Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие ароматических лигандов с олигонуклеотидами заданных последовательностей

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие ароматических лигандов с олигонуклеотидами заданных последовательностей"

(

\

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

_05_

- : На правах рукописи

ЗАВЬЯЛОВА Оксана Стефановна

УДК 577.113 : 541.49

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ С ОЛИГО-НУКЛЕОТИДАМИ ЗАДАННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

(03.00.02 - биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва, 1997

Работа выполнена в департаменте физики и химии Севастопольского государственного технического университета.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор Веселков А.Н.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Полтев В.И.

кандидат биологических наук, доцент Тимофеев К.Н.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Защита состоится -ЛХСЬ{___199 в 15 часов 30 минут

на заседании диссертационного Совета К 053.05.68 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьёвы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " -тч '

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор

/

/

Гуляев Б.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Одной из важных проблем современной молекулярной биофизики является установление закономерностей взаимодействия нуклеиновых кислот с биологически активными веществами. С решением этой задачи связано, в частности, совершенствование существующих и создание новых препаратов, способных направленно подавлять размножение вирусов и рост опухолевых клеток путем специфического связывания с теми нуклеотидными последовательностями в ДНК и РНК, которые характерны для вирусов и трансформируемых клеток. Наибольший интерес с точки зрения физики нуклеиновых кислот и их возможных конформационных изменений представляет интеркаляционное связывание ароматических лигандов с двойной спиралью ДНК. Несмотря на то, что к настоящему времени опубликовано большое число научных работ, посвященных изучению особенностей взаимодействия ароматических лигандов с нуклеиновыми кислотами, остается ряд нерешенных вопросов, связанных, например, с установлением молекулярного механизма действия подобных биологических соединений, сик-венс-специфичности связывания ароматических веществ с определенными нуклеотидными последовательностями. Сложность строения и конформа-ционная изменчивость полимерных молекул нуклеиновых кислот, большое разнообразие мест связывания лиганда в полимерной цепи ограничивают возможности анализа роли тех или иных взаимодействий в стабилизации молекулярных структур и установлении физических закономерностей мо-лекулярно-биологических процессов. Вместе с тем, экспериментально установлено, что общие принципы избирательного взаимодействия биологически активных веществ с генетическим материалом клетки могут наблюдаться уже на коротких нуклеотидных последовательностях. Следовательно основные особенности молекулярного механизма действия биологически активных веществ, селективность связывания лигандов с определенными сайтами в олигонуклеотидной цепи, энергетические и структурные характеристики комплексов ароматических молекул с нативными ДНК и РНК могут быть выявлены путем изучения их взаимодействия с малыми фрагмен-

тами нуклеиновых кислот - олигонуклеотидами различного нуклеотидного состава и последовательности оснований в цепи. Экспериментальные методы одно- и двумерной 'Н-ЯМР спектроскопии являются наиболее эффективными для подобных исследований.

Цель настоящей работы - установление основных физических закономерностей селективности связывания ароматических молекул красителей с компонентами нуклеиновых кислот, исследование влияния нуклеотидного состава и последовательности оснований в цепи на особенности процессов комплексообразования молекул.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные научные задачи:

1) разработь методики определения структурных и термодинамических параметров комплексообразования ароматических лигандов с олигонуклеотидами на основе изучения концентрационных и температурных зависимостей протонных химических сдвигов взаимодействующих молекул и данных 2М ЯМР-спектроскопии;

2) определить равновесные константы и термодинамические параметры комплексообразования ароматических лигандов с олигонуклеотидами в растворе; провести анализ динамического равновесия молекулярных ассоциа-тов и комплексов лиганд-олигонуклеотид, образующихся в растворе;

3) выявить особенности межмолекулярных взаимодействий, физической природы сиквенс-специфичности связывания ароматических лигандов с определенными сайтами олигонуклеотидных последовательностей.

Научная новизна.

-установлено, что характеристики процесса самоассоциации ароматических лигандов существенно зависят от структуры их хромофоров и наличия боковых цепей и групп. Так, самоассоциация молекул акридиновых красителей профлавина (ПФ) и акридинового оранжевого (АО) носит явно выраженный кооперативный характер, для фенантридинового красителя бромистого этидия (ЭБ) кооперативное^ практически отсутствует, а для фе-ноксазонового антибиотика актиномицина D ( AMD ) процесс агрегации

имеет антикооперативный характер;

-получены количественные данные, показывающие, что параметры самоассоциации дезокситетрануклеотидов и их термическая стабильность в растворе существенно зависят от состава и последовательности азотистых оснований в нуклеотидной цепи; стабильность дезокситетрануклеотидных дуплексов убывает в следующем ряду: с1(СрОрСрС)2 > сЗ(СрСрСрС)2 > <1(ТрОрСрА)2 > (КАрСрСрТ), > сНАрС.рСрТЬ;

-установлено преимущественное связывание акридинового красителя ОФ и фенантридинового красителя ЭБ с пиримидин-пуриновой последовательностью оснований в тетрануклеотидом дуплексе, при этом прочность связывания ПФ уменьшается в следующем ряду: с1(СрСрСрО) > ¿(ОрСрСрС) > ё(АрСрСрТ) > (З(АрСрСрТ) и зависит от того, какие нук-леотиды фланкируют участок связывания с лигандом;

-показано, что акридиновый краситель ПФ встраивается со стороны большой, а фенантридиновый краситель ЭБ - со стороны малой бороздки ДНК, что связано с особенностями химического строения фенантридинового и акридинового красителей;

-проведен теоретический анализ экранирования протонов ПФ и ЭБ нуклеотидными парами в:С и А:Т в интеркалированном комплексе при вариациях конформационных параметров спирали; результаты расчетов свидетельствуют о различном вкладе трансляционных и угловых конформационных параметров спирали в экранирование протонов симметричной (ПФ) и несимметричной (ЭБ) молекул ароматических красителей;

-определены пространственные структуры наиболее вероятных комплексов молекул красителей ПФ и ЭБ с дуплексами изученных дезокситетрануклеотидов на основе рассчитанных значений предельных протонных химических сдвигов и 2М-1ЧОЕ8У спектров;

-обоснована методика определения термодинамических параметров комплексообразования красителей с дезокситетрануклеотидами; установлены термодинамические особенности связывания ЭБ с одно- и двухцепо-чечными изомерными тетрануклеотидными последовательностями (1(АССТ) и <1(ТОСА); рассчитаны вклады различного типа реакций в рас-

творе (образование 1:1, 2:1, 1:2 и 2:2 комплексов) в суммарные тепловые и энтропийные эффекты; сделан вывод о характере физико-химических взаимодействий, ответственных за связывание красителя с исследуемыми последовательностями.

Научно-практическая значимость работы. Результаты, полученные в диссертационной работе углубляют знания и уточняют существующие представления об особенностях процессов взаимодействия биологически активных ароматических веществ с нуклеиновыми кислотами. Класс ин-теркалирующих веществ достаточно широк и разнообразен по своим медико-биологическим проявлениям. Примером могут служить противоопухолевые антибиотики актиномицин Б, эллиптицин, дауномицин, красители акридинового ряда профлавин, акридиновый оранжевый, обладающие мутагенной, канцерогенной активностью, краситель бромистый этидий, проявляющий трипаноцидное действие. Разработанные в диссертации методики, алгоритмы и программы анализа концентрационных и температурных зависимостей экспериментальных параметров ПМР-спектроскопии позволяют проанализировать закономерности равновесия "олигонуклеотид-ароматический лиганд" в растворе, найти константы образования различного вида комплексов и, соответственно, сделать выводы о сиквенс-специфичности связывания лиганда, определить структуры образующихся молекулярных комплексов, дифференцировать вклады различных реакций комплексообразования в суммарные тепловой и энтропийный эффекты при взаимодействии интеркалятора с олигонуклеотидами в растворе. Предложенные в диссертации методики расчета структурных и термодинамических параметров применимы для анализа молекулярного механизма селективного связывания ароматических лигандов с короткими фрагментами как од-ноцепочечных, так и двухспиральных ДНК в условиях сложного равновесия в растворе. Полученные результаты и выводы работы могут быть использованы в научных исследованиях по изучению процессов молекулярного "узнавания" в различных физико-химических и биологических системах и положены в основу дальнейших работ в области разработки биологи-

чески активных веществ и лекарственных препаратов.

Апробация работы._Основные результаты диссертационной работы

представлялись и докладывалисть на I Всесоюзной конференции по теоретической органической химии (Волгоград, октябрь 1991); 32-м Международном Санибел-симпозиуме (Флорида, США, март 1992); IX Всесоюзном семинаре "Структура и динамика молекул и молекулярных систем" (Черноголовка, апрель 1992); III Международном конгрессе по теоретической органической химии (Тойохаши, Япония, июль 1993); 35-м Международном Санибел-симпозиуме (Флорида, США, март 1995); Международной научной конференции, посвященной 150-летию Ивана Пулюя (Тернополь, май 1995); XII Международном совещании по ЯМР спектроскопии (Манчестер, Великобритания, июль 1995); Международном Рабочем совещании по проблемам ЯМР спектроскопии высокого разрешения (Севастополь, сентябрь 1995); XIII Национальной школе-семинаре с международным участием "Спектроскопия молекул и кристаллов" (Сумы, апрель 1997). Тезисы перечисленных докладов опубликованы.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 16 печатных работах.

Структура и объём диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, двух приложений и списка цитируемой литературы, содержащей 201 наименование на русском и английском языках. Материал диссертационной работы изложен на 127 страницах машинописного текста (без рисунков, таблиц и списка литературы), 56 рисунков на 38 страницах, 43 таблицы на 29 страницах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. Первая глава представляет собой обзор литературных данных. В разделе 1 рассматриваются структурные особенности нуклеиновых кислот и их компонентов. Приведена принятая в настоящее время номенклатура, необходимая для описания конформационных параметров двойной спирали ДНК и отдельных пар оснований. Обосновано при-

менение экспериментальных методов ЯМР-слектроскопии для исследования конформаций коротких нуклеотидных последовательностей в растворе. Второй раздел посвящен обзору литературных данных по самоассоциации биологически важных ароматических молекул в водном растворе. Проведен сравнительный анализ структурных и термодинамических параметров, полученных различными экспериментальными методами, для реакций самоассоциации биологических молекул в растворе. В третьем разделе представлены имеющиеся в литературе данные по комплексообразованию ароматических лигандов с олигонуклеотидами различного состава и последовательности оснований. Наиболее подробно рассмотрены результаты, полученные с использованием метода ЯМР-спекгроскопии и модели интеркаляционно-го связывания лиганда с двухспиральными нуклеотидными последовательностями. Проанализированы имеющиеся в литературе данные о селективности связывания красителей с определенными участками нуклеиновых кислот.

Объекты и методы исследования. Во второй главе изложены некоторые вопросы теории импульсной ЯМР-спектроскопии, экспериментальной техники получения одномерных и двумерных спектров, обработки и интерпретации полученных экспериментальных данных. Показана целесообразность использования в настоящей работе методик гомоядерной корреляционной спектроскопии 2D-COSY и 2D-NOESY. Приведены сведения об образцах, методике приготовления растворов и условиях проведения эксперимента. В работе использованы образцы красителей и антибиотиков (профлавина, бромистого этидия и актиномицина D) фирмы "Sigma" (США). Образцы дезокситетрануклеозидтрифосфатов ( 5' - d(GpCpGpC), 5'-d(CpGpCpG), 5'-d(ApGpCpT), 5'-d(ApCpGpT), 5'-d(TpGpCpA)) синтезированы компанией "Oswel DNA Service" (Великобритания). Концентрации молекул определяли спектрофотометрически по известным молярным коэффициентам экстинкции. Одномерные и двумерные (2D-COSY и 2D-NOESY) 'Н ЯМР спектры измеряли на импульсных спектрометрах "JEOL GSX 500" (500 МГц) и "Bruker АМХ" (600 МГц). Регистрация одномерных

спектров проводилась в диапазоне частот 10 КГц. Остаточный сигнал HOD насыщался в период детектирования. Спектры 2D-NOESY регистрировались при температуре Т=298 К с использованием стандартной импульсной последовательности при ширине спектров SW=10 КГц, 2048 точек в период детектирования, 512 приращений времен эволюции и при фиксированном времени смешивания тт=300 мс. Спектры 2D-COSY измеряли при той же температуре с использованием стандартной последовательности импульсов при 2048 точках в периоде детектирования и 256 приращениях времен эволюции. Период восстановления составлял 1 с для 2D-COSY и 3 с для 2D-NOESY эксперимента. Химические сдвиги в спектрах определялись относительно ДСС (2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфокислота), в качестве внутреннего стандарта использовали ТМА (бромид тетраметиламмония).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Самоассоциация ароматических лигандов. Анализ концентрационных зависимостей химических сдвигов необменивающихся протонов ПФ, АО, ЭБ и AMD проводили с использованием моделей бесконечномерной некооперативной и кооперативной самоассоциации молекул. В некооперативной модели предусматривается равенство равновесных констант образования ассоциатов Щ, так что К,-К2-...=К=К. Средние по всем протонам значения равновесных констант ассоциации для исследованных лигандов приведены в табл. 1. Из таблицы видно, что константа самоассоциации ЭБ заметно меньше соответствующих констант для акридиновых красителей ПФ, OA и антибиотика AMD. Это очевидно связано с различным химическим строением хромофоров красителей. В бесконечномерной кооперативной модели принято, что К,=ъК и К2=К3=...=К, где с - параметр кооперативное™. Полученные значения <т приведены в табл. 1. Величина о < 0.5, полученная для агрегации акридиновых красителей ПФ и АО, свидетельствует о кооперативном характере их самоассоциации.

Для фенантридинового красителя ЭБ параметр кооперативное™ а близок к единице, что говорит о практическом отсутствии кооперативное™

при агрегации красителя. Значение величины а > 1 для AMD позволяет сделать вывод об антикооперативности процесса агрегации антибиотика.

Таблица 1.

Параметры самоассоциации молекул лигандов в водном растворе (0.1 моль/л Ыа-фосфатный буфер, рО=7.15, Т=294 К)

Кра- Некооперативная Коопреативная -AG, -АН, -AS,

си- модель модель кДж/ кДж/ Дж/моль

тель К, л/моль Kd, л/моль К, л/моль о моль моль •К1

ПФ 700±150 350±75 1050±100 0.42±0.06 15.9±0.5 46.0±8.4 144.5±16.7

АО 6100±700 3050±350 9000±600 0.45±0.05 21.3±0.3 38.1 ±4.6 57.3±7.5

ЭБ 352±16 176±8 401±21 0.89±0.06 14.2±0.2 23.4±3.3 31.3±4.6

AMD - 1440±160 1400±100 1.49±0.10 18.0±0.3 31.8±6.3 46.9±10.9

Анализ структур димеров исследованных лигандов в водном растворе проведен на основе расчетных значений индуцированных химических сдвигов протонов красителей и антибиотика А5 = 5да-8^ и спектров 2D-

NOESY. Наблюдается антипараллельная ориентация хромофоров в димерах всех рассмотренных красителей, связанная с характерным распределением электрических зарядов в ароматических молекулах.

Термодинамические параметры самоассоциации определялись по экспериментальным температурным зависимостям протонных химических сдвигов рассмотренных молекул с использованием аддитивной модели и формализма Вант-Гоффа. Усредненные значения термодинамических характеристик самоассоциации ароматических лигандов представлены в табл.1. Анализ полученных значений ДS позволяет сделать заключение, что при ассоциации ЭБ и AMD более существенную роль, в сравнении с ПФ, играют гидрофобные взаимодействия, дающие положительный энтропийный вклад.

2. Самоассоииаиия тетранукпеотидов. Полное отнесение сигналов протонов тетрануклеотидов 5'-d(GpCpGpC),5'-d(CpGpCpG),5'-d(ApGpCpT),

5'-с1(АрСрОрТ) и 5'-с1(ТрСрСрА) произведено по измеренным двумерным 20-С03У и 20-Ы0£5У спектрам. Качественный анализ интенсивностей кросс-пиков в спектрах 20->ЮЕ5У и констант спин-спинового взаимодействия между протонами дезоксирибозных остатков позволяет сделать заключение о том, что рассматриваемые дезокситетрануклеотиды находятся в водном растворе преимущественно в В-конформации. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что термическая стабильность олигонуклео-тидных дуплексов возрастает в следующем ряду: с!(АрОрСрТ)2< <1(АрСрСрТ)2 < с1(ТрСрСрА)2 < с1(СрСрСрС)2 < с1(СрОрСрО)2 и зависит от нуклеотидного состава и числа пиримидин-пуриновых участков в последовательности. Полученные значения термодинамических параметров реакций самоассоциации тетрануклеогидов подтверждают роль состава и последовательности оснований в нуклеотидной цепи в стабилизации спиральных структур.

З.Комплексообразовапие ароматических лигандов с дезокситетрануклеотидами в водном растворе. Рассмотрены процессы комплексообра-зования ароматических лигандов ПФ и ЭБ с дезокситетрануклеотидами а(СрСрСрО), а(СрСрОрС), а(АрСрОрТ), а(АрСрСрТ) и <1(ТрСрСрА), отличающимися локализацией мест преимущественной посадки лиганда (пиримидин-пуриновые сайты), нуклеотидными звеньями, фланкирующими выделенные сайты, а также числом таких сайтов в нуклеотидной последовательности. Это дает возможность проследить закономерности процесса селективного связывания ароматических лигандов с различными нуклеотидными последовательностями.

Данные двумерной гомоядерной корреляционной спектроскопии 2Б-КЮЕБУ использовались для идентификации протонов в спектрах 'Н ЯМР смешанных растворов и позволили качественно определить места связывания красителей с тетрануклеотидами.

Для количественной оценки взаимодействия ароматических лигандов с рассмотренными дезокситетрануклеотидами были проанализированны различные схемы образования молекулярных комплексов. Ниже приведена

общая схема, учитывающая следующие равновестные реакции в растворе

К К

£ + £><-(о) N + N1—(Ъ)

К К

й + -(с) D + Лr2<-(«/)

К К

Ы + ОЫ<-(<?) 0 + 0Ы<-(/) (1)

Кс

Здесь К, -равновесная константа образования комплекса 1:1 красителя с одиночной нитью (Д/У); К2 и К, - константы, характеризующие возможность образования 1:2 комплекса (АЛ^ ) красителя с тетрануклеотвдом двумя способами: непосредственным связыванием красителя с дуплексом (1й) и связывание путем взаимодействия мономера тетранукяеотида с 1:1 комплексом, где краситель играет роль "скрепки" (1е)\ К4, К5 - равновесные константы образования 2:1 комплекса (П2М) и 2:2 комплекса соот-

ветственно. Протонные химические сдвиги молекул красителей рассчитывались с использованием аддитивной схемы на основании закона сохранения массы и закона действующих масс по формуле:

6= —{бт +2КаО&л+Кх№1 + КыК2ЫЧ2+К1К^2Ьг +

где А)> & - исходная и равновесная молярные концентрации красителя соответственно. Величины 8т, 50, К^ и Кы определены независимым образом при исследовании самоассоциации красителей и тетрануклеотидов в тех же экспериментальных условиях. Равновесные константы К,-К5 и предельные

химические сдвиги 5; - б5 соответствующих комплексов находились как параметры уравнения (2) методом последовательного усложнения модели.

Процедура нахождения параметров основана на минимизации квадратичного функционала невязки с использованием экспериментальных концентрационных зависимостей химических сдвигов протонов красителей.

Таблица 2.

1:1 1:2(реакц.1с1) 1:2(реакц.1е) 2:1 2:2

А",,л/моль АГ,,л/моль К3, л/моль К4, л/моль •КГ,,л/моль

ПФ + (¡(ССвС) (Т=298 К)

3800 ± 600 9400 ±1000 - 2500 ± 400 520 ±120

ПФ + ¿(СвСО) (Т=298 К)

6200 ± 800 17600±1600 - 3630 ± 660 10900 ±900

ПФ + фАСвТ) (Т=298 К)

22000±1800 4880 ±1220 15700 ±2300 1520 ±380 -

ПФ + <1(АССТ) (Т=298 К)

24300 ±1500 7000 ±1200 3400 ± 450 470 ±150 -

ЭБ + <1(АОСТ) (Т=303 К)

8750 ±1600 14900 ± 2700 590 ± 90 5160 ±110 1620 ±290

ЭБ + фТССА) (Т=303 К)

12200 ±2500 42000 ± 5000 200 ± 90 4800 ±1600 67500 ±12200

Рассчитанные значения констант образования комплексов, позволяющие сделать заключение о селективности связывания ароматических лигандов с тем или иным сайтом нуклеотидной последовательности, приведены в табл.2. Из таблицы видно, что для тетрануклеотидов ё(СССО) и <1(ТССА), имеющих 2 сайта с пиримидин-пуриновой последовательностью оснований, константы К5 образования 2:2 комплексов лигандов с тетрамерами значительно превышают соответствующие константы комплексообразова-ния с дезокситетрануклеотидами содержащими один пиримидин-пуриновый участок или не содержащими таких участков в последовательности. Сравнение констант К2, К3, характеризующих связывание одной молекулы лиганда с дуплексом тетрануклеотида свидетельствует о том, что их величины существенно зависят от нуклеотидов, фланкирующих места посадки красителя. Равновесные константы реакций К4 значительно меньше

констант К], т.е. связывание второй молекулы ПФ и ЭБ с одиночной нитью тетрануклеотидов имеет антикооперативный характер.

Следует отметить, что средние значения констант комплексообразова-ния ЭБ заметно выше чем ПФ, что, очевидно, связано со структурными различиями ароматических лигандов и спецификой их связывания с дезок-ситетрануклеотидами. Анализ полученных результатов позволяет сделать заключение о преимущественной интеркаляцип ПФ и ЭБ в пиримидин-пуриновую последовательность оснований, при этом встраивание лиганда в дуплекс согласуется с моделью "исключенного соседа".

По найденным значениям констант реакций комплексообра-зования было рассчитано относительное содержание молекулярных ассоциатов в растворе в зависимости от г=*Ы0 /В0 -соотношения исходных концентраций дуплекса тетранук-леотида и красителя. На рис. 1 в качестве примера приведены рассчитанные зависимости относительного содержания молекулярных комплексов в растворе для двух систем: ЭБ+<3(АОСТ) и ЭБ+ ¿ОТССА). Существенно, что вклад в общее равновесие различного типа комплексов определяется не только значениями равновесных констант реакций, но и существенно зависит от г. Анализ динамического равновесия комплексов молекул необходим, чтобы установить вклад каждого типа комплекса в химические сдвиги протонов и соответственно определить предельные значения химических сдвигов протонов этих комплексов, позволяющие выявить структурные особенности ассоциатов.

С/О о

Рис. 1 Относительное содержание молекулярных комплексов в смешанном растворе ЭБ с <1(АОСТ) (пунктирные) и с!(ТОСА) (сплошные линии) в зависимости от г.

4. Структуры комплексов. По рассчитанным значениям предельных химических сдвигов протонов красителей и данным 20-Т-ТОЕ5У в работе были построены наиболее вероятные структуры комплексов ПФ и ЭБ с дуплексами рассмотренных тетрануклеотидов. При этом использовали модифицированную модель эквивалентных магнитных диполей, полученную в результате аппроксимации квантово-механических кривых экранирования для оснований нуклеиновых кислот. При расчетах пространственных структур комплексов красителей с дезокситетрануклеотидами применяли алгоритм преобразования координат атомов и программу, реализующую этот алгоритм, разработанные в ИТЭБ РАН. Последовательность преобразований координат в двойной спирали отвечала изменениям параметров «в (пропеллер), к (излом пары), т (наклон пары), р (крен), Их (сдвиг), Д,

Рис.2 Расчетная структура участка комплекса 1:2 ЭБ с 5'-с1(ТрСрСрА), соответствующая интеркаляции красителя в 5'-с1(ТО) сайт тетрануклео-тида; а)-вид сбоку со стороны широкой канавки спирального участка; б)-вид сверху перпендикулярно плоскостям оснований и хромофору красителя. Стрелка указывает направление к широкой канавке спирали.

Рис.3 Расчетная структура комплекса 2:2 ЭБ с 5'-(ТрСрСрА), соответствующая интеркаляции двух молекул красителя в пиримидин-пуриновые сайты тетрануклеотида. Вид на комплекс сбоку со стороны широкой канавки спирального участка. Хромофор и фе-нольное кольцо красителя заштрихованы.

(скольжение), Г2 (закручивание) и />г (поднятие). В качестве примера на рисунке 2 приведена расчетная структура участка комплекса 1 : 2 ЭБ + 5'-(ЦТрСрСрА), соответствующая шперкаляции красителя в 5'- (1(Т-С) сайт тетрамера. Интеркалированный комплекс характеризуется следующими па-

0 о

раметрами спирали: Л,=6.8 А, £2=14°, о>=-4.3°, т=-3.4°, Я = 0.36 А,

о

£у=0.35 А , р=7.5°, к=-5.0°. Хромофор красителя располагается перпендику-

0

лярно оси спирали на равных расстояниях (/>=3.4 А ) от плоскости верхней и нижней пары оснований. Рассчитанная наиболее вероятная структура комплекса 2:2 ЭБ с дезокситетрануклеотидом ¿(ТС С А), отвечающая интер-каляции красителя в два пиримидин-пуриновых сайта тетрамера, представлена на рисунке 3. При комгшексообразовании ПФ с дезокситетрануклео-тидами угол закручивания Г2=33°-34° (т.е. раскручивание спирали в месте интеркаляции составляет ~ 3°), что существенно отличается от расчетной величины Г2 для комплексов ЭБ с тетрануклеотидами (П=10°-140). Эти результаты хорошо согласуются с данными рентгеноструктурного анализа.

5. Термодинамический анализ взаимодействия ароматических лиган-дов с олигонуклеотидами в водном растворе. С целью определения термодинамических характеристик реакций комплексообразования изучены температурные зависимости химических сдвигов протонов ЭБ в смешанных растворах с тетрануклеотидами ё(АОСТ) и с!(ТССА) в диапазоне температур от 278 К до 353 К в тех же условиях растворителя, что и при концентрационных измерениях. Для количественной оценки термодинамических параметров реакций образования каждого типа комплекса необходимо установить зависимость их мольных долей от температуры. Это было сделано с использованием аддитивной модели, в которой наблюдаемые химические сдвиги протонов красителя определяются суммой вкладов от мономерной и димерной форм, а так же от вклада молекул ЭБ в составе 1:1, 1:2, 2:1, 2:2 комплексов с тетрануклеотидами:

&1(Т) = /т(Т)5т1+/АТ)Ьл+$1МТ)8и

*=1

В этой модели влияние температуры на значение 8,- учитывается тем, что мольные доли ./¿(£=1,2,3,4), однозначно связанные с равновесными константами К] - К4 образования комплексов, являются функцией температуры. Определение температурных зависимостей для констант равновесия позволило найти термодинамические параметры комплексообразования-АН и энтропию ДЯ для различных типов комплексов, образующихся в растворе. Величины АН и Д5 рассчитывались двумя различными способами.

Способ 1. Расчетная методика предусматривает применение параметрических регрессионных уравнений для описания зависимости мольных долей от температуры. Такие зависимости для различных типов комплексов ЭБ с тетрануклеотидами с1(АОСТ) и сЦТССА) приведены на рисунке 4.

Из рисунка видно, что при низких температурах краситель находится преимущественно в связанном состоянии. Содержание 1:1 комплекса монотонно уменьшается с повышением температуры, но остается значительным вплоть до высоких температур (Т-353 К), в то время как доля комплекса 2:1 достаточно мала во всем исследованном диапазоне температур. Температурные зависимости комплексов ЭБ с дуплексами тетрануклеотидов и 02Ы2

имеют характерный вид кривых

Г, К

Рис.4 Расчетные зависимости мольных долей ЭБ и комплексов красителя с тетрануклеотидами <1(АССТ) (пунктирная) и ё(ТвСА) (сплошная линии) от температуры.

плавления для двухспиральных олигонуклеотидов. Комплексы тетрануклео-тидов и в мономерной и в дуплексной форме с двумя молекулами ЭБ являются менее прочными, чем соответствующие комплексы с одной молекулой красителя. В связи с этим важно отметить то, что экспериментально наблюдаемые кривые плавления для подобных многокомпонентных систем имеют усредненный характер и без соответствующего количественного анализа, позволяющего дифференцированно оценить вклад каждого типа комплекса, нельзя сделать определенные суждения о температурной стабильности того или иного ассоциата в растворе. По рассчитанным величинам мольных долей на основе формализма Вант-Гоффа в работе определены константы реакций К(Т) и термодинамические параметры ДН и АЯ ком-плексообразования молекул (табл.3).

Таблица 3.

Термодинамические параметры А(7, АЛ (кДж/моль) и Д51 (Дж/моль'К) ре-

акций комплексообразования ЭБ с дезокситетрануклеотидами

Вид Вид 1 способ расчета 2 способ расчета

компл хим. реакции -ДС(303 К) -ля -Л5 (303 К) -дя° -Д5°

5' - а(АрСрСрТ)

1 : 1 22.9 ± 0.4 108 ± 1 280 ± 30 131 ± 13 358 ± 39

2: 1 0+0^-*02 N 21.5 ±0.5 114 ± 20 307+ 58 106 ± 51 280 + 48

1 : 2 О+Г^БЫг 24.2 ± 0.4 81.7 ±20.5 190 ± 36 75.4 ± 24.3 169 ± 30

5' - а(ТрСрСрА)

1 : 1 23.7 ± 0.5 121 ± 7 321 ± 18 134 ±29 365 ±75

2: 1 В+БЫ^^Ог N 21.3 ±0.7 114 ± 16 304 ± 41 109 ±25 288 ± 47

1 : 2 26.9 ± 0.2 80 ± 6.3 176 ± 27 85.1 ± 15.5 191+38

2 : 2 О-ЮМ^О^ 28.0 ± 0.4 111 ± 11 271 ± 29 136 + 38 354 ± 67

Способ 2. Согласно этому способу для расчета термодинамических параметров ассоциации используется соотношение (2). В этом случае константы комплексообразования и самоассоциации молекул, входящие в (2), определялись через соответствующие термодинамические параметры ДН° и

Дб<; в виде К\Т) = ехрГ/„— ^ /пТ) • Искомые термодинамические

параметры {АН0 и Л .У) определялись путем минимизации функции невязки экспериментальных и расчетных значений 8 и приведены в табл. 3. Из таблицы видно, что энтальпии АН реакций комплексообразования ЭБ с изомерными дезокситетрануклеотидами с1(АССТ) и ё(ТОСА) (комплексы 1:1 и 2:1, 1:2 и 2:2) имеют достаточно большие отрицательные значения. Анализ термодинамических параметров показывает, что при связывании красителя с одно- и двухцепочечными тетрануклеотидами основной вклад в отрицательные значения термодинамических параметров вносят дисперсионные силы. Положительный энтропийный вклад определяется главным образом гидрофобными взаимодействиями, связанными с переносом молекулы красителя в место интеркаляции. Значительный вклад гидрофобных взаимодействий наблюдается в случае комплексообразования ЭБ с дуплексами рассмотренных дезокситетрануклеотидов. Подобная картина имеет место и при комплексообразовании акридинового красителя ПФ с дезокситетрануклеотидами.

ВЫВОДЫ

1.Основные характеристики процессов самоассоциации ароматических лигандов существенным образом зависят от химической структуры лиганда, наличия боковых цепей и групп. Показано, что в димерных комплексах ароматических лигандов имеет место антипараллельная ориентация хромофоров молекул.

2.Термическая стабильность олигонуклеотидных дуплексов зависит от нуклеотидного состава и числа пиримидин-пуриновых участков в последовательности, возрастая в следующем ряду: с1(АрСрСрТ)2<(1(АрСрОрТ)2< с1(ТрСрСрА)2<сЭ(СрСрСрС)2< (3(СрСрСрС)2.

3.Проведенный теоретический анализ экранирования протонов лигандов парами азотистых оснований в интеркалированном комплексе свидетельствует о различном вкладе трансляционных и угловых конформационных параметров двойной спирали в экранирование протонов симметричной молекулы акридинового красителя профлавина и несимметричной молекулы фенантридинового красителя бромистого этидия.

4.Установлено, что красители ПФ и ЭБ преимущественно связываются с пиримидин-пуриновой последовательностью оснований. Интеркаляция лигандов отвечает модели "исключенного соседа", при этом прочность связывания ПФ с тетрануклеотидным дуплексом уменьшается в ряду с1(СрОрСрС)2> ё(СрСрОрС)2 > (1(АрСрСрТ)2 > с!(АрСрСрТ)2. Вероятность селективного связывания ПФ и ЭБ с пиримидин-пуриновыми сайтами тет-рануклеотидных последовательностей зависит от вида оснований, фланкирующих места преимущественной посадки лиганда.

5.Показано, что содержание в растворе различных типов комплексов "тетрануклеотид-лиганд" зависит от температуры раствора, соотношения исходных концентраций взаимодействующих молекул и последовательности оснований в цепи дезокситетрануклеотидов.

6.Разработана методика определения структур интеркалированных комплексов ароматических лигандов с олигонуклеотидными дуплексами на основе рассчитанных предельных значений протонных химических сдвигов и данных 2М-ЫОЕ спектров. Построены наиболее вероятные пространственные структуры 1:2 и 2:2 комплексов ПФ и ЭБ с различными сайтами двух-спиральных тетрануклеотидных последовательностей.

7.Установлены термодинамические особенности связывания ЭБ с одно-и двухцепочечными олигонуклеотидными последовательностями. Определены термодинамические параметры (энтальпия ¿Л, энтропия АЯ и свободная энергия Гиббса АО) реакций образования различных комплексов ЭБ с дезокситетрануклеотидами с1(АОСТ) и с!(ТОСА) в водном растворе. Результаты свидетельствуют о существенной роли гидрофобных взаимодействий при связывании лигандов с дуплексами олигонуклеотидов.

8.Показано, что характерные закономерности равновесия молекулярных ассоциатов в растворе, вероятные типы образующихся комплексов ПФ и ЭБ с дезокситетрануклеотидами являются сходными для ароматических лигандов. Вместе с тем, особенности химической структуры интеркалирую-хцих лигандов в значительной степени определяют специфику их связывания как с одиночной, так и с двухспиральной формами нуклеотидных по-

следовательностей. В частности, акридиновый краситель ПФ встраивается

со стороны большой, а фенантридиновый краситель ЭБ - со стороны малой

бороздки ДНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Veselkov A.N., Davies D.B., Djimant L.N., Zav'ylova O.S., Luchin V.L. Structural and thermodynamical analysis of acridine dye proflavine with de-oxytetranucleotides of different base sequence using ID and 2D 'H NMR data // Book of Abstracts 32ш Sanibel symposia.- Florida, USA.- 1992,- P. 114.

2. Веселков A.H., Дымант JI.H., Завьялова О.С., Зенаишвили С.А. Экранирующее влияние нуклеотидных пар на протоны интеркалированного красителя при различных конформационных состояниях комплекса // Биофизика.- 1993.- Т.38, №3.- С.552-553.

3. Завьялова О.С., Сигаев В.А., Дымант Л.Н., Веселков А.Н. Особенности процессов самоассоциации и комплексообразования с профлавином де-зокситетрануклеотидов в растворе: качественный анализ по спектрам 'Н-ЯМР молекул // Биофизика.-1993.- Т.38, № 3.- С.553-554.

4. Veselkov A.N., Djimant L.N., Zav'ylova O.S., Sigaev V.A. 'H NMR investigation of proflavine binding selectivity with deoxitetranucleotides of different base seguence// Abstracts of III World Congress of the theoretical organic chemists.- Toyohashi, Japan.- 1993.- P.159.

5. Veselkov A.N., Djimant L.N., Zav'yalova O.S., Zenaishvili S.A. Shielding effect of the base pairs on the protons of intercalated dyes at different conformational states of dye-oligonucleotide complex // Abstracts of III World Congress of the Theoretical Organic Chemists, Toyohashi, Japan.- 1993.-P.141.

6. Веселков A.H., Дымант Л.Н., Завьялова О.С., Зенаишвнли С.А. Экранирующее влияние нуклеотидных пар на протоны интеркалированного красителя // Кн.:Труды факультета естественных наук Севастопольского приборостроительного института.- 1993.- Вып.1.- С.53-60.

7. Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Завьялова О. С., Дэвис Д. Термодинамические параметры самоассоциации молекул бромистого этидия // Химическая физика,- 1994,- Т.13, №12,- С.161-164.

8. Веселков А.Н.,Дымант Л.Н.,Барановский С.Ф.,Болотин П.А.,Завьялова О.С., Дэвис Д. Исследование самоассоциации антибиотика актиномици-на D в водном растворе методом 'Н-ЯМР спектроскопии// Журн.структ.химии.- 1995.-Т.36, №1.- С.81-88.

9. Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Болотин П.А., Завьялова О.С. и dp. Исследование комплексообразования бромистого этидия с самокомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(ApGpCpT) методом одномерной и двумерной 'Н-ЯМР спектроскопии // Биофизика.- 1995.- Т.40, Вып 6,-С.1189-1201.

10. Djimant L.N., Zav'ylova O.S., Bolotin Р.А., Baranovsky S.F. 'H NMR thermo-dynamical analysis of the interaction of ethidium bromide with deoxitetra-nucleotides of different base sequence // Book of Abstracts, 12th International Meeting on NMR Spectroscopy, UMIST Manchester.- 1995.- P.62.

11. Веселков О., Димант JI., Зав'ялова О., Петренко И., Леонтович О. Тер-MOflHHaMiHHi взаемода фенантридинового барвника бромистого етдаю з дезокситетрануклеотщами pi3Ho'i послщовноси базис1в // М1жнародна наукова конференщя, присвячена 150-р1ччю 1.Пулюя, Тернопшь.- 1995.-С.47-48.

12.Веселков А.Н., Завьялова О.С., Дымант Л.Н., Дэвис Д. Исследование комплексообразования бромистого этидия с самокомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(TpGpCpA) методом 'Н-ЯМР спектроскопии // Журн. физич.химии.- 1996,- Т.70, № 9.- С.1617-1624.

13.Веселков А.Н., Завьялова О.С., Петренко Н.В., Дымант Л.П., Дэвис Д. Экранирующее влияние нуклеотидных пар на протоны интеркалиро-ванного красителя бромистого этидия при различных конформационных состояниях олигонуклеотидного дуплекса // Биофизика.- 1997.- Т.42,-С.243-244.

14. Веселков А.Н., Завьялова О.С., Дымант Л.Н., Шипп Д., Дэвис Д. Анализ комплексообразования фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5'-d(TpGpCpA) в водном растворе по данным 'Н-ЯМР спектроскопии // Журн.физической химии,- 1997.- Т.71, №1.- С.33-38.

15.Болотин П.А., Завьялова О.С., Веселков Д.А. 'Н-ЯМР структурный и термодинамический анализ самоассоциации ароматических лигандов в водном растворе // Вестник СевГТУ,- 1997.- Вьш.2.- С.31-36.

16. Веселков А.Н., Завьялова О. С., Петренко Н.В. и др. Исследования сик-венс-специфичности связывания ароматического лиганда с само- и не-самокомплементарными дезокситетрануклеотидами в водном растворе методом 1М и 2М 'Н-ЯМР спектроскопии //Тезисы доклада на XIII Национальной школе-семинаре с международным участием "Спектроскопия молекул и кристаллов".- г.Сумы.- 1997.- С.62.