Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный механизм сиквенс-специфичности связывания ароматического лиганда с короткими одноцепочечными фрагментами ДНК в водном растворе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный механизм сиквенс-специфичности связывания ароматического лиганда с короткими одноцепочечными фрагментами ДНК в водном растворе"

ХАРЬКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

. ПЕТРЕНКО НАТАЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

' и »4

*:: :>

"'■*" 1«;0 УДК 577.113

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ СИКВЕНС- СПЕЦИФИЧНОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ АРОМАТИЧЕСКОГО ЛИГАНДА С КОРОТКИМИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫМИ ФРАГМЕНТАМИ ДНК В ВОДНОМ

РАСТВОРЕ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ХАРЬКОВ 1998

Диссертацией является рукопись.

Работа выполнена в Севастопольском государственном техническом университете Министерства образования Украины

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор Веселков Алексей Никонович, Севастопольский государственный технический университет, директор департамента физики и химии

Официальные оппоненты:

1. Доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник Семенов Михаил Алексеевич, Институт радиофизики и электроники HAH Украины, г. Харьков, ведущий научный сотрудник

2. Кандидат физико-математических наук Зозуля Виктор Николаевич, Физико-технический институт низких температур HAH Украины, г. Харьков, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, г. Киев

Защита состоится " ^" ^ 199 ^ года в ^^ часов на заседании специализированного ученого совета Д 02.02.13 Харьковского государственного университета, 310077, г. Харьков, пл. Свободы, 4

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Харьковского государственного университета

Автореферат разослан " ^^" ^^ 199^ года

Ученый секретарь

специализированного ученого совета, кандидат биологических наук ^

Гаташ С.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение поведения одноцепочечной ДНК (ввДИК) в растворе важно доя понимания процессов передачи генетической информации и репликации ДНК. Известно, что в некоторых бактериофагах молекула ДНК существует в виде одноцепочечной структуры. Результаты исследований, проведенных в последнее время, свидетельствуют о высоком сродстве и избирательном связывании ароматических лигандов - антибиотика актиномицина Б и акридиновых красителей с вэДИК. Для прогнозирования медико-биологических свойств антибиотиков и целенаправленной разработки новых лекарственных средств, для понимания механизма функционирования антибиотиков на молекулярном уровне необходимо использование различных теоретических и экспериментальных методов исследования. Одним из наиболее эффективных экспериментальных методов для изучения молекулярных комплексов в растворе является ЯМР-спектроскопия. На основе метода ЯМР-спектроскопии, который по информативности в настоящее время сравним с рентгеноспруктурным анализом, установлены структуры ряда комплексов биологически активных веществ с самокомплементарными олиго-нуклеотидными последовательностями. Вместе с тем, практически отсутствуют в литературе данные по комплексообразованию лигандов с одноцепочечными фрагментами нуклеиновых кислот. Это связано с тем, что в разбавленном водно-солевом растворе ббДНК может находиться в различных конформационных состояниях, в частности, наряду с внутримолекулярными связями между азотистыми основаниями в одноцепочечной ДНК могут возникать и межмолекулярные связи. Один из путей решения этой проблемы - использование модельных соединений - сравнительно коротких несамокомплементарных дезокситетрануклеотидов различной последовательности оснований в цепи. Экспериментально установлено, что специфичность связывания ароматических лигандов с нативной ДНК проявляется уже на коротких самокомплементарных олигонуклеотидах, включающих в себя соответствующий участок. Следовательно, можно ожидать, что необходимые энергетические и структурные характеристики комплекса лигандов с звДНК в растворе могут быть выявлены путем изучения их взаимодействия с малыми фрагментами одноцепочечных нуклеиновых кислот - несамокомплементарными олигонуклеотидами заданной последовательности оснований.

Цель исследования, проведенного в диссертационной работе - установить основные закономерности интеркаляционного взаимодействия ароматического лиганда бромистого этидия с одноцепочечными дезокситетрануклеотидами различной последовательности оснований в водно-солевом растворе. Вьшснить влияние нуклеотидного состава и последовательности оснований в цепи на особенности процессовкомплексообразования ароматического лиганда и ввДНК. Для достижения поставленной цели решались задачи: расшифровки и отнесения сигналов протонов в одномерных и двумерных спектрах растворов некомплементарных дезокси-тетрануклеотидов и бромистого этидия; изучения закономерностей самоассоциации ароматических лигандов, одноцепочечных дезокситетрануклеотидов различной последовательности оснований; разработки методик определения структурных и термодинамических параметров ассоциации и комплексообразования ароматического лиганда с некомплементарными олигонуклеотидами на основе концентрационных и температурных зависимостей протонных химических сдвигов; изучения комплексообразования фенантридинового красителя бромистого этидия с одноцепочечными тётрамерами различного нуклеотидного состава и последовательности оснований в цепи, установление основных типов образующихся комплексов, их структуры и 'термодинамических характеристик; анализа характера физико-химических взаимодействии, ответственных за селективность связывания ароматического красителя с одноцепочечными компонентами нуклеиновых кислот. : .,.

Научная новизна определяется результатами, входящими в основные положения, выносимые на защиту: - впервые на основе использования методов одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии проведено комплексное и систематическое исследование взаимодействия в водном растворе типичного интеркалятора бромистого этидия со специально синтезированными синтетическими несамоком-плементарными дезокситетрануклеотидами различной последовательности оснований в цепи; - показано, что содержание различного типа комплексов в растворе существенно зависит от соотношения исходных концентраций взаимодействующих молекул и последовательности оснований в цепи несамокомплементарных дезокси-тетрануклеотидов. Степень связывания бромистого этидия с одноцепочечными молекулами теггрануклеотидов зависит от нуклеотидного состава, последовательности оснований в цепи, а также от типа нуклеотидов, фланкирующих участки прёймуще-

ственной посадки красителя; - разработана методика расчета структур комплексов красителя с одноцепочечными тетрануклеотидами по предельным значениям протонных химических сдвигов взаимодействующих молекул. Определены пространственные структуры 1:1 и 2:1 комплексов бромистого этидия с одноцепочечными дезокситетрануклеотидами, проведен сравнительный анализ геометрических особенностей комплексов молекул в растворе; - разработана методика определения термодинамических параметров комплексообразования ароматического лиганда с дезоксиолигонуклеотидами, основанная на температурных зависимостях протонных химических сдвигов красителя в водном растворе, позволяющая дифференцированно определить вклады различного типа реакций в суммарные тепловые и энтропийные эффекты. Определены термодинамические параметры (свободные энергии Гиббса, энтальпии и энтропии) реакций комплексообразования бромистого этидия с несамокомплементарными дезокситетрануклеотидами <1(ААСС), ¿(ОАЛв), <1<ССАА) и <3(СГСА) в водном растворе, сделан вывод о характере физико-химических взаимодействий, ответственных за селективность связывания красителя с различными сайтами исследованных одноцепочечных последовательностей.

Научная и практическая ценность работы. Полученные в работе экспериментальные и теоретические результаты углубляют существующие представления о взаимодействии биологически активных низкомолекулярных веществ с генетическим материалом клетки. Многие низкомолекулярные ароматические лиганды обладают химиотерапевтическими свойствами, в том числе и антиканцерогенной активностью, в частности, бромистый этидий обладает трипаноцидными свойствами. Для выяснения механизма селективного связывания ароматических лигандов с од-ноцепочечной ДНК изучено комплексообразование типичного интеркалятора бромистого этидия с модельными несамокомплементарными олигонуклеотидными последовательностями, отличающимися нуклеотидным составом и последовательностью оснований в цепи. Такие исследования важны для выяснения роли лигандов в процессе транскрипции и репликации ДНК. Использование методов одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии позволило выполнить детальный анализ структурных и термодинамических характеристик комплексообразования одноцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот с фенантридиновым красителем в растворе. Исследования показали, что характерные особенности взаимодействия молекул.

специфика связывания бромистого этидия с определенными участками одноцепо-чечных нуклеиновых кислот проявляется уже на коротких нуклеотидных последовательностях. Подобные исследования важны для понимания молекулярных механизмов взаимодействия нуклеиновых кислот с белками и другими биологически важными соединениями, для установления общих принципов избирательного взаимодействия лигандов с генетическим материалом оеггки.

Конкретный вклад диссертанта: подбор, обработка и анализ литературных данных; постановка научной задачи, выбор и реализация аналитических и численных методов ее решения; расшифровка и отнесение сигналов протонов в одномерных и двумерных спектрах растворов исследуемых молекул; участие в разработке методик определения структурных и термодинамических параметров ассоциации и комплексообразования молекул на основе концентрационных и температурных за-висимотей протонных химических сдвигов; анализ и интерпретация полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты исследований, вошедших в диссертацию были представлены и обсуждены на: семинаре Химического общества им. Д.И. Менделеева "Молекулярная физика и биофизика вощых систем", г. Санкт-Петербург, 1995 г.; семинарах департамента физики и химии СевГТУ, г. Севастополь, (1994 - 1997); Международной научной конференции, посвященной 150-летию рождения И.Пулюя, г. Тернополь, май, 1995; Международной конференции по эк-периментальной ЯМР-спектроскопии, г. Париж, Франция, май, 1996; 12 биофизическом съезде, Амстердам, Голландия, август, 1996; XIII Нацюнально! Школи-Семшару з м1жнародною участю "Спектроскопия молекул та кристалш", м. Суми, квггень, 1997; 13 Международная конференция по ЯМР-спектроскопии, г. Эксетер, Великобритания, июль, 1997. Тезисы перечисленных докладов опубликованы.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура диссертаций. Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы, включающего 210 наименований. Материал изложен на 183 страницах, содержит 33 таблицы и 44 рисунка.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность исследования, изложены его цель и задачи, указана новизна полученных результатов, их научная и практическая ценность. Даны сведения об апробации работы.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ С ОДНОЦЕПОЧЕЧ-НЫМИ И ДВУХСПИРАЛЬНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ В РАСТВОРЕ

В первом разделе, имеющем обзорный характер, приведены экспериментальные и теоретические данные о структуре и кокформационных состояниях нуклеиновых кислот и их компонентов, равновесной самоассоциации коротких нуклеотидных последовательностей и ароматических молекул красителей, ком-плексообразовании олигонуклеотидов с ароматическими молекулами красителей и антибиотиков. В первом подразделе приведено описание пространственной структуры нуклеотидных цепей и геометрии пар оснований в нуклеотидной последовательности. Рассмотрены результаты изучения конформации молекулы денатурированной ДНК ( в$ДНК ) в растворе. Отмечаются сложности проведения подобных исследований, связанные с возможностью образования внутри- и межмолекулярных водородных связей между основаниями ДНК. Обсуждаются также исследования по изучению конформации одноцепочечных гомополимеров в водном растворе. Второй подраздел включает в себя обзор литературных данных по параметрам самоассоциации ароматических лигандов и олигонуклеотидов, структурным характеристикам образующихся ассоциатов и их стабильности. Рассмотрены результаты исследований термодинамики образования ассоциатов олигонуклеотидов различных последовательностей оснований в цепи, полученных оптическими методами и методами ЯМР-спектроскопии. В третьем подразделе представлены результаты работ по комплексообразованию ароматических лигандов с одно- и двух-цепочечными олигонуклеотидными последовательностями в растворе. Рассмотрены модели интеркаляционного связывания ароматического лиганда с двухспиральной молекулой ДНК и "частично интеркалированного связывания" с бйДНК. Проанализированы имеющиеся в литературе данные о селективности связывания лигандов

с фрагментами ДНК. Сделан вывод о том, что: несамокомплементарные олиго-нуклеотидные последовательности могут служить в качестве модели вэДИК; для выяснения роли физико-химических факторов в механизме избирательного связывания лиганда с вэДНК необходимо иметь количественную информацию о параметрах образования и структурных характрисгиках различного типа молекулярных комплексов красителей с некомплементарными дезокситетрануклеотидами в растворе.

ОСНОВЫ СПЕКТРОСКОПИИ И ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

Во втором разделе рассмотрены физические основы теории импульсной ЯМР-спектроскопии, теоретические концепции интерпретации химических сдвигов и методика получения и обработки спектров протонного магнитного резонанса. Показана целесообразность использования в настоящей работе методик 2М-С08У, 2М-ТОСБУ и 2М-ГЮЕ5У. Рассмотрены возможности расчета структур интеркаляционных комплексов по данных ядерного эффекта Оверхаузера (КОЕ). Приведены сведения об объектах исследования и условиях проведения эксперимента.

ИССЛЕДОВАНИЕ САМОАССОЦИАЦИИ МОЛЕКУЛ НЕКОМПЛЕМЕНТАРНЫХ ДЕЗОКСИТЕТРАНУКЛЕОТИДОВ РАЗЛИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОСНОВАНИЙ В ВОДНОМ РАСТВОРЕ

Отнесение сигналов в спектрах ПМР одноцепочечных тетрануклеотидов 5'-а(ААОС), 5'-с1(ОААО), 5'чЗ(СОАА) и 5'-с1(СТОА) получено на основании двумерных гомоядерных ТОСБУ и ЫОЕБУ- экспериментов. Использована модель двух состояний для анализа ассоциации молекул в растворе. На основе изучения концентрационных и температурных зависимостей протонных химических сдвигов молекул определены структурные и термодинамические параметры самоассоциации несамокомплементарных дезокситетрануклеотидов в водном растворе. Значения равновесных констант ассоциации некомплементарных тетрануклеотидов, полученные в результате расчетов, представлены в табл. 1.

Таблица 1

Термодинамические параметры и равновесные константы самоассоциации некомплементарных дезокситетрануклеотидов в водном растворе (рО=7. !5)

тетра- К, л/моль 1 метод расчета 2 метод расчета

нуклеотид (Т=298 К) ДН, Д5(298), ДС(298), ДН, Д8(29в>,

кД ж/моль Дж/молмК кД ж/моль кД ж/моль Дж/моль*К

а(СОАА)

23,4 ±6,8 -(38,9+2,0) -(104,4+6,0) -(7,8+0,7) -(40,8+2,5) -(109,5+5,5)

¿(ААСЗС)

¿(СТО А) 8,2 + 3,5 -(31,9+0,6) -(89,6+1,6) -(5,2+1,2) -(35,5+2,5) -(98,2+4,0)

сКСААО 4,0 + 0,8 -(18,5±6,1) -(50,7+19,0) -(3,4±0,5) -(19,5+4,0) -(64,6+8,1)

Наблюдаемые различия в параметрах самоассоциации молекул связаны с возможностью специфического спаривания оснований (пары С-в и А-Т) при "скольжении" нитей тетрануклеотидов 5'-с1(ААОС), 5'-с1(ССАА) и 5'-с1(СТСА) друг относительно друга (рис. 1).

5 А

И

Рис.1. Схематическое представление димерных комплексов некомплемеитарных дезокситетрануклеотидов.

Полученные значения термодинамических параметров реакций самоассоциации тетрануклеотидов в растворе подтверждают, что термодинамическая

стабильность коротких фрагментов нуклеиновых кислот существенно зависит от состава и последовательности оснований в нуклеотидной цепи (см. табл. 1).

ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ ФЕНАНТРИДИНОВОГО КРАСИТЕЛЯ С НЕКОМПЛЕМЕНТАРНЫМИ ТЕТРАНУКЛЕОТИДАМИ РАЗЛИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОСНОВАНИЙ

Изложены результаты исследования комплексообразования фенантриди-нового красителя бромистого этидия (ЭБ) с несамокомплементарными дезокси-тетрануклеотидами 5'-¿(ДАОС), 5'-с1(ОААС), 5'-<1(ССАА) и 5'-с1(СТСА), отличающихся составом и последовательностью оснований в цепи.Это дает возможность сравнительного анализа сиквенс-специфичности связывания лиганда с различными сайтами нуклеотидных последовательностей.

Для количественного анализа взаимодействия красителя с некомплементарным дезокситетрануклеотидом рассмотрена следующая схема образования молекулярных ассоциатов в растворе:

где К,/, равновесные константы димеризации красителя и тетрануклеотида в растворе; К.1, Кг, Кз - равновесные константы образования компелекса 1:1 красителя с одиночной нитью (ОН) и 1:2 комплекса красителя с дуплексом тетрануклеотида, а также образования комплекса 2:1 двух молекул красителя с одиночной нитью (ЭгИ) соответственно. При расчете по этой схеме наблюдаемый протонный химический сдвиг в молекулах красителя представляется в виде:

д+в< к" >вг Ш + В< Кг >/уУ

г

(О

5 = £> / Д, (5,„ + + К, /V 61 + 2К, К7 // £> 62 +К{ Кз№5з), (2)

где По - исходная молярная концентрация красителя ; И к N - равновесные молярные концентрации мономеров бромистого этидия и тетрануклеотидов соот-

ветственно. Величины 5„„ А'^и ЛГд, озпределены независимым образом (см. раздел 3) при исследовании самоассоциации красителя и тетрануклеотидов в тех же условиях растворителя. Равновесные константы К\ ч- К} и предельные химические сдвиги 5| .-9- 6з соответствующих комплексов находились как параметры модели (2). Полученные значения предельных химических сдвигов в комплексах и рано-весные константы комплексообразования бромистого этидия с некоиплементар-ными дезокситетрануклеотидами в водном растворе при Т = 298 К представлены в табл. 2.

Таблица 2

Расчетные значения параметров (5, млн1; К, 103 л/моль) комплексообразования бромистого этидия с некомплементарными дезокситетрануклеотидами в водном растворе при Т= 298 К, рБ = 7.15

ЭБ*5'-<1(СрСрАрА)

Протон 5> 5г 5з &тл К! К2 Кз

Н1 7.87 8.19 7.97 8.69

НЮ 7.90 8.06 7.87 8.63

Н9 7.01 7.31 7.04 7.66 (20.0+1.9) (11.312.1) (6.6±1.8)

Н4 6.84 7.18 6.86 7.55

Н2 6.71 7.15 6.90 7.48

Н7 5.96 6.35 5.85 6.67

ЭБ+5'ч1(АрАрСрС)

Н1 7.99 8.22 7.94 8.6 9

НЮ 7.95 8.13 7.89 8.63

Н9 7.16 7.36 7.07 7.66 (17.6+3.2) (6.97+0.97) (5.9510.75)

Н4 6.89 7.29 6.92 7.55

Н2 6.87 7.23 6.84 7.48

Н7 6.11 6.37 5.98 6.67

ЭБ+5'-<1(СрТрСрА)

Н1 7.76 8.16 8.08 8.69

НЮ 7.84 8.04 7.88 8.63

Н9 6.90 7.27 6.94 7.66 (17.011.5) (3.3+1.7) (2.911.4)

Н4 6.83 7.09 6.86 7.55

Н2 6.82 7.03 6.88 7.48

Н7 5.97 6.09 5.72 6.67

ЭБ+5'-<ЦСрАрАрС)

Н1 8.03 8.15 7.98 8.69

НЮ 8.00 8.06 7.92 8.63

Н9 7.34 7.36 7.25 7.66 (2.010.47) (1.7510.35) (1.13+0.32)

Н4 7.08 7.32 7.20 7.55

Н2 7.15 7.26 7.14 7.48

Н7 6.04 6.46 6.31 6.67

При комплексообразовании ЭБ с одноцепочечным тетрануклёотидом £1(<ЗААС), величина К\ приблизительно на порядок меньше в сравнении с константами других изученных несамокомплементарных тетрануклеотидов. Связывание второй молекулы бромистого этидия с одиночной нитью тетрануклеотидов ¿(ААСЗС), ¿(СвАА) и ¿(СГСА), содержащих чередующиеся типы оснований, имет антикооперативный характер. Вместе с тем, связывание двух молекул ЭБ в в пурин-пуриновые сайты одиночной нити тетракуклеотида <1(СААС) происходит с примерно одинаковой вероятностью.

Расчеты показывают, что вклад в общее равновесие различного типа комплексов определяется не только значениями равновесных констант реакций, но и зависит существенно от соотношения исходных концентраций тетрануклео-тида и лиганда (г = И01 В0) (рис. 2).

С/Во

Рис. 2. Относительное содержание молекулярных комплексов в растворе для дезокситетрануклеотида ¿(СТСА) в зависимости от г-^/БоПрч До =1,15 «Ю-3 моль / л, Т = 298 К.

Структуры комплексов. Анализ структур комплексов бромистого этидия с несамокомплементарными тетрануклеотидами проводили на основании рассчитанных предельных значений протонных химических сдвигов и данных 2М- ]ЧОЕ8У. Использовали модифицированную модель эквивалентных диполей, полученную в результате аппроксимации квантово-механических кривых экранирования для оснований нуклеиновых кислот.

На рис.3 представлена в различных проекциях рассчитанная наиболее вероятная структура участка комплекса ЭБ с тетрануклеотидом <3(СТСА), отвечающая одному из возможных способов связывания красителя в (ТС)-сайте тет-рамера.

Рис. 3. Расчетная структура комплекса 1 : 1 бромистого этидия с 5'-с1(СрТрОрА), соответствующая встраиванию красителя в с!(ТО)-сайг одноцепочечного тетрануклеотида со стороны ароматического кольца, содержащего протоны Н2 и Н4:

а). - вид на комплекс сбоку. Молекула красителя заштрихована;

б). - вид на СГО)-сайт со встроенным красителем сверху, показывающий взаимное расположение плоскостей оснований и хромофора бромистого этидия в 1:1 комплексе.

Структуры рассчитанных комплексов ЭБ с исследованными дезокситетрануклео-тидами характеризуются параметрами спирали, представленными в табл. 3.

Таблица 3

Конформационные параметры спирали в частично интеркалированных

комплексах бромистого этидия с исследованными дезокситетрануклеотидами

Комплекс 1: 1

Тетрамер CGAA AAGC CTGA GAAG

Сайт CG GC TG AG

D?. - rise 0.64 (им) 0.65 (HM) 0.61 (HM) 0.71 (hm)

Q - twist 28.5° 18.0° 14.2° 13.7°

о - propel 5.0° 5.0° 0.5° -4.8°

т-tilt 0.0° 0.0° 0.2° 2.9°

Dx - shift - 0.08 (HM) 0.15 (HM) - 0.05 (HM) - 0.04 (HM)

Dy - slide 0.20 (HM) 0.06 (HM) -0.01 (HM) 0.06 (HM)

p - roll 3.5° 1.5° 5.5° 1.5°

К - buckle 3.0° 3.0° -1.5° 5.0°

Обращает на себя внимание уменьшение расстояния между основаниями нуклеотидов (Dz) и увеличение угла закручивания (Q) по сравнению с интерка-лированными 1 : 2 комплексами красителях дуплексами самокомплементарных дезокситетрануклеотидов.

ТЕРМОДИНАМИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АРОМАТИЧЕСКОГО ЛИГАН-ДА С ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК

В пятом разделе с целью определения термодинамических характеристик реакций комплексообразования изучены температурные зависимости химических сдвигов протонов молекул в смешанном растворе бромистого этидия с не-самокомплементарными дезокситетрануклеотидами 5'-d(AAGC), 5'-d(GAAG), 5'-d(CGAA) и S'-d(CTGA) в тех же условиях растворителя, что и при концентрационных измерениях (см. раздел 4). Для количественной оценки термодинамических параметров реакций образования каждого типа комплекса необходимо установить зависимость их мольных долей от температуры. Это было сделано с использованием аддитивной модели, в которой наблюдаемый химический сдвиг протонов красителя определяется суммой вкладов от мономерной и димерной форм, а также от вклада молекул ЭБ в составе I : I, 1 : 2 и 2 : I комплексов с тет-рануклеотидами.

8t(T) = fJT)Smi+/d(T)Sdi+fj/JT)Sti (3)

К = 1

В этой модели влияние температуры на значение 8 учитывается тем, что мольные доли /к (к — 1, 2,3), однозначно связанные с равновесными константами КI -s- K~j образования комплексов, являются функцией температуры. Определение температурных зависимостей для констант равновесия позволяет найти термодинамические параметры комплексообразования -Л H (энтальпия) и Д S (энтропия) для различных типов комплексов. Величины Д H и Д S рассчитыыва-лись двумя различными способами.

Способ 1. Расчетная методика предусматривает применение параметрических регрессионных уравнений для описания зависимости мольных долей от температу-

ры. Равновесные константы комплексообразования Ki - К\ при различных температурах были рассчитаны из найденных значений мольных долей с использованием закона сохранения массы и законов действия масс для рассматриваемых реакций. Для оценки энтальпии и энтропии реакций образования комплексов ЭБ с некомплементарными тетрануклеотидами в растворе использовали формализм Вант-Гоффа.

Способ 2. Согласно этому способу для расчета термодинамических параметров ассоциации используется соотношение (2) для наблюдаемого химического сдвига протонов красителя в растворе с некомплементарным тетрануклеотидом, в котором константы реакций комплексообразований К\ - Аз, а также реакций диме-ризации красителя Kd, входящие в (2), определяются через соответствующие термодинамические параметры Д5°° и АНа:

К(Т) = ехр [ ( А5° / Л ) - ( А.Н° / RT)] (4)

в предположении, что величины &S° и АН° Fie зависят существенным образом от температуры в исследованном диапазоне температур. Термодинамические параметры димеризации ЭБ ASf и АН/ находятся из независимых экспериментов в идентичных экспериментальных условиях. Из табл. 4 видно, что все рассматриваемые реакции комплексообразования ЭБ с некомплементарными дезокситет-рануклеотидами являются экзотермическими. Обращает на себя внимание существенно меньшие (примерно в два раза) значения термодинамических параметров реакций взаимодействия бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом d(GAAG), содержащим только пуриновые основания в цепи, в сравнении с тет-рамерами d(CTGA), d(AAGC) и d(CGAA), содержащими чередующиеся типы оснований в последовательностях. Встраивание второй молекулы бромистого этидия при формировании 2 : 1 комплекса с одноцепочечными несамокомпле-ментарными тетрануклеотидами d(CTGA), d(CGAA) и d(AAGC) отвечает менее благоприятной свободной энергии связывания в сравнении с ДG реакции комплексообразования первой молекулы красителя.

Таблица 4

Термодинамические параметры комплексообразования ЭБ с некомплементарными дезокситетрануклеотидами (рВ=7.15)

Тетранук- Тип 1 способ расчета II способ расчета

леотид комп- -ДО, -ДН, -ДБ, -ДН", -ДБ',

лекса кДж/моль кДж/моль Дж/моль.К кДж/моль Дж/моль.К

(298 К) (298 К)

1 1 (24.3 + 0.4) (86 + 4) (207113) (8816) (211118)

5'-с1(ССАА) 2 1 (22.7 1 0.8) (6316) (136 + 20) (66 ±6) (144114)

1 2 (21.510.9) (6919) (158 + 33) (66 ±5) , (148117)

1 1 (23.810.7) (8013) (189110) (85 ±5) (2041 17)

5'-<1(АА вС) 2 1 (21.710.3) (60117) (129 1 56) (57 ±6) (118124)

1 2 (21.2 + 0.7) (63120) (139 + 66) (5617) (116 + 28)

1 1 (24.110.2) (99+10) (253133) (88±9) (214123)

,5'-<1(СГСА) 2 1 (20.4+1.1) (70+12) (167137) (6717) (156+18)

1 2 (19.4+2.1) (66 ± 5) (155126) (5818) (130+26)

I 1 (18.710.9) (4519) (105130) (54+ 10) (1181 14)

5'-сЗ(СААО 2 1 (18.310.8) (47+ 13) (95 ± 27) (611 11) (1431 16)

1 2 (1711) (3418) (56 ± 14) - -

Проведенный термодинамический анализ позволяет заключить, что на-

блюдаемые термодинамические параметры реакций взаимодействия бромистого этидия с одноцепочечными дезокситетрануклеотидами, в основном, определяется взаимодействиями Ван-дер-Ваальса и электростатическими, а также конформа-ционными изменениями в олигонуклеотиде.

ВЫВОДЫ

В заключение сформулированы основные результаты и выводы, полученные в диссертационной работе:

1. Изучение процессов самоассоциации молекул несамокомплементарных дезокситетрануклеотидов 5'- с!(ААОС), 5'- <1(ОААО), 5'- с!(ССАА) и 5'-<1(СТОА) показало, что величины равновесных констант, а соответственно и значения свободной энергии Гиббса реакций димеризации существенно отличаются для тет-рануклеотидов различных последовательностей оснований; вероятность образования димерного комплекса для несамокомплементарных теграмеров существенно выше в том случае, когда существует возможность спаривания отдельных оснований в димерных ассоциатах, термическая стабильность которых убывает в следующем ряду: с!(ССАА)2 * <1(ААСС)2 > ¿(СЛЧЗА^ » <1(СААС)2; значения

термодинамических параметров подтверждают роль состава оснований для реакций димеризации некомплементарных тетрамеров в водном растворе.

2. Установлено преимущественное взаимодействие бромистого этидия с пиримидин-пуриновыми сайтами одноцепочечной тетрануклеотидной последовательности, однако, различия в сродстве связывания красителя с сайтами, содержащими чередующиеся типы оснований (Св, ОС, ТО) в одноцепочечной последовательности много меньше в сравнении с дуплексными структурами самокомплементарных тетрамеров. Обнаружена значительно меньшая вероятность связывания бромистого этидия с сайтами одноцепочечных последовательностей, содержащих одинаковые' типы оснований (пурин-пуриновые или пиримидин-пиримидиновые) в цепи.

3. Предложен метод расчета экранирования протонов бромистого этидия парами азотистых оснований в интеркалированном комплексе на основе модели эквивалентного диполя и квантово-механических кривых экранирования. Проведен анализ влияния трансляционных и угловых конформационных параметров спирали на экранирование протонов красителя в интеркалированном комплексе.

4. Разработана методика расчета структур комплексов красителя с одно-цепочечными последовательностями на основе рассчитанных предельных значений протонных химических сдвигов взаимодействующих молекул и данных 2М-МОЕ спектров. Впервые построены наиболее вероятные пространственные структуры комплексов 1:1 бромистого этидия с одноцепочечными дезокситетра-нуклеотидами, установлены геометрические особенности комплексов молекул и проведен их сравнительный анализ.

5. Показано, что содержание в растворе различных типов комплексов "тетрануклеотид-лиганд" зависит от температуры раствора, соотношения исходных концентраций взаимодействующих молекул и последовательности оснований в несамокомплементарном дезокситетрануклеотиде.

6. Определены термодинамические параметры (энтальпия АН, энтропия А5 и свободная энергия Гиббса АО) реакций образования комплексов 1:1,1: 2, 2 : I бромистого этидия с несамокомплементарными дезокситетрануклеогидами 5'- ¿(ААСС), 5'- <1(ОААС), 5'- сЗ(СОАА) и 5'-<1(СТОА) в водном растворе. Проведенный анализ позволяет заключить, что наблюдаемые термодинамические

параметры реакций взаимодействия бромистого этидия с одноцепочечными дез-окситетрануклеотидами, в основном, определяется взаимодействиями Ван-дер-Ваальса и электростатическими, а также конформационными изменениями в олигонуклеотиде.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Весеяков А.Н., Барановский С.Ф., Петренко Н.В., Осетров С.Г., Весел-ков Д.А., Дымант JI.H., Такер А., Паркес X., Дэвис Д. Исследование самоассоциации молекул некомплементарных дезокситетрануклеотидов различной последовательности оснований в водном растворе методом 1 Н-ЯМР спектроскопии // Биополимеры и клетка,- 1996.-Т. 12.- N 4,- С. 38-48.

2. Весеяков А.Н., Барановский С.Ф., Дымант JI.H., Петренко Н.В., Осетров С.Г., Такер А., Дэвис Д. Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(CpGpApA) в водном растворе методом 'Н ЯМР спектроскопии // Биополимеры и клетка,- 1996.- T.I2.- N 6, С. 36-49.

3. Веселков А.Н., Завьялова О.С., Петренко Н.В., Дымант JI.H., Дэвис Д.. Экранирующее влияние нуклеотидных пар на протоны интеркалированного красителя бромистого этидия при различных конформационных состояниях олиго-нуклеотидного дуплекса. // Биофизика.-I997.-T. 41, вып. 1, - С. 243-244 (статья полностью депонирована в ВИНИТИ, N 3026-В96 от 14.10.1996 г.)

4. Веселков А.Н., Барановский С.Ф., Дымант JI.H., Петренко Н.В., Веселков Д.А., Такер А., Дэвис Д. Комплексообразование бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(ApApGpC) // Модекуляр. биология.-1996.- Т. 31, N 2, С. 263-273.

. 5. Veselkov A.N., BaranovsKy S. F., Djimant L.N., PetrenKO N. V., Davies D. Self-association of non-complementary deoxytetranucleotides in aqueous solution // Progress in Biophysics &Molecular Biology.- 1996,- v. 65, NSl.- P. 106.

..,,., 6. Барановский С.Ф., Дымант Л.Н., Осетров С.Г., Петренко H.В., Паркес X., Дэвис Д., Веселков А.Н. Исследование комплексообразования бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(GpApApG) в водном растворе методом 'Н-ЯМР спектроскопии. // Ж. структ. химии,- 1997,- Т. 38,-N4,-С.

7. Веселков А.Н., Барановский С.Ф., Дымант Л.Н., Петренко Н.В., Осетров С.Г., Веселков Д.А., Паркес X., Дэвнс Д. Исследование комплексообразова-ния ароматического красителя бромистого этидия с одноцепочечным некомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-<1(СрТрСрА) в водном растворе методом 'Н ЯМР спектроскопии II Биофизика,- 1997.- Т.41,- N 5.

В. Веселков А.Н., Барановский С.Ф. , Дымант Л.Н., Петренко Н.В., Веселков Д.А., Такер А., Дэвис Д.. Термодинамика взаимодействия ароматического лиганда с одноцепочечной ДНК: анализ комплексообразования бромистого этидия с некомплементарными изомерными дезокситетрануклеотидами 5'-с1(СОАА) и 5'- <}(ААСС) по данным 'Н ЯМР//Биополимеры и клетка.- 1997.- Т. 13.-N2. - С. 100-107.

9. Барановский С.Ф., Дымант Л.Н., Петренко Н.В., Веселков Д.А., Такер А., Дэвис Д., Веселков А.Н. Термодинамический анализ взаимодействия бромистого этидия с одноцепочечными некомплементарными дезокситетрануклеотидами 5'- с1(СГСА) и 5'- <3(СААС) по данным 'Н ЯМР.// Химическая физика-1997.-Т 17.

АНОТАЦ1Я

Петренко Н.В. Молекулярний механизм сиквенс-специф1чносп зв'язування ароматичного Л1'ганду з короткими одноланцюговими фрагментами ДНК у водному розчиш. -Рукопис.

Дисертащ'я на здобуття наукового ступенякандидата ф1зико-математичних наук з спещ'альносп 03.00.02 - бюфвика - Севастопольський державний техшчний университет, м. Севастополь, 1997.

Методами одном1рно1 та двомфноУ (2М-ЫОЕБУ 1 гМ-ТОСЭУ) 'Н ЯМР-спектроскопп (500/600 МГц) у розчиш вивчено комплексоутворення фенан-тридшового барвника бром1стого етдаю з одноланцюговими несамокомплемен-тарними дезокситетрануклеотидами 5'-<1(ААОС), 5'-<1(СААО), 5,-d(CGAA), 5'-ё(СГСА) рпного нуклеотщного складу та посшдовносп. Розроблено методику розрахунюв параметр!в взаемода ароматичного л!ганду з тетрануклеотщами у водно-соляному розчиш I визначено термодинам1чш та структурш параметри комплексоутворення молекул. Встаповлено переважну взаемод1ю ЕБ з тр1м1шн-

пуриновими дшянками одноланцюгово'1 послщовностк Розробдено методику розрахунюв структур та побудовано найбшьш ¡мов1рш просторов! структури 1: 1 комплекав барвника з одноланцюговими послщовностями. На основ! запропо-нованоТ методики визначено термодинамьчш параметри ентальпп, ентропй" та вшьно!' енергп Пббса для комплекав 1:1,2:111:2 ЕБ з несамокомплементар-нимн дезокситетрануклеотщами. Анал1з показуе, що зв'язування ЕБ с одноланцюговими дезокситетрануклеотщами, в основному, визначаеться взаемод1ями Вак-дер-Ваальса та електростатичними, а також конформацшними змжами в ол!гонуклеот1Д1.

Ключов1 слова: ЯМР-спектроскошя, самоасощащя, комплексоутворення, бро-М1стий етщш (ЕБ), несамокомплементарний дезокситетрануклеотщ, Х1м1чник зсув, р^вноважш константа, термодинам!чш параметри.

Петренко Н.В. Молекулярный механизм сиквенс-специфичности связывания ароматического лиганда с короткими одноцепочечными фрагментами ДНК в водном растворе. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. -Севастопольский государственный технический университет, г. Севастополь, 1997.

Методами одномерной и двумерной (2М- МОЕБУ и 2М-ТОС8У) 'Н-ЯМР спектроскопии (500/600 МГц) в растворе изучено комплексообразование фенан-тридинового красителя бромистого этидия с одноцепочечными несамокомпле-ментарными дезокситетрануклеотидами 5'-<1(ААСС), 5'-<1(ОААС), 5'-ё(ССАА) и 5'-<1(СТОА) различного нуклеотидного состава и последовательности. Разработана методика расчета параметров взаимодействия ароматического лиганда с тетрануклеотидами в водно-солевом растворе и определены термодинамические и структурные параметры комплексообразования молекул. Установлено преимущественное взаимодействие ЭБ с пиримидин-пуриновыми участками одно-цепочечной последовательности. Разработана методика расчета структур и построены наиболее вероятные пространственные структуры 1 : 1 комплексов красителя с одноцепочечными последовательностями. Определены на основе предложенной методики термодинамические параметры - энтальпии, энтропии и свободные энергии Гиббса для комплексов 1: 1, 2 : 1 и 1 : 2 ЭБ с несамокомплемен-

тарными дезокситетрануклеотидами. Анализ показывает, что связывание ЭБ с одноцепочечными дезокситетрануклеотидами, в основном, определяется взаимодействиями Ван-дер-Ваальса и электростатическими, а также конформационны-ми изменениями в олигонуклеотиде.

Ключевые слова: ЯМР-спектроскопия, самоассоциация, комплексообра-зование, бромистый этидий (ЭБ), несамокомплементарный дезокситетрануклео-тид, химический сдвиг, равновесные константы, термодинамические параметры.

Petrenko N.V. Molecular mechanism of sequence-specific binding of aromatic ligand with short fragments of DNA in aqueous solution. - Manuscript.

Thesis for a Candidate's degree of Physical and Mathematical Sciences in Biophysics-Speciality 03.00.02. Sevastopol State Technical University, Sevastopol, 1997.

Complex formation between phenanthridine drug ethidium bromide (EB) and single - stranded non - self - complementary deoxytetranucleotides 5'-d(AAGC), 5'-d(GAAG), 5'-d(CGAA), 5'-d(CTGA) of different nucleotide content and base sequence has been investigated using one-dimensional and two-dimensional (2M-NOESY and 2M-TOCSY) 500/600 MHz 'H-NMR spectroscopy. A method of calculation of parameters of complex formation between aromatic ligand and tetranucleotides in aqueous salt solution has been developed; thermodynamical and structural parameters of molecules complexation have been determined. It has been found that EB binds preferentially to the pyrimidine-purine sites of single stranded deoxytetranucleotides in solution. A method of calculation of the structures of the complexes between drug and single strands has been developed and the most favourable spatial structures of 1 . 1 complexes of EB with single-stranded deoxytetranucleotides have been constructed. The thermodynamical parameters -enthalpies, entropies and Gibbs free energies for 1: 1,2: 1 and 1 : 2 complexes between EB and deoxytetranucleotides have been determined, based on the method developed in the work. Analysis has shown that binding of EB to single stranded deoxytetranucleotides is mainly determined by van der Waals and electrostatic interactions and also by changes in the conformations of the oligonucleotide.

Key words: NMR-spectroscopy, self-association, complexation, ethidium bromide (EB), non-self-complementary deoxyteranucleotide, chemical shift, equilibrium constants, thermodynamical parameters.