Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Шпилечные и дуплексные формы дезоксиолигонуклеотидов и их комплексы с ароматическими лигандами в водном растворе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Шпилечные и дуплексные формы дезоксиолигонуклеотидов и их комплексы с ароматическими лигандами в водном растворе"

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ХАРКШСЬК]^ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. В.Н. КАРАЗГНА

ПАХОМОВ Валерій Інокентійовкч

УДК 577.113

ШПИЛЬКОВІ Й ДУПЛЕКСНІ ФОРМИ ДЕЗОКСИОЛІГ0НУКЛЕОТИДІВ ТА ЇХ КОМПЛЕКСИ З АРОМАТИЧНИМИ ЛІГАНДАМИ У ВОДНОМУ РОЗЧИНІ

03.00.02 • біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фііико-математичних наук

Харків 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконша а Севастопольському державному технічному університеті Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук,

професор Веселков Олексій Никонович,

Севастопольський державний технічний університет, завідувач кафедрою фізики

Офіційні опоненти:

- Сорокін В. О. доктор фізико.-математичних наук, старший науковий співробітник ( Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б. І. Веркіна НАН України, провідний науковий співробітник)

- Больбух Т. В., кандидат фізико.-математичних наук, старший науковий співробітник відділу біофізики (Інститут радіофізики та електронікі ім. А. Я. Усікова НАН України)

Провідна установа - інститут фізики НАН України

Захист відбудеться ^ 2000 року о годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна, 61077 , м. Харків, пл. Свободи, 4. ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. 6.Н. Каразіка

Автореферат розісланий 35^ С 2000 року

Вчений секретар ----

спеціалізованої вченої ради ГаташС. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема визначення структурних особливостей нуклеїнових кислот, їх динаміки і впливу на формування комплексів ДНК з біологічно активними ароматичними речовинами важлива як у фундаментальному, так і у прикладному відношеннях. Неспадаючий інтерес до цієї проблеми грунтується на досить ефективній противопухлин-ній дії лікарських препаратів з даного класу хімічних сполук, а також на їх можливій токсичній, в тому числі мутагенній, дії на організм.

Незважючи на те, що у цей час виявлено загальні характерні риси реакцій нековгціент-ного зв’язування лігандів з дільницями ДНК (зовнішнє зв'язування та інтеркаляція) і основні типи енутрі- і міжмолекулярних взаємодій (водневі зв'язки, електростатичні, гідрофобні і ван-дер-ваальсові взаємодії), впливу на структуру і тривалість комплексів, що утворюються, для з’ясування молекулярного механізму дії біологічно активних речовин важливо мати детальну Інформацію про структурні І термодинамічні параметри комплексо-утворення, що залежать як від первинної! вторинної структури нуклеінових кислот, так і від зовнішніх умов. Завдяки розвитку методик синтезу олігонуклеотидів з заданими характеристиками, стало можливим проводити експерименти з комплементарними і некомппемен-тарними опігонуклеотидними послідовностями, що формують різноманітні вторинні структури: двоспіральні дуплекси і фрагменти одноланцюгової-бзДНК, шпильки, внутрішні петлі.

Незвичайні конформаційні стани в нативній ДНК та їх роль в процесах передачі генетичної інформації ще порівняно мало вивчено. Дослідження олігонуклеотидів в подібних станах, особливостей комплексоутворення низькомолекулярних біологічно активних речовин з нестандартними структурами і впливу зв'язаного ліганду на процеси взаємодії ДНК з регуляторними білками мають великий науковий і практичний інтерес, оскільки в багатьох випадках специфічність взаємодії біомолекул визначається, головним чином, їхньою просторовою конфігурацією, а не молекулярним складом. Найбільш детальну інформацію про структуру олігонуклеотидних комплексів і термодинаміку комплексоутворення у розчині дозволяють отримати засоби кореляційної одно- і двомірної ЯМР-спектросколії, тому вони були взяті в якості основних експериментальних методик для дослідження процесів комплексоутворення ароматичних лігандів з ДНК.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася у повній відповідності з планом науково-дослідних робіт кафедри фізики та хімії Севастопольського державного технічного університету в рамках держбюджетних НДР Міносвіти України: "Специфіка взаємодій лікувальних засобів з ДНК. Встановлення природи фізико-хімічних факторів, відповідальних за селективність зв'язування лікувальних засобів, які мають різні біологічні властивості, з наперед визначеними послідовностями ДНК” ("Комплекс”, “Комппекс-2“, 1997-99 рр., Координаційний план №16 Міносвіти України) і “Молекулярні основи протекторної дії кофеіну та його метаболітів як комплексоутворивачів-інтерцепторів ароматичних біологічно-активних речоеин” (“Ліганд”, 1998-2000 рр.), за програмою Міжнароднього наукового фонду (фонд Сороса) - Гранти № ио 7000, № ІЮ 7200, а

також за Договором про науково-технічну співдружність СевДТУ з департаментом хімії Беркбек коледжу Лондонського університету (Великобританія) на спільні наукові дослідження (19S3-98 pp., 1999-2004 pp. “Specificity of drug-nucleic acid interactions“) і за Міжнародним Грантом INTAS No 97-31753 (1999-2001 pp. "Design, synthesis and testing of novel biologicaily-acti'/e molecules as potential drugs with sequence-specific binding to nucleic acids")

Мета та задачі дослідження. Мета роботи - встановити основні кснформаціймі характеристики дезоксиолігонуклєотидіа різноманітної довжини і послідівності основ у ланцюзі, в тому числі самокомплементарних скта - і гексамерів і несамокомплементарного гептамеру, що містить паліндромиу послідовність основ і здатного утворювати компактну шпильку; вивчити особливості комплексоутворення ароматичних лігандів - фенантридінового барвника бромистого етідія і антрациклінового антибіотика дауноміцина з даними нуклеотидни-ми послідовностями; з'ясувати вплив вторинної' структури, нуклеотидного складу і послідівності основ в ланцюзі на процеси комплексоутворення молекул ароматичного ліганду і дезоксиолігонуклеотиду.

Для досягнення цієї мети були поставлені та вирішені такі задачі:

1. Розшифровка і віднесення сигналів магнітного резонансу протонів і ядер фосфору в одномірних і двомірних кореляційних спектрах водно-соляних розчинів молекул, що досліджуються, виявлення в спектрах ядерного ефекту Оверхаузера олігонуклеотидних комплексів характерних внутрі- і міжмолекулярних крос-піків та їх інтерпретація.

2. Вивчення процесів утворення вторинних струїстур молекул олігонуклеотидів різної довжини і послідовності основ, визначення якісних і кількісних характеристик, необхідних для аналізу молекулярної рівноваги у водно-соляному розчині ароматичного ліганду і олігонуклеотиду.

3. Розробка методик визначення структурних і термодинамічних параметрів утворення вторинних струїстур олігонуклеотидів та їх комплексоутворння з ароматичними лігандами у розчині за експериментальними залежностями протонних хімічних зсувів від концентрацій взаємодіючих молекул і температури.

4. Дослідження засобами ЯМР-спектроскопії комплексоутворення фенантридінового барвника бромистого етідію і протипухлинного антрациклінового антибіотика дауноміцину з дезоксигекса дезоксигепта - і дезоксиоктануклеотидами, встановлення основних типів комплексів, що утворюються, їх структурних параметрів і термодинамічних характеристик; аналіз фізико-хімічних взаємодій, відповідальних за селективність зв'язування ароматичних лігандів з дільницями ДНК.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше проведено дослідження водно-соляних розчинів дезоксиопігонуклеотидів різної довжини і послідівності основ у ланцюзі: несамокомплементарного дезоксигепта-нуклеотида, що містить дільницю з паліндромною поспідівністю, і самокомплементарних дезоксигекса - і дезоксиоктануклеотидів засобом одно- і двомірної'Н-ЯМР-спектроскопііі

з

двомірной гетероядерної кореляційної 1Н-3,Р-ЯМР-спектроскопії. Проведено віднесення сигналів магнітного резонансу протонів і ядер фосфору, і на основі аналізу спектрів ЯМР зроблено висноеох про переважне утворення шпилькової структури несамокомплементар-ного гептамеру і формування двоспіральних дуплексів самокомплементарних дезок-сиолігонукпеотидів у водному розчині.

2. Вперше вивчена взаємодія дезоксиолігонуклеотидів різноманітної вторинної структури з біологічно активними речовинами - фенантридіновим барвником бромистим етідісм і антрацикліновим антибіотиком дауноміцином у водно-соляному розчині. Виявлено особливості утворення комплексів ароматичних лігандів - барвника і антибіотика з олігонуклеоти-дами в залежності від співвідношення вхідних концентрацій взаємодіючих молекул і температури розчину.

3. Запропоновано методику розрахунку констант рівноваги реакцій утворення шпилькових і дуплексних структур олігонуклеотидів, а також реакцій комплексоутворення “олігонуклеотид-ліганд". Показано наявність складної рівноваги в розчині між різноманітними конформаційними станами олігонукпеотидних послідовностей: мономер-шпилька-димер для дезоксигептануклєотиду 5'-сЗ (врСрОрАрАрОрС) з паліндромною дільницею в ланцюзі і рівноваги “мономер-деоспиральний дуплекс" для самокомплементарних дезоксигексанукпеотидів 5'чі (СрСрТрАрСрО) і 5ЧІ(СрОрСрСрСрС), і дезоксиокта-нуклеотида 5'-сі(СрАрСрАрТрСрТрС). Визначено значення граничних протонних хімічних зсувів молекул дезоксиолігонуклеотидів в різних формах і в складі комплексів, рівноважних констант і термодинамічних параметрів реакцій утворення шпильки, самокомплементарних і несамокомплемектарних дуплексів та їх комплексів з бромистим етідісм і дауноміцином. Розраховано молекулярні структури інтеркальованих комплексів бромистого етідія і дау-номіцина з двоспиральними дільницями дезоксиолігонуклеотидів в різних конформаційних станах на сснові отриманих значень індукованих хімічних зсувів протонів лігандів в складі комплексів і даних 2М-КІОЕ.

4. Проведено порівняльний аналіз ролі різноманітних типів внутрі- і міжмолекулярних взаємодій в процесах комплексоутворення дезоксиолігонуклеотидів з ароматичними лігандами у розчині.

Практичне значення отриманих результатів. Матеріали дисертації поширюють і уточнюють уявлення про молекулярний механізм утворення стандартних і нестандартних вторинних структур ДНК, сиквенс-специфічности зв’язування ароматичних лігандів з оліго-нуклеотидами в різноманітних конформаційних станах. Отримані в роботі експериментальні і теоретичні результати можуть бути використані для встановлення загальних принципів відбіркової взаємодії біологічно активних речовин з генетичним матеріалом клітки і розуміння ролі нестандартних структур у функціонуванні молекули ДНК - носії генетичної інформації. Параметри комплексоутворення олігонуклеотидів різноманітної вторинної структури з фенантридіновим барвником бромистим етідіем, що має трипаноцидну дію, і протипухлинним антибіотиком дауноміцином - інгібітором синтезу ДНК і РНК, важливі при розробці речовин з заданими медико-біологічними властивостями.

Розроблені в дисертації методики можна застосовувати для дослідження процесів утворювання різноманітних вторинних структур олігонуклеотидів, в тому числі і з неком-плементарними послідовностями основ в ланцюзі, а також для визначення параметрів ксмплексоутвореиня опігомерів з біологічно активними речовинами у розчині.

Отримані результати і висновки дисертаційної роботи можуть бути використані при детальних дослідженнях процесів молекулярного "пізнавання" у біологічних системах, в особливості при розробці нових лікарських препаратів, специфічно взаємодіючих з структурними особливостями конформаційних станів нуклеїнових кислот.

, Особистий внесок здобувача: підбір, обробка та аналіз літературних даних; розшиф-ровка та ототожнення резонансних сигналів протонів і ядер фосфору в одно- та двомірних гомоядерних та гетероядерних кореляційних спектрах ЯМР розчинів досліджених молекул; виявлення внутрі- та міжмолекулярних кореляцій протонів молекул у комплексах та інтерпретація отриманих результатів; розробка моделей асоціації молекул у розчині; розрахунок лімітних значень протонних хімічних зсувів молекул у складі комплексів, рівноважних констант і термодинамічних параметрів комппексоутворення; участь у розробці методик розрахунків структурних параметрів молекулярних комплексів на основі даних ЯМР-спактросколії; розробка основних положень та висновок дисертарції.

Апробация результатів дисертації. Основні результати досліджень по темі дисертації були представлені та обговорені на:

,Ф 13-th International Meeting on NMR Spectroscopy (Exeter, Великобританія, 1S97),

0 British Biophysical Society Meeting on Structure, Function and Dynamics of Nucleic

Acids (Guildford, Великобританія, 1998),

0 14-th European Experimental NMR Conference (Bled, Slovenia, 1993),

0 II з'їзді Українського Біофізичного Товариства (Харьків, 1998),

о Conference (with international participants) on “Physics of Biological Systems”(Kiev,

1998);

0 14-th International meeting on NMR spectroscopy (Edinburgh, Великобританія, 1999).

0 II з'їзді біофізиків Росії (Москва, Росія, 1999).

Публікації. Основні результати дисертації викладені в 16 наукових працях, в тому числі в 8 статтях в наукових журналах і 8 тезах доповідей на національних та міжнародних конференціях.

Структура й обсяг дисертації: Робота складається із вступу, п’яти розділів, висновків, списку використаних джерел (294 найменування) і додатку. Повний обсяг дисертації складає 224 сторінки, з них додаток займає 31 стор., список використаних джерел -23 стор.. ілюстрації та таблици - 25 стор., текст містить 22 таблиць та 57 мал.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми, сформульовано мету і задачі дослідження, вказана новизна отриманих результатів, наведено основні положення роботи.

Розділ 1 присвячено огляду літератури по темі роботи. Викладено основні параметри та особливості вторинної структури нуклеїнових кислот у розчині. Особлива увага приділена дослідженню шпилькових структур ДНК. Проаналізовано літературні дані про процеси зв’язування олігонуклеотидів з ароматичними лігандами, інтеркалюючими у ДНК, зокрема, з фенантридіновим барвником - бромистим етідієм (ЄВ) і антрацикпіновим антибіотиком - дауноміцином (РАІІ), обговорено також прояви сіквенс-специфічности інтеркаляційного зв’язування ароматичних лігандів, структурні особливості комплексів, що утворяться у водно-соляному розчині, обгрунтовано висновок про доцільність використання в експериментах порівняно більш довгих нуклеотидних послідовностей.

В розділі 2 наведено опис принципів ЯМР-спекгроскопії. Розглянуто методи двомірної гомоядерної (2М-ТОСвУ та 2М-ЫОЕЭУ) і гетероядерної кореляційної спектроскопії (2М-НМВС), що надас детальну інформацію про зміни структурних параметрів взаємодіючих молекул, зокрема, дезоксиолігонуклеотиду та ароматичного ліганду, при комплексоутворенні у водному розчині. Наведено засоби приготування експериментальних зразків та умови проведення експериментів, а також базову методику віднесення резонансних сигналів в ЯМР-спектрах олігомерів ДНК.

Зразки олігомеріа ДНК 5'-сі (СрОрСрйрСрв), 5'-сі (СрЭрТрАрСрО, 541 (врСрОрАрАрврС) і 5ЧІ (брАрСрАрТрСрТрС) розчиняли у ОгО (99,95% 0), ліофілізували та розчиняли у дейтерірованому 0,1 М фосфатному буфері, рО 7,15, що містить 10ч М ЕДТА. Ароматичні ліганди ЕВ і ОАІІ також ліофілізували з ОгО і розчиняли у буфері. Концентрацію барвника і антибіотика визначали спектрофотометрично (£ЕВ=5860 М'’см1 і £оАи=11500 М ’см1, X =480 нм). Спектри ЯМР вимірювали на імпульсних спектрометрах з резонансними частотами 500 і 600 МГц (МЕОІ. йЭХ 600”, ‘Вгикег ОЯХ 500 і “Вгикег АМХ 600“). Вивчення залежності хімічних зсувів протонів молекул від співвідношення їх концентрацій у розчині проводили при декількох температурах. При титруванні підтримували постійною концентрацію ліганда. Температурні залежності хімічних зсувів протонів визначалися при постійному складі розчину. В процесі вимірів температура зразка стабілізувалась э похибкою ±1 К з допомогою терморегулятора ВУТ-ЗООО або ^ЕОІ. ІШ’-СУТЗ”. Всі ЯМР-експерименти виконано в умовах швидкою протонного хімічного обміну взаємодіючих молекул в тимчасовому масштабі ЯМР. Хімічні зсуви протонів вимірювали відносно сигналу ДСС. Мінімальний обсяг розчину - 5 мл. Досліджуємі зразки заздалегідь дегазували.

В розділі 3 наведено результати дослідження процесів самоасоціації у водному розчині самсксмплементарних гексамеріа 5'-сі(СрСрСрСрСрС), 5'-сІ(СрСрТрАрСрС), октамера 5ЧІ(СрАрСрАрТрСрТрС) і некомплементарного гептамера 5'-¿(ЄрСрСрАрАрбрС), що містить паліндромну послідовність. При ототожненні сигналів в спектрі 'Н-ЯМР дезоксиолігонуклеотидів по спектрам 2М-ТОСЗУ виявлено групи протонів,

зв'язаних спін-спіновою взаємодією (що належать окремій основі (Н5, HS), (СН3, Н6) або дезоксирібозному кільцю Н1', Н2',... Н5"), а по спектрам 2M-NOESY та 2М-НМВС проведено сіквенційне віднесення. Ароматичні протони H8G і Н5С/Н6С термінальних основ гуанина і цітозіна s досліджених послідовностях виявлено по меншому числу крос-піків МОЕ з протонами Н1’ дезоксирибози.

В спектрах 2M-N0E розчинів самошмплементарних дезоксиоліго-нуклеотидів спостерігаються досить інтенсивні крос-піки між протонами Н8 (риг)ІИВ фуг) основи і Н2' зв'язаного з ним дезоксирібозного кільця при порівняно низьких інтенсивностях крое-пікв між протонами Н8/Н6 і Н1\ що характерно для ашіи-конформації основ відносно цукрових кілець в дезоксиолігонукпеотидах. Крім того, для більшості цукрових залишків сигнали NOE між протонами Н1 ' і Н2” виявляються більш інтенсивними в порівнянні з крос-піками між Н1' і Н2’, що вказує на переважну конформацію S-типу (С2’-ендо) дезсжсирібози в ланцюзі. З цього можна стверджувати, що досліджусмі дуплекси гекса - і октамерів знаходяться в конформації близької до 8-форми. Аналіз гетероядерних 1Н-31Р двомірних спектрів да с додаткове підтвердження сіквенційному віднесенню сигналів протонів в 1Н-ЯМР-спектрзх гексамеріа, бо ядра фосфору виявляють ксрепяцй з протонами НЗ’ »-то та протонами Н4' і Н5', Н5" (/+-1)-го дезоксирібозних залишків. Спостерігаються також менші інтенсивності крос-піків Н4’-Р в порівнянні з крос-піками НЗ'-Р і Н5', Н5"-Р у зв'язку з більшою віддаленістю протонів Н4' від ядер фосфору.

В спектрі гептамера 5'-d (GCGAAGC) резонансний сигнал протона Н4'А4 с значно зміщеним в сильне поле. Подібні зміни характерні для неспарених нуклеотидів, які знаходяться в петлі шпилькової структури, що пов’язано з екрануванням протона дезоксирібози кільцевими струмами сусідньо) пуринової основи. Така конформація підтверджується крос-піком в спектрі 2M-NOE між протоном Н4'А4 та ароматичним протоном сусідньої основи Н8А5 і порушенням на дільниці GAA характерних для самокомплементарних дуплексів ДНК сікеєнційних контактів NOE між протонами основ і дезоксирібози. На підставі проведеного аналізу зроблено висновок про утворення в розчині компактної шпилькової структури 5'-d(GCGAAGC) з короткою GAA-петлею, стабілізуемою невірною G A-парою основ. При цьому для протонів нуклеотидів в стеблі короткої шпильки G1C2-G3C7 спостерігається співвідношення інтенсивностей крос-піків NOE, характерне для спіралі В-ДНК.

Експериментальні залежності протонних хімічних зсувів від концентрації1 та температури використано для розрахунку рівноважних констант (К) і термодинамічних параметрів (ентальпії лН° і ентропії AS0) реакцій утворення шпилькових і дуплексних форм гептамера у розчині (див. мал. 1 і табл. 1). Розрахунок виконано на підставі адитивної моделі парциальних внесків від протонів молекул олігомерів, які знаходяться у різних конформаційних станах. На мал. 2 наведено розрахункові залежності мольних часток мономера, шпильки і дімера від концентрації та температури розчину. З мал. 2 видно, що має місце складна рівновага різних конформаційних станів дезоксигептануклеотида 5'-d(GCGAAGC) у водному розчині.

Отримане значення &Ні° для шпильки, що складається з стебла з двома ЄС-парами, декілька менше (»20 %) по абсолютній величині теоретичного значення АН° знайденого по моделі "найближчого сусіда”. Це може бути пов'язано або з частковим порушенням спарювання С С-пари, яка знаходиться близько до петлі при малому розмірі стебла внаслідок напруженої структури короткого опігонуклеотиднго ланцюга. Значення дНа виявляється декілька більшим теоретичного для чотирьох нуклеотидних Є-С-пар. Це припускає, що в &Нц° певний внесок дас утворення невірних нуклеотидних (АС)-пар,

а)

ТО

т

«Д-

Мал. 1 - Реакції утворення Мал. 2 - Розрахункові залежності відносного складу шпильки - а) і дуплекса - 6} різних форм гелтамера 5'-с1(СССААСС) а)-від концентрації'

гептамеоа 5чі(СССААОС) при Т =298 К і б) - від температури при А/о=2,55-10'3 М;

розглянутих в роботі. 1-мономер, 2-шпилька, 3-дімер

Таблиця 1

Розрахункові значення К, ЛН° і АЙ0 реакцій утворення шпильки і дуплекса гелтамера 5'-с1(ОрСрСрАрАрОрС), Т=298 К

Параметр N+N«->N2

К 10л, ГІ/МОЛЬ 57,2±4,7 а] 113±18

-4Л°, кДж/моль 64,3±2,8 169±16

-ДЭ0, Дж/(моль К) 182±8 471±53

Примітка, а) - безрозмірна величина Самоасоціація самокомплементарних гекса - і октамера розглянута в рамках моделі двох станів; відповідні значення рівноважних констант і термодинамічних параметрів самоасоціації, розраховані по експериментальним концентраційним і температурним залежностям протонних хімічних зсувів олігомерів ДНК і по моделі "найближчого сусіда", наведено в табл. 2. З табл. 2 видно, що теоретичні і розраховані з експериментальних даних значення &С°, АН° і Л5° знаходяться в хорошій згоді, що вказує на порівняно невеликий дестабілізуючий ефект від розкриття термінальних ЄС-пар для гекса - і октамерів ДНК в означених умовах розчинника.

В розділі 4 наведено результати дослідження взаємодії ЕВ з гептамером 5'-сІ(СССААСС), і октамером б'-сі(САСАТОТС) у водному розчині. Аналіз спектрів 2М-ЫОЕ5У показав, що молекули бврвника переважно інтеркалюють в <і(С-С)-сайт двосліральних дільниць шпильки та дуплексу гелтамера і в піримідин-пуринові сі(С-А) - і сі(Т-А)-сайтьі

дуплекса октамера Для розрахунку констант і термодинамічних параметрів комплексоутворення ЕВ з олігомерами ДНК використано залежності хімічних зсувів необмінних э розчинником протонів фенантридінового хромофора барвника від концентрації дезоксиолігонуклеотида і температури розчину.

Таблиця 2

Розрахункові параметри (Кд, 10* л/моль; Гт, К; Л6д°; ДНь, кДж/моль; ДЭ*0, кДж/моль К)) для реакції самоасоціації гексамерів 5'-сі(С6ТАСС) і 5’-с1(СССССС) і октамера

5'-с1((дАСАТОТС), Г=298 К

Олігомєр Г<А Тт .... ^ .. . -А5

Роз рахунок по експериментальним даним

¿(СвТАСО 30,7±2,8 316+2 25,6±0,5 198±14 0,58±6

¿(СвСОСО (5,2±0,7)-10* 338±3 44,0±1,2 248±26 0,68+9

¿(ОАСАТСТС)^ 830+190 321+5 33,7±0,6 410±38 1,26±0,13

Розрахунок по моделі “найближчого сусід а"

¿(СвТАСО - 22,2 179 0,53

гі(СССССО - 48,5 242 0,65

¿{САСАТСТСГ1 - 29 390 1,2

Примітка, а) - значення термодинамічних параметрів на моль дуплекса.

Розроблена модель утворення комплексів враховує зв'язування одно- і двониткової форм гептамєра з однією молекулою бромистого етідія, а шпильки, вміст якої превалює у розчині, - з однією і двома молекулами барвника, у випадку ж октамера розглянуто реакції комплексоутворення ЕВ з дуплексом олігонуклеотида. Враховано, що в розчині має місце динамічна рівновага взаємодіючих молекул, включаючи процеси формування комплексів барвника з олігомером, а також реакції самоасоціації олігонуклеотида. Означені реакції наведено б табл. З, де Р - бромистий етідій, N. N1. і N2 - дезоксиолігонуклеотид в одноланцюговій, шпильковій та дуплексній формах, відповідно. Хімічні зсуви протонів барвника розраховувались з використанням адитивної моделі. Мольні частки ЕВ розраховувались за законом діючих мас, з урахуванням рівнянь матеріального балансу для олігомера і барвника. Залежність констант рівноваги (К) від температури виражалася через прирощення ентальпії і ентропії дБ0 в реакціях утворення відповідних комплексів: К(Т)=ехр(А^ІЯ-&5°ІЯТ), у припущенні, що їхні значення в даних експериментальних умовах не залежать суттєво від температури. Розрахунок значень означених величин проводився шляхом мінімізації квадратичного функціонала невязки експериментальних і розрахункових значень хімічних зсувів протонів ЕВ. З табл. З видно, що зв'язування ароматичного ліганда з виключно компактною шпильковою структурою ¿(СССААЄС) суттєво менше, ніж з конформаційно більш об’ємними структурами мономера

і дімера дезоксигептануклеотида.

Реакції комплексоутворення ЕВ з 5'-сі(САСАТ0ТС)2, відповідні розрахункові значення рівноважних констант і термодинамічні параметри реакцій наведено в табл. 3. Видно, що утворення 1:2 і 2:2 комплексів ЕВ з дуплексом значно переважає утворення комплексів 3:2 і 4:2, тобто К,>Кг»Кз>Кі. Відносно високі значення Кл і К2 відповідають переважному зв’язуванню першої і другої молекул барвника з руг-риг ( сі(С-А)- і й(Т-Є) ) дільницями октамерного дуплекса.

Таблиця З

Константи рівноваги К, (л/моль) і термодинамічні параметри AG0, дН° (кДж/моль), AS0 (Дж/(мольК)) комплексоутворення ЕВ з гептамером 5'-d(GCGAAGC) і ____________________охтамером 5'-d(GACATGTC) при 298 К_______ _______

Реакція утворення комплексу | К, 10’ -AG6 -ASC

EB+5'-d(GCGAAGC)

D+N DN 11,711,7 23,2+0,3 60,7±7,5 125124

D+NL<-^_>DNL 3,9±1,4 20,5±0,7 48,317,1 93122

D+N2< ^->DN; 17,7±1,9 24,2±0,3 69,5+3,8 152113

D+DNk K* > D2N2 0,51+0,16 15,4±0,7 37,9+9,4 75134

EB+5'-d(GACATGTC)

D+N; <-&-> DM; 718±65 33,4±3,3 47,8+2,5 48,417,5

d+dn2 <—^->d2n2 315+41 31,4+4,1 75,913,6 149126

d+d2n2 <-£*-> d3n2 47+7 26,6+4,0 99,813,6 245+43

D+DjNj <_iLi_>D«N2 18±4 24,315,4 86,3+4,2 208151

За значеннями констант було розраховано відносний вміст молекулярних комплексів у розчині в залежності від співвідношення початкових концентрацій олігонуклеотида і барвника (r=No!Do), аналіз яких показав, зокрема, що відносний вміст комплексів 1:1 бромистого етідія зі шпилькою досить швидко росте із збільшенням г в діапазоні 0<г<1,5, тому що вміст шпилькових структур превалює у розчині при низьких температурах і концентраціях. Аналіз динамічної' рівноваги утворення комплексів є необхідним, щоб встановити внесок кожного типу комплексу в хімічний зсув протонів і відповідно визначити лімітні значення хімічних зсувів протонів в цих комплексах, ідо дозволяє виявити структурні особливості асоціатів. По значенням лімітних значень хімічних зсувів протонів ЕВ в складі комплексів і даних 2M-NOE побудовано найбільш імовірні просторові структури інтеркальованих комплексів ЕВ зі шпилькою та дуплексом гептамера, що показано на мал. 4.

Структури 1:1 комплексу ЕВ зі стеблом шпильки і 1:2 комплексу з дуплексом гептамера (см. мап. 4) суттєво відрізняються конформаційними параметрами спірапи. Аналіз структур 2:2-комплексіз “октамер+ЕВ" показав, що вбудова другої молекули барвника призводить до зміни конформаційних параметрів спірапи інтеркальованих сайтів комплексів дуплекса октамера в порівнянні зі структурами 1:2 комплексів цих молекул.

Отримані значення термодинамічних параметрів для 1:2 і 2:2 комплексів ЕВ з окгамерним дуплексом добре узгоджуються з результатами калориметрічних досліджень зв’язування ЕВ з олігонуклеотидними дуплексами порівняної довжини. Розрахункові температурні залежності мольних часток різного типу комплексів ЕВ з октамером показано на мал. 5. Видно, що форми залежностей для 1:2, 2:2 і 3:2 комплексів ЕВ з окгамерним дуплексом аналогічні типовим “кривим плавлення” двоспіральних олігонуклеотидв. Розрахунки також показали, що наступне інтеркапяційне зв’язування ЕВ з окгамерним дуплексом відбувається антикооперативно і дестабілізує спіральну структуру.

Мал. 4 - Розрахункова структура дільниці комплексів ЕВ з гептамером 5Ч1(СС<ЗАА6С): а) вбудова ЕВ в с1(С-С)-сайт стебла шпильки, вигляд збоку. Хромофор і фенольне кільце ЕВ заштриховано; б) - вид згори; е) - дільниця комплексу 1:2 ЕВ з дуплексом гептамера, відповідний інтєркаляції барвника в с!(С-С)-еайт, вид на комплекс з боку широкої' борозні спіральной дільниці; г) - вид згори. Стрілка вказує напрям до широкої борозні дуплекса

Розділ 5 присвячено дослідженню взаємодії гексамерів і гептамера ДНК з антрацикліновим антибіотиком - дауноміцином. Аналіз отриманих в спектрах ЯМР змішаних з антибіотиком розчинів дезоксигексануклеотидів значень характерних констант спін-спіновой взаємодії протонів дезоксирибози та співвідношень інтенсивностей крос-піків NOE показав, що дуплекси гексамерів при комплексоутворенні з DAU у розчині зберігають конформацію цукрофосфатного кістяка, близьку до 6-формі ДНК. На основі міжмолекулярних NOE-контактів, що спостерігаються, і змін хімічних зсувів ядер фосфору 31Р зроблено висновок про переважне встроювання хромофора антибіотика в термінальні піримідин-пуринові d(C-G)-caü™ дезоксигексанукпео-тидів. В спектрах 2M-NOESY і 2М-НМВС розчинів DAU з гептамером 5'-d(GCGAAGC) виявлено суттєві різниці в порівнянні з аналогічними спектрами розчинів ЕВ з гептамером. Враховуючи, що гептамер в розчині знаходиться в основному у формі шпильки, цей експериментальний факт вказує на різний характер перебудови гептамера при інтєркаляції барвника і антибіотика в 5'-d{G-C)-caítT стебла короткої шпильки.

Мал. 5 - Відносний склад

молекулярних комплексів (1) ЕВ з октамером 5'<І(САСАтеТС), у розчині в залежності від

температури при Оо=1,15 мМ і Л/2=1,21 мМ

На основі експериментальних концентраційних і температурних залежностей хімічних зсувів протонів антибіотика у змішаному розчині розраховано лімітні значення протонних хімічних зсувів ліганда в складі комплексів з дезоктаолігонукпеотидами, я» знаходяться у різних конформаційних станах, а також рівноважні константи і термодинамічні параметри реакцій комплексоутворення (див. табл. 4). З табл. 4 видно, що комплексоутворення другої молекули DAU з гексамерами носить антикооперативний характер, що пов’язано з певними стеричними перешкодами, створюваними масивним позитивно зарядженим аміноцукровим кільцем антибіотика у малій борозні подвійної спіралі дуплекса. Порівняння значень констант К2 при зв'язуванні DAU з 5’-d(CGTACG)2 і 5'-d(CGCGCG)2 показує, що триплет, який містить дві сусідні C-G-пари, фланковані АТ-лзрою в послідовності d(CGTACG), є більш переважною дільницею зв'язування DAU з дуплексом ДНК, ніж триплет з трьома послідовними C-G-парами основ в гексамері d(CGCGCG).

Таблиця 4

Рівноважні константи (К, л/моль) і термодинамічни параметри (aG0, АН0, кДж/моль, AS0, Дж/(моль К)) при комплексоу творенні DAU з гексамерами 5'-d(CGTACG), __________________5'-d(CGCGCG) і гептамером 5'-d(GCGAAGC) ________________^___

Реакція «,10^ -A G° -AH0 -AS°

DAU+5'-d(CGTACG)

D+N<-fr- >DN 22+4 27 + 4 160 ±20 450 ± 56

P+N2<- ->dn2 69001500 40 + 4 53 ± 6 45 + 16

D+DN«—£2—>D2N 36+6 28 ±5 91 ±11 210 + 28

d+dn2<-^-»d2n2 33±5 26 + 7 42 ±6 51 ±10

DAU+5'-d(CGCGCG)

D+N <- Ai > DN 68+9 30 + 6 175± 24 484 ±51

D+N2 <-*» > D N2 2200І280 38 ±4 38 + 11 201 ± 33

D+DN <■ >D2M 3,142,8 21 ±24 88 ±13 225 ± 34

d+dn2<—ía_>d2n2 49±12 28 + 8 43 ±5 50 ±14

DAU + 5'-d(GCGAAGC)

D+N > DN 48+8 27+3 81 ±8 179+19

D+NL < -a'J. »DNl 72+12 28+3 99+10 237±22

d+n2<—^->dn2 3100±360 37±2 58+12 69±13

По розрахованим значенням лімітних хімічних зсувів ніобмінних протонів антибіотика і даних 2M-NOE побудовано просторові структури молекулярних комплексів "DAU+олігомер". На мал. 6, як приклад, наведено розраховану структуру інтеркальованого 1:2 комплексу DAU з d(CGCGCG)2. З мал. 6 видно, що хромофор антибіотика орієнтований практично перпендикулярно повздовжній осі пар основ в інтеркальованому сайті, а аміноцукрове кільце розташоване в малій борозні двоспірального дуплекса, частково перекриває третю пару основ. Така орієнтація хромофора DAU суттєво відрізняється від розташування хромофора барвника ЕВ в інтеркальованому комплексі (мал. 4).

Рев рахункові конформаційні

параметри спіралі на дільницях інтеркаляції ЕВ і DAU вказують, зокрема, на значну відмінність значень кутів закрутки дуплекса: «15° і = 35°, відповідно, тобто зв'язування DAU практично не змінює цзй параметр дуплекса. Розраховані структури молекулярних комплексів в розчині добре узгоджуються із структурами, отриманими кристалографічними засобами.

Аналіз значень ентропії і ентальпії комплексоутворення DAU з дуплексами гексамерів, що досліджувалися, вказує на суттєву роль гідрофобних взаємодій, які впливають на характер

Мал. 6 - Розрахункова просторова структура 1:2 специфічного звязування антибіотика.

комплексу DAU з 5"-d(CGCGCG): З - вид на інтер- Можна відзначити також, що

кальований комплекс (триплетна дільниця зв'язування дауноміцина з гептамером

d(CGC)) збоку; хромофор і аміноцукрове кільце ¿(GCGAAGC) виявляє дестабілзуючий антибіотика заштриховано; g вид на термінальну '

й(СЄ)-дільницю згори, що показує взаємне вплив на компактну шпилькову розташування азотистих основ і хромофора DAU структуру, як і у випадку комплексові .2 комплексі утворення шпильки з бромистим

етідіем. Подібний ефект спостерігає-ться і при комплексоутворенні гексамерів з декількома молекулами антибіотика у розчині.

ВИСНОВКИ

1. Методом одномірно? і двомірної гомоядерної (’Н) та гетероядерної (1Н-31Р) кореляційної ЯМР-спектроскопії (500/600 МГц) вивчено конформаційні властивості самоком-плементарних дезоксигексануклеотидів 5чі(СрСрСрСрСрЄ) і 5'-й (СрОрТрАрСрС), дезок-сиоктануклеотида 5'-сі(СрАрСрАрТрЄрТрС) і несамокомплементарного дезоксигепта-нукпеогида 5'-с1(СрСрСрАрАрСрС), що містить паліндромну послідовність в ланцюзі, а також процеси комплексоутворення вказаних опігомерів ДНК з ароматичними лігандами -фенантридіновим барвником бромистим етідіем і антрацикліновим антибіотиком дауно-міцином у водному розчині.

2. Виявлено, що для несамокомплементарного дезоксигептануклеотида 5’-d(GpCpGpApApGpC) спостерігається складна рівновага у розчині, включаючи одноланцю-гову, шпилькову і дуплексну (з невірним спарюванням основ) форми гептамеру.

13 -

3. Встановлено, що стебло шпильки гептамеру, що складається з двох пар основ, приймає конформацію близьку до В-формиДНК.

4. Показано, що хромофор фенантридінового барвника здебільшого інтеркалює в пу-рин-піримідиновий 5'-<і(6-С)-сайт стебла шпильки і дуплекса гептамеру 5'-сІ(СрСрСрАрАрСрС).

5. Вперше побудовано просторові структури інтеркальованих комплексів бромистого етідію з вС-сайтами шпилькової' і дімерної форм дезоксигептанукпеотида 5'-¿(СрСрСрАрАрСрС) у водному розчині, які характеризуються різноманітними конформа-ційними параметрами спіралі.

6. Встановлено, що бромистий етідій переважно інтеркалюе в піримідин-пуринові 5'-сІ(С-А) - і 5’кі(Т-С)-сайти самокомплементарного октамеру 5'ч1(СрАрСрАрТрСрТрС), при цьому зв'язування молекул барвника з олігонукпеотедним дуплексам відбувається антикооперативно.

7. Порівняльний аналіз розрахованих структур 1:2 і 2:2 комплексів бромистого етідію з 5’-сі(САСАТСТС)2 у розчині свідчить про взаємний вплив зв'язаних молекул барвника на параметри подвійної спіралі в інтеркапьованих піримідин-пуринових сайтах дуплекса октамеру.

8. Встановлено, що склад молекулярних комплексів досліджених дезокеиолігонуклео-тидів з барвником бромистим етідіем і антибіотиком дауноміцином залежить від співвідношення вхідних концентрацій олігонуклеотиду та ліганду і температури розчину.

9. Встановлено, що дауноміцин переважно інтеркалюе у термінальний 5'чі{С-С)-сайт дезоксигексануклеотидів 5'-сІ(СрСрСрСрСрС) і 5'-с!(СрСрТрАрСрС), при цьому аміно-цукрове кільце антибіотику розташовується у малій борозні гексамерного дуплекса, частково перекривуючи третю пару основ.

10. Кількісний аналіз комплексоутворення дауноміцину з дезоксигексанукпеотадами 5'-д(СрСрСрСрСрС) і 5'-с)(СрСрТрАрСрв) свідчить про переважне зв'язування антибіотика з триплетною нуклеотидною поелідівністю, що містить дві сусідні Сб-пари, фланковані АТ-парою, в Б'-сІ(СрСрТрАрСрС) у порівнянні з триплетом, що містить три послідовні СЄ-пари, в гексамері 5'-с1(СрСрСрСрСрС). Показано, що гідрофобні взаємодії1 аміноцукрового залишку антибіотика в малій борозні подвійної спіралі ДНК вносять основний внесок у переважне зв'язування молекули ліганду.

11. Виявлено, що дауноміцин виявляє певну специфічність зв'язування з гі(СрС)-сайтом в однониткових послідовностях досліджених дезоксигексануклеотидів.

12. Розраховано найбільш імовірні просторові структури 1:2 комплексів дауноміцин-£)(СССССС)2 і дауноміцин-сКСЄТАСвЬ у водному розчині, які добре узгоджуються з структурами подібних комплексів, визначених засобами рентгеноструктурного аналізу кристалічних зразків.

13. Виявлено, що зв'язування бромистого етідію і дауноміцина впливає дестабілізуюче на шпилькову структуру, що формується дезоксигептануклеотидом 5ЧІ(СрСрСрАрАрСрС), при цьому встановлено суттєву різницю в характері структурних змін гептамера при ком-ппексоутворенні з цими лігандами.

14. Визначено термодинамічні параметри - вільна енергія Гіббса, ентальпія, ентропія і рівноважні константи комплексоутворення барвника і антибіотика з дослідженими олігоме-рами ДНК; зроблено порівняльний аналіз впливу міжмолекулярних взасмодій на процеси комплексоутворення ароматичних лігандів з дезоксиолігонукпеотидами у водному розчині.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАН ИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Davies D.B., Pahomov V.I., Veselkov A.N. NMR determination of the conformational and drug binding properties of the DNA heptamer d(GpCpGpApApGpC) in aqueous solution//NucIeic Acids Reseach.-1997.-V.25, N.22.-P.4523-4531.

2. Веселков A.H., Пахомов В.И., Барановский С.Ф., Дзвис Д.Б. Анализ конформаци-онных состояний олигонуклеотида с палиндромной последівательностью 5'-d(GpCpGpApApGpC) методом 1Н-ЯМР-спектроскопииШолекулярн. биология.-1997.-Т.31, №6.-0.1036-1042.

3. Веселков А.Н., Пахомов В.И., Дымант Л.Н., Барановский С.Ф., Такер А., Дэвис Д. Исследівание комплексообразования бромистого этидия с палиндромной последівательностью 5'-d(GpCpGpApApGpC) в водном растворе методом 1Н-ЯМР-спектроскопии//Молекулярн. биопогия.-1998.-Т. 32, №4.-С. 639-648.

4. Pahomov V.I., Davies D.B., Veselkov A.N. Thermodynamical analysis by ’H NMR of the complexation of ethidium bromide to a DNA octamer, 5'-d(GpApCpApTpGpTpC), in aqueous solution//BicHHK ХДУ, № 434. Біофізичний вісник. -1999, № 3. - С. 7-14.

5. Веселков АН., Дымант Л.Н., Пахомов В.И., Осетров С.Г., Такер А., Дэвис Д. Б. Анализ взаимодействия бромистого этидия с октамером ДНК S'-d(GpApCpApTpGpTpC) в водном растворе по данным 1Н ЯМР спектроскопии II Ж. Структ. Химии.-1999.-Т. 40, №2. -С. 265-275.

6. Веселков А.К, Осетров С.Г., Пахомов В.И., Веселкова Н.В., Дэвис Д.Б. Самоас-социация молекул дезоксиолигонуклеотида d(GpApCpApTpGpTpC) в водном растворе: термодинамический анализ образования дуплекса октамера по данным 1Н-ЯМР//Биополимеры и клетка.-1998.-Т.14, №3.-0.184-190.

7. Пахомов В.И., Веселков А.Н. Термодинамические параметры самоассоци-ации дезоксиолигонуклеотидів 5'-d(GCGAAGC) и 5'-d(GACATGTC) в водном растворе // Вестник СевГТУ (экология).-1999.-№ 16.-С. 3-8.

8. Vesetkov A.N., Pahomov V.I., Baranovsky S.F., Davies D.B. 1H NMR analysis of the binding of ethidium bromide to a very stable DNA hairpin loopII Book of Abstracts 13-th Intern. Meeting on NMR Spectroscopy. - Exeter (UK), 1997. - P.57.

S. Davies D.B., Baranovsky S.F., Pahomov V.I., Djimant L.N., Veselkov A.N. ’H NMR structural and thermodynamical analysis of the binding of an aromatic drug, ethidium bromide, to a DNA octamer // Book of Abstracts 13-th Intern. Meeting on NMR Spectroscopy. - Exeter (UK), 1997.-P.58.

10. Veselkov A. N., Pahomov V.I., Djimant L. N.. Davies D. B. 1H NMR structural and thermodynamical analysis of the complexation of etidium bromide to a DNA octamer, 5'-

d(GpApCpApTpGpTpC), in aqueous solution // Abstract Book of 14-th European Experimental NMR Conference. - Bled (Slovenia), 1938. - P. 199.

11. Пахомов B.I., Димант Л.Н., Веселков OH. Структурний та термодинамічний аналіз комплексоутворення ароматичного лиганду з октамером ДНК у водному розині // Тези доповідей II зїзду Українського біофізичного товариства. - Харьків, -1998. - С. 28.

12. Pahomov V.I., Davies D.B., Veselkov A.N. Conformational properties of deoxy-oligonucieotide with palindromic nucleotide sequence and its complexation with aromatic ligand in aqueous solution U Abstracts of the conference (with international participants) on “Physics of Biological Systems".-Kiev,-1998.-P. 41.

13. Eaton R.J., Davies D.B., Pahomov V.I., Djimant L.N., Veselkov A.N. NMR Analysis of the binding of daunomycin with DNA hexamers // Book of abstracts of 14-th International meeting on NMR spectroscopy.- Edinburgh (UK), 1999.-P. 20.

■ 14. Veselkov A.N., Pahomov V.I., Baranovsky S.F., Djimant L.N., Simanin A.V., Davies D.B. NMR analysis of binding of daunomycin to DNA hairpin // Book of abstracts of 14-th International meeting on NMR spectroscopy. - Edinburgh (UK), 1999. - P. 21.

15. Пахомов В.И., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. ЯМР-анализ комплексосбразова-ния ароматических лигандів с гептануклеотидом 5'-d(GpCpGpApApGpC) в водном растворе // Тезисы докладів 11-го съезда биофизиков России. - Москва, - 1999. - С. 146.

16. Веселков А.Н., Пахомов В.И., Итон Р. Дж., Дэвис Д.Б. ЯМР-исследование самоассо-циации молекул дезоксигексгнуклеотидов 5'-d(CpGpCpGpCpG) и 5'-d(CpGpTpApCpG) в водном растворе// Биофизика.-2000.-Т. 45, №1.-С. 20-26.

АНОТАЦІЯ

Пахомов В.І. Шпилькові й дуплексні форми дезоксиолігонуклєотидів та їх комплекси з ароматичними лігандами у водному розчині. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна. м. Харків, 2000.

Методами кореляційної ’Н-1Н (2M-TOCSY, 2M-NOESY) та 1Н-Э1Р (2М-НМВС) ЯМР-спектроскопії (500 і 600 МГц) досліджено самоасоціацію і комплексоутворення гвкса-, геп-та- і сктамеров ДНК з ароматичними лігандами - бромистим етідісм та дауноміцином в залежності від нукпеотідної послідовності і особливостей вторинної структури (дуплекс, шпилька) у водному розчині. На основі концентраційних та температурних залежностей протонних хімічних зсувів і розроблених моделей складної рівноваги у розчині визначено рівноважні константи і термодинамічні параметри реакції самоасоціації та комппексоутво-рення, розраховано відносний вміст різного типу комплексів в залежності від концентрації олігомеру і ліганду та температури. Виходячи з даних 2M-NOE і розрахованих лімітних значень хімічних зсувів протонів лігандів, побудовано просторові структури молекулярних комплексів. Зроблено висновки про сіквенс-специфічність інтеркаляційного зв’язування ароматичних лігандів та про характер сил, стабілізуючих комплекси.

Ключові слова: дезоксиолігонуклеотіди, шпилька ДНК, самоасоціація, комплексоутворення, бромистий етідій, дауноміцин, інтеркапяція, термодинамічни параметри, ЯМР-спектроскопія, молекулярна структура

АННОТАЦИЯ

Пахом08 В. И. Шпилечные и дуплексные формы дезоксиолигонуклеотидов и их комплексы с ароматическими лигандами в водном растворе. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. * Харковский национальный университет им. В.Н. Каразина. г. Харьков, 2000.

Методами корреляционной *Н-1Н (2M-TOCSY, 2M-NOESY) и 'Н-Э,Р (2М-НМВС) ЯМР-спектроскопии (500 и 600 МГц) исследованы самоассоциация и комплексообразование гекса-, гепта- и октамеров ДНК с ароматическими лигандами - бромистым этидием и дау-момицином е зависимости от нуклеотидной последовательности и особенностей вторичной структуры (дуплекс, шпилька) в водном растворе. На основе концентрационных и температурных зависимостей протонных химических сдвигов и разработанных моделей сложного равновесия в растворе определены равновесные константы и термодинамические параметры реакций самоассоциации и комплексообразования, рассчитано относительное содержание комплексов в зависимости от концентраций олигомера и лиганда и температуры. Исходя из данных 2M-NOE и рассчитанных предельных значений химических сдвигов протонов лигандов, построены пространственные структуры молекулярных комплексов. Сделаны выводы о сиквенс-специфичности интеркаляционного связывания ароматических лигандов с дезошлолигонуклеотидами и характере сил, стабилизирующих комплексы.

Ключевые слова: дезоксиолигонуклеотиды, шпилька ДНК, самоассоциация, комплек-сообразование, бромистый этидий, дауномицин, мнтеркаляция, термодинамические параметры, ЯМ Р-спектроскопия, молекулярная струетура

SUMMARY

Pahomov V. I. Hairpin and duplex forms of deoxyoligonucieotldes and their complexes with aromatic ligands in aqueous solution. - Manuscript

Thesis fof a Candidate’s degree of Physical and Mathematical Sciences in Biophyslcs-Speciality 03.00.02 Kharkov National University, Kharkov, 2000

Homonuclear 1H-1H (2D-TOCSY and 2D-NOESY) and heteronuclear (1H-3!P) correlation NMR spectroscopy (500/600 MHz) has been used to investigate self-association of DNA hexam-ers 5’-d(CpGpCpGpCpG) and 5'-d(CpGpTpApCpG), heptamer 5'-d(GpCpGpApApGpC) with palindromic sequence and octamer 5'-d(GpApCpApTpGpTpC). and their complexation with aromatic ligands, the phenathridinium dye, ethidium bromide, and the anthracycline antibiotic, ’

daunomycin, intercalating into DNA. The DMA heptamer forms a very stable hairpin structure, containing a GCGC stem and a tri-nucleotide (GAA) loop.

The reaction constants and thermodynamic parameters of self-association of the deoxyoligonucleotides have been determined from analysis of the dependence of proton chemical shifts on concentration and temperature. Self-association of the hexamers and the octamer has been analysed using two-state model (“monomer-duplex”). The obtained parameters of self-association of deoxyhexanucleotides are in good agreement with theoretical calculations using 'nearest neighbour" model. Analysis of the experimental results shows that there are different conformational states of the heptanuclsotide molecules in aqueous solution; the equilibrium includes the single-stranded random coil, hairpin and a bulged duplex.

The equilibrium constants and thermodynamic parameters (enthalpies, entropies) of the binding of the deoxyoligonucleotides with the drugs have been determined using the concentration and temperature dependences of chemical shifts of nonexchangeable protons of the ligand in the mixture with the oligomer. Calculation of the relative amounts of the different complexes reveals important features of the dynamic equilibrium of both temperature and the ratio of the drug and the oligomer concentrations.

The calculated values of equilibrium constants and the results of homonuclear (2D NOESY) and heteronuclear 1H-31P 2D NMR spectroscopy have revealed the preferred sites of the ligands binding with the deoxyoligonucleotide sequences. The relatively high magnitudes of the constants of 1:2 and 2:2 complex formation between ethidium bromide and the octamer are consistent with complexation of the first and the second drug molecules being preferred to the pyr-pur sites [d(CA) and d(TG)] of the deoxyoligonucleotide duplex. It has been also shown that successive intercalative binding of ethidium bromide to the octamer duplex destabilises the helical structure, presumably due to unwinding of the helix by the drug. Analysis of the binding of daunomycin to the hexamers shows that drug molecule intercalates preferentially into the terminal d(CpG) site of each of the hexanucleotides and that the aminosugar of the antibiotic is situated in the minor groove of the hexamer duplex, partly eclipsing the third base pair. It is found that there is an apparent site-specificity on drug binding with a triplet nucleotide sequence containing two adjacent C-G base pairs flanked by an A-T base pair in the 5'-d(CGTACG) hexamer over a triplet with three successive C-G base pairs as In 5'-d(CGCGCG). The major reason for the preferential binding of daunomycin is found to stem from hydrophobic interactions of its aminosugar moiety in the minor groove of the double helix. It has been shown that successive binding of the drug molecules both to hexa- and octanucleotide monomer and duplex is anti-cooperative. Comparative analysis of the binding of the ethidium bromide and daunomycin with the DNA oligomers is discussed. The most favourable structures of molecular complexes has been calculated in terms of helix conformational parameters taking into consideration the intermolecular NOE contacts in conjunction with the determined values of induced chemical shifts of ligand protons in the intercalated complex.

Key words: deoxyoligonucleotides, hairpin of DNA, self-association, complexation, ethidium bromide, daunomycin, intercalation, thermodynamical parameters, NMR-spectroscopy, molecular structure

.. ПАХОМОВ Валерій Івокентійович

'Шпилькові й дуплексні форми дезоксиолігонукпеотидіа та їх комплекси з ароматичними лігандам1/! у водному розчині*

Підписано до друку /2.ЙГ2000 р. Формат 60x601/16 Друк офсетний. Умови,-др.арк. 1,5.

Тираж 100 прим. Зам.

Видавництво "СевДТУ”, Севастополь, 53, Стрілецка бухта, Студмістечко, НМЦ