Комплексы компонентов нуклеиновых кислот с ароматическими молекулами красителей в растворе

Дымант, Леонид Наумович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Комплексы компонентов нуклеиновых кислот с ароматическими молекулами красителей в растворе
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Комплексы компонентов нуклеиновых кислот с ароматическими молекулами красителей в растворе"

Гсс, :.</■■ •

V , . , г •

б«:? -

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТЬШиИ^! УНИВЕРСИТЕТ им. К.Б.ЛОМОНОСОВА

ДШШТ Леонид Наумович

УД{ 077.113+041.49

КОМПЛЕКСЫ КОМПОНЕНТОВ НУКЛЕШОВЦХ КИСЛОТ с АРОМАТИЧЕСКИМИ МОЛЕКУЛАМИ КРАСИТЕЛЕЙ В РАСТВОРИ

03.00.02 -Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Москва 1993

Раоота выполнена » Сивастэпользком ь^иборо ¡троятелыюм ИНСТИТУТ"

0|<и; -чльта оппонент«:

доктор фиэико-матоматкчуских наук,над.науч.сотр.3.И.Полтэв доктор химических яаук.от.науч.сотр. Г.Г.Мшшков доктор Физико-математических наук,профессор В.К.Иванов

Ьадущал организация: Институт радиофизики и эл-зктроники АН Ук^ины

Зашита состоится " алрсля ._ 1993 года в

1530 часов на заседании Специализированного Учёного Соьета а 053.06.53 при МГУ им.К.В.Ломоносова по ахрэсу: 119899,Москва, Воробьев!» горы, биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеки биологи. ческого факульт- та МГУ

Автореферат разослан " уяртя_ 1993 года

Учений секретарь

Специализ1'рсванного Совета, л

доктор биологических наук, ,

профессор I *Г.2.Кренделёва

ОЕцЛЯ ХЛРЛ1гШЧ;ОТ1КЛ РАШГи

' Актуальность темы. Проблема взаимодействия нуклеинових кислот с биологически активными ароматическими веществами является одной из 1'вжнмх и современной молекулярной биофизике. Многие органические красители и антибиотики оказывают биологическое действие, глапдам образом, путем связывания с молекулами Д)Н и ГОК. Это при родит к нарушению биологических функций нуклеиновых кисло'? вследствие изменения конформации молекул и сте-рического экранирования лри метаболических процессах в клетке. Среди возможных механизмов взаимодействия лигандоп с нуклеиновыми кислотами существенный интерес представляет интеркаляцион-кое связывание, характерное для ароматических молекул красителей, имекгдих плоские гетероциклические хромофор!. Класс интер-каиирукхцих веществ достаточно цшрок и разнообразен пч споим ' медико-биологическим проявлениям. Ирт/орами могут слу;*■.'■>> противоопухолевые антибиотики актиноиицин П , эллиптпцин, дауномицпл, красителя акридинового ряда проплати, акридиновый оранжевый, обладающие мутагенной, канцерогенной активностью, краситель бромистый этидий, проявляющий трипаиоцидиоо действие. Несмотря на многочислешыв исследования закономерностей лнтер-калпционного связывания ароматических лигандов с нуклеиновыми кислотами, молекулярный механизм действия подобных биологически активш-гх соединений изучен недостаточно. Сложность строения и конформационная изменчивость нативньгх молекул нуклеиноа/х кислот, болыгов разнообразие мест связывания лиганда о полимерной цепи ограничивают возможности анализа роли тех или иных взаимодействий в стабилизации молекулярных структур и установления общих закономерностей происходящих молекулярно-биологи-ческих процессов. Более глубокое понимание механизмов действия ароматических соединений - интеркаляторов на Д;К и ГШ может быть получено путем изучения связывания этих лигандов с модельными соединениями - самокомплементарными, олигонуклеотидами различного нуклеотидного состава и последовательности оснований в цапи. Это, в определенной мере, оправдано тем, что возмущения, которое возникал/г в нуклеотидной цепи при внедрении ин-теркалиру»>цей молекулы, имеют преимущественно ближний порядок. Установлено также, что многие характерные особенности взаимодействия, в частности, сиквенс - специфичность ароматических

яигандов проявляются уже на коротких нуклеотидных последовательностях. Недавно показано на примере противоопухолевых антибио-тк ов, молекулы которых содержат акридиновый хромофор и платину в боковой цепи ( V. Murray et al. , 1992), что интерка-ляторн селективно связываются с одинаковой нуклеотидной последовательностью как в клетках высших организмов, так и в случае выделенной из них, очищенной Д1К. Систематические исследования по взаимодействию лигандов с различными по длине фрагментами нуклеиновых кислот позволяют производить обоснованный перенос выявляемых закономерностей на нативные молекулы Д1К и РНК.

Подобный подход к решению проблемы дает возможность использовать для изучения процессов комплексообразования в растворе и установления пространственных структур комплексов один из наиболее аффективных экспериментальных методов - спектроскопию ядерного магнитного резонанса. Развитие в последнее время методик двумерного ЯМР открыло новые возможности длл'иэучения конформационных состояний олигонуклеотидов и их комплексов с лигаццами. Все сказанное определило выбор метода экспериментального исследови.шя и разработку связанных с ним методик расчета параметров комплексообразования и структур молекулярных комплексов.

Цель работы. Установление основных закономерностей и молекулярного механизма интеркаляционного взаимодействия ароматических молекул красителей с компонентами нуклеиновых кислот в ра-

отворе, выяснение влияния нуклготидного состава и последовательности оснований в цепи на особенности процессов комплексообразования молекул.

Для достижения поставленной цели решались задачи: разработки методик определения параметров ассоциации и комплексообразования молекул на основе концентрационных и температурных зависимостей протоних химических сдвигов; изучения закономерностей самоассоциации красителей, ди- и тетрануклеотидов заданного , состава, определения количественных характеристик, необходимых для анализа равновесия в растворах краситель-олигонуклеотид; расчетно-теоретического обоснования методов обработки данных ЯМР и построения структур интеркалированных комплексов; изучения одномерных и двумерных протонных спектров растворов

красителей с компонентами нуклеиновых кислот различного нуклео-тидного состава и последовательности оснований в цепи, установления основных типов образующихся комплексов, их структурных и термодинамических характеристик; выявления закономерностей избирательного взаимодействия красителей с компонентами нуклеиновых кислот и физической природы наблюдаемых эффектов. v

Научная новизна. D работе впергые на основе систематических исследований взаимодействия в растворе типичных интеркали-рующих веществ профлавина (П$), бромистого этидия ОБ), акти-номицина d (amd) с moho-, ди-, тетрануклеоткдами, проведенных с использованием методов одномерной и двумерной ЯьР-спектроско-пии, установлены особенности связывания ароматических лигандов с фрагментами нуклеиновых кислот различного нуклеотидного состава и последовательности оснований в цепи, выявлены типы реакций, адекватно отражающие процессы коиплексообразования в растворе. Проведен количественный анализ связывания профлавина с Б'- AMP, CpG, GpC, d(GCGC), d(CGCQ), d(ACCff), d(AQCT), бромистого этидия с d(CpQ), актиномицина D с b'-dAl«P, 5'-0MP, CpG, QpC, d(ApT), d(TpA), d(CpG), d (QpC), определены равновесные константы кокплексообр&зования и предельные значения химических сдвигов протонов молекул в составе комплексов. Показано, что содержание различного типа комплексов в растворе существенно зависит от соотношения исходных концентраций взаимодействующих молекул ( г ) и последовательности оснований в цепи. Установлено, что интеркалированные комплексы красителя с двухспиральными молекулами ди- и тетрануклеотидов преобладают в.растворе при значениях г , значительно превышающих стехиометрическое соотношение. Количественно подтверждено преимущественное связывание ПФ с пиримидин-пуриновой, AMD - с пу-рин-пиримидиновой дезоскидинуклеотидной последовательностями оснований в дуплексе. Показано, что при взаимодействии красителей с одноцепочечными молекулами динуклеотидов характер связывания зависит как от нуклеотидного состава, так и от последовательности оснований в цепи.

На основе вычислительного эксперимента по изучению экранирования протонов в интеркалированных комплексах красителя с компонентами нуклеиновых кислдт разработана методика расчета

структур комплексов по предельным значениям химических сдвигов взаимодействующих молекул. С помощью двумерных спектров ШР ( OEüY ) выявлены места преимущественной посадки красителя ОФ при взаимодействии с тетрануклеотидами различной последовательности оснований. Определены пространственные структуры образующихся в растворе молекулярных комплексов красителей с различными фрагментами нуклеиновых кислот,- проведен сравнительный анализ геометрических особенностей комплексов в растворе и кристалле.

Разработана методики, основанные на совместном анализе концентрационных и температурных зависимостей протонных химических сдвигов лиганда, позволяющие оценивать Еклады различного . типа реакций в растворе в суммарные тепловые и энтропийные эффекты. Определены термодинамические параметры реакций компле-сообр&эования 115 с дирибонуклеотидами СрСги QpC и дезокситетра-нуклеотидами d(GCQC), d (CQCQ), d(ACGT), d(AQCT). Получены данные, свидетельствующие о существенной роли гидрофобных взаимодействий при связывании ароматических молекул красителей с дуплексами ол,.л)нуклеотидов.

На основе кооперативной и некооперативной моделей взаимодействия молекул определены равновесные константы, параметры кооперативности, термодинамические характеристики реакций само- и гетероассоциации красителей ite и акридинового ораняе-гого (АО), значения предельных химических сдвигов протонов молекул в составе ассоцкатоЕ, р1ссчитаны структуры димерных комплексов красителей. Найдены предельные значения протонных химических сдвигов в мономерах и дуплексах ди- и тетрануклео-тидов, константы равновесия, энтальпии и энтропии реакций самоассоциации молекул.

Научная и практическая ценность работы. Полученные в работе теоретические и экспериментальные результаты углубляют существующие представления о взаимодействии биологически активных ароматических молекул с нуклеиновыми кислотами. Использование методов одномерной и двумерной ШР-спектроскопии позволило выполнить детальный анализ процессов комллексообразования фрагментов нуклеиновых кислот с красителями в растворе. Исследования показали, что характерные особенности взаимодействия молекул, специфика связывания красителей с определенными участками нуклеиновых

кислот проявляется уже на коротких нуклеотидных последовательностях. Для выяснения механизма селективного ссязивания красителей изучено комллексообразовпние красителе? различной химической структуры с компонентами нуклеиновых кислот, отличающимися нуклеотидным составом, последовательностью оснований в цепи, числом мест преимущественной посадки лиганда и нуклеотидни-ми звеньями, фланкирующими геста связывания красителя. Исследованные лиганда обладает химиотаралевтическими свойствами. 'Гак 11$ имеет бактериостатическое, ЭГ - трипаноцидное, А1л В _ анти-опухолевсе действие. Помимо этого, акридиновые красители (АО и ПФ) обладают мутагенной, канцерогенной активностью, ингибируют синтез Д[1К и РНК и визы вахт хромосомные аберрации. Разработанные метода интерпретации данных .Я.'а3, определения параметров ассоциации и комплексообразсвания молекул позволяют установить типы и структурные характеристики образующихся в растгоре комплексов, константы равновесия и термодинамические параметры реакций, сделать выводы о характере сил, ответственных за взаимодействие молекул. Подобные исследования важны для изучения конфорыационнмх проявлений различных нуклеотидных последовательностей при их связывании с низкомолекулярными лигандами, понимания молекулярных механизмов взаимодействия и РНК с белками и другими биологически важными соединениями, установления общих принципов избирательного взаимодействия биологически активных веществ с генетическим материалом клетки. Получаемые результаты создают основу для прогнозирования поведения макромолекулы "в клетке, подверженной влиянию внешних факторов, решения задач технологии'веществ с заданными биологическими свойствами.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на: семинаре Всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева "Молекулярная физика и биофизика водных сис зм", Санкт-Петербург, 1961, 1964, 1966, 1990; международной школе-семинаре¡"Современные метода в структурной молекулярной биологии", Грапани (Италия), 1961; семинаре научного совета АН УССР по комплексной проблеме "Моделирование физи ческих пр.цессов", Севастополь, 1984, 1980; П Всесоюзной конференции "Перспективные метода планирования и анализа экспериментов при исследовании случайных полей и процессов", Севастополь, 1985; 1У Всесоюзном сиь.гзэиуме "Методы теории идентификации е

задачах измерительной техники и метрологии", Новосибирск195Ь; международном конгрессе по теоретической органической химии,

тдпеа'т, 1967; мепдународном симпозиуме "Гидратация биополимеров", Пущино, 1907; У1, УП Конференциях по спектроскопии биополимеров, Харьков, 19№, 1991; Международном симпозиуме "Электронная структура и свойства молекул и кристаллов", .Дубровник-Кавтат (СФРЮ), 19ь8; всесоюзной школе по молекулярной биофизике, Харьков, 1990; 11 Всесоюзном конгрессе «АТОС, Торонто (Канада), 1990; I Всесоюзной конференции по теоретической органической химии, Волгоград, 1991; УП Международном конгрессе по квантовой химии, кентон (Франция), 1991; К.еждународной конференции "Достижения в моделировании биомолекулярных структур", Обернаи (Франция), 1991; IX Всесоюзном семинаре "Структура и динамика молекул и молекулярных систем", Черноголовка, 1992.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано оо работ.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, выводог трех приложений, списка цитируемой литературы, ■ включающего 37*'. наименования. Материал изложен на Зь7 страницах, содержит С2 таблицы и 99 рисунков.

Основное содержание работы

I. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КРАСИТЕЛЕЙ И АНТИБИОТИКОВ С НУКЛЕИНОВЫМИ МОСТАМИ И ИХ КОМПОНЕНТАМИ

В главе I, имеющей обзорный характер, приведены экспериментальные данные и теоретические результаты по структуре и конформационным состояниям нуклеиновых кислот и их компонентов, равновесной самоассоциации коротких нуклеотидных последовательностей и органических красителей в растворе, комплексообразова-нию олигонуклеотидов с ароматическими молекулами красителей и антибиотиков. В разделе I рассматриваются различные структурные формы молекулы Д{К и условия их существования, особенности "тонкой" структуры нуклеиновых кислот, конформационная микрогетерогенность внутри двойной спирали• Основное внимание уделено результатам исследований олигонуклеотидных последовательностей, полученным методами одномерной и двумерной ШР-спектроскопии.

Раздел 2 глары I посвящен обзору литературных данных по параметрам самоассоциации компонентов нуклеиношх кислот и ароматических молекул красителей, механизмам протекающих в растгоре реакций, структурным характеристикам образующихся ассоциа-тов и их термической стабильности. Рассмотрены результаты исследований термодинамики образования двухспиральных структур различных олигонуклеотидных последовательностей и ассоциатоь ряда ароматических красителей и антибиотиков. Ь разделе 3 представлены результаты экспериментальных п теоретических исследований комплексообразования ароматических молекул красителей и антибиотиков с короткими фрагментами нуклеиновых кислот в растворе и кристалле. Особое внимание уделено модели интер-каляционного связывания лиганда с двухспиральными нуклеотиднм-ми последовательностями. Проанализированы имеющиеся в литературе данные о селективности взаимодействия красителей с определенными участками нуклеиновых кислот. Сделан вывод о том, что для детального выяснения роли тех или иных физико-химических факторов в механизме избирательного связывания лиганда с нуклеотидными последовательностями необходимо иметь количественную информацию о параметрах образования и структурных характеристиках различного типа молекулярных комплексов красителей с олигонуклеотидами в растворе.

П. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Рассмотрены некоторые вопросы теории импульсной ШР-спек-троскопии и экспериментальной техники получения и обработки спектров, необходимые для характеристики условий эксперимента и интерпретации получаемых данных. Обоснована возможность применения модели эквивалентного диполя для расчета протонных химических сдвигов, вызванных кольцевыми токами в ароматических молекулах, находящихся в состоянии вертикального стэ-кинг взаимодействия. Показана целесообразность использования в настоящей работе методик двумерного ЯМР-СОЬТ и НОЕЬУ , проанализированы возможности расчета структур интеркалированных комплексов на основе данных МОЕ-экспериментов. Представлены сведения о материалах и условиях проведения эксперимента.

Использованы образин красителей и антибиотиков (Г1Ф,"А0, ЭБ, AíáD ) , моно- и динуклеотидов (b'- AMP, Ь'-аАЫР, b'-dQMP, Cr^i, QpC, d(Cpíi), d(QpC), d(TpA), d (ApT) ) фирмы " Sigma -, США.Дезокситетрарибонуклеозидтрифосфаты b'-d (GpCpGpC), b' - d (CpGpCpQ), b'-d (ApCpGpT), b'-d (ApQpCpT) синтезированы компанией "oswel эка see'л ge " (Великобритания). Образцы трижды лиофилиэовали из D gO (" Sigma ") с изотопной чистотой 99,91% и растворяли в деИтерированном 0,1 фосфатном буфере, pD 6,6. Концентрации молекул в растворе определяли спектрофо-тометрически. При исследовании ассоциации красителей, самоассоциации динуклеотидов, комплексообразования красителей с моно-и динуклеотидами спектры *Н-ЯМР регистрировали на фурье спект- . рометре wH-270 ("Bruker", ФРГ). Остаточный сигнал HOD насыщался во время детектирования. Регистрацию спектров проводили при ширине развертки 2000 Гц и 1000 Гц с эффективным разрешением в спектре I Гц и 0,Ь Гц соответственно. Ьремя накопления спектров при концентрациях молекул ~10 Ы составляло несколько минут, в области низких концентраций - 6-6 часов. Стабилизация температуры обеспечивалась с точностью 0,2°.

Протонные спектры в экспериментах по изучению самоассоциации дезокситетрануклеотидов и их комплексообразования с 11$ измерены на импульсном спектрометре " jïol GSX ЬОО" с резонансной частотой ЬОО КГц. Химический сдвиг определяли относительно ДОС, в качестве внутреннего стандарта использован TUA. Регистрация одномерных спектров проводилась в диапазоне 10000 Гц, максимальная резрешающая способность равнялась 0,001 м.д. Температура образцов поддерживалась с помощью " je0l nm-gvt 3 " терморегулятора. Спектры 2М- NCESY регистрировали при температуре Т=298 К с использованием импульсной последовательности - ^/2 - tj - ^/2 - Т„. - V2 - tg ПРИ сирине спектров 10000 Гц, 2048 Т' чек в период детектирования ( tg), Ь12 приращений времени эволюции ( t j) и при фиксированном Бремени сме-иивания =300 мс. Спектры 21л-COSY измеряли при той же температуре, используя последовательность импульсов - 3¡~/2 - -- ^/2 - tg, 2046 точек в tg и 2Ь6 приращений в Период восстановления tb составлял I с для 2U-C0SÏ и 3 с для SM-NOESY; Для увеличения чувствительности импульсную последовательность при каждом значении tj повторяли 16 и 32 раза

для-2M-C0.SY и 2М- NOESV- экспериментов соответственно.

Двумерные спектры COSY и N0ESY использовали для отнесения сигналов протонов исследуемых молекул и отоидествления химических и пространственных связей ядер в ассоциатах и комплексах .

Ш. ИССДВД0ВАШ1Е САМОАССОЦИАЦИИ БИОЛОГК'ЩСКИ ВАЖНЫХ ЛРШЛТИЧ1-Ш1Х шшсуд в РАСТЬОРЕ

Самоассоциация красителей акридинового _ряда. Изучены концентрационные зависимости химических сдвигов необмениваюцихся протонов Н , Па, lip, Нх лрофяавина и протонов Ug, ¡¡j li2

Н акридинового ораняевого. Характер зависимостей свидетель-снз

ствует о наличии вертикального стэкинг взаимодействия при самоассоциации молекул. Для анализа экспериментальных данных использована бесконечномерная кооперативная модель самоасссциации молекул, в которой предусматривается отличие константы димериза-ции Kj от констант образования ассоциатов более высокого порядка К , '<-=2,3, так что 1(2=^3=...= К и hj=6h. Использована аддитивная схема для наблюдаемого химического сдвига протонов красителя с учетом законов действующих масс и сохранения массы, а также в предположении, что круговые токи только соседних молекул в ассоциате дают вклад в протонные химические сдвиги и влияние двух соседних молекул одинаково. Расчетная модель содержит неизвестные параметры К, б" , а также 5ми S;. - протонные химические сдвиги в мономере и внутри ассоциатов, которые определялись по экспериментальным концентрационным зависимостям химического сдвига 5 . Получены значения 6" = 0,42i0,0o, К = 4I0L0-I00) л/моль для 11Ф и 6'=0,4L±6,0'o, К=(9000^600) л/моль для АО. Кооперативный характер самоассоциации красителей при данных условиях, по-видимому, обусловлен тем, что электрический заряд молекул в.р'створе большой ионной силы (ju=0,I) в значительной степени экранирован и существенйую роль при ассоциации игр-ают гидрофобные взаимодействия, связанные с переносом молекул красителя из растворителя внутрь стопочного ассоциата. Анализ в pai ах некооперативной модели, когда Kj=...= l'iru= К дает менее удовлетворительное соответствие экспериментальным данным и приводит к большему разбросу расчетных параметров. Полученные величины предельных хиг."«ческих сдвигов о; и использованы для определения наиболее вероятной структуры димерных ассоциатов

молекул АО и ЬФ в растворе. Расчет индуцированных химических сдвигов, вызванных кольцевыми токами, проводился по модели 31 ивалентного диполя. Ь расчетных структурах димерных ассо-циатов плоскости молекул параллельны и расположены на расстоянии 0,34 нм'друг от доуга. Ь случае димера АО молекулы смещены вдоль продольной оси хромофора при угле поворота хромофоров 36-2°, что может быть обусловлено наличием у АО массивных ме-тильных групп, создающих определенные Стерические препятствия при ассоциации этих молекул. В структурах димеров обоих красителей имеет место антипараллельная ориентация хромофоров молекул.

На основе исследований температурных зависимостей химических сдвигов протонов красителей, определены термодинамические характеристики реакций самоассоциации молекул. Измерения выполнены в тех же условиях растворителя, что и при изучении концентрационных зависимостей. Экспериментальные кривые аппроксимированы регрессионными уравнениями в форме многочленов четвертого порядка относительно температуры. Конкретный вид уравнений составлялся на основе аддитивной модели для наблюдаемого химического сдвига с учетом известных мольных долей мономеров, димеров и п. -мерных ассоциатов при Т=294 К и величин 5с , определенных в результате концентрационных измерений, а также в предположении, что при Т=373 К Бесь. краситель находится в мономерной форме. По значениям мольных долей мономеров и ассоциатов при различных температурах определялись равновесные константы и термодинамические параметры реакций. Использование некооперативной модели приводит к следующим значениям изменения энтальпии, энтропии, свободной энергии Гиббса для реакции самоассоциации Гй: дН = - 46 кДк/моль, д6 (294) = ~ Ди/моаь-К, (294) = " кйк/моль. Применение кооператигчой модели позволяет сравнить термодинамические параметры димеризации Ш и образования агрегатов более •высокого порядка. Данные по энтропии реакций п-мерной самоассоциации ПФ подтверждают ранее высказанное предположение, что гидрофобные взаимодействия могут играть существенную роль при образовании ассоциатов более высокого порядка, чем димеры.

Самоассоциация дирибонуклеозидмонофосфатов Ср£ и С&С. В расчетной схеме предполагалось, что для исследованных

концентрации взаимодействие молекул ограничивается, в основном, образованием димерннх ассоциатов. Усреднешше значения константы ассоциации в пределах погрешности ее опред-.-ления совпали для обоих изомерных динуклеотидос и составили ( в л/моль дуплекса): Ка=12,0±2,8 для Ср<? и Ил=10,7±2,9 для £рС при Т=2У4 К. При описании температурной зависимости наблюдаемого химического сдвига величина Ом полагалась функцией температуры и выражалась через мольные доли и химические сдвиги протонов мономеров в двух состояниях - раскрытом, когда стэкинг взаимодействие оснований отсутствует, и закрытом с внутримолекулярным стэкингом. Полагалось, что внутримолекулярный стэкинг и самоассоциация молекул дают независимые вклады в химические сдвиги протонов динуклеотидов и при достаточно высоких температурах (Т~ЗШ К) раствор содержит только неассоциированные раскрытые конформеры. Температурная зависимость для мольной доли дикеров представлена регрессионным уравнением второго порядка. Б результате расчетов получены значения энтальпии дН = - (30^3) кДж/моль и энтропии 3 (294)= ~ (С6-£) Дж/К моль.

Самоассоциация дезокситстрарибонуклеозидтрифосфатов. Исследована ассоциация в водном растворе самокомплементаркых дезок-ситетрануклеотидов <1 (О-рСр^рС), 4 (СрОрСр^), 11 (АрСрС^рТ), <1 (ЛрС^рСрТ). Изучены концентрационные и температурные зависимости химических сдвигов протонов оснований и дезокеирибози с целью определения равновесных констант и термодинамических параметров самоассоциации молекул в растворе, а также для нахождения предельных значений химических сдвигов протонов и

в мономере и дуплексе. Найденные значения использованы при исследовании процессов комплексообразования красителей с тетрануклеотидами. Отнесете сигналов в спектре ШР тетранук-леотидов получено на основании двумерных гомоядерных СО&У и МОЕЗУ-экспериментов. Для большинства .протонов тетрануклео-тидов наблюдается смещение химического сдвига в область сильного поля при увеличении концентрации молекул. Анализ данных дал основание предположить, что взаимодействие молекул можно рассматривать в соответствии с моделью двух состояний. Полученные значения равновесных констант ассоциации ( в л/моль нитей) Кд=Ь70-60 для ¿((ОТ) и КД=6Ь0±80 для ¿(СССО) примерно на порядок превышают величины Кд самоассоциации

тетрануклеотидов <1(АС£Т) и <1(Л0СТ), имеющих менее стабильнее концевые А:Т пары (Кд=Ь0±1Ь, Т=2^3 К). Оценки показывают, что при таких значениях Кд и концентрациях моль/л доля

молекул в дуплексной форме составляет ~ для первых двух температур и -»2056 для А-Т содержащих тетрануклеотидов. В расчетной схеме при определении термодинамических параметров реакций самоассоциации тетрануклеотидов зависимость наблюдаемого химического сдвига от температуры представлена в виде:

б-СТ;)+ <"^-8,0 ¿-„(Т}) (I). Для описания температурной зависимости использовано

регрессионное уравнение второго порядка относительно температуры, в котором учтены известные мольные доли мономеров в растворе при температурах Т^-293 и То=303 К. Функция ) аппроксимирована линейной зависимостью по известным значениям &п Для указанных выше температур. Для оценки энтальпии и энтропии реакций сауоассоциации тетрануклеотидов использованы зависимости Вант-Гоффа 1п Кд= Г(1/Т). Полученные значения термодинамических гчраметров реакций саыоассоциации тетрануклеотидов подтверждают роль состава и последовательности оснований в нуклеотидной цепи в стабилизации спиральных структур. Наиболее стабильным дуплексом среди исследованных тетрануклеотидных последовательностей является ¿(СрО-рСр£), При анализе полученных данных следует учитывать, что е растворе еозкожнк "неидз-альные" спиральные структуры, обусловленные, в первую очередь, плавлением концевых пар г столь коротких дуплексах, а также "скольжением" комплементарных нитей относительно друг друга.

1У. КШПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ КРАСИТЕЛЕЙ И АНТИБИОТИКОВ С МОЬО- И ДО1УКЛЕ0-ТВДАКИ В БОдаОМ РАСТВОРЕ

Ассоциация акридиновых красителей ПФ и АО (модельная система) . Равновесное взаимодействие красителей акридинового ряда, относительно простых по структуре и конформационнб жестких ароматических молекул, имеющих достаточно большое число легко идентифицируемых необменивающихся протонов в плоских хромофорах может рассматриваться в эксперименте ИКР в качестве модели для анализа закономерностей комплексообразования более

сложных биологически важных ароматических молекул. Изучены концентрационные зависимости химических сдвигов протонов красителей в растворе, в котором в одном случае поддерживалась постоянной концентрация 115 и в Другом - постоянная концентрация АО. Анализ взаимодействия молекул ЬФ и АО проводился по следующей схеме:

Здесь Aj и Pj соответствуют мономору АО и ИФ, Л}, Р^, Рк - агрегат а.м, содержащим 1 мономеров АО и J , к мономеров ill' соответственно. Сделано допущение, что равновесные константы самоассоциации ПФ, АО (Кр, Кд), а также константа ассоциации АС и ПФ (К) не зависят от числа молекул в агрегатах и комплексах. Получены выражения, определяющие значения наблюдаемого химического сдвига протонов красителей как функции неизвестных величин предельных химических сдвигов протонов молекул в ассо-циатах и константы ассоциации К. Величины предельных протонных химических сдвигов молекул в мономерах и самоассоциа--тах, а также константы Кр и Кд считались известными - они определялись независимо в тех же условиях растворителя. Концентрации мономеров красителей pj и а^ находились из системы уравнений, записанной на основании закона сохранения массы и законов действующих масс. Бее расчетные значения параметров, полученные на основании экспериментальных зависимостей различных протонов обоих красителей при различных условиях эксперимента (PQ =» const или Aq =const), оказались близки между собой, что свидетельствует об эффективности рассмотренной методики, применимой и при достаточно вы эких концентрациях молекул в растворе. Среднее по всем расчетным значениям величина 1U( 3300-300) л/моль значительно превышает константу димеризации ЬФ. Последнее по-видимому, связано с возрастанием роли гидрофобных взаимодействий комплексе 1:1 АО и ПФ по сравнению с димером ПФ в водном растворе из-за наличия двух гидрофобных метильных групп в молекуле АО. Значения предельных химических сдвигов S использованы для опреде эния наиболее вероятной структуры комплекса 1:1 АО и 11Ф. Ь комплексе, как и в димерах исследованных

(2)

красителей, имеет место антипараллельный стэккнг между хромофорами ароматических молекул. Угол закручивания плоскостей хро-.мофоров в комплексе принимает промежуточное значение между соответствующими углами в димерах Г1Ф и АО и составляет 23°^2°. Рассмотрен предельный случай модели комплексообразования красителей, соответствующий малым концентрациям молекул и учитывающий только димерную самоассоциацию взаимодействующих красителей. Проанализированы полученные результаты и установлены пределы применимости такой модели комплексообразования.

Ьзаимодействие мононуклеотидов с ароматическими лигандами.

Рассмотренная Еьпге схема взаимодействия молекул использована для анализа комплексообразования ПФ с 5'- АЫР, AMD с S' - dAMP и ö' - d QUP. Характе^концентрационных зависимостей химических сдвигов протонов красителей, а также'протонов оснований и сахарных остатков мононуклеотидов свидетельствует о том, что связывание молекул во всех изученных системах осуществляется, в основном, за счет стэкинга оснований и хромо- , форов красителей. Константа взаимодействия AUP с |

существенно выьо констант образования комплексов AKD + £/- j

- d AMP и ПФ + 5' - Ai:P, которые в пределах погрешности их опре- ! деления совпадают. Этот результат качественно согласуется с экспериментальным фактом, что для связывания AMD с полимерной молекулой Д1К и дезоксиолигонуклеотидами необходимо присутст- j вие гуанина в нуклеотидной цепи. Ранее при изучении кристалл«- j ческой структуры 1:2 комплекса А1Ш с С - dQKP ( Sobell ,1972) !

показана возможность установления специфической водородной связи между 2 - аминогруппой гуанина и кислородом треонина в пептидных кольцах антибиотика. Наличие такой связи в растворе подтверждается ЯМР-исследованиями комплексообразования AMD с олигонуклеотидами, содержащими dQ - dC -участки. ( Patel , 1974; К ugh et al. , 1977; Brown et al. ,1964). По-видимому, дополнительная стабилизация комплексов /¿ID с tf - dQMP водородными связями обеспечивает относительно высокую константу взаимодействия этих молекул в сравнении с другими рассмотренными здесь системами. В рассчитанных нами структурах 1:1 комплексов антибиотика с 5' - ¿QMP и 5 - <*ДЫР так же, ках и в отмеченном вше комплексе в кристаллическом состоянии, шестичленное кольцо основания ыононуклеотида

располагается над бензольным кольцом хромофора антибиотика, однако взаимная ориентация молекул в растворе и в кристалле несколько отличается, в частности, в растворе увеличивается степень перекрывания и угол поворота плоскостей молекул. Ь . комплексе ПФ с С'- АМР, где маловероятно установление специфических связей и основную стабилизирующую роль, по-видимому, играют дисперсионные взаимодействия, оба кольца основания мо-нонуклеотида нависают над хромофором красителя, плоскости молекул параллельны друг другу, угол закручивания их относительно друг друга составляет ~36°.

■ Взаимодействие ароматических лигаидов с динуклеотидами; методика расчзта параметров комплексообршования. Рассмотрена следующая схема образования комплексов в растворе: К* КД

N+N = N2 А + А =:= А2

Н1 К2 А + N = АН АН + Я дн

Здесь Кн и Кд - равновесные константы димеризации динуклеоти-да и красителя, и ^ - равновесные константы комплексооб-разования лиганда с одной и двумя молекулами динуклеотида соответственно. Количественная оценка параметров комнлексообра-зования производится на основании концентрационных зависимостей химических сдвигов протонов лиганда. Величина 81 для каждого протона красителя является функцией неизвестных параметров К^, К^, а также 8 J и & 2 - предельных значений химических сдвигов протонов лиганда в составе 1:1 и 1:2 комплексов. Константы К^ и К^ не зависят от вида протона и определяются как среднее по расчетным параметрам доя различных протонов. Значения = 61 , ( 1 =1,2) используются для определения структур комплексов путем установления соответствия этих величин ндуцированным химическим сдвигам исходя из карт.экранирования для азотистых оснований.

Комплексы ПФ с СрС и СрС. В процессе титрования изменялось содержание ПФ в растворе, исходная концентрация динуклео-тидов по, .ерживалась постоянной. Расчеты выполнены по различным наборам экспериментальных точек, относящихся к разным диапазонам концентраций ПФ. Сопоставление получаемых при этом

параметров попголило оценить адекватность используемой модели комплексообраэования и установить пределы ее применимости для даншгх молекулярных систем. Средние значения констант комплек-сообразования и составили ( в л/моль, Т=294 К) :140~30 й 700^1Ь0 .для комплексов ПФ с CpQI 7оО±1!Л) и 1с(£80 для комплексов ¡1} с ?рС. ,'1дн>1ые показывают, что при взаимодействии ПФ с (}рС предпочтительным является образование 1:1 комплексов, в то время как в растворе 11Ф с Ср£ более вероятно формирование комплексов с двумя молекулами динуклеотида. Соотношение между константами образования 1:2 комплексов ПФ с Ср£ и <«рС свидетельствует о наличии преимущественного связывания и® с лири-мидин-пупиновой последовательностью оснований в динуклеотидном . дуплексе. Значения индуцированных, химических сдвигов протонов в 1:2 комплексах ПФ с СрС1 и £рС оказались близки между собой, что предполагает сходство вероятных структур таких комплексов красителя с обоими изомерными динукдеотидами. Сравнение расчетной структуры 1:2 комплекса + Ср(» с той, которая наблюдалась в кристаллическом комплексе этих молекул ( Э. Ке1<11е et а1. , 19.7), показывает их хорошее соответствие. Структуры 1:1 комплексов отличаются в значительной степени, имеет место различная ориентация и степень перекрывания плоскостей оснований и хромофора красителя. Характер взаимного расположения молекул в 1:1 комплексе ПФ с Ср£ позволяет предположить наличие здесь Н-свяэи между аминогруппой ПФ и кислородом фосфата ди- • нуклеогида. В случае 1:1 комплекса ПФ с (¿рС ориентация молекул такова, что существенное значение может иметь электростатическое взаимодействие положительного заряда Н+ красителя и отрицательного заряда фосфатной группы динуклеотида. Ь этом комплексе наблюдается близкое к максимальному перекрывание плоскостей оснований гуанина и хромофора красителя, что предполагает более интенсивное стэкинг взаимодействие по сравнению о комплексом красителя с Ср£. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что реализация той или иной модели связывания красителя с одиночной нуклеотидной последовательностью завк^ит от последовательности оснований в цепи.

Комплексы АИР с Ср£ и СрС. В обоих случаях константа больше К£, так что Л11Г> преимущественно взаимодействует с одной молекулой динуклеотидов. Полученные результаты согласуются с известным фактом, что УЙ.О не связывается с двухспи-

ральной молекулой ГНК. Наблюдается определенное качестпенное сходство во взаимном расположении Л1.Х1 и ПФ в комплексах 1:1 с £рС - в обоих случаях основания динуклеотидов располагаются над центральными кольцами хромофоров лиганда. Однако степень перекрывания плоскостей молекул г 1:1 комплексе ПФ с (}рС значительно выше. Стабилизация 1:1 комплекса может осуществляться за счет водородных сгязей между нуклеотидами и аминокислотными остатками антибиотика. В 1:2 комплексе /¿13 с £рС антибиотик встроен в динуклеотидный дуплекс одним концом хромофора со стороны широкого желобка спирали. Существенно различное расположение хромофора Л.\.0 в 1:1 и 1:2 комплекса предполагает, что реакция присоединения второй молекулы динуклеотида к 1:1 комплексу в определенной мере энергетически невыгодна.

Комплексы А1..Р с дезоксицирибонуклеозидоонофосфатами. На основании исследования концентрационных затсимостей химических сдвигов протонов антибиотика изучено комплексообраэование с ¿(АрТ), ¿(ТрА), а(Ср£), <1(ЦрС). Равноьесные константы образования 1:1 и 1:2 комплексов антибиотика с ¿ИнрТ) и

аО'рЛ) в пределах погрешности совпадают друг с другом и почти на порядок меньше соответствующих констант для гуанин-содержа-щих динуклеотидов. Константа для 1:2 комплекса АМО с ¿(5рС) существенно выше аналогичной константы для других исследованных динуклеотидов. Это подтверждает известные экспериментальные результаты, согласно которым сайты <*(С-(;), "3.СТ-А) и <1 (А-Т) в олигомерах менее предпочтительны для связывания АКО , чем участки с ¿(5-0) последовательностью. При связывании антибиотика с с1(СрЯ) значение константы К^ для 1:1 комплекса значительно превосходит константу К^ 1:2 комплекса эти< молекул. Следовательно в растворе, также как и при комплексооб-разовании №0 с дирибонуклеотидами Ср£ и (¿рС происходит преимущественное связывание антибиотика с одной молекулой <1 (СрО-). Значения химических сдвигов для всех рассмотренных протонов АЛ) в 1:2 комплексах лиганда с й(АрТ) и ¿(ТрА) близки к соответствующим значениям протонных химических сдвигов в мономерной фо че антибиотика, что свидетельствует о слабом взаимодействии АУЛ с указанными динуклеотидами. Подобное имеет мес- ' то и для.1:2 комплекса антибиотика с ¿(Срй), в то же время в случае с с1(£рС) велгчины &2 существенно отличаются от 8 ш для всех протонов, что типично для интеркаляционного взаимодей-

стеия молекул. Сравнение структур комплексов 1:1 и 1:2 с деэ-оксидирибо- и дирибонуклеотидами одинакового нуклеотидного сос-тага показывает, что степень перекрывания основания и хромофора антибиотика существенно различается - в случае с дезоксидири-бонуклеотидами она значительно Еыше.

Комплексы ЭБ с а уС;^). Особенностью данной молекулярной системы е сравнении с рассмотренными выше является низкая константа димеризации красителя, соизмеримая с константой самоассоциации динуклеотидо в, вследствие чего б схеме комплексообра-эования учитывались обе эти реакции. Определена геометрия 1:2 комплекса ЭБ с <1 (Ср<^) (рис.1). Краситель интеркалирован в динуклеотидннй дуплекс со стороны атомов НЗ и 02 пар оснований, т.е. из узкого желобка спирального участка. Наличие фенольного кольца и этильных групп в положениях С и С хромофора красителя существенно сказывается на структуре комплекса, уменьшая степень перекрывания ароматических колец красителя и динуклеоти-дов. Наличие гидрофобного взаимодействия указанных молекулярных групп красителя с динуклеотидами, по-видимому, определяет наблюдаемое от..ичие геометрии 1:2 комплексов ЭБ с <1(Ср5) в растворе и кристалле. ( БоЪе11 сг а1. , 1977). Таким образом, выполненные исследования'показывают, что уже на относительно простых модельных система* - самокомплементарных динуклеотидах проявляется специфика взаимодействия ароматических лигандов. с определенными нуклеотидными последовательностями. Для более обоснованного переноса выявляемых закономерностей на нативные молекулы ДИг и РНК необходимы дополнительные исследования с использованием более длинных фрагментов нуклеиновых кислот.

У. ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПЛЕКСООБРАЗОБАНИЯ ПФ С САКО-КШШЕМЕНТАШсШ ДЕЗЖСИТВД>АНШЕ0ТИДАШ ■ РАЗЛИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОСНОВАНИЙ .

Для решения вопросов о селективности связывания ароматических лигандов с нуклеиношми кислотами необходимы целенаправленные исследования с использованием олигонуклеотидоь, отличающихся локпиэацией мест преимущественной посадки лиганда, нуклеотидными звеньями, фланкирующими выделенные сайты, а также числом таких сайтов в последовательности. Самыми короткими нуклеотидными последовательностями, пригодными для подобных исследований, являются тетрануклеотиды, имеющие три

потенциальных места интеркаляционного связывания. В данной главе методом одномерной и двумерной ЖР-спектроскопии (оОО кГц) изучено комплексообраэование типичного интерколятора 1Й с сако-комплементаршки дезокситетрарибонуклеозидтрифосфат&ми ij'- d(CpQpCpQ), Ь' - d(QpCpf,pC), L'-d(ApCpQpT) и Ь' - d (ApGpCpT). Первкй из тетракеров содержит два.С£ сайта, и которым ÜS? проявляет специфичность взаимодействия в дуплексе, второй третий тетрануг ~*еотиды имеют в центре по одно}.7 такому сайту, фланкированному с Ь' - и 3'- концов различными нуклеозкдаии. Последний тетрануклеотид не имеет ни одного сайта с пирикидин-пуринзвой последовательностью оснований. Вместе с тем, как показали исследования с динуклеотидами (гл.4), существует некоторая вероятность связывания и с пурин-г.иримидиновсй' последовательностью оснований в дуплексе, а при взаимодействии красителя с мономером такие участки нуклеотидной цепи имеют преимущество в сравнении с другими. Закономерности комплексообразования ПФ с тетра-нуклеотидами и структурные особенности комплексов различного вида проанализированы на основании изучения концентрационных зависимостей химических сдвигов необменивающихся протонов нук-леотидов и красителя. Данные двум рной гомоядерной корреляционной спектроскопии Я.1- N0ESY (напр.,рис.2) использованы для идентификации протонов в спектрах ^Н ЖР смешанных растворов, а также для качественного определения мест связывания красителя с тетрануклеотидами.

Взаимодействие 11$ С iL' - d(QpCpGpC). Измерения выполнены при двух условиях эксп римент'а - в одном случае при титровании поддерживалась постоянной концентрация ПО, в другом - тетра-нуклеотида. Характер концентрационных зависимостей химических сдвигов протонов 11Ф, наличие на экспериментальных кривых особенностей при концентрациях красителя и тетрануклеотида, близких к стехиометрическому соотношению 1:2, качественно свидетельствует о преимущественном образовании в растворе комплекса одной молекулы ПФ с дуплексом тетрануклеотида и соответствует интеркаляцконноП модели комплексообразования. Для количественной оценки взаимодействия Гй с тетракерок d(GpCpQpG) проанализированы различные схемы образования комплексов. Установлено, что адекватной эксперименту является схема, учитывающая помимо димеризации ПФ и тетрануклеотидов, следующие

Рис Л . Схематическое представление структуры 1:2 комплекс ЭВ с сЦСрС-). Вид в направлении, перпендикулярном плоскости хромофора красителя.

Рис.2. Спектр 2М-Ы0Е раствора 11Ф с тетрануклеотидом

¿(АЧ^рСрТ) при р0 =0,446 мЫ, М0=1,2 ..и, 1..

равновесные реакции в растворе:

«I

р + К PN Р +Н

Р +н2

При расчете по птой схеме наблюдаемый протонный химический сдвиг в ..голехулах красителя представляется в виде 5= P/P0(S«+2KpPSd +KnN5-l+K1K2K252+2K1K3pNS3+2KNK2K4S4) Величины 5Щ , Sd , К^ и К^ определены ранее (гл.З) при исследовании самоассоциации красителя и тетрануклеотида в тех же условиях растворителя. Искомые величины Kj - К^, S'j находились как параметры модели (L,) на основе экспериментальных концентрационных зависимостей, измеренных при двух указанных выие условиях проведения эксперимента. Получены следующие средние значения констант образования комплексов ( в .'./моль, Т= 298 К): KI=36CX}t6Cü, К2=9400*1000, K3=2t,CO±4üO, h4=U2l£I2G. Близость расчетных значений Kj и Kß позволяет предположить, что. при взаимодействии с одййОчно" нитью тетрамера влияние связывающихся молекул ПФ друг на друга незначительно. Связывание второй молекулы красителя с дуплексом тетрануклеотида в отличие от взаимодействия с одиночной нитью, имеет антикооперативный характер. Можно ожидать, что краситель интеркалирует преимущественно в центральный C-Q сайт и посадка второй молекулы в Д/Плекс маловероятна в.'соответствии с моделью "исключенного соседа". Предельные значения химических сдвигов протонов ПФ примерно одинаковы в Iii и 2:1 комплексах с одиночной нитью и в 1:2 и 2:2 комплексах с дуплексом тетрануклеотида. Это свидетельствует о том, что молекулярные структура в местах интеркаляции первой и второй молекул ПО я шлют с п сходными. Значения предельных химических сдвигов протонов ПФ в составе комплексов с динуклеотидами CpQ и QpC и тетрануклеотидом

d(GpCpGpC) существенно отличаются, что свидетельствует о различном характере встраивания красителя при его интеркаляции в дирибонуклеотид и соответствующий сайт дезокситетрануклео-тида.

Расчеты показывают, что вклад в общее равновесие различного типа комплексов определяется не только значениями равновесных констант реакций, но зависит существенно от соотношения

исходных концентрация тетрануклеотида и лиганда (рис.3). При г = н / Ро =1 относительное содержание всех ассоциатов, за исключением 2:2 комплекса, сравнимо по величине. При больших значениях г преобладающей становится доля 1:2 комплексов, что связано с увеличением вероятности образования так:структур по мире возрастания концентрации дуплекса в растворе. Максимум на концентрационных кривэт для 1:1 и 2:1 комплексов наблюдается при г , близких к стехиометричсскому соотношению.

Анализ структур комплексов ПФ с тетрануклеотидом сделал на основании рассчитанных предельных значений протонных химических сдвигов (1 =1,2,3,4) и 2К - |\|0Е спектра. Найденные значения д = ¿>п - для всех протонов красителя в составе комплексов находятся в пределах 0,Ь;Т,0 к.д., что свидетельствует о дос. ¿.точно сильном перекрывании плоскостей рассматриваемых. ароматических молекул. На рис.4 представлена наиболее вероятная структура 1:2 комплекса, полученная с использованием кривых экранирования Гейсснер-Претте и Пуллмана в предположении, что расстояние между азотистыми основаниями составляет б,С А. Краситель интеркалирован б С-О сайт из большого желобка спирального участка. Встраивание 11Ф в С-О- сайт подтверждается наличием кросс-пиков между протонами красителя и внутренних нуклеози-дов Нв-Н2 (СЗ), НВ-НБ (03) и'Нх-ПЬ (С2) в спектре 21.1-Анализ предельных значений 8 ^ и №я комплексов с одиночной нитью тетрануклеотида показал, что в этих комплексах Щ ориентирован боковым бензольным кольцом к нити тетрамера с максимальным перекрыванием плоскостей взаимодействующих молекул. При этом расстояние между плоскостями гуанина и цитозина . месте интеркаляции меньше, чем в комплексе с двойной спиралью и по оценкам составляет ™6,2 8.

В- гимодействке ПФ с. 6'- <1(СрйрСр£). Количественный анализ взаимодействия ПФ с ¿(СрСрСрС) показал, что как и в случае комплексообразования с <3.(£рСр£рС).экспериментальным дан-ны.. соответствует схема реакций (4). Полученные значения констант .(омплексообра .ования свидетельствуют о ..редпочтительном связывании красителя с двух-чшра^ьной структурой нуклеиновой кислоты. Наличие специфичности к пиримидин-пуриновой последовательности оснований при взаимодействии ПФ с дуплексом подтверждается при .равнении констинт К^ и К^ для д-ух изоь.орн^.с

Рис.3. Относительное содержание молекулярных комплексов в растворе профлавина с тетрануклеотидом <1 ((¡ССО в завис--мости от Г = й„/р,, при Ыо=0,68 мМ. 00

Рис.4. Структура 1:2 комплекса профлавина с сЦСССС). Вид на ОС-сайт в направлении, перпендикулярном плоскости хромофора красителя.

тетрануклеотидов. Константа образования 1:2 комплекса красителя с ¿(СрСЗрСрО), имеющим два С^-сайта, приблизительно ,вдвое превышает К^ для его изомера с одним таким сайтом.. Можно полагать, что ПФ интеркалирует в каждый С^-участок примерно с одинаковой вероятностью. Подобный характер интеркалк ;ии красителя подтверждается наличием в спектре 21.1-МОК кросс-пиков между протонами Ш и нуклеозидов 11^-НЬ (С1) и Н^-НЪ .(03),, а также Н2~Н2'(С2) и Н^-Н2'(С4) примерно равной интенсивности. Константа К4 образования 2:2 комплекса ПФ с <1 (СрЙрСр£) велика, более чем на порядок превышает соответствующую константу для изомерного тетрануклеотида, что согласуется с моделью "исключенного соседа". На концентрационных кривых для 1:1 и 2:2 комплексов при г *1 и для 2:1 комплекса при г ->0,5 наблюдается максимум. Это коррелирует с изменением концентрации мономеров ПФ и тетрануклеотида, а также димера тетрануклеотида в зависимости от г . Характерно, что соотношение между долями 1:1 и 2:1 комплексов для двух изомерных тетрануклеотидов

с1 (СрСрСрй) и а. (СрСр^рС) качественно не соответствует соотношению их равновесных констант К^ и Кд, Наблюдается меньшее . содержание таких комплексов ПФ с. ¿1 (СрОрСрЦ), хотя константы £Сд- и Кд здесь выше, чем при взаимодействии ПФ с 4(СрСрС;рС).

Взаимодействие ПО с Ь' - д. (АрСр^рТ) и Ь' -а (Ар^рСрТ) ■ Диализ концентрационных зависимостей показал, что использованная ранее для -содержащих тетрануклеотидов схема (4) не дает здесь удовлетворительного согласия с экспериментом. Адекватной оказалась схема, в которой предусмотрена возможность образования комплекса 1:2 11Ф с тетрануклеотидами д"/мя различными способами - непосредственное связывание красителя с дуплексом и формирование этого комплекса »путем взаимодействия м^-юмора тетрануклеотида с 1:1 комплексом, где ПФ играет роль "скрепки":

К1 К2 Р + И Рн Р + ¿'Н Р2Н

к3 ' - К4 (6)

РН + n РН^- р + ^ рн2

Необходимость учета "скрепочного" комплекса обусловлена тем, что рав1.~песные константы самоассоциации тетра' еров, ? чекгих концевые А-Т пары, существенно ниже, чем К у. для С(^-содер-

нащкх тетрануклеотидов. Расчет показал, что константы Kg для обоих тетрокеров много меньше Kj, т.е. связывание второй молекулы ГЭ с одиночной.нитью имеет антикооператиЕккй характер. Аналогично, интеркаляция второй молекулы в дуплекс с образованием 2:2 комплекса, так,те яено антикооперативна. Очевидно, краситель преимущественно встраивается в центральные сайты тетра-иеров, поэтому присоединение еще одной молекулы профлчвкна как к одино^.лой нити тетрануклеотида, так и к дуплексу маловероятно. Константа Kg, характеризующая формирование 1:2 комплекса через "скрепку", для последовательности d(ApCpQpT) значительно больше, чем для другого тетрамера. Показано, что в (JC-сайте расположение молекулы красителя не является оптимальным для присоединения второй молекулы тетрануклеотида, поскольку не обеспечивается достаточный стэкинг между хромофором красителя и основаниями присоединяющейся молекулы. Формирование такого комплекса должно сопровождаться переориентацией красителя в месте интеркаляции и, соответственно, дополнительными энергетическими затратами. Что касается вероятностей встраивания П5 непосре; -ственно в дуплекс, то они примерно одинаковые для обоих исследованных тетрануклеотидов. Расчетпме значения индуцированных химических сдвигов протонов Iß и дБ^ в 1:2 комплексе

близки между собой для обеих тетрануклеотидов. Таким образом, геометрия 1:2 комплексов не зависит от того, каким путем шло его .образование. Значения дЗ^ и довольно сильно разли-_

чаются, :ндуцированн1.:с химические сдвиги для всех протонов ПО значительно меньше в 2.1 комплексе в сравнении с 1:1 комплексом. При условии встраивания одной молекулы в центральный сайт можно полагать, что другая молекула присоединяется снаружи к концевым нуклеотидам, поскольку экранирование ее протонов незначительно. Расчет равновесия е растворе показывает, что с ростом

Г наблюдается возрастание доли 1:2 комплексов, формирующихся через "скрепку". При больших я содержание таких 1:2 комплексов ITi с d (ApCpQpT) становится превалирующим, в случае и., взаимодействия красителя с d (ApwpCpV) вклгд этих комплексов не столь значителен ввиду сравнительно большой доли 1:1 комплексов' во всем исследованном диапазоне г . Содержание 1:2 комплексов, образующихся путем интеркаляции красителя в дуплекс тетрамеров, несмотря на высокие значения копст^н-i К^ незначи- . тельно во всем диапазоне изменения г ,что связано с низкой

константой самоасс-оциации тетрануклаотидов. Анализ геометрии молекулярных комплексов, проведенный на основании рассчитан^ индуцированных химических сдвигов протонов взаимодействующих молекул и данных 2М--N0ESY показал, что структуры 1:2 комплексов красителя с рассматриваемыми здесь тетрануклео^идаки близки к тем, что наблюдаются в случае тетрануклеотидов d (Qt£pGpC) и d(CpQpCpQ), т.е. мало зависят от последовательности оснований и от того, какие нуклеозиды фланкирую', участок связывания с лигандом. Вместе с тем, характер нуклеотид-ной последовательности существенно влияет на вероятность образования таких структур б растворе.

yi. ттюдаиимчЕсш анализ взаимодействия

АРОМАТИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ. КРАСИТЕЛЕЙ С ОДИГОНУК-ЛЕОГИДАМИ в РАСТВОРЕ

'. Термодинамика комплексообразования 115 с динуклеотидами. Изучены температурные зависимости химических сдвигов протонов молекул в смешанном растворе НФ с CpQ- и QpC в тех же услог -ях растворителя, что и при концентрационных измерениях (гл.4). Для1 схемы реакций (3) рассмотрена модель, в которой наблюдаемый химический сдвиг протонов красителя определяется суммой вкладов от мономерной и димерной форм, а также от 11Ф в составе 1:1 и 1:2 комплексов с динуклеотидами. Функцией температурь! при этом являются мольные доли всех компонентов в растворе, записанные в виде квадратичных зависимостей от Т. Конкретный вид регрессионного уравнения для S составлялся с учетом известных значений мольных долей при Т=294 К и величин прр^ель-ньгх химических сдвигов протонов ИФ в мономере и ассоциатах, найденных на основе концентрационных измерений, а также в предположении, что при Т-373 К [15 находится в мономерной форме. Для оценки энтальпии и энтропии реакций агрегации ПФ и образования 1:1 ( aHj и j) и 1:2 ( Д.Н., и ^S^) комплексов с ди-чеотидами использованы зависимости Вант-Гоффа lnK=f (1/Г). Существенно, что найденные в результате таки-: расчетов термодинамические параметры реакции Д1 /.ериэации ¡1Ф как в растворе с CpQ, так и р растворе с QpC хорошо согласуются друг с другом и в пределах Погрешности их определения совпадают с результатами, полученными при исследовании непосредст: знно сс оаг -соцкации этого красителя (гл. 3). 'Для 1:1 и 1:2 комплексов 11Ф

с динуклеотидами абсолютные значения энтальпии понижаются по сравнению с реакцией дккериэодии красителя и составляют в (ккал/моль): лНт - - (8,С±0,С), *.Н2 = - (1,Ь±0,3) и = = - (8,0-0,8), AHg = - (1,4±0,3) при взаимодействии с СрÜ и ОрС соответственно. Энтропия комплексообразования иФ с динуклеотидами выше, чем для реакции самоассоциации, а для 1:2 комплекса положительна, что подтверждает высказанное ранее предположение о роли гидрофобных взаимодействий при формировании такого типа комплексов.

Термодинамика комплексообрадования ПФ с дезоаситетрануклео-тидами. Измерены спектры Ш? растворов ПФ с d(GpCpQpC),

d(CpQpCpQ), d (ApCpQpT), d (ApQpCpT)_ при различных температурах в диапазоне от Т=278 К до Т=ЗСЬ К. Наибольшие смещения резонанс«« линий наблюдаются для необмениьающихся протонов красителя, менее всего подвержены температурным изменениям сигналы протонов HB (Q) и KG (Т). Расчетные зависимости для наблюдаемого химического сдвига записывались в соответствии с результатами, полученными при концентрационных исследованиях %тлЛ), где определены схемы реакций, адекватше эксперименту. Термодинамические параметры лН и д.3 для реакций комплекСообразования 115 с тетрануклеотидами рассчитывались двумя способами.

Способ I. Методикаиредусматривает применение парагетри-ческих регрессионных уравнений для описания мольных долей от температуры. Использование регрессионных уравнений второго по- ' рядка относительно температуры, как это делалось'в случае само--ассоциации красителя и комплексообразогания с динуклеотидами, оказалось недостаточным для аппроксимации экспериментальных кривых. В связи с этим, для комплексов 1:2 и 2:2 при взаимодействии Iii с d(GCQC) и d(CGCQ) и для "скрепочного" комплекса 1:2 в растворе с d(ACQT) и d(AQCT) были использованы зависимости, учитывающие кооперативный характер температурных превращений в этих ассоциатах. Конкретный вид регрессионных уравнения составлялся с учетом известных мольных долей при Tj-293 К и в предположении, что при Т~373 К практически ».есь краситель находится з мсномерной форме. Установлены зависимости ст температуры относительного содержания C/PQ различных компонент в растворе (рис. Ь). При низких температурах краситель преимущественно находится.в связанном состоянии. Доля 1:1 комплексов остается зна-

чительной вплоть до высоких температур ~7Ь*80°С для растворов красителя с <1 (ССЦС) и <1 (ССС(|) и ~ ЬЬ-ь при связывании ПФ с й (ЛСЦТ) и а(ЛССТ). Температурные зависимости 1:2 комплекса имеют характерный вид кривых плавления для двухспи-ральных олигонуклеотидов. Температура перехода 1; , при которой мольная доля комплекса уменьшается вдвое по сравнению с его содержанием при низких температурах, на 12*11° превышает температуру плавления для тетрануклеотида без лиганда. Небольшую температуру перехода имеет 1:2 комплекс красителя с ¿(СйСС), в то время как подобный комплекс с <1(АССГ) обладает наименьшей тепловой стабильностью ( 1; ~ 26°С). Комплексы тетрануклеотидов и в мономерной и дуплексной формах с двумя молекулами ПФ являются значительно менее прочными, чем комплек-' сы с одно!' молекулой. Расчетные температурные зависимости С/Р0 использованы для определения энтальпии и энтропии реакций коми-лексообразования по соотношениям Вант-Гоффа. Найденные значения

Рис. Б. Температурные зависимости мольных долей ПФ с d(GpCpQpC) (спл^ишые-линии) и d(CpGpCpQ) . (пунктирные ..„нии). I I' - комплексы 1:1: 2,2',- комплексы 1:2; 3,3'- комплексы 2:1; 4,4'- комплексы 2:2.

Таблица. Термодинамические параметры all ( в ккал/моль) и ^S (в кал/моль-К) реакций образования комплексов ЛФ о тетрануклеотидами

Тетранук-'Вид ком- 'I способ расчета 'И способ расчета

леотид плехса дН л s дН

d (CQCQ) 1:1 -(22,0*1,8) '-(60±Ь) % -'(I8,4±I.4) -(40,0*4) 1:2 -(4,-(4,1-0,4) -(4,6=0,4) +(3,о*0,3)

Л(Гтм 1:1 -(20,Ь±1,6) -(Ь3±4) -(17, Oil,4) -(41,4*3,6} d(QCQC) I:2 _(4,6*0,4) +(I,G-0,o) -(2,¿-0,4)

d(ACQT) 1:1 -¡¡^J, -¡g^, -gb^.J, -go.gU,

« 8 :№U

Способ 2. Входящие в выражения для наблюдаемых химических сдвигов равновесные константы комллексообраэования и самоассоциации молекул выражены через параметры л11 и aS в виде К(Т) = = ехр ( AS/R - АН/ВТ ). Термодинамические параметры для реакций самоассоциации П5 и тетрануклеотидов определены ранее (гл.З) в тех же экспериментальных условиях. Мслользованы полученные при концентрационных исследованиях значения предельных химических сдвигов S>m , ,'Ет - З4. так что наблюдаемый хими-. ческий сдвиг представляется функцией 8 искомых параметров дН i , д ( 1=1,4), которые определялись путем минимизации функционала невязки экспериментальных и расчетных значений S(T). Поскольку параметры дН и &S не зависят от вида протона, минимизируемая сумма составлена по общей совокупности эксперимеиталь-• ных дань_л для всех'протонов красителя. Существенно, что термодинамические параметры, найденные двумя различными способами обработки данных (таблица), в пределах погрешности их определения согласуются друг с другом. Значения энтальпии для всех типов реакций комплексообразования отрицательны, но абсолютные значения этих геличин существенно различаются, что отражает различнее влияние факторов, датадих положительные или отрицательные вклады в общий тепловой эффект реакций. Достаточно большие по абсолютной величине отрицательные значения дН для 1:1 комплексов могут, в первую очередь, определяться ролью стэкинг вза; модействия азотистых оснований с хромофором красителя и электростатических взаимодействий между катионами красителя и отрицательным зарядом фосфатных групп нуклеотида. При образовании 1:2 комплексов следует ожидать

болыгее, чем для 1:1 комплексов влияние процессов, .приводящих к повышению энтальпии, таких как раздвижение находящихся в состоянии вертикального стэкинг взаимодействия пар оснований в комплексе с образованием полости для встраивающейся молекулы, изменение сольватной оболочки при формировании комплекса. Поло*. гельный энтропийный вклад, определяемый гидрофобными взаимодействиями, может в сущестгенной мере проявляться в случае 1:2 комплексов красителя с дуплексом тетрануклеотида, что подтверждается полученными данными.

В приложении I проанализировано экранирующее действие нуклеотидной пары на протоны интеркалированного красителя и на протоны соседней пары оснований при различных конформационних состояниях комплекса. Представлены результаты расчетов экрани- • рования протонов 11$ нуклеотидшми парами C:Q и А:Т в комплексе и экранирование протонов оснований в участках двойной спирали,- образованны? самокомплементарными b' - GC - 3' и С' - А'Г - 3' нуклеотидшми последовательностями. Выявлены наиболее значимые конформационные параметры и области их изменения, которые в первую очередь, должны рассматриваться при определении геомет-: рии комплексов по найденным на основе экспериментальных данных ШР предельным значениям химических сдвигов протонов взаимодействующих молекул.

. В приложении 2 представлены таблицы экспериментальных значений химических сдвигов протонов красителей и нук'леотидов для. всех молекулярных систем, рассмотренных в работе.

Б приложении 3 дано обоснование использованного в работе метода обработки экспериментальных данных.

• . OCliGBlíliE РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДи

I Исследование одномерных и двумерных (2M-N0ESY) спектров h ШР растворов ароматических молекул красителей ПФ, ЭБ, AI.'iD с moho-, ди- и тетрануклеотидами различного нуклестидного cojTüBa и последовательности оснований в идентичных условиях растворителя позю..лло на основе введенных модельных представлений выполнить количествечный анализ процессов взаимодействия молекул по эксп риментальным концентрационным зависимостям протонных химических сдвигов и установить основные виды образующихся в рас.воре комплексов,■определить константы равновесия

и предельные значения химических сдвигов протонов молекул в составе комплексов.

2. Изучение само- и.гетероассоциации акридиновых красителей ПФ и АО, самоассоциации дирибонуклеотидов СрС, ЧрС и дезокситетрануклеотидов <1 (5рСр£рС), а (СрСрСрС}), й(АрСрарТ),

б. (АрДрСрТ) шяеило следующие основные закономерност: : в ди-мерннх комплексах красителей имеет место антипараллельная ориентация хромофоров при расстоянии между плоскостями молекул 3,4 Я, угол поворота хромофоров относительно друг друга зависит от характера их-боковых групп; наибольшую.термическую стабильность среди исследованных тетрануклестидньгх последовательностей ю-е-ет дуплекс [а (Ср£рСра)] абсолютные величины энтальпии плавления дуплексов в расчете на I моль пар оснований в ди- и тет-рануклеотидных последовательностях примерно вдвое ниже известных значений для полимерных молекул нуклеинов;.:* кислот, что связано с возможностью "скольжения" комплементарных нитей относительно друг друга и раскрытия концевых пар. Определены на основе кооперативной и некооперативной моделей взаимодействия молекул равновесные константы, параметры кооперативности, термодинамические характеристики реакций, значения предельных ■химических сдвигов протоноц молекул в мономерах и ассоциатах.

3. Впервые определены пространственные структуры молекулярных комплексов 1:1 ПФ с С- АКР, AI.1I с С'-<1А1;Р и С'-аЭДР: 1:1 и 1:2 комплексов ПФ с Сра и СрС, а(АрСрСрТ),

аСАрбрСрТ) и А1,Ю 'с , (Ср5); а(СрС), СрЧ, СрС; 1:1, 1:2, 2:1, 2:2 комплексов ПФ с 4 (СрСрСрС), а(СрСрСрС) в растворе. Наблюдается геометрическое соответствие структур комплексов в растворе с известными структурами подобных молекулярных комплексов при низкой гидратации ( в кристалле) в случае относительно простого интеркалятора ПФ, не имеющего в сравнении с другими рассмотренными ароматическими лигандами массивных заместителей на хромофоре.

4. Структуры 1:2 комплексов, образованное в результате интеркаляции ПФ в дирибонуклеотиды СрС» и СрС. а также е соответствующие сайты дезокситетрануклеотидов не зависят от последовательности оснований в цепи и нуклеозидов, фланкирующих участок связывания с лигандом. Ориентации хромофора ПФ отно-

сительно азотистых оснований в 1:2 и 2:2 комплексах с -содержащими тетрануклеотидами являются сходными. Найденные для ИФ закономерности не наблюдаются при связывании с нуклеотидными последовательностями структурно более сложного лиганда /¿113 . В случае взаимодействия красителей с одноцепочечными фрагментами нуклеиновых кислот характер комплексообразования зависит как от нуклеотидного состава, так и от последовательности оснований в цепи. Расстояние между плоскостями соседних оснований в комплексах ароматических лигандов с одиночной нитью меньше, чем в комплексах с двухспиральными молекулами нуклеиновых кислот.

Ь. Показано, что избирательность взаимодействия ароматических лигандов с определенной нуклеотидной последовательностью проявляется уже на коротких фрагментах нуклеиновых кислот- ди-и тетранукльотидних .дуплексах. Получены количественные данные, характеризующие преимущественное связывание ПФ с пиримидин-пури-новой последовательностью оснований в дуплексе, АМБ - с цури..-пиримидиновой дезоксидинуклеотвдной последовательностью [¿(СрС)] 2- Установлено, что АУЛ) практически не связывается с АТ - и ТА участками нуклеотидной цепи. Двумерже спектры свидетельствуют о преимущественном встраивании ¡1Ф в СЦ-сайты тетрамеров. Интеркаляция красителя в дуплексы тетрануклеоти-дов отвечает модели "исключенного соседа". При взаимодействии с дуплексом [а (СрСрСрС)] ^ краситель интеркалирует в каждый из двух —ОС;— сайтов с примерно одинаковой вероятностью, посадка втор'Л молекулы лиганда в [¿((^рСрСрС)]^ [а (АрСр(}рТ)] ^ и [а(АрйрСрТ)]^ маловероятна. Связывание 11Ф с фрагментами нуклеиновых кислот зависит но только от последовательности осноь...-ний в месте интеркаляции, но и от вида фланкирующих этот сайт нуклеозвдов, что отражает возможности конформационных перестроек различных фрагментов при комплексообразовании молекул. Содержание различного типа комплексов в растворе зависит от соотношения исходных концентраций взаимодействующих молекул ( г ) и последовательности оснований в нуклеотидной цепи, кнтеркалированные комплексы красителя с двухспиральными молекулами ди- и тетранук эотидов преобладают в растворе при значениях г . ,, значительно превышающих стехиометричес-кое соотношение. Ь случае г "1 вклады различных

ассоциированных и мономерных форм в наблюдаемый химический сдвиг соизмеримы, что необходимо учитывать при интерпретации экспериментальных результатов ЯМР в подобных молекулярных системах .

б. Показана возможность дифференцированного определения теплогмх и энтропийных эффектов реакций образования различного гида комплексов красителей с компонентами нуклеиновых кислот в растворе на основе совместного анализа концентрационных и температурных зависимостей химических сдвигов протонов лиганда. Найдены термодинамические параметры для комплексов 1:1, 1:2, 2:1, 2:2 ПО с ди- и тетрануклеотидами. Среди исследованных структур термически наиболее стабилен 1:2 комплекс с

[а.(СрСрСрС)] р. Комплексы с двумя молекулами красителя термически менее устойчивы, чем 1:1 и 1:2 комплексы. Сравнение изменений энтальпии и энтропии в реакциях комплексообразования красителя с одно- и двухцепочечными фрагментам;: нуклеиновых кислот свидетельствует о более существенном влиянии гидрофобных взаимодействия при связывании лиганда с дуплексами оли-гонуклеотидов.

Приношу глубокую благодарность доктору физико-математических наук, профессору ВЕСЮШСВУ Алексею Киконовичу за консультативную помощь при выполнении настоящей работы.

Основное содервание диссертации опубликовано в следующих работах

1. Веселков Й.Н.,Дыыант Л.Н..Куликов З.Ф. Применение вариационных методов обработки экспериментальных данных при исследовании агрегации молекул акридиновых красителей методом ядерного магнитного резонанса высокого разрешения //Хим.физика,-1984.-Т.3, К 8,-С.П01-И08,

2. Куликов 3.Л.,Веселков Й.Н.,Дымант П.Н.Применение ассоциативного вариационного принципа для обработки данных физического эксперимента //Укр.физ.яурн.-1934.-Т.29,N10.-С.1477-1464.

3. Куликов 3.Л.,Дымант Л.Н.,Семенов В.М.Об одном вариационном методе идентификации в приборостроении // Приборостроение, Киев, "Техника".-1383.-Вып.34.-С.42-46.

4. Investigation of the aggregation of acrldine dyes in aqueous solutl n by proton HMR // fi.N.Ueselkov.L.N.DJlnant.L.S.Karaua-Jeu,E.L.KulikQv.//Studia biophysica.-1985.-U.106.-P.171-180.

5,. Веселков fl.H,.Дымант Л.H,.Куликов 3.0, Исследование агрегации молекул акридинового оранжевого методом протонного магнитного резонанса/ДСХ.-1985.-Т.26.-С.43-46.

6. Веселков Й.Н.,Дымант Л.Н..Барановский С.0.Исследование ассоциации красителей акридинового рада методом протонного резонанса // Хим.Физика.-1986.-Т.5.-С. 318-323.

7, Веселков Й.Н.,Барановский С,0., Дыыант Л.К. Исследование ассоциации красителей акридинового рада методом ПНР//Хим.физика. -1986.-Т.5.-С.316-323.

.8,.Веселков Й.Н..Дымант О.,Барановский С.О.исследование взаимодействия профлавина с аденозинмонофосфатом в водном растворе методом ПКР // Хим.физика.-1986.-С. 1334-1339.

9. Весел.:ов Й.Н,,Дымант Л.К..Барановский С.О.Исследование взаимодействие профлавина с изомерными рибонуклеозиднонофосфатами СрС и СрС методом ПМР //Нолекулар.биология.-1986.-Т.20.Н5.-С.

■ 1244-1250,

10. Веселков Й.Н.,Дымант Л.Н.Исследование структур комплексов про-фллвина с динуклеотидами в водном растворе методом Н ЯНР // Вурн.структ.химии.-1986.-Т.27,Н6.-С. 73-78.

И. Дымант Л.Н..Веселков Й.Н..Барановский С.О. Использование ассоциативного вариационного принципа дла оптимизации обработки результатов наблвдений // Изв. вузов СССР, сер."Приборострое-н-е.-1986.N 1<.-С.7-13. . ■

12. Куликов 3.Л.,Дымант Л.Н..Весе.ков Й.Н. и др.Повышение точности приборных устройств пут!j'реализации алгоритма на основе ассоциативного ь.риационного принципа// Приборостроение. -К.-1986, -Вып.38.-С.83-88.

13. Веселков fi '1.,Дыыант Л.Н.,Куликов Э.Ф. Исследование сам.ассоциации молекул профлавина и акридинового оранжевого в водном

растворе методом ЯИР Н// Теоретич.и эксг.ерим.химия. - 1987.-Т.23.-С.373-376.

14. Веселков А.Н.,Дымант Л.К..Барановский С.О.Определение термодинамических параметров взаимодействия профлавина с дирибонукле-озидыонофосфатами CpG и GpC в водном растворе по данным протонного магнитного резонанса //Молекуляр.биология.-1S87.-T,21. -С.1110-1116.

15. Djiaant L.N. ,Ueselkov fl.N. H NMR deteraination of therodynaoi-cal parameters of isonerlc diribonucleoslde aonophosphates CpG and GpC diserlsation and conplex fornation ulth proflavine

• in aqueous solution // Proc.of WATOC-8? Confess.- Budapest,-1987.-P.32.

16. Ueselkov fl.N..Karauaeu L.S. .DJlaant L.N.PKR study of forsation between proflavine and rlbonucleoside- aonophosphates in aqueous solution: i.Structure analysis// Studia biophyslca.-lS87. -U.12Q.N1.-P. 87-97.

17. Ueselkov A.N..Karauaeu L.S.,Djiaant L.N. Proton aagnetic resonance Study of coaplex foraation between proflavine and diri-bonucleoside aonophosphates in aqueous solution: 2.Therzodyna-Bic analysis // Stud, biophys.-1987.-U.120, Ml.-P.99-107.

18. Djiaant L.N..Ueselkov A.N. H-NHR deternination of theraod\..a-aical paraaeters of isoaeric ribodinucleoslde nonophosphates CpC and GpC dinerization and duplex foraation ulth proflavine In aqueous solution// Proceeding of KATOC-87 Coneress.-Budapest.-1987.-P.92.

19. Дымант Л.Н..Веселков A.H..Барановский С.О. Алгоритмы обработки результатов измерений на основе ассоциативного вариационного принципа в задачах с несколькими параиетрами//Приборостроенке. -К.-'987.-Вып.39..-С.81-84. .

20. Веселков А.Н..Дыман- Л.Н. Ячет кооперативное™ в модели самоассоциации акридиновых красителей// Хим.физика. -1988.-Т.7.-С. 715-718.

21. Дымант Л.Н..Веселков А.Н. Исследование самоассоциации дирибо-нуклеозидыонофосфатов CpG и GpC в водном растворе методом ПНР// Биофизика.-1988. -S4.-C.728.

22. Барановский С.Ф..Веселков ft.Н..Дымант Л.Н.Исследование ассоциации биологически ваяных ароматических молекул в водном растворе методом Н ЯИР// Биофизика.-1988.-Т.33,вып.5.-С. 906.

23. Ueselkov fl.N.,Djiiant L.N. .Baranovsky S.F. PKR investigation of the association of biological active aroaatic aolecules in aqueous solution// The book of abstracts of Int. Synp. on the electronic structure and properties of ao'ecules. Dubrovnic-Cavtat.-1988.-P.94.

24. Веселков fl.H..Барановский С.Ф., Дымант Л.Н. и др. Определение параметров комплексообразования структур комплексов ароматических лигандов с мононуклеотидами в растворе по данным Н SUP, '

Биофизика.-i388.-Т.33.-С. 538-539.

25. Веселкоз fi.H..Барановский С.О., Дичант Л.Н. и ар. Определен»! параметров аомплаксообразованиз и структур комплексов аракати-ческих лигандоз с динуклеотидами в растворе по данник Н ЯКР/, Биофизика.-1S88.-Т.33.N4.- С.728.

25. Djicant L.K..Ueselkov fi.H. ^H-NKR deteraination of the interaction of proflavine and actincaycln D uith isoneric dlribonu-cleoside scnophospadtes Cp£ end GpC ir. aQuoous solution// Abs. Int.Synp.on the electronic structure and properties of ..olecu-les and crystals.flubrovnic-Cavtat. -1988.-P.73.

27. Дкаант Л.Н..Ьеселков A.H..БаранозскиП С.О. и др.Применение ассоциативного вариационного принципа в задаче редукции к заданному прибору//Пр!!бсростроекие,К.-1988.-N40.-С.55-60.

26. Веселков А.Н..Дымант Л.Н..Барановский С.О. Термодинамические параметры саиоасссциации молекул прсфлазика в водной растворе // "'ии. сизика.-1989.-Т. 8.N9.-С ..1282-1285.

23. Всселксв Й.К., Диыант Л.Н. Кеамолекулярные взаимодействия в ■ комплексах ароматических лигандсв с дикуклеотидаии в растворе ' и кристалле// Биофизика.-1989.-Т.34.-С.331.

30. lieselkov* fi. Ji. ,BJ iaant L.N..Baranavsky S.F. РНЙ study of cospl-ex forcation between actinooycin D- and deoxyribodinucieoti-des// fibs.inter.conf."Theory of er.vironsental effects on sol?-cular structure and cheaical reactivity".Canada,Xeufondland, -196S.-P. 76.

31. Дымант Л.H,,Рыбаков Й.Г..Веселков fi.H. Ксвета спектрофотометра для исследования релаксационных процессов в растворах полиме-

.ров // Приб. и техн. эксперимента. - 1989.- НЗ.- С.222-224.

32. Веселкоз fi.H.. Дымант П.Н., Рыбаков ft.Г.Способ определения характерных времен релаксации структурных переходов в растворах ДНК , ' йвт.свид. N1511646.-1969.

33. Веселков fi.H..Рыбаков Й.Г.,Дымант Л.Н. Устройство для формирования температурных реяииов при оптических исследованиях релаксационных процессов в растворах полииеров // йвт.свид. Н1498188.-1989.

34. Веселков А.К.,Дыкант Л.Н..Барановский С.О.Определение структур комплексов и термодинамических параметров взаимодействия проф-лавина с динуклеотидами в водном растворе по данным Н-ЯНР // Молекулярная физика и биофизика водных систем.-Л., 1989.-В.7. -С.113-133.

35. U-selkow ft.N.,D'leant L.H., -Н NHR lnvestij tion of selfassocl-ation of acridine dyes in So! tion using cooperative and non-cooperative Eodels// Pr i;lnt.Syap.on applied theoretical che-nistry.Cuba.ilabanaJuly 2-6.-1990.-P. 79.

36. Ueseikov fi.N. ,'Djinant L.N..Baranovsky S.F. H NMR investigation of cospleii rorsation between proflavine and *.jridin& ore. je in aqueous solution//Proc.of lnt.Synp.on applied theor.chain.Cuba,

Habsna.-iS90.-P.79.

37. Ueselkov fi.H.,Djleant L.U. The structures of the cosplexes and the nature of irdernolecular interactions in the conplexes of aroaatic ligands with dinuclectides//Abs.II HORLD Congress of the theor.org.chea. Canada,Toronto.-1990.-Dfl-16,P. 264.

38. Ueselkov Я..Ч. ,Dj i aant L.N..Baranovsky S.F. H Ш investigation of the interaction of antibiotic actir.aaycin D uith 'ecxyribo-and ribonucleotides in aqueous solution//fibs. II «ORLQ Congress of t>:э theor. org.chen.Canada,Toronto.-1990.-DS-18. P.265.

39. Веселков й.Н.,Дэрис Д.,Дьмант Л.Н. ,Пзркес 'X. Д'ипп Д. 1Н- и 2Н-

Н SMP исследование самассоциации дезокситетрэриоенуклеозид-трифссфатов различной последовательности оснований в водном растворе // Биополимер« и клетка.-1991.-7.7,N5.-С. 15-22.

40. Ueselkov fl.K.,Davies D. .Dj iaant L.N.,etc. H KI'.R study of self-association of decxytetranucleotides uith different nucleoside sequences in aqueous solution// Proc.-31-st Sanibel syaposiua. Florida.USA.-!S91.-P.53.

41. Cavies D..Ueselkov fi.N.,Djinant L.N.,Sigaev U.fl. Thersiodynaai-cal paraaeters of self-associaticn of deoxytetranucleotides in aqueous solution//Abs.collection of Int.Syi3p.of recent advance In cfces.and Hcl.biol.cf cancer research. Beijing, China.-К Л. -P.108.

42. Davies П.,Ueselkov Й.Н.,DJiaan^ L,N.,Parkes H.£. л NHR comparative study of ccaplex forcation between proflavine and isomeric deoxytetranuclectides uith reverse base sequence d(ECCC) and d(CSCG; in aqueous solution // ftbs. Int. Meeting "fldv. in bicaolecular simulations".Obernai.France.-1991.-P.67.

43. Веселков А.Н..Дзвие Д..Дынант (!.Н..Паркес X.Исследование взаимодействия профлавина с дезокситетрариоонуклеозидтркоогфатоы ' dtfipopGpT) в водном тастеоре методом Н-ЯМР спектроскопии // Биополимеры 'и клетка.-1991.-Т.7.N6.-С.5-15.

44. Davies D.B..Ueselkov A.li., D; inant L.K., Shipp ¡).. Sigaev U.fl.

H-KHR study of couplex forsation between proflavine and deoxytetraribonucleoside triphosphates 5'- diflGCT) and 5' -d(ftCGT) in aqueous solution// Prog. 7 Inter.Cor.gr.Cuantua Chemistry. Mentor.,France.-1991 .-P. 102.

45. Зеселков Й.Н.,Дэвис Д.,Дыыант Л.Н. .Паркес Х.,Сигаев З.й. Исследование самоассоциации нолекул дезокситетрарибонуклеозид-трифосф5тоз dtGpCp£рС> а растворе методом одномерной и дь^мер-ноЯ Н ЯНР спектроскопии// 2урн.стр';кт .химии.-13У2.-Т.33, N3. -С.75-82 .

45. Веделков Й.Н.,Дэвис '¿..Дымант Л.Н. Взаимодействие акридинового красителя с дезокситетрануклеотид-зми различной последовательности оснований в воднок растворе//5ислолиыеру и клетка.-1992. -Т.8,N1.-С.23-35.

47. Веселков Й.Н.'.Дзвис Д.,Диизнт Л.Н.,Паркес X. Исследование езе

имодействия профлавина с дезокситетрарибонакдвазидтрифосфатоы 5* —dCСр£рСр£) в водной растворе методам одномерной и двумерной Н-ЯКР спектроскопии//' Нурн. струк. химии,-1992.-Т.33, N4.-С. 82-91.

48. Gavies ü.,t)eSelkov fl.N..Djioant i.К. .Parkes H. H LVR Investigation oí tne interaction of proflavine uith the deoxytetrari-bonucleoslde 5'-dCtpCpUpC) in aqueous solution // Mol. Biol 1992.-U.25,N 8.-P.1177-1188.

49. Дзвкс Д,,8сселков Д,Н.,Димант Л.H,,Паркес X.Исследование взаимодействия профлавина с дезокситетрануклеозидтрифосфатом 5*-d( ApGpCpT ■> в водном растворе методом одномерной и двумерной

Н-ЯМР спектроскопии // Биофизика.-1S92.-Т.37.Bun.1.-С.23-33.

50. Дь-кант Л.Я..Веселков Й.Н. Термодинамика взаимодействия акридинового красителя профлавина с дезокситетрануклеотидом 5'-d(fipCpEpT)// Хим. физика.-19S2,-Т.11,К7.-С.921-927.

51. Зесель^в Й.Н., Дзвис Д., Дымант Л.Н., Паркес X, Термодинамический анализ взаимодействия ярофлавина с дезокситетрануклеоти-дом 5'-d(C£C£) по данным протонного магнитного резонанса // Еурн. структ. химии.-1932.-Т.33,Н4,- С.92-99.

52. Веселков fi.H., Дзвис Д., Дымант Л.Н. Термодинамический анализ взаимодействия акридинового красителя профлавина с дезокситет-рануклеотидами различной последовательности оснований по данным Н ЯКР // Молекуляр.биология.-1992.-Т.26.Вып.4 -С.780-792.

53. Веселков Й.Н.,Дзвис Д.,Дымант Л.Н.,Паркес Х.Дипп Д. Взаимодействие профлавина с дезокситетрарийонуклеозидгрифосфатом 5'-dCflpGpCpT): термодинамический анализ по данным Н ЯИР //

. -Биофизика.-1992.-Т.37.Вып. 5.-С. 851-857.

Информация о работе

Дымант, Леонид Наумович
доктора физико-математических наук
Москва, 1993
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы