отметить, что антиапоптозный белок bcl-2, в нейронах СОЯ и ПВЯ включается в защиту клеток на разных этапах. Так, в СОЯ bcl-2 предотвращает активацию каспазы-9, а в ПВЯ действует на более поздних этапах апоптоза. И в нейронах СОЯ, и в нейронах ПВЯ активация Ьс1-2-зависимых механизмов, вероятно, опосредуется высокой концентрацией N0.

Вляянне изменения уровня катехоламинов на экспрессию каспазы-9, bcl-2, nNOS в нонапептидергических нейронах гипоталамуса у взрослых животных.

Сопоставление полученных нами данных по влиянию сниженного уровня КА в мозге с данными по влиянию повышенных концентраций КА на апоптоз нейросекреторных клеток СОЯ и ПВЯ гипоталамуса позволило придти к следующему заключению.

Как снижение уровня катехоламинов в мозге, так и повышение их уровня приводит к увеличению экспрессии проапоптозного сигнального белка каспазы-9 в нонапептидергических нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса, т.е. приводит к инициации апоптоза по каспаза-9-зависимому пути (рис. ЗА). В нейронах СОЯ увеличение экспрессии каспазы-9 опосредуется возрастанием внутриклеточного содержания N0 как при повышении уровня ПА так и при снижении уровня КА в мозге. В нейронах ПВЯ активация проапоптозного белка каспазы-9 опосредуется повышением уровня N0 в клетках только при снижении уровня КА в мозге.

А Б

Рис. 3. Влияние изменения уровня катехоламинов на инициацию апоптоза (А) и на активацию защитных антиапоптозных механизмов (Б) в нейронах СОЯ и ПВЯ.

Инициация апоптоза, вызванная изменением уровня КА, не приводит к массовой гибели нейронов гипоталамуса. Подавление апоптоза в СОЯ и ПВЯ связано, вероятно, с влиянием антиапоптозного белка Ьс1-2, экспрессия которого значительно возрастает при изменении уровня КА. При снижении уровня КА в нейронах СОЯ Ьс1-2 подавляет образование каспазы-9, а при возрастании уровня НА в СОЯ и при всех изменениях уровня КА в ПВЯ - торможение апоптоза очевидно осуществляется также при участии антиапоптозного белка Ьс1-2, но на более поздних этапах апоптоза (рис. ЗБ). Можно предположить, что апоптоз нонапептидергических нейронов гипоталамуса в конечном итоге зависит от баланса про- и антиапоптозных сигнальных белков, экспрессирующихся под воздействием различных сигналов и, конечно от других факторов, участвующих в регуляции

апоптоза, которые мы не исследовали в нашей работе. Возможно, что N0 может вызывать активацию экспрессии как каспазы-9, так и Ьс1-2, и таким образом оказывать как токсическое, так и защитное воздействие на клетки, чем можно объяснить имеющиеся в литературе противоречия, касающиеся роли N0 в регуляции апоптоза.

3. Влияние снижения уровня катехо л аминов во время эмбриогенеза на содержание каспазы-9 в Ьс1-2 в нейронах СОЯ в ПВЯ у 3-х и 15-тв дневных крысят.

Д>уи1Г¥^япи«льно< состояние мзогомпшиптаят нейронов в их катеюламинергнческяя иннервация.

Показано, что в развивающихся нейронах КА могут ингибировать экспрессию гена ВП [ТгетЫеаи е1 а1., 1995; ВетаЬе е1 а1., 1996]. У взрослых животных КА не влияют на синтез ВП в нейронах СОЯ, но ингибируют его выведение из перикарионов [Ямова и др., в печати]. В нашей работе на 3-й день жизни в клетках СОЯ иммуногистохимически выявлялось значительно большее количество тирозингидроксилазы - основного скорость-лимитирующего фермента синтеза КА, чем у 15-ти дневных крысят (рис. 5А). Также у интактных крысят на 3-й день жизни наблюдается достоверно большее содержание ВП в нейронах СОЯ, чем на 15-й день (рис. 4А). Следовательно, можно предположить, что повышение уровня КА в нейронах СОЯ 3-х дневных крысят ингибирует выведение ВП из перикарионов этих нейронов, как это показано у взрослых крыс и, таким образом, приводит к большему накоплению в них ВП, чем в нейронах СОЯ 15-ти дневных крысят.

В нейронах ПВЯ, в отличие от нейронов СОЯ, на 15-й день жизни крысят уровень ВП почти в 2 раза больше, чем у 3-х дневных (рис. 4Б). В нейронах ПВЯ мы практически не обнаруживали тирозингидроксилазу. Однако, в ПВЯ хорошо выявляются волокна содержащие тирозингидроксилазу, т.е. волокна КА-ергическнх нейронов, иннервирующих нонапептидергические клетки (рис. 5Б). Плотность КА-ергических волокон в ПВЯ на 15-й день значительно выше, чем на 3-й день. Очевидно, что также как и в СОЯ, повышение уровня КА приводит к ингибированию выведения ВП клетками ПВЯ, что приводит к накоплению ВП в клетках ПВЯ 15-ти дневных крысят.

Влияние КА на развивающиеся ВП-ергические нейроны может носить импринтинговый характер - у взрослых животных, мозг которых развивался в условиях дефицита катехоламинов, наблюдается накопление ВП в нейронах СОЯ [Векгапю е1 а1., 1997]. В нашей работе пренатальное снижение уровня КА, вызванное введением а-МРТ самкам с 13-го по 20-й дни беременности, приводило к достоверному увеличению содержания ВП в нейронах СОЯ у крысят на 3-й и 15-й дни постнатальной жизни по сравнению с интактными крысятами и крысятами, родившимися от самок, которые подвергались во время беременности инъекциям физиологического раствора. При этом в нейронах СОЯ 3-х и 15-ти дневных крысят, подвергавшихся пренатальной блокаде синтеза КА, наблюдалось также значительное увеличение содержания тирозингидроксилазы. Можно предположить, что пренатальное снижение уровня КА в мозге вызывает компенсаторное увеличение продукции КА в нейронах СОЯ у 3-х и 15-ти дневных крысят. Очевидно, что повышенное содержание КА ингибирует выведение ВП из перикарионов клеток СОЯ, что и приводит к более высокому содержанию ВП в нейронах СОЯ у крысят подвергавшихся пренатальной блокаде синтеза КА.

В нейронах ПВЯ, также как и в нейронах СОЯ, снижение уровня КА мозга в течение последней трети эмбриогенеза приводило к повышению содержания ВП у крысят на 3-й день жизни. Однако, на 15-й день у крысят подвергавшихся пренатальной блокаде синтеза КА и у крысят, подвергавшихся пренатальному воздействию инъекций физиологического раствора, равно как и у интактных крысят, различий в содержании ВП в нейронах ПВЯ не наблюдалось. Анализ плотности тирозингидроксилаза-иммунореактивных волокон в ПВЯ показал, что у крысят, подвергнутых пренатальной блокаде синтеза КА плотность КА-ергической иннервации значительно выше на 3-й день жизни, чем у контрольных крысят, а к 15-му дню наблюдается ее достоверное снижение по сравнению с контрольными 15-ти

дневными животными. Вероятно, компенсаторное усиление КА-ергической иннервации, вызванное пренатальной блокадой синтеза КА, наблюдаемое у 3-х дневных крысят, тормозит выведение ВП из перикарионов и тем самым способствует накоплению ВП в нейронах ПВЯ,

Супраоптияеское ядро

6 0,08

i 0,06

g 0,04

1 g 0,02

Ё 0

Паравеятрякуляряое ядро

Физ. а-

р-р. мпт

3-й день

Физ. а-р-р. МГТТ

15-Я день

Рис. 4. Влияние эмбрионального снижения уровня КА на содержание ВП: А - в нейронах СОЯ, Б - в нейронах ПВЯ. М±т. Достоверность различий: * - от контроля; ** - от физиологического раствора; # - между контрольными группами на 3-й и 15-й день, р < 0,05.

I Супраоптияеское ядро j Парявентрвкулярпое ядро ;

1 w 1 !

§0,a25J i I i 0,02 j T | j T i

. itülui 111111

О К Физ. а- К Физ. а- I | ° К Физ. а- К Физ. а-

р-р. МГГГ р-р. МПТ | | р-р. МПТ р-р. мггг 1

3-Я день 15-йдевь ! ! 3-й день 15-й день 1

Рис. 5. Влияние снижения уровня КА в течение эмбрионального развития на содержание тирозингидроксилазы в клетках СОЯ (А) и волокнах ПВЯ (Б). М±т. Достоверность различий: * - от контроля; ** - от физиологического раствора; # - между контрольными группами на 3-й и 15-й день, р < 0,05.

Таким образом, мы показали различия в содержании ВП в нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса у интактных крысят на ранних сроках постнатального онтогенеза. Изменения содержания ВП в этих нейросекреторных клетках совпадают с изменением уровня КА в этих ядрах, повышение концентрации которых ингибирует выведение ВП из клеток как СОЯ, так и ПВЯ. Однако, механизмы изменения уровня КА в СОЯ и ПВЯ различаются: в СОЯ - за

счет усиления активности синтеза КА в самих ВП-ергических нейронах, а в ПВЯ - за счет увеличения плотности КА-ергической иннервации.

Содержание кчсп13ы-9 и bcl-2 в новапептидергичесюл нейронах интяктных кпысит на 3-й и 15-й дни жизни.

Сравнительный анализ содержания каспазы-9 и bcl-2 в нейронах СОЯ и ПВЯ у интактных крысят позволил выявить различия в динамике экспрессии про- и антиапоптозных белков в нонапептидергических клетках этих двух гипоталамических ядер на ранних сроках постнатального онтогенеза (рис. 6А, 6Б). В СОЯ у крысят с 3-го по 15-й день жизни наблюдается снижение уровня экспрессии проапоптозного белка каспазы-9, на фоне высокой экспрессии антиапоптозного белка bcl-2. В нейронах ПВЯ, в отличие от нейронов СОЯ, с 3-го по 15-й день жизни наблюдается повышение экспрессии как каспазы-9, так и bcl-2. Эти данные позволяют предположить следующее: во-первых, очевидно, что каспаза-9 играет существенную роль в постнатальном формировании клеточного состава нонапептидергических центров гипоталамуса, приводя к инициации апоптоза и выбраковке "лишних" постмитотических нейронов СОЯ и ПВЯ. Во-вторых, выживаемость "нужных" нонапептидергических нейронов в раннем постнатальном онтогенезе, очевидно, связана с антиапоптозным действием bcl-2, который, как уже упоминалось, может участвовать в подавлении апоптоза на разных этапах гибели клеток. Эти данные подтверждают сделанное нами ранее предположение о том, что в СОЯ bcl-2 тормозит экспрессию каспазы-9, тогда как в ПВЯ, bcl-2 очевидно подавляет апоптоз на более подних этапах его развития. В-третьих, гибель постмитотических нейронов, а следовательно и формирование клеточного состава раньше начинается и раньше завершается в СОЯ, в нейронах которого с 3-го к 15-му дню постнатальной жизни происходит снижение экспрессии каспазы-9, а следовательно и инициации апоптоза по каспаза-9-зависимому пути. ВП-ергические нейроны СОЯ в основном регулируют водно-солевой обмен, а ВП-ергические нейроны ПВЯ кроме регуляции водно-солевого обмена, принимают участие в регуляции стрессорного ответа, усиливая высвобождение АКТГ из передней доли гипофиза. Очевидно, что участие нейронов ПВЯ в реализации стрессорного ответа объясняет наблюдаемое повышение экспрессии каспазы-9 в нейронах ПВЯ у крысят к 15-му дню жизни (период установления морфофункциональных связей между звеньями гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы [Sapolsky, Меапеу, 1986; Науменко, 1994]), а также объясняет увеличение экспрессии каспазы-9 только в нейронах ПВЯ в ответ на инъекции физиологического раствора взрослым животным. Возможно, что в онтогенезе созревание системы регуляции водно-солевого обмена является более значимой для организма на ранних этапах развития, чем стресс-реализующей системы, и именно поэтому, на наш взгляд, программированная клеточная гибель нейронов СОЯ раньше начинается и раньше завершается, чем в ПВЯ.

Влияние инъекций Физиологического раствора беременным самкам на содержание каспазы-9 и bcl-2 в нейронах у крысят на 3-й и 15-й дни жизни.

Мы вводили беременным самкам физиологический раствор в качестве контроля к введению блокатора синтеза КА. Инъекции физиологического раствора беременным самкам приводили к повышению экспрессии каспазы-9 у крысят на 3-й день постнатальной жизни в нонапептидергических нейронах обоих ядер гипоталамуса, которая сохранялась до 15-го дня только в СОЯ (рис. 7А, 7Б).

Изменение уровня содержания каспазы-9 и bel-2 в нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса v крысят на 3-й и 15-й дни жизни под шмиимм сниженного уровня катехоламиноа в течение эмбриогенеза.

Введение беременным самкам блокатора синтеза КА - а-МРТ приводило к достоверному увеличению содержания каспазы-9 в клетках СОЯ у крысят на 3-й день жизни

не только по сравнению с интактными крысятами, но и с крысятами, матерям которых во время беременности вводили физиологический раствор (рис. 7А). Экспрессия антиапоптозного белка Ьс1-2 в нейронах СОЯ также была выше у 3-х дневных крысят, подвергавшихся пренатальной блокаде синтеза КА, чем у 3-х дневных крысят после пренатального введения физиологического раствора. Таким образом, снижение уровня КА во время беременности приводит к инициации как проапоптозных сигналов в нейронах СОЯ, так и к активации защитных антиапоптотических механизмов у крысят на 3-й день жизни.

Супраоптяческое ядро

50i 40

3 30

I 20-1

ез х

3-й день 15-й день взрослые моркт

Паравентрикулариое ядро

S 505 40 ■

? 3 30 3 8 ß 8- 20

Г10

О о

3-й день 15-й день взрослые

Рис. б. Изменение количества каспаза-9-(пунктирная линия) и Ьс1-2-(сплошная линия) ИР нейронов в ходе постнатального онтогенеза у крысят в СОЯ (А) и в ПВЯ (Б).

А Б

Супраоптическое ядро | | Паравевтрмкулярвое ядро

Рис. 7. Влияние снижения уровня КА в течение эмбрионального развития на количество каспаза-9-(белые столбики) и Ьс1-2-(черные столбики) ИР клеток в СОЯ (А) и в ПВЯ (Б). М±т. Достоверность различий: * - от контроля; ** - от физиологического раствора; # -между контрольными группами на 3-й и 15-й день, р < 0,05.

На 15-й день жизни в нейронах СОЯ у крысят, подвергавшихся пренатальной блокаде синтеза КА, содержание каспазы-9 снижалось по сравнению с таковым у 3-х дневных крысят, но оно было выше, чем у контрольных крысят соответствующего возраста (рис. 7А). Также к 15 дню снижалось содержание Ьс1-2, но менее значительно, чем содержание каспазы-9, что также указывает на способность Ьс1-2 подавлять экспрессию каспазы-9 в нейронах СОЯ.

Таким образом, пренатальное воздействие пониженного уровня КА вызывает не только значительную активацию программированной клеточной гибели в нейронах СОЯ к 3-му дню жизни крысят, но и активирует также защитные механизмы в клетках этого ядра, о чем свидетельствует возросший уровень антиапоптозного белка Ьс1-2. Снижение содержания каспазы-9 и Ьс1-2 к 15-му дню жизни может быть связано с общей закономерностью, которую мы показали у крысят контрольных групп, у которых к 15-му дню жизни в клетках СОЯ наблюдается снижение содержания каспазы-9 до уровня, приблизительно характерного для взрослых интактных животных.

Как и в СОЯ, в ПВЯ 3-х дневных крысят снижение уровня КА в мозге в течение последней трети эмбриогенеза приводило как к инициации апоптоза по каспаза-9-зависимому пути, так и к активации защитных Ьс1-2-зависимых механизмов (рис. 7Б).

Повышенная экспрессия каспазы-9, вызванная снижением уровня КА мозга во время внутриутробного развития, сохраняется на высоком уровне в ПВЯ по крайней мере до 15-го дня постнатальной жизни крысят. Интересно отметить, что содержание антиапоптозного белка Ьс1-2 в нейронах ПВЯ у крысят подвергнутых пренатальной блокаде синтеза КА и у интактных крысят этого же возраста достоверно не отличалось, чем возможно и объясняется высокий уровень экспрессии каспазы-9 у этих крысят.

Таким образом, пренатальное снижение уровня КА в мозг« вызывает значительное увеличение содержания каспазы-9 и Ьс1-2 в нонапептидергических нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса у крысят на ранних сроках постнатального онтогенеза. Кроме того, наблюдаемые различия в уровне экспрессии про- и антиапоптозных белков в СОЯ и ПВЯ связаны с наблюдаемыми нами различиями в реакции КА-ергической системы мозга на примененные воздействия: вследствие эмбриональной блокады синтеза КА на 3-й день после рождения значительной увеличивается плотность КА-ергической иннервации в ПВЯ, что возможно и приводит к наблюдаемому нами усилению проапоптозной активности в нейронах. К 15-му дню плотность КА-ергической иннервации снижается даже ниже контрольного уровня, что сопровождается уменьшением экспрессии каспазы-9. В СОЯ также наблюдалась подобная закономерность, но под воздействием пренатальной блокады синтеза КА изменялась не плотность КА-ергической иннервации, а увеличивалась активность экспрессии тирозингидроксилазы в нейронах СОЯ. Тем ни менее в этом случае также усиление экспрессии тирозингидроксилазы сопровождалось усилением экспрессии каспазы-9 и Ьс1-2. Возможно, изменения, наблюдаемые нами в апоптотической активности в нейронах СОЯ и ПВЯ, связаны с их реакцией на повышение уровня КА в пределах этих нейроэндокринных центров. Это предположение согласуется с описанными нами ранее результатами экспериментов на взрослых животных, где повышение уровня КА приводило к инициации апоптоза в нонапептидергических нейронах по каспаза-9-зависимому пути.

4. Функциональное состояние вазопрессвнергвческвх нейронов у трансгенных мышей по про- и автваповтозным генам.

В наших экспериментах мы показали повышение экспрессии сигнальных белков апоптоза в нейронах СОЯ и ПВЯ, не приводящее, однако, к гибели этих клеток. При этом наблюдалось также изменение функциональной активности изучаемых нейронов. Существуют пока единичные работы, где говорится об изменении активности синтеза сигнальных белков клеточного цикла при различных воздействиях, изменяющих функциональное состояние клеток [Атзоп et а1., 2000]. Таким образом, можно предположить, что про- и антиапоптозные белки, взаимодействуя между собой и с другими

внутриклеточными посредниками, могут влиять на функциональное состояние клеток. Чтобы проверить это предположение мы оценивали функциональное состояние ВП-ергических нейронов СОЯ и ПВЯ у нокаутных мышей по проапоптозным генам р21 и р53, по антиапоптозному гену bcl-2, и трансгенных мышей с повышенной экспрессией митогенного фактора c-Raf-1.

Мьпди-нокаугы ио проапоптозным генам р21 и р53.

Известно, что белки р21 и р53, кодируемые одноименными проапоптозными генами, принимают участие в регуляции клеточного цикла и апоптоза. Белок р53 является полифункциональным благодаря своей способности действовать в качестве специфического транскрипционного фактора, усиливая экспрессию одних генов и подавляя экспрессию других. Так, например, р53 может подавлять активность промотора гена bcl-2, снижая уровень этого антиапоптозного белка в клетке [Чумаков, 1998].

В нашей работе "выключение" гена р53 вызывало различные изменения в функциональной активности ВП-ергических нейронов двух нонапептидергических нейросекреторных центров. В СОЯ отсутствие белка р53 приводило к снижению функциональной активности нейронов, проявляющуюся в уменьшении синтеза ВП (рис. 8А). В ПВЯ отсутствие белка р53 вызывало повышение функциональной активности этих нейронов, приводя к усилению выведения ВП из перикарионов, но при этом не оказывало влияние на синтез ВП (рис. 8Б). Из этого можно заключить, что проапоптозным белок р53 кроме регуляции клеточного цикла, геномной стабильности и апоптоза может участвовать в регуляции специфических функций нейронов, таких как синтез и выведение ВП.

Интересно, что у мышей - нокаутов по проапоптозному гену р21, увеличение экспрессии которого часто связано с активирующим действием р53 [el-Deiry et al., 1993], в нейронах СОЯ отмечалось достоверное увеличение синтеза ВП, о чем свидетельствует как значительно большее содержание и-РНК ВП, так и иммунореактивного ВП по сравнению с контрольной линией (рис. 8А). Таким образом, если "выключение" гена р53 приводило к снижению функциональной активности нейронов СОЯ, то "выключение" гена р21, напротив, вызывало повышение их функциональной активности.

У мышей р21-/- в нейронах ПВЯ также наблюдалось значительное повышение уровня и-РНК ВП по сравнению с мышами дикой линии, следовательно, в нейронах ПВЯ, также как и в нейронах СОЯ, отсутствие гена р21 приводило к увеличению экспрессии ВП (рис. 8Б). Несмотря на повышенный синтез ВП в ПВЯ у нокаутных мышей, количество иммунореактивного ВП в этих клетках не отличалось от такового у диких мышей. Очевидно, это связано с усилением выведения ВП из перикарионов, что также свидетельствует об усилении функциональной активности ВП-ергических нейронов ПВЯ в отсутствии гена р21. Таким образом, мы показали, что отсутствие гена р21 увеличивает функциональную активность ВП-ергических нейронов как СОЯ, так и ПВЯ гипоталамуса.

Сопоставление полученных данных о функциональной активности ВП-ергических нейронов нокаутных мышей по проапоптозным белкам р21 и р53 позволяет нам придти к следующему заключению. Так как отсутствие гена р21 приводит к повышению синтеза ВП в нейронах СОЯ, то можно предположить, что у мышей диких линий белок р21 участвует в регуляции функции ВП-ергических клеток, приводя к снижению экспрессии ВП, непосредственно, или взаимодействуя с другими внутриклеточными посредниками. Аналогично, можно было бы предположить, что белок р53, наоборот, повышает экспрессию ВП, так как выключение одноименного гена приводит к снижению синтеза ВП. Представляется странным, что белки р21 и р53, которые влияют на клеточный цикл однонаправленно и часто действуют взаимосвязанно, оказывают противоположное влияние на функциональное состояние одних и тех же нейронов. Это кажущееся противоречие можно объяснить следующим: показано, что в нейронах нокаутных мышей по гену р53 отмечается неожиданное увеличение экспрессии белка p21 [Amson et al., 2000]. При этом авторы отмечают снижение способности мышей к обучению и, следовательно, снижение нейрональной активности. Вероятно, именно повышение экспрессии белка р21 у нокаутных

мышей по гену р53 в наших экспериментах приводит к снижению синтеза ВП в нейронах СОЯ. Это также согласуется с тем, что у нокаутных мышей по гену р21 наблюдается повышение синтеза ВП.

Мыши-нокауты до «ятишоптозному гену Ьс1-2.

В гипоталамусе в нейронах СОЯ у Ьс1-2-/- мышей количество и-РНК ВП не отличалось от его содержания у мышей дикого типа (рис. 8А). Количество иммунореактивного ВП в нейронах СОЯ у нокаутных и диких мышей также достоверно не отличалось. Следовательно, отсутствие гена Ьс1-2 не оказывало влияния на функциональное состояние ВП-ергических нейронов СОЯ.

В нейронах ПВЯ, в отличие от нейронов СОЯ, у нокаутных мышей наблюдалось значительно меньшее содержание и-РНК ВП, чем у контрольных мышей (рис. 8Б). Следовательно, "выключение" гена Ьс1-2 приводит к снижению синтеза ВП в нейронах ПВЯ. Это подтверждается также достоверно более низким уровнем иммунореактивного ВП в перикарионах нейронов ПВЯ у мышей-нокаутов по сравнению с дикой линией мышей. Следовательно, инактивация гена Ъс1-2 приводит к снижению функциональной активности ВП-ергических клеток ПВЯ гипоталамуса, проявляющемуся в уменьшении синтеза ВП. Одним из возможных объяснений снижения функциональной активности нейронов у мышей с дефицитом Ьс1-2 может быть нарушение внутриклеточного кальциевого гомеостаза, в результате усиления выхода кальция из митохондрий [МшрЬу, Р^вкшп, 1999].

Таким образом, снижение функциональной активности нейронов ПВЯ, наблюдаемое у мышей-нокаутов по гену Ьс1-2, свидетельствует о том, что этот антиапоптозный белок кроме своей основной функции ингибитора апоптоза может также принимать участие в регуляции специфической функции ВП-ергических нейронов - синтезе ВП.

А Б

Шр»вещ|мисуляривс ядро

p2W- р53-/- bd-2-/- c-Raf-

Рис. 8. Содержание и-РНК ВП (белые столбики) и иммуннореактивного ВП (серые столбики) в нейронах СОЯ (А) и ПВЯ (Б) нокаутных мышей. М+m. Достоверность различий: * - от дикой линии (wild type), р < 0,05

Траиггешлае мыши по гену c-Raf-1.

Сигнальный белок c-Raf-1 активируется в ответ на активацию рецепторов факторов роста, что приводит к стимуляции деления, роста и дифференцировки клеток [Slupsky et al., 1998]. Кроме этого c-Raf-1-зависимая протеинкиназа способна фосфорилировать другие сигнальные белки, в частности р53 [Jamal, Ziff, 1995], а также связываться с bcl-2, встраиваясь в митохондриальную мембрану, что приводит к усилению антиапоптозной функции последнего [Wang et al., 1996].

В нашей работе у трансгенных мышей со сверхэкспрессией с-ИЫИ в нейронах СОЯ и ПВЯ наблюдалось значительное увеличение содержания и-РНК ВП, по сравнению с дикой линией мышей (рис. 8А, 8Б). Следовательно, повышенная экспрессия белка с-ЯаМ приводит к увеличению синтеза ВП, т.е. повышает функциональную активность ВП-ергических нейронов. Интересно отметить, что содержание иммунореактивного ВП в клетках СОЯ и ПВЯ у мышей со сверхэкспрессией с-Ла£-1 значительно ниже, чем у мышей дикого типа. Следовательно, повышенная экспрессия 0-1^-1 усиливает также и выведение ВП из перикарионов ВП-ергических клеток.

Таким образом, и в СОЯ и в ПВЯ сверхэкспрессия сигнального белка с-11аГ-1 приводит к значительному усилению специфической функциональной активности ВП-ергических клеток гипоталамуса. Очевидно, что с-Яа£-1 кроме регуляции пролиферации, дифференциации и апоптоза, может также оказывать влияние на функциональное состояние гипоталамических нейронов.

Итак, полученные данные свидетельствуют о том, что проапоптозные белки р21 и р53, антиапоптозный белок Ьс1-2 и сигнальный белок с-ЯаМ могут оказывать влияние на специфическую функцию ВП-ергических нейронов, влияя как на синтез ВП, так и на его выведение из перикарионов. Мы не можем сказать, является ли это влияние прямым или оно опосредуется взаимодействием этих белков с другими внутриклеточными посредниками. При этом для каждого из изученных нами сигнальных белков апоптоза мы показали свое, специфическое действие на функцию ВП-ергических клеток. Нам удалось также показать, что одни и те же сигнальные белки апоптоза способны оказывать различное влияние на ВП-ергические клетки двух нейросекреторных центров - СОЯ н ПВЯ гипоталамуса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Мы показали, что КА играют существенную роль в регуляции апоптоза нейронов в развивающихся нонапептидергическнх центрах гипоталамуса неонатальных крысят, что согласуется с данными других авторов о морфогенетическом влиянии КА на гипоталамические нейросекреторные центры.

На взрослых животных и на крысятах мы показали, что любое значительное изменение уровня КА в мозге сопровождается увеличением содержания пМОЭ и приводит к повышению экспрессии сигнальных белков апоптоза в нейросекреторных клетках СОЯ и ПВЯ. С одной стороны, это свидетельствует об участии КА и N0 в регуляции апоптоза нонапептидергическнх нейронов. С другой стороны, наблюдаемые изменения функционального состояния ВП-ергических нейронов, коррелирующие с изменением экспрессии про- и антиапоптозных белков, позволили нам предположить, что сигнальные белки апоптоза участвуют в регуляции функционального состояния этих клеток. Наши дальнейшие эксперименты, проведенные на трансгенных мышах по про- и антиапоптозным генам, показали влияние сигнальных белков апоптоза на синтез и выведение ВП нейронами СОЯ и ПВЯ, т.е. подтвердили наше предположение об участии сигнальных белков апоптоза в регуляции нейрональной активности. Совокупность результатов нашей работы позволила нам придти к заключению о зависимости апоптоза нонапептидергических нейронов от факторов, принимающих участие в регуляции функциональной активности этих нейронов (катехоламины, N0), а также о зависимости функциональной активности нонапептидергических нейронов от экспрессии в них сигнальных белков апоптоза.

Интересно отметить, что практически во всех наших экспериментах мы наблюдали значительные различия в реакции нейронов СОЯ и ПВЯ гипоталамуса на применяемые воздействия. Во-первых, показаны различия в уровне экспрессии про- и антиапоптозных белков при одних и тех же воздействиях (инъекции физиологического раствора, дегидратация, изменение уровня КА в мозге), что может быть связано с различными функциями выполняемыми этими нейронами. Во-вторых, выявлены различия в модулирующем влиянии N0 на экспрессию сигнальных белков апоптоза в нейронах СОЯ и

ПВЯ. И, в-третьих, показаны различные эффекты одних и тех же белков апоптоза на активность ВП-ергических клеток двух нейросекреторных центров - СОЯ и ПВЯ гипоталамуса.

ВЫВОДЫ

1. Снижение уровня катехоламииов в мозге, также как и его повышение приводит к увеличению экспрессии проапоптозного сигнального белка каспазы-9 в нонапептидергических нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса, т.е. приводит к инициации апоптоза по каспаза-9-зависимому пути. В нейронах СОЯ увеличение экспрессии каспазы-9, возможно, опосредуется возрастанием внутриклеточного содержания N0 как при повышении уровня норадреналина, так и при снижении уровня катехоламииов в мозге. В нейронах ПВЯ активация проапоптозного белка каспазы-9 опосредуется повышением уровня N0 только при снижении уровня катехоламииов в мозге.

2. Инициация апоптоза, вызванная изменением уровня катехоламииов, не приводит к массовой гибели нейронов СОЯ и ПВЯ гипоталамуса, что вероятно связано с увеличением внутриклеточного содержания антиапоптозного белка Ьс1-2, экспрессия которого может усиливаться под воздействием N0. При снижении уровня катехоламииов в нейронах СОЯ Ьс1-2 подавляет активацию каспазы-9, а при возрастании уровня норадреналина в СОЯ и при всех изменениях уровня катехоламииов в ПВЯ - торможение апоптоза очевидно осуществляется также при участии антиапоптозного белка Ьс1-2, но на более поздних этапах апоптоза.

3. Снижение уровня катехоламииов в мозге в течение эмбриогенеза приводит к усилению инициации апоптоза по каспаза-9-зависимому пути в нонапептидергических нейронах у крысят на ранних сроках постнатальнош онтогенеза, что подтверждает участие катехоламииов в морфогенезе СОЯ и ПВЯ гипоталамуса. Динамика экспрессии про- и антиапоптозных белков (каспазы-9 и Ьс1-2) в нонапептидертических нейронах интактных крысят и крысят, подвергавшихся пренатапьному снижению уровня катехоламииов, позволяет предположить, что в ходе постнатапьного онтогенеза апоптотнческая гибель нейронов завершается раньше в СОЯ, чем в ПВЯ.

4. Анализ функционального состояния вазопрессинергических нейронов иокаутных и трансгенных мышей позволяет заключить, что сигнальные белки апоптоза - р21, р53, Ьс1-2 и митогенный фактор с-Ка£-1 участвуют в регуляции функциональной активности этих нейронов, оказывая различное влияние на синтез и выведение вазопрессина в СОЯ и ПВЯ.

5. Выявлены существенные различия в регуляции функционального состояния клеток СОЯ и ПВЯ сигнальными белками апоптоза и путях реализации программированной клеточной гибели.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Таранухин А.Г., Глазова М.В., Евтеева С.Е., Ямова Л.А., Черниговская Е.В. Участие катехоламииов и оксида азота в регуляции апоптоза в нонапептидергических нейронах гипоталамуса крыс. Ж. эвол. биохим. и физиол. 2002. Т. 38. С. 615-619.

2. Таранухин А.Г., Черниговская Е.В., Глазова М.В., Евтеева С.Е., Ямова Л.А., Оганесян Г.А. Регуляция катехоламинами апоптоза нонапептидергических нейронов гипоталамуса крыс в опытах in vitro. Ж. эвол. биохим. и физиол. 2003. Т. 39. С. 593-598.

3. Таранухин А.Г., Евтеева С.Е., Ямова Л.А., Глазова МЛ., Черниговская Е.В. Блокада синтеза катехоламииов мозга повышает активность синтеза проапоптозного белка каспаза-9, увеличивая экспрессию NO-синтазы в нонапептидергических нейронах гипоталамуса крыс. Тезисы докладов. ХП Международное совещание и V школа по эволюционной физиологии. С-Петербург. 2001. С. 143-144.

4. Таранухин А.Г., Евтеева С.Е., Ямова Л.А, Глазова М.В., Черниговская Е.В. Роль оксида азота (NO) в опосредовании сигнала при инициации катехоламинами процесса

апоптоза в ноналептидергических нейронах гипоталамуса. Сборник тезисов 6-й Пупщнской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. 2002. Т. 1. С. 147.

5. Таранухин А.Г., Евтеева С.Е., Ямова JI.A., Глазова М.В., Черниговская Е.В. Влияние катехоламинов на апоптоз ноналептидергических нейронов гипоталамуса крыс. Тезисы докладов. Вторая научная конференция с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии". Новосибирск. 2002. С. 153.

6. Черниговская Е.В., Таранухин А.Г., Глазова М.В., Федоров J1.M. Сигнальные белки апоптоза влияют на функциональную активность вазопрессинергических нейронов гипоталамуса мышей. Тезисы докладов. Вторая научная конференция с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии". Новосибирск. 2002. С. 175.

7. Таранухин А.Г., Оганесян Г.А., Ямова Л.А., Комиссаров А.Б., Черниговская Е.В. Влияние пренатальной блокады синтеза катехоламинов на содержание вазопрессина в нейронах крысят на ранних сроках постнатального онтогенеза. Тезисы докладов. Всероссийская конференция с международным участием "Нейроэндокринология-2003". С-Петербург. 2003. С. 145-146.

8. Таранухин А.Г., Черниговская Е.В. Влияние пренатальной блокады синтеза катехоламинов на инициацию апоптоза ноналептидергических нейронов у крысят на ранних сроках постнатального онтогенеза. Тезисы докладов. Всероссийская конференция с международным участием "Нейроэндокринология-2003". С-Петербург. 2003. С. 146-148.

9. Chernigovskaya Е., Taranukhin A., Yamova L., Fedorov L. Signalling apoptotic proteins: possible participation in the regulation of vasopressin and catecholamine biosynthesis in the hypothalamus. Abstracts. International symposium "Neuron differentiation and plasticity -regulation by intercellular signals". Moscow, Russia. 2003. P. 43.

10. Taranukhin A., Yamova L., Chernigovskaya E. Prenatal blockade of catecholamines synthesis influences on apoptotic signal proteins expression in rat nonapeptidergic neurons on 3-d and 15-th postnatal days. Abstracts. International symposium "Neuron differentiation and plasticity - regulation by intercellular signals". Moscow, Russia. 2003. P. 58-59.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97.

Подписано в печать 40. ЛООЗ Объем в п.л. ^сГ

Тираж 400. Заказ

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства СПбГПУ 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29.

Отпечатано на ризографе И14-2000 ЕР Поставщик оборудования — фирма "Р-ПРИ НТ" Телефон: (812) 110-65-09 Факс: (812) 315-23-04

t (

Ш 1 5 6 3 Ô

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Таранухин, Андрей Григорьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА Ь ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Нонапептидергическая система гипоталамуса.

1.1.1. Морфофункциональная характеристика ноналептидергических центров гипоталамуса.

1.1.2. Регуляция СОЯ и ПВЯ.

1.1.3. Формирование СОЯ и ПВЯ в онтогенезе.

1.1.4. Развитие КА-ергической иннервации СОЯ и ПВЯ в онтогенезе.

1.2. Апоптоз или программированная клеточная гибель.

1.2.1. Морфологическая характеристика апоптоза.

1.2.2. Роль каспаз в апоптозе.

1.2.2.1. Общее строение каспаз.

1.2.2.2. Активация каспаз (переход зимогенов в форму активного фермента).

1.2.3. Пути инициации апоптоза.

1.2.3.1. Инициация апоптоза внешними сигналами.

1.2.3.1.1. Рецепторная инициация апоптоза.

1.2.3.2. Инициация апоптоза внутриклеточными сигналами.

1.2.3.2.1. Роль митохондриапьного пути в инициации апоптоза.

1.2.3.2.2. Роль эндоплазматического ретикулума в инициации апоптоза.

1.2.3.2.3. Р53 опосредованная инициация апоптоза.

Ядерные механизмы.

1.2.4. Апоптоз в каспаза-ингибированных клетках.

1.2.5. Подавление апоптоза.

1.2.5.1. Роль Вс1-2-подобных белков в апоптозе.

1.2.5.2. Роль белков семейства 11аГ.

1.2.6. Роль программированной клеточной гибели в эмбриогенезе.

У 1.2.7. Особенности экспрессии каспазы-9 и bcl-2 в эмбриогенезе и раннем постнатальном онтогенезе.

1.3. Некоторые факторы влияющие на апоптоз нейронов.

1.3.1. Денервация.

1.3.2. РольЖ) в апоптозе.

1.3.3. Дегидратация.

1.3.4. Влияние катехоламинов на апоптоз.

ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Экспериментальные модели.

2.1.1. Инкубация переживающих срезов гипоталамуса в средах с добавлением норадреналина и дофамина.

2.1.2. Фармакологическое ингибирование синтеза катехоламинов.

2.1.2.1. Блокада синтеза катехоламинов на фоне специфической физиологической нагрузки у взрослых крыс.

2.1.2.2. Снижение уровня катехоламинов КА мозга в ходе эмбрионального развития крысят.

2.1.3. Изучение влияния сигнальных белков апоптоза на специфическую функциональную активность ВП-ергических нейронов.

2.2. Обработка ткани.

2.3. Методики исследований.

2.3.1. Иммуногистохимия.

Vk 2.3.2. Гибридизация in situ.

2.4. Микроскопия и анализ изображений.

2.5. Статистический анализ результатов.

ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Влияние катехоламинов на содержание nNOS, каспазы-9 и bcl-2 в нонапептидергических клетках гипоталамуса взрослых крыс.

3.1.1. Влияние повышенной концентрации ДА и НА на содержание nNOS, каспазы-9 и bcl-2 в нонапептидергических клетках СОЯ и ПВЯ гипоталамуса.

3.1.1.1. Влияние денервации на содержание пИОв, каспазыи Ьс1-2 в нонапептидергических нейронах.

3.1.1.2. Влияние ДА на содержание пЫОБ, каспазы-9 и Ьс1в нонапептидергических нейронах.

3.1.1.3. Влияние НА на содержание пЫОБ, каспазы-9 и Ьс1в нонапептидергических нейронах.

3.1.2. Влияние сниженного уровня КА на содержание пМОБ, каспазы-9 и Ьс1-2 в нейронах СОЯ и ПВЯ.

3.1.2.1. Содержание пЫОБ, каспазы-9, Ьс1-2 в контрольной группе.

3.1.2.2. Содержание пЫОБ, каспазы-9, Ьс1-2 в группе крыс, получавших инъекции физиологического раствора.

3.1.2.3. Содержание пМОБ, каспазы-9, Ьс1-2 у крыс подвергнутых воздействию дегидратации.

3.1.2.4. Содержание пМОБ, каспазы-9, Ьс1-2 у крыс подвергнутых снижению уровня катехоламинов в мозге на фоне дегидратации.

3.1.3. Влияние пренатальной блокады синтеза катехоламинов на содержание каспазы-9 и Ьс1-2 в нонапептидергических нейронах у крысят на 3-й и 15-й день жизни.

3.1.3.1. Функциональное состояние вазопрессинергических нейронов.

3.1.3.2. Влияние пренатальной блокады синтеза КА на

КА-ергическую иннервацию крысят на 3- и 15-й дни жизни.

3.1.3.3. Содержание каспазы-9 и Ьс1-2 в нонапептидергических нейронах у крысят на 3-й и 15-й дни жизни.

3.1.3.4. Влияние пренатального введения физиологического раствора на содержание каспазы-9 и Ьс1-2 в нейронах у крысят на 3-й и 15-й дни жизни.

3.1.3.5. Влияние пренатальной блокады синтеза катехоламинов на содержание каспазы-9 и Ьс1-2 в нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса у крысят на 3-й и 15-й дни жизни. у 3.2. Функциональное состояние ВП-ергических нейронов у нокаутных мышей по про- и антиапоптозным генам.

3.2.1. Мыши-нокауты по проапоптозным генам.

3.2.1.1. Мыши, нокаутные по гену р21.

3.2.1.2. Мыши, нокаутные по гену р53.

3.2.2. Мыши, нокаутные по антиапоптозному гену bcl-2.

3.2.3. Трансгенные мыши по гену c-Raf-1.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Влияние КА на содержание nNOS, каспазы-9 и bcl-2 в нейронах

СОЯ и ПВЯ взрослых крыс.

4.1.1. Влияние повышенной концентрации КА на содержание nNOS, каспазы-9 и bcl-2 в нонапептидергических нейронах. т 4.1.1.1. Влияние денервации на содержание nNOS, каспазы-9 и bcl-2 в нонапептидергических нейронах в опытах in vitro.

4.1.1.2. Влияние ДА на содержание nNOS, каспазы-9 и bclв нонапептидергических нейронах.

4.1.1.3. Влияние НА на содержание nNOS, каспазы-9 и bclв нонапептидергических нейронах.

4.1.2. Влияние сниженного уровня КА на содержание nNOS, каспазы-9 и bcl-2 в нейронах СОЯ и ПВЯ.

4.1.2.1. Содержание nNOS, каспазы-9, bcl-2 в группе крыс, получавших инъекции физиологического раствора. it 4.1.2.2. Содержание nNOS, каспазы-9, bcl-2 у крыс подвергнутых воздействию дегидратации.

4.1.2.3. Содержание nNOS, каспазы-9, bcl-2 у крыс подвергнутых снижению уровня катехоламинов в мозге на фоне дегидратации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия сигнальных белков апоптоза в нонапептидергических нейронах гипоталамуса"

Актуальность проблемы.

Общепризнано, что гипоталамо-гипофизарный нейроэндокринный комплекс у позвоночных животных играет ведущую роль в интеграции организма, поддержании гомеостаза, а также в реализации разнообразных адаптивных функций. Существенную роль в регуляции этих процессов отводят нонапептидергической гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе, продуцирующей нонапептидные гормоны — вазопрессин (ВП) и окситоцин (ОТ) [ЗсЬаггег, БсИаггег, 1963; Поленов, 1968, 1983]. ВП и ОТ являются основными участниками регуляции водно-солевого обмена и тонуса сосудов. Показано участие этих нейрогормонов в терморегуляции, регуляции поведения, обучения и памяти. Кроме того, нонапептидные гормоны, поступая в портальный кровоток передней доли гипофиза, действуют наряду с аденогипофизотропными гормонами, оказывая влияние на выделение тропных гормонов [Поленов, 1986].

Крупноклеточные ВП- и ОТ-ергические нейроны являются удобной моделью для изучения цитофизиологических аспектов синтеза и выделения нейрогормонов. Их относительно крупные размеры, хорошо известная локализация и способность изменять свою функциональную активность адекватно применяемым нагрузкам позволяет использовать их для изучения процессов внутриклеточной регуляции функционального состояния и апоптоза.

Проблема апоптоза активно изучается последние 30 лет и за это время накоплено большое количество данных о механизмах апоптоза и особенностях его реализации в зависимости от индукторов инициирующих апоптоз и от типа клеток. Хорошо изучены многочисленные факторы, вызывающие апоптоз нейронов и подробно описаны сигнальные пути инициации и реализации апоптоза [ЕагшИаш е1 а!., 1999; ВиёШаг^о & а!.,

1999]. В то же время существует очень мало работ касающихся факторов, вызывающих апоптоз нонапептидергических нейронов и участвующих в его регуляции.

Известно, что в формирующейся нервной системе большую роль играет программированная клеточная гибель нейронов, которая является необходимым условием нормального развития центральной и периферической нервной системы [Oppenheim, 1991; Johnson, Deckwerth, 1993; Henderson, 1996]. Кроме того, усиление или ослабление интенсивности апоптоза нейронов могут приводить к различным нарушениям и аномалиям развития структур головного мозга. Однако, до сих пор остается без внимания роль апоптоза в формировании нонапегггидергической нейросекреторной системы гипоталамуса.

Катехоламины (КА) и NO — факторы, участвующие в регуляции функционального состояния нонапептидергических нейронов взрослых животных. В ряде работ на различных типах нейронов показано, что КА и NO принимают участие в регуляции программированной клеточной гибели, при этом действие этих веществ на апоптоз не является однозначным и во многом зависит от типа клеток и условий опыта [Noh et al., 1999; Brune et al., 1998]. Однако практически ничего не известно об участии КА и N0 в регуляции апоптоза нонапептидергических нейронов. Показано, что КА оказывают морфогенетическое влияние на развивающиеся гипоталамические нейроны, в том числе и нонапептидергические [Lauder, Bloom, 1974; Wray, Hoffman, 1986]. Однако, существуют единичные работы, связывающие морфогенетическое влияние КА на формирующиеся нейросекреторные центры гипоталамуса с программированной клеточной гибелью [Pabbathi et al., 1997].

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение влияния катехоламинов на экспрессию сигнальных белков апоптоза в нонапегггидергических нейронах гипоталамуса крыс находящихся на разных стадиях постаатального онтогенеза, а также выяснение возможного участия специфических сигнальных белков апоптоза в регуляции функционального состояния вазопрессинергических нейронов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить характер влияния изменений уровня КА в мозге на содержание пИОБ, проапоптозного бежа каспазы-9 и антиапоптозного белка Ьс1-2 в нонапегггидергических нейронах взрослых крыс.

2. Оценить динамику экспрессии каспазы-9 и Ьс1-2 в нонапегггидергических нейронах крысят, подвергавшихся пренатальной блокаде синтеза КА и интактных крысят на ранних этапах постнатального онтогенеза.

3. Оценить функциональное состояние ВП-ергических нейронов у мышей-нокаутов по генам р21, р53 и Ьс1-2, и у мышей с повышенной экспрессией гена с-Яа£-1.

Научная новизна результатов исследования

В данной работе впервые продемонстрировано, что значительные изменения уровня КА в мозге сопровождаются увеличением внутриклеточного содержания п>Ю8 и приводят к повышению экспрессии каспазы-9 и Ьс1-2 в нонапепгидергических нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса. Динамика экспрессии каспазы-9 и Ьс1-2 в течение раннего постнатального онтогенеза существенно различается в нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса интактных крысят, указывая на более раннее завершение формирования СОЯ. Пренатальное снижение уровня КА в мозге вызывает

1* значительное усиление механизмов как инициирующих, так и подавляющих апоптоз в нонапептидергических клетках у крысят на ранних сроках постнаталъного развития, что свидетельствует о морфогенетическом влиянии КА на развивающиеся нонапептидергические нейросекреторные центры.

Также впервые показано, что сигнальные белки апоптоза — р21, р53, Ьс1-2 и митогенный фактор - с-К.а£-1 участвуют в регуляции синтеза и выведения ВП нейронами СОЯ и ПВЯ гипоталамуса.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. На ранних стадиях постнаталъного онтогенеза КА модулируют апоптоз нейронов СОЯ и ПВЯ, оказывая таким образом морфогенетическое влияние на формирующиеся нонапептидергические нейросекреторные центры.

3. Сигнальные белки апоптоза участвуют в регуляции функционального состояния ВП-ергических нейронов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Совокупность результатов работы позволила сформулировать научную гипотезу о зависимости апоптоза нонапептидергических нейронов от факторов, принимающих участие в регуляции функциональной активности этих нейронов (катехоламины, N0), а также о зависимости функциональной ч активности нонапептидергических нейронов от экспрессии в них сигнальных белков апоптоза.

Полученные результаты важны для понимания механизмов апоптоза нонапептидергических нейросекреторных клеток в условиях их хронической активации. Кроме того, полученные данные позволяют оценить роль апоптоза в ходе формирования нонапептидергических нейросекреторных центров. Выяснение роли КА в регуляции апоптоза развивающихся ВП-ергических нейронов может иметь практическое значение в клинике при лечении несахарного диабета, а также при исследовании приспособляемости организма к условиям длительного стресса.

Работа выполнена по плану научных исследований лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН в рамках проекта РФФИ (01-04-48825).

Апробация работы и публикация результатов исследования

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на XII Международном совещании и V школе по эволюционной физиологии (С-Петербург, 2001), на 6-й Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология — наука XXI века" (Пущино, 2002), на Второй научной конференции с международным участием 'Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии" (Новосибирск, 2002), на международном симпозиуме '"Neuron differentiation and plasticity - regulation by intercellular signals" (Москва, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием "Нейроэндокринология-2003" (С-Петербург,

2003). По материалам диссертации опубликовано 8 тезисов докладов Российских и международных конференциях и две научные статьи рецензируемых российских журналах.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Таранухин, Андрей Григорьевич

ВЫВОДЫ

1. Снижение уровня катехоламинов в мозге, также как и его повышение приводит к увеличению экспрессии проапоптозного сигнального белка каспазы-9 в нонапептидергических нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса, т.е. приводит к инициации апоптоза по каспаза-9-зависимому пути. В нейронах СОЯ увеличение экспрессии каспазы-9, возможно, опосредуется возрастанием внутриклеточного содержания N0 как при повышении уровня норадреналина, так и при снижении уровня катехоламинов в мозге. В нейронах ПВЯ активация проапоптозного белка каспазы-9 опосредуется повышением уровня N0 только при снижении уровня катехоламинов в мозге.

2. Инициация апоптоза, вызванная изменением уровня катехоламинов, не приводит к массовой гибели нейронов СОЯ и ПВЯ гипоталамуса, что вероятно связано с увеличением внутриклеточного содержания антиапоптозного бежа Ьс1-2, экспрессия которого может усиливаться под воздействием N0. При снижении уровня катехоламинов в нейронах СОЯ Ьс1-2 подавляет активацию каспазы-9, а при возрастании уровня норадреналина в СОЯ и при всех изменениях уровня катехоламинов в ПВЯ - торможение апоптоза очевидно осуществляется также при участии антиапоптозного белка Ьс1-2, но на более поздних этапах апоптоза.

3. Снижение уровня катехоламинов в мозге в течение эмбриогенеза приводит к усилению инициации апоптоза по каспаза-9-зависимому пути в нонапептидергических нейронах у крысят на ранних сроках постнатального онтогенеза, что подтверждает участие катехоламинов в морфогенезе СОЯ и ПВЯ гипоталамуса. Динамика экспрессии про- и антиапоптозных белков (каспазы-9 и Ьс1-2) в нонапептидергических нейронах интактных крысят и крысят, подвергавшихся пренатальному снижению уровня катехоламинов, позволяет предположить, что в ходе постнатального онтогенеза апоптотическая гибель нейронов завершается раньше в СОЯ, чем в ПВЯ.

4. Анализ функционального состояния вазопрессинергических нейронов нокаутных и трансгенных мышей позволяет заключить, что сигнальные белки апоптоза - р21, р53, Ьс1-2 и митогенный фактор с-ЯаМ участвуют в регуляции функциональной активности этих нейронов, оказывая различное влияние на синтез и выведение вазопрессина в СОЯ и ПВЯ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что КА играют существенную роль в регуляции апоптоза нейронов в развивающихся нонапептидергических центрах гипоталамуса неонатальных крысят, что согласуется с данными других авторов о морфогенетическом влиянии КА на гипоталамические нейросекреторные центры.

На взрослых животных и на крысятах мы показали, что любое значительное изменение уровня КА в мозге сопровождается увеличением содержания пЫОБ и приводит к повышению экспрессии сигнальных белков апоптоза в нейросекреторных клетках СОЯ и ПВЯ. С одной стороны, это свидетельствует об участии КА и N0 в регуляции апоптоза нонапептидергических нейронов. С другой стороны, наблюдаемые изменения функционального состояния ВП-ергических нейронов, коррелирующие с изменением экспрессии про- и антиапоптозных белков, позволили нам предположить, что сигнальные белки апоптоза участвуют в регуляции функционального состояния этих клеток. Наши дальнейшие эксперименты, проведенные на трансгенных мышах по про- и антиапоптозным генам, показали влияние сигнальных белков апоптоза на синтез и выведение ВП нейронами СОЯ и ПВЯ, т.е. подтвердили наше предположение об участии сигнальных белков апоптоза в регуляции нейрональной активности. Совокупность результатов нашей работы позволила нам придти к заключению о зависимости апоптоза нонапептидергических нейронов от факторов, принимающих участие в регуляции функциональной активности этих нейронов (катехоламиньг, N0), а также о зависимости функциональной активности нонапептидергических нейронов от экспрессии в них сигнальных белков апоптоза.

Интересно отметить, что практически во всех наших экспериментах мы наблюдали значительные различия в реакции нейронов СОЯ и ПВЯ гипоталамуса на применяемые воздействия. Во-первых, показаны различия в уровне экспрессии про- и антиапоптозных белков при одних и тех же воздействях (инъекции физиологического раствора, дегидратация, изменение уровня КА в мозге), что может быть связано с различными функциями выполняемыми этими нейронами. Во-вторых, выявлены различия в модулирующем влиянии N0 на экспрессию сигнальных белков апоптоза в нейронах СОЯ и ПВЯ. И в-третьих, показаны различные эффекты одних и тех же белков апоптоза на активность ВП-ергических клеток двух нейросекреторных центров - СОЯ и ПВЯ гипоталамуса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Таранухин, Андрей Григорьевич, Санкт-Петербург

1. Балахонов A.B., Пескова Т.Н. Нормальная гибель клеток в эмбриогенезе позвоночных животных // Усп. совр. биол.-1982.-Т.94.-С.433-445.

2. Борисова Е.А., Животовский Б.Д., Хансон К.П. Матричные свойства и белковый состав продуктов посттрансляционной деградации хроматина тимуса крыс // Радиобиология.-1984.-Т.24.-С.607-611.

3. Гоуфман Е.И. Клеточная организация паравентрикулярных ядер гипоталамуса крысы // Архив анат. гистол. эмбриол.-1990.-Т.98, N6.-C.46-52.

4. Звонарева Н.Б., Сейлиев A.A., Колюбаева С.Н., Борисова Е.А.,

5. Животовский Б.Д., Хансон К.П. Исследование механизма гибели тимоцитов при воздействии сверхвысоких доз у-из лучения // Радиобиология.-1987.-Т.27.-С.319-323.

6. Красновская И.А., Кузик В.В. Гомориположительные элементы гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы крысы (иммуногистохимическое исследование) // Архив анат. гистол. эмбриол.-1985.-Т.89, N8.-C.38-44.

7. Луцик Е.А. Афферентные связи // в кн.: Нейроэндокринология, ч. Первая, кн. Вторая.-1993.-С.270-286.

8. Макаренко И.Г., Угрюмов М.В., Калас А. Развитие связей крупноклеточных ядер гипоталамуса с задней долей гипофиза в пренатальном онтогенезе у крыс // Онтогенез.-1999.-Т.30.-С.296-301.

9. Маслова Л.Н. Отдаленный эффект пренатального воздействия гидрокортизоном на гипофизарно-адренокортикальную систему у доместицированных и недоместицируемых серебристо-черных лисиц // С/х биол.-1988.-С. 107-109.

10. Науменко E.B. Модификации функций гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы взрослых животных, вызванные воздействиями в раннем онтогенезе // в кн.: Нейроэндокринология, ч. Вторая.-1994.-С. 152-190.

11. Ю.Науменко Е.В., Дыгало H.H. Реактивность гипоталамо-гипофизарно-надпочечникового комплекса взрослых крыс после введения гидрокортизона их матерям во время беременности // Онтогенез.-1979.-Т.10.-С.476-482.

12. Науменко Е.В., Дыгало H.H., Маслова JI.H. Длительная модификация стрессорной реактивности воздействиями в пренатальном онтогенезе // Онтогенетические и генетико-эволюционные аспекты нейроэндокринной регуляции стресса. Новосибирск: Наука.-1990.-С.40-54.

13. Новиков B.C. Программированная клеточная гибель // С-Петербург: Наука. -1996.-276с.

14. З.Поленов A.JI. Гипоталамическая нейросекреция // JI.: Наука.-1968.-159с.

15. Поленов A.JI. Морфофункциональные основы нейросекреторных (пептидергических) и адренергических регулирующих механизмов гипоталамуса//в кн.: XI съезд Всес. физиол. об-ва.-1970.-Т.1.-С.311-315.

16. Поленов A.JI. Роль Гомориположительной гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы в регуляции размножения (сравнительный морфологический и эколого-гистофизиологический анализ) // Ж. эвол. биохим. и физиол.-1986.-Т.22.-С.406-418.

17. Поленов A.JI. Эволюция гипоталамо-гипофизарного нейроэндокринного комплекса // Руководство по физиологии. Эволюционная физиология. JL: Наука.-1983.-ч.2.-С.53-109.

18. Поленов A.JI., Константинова М.С., Гарлов П.Е. Гипоталамо-гипофизарный нейроэндокринный комплекс // в кн.: Нейроэндокринология, ч. Первая, кн. Первая. -1993.-С. 139-187.

19. Угрюмов М.В. Нейроэндокринная регуляция в онтогенезе // М.: Наука.-1989.-247С.

20. Черниговская Е.В., Глазова М.В., Ямова JI.A., ЕвтееваС.Е., Красновская И.А. Роль катехоламинов в регуляции функционального состояния вазопрессинергических клеток гипоталамуса крыс // Ж. эвол. биохим. и физиол.-2001.-Т.37.-С. 144-149.

21. Черниговская Е.В., Данилова О.А., Беленький М.А. Характеристика нейросекреторных центорв гипоталамуса крыс, связанных с регуляцией функции коркового вещества надпочечников // Пробл. эндокринол.-1988. -Т.34.-С.60-64.

22. Чумаков П.М. Роль гена р53 в программированной клеточной смерти // Известия ан. серия биологическая.-1998.-К2.-С. 151-156.

23. Ямова Л.А., Глазова М.В., Евтеева С.Е., Черниговская Е.В. Влияние блокады синтеза катехоламинов на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса дегидратированных крыс // Ж. эвол. биохим. и физиол. В печати.

24. Ямова Л.А., Глазова М.В., Евтеева С.Е., Черниговская Е.В. Роль различных типов адренорецепторов в регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейросекреторных клеток гипоталамуса крыс //Ж. эвол. биохим. и физиол.-2002.-Т.38.-С.383-387.

25. Abe-Dohmae S., Harada N., Yamada К., Tanaka R. Bcl-2 gene is highly expressed during neurogenesis in the central nervous system // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1993.-V.191.-P.915-921.

26. Alagarsamy S., Phillips M., Pappas T., Johnson K.M. Dopamine neurotoxicity in cortical neurons // Drug Alcohol Depend.-1997.-V.48.-P. 105-111.

27. Altman J., Bayer S.A. Development of the diencephalon in the rat. I. Autoradiographic study of the time of origin and settling patterns of neurons of the hypothalamus//J. Comp. Neurol.-1978.-V.182.-P.945-972.

28. Anderson C.H. Time of neuron origin in the anterior hypothalamus of the rat // Brain Res.-1978.-V.154.-P.119-122.

29. Armstrong W.E., Warach S., Hatton G.I., McNeill. Subnuclei in the rat hypothalamic paraventricular nucleus: A cytoarchitectural, HRP, andimmunocytochemical analysis // Neurosci.-1980.-V.5.-P. 1931-1958.

30. Banasiak K.J., Haddad G.G. Hypoxia-induced apoptosis: effect of hypoxic severity and role of p53 in neuronal cell death // Brain Res.-1998.-V.29.-P.295-304.

31. Bandaranayake R.C. Morphology of the accessory neurosecretory nuclei and of the retrochiasmatic part of the supraoptic nucleus of the rat // Acta Anat.-1971. -V.80.-P. 14-22.

32. Barde Y.-A. Trophic factors and neuronal survival // Neuron.-1989.-V.2.-P. 1525-1534.

33. Barker J.L., Craytin J.W., Nicoll R.A. Noradrenaline and acetylcholine responses of supraoptic neurosecretory cells // J. Physiol. (Lond.).-1971.-V.218.-P. 19-32.

34. Beltramo M., Calas A., Chernigovskaya E., Thibault J., Ugrumov M. Long-lasting effect of catecholamine deficiency on differentiating vasopressin and oxytocin neurons in the rat supraoptic nucleus // Neuroscience.-1997.-V.79.-P.555-561.

35. Bernabe J., Proshlyakowa E., Sapronova A. et al. Pharmacological model of catecholamine depletion in the hypothalamus of fetal and neonatal rats and its application//Cell. Mol. Neurobiol.-1996.-V.16.-P.617-624.

36. Blanco F.J., Ochs R.L., Schwarz H., Lotz M. Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide//Am. J. Pathol.-1995.-V.146.-P.75-85.

37. Boldin M.P., Goncharov T.M., Goltsev Y.V., Wallach D. Involvement of MACH, a novel MORTl/FADD-interacting protease, in Fas/APO-1- and TNF receptor-induced cell death // Cell.-1996.-V.85.-P.803-815.

38. DNA damage following deafferentation in adult rats cerebellar cortex: a lesion model // Neuroscience.-2000.-V.95.-P.163-171.

39. Bourque C.W., Oliet S.H., Richard D. Osmoreceptors, osmoreception and osmoregulation // Frontiers in Neuroendocrinology.-1994.-V. 15.-P.231 -274.

40. Brune B., von Knethen A., Sandau K.B. Nitric oxide and its role in apoptosis // European Journal of Pharmacology.-1998.-V.351.-P.261-272.

41. Buller K.M., Smith D.W., Day T.A. Differential recruitment of hypothalamic neuroendocrine and ventrolateral medulla catecholamine cells by non-hypotensive and hypotensive hemorrhages // Brain Res.-1999.-V.834.-P.42-54.

42. Calabrese V., Bates T.E., Stella A.M. NO synthase and NO-dependent signal pathways in brain aging and neurodegenerative disorders: the role of oxidant/antioxidant balance // Neurochem. Res.-2000.-V.25.-P. 1315-1341.

43. Calka J., Wolf G., Brosz M. Ultrastructural demonstration of NADPH-diaphorase histochemical activity in the supraoptic nucleus of normal and dehydrated rats //Brain Res. Bull.-1994.-V.34.-P.301-308.

44. Capurso S.A., Calhoun M.E., Sukhov R.R., Mouton P.R., Price D.L., Koliatsos V.E. Deafferentation causes apoptosis in cortical sensory neurons in the adult rat// J. Neurosci.-1997.-V.17.-P.7372-7384.

45. Cecconi F., Alvarez-Bolado G., Meyer B.I., Roth K.A., Gruss P. Apaf-1 (CED-4 Homolog) regulates programmed cell death in mammalian development // Cell.-l 998.-V.94.-P.727-737.

46. Cenni M.C., Bonfanti L., Martinou J.C., Ratto G.M., Strettoi E., Maffei L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice //Eur. J. Neurosci.-1996.-V.8.-P. 1735-1745.

47. Cheng N., Maeda T., Kume T., Kaneko S., Kochiyama H., Akaike A., Goshima Y., Misu Y. Differential neurotoxicity induced by L-DOPA and dopamine in cultured striatal neurons // Brain Res.-1996.-V.743.-P.278-283.

48. Chopp M., Li Y., Zhang Z.G., Freytag S.O. P53 expression in brain after middle cerebral artery occlusion in the rat // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1992.-V.182.-P. 1201-1207.

49. Colucci W.S., Sawyer D.B., Singh K., Communal C. Adrenergic overload and apoptosis in heart failure: implications for therapy // J. Card. Fail.-2000.-V.6.-P. 1-7.

50. Crespo D., Ramos J., Gonzalez C., Fernandez-Viadero C. The supraoptic nucleus: a morphological and quantitative study in control and hypophysectomised rats // J. Anat.-1990.-V.169.-P.l 15-123.

51. Creveling C.R., Lundstrom J., McNeal E.T., Tice L. Daly J.W. Dihydroxytryptamines: Effects on noradrenergic function in mouse heart in vivo // Mol. Pharmacol.-1975.-V. 11.-P.211-222.

52. Cunningham E.T., Bohn M.C., Sawchenko P.E. Organization of adrenergic inputs to the paraventricular and supraoptic nuclei of the hypothalamus in the rat// J. Compar.Neurol.-1990.-V.292.-P.451-667.

53. Cunningham Jr. E.T., Sawchenko P.E. Anatomical specificity of noradrenergic inputs to paraventricular and supraoptic nuclei of the rat hypothalamus // J. Comp. Neurol.-1988.-V.274.-P.60-76.

54. Daftary S.S., Boudaba C., Szabo K., Tasker J.G. Noradrenergic excitation of magnocellular neurons in the rat hypothalamic paraventricular nucleus via intranuclear glutamatergic circuits // J. of Neuroscience.-1998.-V.18.-P. 1061910628.

55. Daikoku S., Kawano H., Okamura Y., Tokuzen M., Nagatsu I. Ontogenesis of immunoreactive tyrosine hydroxylase-containing neurons in rat hypothalamus // Develop. Brain Res.-1986.-V.28.-P.85-98.

56. Daily D., Barzilai A., Offen D., Kamsler A., Melamed E., Ziv I. The involvement of p53 in dopamine-induced apoptosis of cerebellar granule neurons and leukemic cells overexpressing p53 // Cell. Mol. Neurobiol.-1999.-V.19.-P.261-276.

57. Daugas E., Susin S.A., Zamzami N., Ferri K.F., Irinopoulou T., Larochette N., Prevost M-C., Leber B., Andrews D., Penninger J., Kroemer G. Mitochondrio-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis // FASEB J.-2000.-V.14.-P.729-739.

58. Dawson V.L., Dawson T.M., Bartley D.A., Uhl G.R., Snyder S.H. Mechanisms of nitric oxide-mediated neurotoxicity in primary brain cultures // J. Neurosci.-1993.-V.13.-P.2651-2661.

59. Decavel C., Geffard M., Calas A. Comparative study of dopamine- and noradrenaline-immunoreactive terminals in the paraventricular and supraoptic nuclei of the rat // Neurosci. Lett.-1987.-V.77.-P. 149-154.

60. Deng C., Zhang P., Harper J.W., Elledge S.J., Leder P. Mice lackingp21CIPl/WAFl undergo normal development, but are defective in G1 checkpoint control // Cell.-1995.-V.82.-P.675-684.

61. Deveraux Q.L., Takahashi R., Salvesen G.S., Reed J.C. X-linked IAP is a direct inhibitor of cell death proteases //Nature.-1997.-V.388.-P.300-303.

62. Donehower L.A., Harvey M., Slagle B.L., McArthur M.J., Montgomery C.A.

63. Jr., Butel J.S., Bradley A. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours //Nature.-1992.-V.356.-P.215-221.

64. E1-Husseini A.E., Williams J., Reiner P.B., Pelech S., Vincent S.R. Localization of the cGMP-dependent protein kinases in relation to nitric oxide synthase in the brain // J. Chem. Neuroanat.-1999.-V.17.-P.45-55.

65. Ellis R.E., Yuan J., Horvitz H.R. Mechanisms and functions of cell death // Annu. Rev. Cell Biol.-1991.-V.7.-P.663-698.

66. Nitric oxide induced apoptosis in mouse thymocytes // J. Immunol.-1995.-V.155.-P.2858-2865.

67. Fortin A., Cregan S.P., MacLaurin J.G., Kushwaha N., Hickman E.S., Thompson C.S., Hakim A., Albert P.R., Cecconi F., Helin K., Park D.S., Slack

68. R.S. APAF1 is a key transcriptional target for p53 in the regulation of neuronal cell death//J. Cell Biol.-2001.-V.155.-P.207-216.

69. Fu W., Luo H., Parthasarathy S., Mattson M.P. Catecholamines potentiate amyloid beta-peptide neurotoxicity: involvement of oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and perturbed calcium homeostasis // Neurobiol. Dis.-1998.-V.5.-P.229-243.

70. Fujioka T., Sakata Y., Yamaguchi K., Shibasaki T., Kato H., Nakamura S. The effects of prenatal stress on the development of hypothalamic paraventricular neurons in fetal rats // Neuroscience.-1999.-V.92.-P. 1079-1088.

71. Goping I.S., Gross A., Lavoie J.N., Nguyen M., Jemmerson R., Roth K., Shore G.C. Regulated targeting of BAX to mitochondria // J. Cell Biol.-1998.-V.143.-P.207-215.

72. Green D.R. Apoptotic pathways: the roads to ruin // Cell.-1998.-V.94.-P.695-698.

73. GribkofT V.K. Electrophysiological evidence for N-methyl-D-aspartateexcitatory amino acids receptors in the rat supraoptic nucleus in vitro // Neurosci. Lett-1991 .-V. 131 .-P.260-262.

74. Gross A., McDonnell J.M., Korsmeyer S.J. Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis // Genes and Dev.-1999.-V.13.-P. 1899-1911.

75. Hagemann C., Rapp U.R. Isotype-specific functions of Raf kinases // Exp. Cell Res.-1999.-V.253.-P.34-46.

76. Han S.K., Mytilineou C., Cohen G. L-DOPA up-regulates glutathione and protects mesencephalic cultures against oxidative stress // J. Neurochem.-1996.-V.66.-P.501-510.

77. Harper J.W., Adami G.R., Wei N., Keyomarsi K., Elledge S.J. The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases // Cell.-1993. -V. 75.-P.805-816.

78. Hata R., Gillardon F., Michaelidis T.M., Hossmann K.A. Targeted disruption of the bcl-2 gene in mice exacerbates focal ischemic brain injury // Metab. Brain

79. Dis.-1999.-V.14.-P.l 17-124.

80. Hatakeyama S., Kawai Y., Ueyama T., Senba E. Nitric oxide synthase-containing magnocellular neurons of the rat hypothalamus synthesize oxytocin and vasopressin and express Fos following stress stimuli // J. Chem. Neuroanat.-l 996.-V. 11 .-P.243-256.

81. Henderson C.E. Programmed cell death in the developing nervous system. // Neuron.-! 996.-V. 17.-P.579-585.

82. Hochman A., Sternin H., Gorodin S., Korsmeyer S., Ziv I., Melamed E., Offen

83. D. Enhanced oxidative stress and altered antioxidants in brains of Bcl-2-deficientmice//J. Neurochem.-1998.-V.71.-P.741-748.

84. Hockenbery D., Nunes G., Milliman C., Schreiber R.D., Korsmeyer S.J. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. // Nature.-1990.-V.348.-P.334-336.

85. Hoyt K.R., Reynolds I.J., Hastings T.G. Mechanism of dopamine-induced cell death in cultured rat forebrain neurons: Interactions with and differences from glutamate-induced cell death //Exp. Neurol.-1997.-V.143.-P.269-281.

86. Hu Y., Benedict M.A., Ding L., Nunez G. Role of cytochrome c anddATP/ATP hydrolysis in Apaf-1-mediated caspase-9 activation and apoptosis // EMBO J.-l 999.-V. 18.-P.3586-3595.

87. Hu Y., Benedict M.A., Wu D., Inohara N., Nunez G. Bcl-XL interacts with Apaf-1 and inhibits Apaf-1-dependent caspase-9 activation // Proc. Natl. Acad. Sci.-1998.-V.95.-P.4386-4391.

88. Hughes P.E., Alexi T., Schreiber S.S. A role for the tumour suppressor gene p53 in regulating neuronal apoptosis //Neuro Report.-1997.-V.8.-P.5-12.

89. Hwang B.H., Wang G.M. A rapid and sensitive radioimmunohistochemical assay for quantitation of vasopressin in discrete brain regions with anftanatomical resolution // J. Neurosci. Methods.-1993.-V.50.-P.37-44.

90. Ifft J.D. An autoradiographic study of the time of final division of neurons in rat hypothalamic nuclei //J. Comp. Neurol.-1972.-V.144.-P. 193-204.

91. Itoi K., Helmreich D.L., Lopez-Figueroa M.O., Watson S.J. Differential regulation of corticotropin-releasing hormone and vasopressin gene transcription in the hypothalamus by norepinephrine // J. Neurosci.-1999.-V. 19.-P.5464-5472.

92. Jacobson M.D., Burne J.F., King M.P., Miyashita T., Reed J.C., RaffM.C. Bcl-2 blocks apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA // Nature.-1993.-V.361.-P.365-366.

93. Jesenberger V., Procyk K.J., Ruth J., Schreiber M., Theussl H.C., Wagner E.F., Baccarini M. Protective role of Raf-1 in Salmonella-induced macrophage apoptosis //J. Exp. Med.-2001.-V. 193.-P.353-364.

94. Jiang X., Wang X. Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1 // J. Biol. Chem.-2000.-V.275.-P.31199-31203.

95. Johnson E.M. Jr., Deckwerth T.L. Molecular mechanisms of developmental neuronal death//Annu. Rev. Neurosci.-1993.-V.16.-P.31-46.

96. Jordan J., Galindo R.S., Prehn J.H.M., Weichselbaum R.R., Beckett M., Ghadge G.D., Roos R.P., Leiden J.M., Miller R.J. p53 expression induced apoptosis in hyppocampal pyramidal neuron cultures // J. Neurosci.-1997.-V.17.-P. 1397-1405.

97. Kadekaro M., Liu H., Terrell M.L., Gestl S., Bui V., Summy-Long J.Y. Role of NO on vasopressin and oxytocin release and blood pressure responses during osmotic stimulation in rats // Am. J. Physiol.-1997.-V.273.-P. 1024-1030.

98. Kadekaro M., Terrell M.L., Liu H., Gestl S., Bui V., Summy-Long J.Y. Effects of L-NAME on cerebral metabolic, vasopressin, oxytocin, and blood pressure responses in hemorrhaged rats // Am. J. Phisiol.-1998.-V.274.-P.1070-1077.

99. Kalimo H. Ultrastructural studies on the hypothalamic neurosecretory neurons of the rat. m. Paraventricular and supraoptic neurons during lactation and dehydration // Cell Tissue Res.-1975.-V.163.-P. 151-168.

100. Kermer P., Ankerhold R., Klocker N., Krajewsi S., Reed J.C., Bahr M. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo // Brain Res. Mol. Brain Res.-2000.-V.85.-P. 144-150.

101. Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer.-1972.-V.26.-P.239-257.

102. Kerr J.F.R., Winterford C.M., Harmon B.V. Apoptosis its significance in cancer and cancer therapy // Cancer.-1994.-V.73.-P.2013-2026.

103. Kim Y.M., Kim T.H., Seol D.W., Talanian R.V., Billiar T.R. Nitric oxide suppression of apoptosis occurs in association with an inhibition of Bcl-2 cleavage and cytochrome c release // J. Biol. Chem.-1998.-V.273.-P.31437-31441.

104. Kim Y.M., Talanian R.V., Billiar T.R. Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increases in caspase-3-like activity via two distinct mechanisms // J. Biol. Chem.-l 997.-V.272.-P.31138-31148.

105. Kiss A., Jezova D., Aguilera G. Activity of the hypothalamic pituitary adrenal axis and sympathoadrenal system during food and water deprivation in the rat // Brain Res.-1994.-V.663.-P.84-92.

106. Ko L.J., Prives C. p53: puzzle and paradigm // Genes Dev.-1996.-V.10.-P. 1054-1072.

107. Kolasa K., Harrel L.E. Apoptotic protein expression and activation of caspases is changed following cholinergic denervation and hippocampal sympathetic ingrowth in rat hippocampus //Neuroscience.-2000.-V.101.-P.541-546.

108. Krieg W.J.S. The hypothalamus of the albino rat // J. Comp. Neurol.-1932.-V.55.-P. 19-89.

109. Krisch B. Electron microscopic immunocytochemical investigation on the postnatal development of the vasopressin system in the rat 11 Cell Tissue Res.-1980.-V.205.-P.453-471.

110. Krisch B. Ultrastructure of regulatory neuroendocrine neurons and functionally related structures // Current Topics in Neuroendocrinology.-1986.-V.7.-P.251-290.

111. Kroemer G., Zamzami N., Susin S.A. Mitochondrial control of apoptosis // Immunol. Today.-l 997.-V. 18.-P.44-51.

112. Kruidering M., Evan G.I. Caspase-8 in apoptosis: the beginning of "the end"? // IUBMB Life.-2000.-V.50.-P.85-90.

113. Kubasova T.A., Chukhlovin A.B., Somosy Z., Ivanov S.D., Koteles G.J., Zherbin E.A., Hanson K.P. Detection of early membrane and nuclear alterations of thymocytes upon in vitro ionizing radiation // Acta Physiol. Hung.-1993.-V.81.-P.277-288.

114. KuidaK. Caspase-9 //Int. J. Biochem. Cell Biol.-2000.-V.32.-P.121-124.

115. Kuida K., Haydar T.F., Kuan C.-Y., Gu Y., Taya C., Karasuyama H., Su M.S.S., Rakic P., Flavell R.A. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase-9 // Cell.-1998.-V.94.-P.325-337.

116. Kuida K., Zheng T.S., Na S., Kuan C.-Y., Yang D., Karasuyama H., Rakic P., Flavell R.A. Decreased apoptosis in the brain and premature lethality in CPP32-deficient mice // Nature.-1996.-V.384.-P.368-372.

117. Lafarga M., Villegas J., Crespo D. Changes in nucleolar morphology and volume of the supraoptic nucleus neurons during postnatal development of the rat//Brain Res.-1985.-V.354.-P.310-313.

118. Lane D.P. A death in the life of p53 // Nature.-1993.-V.362.-P.786-787.

119. Lauder J.M., Bloom F.E. Ontogeny of monoamine neurons in the locus coeruleus, raphe nuclei and substantia nigra of the rat. I. Cell differentiation // J. Comp. Neurol.-1974.-V. 155.-P.469-482.

120. Laurent F.M., Hindelang C., Klein M.J., Stoeckel M.E., Felix J.M. Expression of the oxytocin and vasopressin genes in the rat hypothalamus during development: an in situ hybridization study // Brain Res. Dev. Brain Res.-l 989.-V.46.-P. 145-154.

121. Laverty R. Catecholamines: Role in health and disease // Drugs.-1978.-V.16.-P.418-440.

122. Lavigueur A., Maltby V., Mock D., Rossant J., Pawson T., Bernstein A. High incidence of lung, bone, and lymphoid tumors in transgenic mice overexpressing mutant alleles of the p53 oncogene // Mol. Cell Biol.-1989.-V.9.-P.3982-3991.

123. Lazcano M.A., Bentura M.L., Toledano A. Morphometric study on the development of magnocellular neurons of the supraoptic nucleus utilising immunohistochemical methods //J. Anat.-1990.-V.168.-P.l-11.

124. Lee C.S., Han J.H., Jang Y.Y., Song J.H., Han E.S. Differential effect of catecholamines and MPP(+) on membrane permeability in brain mitochondria and cell viability in PC 12 cells // Neurochem. Int.-2002.-V.40.-P.361-369.

125. Levine A.J. p53, the cellalar gatekeeper for growth and division // Cell.-1997.-V.88.-P.323-331.

126. Li J., Billiar T.R., Talanian R.V., Kim Y.M. Nitric oxide reversibly inhibits seven members of the caspase family via S-nitrosylation // Biochem. Biophys. Res. Commun.-l 997.-V.240.-P.419-424.

127. Li Y., Chopp M., Zhang Z.G., Zaloga C., Niewenhuis L., Gautam S. P53-immunoreactive protein and p53 mRNA expression after transient middle cerebral artery occlusion in rats // Stroke.-1994.-V.25.-P.849-855.

128. Lipari E.F., Lipari D., Gerbino A., Di Liberto D., Bellafiore M., Catalano M., Valentino B. The hypothalamic magnocellular neurosecretory system in developing rats//Eur. J. Histochem.-2001.-V.45.-P. 163-168.

129. Liu J., Mori A. Monoamine metabolism provides an antioxidant defense in the brain against oxidant- and free radical-induced damage // Arch. Biochem. Biophys.-1993.-V.302.-P. 118-127.

130. Lockshin R.A., Williams C.M. Programmed cell death II. Endocrine potentiation of the breakdown of the intersegmental muscles of silkmoths // J. Insect Physiol.-1964.-V. 10.-P.643-649.

131. Lopez-Collazo E., Mateo J., Miras-Portugal M.T., Bosca L. Requirement of nitric oxide and calcium mobilization for the induction of apoptosis in adrenal vascular endothelial cells//FEBS Lett.-1997.-V.413.-P. 124-128.

132. Lorsbach R.B., Murphy W.J., Lowenstein C.J., Snyder S.H., Russell S.W. Expression of the nitric oxide synthase gene in mouse macrophages activated for tumor cell killing//J. Biol. Chem.-1993.-V.268.-P.1908-1913.

133. Lud Cadet J., Harrington B., Ordonez S. Bcl-2 overexpression attenuates dopamine-induced apoptosis in an immortalized neural cell line by suppressing the production of reactive oxygen species // Synapse.-2000.-V.35.-P.228-233.

134. Ludwig R.L., Bates S., Vousden K.H. Differential activation of target cellular promoters by p53 mutants with impaired apoptotic function // Mol. Cell. Biol.-1996.-V.16.-P.4952-4960.

135. Luo Y., Kaur C., Ling E.A. Hypobaric hypoxia induces fos and neuronal nitric oxide synthase expression in the paraventricular and supraoptic nucleus in rats//Neurosci. Lett.-2000.-V.296.-P. 145-148.

136. Luo Y., Umegaki H., Wang X., Abe R., Roth G.S. Dopamine induces apoptosis through an oxidation-involved SAPK-JNK activation pathway // J. Biol. Chem.-1998.-V.273.-P.3756-3764.

137. Lutz-Bucher B., Koch B. Evidence for an inhibitory effect of nitric oxides o neuropeptide secretion from isolated neural lobe of the rat pituitary gland // Neurosci. Lett.-1994.-V.165.-P.48-50.

138. Makarenko I.G., Ugrumov M.V., Calas A. Axonal projections from the hypothalamus to the median eminence in rats during ontogenesis: Dil tracing study //Anat. Embryol. (Berl).-2001.-V.204.-P.239-252.

139. Mannick J.B., Hausladen A., Liu L., Hess D.T., Zeng M., Miao Q.X., Kane L.S., Gow A.J., Stamler J.S. Fas-induced caspase denitrosylation // Science.-1999.-V.284.-P.651-654.

140. Mason W.T., Ho I., Eckenstein T., Hatton G. Cholinergic input to rat supraoptic nucleus: Combined immunocytochemical and histochemical identification//Brain Res. Bull.-1983.-V.l 1.-P.617-626.

141. Mayer B., Hemmens B. Biosynthesis and action of nitric oxide in mammalian cells // TIBS.-1997.-V.22.-P.477-481.

142. McCann S.M., Karanth S., Kimura M., Yu W.H., Rettori V. The role of nitric oxide (NO) in control of hypothalamic-pituitary function // Rev. Bras. Biol.-l996.-V.56.-P. 105-112.

143. McCarthy N.J., Whyte M.K., Gilbert C.S., Evan G.I. Inhibition of Ced-3/ICE-related proteases does not prevent cell death induced by oncogenes,

144. DNA damage, or the Bcl-2 homologue Bak // J. Cell. Biol.-1997.-V.136.-P.215-227.

145. McDonnell T.J., Deane N., Piatt F.M., Nunez G., Jaeger U., McKearn J.P., Korsmeyer S.J. bcl-2-immunoglobulin transgenic mice demonstrate extended B cell survival and follicular lymphoproliferation // Cell.-1989.-V.57.-P.79-88.

146. McGahan L., Hakim A.M., Robertson G.S. Hippocampal myc and p53 expression following transient global ischemia // Mol. Brain Res.-1998.-V.56,-P. 133-145.

147. McLaughlin BA, Nelson D, Erecinska M, Chesselet MF. Toxicity of dopamine to striatal neurons in vitro and potentiation of cell death by a mitochondrial inhibitor//J. Neurochem.-1998.-V.70.-P.2406-2415.

148. Meeker R.B., Swanson D.J., Hayward J.N. Light and electron microscopic localization of glutamate immunoreactivity in the supraoptic nucleus of the rat hypothalamus // Neuroscience.-1989.-V.33.-P. 157-167.

149. Mehmet H. Caspases find a new place to hide // Nature.-2000.-V.403.-P.29-30.

150. Merry D.E., Veis D.J., Hickey W.F., Korsmeyer S.J. bcl-2 protein expression is widespread in the developing nervous system and retained in the adult PNS // Development.-1994.-V.120.-P.301-311.

151. Meyer D.K., Brownstein M.J. Effect of surgical deafferentation of the supraoptic nucleus on its choline acetyltransferase content // Brain Res.-1980.-V.193.-P.566-569.

152. Michieli P., Chedid M., Lin D., Pierce J.H., Mercer W.E., Givol D. Induction of WAF1/CIP1 by a p53-independent pathway // Cancer Res.-1994.-V.54.-P.3391-3395.

153. Mikula M., Schreiber M., Husak Z., Kucerova L., Ruth J., Wieser R., Zatloukal K., Beug H., Wagner E.F., Baccarini M. Embryonic lethality and fetal liver apoptosis in mice lacking the c-raf-1 gene // EMBO J.-2001.-V.20.-P. 1952-1962.

154. Miura T., Muraoka S., Ogiso T. Lipid peroxidation inhibited by monoamines//Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol.-1996.-V.93.-P.57-67.

155. Miyata S., Itoh T., Matsushima O., Nakashima T., Kiyohara T. Not only osmotic stress but also repeated restraint stress causes structural plasticity in the supraoptic nucleus of the rat hypothalamus // Brain Res. Bull.-1994.-V.33.-P.669-675.

156. Mohr S., Zech B., Lapetina E.G., Brune B. Inhibition of caspase-3 by S-nitrosation and oxidation caused by nitric oxide // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1997.-V.238.-P.387-391.

157. Murphy A.N., Fiskum G. Bcl-2 and Ca(2+)-mediated mitochondrial dysfunction in neural cell death // Biochem. Soc. Symp.-1999.-V.66.-P.33-41.

158. Muzio M., Stockwell B.R., Salvesen G.S., Dixit V.M. An induced proximity model for caspase-8 activation //J. Biol. Chem.-1998.-V.273.-P.2926-2930.

159. Targeted disruption of Bcl-2 alpha beta in mice: occurrence of gray hair, polycystic kidney disease, and lymphocytopenia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1994.-V.91 .-P.3700-3704.

160. Nat R., Radu E., Regalia T., Popescu L.M. Apoptosis in human embryo development: 3. Fas-induced apoptosis in brain primary cultures // J. Cell Mol. Med.-2001.-V.5.-P.417-428.

161. Ng Y.K., Xue Y.D., Wong P.T. Different distributions of nitric oxide synthase-containing neurons in the mouse and rat hypothalamus // Nitric Oxide.• -1999.-V.3.-P.383-392.

162. Nicotera P., Zhivotovsky B., Bellomo G., Orrenius S. Ion signalling in apoptosis // Apoptosis / Ed. Mihich E., Schimke R.T. N.Y.: Plenum Press.-1994.-P.97-115.

163. Noh J.S., Kim E.Y., Kang J.S., Kim H.R., Oh Y.J., Gwag B.J. Neurotoxic and neuroprotective actions of catecholamines in cortical neurons // Exp. Neurol.-1999.-V. 159.-P.217-224.

164. Okere C.O., Murata E., Higuchi T. Perivascular localization of nitric oxide synthase in the rat adenohypophysis: potential implications for function and cell-cell interaction //Brain Res.-1998.-V.784.-P.337-340.

165. Oppenheim R. W. Cell death during development of nervous system // Annu.

166. Rev. Neurosci.-l 991 .-V. 14.-P.453-501.

167. O'Shea R.D., Gundlach A.L. Food or water deprivation modulate nitric oxide synthase (NOS) activity and gene expression in rat hypothalamic neurones: correlation with neurosecretory activity? // J. Neuroendocrinol.-1996.-V.8.-P.417-425.

168. Ota M., Crofton J.T., Festavan G.T., Share L. Evidence that nitric oxide can act centrally to stimulate vasopressin release // Neuroendocrinology.-1993.-V.57.-P.955-959.

169. Ota M., Crofton J.T., Toba K., Share L. Effect on vasopressin release of microinjection of cholinergic agonists into the rat supraoptic nucleus // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.-1992.-V.201.-P.208-214.

170. Pabbathi V.K., Brennan H., Muxworthy A., Gill L., Holmes F.E., Vignes M., Haynes L.W. Catecholaminergic regulation of proliferation and survival in rat forebrain paraventricular germinal cells //Brain Res.-1997.-V.760.-P.22-33.

171. Palkovits M., Brownstein M., Saavedra J.M., Axelrod J. Norepinephrine and dopamine content of hypothalamic nuclei of the rat // Brain Res.-1974.-V.77.-P. 137-149.

172. Parker S.B., Eichele G., Zhang P., Rawls A., Sands A.T., Bradley A., Olson E.N., Harper J.W., Elledge S.J. p53-independent expression of p21Cipl in muscle and other terminally differentiating cells // Science.-1995.-V.267.1. P. 1024-1027.

173. Parsadanian A.S., Cheng Y., Keller-Peck C.R., Holtzman D.M., Snider W.D. Bcl-xL is an antiapoptotic regulator for postnatal CNS neurons // J. Neurosci.-1998.-V. 18.-P. 1009-1019.

174. Peterson R.P. Magnocellular neurosecretory centres in the rat hypothalamus //J. Comp. Neurol.-1966.-V. 128.-P. 181-185.

175. Pettmann B., Henderson C.E. Neuronal cell death // Neuron.-1998.-V.20.-P.633-647.

176. Plochocka-Zulinska D., Krukoff T.L. Increased gene expression of neuronal nitric oxide synthase in brain of adult spontaneously hypertensive rats // Brain Res. Mol. Brain Res.-1997.-V.48.-P.291-297.

177. Pollard I. Effect of stress administered during pregnancy on reproductive capacity and subsequent development of the offspring of rats: Prolonged effects on the litters of a second pregnancy // J. Endocrinol.-1984.-V. 100.-P.301-306.

178. Porat S., Premkumar A., Simantov R. Dopamine induces phenotypic differentiation or apoptosis in a dose-dependent fashion: involvement of the dopamine transporter and p53 // Dev. Neurosci.-2001.-V.23.-P.432-440.

179. Porat S., Simantov R. Bcl-2 and p53: role in dopamine-induced apoptosis and differentiation // Ann. N. Y. Acad. Sci.-1999.-V.893.-P.372-375.

180. Poulain D.A., Wakerley J.B. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurones secreting oxytocin and vasopressin // Neuroscience.-1982.-V.7.-P.773-808.

181. Pow D.V. Immunocytochemistry of amino acids in the rodent supraoptic nucleus and pituitary using extremely specific, very high titre antisera // J. Neuroendocrinology.-1993.-V.

182. Purring-Koch C., McLendon G. Cytochrome c binding to Apaf-1: The effects of dATP and ionic strength // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2000.-V.97.-P.11928-11931.

183. Purves D., Snider W.D., Voyvodic J.T. Trophic regulation of nerve cell morphology and innervation in the autonomic nervous system // Nature.-1988.-V.336.-P. 123-128.

184. Raff M.C. Death wish // The Sciences.-1996.-V.36.-P.36-40.

185. Raff M.C. Social controls on cell survival and death: an extreme view // Nature.-1992.-V.356.-P.397-400.

186. Randle J.C., Mazurek M., Kneifel D. Alpha 1-adrenergic receptor activation releases vasopressin and oxytocin from perfused rat hypothalamic explants // Neurosci Lett.-1986.-V.65.-P.219-223.

187. Raoul C., Henderson C.E., Pettmann B. Programmed cell death of embryonic motoneurons triggered through the Fas death receptor // J. Cell Biol.-l999.-V. 147.-P. 1049-1062.

188. Reppert S.M., Uhl G.R. Vasopressin messenger ribonucleic acid in supraoptic and suprachiasmatic nuclei: appearance and circadian regulation during development // Endocrinology.-1987.-V.120.-P.2483-2487.

189. Rhodes C.H., Morrell J.I., Pfaff D.W. hnmunohistochemical analysis of magnocellular elements in rat hypothalamus: distribution and numbers of cells containing neurophysin, oxytocin, and vasopressin // J. Comp. Neurol.-1981.-V.198.-P.45-64.

190. Rosenberg P.A. Catecholamine toxicity in cerebral cortex in dissociated cell culture // J. Neurosci.-1988.-V.8.-P.2887-2894.

191. Rosse T., Olivier R., Monney L., Rager M., Conus S., Fellay I., Jansen B., Borner C. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c // Nature.-1998.-V.391 .-P.496-499.

192. Roy N., Deveraux Q.L., Takashashi R., Salvesen G.S., Reed J.C. The c-IAP-1 and c-IAP-2 proteins are direct inhibitors of specific caspases // EMBO J.-1997.-V. 16.-P.6914-6925.

193. Sakhi S., Sun N., Wing L.L., Mehta P., Schreiber S.S. Nuclear accumulation of p53 protein following kainic acid-induced seizures // Neuro Report.-1996.-V.7.-P.493-496.

194. Sanchez F., Moreno M.N., Yacas P., Carretero J., Vazquez R. Swim stress enhances the NADPH-diaphorase histochemical staining in the paraventricular nucleus of the hypothalamus // Brain Res.-1999.-V.828.-P. 159-162.

195. Saphier D. Electrophysiology end neuropharmacology of noradrenergic projections to rat PVN magnocellular neurons // Am. J. Physiol.-1993.-V.246.-P.891-902.

196. Sapolsky R.M., Meaney M.J. Maturation of adrenocortical stress response: Neuroendocrine control mechanisms and the stress hyporesponsive period // Brain Res. Rev.-1986.-V.l 1.-P.65-76.

197. Sawchenko P.E., Swanson L.W. The organization of noradrenergic pathways from the brainstem to the paraventricular and supraoptic nuclei in the rat // Brain Res.-1982.-V.257.-P.275-325.

198. Scaffidi C., Fulda S., Srinivasan A., Friesen C., Li F., Tomaselli K.J., Debatin K-M., Krammer P.H., Peter M.E. Two CD95 (Apo-l/Fas) signaling pathways // EMBO J.-1998.-V.17.-P. 1675-1687.

199. Scaffidi C., Schmitz I., Zha J., Korsmeyer S.J., Krammer P.H., Peter M.E. Differential modulation of apoptosis sensitivity in^T^ type I and type II cells. // J. Biol. Chem.-1999.-V.274.-P.22532-22538.

200. Scharrer E., Scharrer B. Neuroendocrinology // N.Y.-Lond.: Columbia University Press.-1963.-289 p.

201. Seiliev A.A., Zvonareva N.B., Zhivotovsky B.D., Hanson K.P. Determination of some nuclear deoxiribonucleases in rat thymocytes // Radiat. Environ. Biophys.-1992.-V.31.-P. 123-132.

202. Shoji M., Share L., Crofton J.T., Brooks D.P. The effect on vasopressin release of microinjection of cholinergic agonists into the paraventricular nucleus of conscious rats // J. Neuroendocrinol.-1989.-V.l.-P.401-406.

203. Simonian N.A., Coyle J.T. Oxidative stress in neurodegenerative diseases // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.-1996.-V.36.-P.83-106.

204. Sladek C.D., Joynt R.J. Characterization of cholinergic control of vasopressin release by the organ cultured rat hypothalamo-neurohypophyseal system // Endocrinology.-1979.-V. 104.-P.659-663.

205. Slupsky J.R., Weber C.K., Ludwig S., Rapp U.R. Raf-dependent signaling pathways in cell growth and differentiation // Cell Growth and Oncogenesis.-1998.-P.75-95.

206. Smith D.W., Sibbald J.R., Khanna S., Day T.A. Rat vasopressin cells responses to simulated hemorrhage: stimulus-dependent role for A1 noradrenergic neurons//Am. J. Physiol.-1995.-V.268.-P. 1336-1342.

207. Soinila S., Sadeniemi M., Lumme A., Vanhatalo S. Age-related augmentation of the dehydration-induced increase in the supraoptic nitric oxide synthase activity in rats // Neurosci. Lett.-1999.-V.272.-P. 13-16.

208. Somasundaram K., El-Deiry W.S. Tumor supressor p53: regulation and function // Front Biosci.-2000.-V.5.-P.D424-D437.

209. Specht L.A., Pickel V.M., Joh T.H., Reis D.J. Licht-microscopic immunocytochemical localization of tyrosine hydroxylase in prenatal rat brain. I. Early ontogeny//J. Comp. Neurol.-1981.-V.199.-P.233-253.

210. Susin S.A., Zamzami N., Castedo M., Hirsch T., Marchetti P., Macho A., Daugas E., Geuskens M„ Kroemer G. Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease //J. Exp. Med.-1996.-V.184.-P. 1331-1341.

211. Swanson L.W., Sawchenko P.E. Hypothalamic integration: organization of paraventricular and supraoptic nuclei // Ann. Rev. Neurosci.-1983.-V.6.-P.269-324.

212. Tamatani M., Ogawa S., Niitsu Y., Tohyama M. Involvement of Bcl-2 family and caspase-3-like protease in NO-mediated neuronal apoptosis // J. Neurochem.-1998.-V.71.-P. 1588-1596.

213. Tanabe H., Eguchi Y., Kamada S., Martinou J.C., Tsujimoto Y. Susceptibility of cerebellar granule neurons derived from Bcl-2-deficient and transgenic mice to cell death //Eur. J. Neurosci.-1997.-V.9.-P.848-856.

214. Trembleau A., Ugrumov M., Roche D., Calas A. Vasopressin and oxytocin gene expressions in intact rats and under the catecholamine deficiency during ontogenesis //Brain Res. Bull.-1995.-V.37.-P.437-448.

215. Uberti D., Belloni M., Grilli M., Spano P., Memo M. Induction of tumour-suppressor phosphoprotein p53 in the apoptosis of cultured rat cerebellar neurons triggered by excitatory amino acids // Eur. J. Neurosci.-1998.-V.10.-P.246-254.

216. Uehara T., Kikuchi Y., Nomura Y. Caspase activation accompanying cytochrome c release from mitochondria is possibly involved in nitric oxide-induced neuronal apoptosis in SH-SY5Y cells // J. Neurochem.-1999.-V.72.-P. 196-205.

217. Ueta Y., Levy A., Chowdrey H.S., Lightman S.L. Water deprivation in the rat induces nitric oxide synthase (NOS) gene expression in the hypothalamic paraventricular and supraoptic nuclei // Neurosci. Res.-l 995.-V.23.-P.317-319.

218. Ueta Y., Levy A., Lightman S.L. et. al. Hypovolemia upregulates the expression of neuronal nitric oxide synthase gene in the paraventricular and supraoptic nuclei of rats // Brain Res.-1998.-V.790.-P.25-32.

219. Ugrumov M.V., Taxi J., Tixier-Vidal A. et al. Ontogenesis of tyrosine hydroxylase-immunopositive structures in the rat hypothalamus: An atlas of neuronal cell bodies //Neuroscience.-1989a.-V.29.-P. 135-156.

220. Ugrumov M.V., Tixier-Vidal A., Taxi J. et al. Ontogenesis of tyrosine hydroxylaseimmunopositive structures in rat hypothalamus: Fiber pathways and terminal fields // Ibid.-1989b.-V.29.-P. 157-166.

221. UsunofTK.G., Kharazia V.N., Valtschanoff J.G. et. al. Nitric oxide synthase-containing projections to the ventrobasal thalamus in the rat // Anat. Embryol. (Berl).-l 999.-V.200.-P.265-281.

222. Vaux D.L., Cory S., Adams J.M. Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells // Nature.-1988.-V.335.-P.440-442.

223. Vaux D.L., Strasser A. The molecular biology of apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-1996.-V.93.-P.2239-2244.

224. Veltmar A., Culman J., Qadri F. et. al. Involvement of adrenergic and angiotensinergic receptors in the paraventricular nucleus in the angiotensin II-induced vasopressin release // J. Pharmacol. Exp. Ther.-1992.-V.263.-P. 12531260.

225. Volbracht C., Leist M., Kolb S.A., Nicotera P. Apoptosis in caspase-inhibited neurons // Mol Med.-2001.-V.7.-P.36-48.

226. Waldman T., Kinzler K.W., Vogelstein B. p21 is necessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancer cells // Cancer Res.-1995.-V.55.-P.5187-5190.

227. Wray S., Hoffman G. Catecholamine innervation of LH-RH neurons: a developmental study //Brain Res.-1986.-V.399.-P.327-331.

228. Wyllie A.H., Kerr J.F., Currie A.R. Cell death: the significance of apoptosis //Int. Rev. Cytol.-1980.-V.68.-P.251-306.

229. Xiang H., Hochman D.W., Saya H., Fujiwara T., Schwartzkroin P.A., Morrison R.S. Evidence for p53-mediated modulation of neuronal viability // J. Neurosci.-1996.-V.16.-P.6753-6765.

230. Xiang J., Chao D.T., Korsmeyer S.J. BAX-induced cell death may not require interleukin 1 beta-converting enzyme-like proteases // Proc. Natl. Acad. Sci.-1996.-V.93.-P. 14559-14563.

231. Yamada K., Emson P., Hokfelt T. Immunohistochemical mapping of nitric oxide synthase in the rat hypothalamus and colocalization with neuropeptides // J. Chem. Neuroanat.-l 996.-V. 10.-P.295-316.

232. Yasin S., Costa A., Trainer P. Windle R., Forsling M.L., Grossman A. Nitric oxide modulates the release of vasopressin from rat hypothalamic explants // Endocrinology.-1993.-V. 133.-P. 1466-1469.

233. Youn Y.C., Kwon O.S., Han E.S., Song J.H., Shin Y.K., Lee C.S. Protective effect of boldine on dopamine-induced membrane permeability transition in brain mitochondria and viability loss in PC 12 cells // Biochem. Pharmacol.-2002.-V.63 .-P.495-505.

234. Zherbin E.A., Chukhlovin A.B., Koteles G.J., Kubasova T.A., Vashchenko V.I., Hanson K.P. Effect in vitro of cadmium ions on some membrane andnuclear parameters of normal and irradiated thymic lymphoid cells // Arch. Toxicol.-1986.-V.59.-P.21-25.

235. Zhivotovsky B.D., Wade D., Cahm A., Orrenius G., Nicotera P. Formation of 50 kbp chromatin fragments in isolated liver nuclei is mediated by protease and endonuclease activity//FEBS Lett.-1994.-V.351.-P.150-154.

236. Zhou L., Connors T., Chen D.F., Murray M., Tessler A., Kambin P., Saavedra R.A. Red nucleus neurons of Bcl-2 over-expressing mice are protected from cell death induced by axotomy // Neuroreport.-1999.-V.10.-P.3417-3421.

237. Zilkha-Falb R., Ziv I., Nardi N., Offen D., Melamed E., Barzilai A. Monoamine-induced apoptotic neuronal cell death // Cell. Mol. Neurobiol.-1997.-V.17.-P. 101-118.

238. Zvonareva N.B., Zhivotovsky B.D., Hanson K.P. Distribution of nuclease attack sites and complexity of DNA in the products of post-irradiation degradation of rat thymus chromatin // Int. J. Rad. Biol.-1983.-V.44.-P.261-266.

239. Выражаю благодарность коллективу нейроэндокринологов за повседневную помощь, поддержку и ценные консультации.

Информация о работе

Таранухин, Андрей Григорьевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2003
ВАК 03.00.13

Диссертация

Экспрессия сигнальных белков апоптоза в нонапептидергических нейронах гипоталамуса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы