Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Серологическая диагностика лихорадки Западного Нила

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Шишкина, Екатерина Олеговна

Список сокращений.

Введение.

Часть I. Литературный обзор. Лихорадки Западного Нила (ЛЗН)

1. История изучения вируса Западного Нила (ЗН).

2. Классификация и характеристика вируса ЗН.

3. Эпидемиология ЛЗН

3.1. Распространение вируса ЗН.

3.2. Заболеваемость и летальность при ЛЗН.

3.3. Сезонность ЛЗН.

3.4. Иммуноструктура населения к вирусу ЗН.

3.5. Переносчики вируса ЗН.

3.6. Резервуары вируса ЗН.

4. Клиническая картина ЛЗН.

5. Патологическая анатомия при ЛЗН.

6. Лечение

6.1. Принципы лечения больных ЛЗН.

6.2. Экспериментальная оценка активности противовирусных препаратов.

7. Специфическая диагностика ЛЗН

7.1. Вирусологическая диагностика

7.1.1. Методы выделения вируса ЗН.

7.1.2. Методы индикации вируса в полевых и клинических материалах.

7.2. Серологическая диагностика ЛЗН

7.2.1. Методы обнаружения специфических антител у больных ЛЗН и эффективность их применения.

7.2.2. Динамика различных видов антител у больных ЛЗН.

8. Профилактика JI3H.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Серологическая диагностика лихорадки Западного Нила"

Актуальность проблемы.

В августе-сентябре 1999 г. на юге Европейской части России, а также в Нью-Йорке и его окрестностях практически одновременно возникли эпидемические вспышки лихорадочных заболеваний с преобладанием нейроинфекционных форм и высокой смертностью (7-12,5%), этиологически связанные с вирусом Западного Нила (ЗН). Вирус ЗН относится к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus и антигенному комплексу вируса японского энцефалита, к которому принадлежат также вирусы энцефалитов Сент-Луис (Америка), долины Муррей (Австралия) и некоторые другие. Передается с укусами комаров.

Вирус ЗН является одним из наиболее широко распространенных арбовирусов. Его ареал охватывает огромные территории Южной, Центральной и Восточной Европы, юг Западной Сибири, Среднюю Азию, Казахстан, Южную и Юго-Восточную Азию, Океанию и Австралию. Доказательства активности вируса ЗН в Северной Америке (Нью-Йорк и его окрестности), летом 1999 г. были получены впервые.

Сотни случаев лихорадки Западного Нила (ЛЗН) были диагностированы в начале 50-х годов в Израиле. Во время эпидемии в ЮАР (1974 г.) было зарегистрировано примерно 3000 больных. В 1994 году в Алжире заболело около 50 человек. Отдельные случаи или вспышки лихорадки ЗН наблюдались в Азербайджане, Таджикистане, Центрально-Африканской республике, Заире, Египте, Эфиопии, Индии, на Мадагаскаре, в Нигерии, Пакистане и Судане. В Европе первые штаммы вируса ЗН были выделены в 1963 г. из клещей Hyalomma plumbeum plumbeum, собранных в дельте Волги, от больных людей и комаров, отловленных в дельте Роны, во Франции. В 60-е годы немногочисленные случаи заболевания наблюдались во Франции и Астраханской области, в Испании, Румынии; в 70-е, 80-е и 90-е годы - в Белоруссии, на Западной Украине и Чехии. В июле-октябре 1996 г. имела место крупная эпидемическая вспышка лихорадки Западного Нила.

В 1999 году в Астраханской, Волгоградской областях и Краснодарском крае было выявлено не менее 600 больных ЛЗН, в США - 62 человек.

Несмотря на выраженную неврологическую симптоматику у многих больных при диагностике ЛЗН, как и при других арбовирусных инфекциях, решающее значение имеют результаты серологической диагностики. Поэтому выяснение возможностей использования различных серологических методов для диагностического обследования больных, а также для изучения иммуноструктуры населения, представляется весьма актуальным.

Мало исследованными и исключительно важными для разработки критериев серологической диагностики ЛЗН являются вопросы динамики различных видов специфических антител в зависимости от возраста больных и формы заболевания, возможность определения ранних IgM антител, как основы экспресс-диагностики.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы являлось получение доказательств значения вируса ЗН в этиологии эпидемической вспышки на юге России, изучение возможностей использования различных серологических методов (ИФА, РТГА, ВИЭФ и РН в культуре клеток) для специфической диагностики ЛЗН и изучения иммуноструктуры населения в эндемичных регионах. В соответствии со сформулированной целью были определены следующие задачи исследования:

1. Серологическое обследование больных с сезонными лихорадочными заболеваниями, подозрительными на ЛЗН, из эндемичных регионов юга России.

2. Сравнение специфичности выявляемых антител к вирусу ЗН и к родственным флавивирусам (японского энцефалита, желтой лихорадки, энцефалита Сент-Луис).

3. Изучение динамики различных типов антител у больных ЛЗН в зависимости от тяжести течения заболевания, возраста и пола больных.

4. Разработка критериев специфической диагностики ЛЗН (диагностические титры, оптимальное время и интервалы обследования больных с применением различных серологических методов).

5. Изучение иммуноструктуры населения к вирусу ЗН.

6. Анализ полученных серологических, эпидемиологических и клинических данных.

Научная новизна исследований.

Впервые получены данные, указывающие на значение вируса ЗН в этиологии крупной эпидемической вспышки на юге России. Вспышка характеризовалась преобладанием случаев менингитов и менингоэнцефалитов, а также высокой заболеваемостью городских жителей, что ранее не наблюдалось в эндемичных регионах СССР и России.

На основании обследования сывороток крови больных ЛЗН изучена динамика различных видов антител, выявляемых в серологических реакциях. Определены критерии специфической диагностики ЛЗН (диагностические титры антител, оптимальные сроки обследования). Рекомендована научно-обоснованная схема серологической диагностики.

Показана эффективность экспресс-серодиагностики по выявлению иммуноглобулинов класса М методом MAC-ELISA в сыворотках крови и СМЖ больных.

Установлено соотношение различных клинических форм при ЛЗН. Изучены некоторые эпидемиологические особенности вспышки и иммуноструктура населения к вирусу ЗН.

Практическая ценность исследований.

На основании результатов диссертации рекомендована схема серологической диагностики ЛЗН. Использование метода MAC-ELISA (для выявления IgM) позволяет проводить экспресс-диагностику заболевания в острый период болезни, что в свою очередь дает возможность выбора правильной тактики лечения больных.

Изучение динамики гуморального иммунитета у здорового населения в эндемичных регионах является важным компонентом эпиднадзора за очагами ЛЗН и обеспечивает ценную информационную базу для прогнозирования заболеваемости и обоснования профилактических мероприятий.

Разработанные при участии автора три типа иммуноферментных тест-систем для выявления IgM и IgG к вирусу ЗН в крови людей, а также антигена вируса ЗН в клинических полевых и экспериментальных материалах, прошли успешные государственные испытания в ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Они нашли широкое применение в практической работе ЦГСЭН и противочумной службы Российской Федерации (Астрахань, Волгоград, Краснодар, Новороссийск и др.).

При участии автора диссертации опубликованы методические указания «Эпидемиологический надзор за лихорадкой Западного Нила в Астраханской области, специфическая диагностика заболевания, меры общественной и личной профилактики» (2000 г.), используемые органами здравоохранения в эндемичных по ЛЗН регионах России.

Основные положения, выносимые на защиту.

В августе-сентябре 1999 г. на юге России (в Астраханской, Волгоградской областях и Краснодарском крае) была зарегистрирована крупная эпидемическая вспышка ЛЗН (560 случаев). В результате выполнения настоящей работы впервые установлена роль вируса ЗН в этиологии 465 случаев ЛЗН в Волгоградской области и Краснодарском крае.

На основании обследования сывороток крови больных в серологических реакциях с антигенами вирусов ЗН и антигеннородственных вирусов японского энцефалита, желтой лихорадки и энцефалита Сент-Луис и ряда гетерологичных арбовирусов (КГЛ и лихорадки Синдбис), установлена выраженная специфичность выявленных антител к вирусу ЗН.

Серологическая экспресс-диагностика ЛЗН может основываться на результатах однократного обнаружения методом MAC-ELISA специфических IgM в пробах СМЖ (в титре £1:10) и в сыворотках крови (>1:800), взятых в острый период болезни.

При обследовании парных сывороток, помимо MAC-ELISA можно использовать также ИФА-IgG и РТГА. Для обнаружения диагностических показателей сероконверсии специфических IgG и антигемагглютининов в парных сыворотках крови интервал между взятием первой и второй проб должен составлять, как правило, не менее 10-14 дней.

В сыворотках крови больных JI3H диагностические титры IgM к вирусу ЗН обнаруживаются уже на 3-5 дни заболевания, достигая максимальных уровней (иногда 1:102400-1:204800) на 11-15 дни. Наибольшие показатели средних титров IgG и антигемагглютининов (соответственно 1:6400 и 1:320) приходятся на 16-18 дни болезни. В некоторых случаях титры IgG в этот период составляют 1:102400, а титры антигемагглютининов - 1:2560.

ЛЗН на юге России в 1999 г. характеризовалась высокой заболеваемостью городских жителей, что ранее не наблюдалось в эндемичных регионах СССР и России. Более 60 % больных были в возрасте старше 50 лет. Мужчины болели чаще (75,6%), чем женщины. Относительные показатели заболеваемости на 100000 населения составляли: 12,2 в г. Астрахани, 9,3 - в сельских районах Астраханской области, 32,7 в г. Волжском Волгоградской области, 25,9 - в г. Волгограде и 10,1 в эндемичных сельских районах Волгоградской области.

ЛЗН протекала в двух клинических формах: лихорадочной (20,8%) и нейроинфекционной с тремя вариантами течения (менингеальным, по типу серозного менингита (68,8%), менингоэнцефалитическим (10,2%) и энцефалитическим (0,2%). Летальность составила 7,7%. Наблюдался полиморфизм клинических проявлений и отсутствие выраженных патогномоничных симптомов, поэтому ведущее значение в диагностике заболеваний имела специфическая серологическая диагностика.

У больных с нейроинфекционной формой ЛЗН и у лиц старше 50 лет в острый период болезни уровень специфических антител был достоверно выше, чем у больных с лихорадочной формой. Отмечены и некоторые другие особенности динамики и титров специфических антител, выявляемых у больных ЛЗН методами ИФА-IgM, ИФА- IgG и РТГА.

У населения Астраханской области после эпидемической вспышки ЛЗН 1999 г. произошло, по сравнению с 1998 г., увеличение иммунной прослойки с 31,6% до 50,0%. В октябре 1999 г. IgM к вирусу ЗН были обнаружены у 3,1% практически здоровых жителей г. Астрахани, что свидетельствовало о недавно перенесенной инаппарантной форме ЛЗН. В целом, за 1998-1999 г.г. в Астраханской области 51,9% жителей сельской местности и 35,0% горожан имели антитела к вирусу ЗН. В декабре 2001 г. в трех обследованных районах Астраханской области процент доноров, серопозитивных к вирусу ЗН, составлял 19,4.

РТГА обладает значительно меньшей чувствительностью, чем РН и ИФА-IgG для обнаружения анамнестических антител к вирусу ЗН, поэтому информативность данных, полученных с помощью этой реакции при проведении сероэпидемиологических исследований, менее значительна.

Апробация работы.

Апробация работы состоялась на заседании Экспертного Специализированного Совета предварительной экспертизы диссертационных работ по медицинской вирусологии и эпидемиологии при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 21 мая 2003 г.

Результаты исследований представлены и обсуждены на заседании секции вирусологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова (19 ноября 2001 г.) и на И-ой Научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (г. Новосибирск, май, 2002 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 научных статей в центральных научных журналах и 7 тезисов докладов - в сборниках конференций.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литература, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (49 отечественных и 154 зарубежных источников). Общий объем работы составляет 155 страниц машинописного текста, включающего 35 таблиц и 19 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Шишкина, Екатерина Олеговна

131 Выводы

1. Впервые получены данные, указывающиеся на значение вируса Западного Нила в этиологии крупной эпидемической вспышки на юге России (Астраханская и Волгоградская области, Краснодарский край), где в 1999 году при участии автора диссертации было верифицировано 560 случаев лихорадки Западного Нила.

2. Установлены критерии для постановки этиологического диагноза «лихорадка Западного Нила»: регулярное выявление специфических IgM, IgG и антигемагглютининов в сыворотках крови и пробах СМЖ, сероконверсия антител в парных сыворотках, высокое совпадение данных обследования сывороток методами MAC-ELISA, ИФА-IgG и РТГА, выделение штаммов вируса Западного Нила от больных людей и обнаружение в их крови специфических антигенов.

3. В результате серологического обследования больных людей проведена дифференциация лихорадки Западного Нила от этиологически родственных флавивирусных инфекций (японского энцефалита, желтой лихорадки i энцефалита Сент-Луис), а также эндемичных арбовирусных заболеваний (крымская iтрагическая лихорадка и лихорадка Синдбис), встречающихся в южных регионах.

4. В процессе работы установлена практически одинаковая эффективность методов ИФА-IgM (MAC-ELISA), ИФА-IgG и РТГА для выявления специфических антител у больных ЛЗН: результаты ИФА-IgM и ИФА-IgG совпадали в 88,5%, ИФА-IgM и РТГА — в 94,2%, ИФА-IgG и РТГА — в 92,9%.

5. У больных ЛЗН выявлено два основных типа ответов гуморальных антител: первичный, преобладающий при лихорадочной форме заболевания, и вторичный, преобладающий при нейроинфекционных формах.

6. Установлена зависимость титров IgM, IgG и антигемагглютининов у больных ЛЗН от тяжести заболевания, возраста и пола. В целом, показатели титров антител в течение первых

1,5 недель заболевания значительно выше у больных в возрасте старше 50 лет, при нейроинфекционной форме заболевания, и выше у женщин, чем у мужчин.

7. Показано, что наилучшим методом серодиагностики ЛЗН является MAC-ELISA. В случае обследования на антитела класса IgM диагноз ЛЗН может быть поставлен по результату обследования одной сыворотки крови (в титре >1:800) или СМЖ (в титре >1:10), взятых у больного в острый период болезпи, а также на основании выявления положительной или отрицательной динамики IgM, IgG и антигематлютининов в парных сыворотках. При обследовании на антитела IgG и антигемагглютинины необходимо проводить сравнительное титрование парных сывороток, взятых у больного в острый период заболевания и через 1,5-2 недели.

8. Показано, что в Астраханской области после эпидемической вспышки ЛЗН 1999 г., по сравнению с 1998 г., произошло увеличение серопозитивных лиц с 31,6 до 50,0%. В целом за 1998-1999 г.г. в Астраханской области 51,9% сельских жителей и 35,0% горожан имели антитела к вирусу ЛЗН. По данным ИФА-IgG достаточно высокий уровень иммунной прослойки населения (19,4%) сохранился и в 2001 г.

9. По данным анализа серологически подтвержденных случаев, вспышка лихорадки Западного Нила на юге России в 1999 г. характеризовалась высокой заболеваемостью городских жителей, что ранее не наблюдалось в эндемичных регионах СНГ и России. Более 60 % больных были в возрасте старше 50 лет. ЛЗН протекала в двух формах: лихорадочной (20,8%) и нейроинфекционной (79,2%) с тремя вариантами течения (менингеальным, по типу серозного менингита. (68,8%), менингоэнцефалитическим (10,2%) и энцефалитическим (0,2%). Летальность составила 7,7%.

Заключение

Вирус ЗН относится к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus, к антигенному комплексу японского энцефалита (ЯЭ). В 60-е годы по данным изучения антигенных свойств штаммов, изолированных в разных районах, были выделены африканско-ближневосточная и индийская группы вируса. Вирус Кунжин, относившийся к комплексу ЯЭ, начиная с 1997 г. рассматривается как подтип вируса ЗН. Филогенетическое дерево, построение которого основано на секвенировании гена Е, позволяет распределить изоляты вируса ЗН в четыре группы. Австралийские изоляты вируса Кунджин и изоляты вируса ЗН из Северной, Западной и Центральной Африки, Южной и Восточной Европы, Индии и Ближнего Востока формируют группу I. Группа II включает штаммы вируса ЗН из Западной, Центральной, Восточной Африки и Мадагаскара. Результаты секвенировании гена Е и полного генома индийского штамма Ig 2266 послужили основанием для выделения индийских штаммов в отдельную Ш группу. Секвенирование наиболее своеобразного, из всех известных до сих пор штаммов вируса ЗН - Краснодар 190, указывает на необходимость его выделения в самостоятельную IV группу.

Вирус ЗН является одним из наиболее широко распространенных арбовирусов.

Основными переносчиками вируса ЗН являются комары, преимущественно виды, питающиеся на птицах. Вирус в различных странах Старого Света был выделен от 43 видов комаров, относящихся к 7 родам.

Резервуарами вируса ЗН в природе являются птицы, в значительно меньшей степени, млекопитающие.

Трансмиссионные циклы вируса ЗН приурочены, главным образом, к увлажненным экосистемам (дельты и долины рек). В Европе циркуляция вируса ЗН осуществляется в двух главных типах экосистем: сельском (или лесном) и городском.

Показатели гуморального иммунитета к вирусу ЗН у людей в разные годы в различных эндемичных регионах варьировали от 4,1 до 86 %.

ЛЗН имеет выраженную летне-осеннюю сезонность.

Сотни случаев ЛЗН были диагностированы в начале 50-х годов в Израиле. В 1994 году в Алжире заболело около 50 человек. Отдельные случаи или вспышки ЛЗН наблюдались в Азербайджане, Таджикистане, Центрально-Африканской республике, Заире, Египте, Эфиопии, Индии, на Мадагаскаре, в Нигерии, Пакистане и Судане. В 60-е годы немногочисленные случаи заболевания наблюдались во Франции и Астраханской области, в Испании, Румынии; в 70-е, 80-е и 90-е годы - в Белоруссии, на Западной Украине и Чехии. В июле-октябре 1996 г. имела место крупная эпидемическая вспышка ЛЗН в Румынии.

ЛЗН во всех районах своего распространения до середины 1990-х годов поражала главным образом сельское население. В 1996-1999 г.г. в Румынии, России и США среди больных ЛЗН преобладали городские жители.

Возрастной состав лиц, болеющих лихорадкой определяется, в первую очередь, интенсивностью циркуляции вируса ЗН в разных странах.

До середины 90-х годов существовало представление о легкости течения лихорадки ЗН и редкости развития воспалительного процесса в оболочках мозга и его веществе. Во время вспышек ЛЗН в Алжире (1994 г.), в Румынии (1996 г.), Израиле (1997, 2000 г.г.), в России (1999 г.) и в США (1999,2000 г.г.) у значительной части больных ЛЗН (50-68%) развивались синдромы серозного менингита и менингоэнцефалита.

Несмотря на выраженную неврологическую симптоматику у многих больных ЛЗН, при диагностике ЛЗН решающее значение имеют результаты специфической лабораторной диагностики.

Для обнаружения специфических антител у больных и реконвалесцентов ЛЗН и изучения иммуноструктуры населения в 1940-х, 1950-х годах использовали РН, в 1950-1970-х - РН, РТГА, РИА, НРИФ и РСК, с середины 1980-х годов - в основном иммуноферментный метод, позволяющий обнаруживать специфические антитела IgM и IgG.

Этиологический диагноз в настоящее время устанавливают, главным образом, на основании обнаружения специфических IgM в СМЖ и сыворотках крови, или значительной сероконверсии титров IgM и IgG в ИФА.

Для лечения больных ЛЗН используют методы симптоматической терапии. Специфических вакцин против ЛЗН пока не существует; для неспецифической профилактики применяют меры защиты от укусов комаров.

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1.Сыворотки крови больных и здоровых людей.

1038 сывороток крови от 683 больных с подозрением на ЛЗН и 39 проб СМЖ 38 больных, были взяты во время эпидемической вспышки ЛЗН, наблюдавшейся на юге России в июле-сентябре 1999 г., и получены нами из лечебных учреждений Астрахани, Волгограда и Краснодара.

Сыворотки крови практически здоровых людей (доноров) - жителей г. Астрахани и области, были собраны в июле-сентябре 1998 г. (310 проб) и октябре 1999 г. (162 пробы) и любезно предоставлены Астраханской ПЧС, ЦГСЭН в Астраханской области и областной станцией переливания крови. Сыворотки крови 232 практически здоровых людей (доноров) -жителей Приволжского, Наримановского и Камызякского районов Астраханской области, находящихся на территории верхней и средней части дельты Волги, были собраны в декабре 2001 г. и любезно предоставлены профессором Колобухиной Л.В. Полученные сыворотки разливали по 300 мкл в пластиковые пробирки, замораживали и хранили при минус 20° С.

Первые пробы сывороток от больных были взяты при госпитализации, а последующие - с интервалами в 7-24 дней (в зависимости от срока пребывания в стационаре).

1.2. Использованные вирусы и штаммы.

Для постановки реакции нейтрализации (РН) и приготовления сахарозо-ацетоновых мозговых антигенов для РТГА, ИФА, РДПА и ВИЭФ использовали пассируемые на новорожденных белых мышах штаммы следующих вирусов: вирус ЗН, штамм Аз. 1628, выделенный в 1967 г. из органов черного дрозда Turaus merula, добытого в Азербайджане в 1967 г. (16); вирус ЗН штамм Аст. 986, выделенный в 1999 г. из сыворотки крови больного человека, заболевшего в Астраханской области в 1999 г. (28); вирус японского энцефалита, штамм Р1, выделенный в 1949 г. из мозга погибшего человека в Китае; вирус желтой лихорадки, вакцинный штамм Дакар; вирус энцефалита Сент-Луис, прототипный штамм, выделенный из мозга погибшего человека в США; вирус Синдбис, штамм 574, выделенный в 1967 г. из органов птенцов желтой цапли, в Азербайджане в 1967 г. (16). Все штаммы были получены из коллекции вирусов лаборатории биологии и индикации арбовирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Для постановки реакции нейтрализации готовили на физиологическом растворе 10% суспензии мозга нбм, инфицированных штаммом 1628 вируса ЗН. Перед постановкой опыта осветляли центрифугированием в течение 20 минут при 3000 об/мин.

Антигены получали методом сахарозо-ацетоновой экстракции из мозговой ткани инфицированных нбм методом Clarke и Casals (68). 20% суспензию мозга инфицированных мышей готовили в охлажденном растворе сахарозы (из расчета 0,4 мл раствора сахарозы на 0,1 г мозга). Эту суспензию обрабатывали ацетоном, добавляя по каплям в центрифужные стаканы с охлажденным ацетоном при непрерывном помешивании. Надосадочную жидкость удаляли после ценрифугирования. Осадок подвергали подобной обработке еще два раза. После чего его высушивали под вакуумом до превращения в сухой порошок. В качестве растворителя использовали боратный буферный раствор рН 9,0. Инфекционную активность антигена инактивировали 1% раствором бета-пропилактона.

1.3. Иммунные асцитные жидкости (ИАЖ) белых мышей.

ИАЖ получали в соответствии с описанием С.Я. Гайдамович с соавторами (15). Самкам белых беспородных мышей весом 20-22 г вводили внутрибрюшинно, пятикратно с интервалом 7 дней по 0,2 мл 10% вируссодержащей мозговой суспензии в сочетании с равным количеством адьюванта Фрейдна. Через 24 часа после последней инъекции мышам вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл клеток саркомы 180/TG. Количество асцитной жидкости, взятой после окончания курса иммунизации, варьировало от 5 до 12 мл от одного животного.

1.4. Выделение иммуноглобулинов.

Иммуноглобулины, содержащие антитела к вирусу ЗН, выделяли из мышиных ИАЖ осаждением насыщенным раствором сернокислого аммония с последующей очисткой на сефадексе G - 200. В каждой фракции определяли количество белка и его специфическую активность в РТГА. С целью применения в ИФА ( для сенсибилизации планшетов и получения коньюгатов) использовали фракции, с активностью не менее, чем 1:5000. Иммуноглобулины хранили до применения при -20° С в жидком или лиофилизированном состоянии (15).

1.5. Получение пероксидных коньюгатов.

Для приготовления коньюгата применяли перйодатный метод: 4 мг пероксидазы растворяли в 1 мл дистиллированной воды и добавляли 0,2 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора перйодата натрия, После перемешивания в течении 20 минут при комнатной температуре раствор активированной пероксидазы диализировали против 0,001 М ацетатного буфера при 4° С. 8 мг специфических иммуноглобулинов в 0,01 М КББ соединяли с раствором пероксидазы, рН которого поднимали до 9,6. Конъюгация происходила при комнатной температуре при непрерывном помешивании в течении 2 ч. К коньюгату добавляли 0,1 мл боргидрата натрия (4 мг в 1 мл дистиллированной воды) и оставляли при 4° С. Через 2 часа коньюгат чистили на колонке с сефадексом G-200. Затем коньюгат исследовали в твердофазном ИФА на специфическую активность и определяли рабочее разведение, которое должно быть не менее чем 1:100. Готовый коньюгат сохраняли при -20° С в жидком или лиофилизированном состоянии (15).

1.6. Клеточные культуры.

Перевиваемая клеточная культура почки зеленой мартышки (Vera Е6) (19) была получена из лаборатории геморрагических лихорадок НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

1.7. Методы исследования.

1.7.1. Реакция нейтрализации в культуре клеток Vero Е 6. Реакцию нейтрализации выполняли микрометодом (179) в 96-луночных микропанелях (производство"Со81аг" и "Linbro") с монослоем перевиваемой культуры клеток Vero Е6, выращенной на среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и 0,08 г/мл сульфата гентамицина.

Смесь для заражения клеточной культуры содержала 0,1 мл сыворотки в разведении 1:20 и 0,1 мл суспензии, содержащей 100 ЦПД50 вируса ЗН (штамм Аз 1628). Для разведения вируса и сывороток применяли культуральную среду Игла с 1-2% КРС и 0,08 г/мл сульфата гентамицина. Смесь встряхивали и выдерживали 1-1,5 часа при 37° С или 18-24 часа при 4° С. Из лунок планшетов с монослоем клеток Vero Е6, тщательно удаляли питательную культуральную среду и заражали клетки смесью вируса и сывороток. После чего панели инкубировали при 37° С в термостате.

Результаты РН учитывали на 3, 7,10 и 14 дни, регистрируя цитопатогенный эффект под инвертируемым микроскопом.

При постановке РН ставили следующие контроля: определение токсичности испытуемых сывороток в разведении 1:20 для клеточной культуры; титрование вируссодержащей суспензии; контроль рабочей дозы вируса в смеси с нормальной сывороткой; контроль специфической нейтрализации вируса (100 ЦЛД50) гомологичной иммунной сывороткой или ИАЖ в разведениях 1:10-1:320.

1.7.2. Иммуноферментный анализ (ИФА).

Использовали классические принципы постановки твердофазного ИФА (18).

1.7.2.1. ИФА для определения антигенов вируса ЗН.

Для обнаружения антигена применяли «сэндвич»-ИФА в соответствии с описанием Ткаченко и соавт. (186). Лунки планшетов сенсибилизировали в объеме 0,1 мл на лунку специфическим и нормальными иммуноглобулинами, из расчета 1 мкг на лунку, разведенным в О,OS М карбонатно-бикарбонатный буфере (КББ) с рН 9,6. Планшеты инкубировали во влажной камере в течение 2 часов при 37°. С или 18 часов при 4° С. Не адсорбировавшийся иммуноглобулин удаляли вытряхиванием, лунки дважды отмывали 0,01 М фосфатно-буферным раствором (ФБР) рН 7,4 с добавлением 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20 (ФСБ-т). После этого лунки обрабатывали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) на 0,01 М ФБР в течении 45 минут при температуре 37° С для блокирования "активных, свободных центров" на твердофазовом носителе. Затем планшеты промывали один раз ФСБ-т и высушивали.

Обследуемые сыворотки крови и СМЖ вносили параллельно в 2 лунки (каждая проба тестировалась с нормальным и специфическими иммуноглобулинами) в объеме 0,1 мл в разведениях 1:10-1:1280 на 1% растворе БСА в ФСБ-т и инкубировали в термостате в течении 1,5-2 часов при температуре 37° С или 18 часов при 4° С. Затем планшеты отмывали трижды ФСБ-т. На следующем этапе и очищенные мышиные противовирусные IgG-антитела, меченные пероксидазой хрена (конъюгат), добавляли в рабочем разведении по 0,1 мл в каждую лунку с последующей инкубацией при температуре 37° С в течении 1 часа. Затем планшеты промывали 5 раз ФСБ-т. После заключительного промывания устанавливали наличие в системе пероксидазной метки по изменению окраски внесенного в объеме 0,1 мл субстрат-индикаторного раствора. Для его приготовления 5 мг ортофенилендиамина (ОФД) растворяли в 0,1 м цитратно-фосфатном буфере, рН 5,0 и добавляли в раствор перекиси водорода до конечной концентрации 0,006%. Через 10-15 минут инкубации в темной камере при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 2 М серной кислоты по 0,05 мл в лунку.

Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП), измеряемой на фотометре "Мультискан" ("Flow") при длине волны 492 нм. Пробу считали положительной, если значение ее ОП было в 2,1 раза большим, чем значение Oil отрицательного контроля.

Положительными контролями служили сахарозо-ацетоновые антигены вируса ЗН, а отрицательными - нормальные антигены, приготовленные аналогичным методом. Если ОП обследуемых сывороток и СМЖ была одинаковой в лунках с нормальным и специфическими иммуноглобулинами и превышала ОП отрицательного контроля в 2,1 раза, то результат учитывался как неспецифический.

1.7.2.2. Непрямой метод "сэндвич"-ИФА для определения специфических IgG (ИФА-IgG).

Для обнаружения антител класса G применяли «сэндвич»-ИФА в соответствии с описанием Meegan and LeDuc (129). После выполнения этапов, включающих сенсибилизацию твердофазового носителя специфическим иммуноглобулином и блокировку "свободных, активных центров" (см. п. 1.7.1.1), лиофильно высушенные нормальные и специфические вирусные антигены растворяли в 1% растворе БСА на ФСБ-т в соответствии с рабочими разведениями и вносили в лунки планшетов по 0,1 мл. После инкубации и промывки лунок добавляли по 0,1 мл обследуемых сывороток и СМЖ в разведениях 1:100-1:51200 и 1:10-1:320 соответственно, в две лунки. Каждая сыворотка и СМЖ тестировалась параллельно со специфическим и нормальным антигенами.

На следующем этапе наслаивали пероксидазный конъюгат мышиных моноклональных антител против IgG человека по 0,1 мл в рабочем разведении. Дальнейшие процедуры, связанные с регистрацией реакции, рассмотрены в п. 1.7.1.1.

Положительными контролями служили сыворотки крови, содержащие специфические IgG, а отрицательными - сыворотки крови доноров, не имеющих антител к вирусу ЗН. За титр сыворотки и СМЖ принимали наибольшее разведение, ОП которого в 2,1 раза превышала ОП отрицательных контролей. При обнаружении одинаковой ОП в лунках с нормальным и специфическим антигенами и превышением ОП отрицательного контроля в 2,1 раза, результаты обследования сывороток и СМЖ считались неспецифическими.

1.7.2.3. Метод "захвата" иммуноглобулинов класса М (MAC-EL1SА).

ИФА для выявления IgM антител в сыворотках людей проводили в соответствии с описанием Calisher et al (63), Meegan and LeDuc (129). Лунки полистероловых планшетов сенсибилизировали в течении 18 часов при 4° С козьими антителами против ц-цепи иммуноглобулина человека в объеме 0,1 мл, разведенными в КББ, рН 9,5. Этап блокирования "свободных, активных центров" проводили по стандартной схеме. Затем каждую пробу вносили в две лунки, по 0,1 мл и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37° С. Исследуемые сыворотки и СМЖ разводились в 100-204800 и 10-320 раз, соответственно. После четырехкратной промывки, в одну лунку из двух вносили нормальный антиген, в другую - антиген вируса Западного Нила, т.е. каждая сыворотка и СМЖ тестировалась параллельно со специфическим и нормальным антигенами. Инкубация происходила в течении 18 часов при температуре 4° С.

Далее вносили пероксидазный конъюгат мышиных антител против вируса ЗН в рабочем разведении, по 0,1 мл в лунку. Дальнейшие процедуры, связанные с регистрацией реакции, рассмотрены в п. 1.7.1.1.

Положительными контролями служили сыворотки крови, содержащие специфические IgM, отрицательными - сыворотки доноров, не имеющих антител к вирусу ЗН. За титр сыворотки и СМЖ принимали наибольшее разведение, ОП которого в 2,1 раза превышала ОП отрицательных контролей. При обнаружении одинаковой ОП в лунках с нормальным и специфическим антигенами и превышением ОП отрицательного контроля в 2,1 раза, результаты обследования сывороток и СМЖ считались неспецифическими.

1.7.3. Реакция торможения гемагглютинации.

РТГА выполняли в соответствии с методом Clarke and Casals (68) в микромодификации на 96-луночных микропанелях (15) с 8 антигенными единицами антигена вируса ЗН. Для удаления ингибиторов гемагглютинации сыворотки крови предварительно обрабатывали 25%-ой взвесью каолина и гусиными эритроцитами.

В каждый опыт включали контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию, контроль на полноту удаления неспецифических гемагглютининов из сыворотки, контроль рабочей дозы антигена и контроль специфичности антигена с гомологичной гипериммунной сывороткой (ИАЖ).

Сыворотки считали положительными, если они подавляли гемагглютинацию в разведении 1:20 и выше. Для исключения ложноположительных результатов, связанных с неполным удалением ингибиторов, положительные в РТГА сыворотки прогревались (в разведении 1:10) в течении 1 минуты в кипящей бане и повторно испытывались в РТГА с 4-8 АЕ антигена.

1.7.4. Реакция диффузионной преципитации в агаре.

Для постановки РДПА использовали метод двойной диффузии в агаровом геле по Ouchterlony (3). Расплавленный агар "Дифко" в виде 1% геля на физиологическом растворе наливали в количестве 4-5 мл на предметные стекла и после затвердевания вырезали лунки диаметром 3 мм. Лунки располагали таким образом, чтобы центральную с антигеном на расстоянии 6 мм окружали 6 лунок с обследуемыми цельными сыворотками. Реакция проходила во влажной камере при температуре 37° С в течении 18-24 часов. В случае положительной реакции в результате диффузии антигена и антитела между лунками с сывороткой и антигеном образовывалась тонкая линия преципитата.

1.7.5. Реакция встречного иммунофореза.

Реакция ВИЭФ ("cross-over") в агаровом геле выполняли по описанию Lang and Haan (13). Расплавленный агар "Дифко" в виде 1,5% геля на барбитал-ацетатном буфере с рН 8,28,6 наливали на предметные стекла слоем толщиной около 1 мм. Для затвердевания геля стекла оставляли во влажной камере. Затем вырезали одну за другой две группы лунок и удаляли вырезанный гель. Лунки до краев заполняли с катодной стороны САА в разведении 1:100, с анодной стороны - цельной сывороткой больного и в двух разведениях - 1:2, 1:4. После заполнения лунок стекла помещали в электрофоретическую камеру в соответствии с выбранным направлением электрофореза и замыкали цепь полосками фильтровальной бумаги, смоченными барбитал-ацетатным буфером, которые на 1 см покрывали гель в местах контакта. При напряжении 150 В электрофорез продолжали 60 минут. Затем пластинки геля рассматривали при косом освещении на темном фоне. При положительной реакции между лунками с антигеном и сывороткой возникали линии преципитации, располагающиеся ближе к лунке с антигеном.

1.7.6.Статистические методы.

При анализе результатов сероэпидемиологических исследований, характеризующих параметры иммуноструктуры населения к вирусу ЗН и динамику различных типов антител у больных ЛЗН, оценку существенности различий относительных показателей производили по

Г~я 7 формуле: t= pi-p2 / V mi+шг, где р- доля изучаемого признака, а ш - средняя ошибка

I-' вычисляемого признака: m=V p.q / n , где р-доля изучаемого признака, q-доля противоположного признака (100-р), n-количество наблюдений. Доверительный коэффициент (критерий Стьюдента -1) оценивался по таблице для п < 30 и п > 30 (33).

Степень корреляции результатов РН, РТГА и ИФА-IgG при обследовании сывороток крови доноров и результатов ИФА-IgM, ИФА-IgG, РТГА, РДПА и ВИЭФ при обследовании больных ЛЗН определяли с помощью коэффициента сопряженности Брависа (Bravis): г = a*d - b*c /v{a+b)*(c+d)*(a+c)«(b+d),' где a, b, с, d - численность групп, полученных в результате сведения всех показателей в четырехпольную корреляционную таблицу:

Результат Условие Всего

А+ А-

В+ а с а+с

В- b d b+d

Итого a+b c+d a+b+c+d

Оценку корреляционной связи по коэффициент корреляции определяли по таблице:

Корреляционная связь Величина коэффициента корреляции при наличии прямой связи (+) обратной связи (-)

Связь отсутствует 0 0

Слабая от 0 до +0,3 от 0 до -0,3

Умеренная от+0,31 до +0,7 от -0,31 до -0,7

Сильная от+0,7 до+1,0 от-0,7 до-1,0

Связь полная +1,0 -1,0

Достоверность коэффициента корреляции определяли соотношением его и его средней ошибки, вычисляемой по формуле: mr = 1-r2 / Vn, где г- коэффициент корреляции, п - число наблюдений; t (доверительный коэффициент) = г / mr> который оценивался по таблице для п <30 и п>30 (33).

Значимость (определение вероятности) коэффициента корреляции оценивали по критерию X2, для числа степеней свободы с = 1 (для четырехпольной таблицы): х2 ~ (a*d -b*c)2«n / (a+d)«(c+d)«(a+c)»(b+d), где a, b, с, d - численность групп, полученных в результате сведения всех показателей в четырехпольную корреляционную таблицу. При х2 = 3,84 -р<0,05; ^=6,64 - р<0,01 (33).

Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча: ЛД50 = А * f (5° ~а)/ (Ь'а), где А - доза, которая вызывает смерть или инфицирование у менее 50% реагирующих объектов, В - доза, которая вызывает смерть или инфицирование у более 50% реагирующих объектов, а - % реагирующих на дозу А, в - % реагирующих на дозу В, f- фактор разведения (34).

ГЛАВА 2. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЗН

2.1. Доказательства роли вируса ЗН в этиологии эпидемической вспышки ЛЗН на юге России в 1999 г.

Волгоградская область. В начале сентября 1999 г. в лабораторию биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН поступила информация о том, что в Волгоградской области наблюдается вспышка острых лихорадочных заболеваний, протекающих, главным образом, с диагнозами «серозный менингит» и «менингоэнцефалит», предположительно энтеровирусной этиологии. Учитывая некоторые существенные клинические и эпидемиологические особенности вспышки, профессор Е.В. Легцинская предложила обследовать сыворотки больных детей из Вологограда на антитела к арбовирусам, эндемичным для Нижнего Поволжья. Парные сыворотки 10 больных детей, полученные из детской инфекционной больницы № 21 г. Волгограда (гл. врач A.M. Алюшин) были обследованы 10 сентября 1999 г. ст.н.с. В.Ф. Ларичевым в ИФА на антитела IgM и IgG к вирусам ЗН, КГЛ и Синдбис. У всех 10 больных были обнаружены диагностические титры IgM и высокие титры IgG к вирусу ЗН при отсутствии антител к вирусам КГЛ и Синдбис (табл. 2).

В сентябре 1999 г. в лабораторию геморрагических лихорадок НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова из Волгоградкой области поступили 200 сывороток крови и 12 проб СМЖ от 86 больных с диагнозами серозный менингит и менингоэнцефалит с целью расшифровки наблюдавшейся вспышки. Результаты их обследования на антитела к вирусам ГЛПС, КГЛ и ЛХМ оказались отрицательными, и эти материалы были переданы профессором Е.А. Ткаченко в лабораторию биологии и индикации арбовирусов. В сыворотках 62 больных и 6 пробах СМЖ методом ИФА были обнаружены диагностические титры IgM и IgG к вирусу ЗН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Шишкина, Екатерина Олеговна, Москва

1. Азарова И.А.Подавление репродукции и диссеминации вируса Западного Нила в организме млекопитающих и паразитарной системе «клещ-позвоночное» //Автореф. канд. дисс. к.б.н. -Минск-2000 г.- 26 с.

2. Башкирцев В.Н. Природно-очаговые инфекции в Астраханской области // Автореф. канд. дисс. к.м.н. Москва. - 1971 .-19 с.

3. Бем Э. Иммунодиффузия // В кн: Иммунологические методы, под ред. X. Фримеля. А.П. Тарасова. 1987. - М. - Медицина. - С.73-88.

4. Богомолов Б.П., Лещинская Е.В., Шатилова Н.И. и соавт. Клиника заболеваний, имеющих установленную связь с вирусом лихорадки Западного Нила // Матер, науч. практ. конференции медработников Астраханской области. - Астрахань. -1969. - С.40-43.

5. Бутенко А.М. Выделение вируса лихорадки Западного Нила из клещей Hyalomma plumbeum plumbeum Panz. в Астраханской области и изучение его свойств // Автореферат канд. дисс.к.б.н. Москва. - 1966. - 12 с.

6. Бутенко А.М., Березин В.В., Лещинская Е.В. Лихорадка Западного Нила // Информационное письмо. Астрахань, 1966.-15 с.

7. Бутенко A.M., Чумаков М.П., Башкирцев В.Н. и соавт. Новые данные об изучении лихорадки Западного Нила в СССР (Астраханская область)//В сб.: Материалы 15 научной сессии ИПВЭ АМН СССР. М.: ИПВЭ АМН СССР. - 1968. - Вып. 3. -С. 175-176.

8. Бутенко A.M., Столбов Д.Н. История изучения арбовирусных инфекций в Астраханской области // Вопросы риккетсиологии и вирусологии. Астрахань, Москва. - 1996.-С. 51-67.

9. Бутенко A.M., Ковтунов А.И., Хуторецкая Н.В., и соавт. Выделение штамма Аст 901 вируса Западного Нила из крови больного человека в Астраханской области2000 г.) // Вопр. вирусол. 2001. - № 4. - С.З1 -32.

10. Бутенко А.М., Ковтунов А.И., Джаркенов А.Ф.и соавт. Эпидемиологическая характеристика лихорадки Западного Нила в Астраханской области // Вопр. вирусол. 2001. - № 4. - С.34-35.

11. Вильмс К., Клауш Б., Штраубе В. и соавт. Встречный электрофорез (электросинерез) // В кн: Иммунологические методы, под ред. X. Фримеля. 1979. -М.-Мир. - С.78 -89.

12. Вирусные болезни, передаваемые членистоногими и грызунами // Доклад научной группы ВОЗ № 719. Женева. - ВОЗ. - 1986. - С. 1-119.

13. Гайдамович С.Я., Никифорова Л.П., Громашевский В.Л. и др. Выделение арбовирусов из группы А и Б в Азербайджане // Матер. 15-й науч. сесс. ИПВЭ АМН СССР. Москва. - 1968.-Вып.З. - С.165.

14. Галкина И.В. Распространение вирусов в Поволжье // Автореф. канд. дисс. к.м.н. -М., 1991.-23 с.

15. Иммуноферментный анализ /Под ред. Т. Т. Нго, Г. Ленхоффа. Москва. - 1988.1. С. 172-242.

16. Каталог перевиваемых клеточных линий./Новохатский А.С., Михайлова Г.Р., Царева А.А. и соавт. //Деп. ВИНИТИ № 247-79. -Т.2 Москва. - 1978 - 88 с.

17. Краснова Е.М., Львов Д.К., Жуков А.Н. и соавт. Эпидемиологический мониторинг лихорадки Западного Нила в Волгоградской области // Вопр. вирусол. 2001. - № 4.-С.

18. Костюков М.А., Алексеев А.Н., Булычев В.П., Гордеева З.Е. Экспериментальное заражение комаров Culex pipiens вирусом Западного Нила при кормлении на инфицированных лягушках Rana ridibunda II Мед. паразитол 1986. - № 6. - С.76-78.

19. Ларичев В.Ф., Бутенко А.М., Русакова Н.В. и соавт. Показатели специфических антител у реконвалесцентов, перенесших лихорадку Западного Нила // Вопр. вирусол. 2002. - № 6. - С.11-13.

20. Лещинская Е.В., Башкирцев В.Н., Богомолов Б.П. и соавт. Клиническая картина лихорадки Западного Нила в Астраханской области // Матер. 15-й науч. сесс. ИПВЭ АМН СССР. Москва. - 1968. - Вып.З. - С.228-230.

21. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: Медицина. -1989. - 335 с.

22. Львов Д.К. Лихорадка Западного Нила // Вопр. Вирусол. 2000. - № 2. - С. 4 -9.

23. Львов Д.К., Бутенко A.M., Гайдамович С.Я. и соавт. Эпидемическая вспышка менингоэнцефалита в Краснодарском крае и Волгоградской области, вызванная вирусом лихорадки Западного Нила (предварительное сообщение) // Вопр. вирусол.-2000. -№ 1. С. 37-38.

24. Львов Д.К., БутенкоА.М., Вышемирский О.И. и соавт. Выделение вируса Западного Нила от больных людей в период эпидемической вспышки в Волгоградской и Астраханской областях // Вопр. вирусол. 2000. - № 3. - С. 9-12.

25. Мирзоева Н.М. Итоги изучения арбовирусных инфекций в Азербайджане (по материалам 1966-1976 г.г.)// В сб. «Арбовирусы» 1978. - Вып. 3. - С.27-31.

26. Недялкова М.С. Серологическая диагностика заболеваний, вызываемых вирусами Тягиня и Инко И Автореф. канд. дисс. к.м.н. М. -1991. - 27 с.

27. Петров В.А., Краснова Е.М., Львов Д.К., Жуков А.Н.Бутенко A.M., Ларичев

28. В.Ф., Шишкина Е.О. и др. Клиника и эпидемиология лихорадки Западного Нила в Волгоградской области (1999 и 2000 г.г.) // Вопр. вирусол. -2001.- № 4 С.22-26.

29. Поляков И.В., Соколова Н.С. Практическое пособие по медицинской статистике.-Ленинград «Медицина». 1975. - 150 с.

30. Практическая вирусология./Под ред. Штарке Г.- Москва.-1970. С.317-318.

31. Прилипов А.Г., Самохвалов Е.И., Львов Д.К. и соавт. Генетический анализ вирусов лихорадки Западного Нила, выделенных на юге Русской равнины (Волгоградская и Астраханская области) в 1999 г. // Вопр. вирусол. 2001. - № 1. - С. 8-12.

32. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Москва. - 2000. - С. 78.

33. Росицкий Б. Экспедиция чехословацких паразитологов в Албанию// Зоологич. жур. 1960. - № 39. - С.6.

34. Семенов В.Ф., Чунихин С.П., Кармышева В.Ю. Изучение хронической арбовирусной инфекции у птиц// Вестник Академии Медицинских наук СССР

35. Москва). -1973. №2. - С.79-83.

36. Стриханов С.Н., Бутенко A.M., Мкртчан М.О. и соавт. Выявление заболеваемости лихорадкой Западного Нила в Краснодарском крае // Матер, науч-практ. конф. «Инфекционные болезни на рубеже XXI века». Москва. - 2000. - Ч. 2. - С.52-53.

37. Стриханов С.Н., Бутенко А.М., Шишкина Е.О. Клиническое течение лихорадки Западного Нила // Матер, науч-практ. конф. «Инфекционные болезни на рубеже XXI века». Москва. - 2000. - Ч. 2. - С.52.

38. ТинкерЮ.А., Шишкова О.М., АдимовВ.Л. и соавт. Результаты обследования территории Северо-Западного Кавказа на арбовирусные инфекции // Итоги науки и техники. Сер. «Вирусология». - Т. 24. - М.: ВИНИТИ. -1991. - С. 27-28.

39. Чумаков М.П., Бутенко A.M., Башкирцев В.Н. и соавт. Выделение вируса Западного Нила от больных людей в Астраханской области // Матер, науч. практ. конф. медработников Астраханской области. Астрахань. - 1969. - С. 36-38.

40. Шишкина Е.О., Бутенко A.M., Гайдамович С.Я. и соавт. Изучение иммуноструктуры населения Астраханской области к вирусу Западного Нила в 1998 и 1999 гг. // Вопр. вирусол. 2002. - № 6. - С. 13-17.

41. Юшенков В.А., Ковтунов А.И., Салько В.Н. и соавторы. Урбанизация эпидпроцесса лихорадки Западного Нила в Астраханской области // Инф. бюлл. Здоровье населения и среда обитания. Минздрав РФ. Федеральный ЦГСЭН. -1999.-Вып. 8,№12.-С. 15-16.

42. Albagali С., Chaimoff R. A case of West Nile myocarditis // Harefuah. 1959. - № 57. -P.274-275.

43. Andreadis T.G., Anderson J.F., Vossbrinck C.R. Mosquito surveillance for West Nile virus in Connecticut, 2000: Isolation from Culex pipiens, Cx. restuans, Cx. salinarius, and Culiseta melanura // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol.7. - № 4. - P.670-674.

44. Baneijee K. The role of Japanese encephalitis — West Nile complex viruses as an emerging problem in India // International Conference for Tropical Medicine and Malaria, 14-th. —Nagasaki. 1996. — P. 128.

45. Batieha A., Saliba E.K., Graham R. et al. Seroprevalence of West Nile, Rift Valley, andsandfly arboviruses in Hashimiah, Jordan. // Emerg. Infect. Dis. 2000. - Vol.6. - № 4. -P.358-362.

46. Beasley D.W.C., Davis C.T., Whiteman M. et al. Molecular determinants of virulence of West Nile virus in America // Emergence and Control of Zoonotic Viral Encephalitis. Abstract Book. France. - 2003. - P.39.

47. Ben-Nathan D., Maestroni G.J., Lustig S. et al. Protective effects of melatonin in mice infected with encephalitis viruses //Arch Virol. 1995.- Vol.140.- № 2. - P.223-230.

48. Ben-Nathan D., Lachmi В., Lustig S., Feuerstein G. Protection by dehydroepiandrosterone in mice infected with viral encephalitis //Arch. Virol. 1991. — Vol.120. - №3-4.-P.263-271.

49. Berncopf H., Levin S., Nerson R. Isolation of West Nile virus in Israel // J. Infec. Dis. -1953. Vol. 93. - № 3. - P. 207-218.

50. Besselaar T.G., Blackburn N.K. Antigenic analysis of West Nile strains using monoclonal antibodies // Arch. Virol. — 1988. — Vol. 99. P. 75-84.

51. Blackburn N.K., Thompson D.L., Jupp P.G. Antigenic relationship of West Nile strains by titreration calculated from cross-neutralization test result // Epidemiol. Infect. — 1987. —Vol. 99.-P. 551-559.

52. Blackburn N.K. Arbovirus unit // Annual report. National Institute for Virology. South Africa. - 1988.-P. 27

53. Blackburn N.K., Reyers F., Berry W.L., Shepherd A.J. Susceptibility of dogs to West Nile virus: a survey and pathogenicity trial. // J. Сотр. Pathol. 1989. - Vol.100. - № 1. - P.59-66.

54. Bryan J.P., Iqbal M., Ksiazek T.G. et al. Prevalence of sandfly fever, West Nile fever, Crimean-Congo hemorrhagic fever, and leptospirosis antibodies in Pakistan military personnel // Mil. Med. 1996. - Vol.161. - № 3. - P.149-153.

55. Calisher C.H., Petzman C.I., Muyh D.J., Parsons M.A. Serodiagnosis of La Cross virusinfection in humans by detections of immunoglobulin M class antibodies. // J. Clin. Microbiol. 1986. - Vol. 23. - P. 667-671.

56. Ceausu E., Erscoiu S., Calistru P. et al. Clinical manifestations in the West Nile virus outbreak // Rom. J. Virol. -1997. Vol.48. - № 1-4. - P. 3-11.

57. Cernescu C., Ruta S.M., Tardei G. et al. A high number of severe neurologic clinical forms during an epidemic of West Nile infection // Rom. J. Virol. 1997. - Vol.48. - № 1-4.-P. 13-25.

58. Cernescu C., Nedelcu N.I., Tardei G. et al. Continued transmission of West Nile virus to humans in southeastern Romania, 1997-1998 // J. Infect. Dis. 2000. - Vol.181. - № 2.-P.710-712.

59. Clarke D. H., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutination-inhibition with arthropod-borne viruses.// Am. J. Trop. Med. Hyg. 1958. - Vol. 7. - P. 561-573.

60. Classification and Nomenclature of Viruses. Edited by Franki R. I. В., Faugnet C.M., Knidson D.L., Brown F // Arch. Virol. Supp.2. - 1991. - 37 p.

61. Cohen D., Zaide Y., Karasenty E. Prevalence of antibodies to West Nile fever, sandfly fever Sicilian, and sandfly fever Naples viruses in healthy adults in Israel // Public Health -1999. Vol.27. -№1-3. -P.217-230.

62. Cornel A.J., Jupp P.G., Blackburn N.K. Environmental temperature on the vector competence of Culex univittatus (Diptera: Culicidae) for West Nile virus // J. Med. Entomol. 1993.-Vol. 30.-№2.- P. 449-456.

63. Corwin A., Habib M., Olson J. et al. The prevalence of arboviral, rickettsial, and Hantaan-like viral antibody among schoolchildren in the Nile river delta of Egypt.

64. Trans. R. Soc. Trap. Med. Hyg. 1992. - Vol. 86. № 6. - P.677-679.

65. Davies A.M., Yoshpe-Purer Y. Observation on the biology of West Nile virus with special reference to its behaviour in the mosquito Aedes aegypti // Ann. Trop. Med. and Parasit. 1954. - Vol. 48. - № 1. - P. 46-54.

66. Dycers T.I., Brown K.L., Gundersen C.B., Beaty B.J. Rapid diagnosis of La Cross encephalitis: detection of specific immunoglobulin M in cerebrospinal fluid // J. Clin. Microbiol. 1985. - Vol. 22. - P. 740-744.

67. Ernek E., Kozuch O., Nosek J. et al. Arboviruses in birds captured in Slovakia // J. Hyg. Epid. Microb.Imm.(Prague). 1977. - Vol.21. - P.353-359.

68. Fagbami A.H., Fabiyi A. Arbovirus studies in two towns in western state of Nigeria // Trop. Geogr. Med. 1975. - Vol. 27. -№ 1. -P.59-62.

69. Fagbami A.H. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria // Trop. Geogr. Med. 1977. - Vol. 29. - № 2. - P.187-191.

70. Fagbami A.H. Human arthropod-borne virus infections in Nigeria. Serological and virological investigations and Shaki, Oyo State // J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. 1978. - Vol. 22. - № 2. -P.184-189.

71. Fanquet C. Taxonomy and classification arboviruses // Encyclopedia of Virology / Eds R. G. Webster, A. Granoff. — London, 1994. Vol. 3. - P. 1396-1410.

72. Feinstein S., Akov Y., Lachmi B.E. et al. Determination of human IgG and IgM class antibodies to West Nile virus by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) // J. Med. Virol. 1985. - Vol. 17. - № 1. - P.63-72.

73. Gaidamovich S.Ya., Melnikova, E. E. Passive hemolysis-in-gel with Togaviridae arboviruses // Intervirology/ 1980. - Vol. 13. - P.16-20.

74. Garmendia A.E., Van Kruiningen H.J., French R.A. et al. Recovery and identification of West Nile virus from a hawk in winter // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - № 8. -P.3110-3111.

75. Georges A. J., Lesbortes J.L., Georges M.C. et al. Fatal hepatitis from West Nile virus // //Ann. Inst. Pasteur. Viral. -1987. Vol.138. - P. 237-244.

76. Ghowers M.Y., Lang, Nassar F., Ben-David D. et al. Clinical characteristics of the West Nile fever outbreak, Israel, 2000 // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7. - № 4 - P. 675678.

77. Giladi M., Metzkor-Cotter E., Martin D.A. et al. West Nile Encephalitis in Israel, 1999: The New York Connection // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7. - № 4. - P. 659-661.

78. Goldblum N., Sterk V.V., Padereki B. West Nile fever. The clinical features of the disease and the isolation of West Nile virus from the blood of nine human cases // Am. J.Hyg. 1954. - Vol.59. - №1. - P. 89-103.

79. Goldblum N., Sterk V.V., Padereki B. The isolation of nine strains of West Nile virus from patients during an epidemic // Intern. Conf. Microbiology. 1955. - Abstr. 3. - P. 101.

80. Goldblum N., Sterk V., Jasinska-Kiindberg. The natural history of West Nile virus. II. Virological findings and the development of homologous and heterologous antibodies in West Nile infection in man // Am. J. Hig. -1957. Vol.66. - P. 366-380.

81. Goldwasser R.A., Davies A.M. Transmission of a West Nile virus like by Aedes aegypti // Trans. Roy. Soc. Trap. Med. Hyg. 1953. - Vol. 47. - № 4. - P. 336-337.

82. Gradoth N., Weitzman S., Lehmann E. E. Acute anterior myelitis complicating West Nile fever // Arch. Neural. 1979. Vol. 36. - P.172-173.

83. Hamilton P.K., Taylor R.M. Report of clinical case of West Nile virus infection probably acquired in the laboratory // Am. J.Trop. Med. Hyg. 1954. - Vol. 3. - № 1. - P. 51 -53.

84. Hammam H.M., Price W.H. Further observation on geographic variation in the antigenic character of West Nile and Japanese B. viruses // Amer. J. Epidemiol. — 1966. — Vol. 83. —P. 113-122.

85. Hammon W., Sather G. G. Immunity of hamsters to West Nile and Murray Valley encephalitis viruses following immunization with St. Louis and Japanese viruses // B. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1956. Vol. 91. -P.521-524.

86. Hofmann H., Kunz C., Heinz F.X. Laboratory diagnostisis of tick-born encephalitis // Arch. Virol. 1990. - Supp.l. - P. 153 - 160.

87. Hayes C. G. West Nile fever // The Arboviruses: Epidemiology and Ecology / Ed. T. P. Monath. — Boca Raton. 1989. — Vol. 5. - P. 59-69.

88. Hubalek Z., Halouzka J. Arthropod-borne viruses of vertebrates in Europe // Acta Scientiarum Naturalium Brno. 1996. - Vol. 30. - № 4-5. - P. 1-95.

89. Hubalek Z., Halouzka J. West Nile fever a reemerging mosquito-borne viral disease in Europe // Emer. Inf. Dis. - 1999. - Vol.5. - № 5 - P. 643-650.

90. Hubalek Z., Savage H.M., Halouzka J., Juricova Z., Sanogo Y.O., Lusk S. West Nile virus investigations in South Moravia, Czechland // Viral. Immunol. 2000. - Vol. 13. -№ 4. - P.427-433.

91. Human West Nile virus surveillance-Connecticut, New Jersey, and New York, 2000 //.

92. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2001. - Vol.13. - № 50(14). - P. 265-268.

93. Hurlbut H. West Nile virus infection in arthropords // Am. J. Trop. Med. and Hyg. -1956. Vol.5. -№1.- P. 76-85.

94. Igarashi A., Tanuka M., Morita K. et al. Detection of West Nile and Japanese encephalitis viral genome sequences in cerebrospinal fluid from acute encephalitis cases in Karachi, Pakistan // Microbiol.Imm. — 1994. Vol. 38. - P. 827-830.

95. International Catalogue of Arboviruses, Including Certain Other Viruses of Vertebrates / Eds N. Karabatsos. — San -Antonio. 1985. - 305 p.

96. Jordan I., Briese Т., Fischer N. et al. Ribavirin inhibits West Nile virus replication and cytopathic effect in neural cells // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 182. - № 4. - P.1214-1217.

97. Jupp P.G., Mcintosh B.M. Quantitative experiments on the vector capability of Culex (Culex) univittatus Theobald with West Nile and Sindbis viruses // J. med. Entomol. — 1970.—Vol. 7.-P. 371-373.

98. Jupp P.G., Mcintosh B.M. Quantitative experiments on the vector capability of Culex (Culex) pipiens fatigans Wiedemann with West Nile and Sindbis viruses // Ibid. — 1970. P. 353—356.

99. Jupp P.G., Blackburn N.K., Thompson D.L., Meenehan G.M. Sindbis and West Nile virus infections in the Witwatersrand-Pretoria region // S. Afr. Med. J. 1986. - Vol.16. -№70(4).-P. 218-220.

100. Katioka M. Experimental transmission of the West Nile virus by the mosquitoes // Jap. Med. J. 1950. - № 3. - P. 77-81.

101. Kimura-Kuroda J., Yasui K. Antigenic comparison of envelope protein E between Japanese encephalitis virus and some other flaviviruses using monoclonal antibodies // J. Gen. Virol. -1986. Vol. 67. - Pt. 12. - P. 2663-2672.

102. Kulasekera V., Kramer L., Nasci R.S, Mostashari F., Cherry В., Track S.C. West Nile virus infection in mosquitoes, birds, horses, and humans, Staten Island, New York, 2000 // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol.7. - № 4. - P. 722-725.

103. Lanciotti R.S., Roehrig J.T., Deubel V. et al. Origin of the West Nile virus responsible for an outbreak of encephalitis in the northeastern United States // Science. 1999. - Vol. 17. - № 286(5448). - P. 2333-2337.

104. Lavillaureix J., Vermeil C., Petrovic A. Note preliminaire concernant les caracteres experimentaux du virus West Nile // Bull. Soc. Pathol.Exot. 1958. - Vol. 51. - № 4. -P. 486-495.

105. Leport C., Janowski M., Brun-Vezinet F. et al. West Nile virus meningomyeloencephalitis—value of interferon assays in primary encephalitis // Ann. Med.Interne (Paris). 1984. - Vol. 135. - № 6. - P.460-463.

106. Lozano A., Filipe A.R. Antibodies against the West Nile virus and other arthropod-transmitted viruses in the Ebro Delta region // Rev. Esp. Salud. Publica. 1998. - Vol. 72. - № 3. - P.245-250.

107. Lucasse C. First isolation of West > ile virus in Central Africa // Bull. Soc. Path. Exot. -1963.-Vol. 56.-№2. -P. 156-160.

108. Lustig S., Olshevsky U., Ben-Nathan D. et al. A live attenuated West Nile virus strain as a potential veterinary vaccine. //Viral. Immunol. 2000. - Vol. 13. - № 4. - P.401-410.

109. Lvov D.K., Butenko A.M., Gromashevsky V.L. et al. Isolation of two strains of West Nile virus during an outbreak in Southern Russia, 1999 // Emerg. Infect. Dis. 2000. -Vol. 6. - № 4. - P.373-376.

110. Marberg K., Goldblum N., Sterk V. V. et al. The natural history of West Nile fever. I. Clinical observations during an epidemic in Israel // Am. J. Hyg. 1956. Vol. 64.1. Р.259-265.

111. Mathiot С.С., Georges A.J., Deubel V. Comparative analysis of West Nile virus strains isolated from human and animal hosts using monoclonal antibodies and cDNA restriction digest profiles // Res. Virol. 1990. - Vol. 141. - № 5. - P.533-543.

112. Mcintosh B.M. Susceptibility of some African wild rodents to infection with various arthropod-borne viruses // Trans, roy. Soc. trop. Med. Hyg. — 1961. — Vol. 55. — P. 63-68.

113. Mcimosh B.M., Jupp P.G., Dickinson P.G. et al. Studies on Sindbis and West Nile virus in South Africa. 1. Viral activity as revealed by infection of mosquitoes and sentinel fowls // S. Afr. J. med. Sci. 1967. - Vol. 32. - P. 1-14.

114. Mcintosh B.M., McGillivray G.M., Dickinson D.B. et al. Ecological studies on Sindbis and West Nile viruses in South Africa. IV. Infection in a wild avian population // S. Afr. J. Med. Sci. -1968. Vol. 33. - P. 105-112.

115. Mcintosh B.M., Dickinson D.B., McGillivray G.M.Ecological studies on Sindbis and West Nile viruses in South Africa. V. Response of birds to inoculation of viruses // S. Afr. J. Med. Sci. 1969. - Vol. 34. - P.77-82.

116. Mcintosh B.M., Jupp P.G., Dos Santos I., Meenehan G.M. Epidemics of West Nile and Sindbis viruses in South Africa with Culex (Culex) univittatus Theobald as vector // South African Journal of Science. 1976. - Vol.72. - P. 295-300.

117. Meco O.West Nile arbovirus antibodies with hemagglutination inhibition (HI) in residents of Southeast Anatolia (Turkey) // Mikrobiyol. Bui. 1977. - Vol.11. - № 1. -P.3-17.

118. Mekki E.I., van der Groen A.G., Pattyn S. R. Evaluation of immunofluorescence and immunoperoxidase methods for antibody determination against Chikungunya; West Nile and yellow fever viruses // Ann. Soc. Belg. Med. Trap. -1979. Vol. 57. - P.121-126.

119. Melnick J.L., Paul J.R., Riordan J.7. et al. Isolation from human sera in Egypt of a virus apparently identical to West Nile virus // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1951. - Vol. 77. -P. 661-665.

120. Mohammed Y. S., Gresikova M., Adamyova K. et al. Studies on arboviruses in Egypt. II. Contribution of arboviruses to the aetiology of undiagnosed fever among children // J. Hyg. (Camb.). 1970. - P. 68. - P.491-495.

121. Monath T. P., Tsui T. F. Flaviviruses // Clinical Virology / Eds D. D. Richman et al. -New York. -1977. P. 1133-1186.

122. Monath T. P. Epidemiology. St. Louis Encephalitis. Washington DC. American Public Health Assn. -1980. P. 239-312.

123. Monath T.P., Heinz F.X. Flaviviruses. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, editors. Fields virology. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott-Raven. -1996. P. 961-1034.

124. Morvan J., Besselaar Т., Fontenille D., Coulanges P. Antigenic variations in West Nile virus strains isolated in Madagascar since 1978 // Res. Viral. 1990. - Vol. 141. - P. 667676.

125. Morvan J., Chin L.H., Fontenille D. et al. Prevalence of antibodies to West Nile virus in youngsters from 5 to 20 years old in Madagascar // Bull Soc. Pathol. Exot. -1991. Vol. 84. - № 3. - P.225-234

126. Murgue В., Murri S., Zientara S. et al. West Nile outbreak in horses in Southern France,2000: the return after 35 years // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7. - № 4. - P.692-696.

127. Murphy F.A., Fanquet C.M., Bishop C.H.L. et al. Virus taxonomy classification and Nomenclature of viruses // Arch. Virol. — Vol. 10. Supp I. - P. 34-37.

128. Nash D., Mostashari F., Fine A. et al. The outbreak of West Nile virus infection in the New York City area in 1999 // N. Engl. J. Med. 2001. - Vol. 344. - № 24. - P.1807-1814.

129. Nir Y., Goldwasser R., Lasowski J., Murgalit J. Isolation of West Nile virus strains from mosquitoes in Israel //Ibid. — 1968. — Vol. 87. P. 496-501.

130. Nir Y., Goldwasser R., Lasowski Y., Avivi A. Isolation of arboviruses from wild birds in Israel // Am. J. Epidemiol. 1967. - Vol. 86. - P. 372-378.

131. Nir Y., Lasowski Y., Avivi A., Goldwasser R. Survey for antibodies to arboviruses in the serum of various animals in Israel during 1965-1966 // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1969. -Vol. 18.-P. 416-422.

132. Nir Y., Avivi A., Lasovski Y. Arbovirus activity in Israel // Isr J. Med. Sci. 1972. -Vol. 8.-P. 1695-1701.

133. Nir Y., Groen J., Heuvelmans H., Tuynman W., Copra C., Osterhaus A.D. An outbreak of West Nile fever among migrants in Kisangani, Democratic Republic of Congo // Am. J.Trop.Med.Hyg.- 1999.-Vol.61.-№6.- P. 885-888.

134. Olaleye O.D., Omilabu S.A., Ilomechina E.N., Fagbami A.H. A survey for haemagglutination-inhibiting antibody to West Nile virus in human and animal sera in Nigeria // Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. -. 1990. Vol. 13. - № 1. - P. 35-39.

135. Panthier R. Epidemiologic du virus West Nile: etude d'un foyer en Camargue // I. Introduction. Ann. Inst. Pasteur. 1956. - Vol. 114. - P. 518-520.

136. Paul S.D., Rajagopalan P.K., Sreenivasan M.A. Isolation of West Nile virus from the frugivorous bat, Rousettus leschenault // Indian J. Med. Res. 1970. - Vol. 58. P.l 1691171.

137. Peiris J.S.M., Amerasinghe F.P. West Nile fever. In: Beran GW, Steele JH, editors. Handbook of zoonoses. Section B: Viral. 2nd ed. Boca Raton (FL): CRC Press. 1994. -P. 139-48.

138. Petersen L.R., Roehrig J.T. West Nile Virus: A Reemerging Global Pathogen // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7. - № 4. - P.611-614.

139. Perelman A., Stern J. Acute pancreatitis in West Nile fever // Am. J. Trop. Med. Hyg. -1974.-Vol. 23.-P.l 150-1152.

140. Philip С. В., Smadel J. E. Transmission of West Nile virus by infected Aedes albopictus // Prog. Soc. Exp. Biol. Med. -1943. Vol. 53. - № 1. - P. 49-50.

141. Poidinger M., Hall R.A., Mackenzie J. S. Molecular characterization of the Japanese encephalitis serocomplex of the flavivirus genus // Virology. 1996. - Vol. 218. - P. 417421.

142. Porterfild J.S. Antigenic characteristics and classification of Togaviridae // The Togaviruses / Ed R.W. Schlesinger. New -York, London, Toronto, Sydney, San Francisco. - 1980. - Ch.2.- P. 13-46.

143. Porterfield J. S. Flaviviridae // Viruses of Vertebrates. — London. -1989. P. 62-89.

144. Porterfield J.S. Encephalitis viruses and related viruses causing hemorrhagic disease // Encyclopedia of Virology / Eds R. G. Webster, A. Granoff. 1994. - Vol. 1. - P. 361-367.

145. Rai G.P., Tuteja U, Kumar P. Comparison of haemagglutination inhibition and indirect fluorescent antibody tests to detect certain flavivirus antibodies in equines // Acta Microbiol. Hung. 1992. - Vol.39. - № 1. - P.69-73.

146. Reeves W.C. Factors that influence the probability of epidemics of western equine, St. Louis, and California encephalitis in California // Calif. Vector Views 1967. - Vol. 14. -P.13-18

147. Rodhain F, Petter J.J., Albignac R., Coulanges P., Hannoun C. Arboviruses and lemurs in Madagascar: experimental infection of Lemur fulvus with yellow fever and West Nileviruses // Am. J. Trap. Med. Hyg. -1985. Vol. 34. - P.816.

148. Runo G., Chang G.L., Tsushyra K. et al. Phytogeny of the genus Flavivirus // J. Virol.1998. —Vol.72. —P. 73-83.

149. Schmidt J. R., Masoury H. K. Natural and experimental infection of Egyptian horses with West Nile virus // Ann. Trop. Med. Parasitol. -1963. Vol. 57. - P.415-427.

150. Schmitz H., Emmerich P. Detection of specific immunoglobulin M antibody to different flaviviruses by use of enzyme-labeled antigens // J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 19. -№ 5. - P.664-667.

151. Senne D.A., Petersen J.C., Hutto D.L. et al. Pathogenicity of West Nile virus in chickens // Avian Dis. 2000. - Vol.44. - № 3. - P. 642-649

152. Shi P.Y., Kauffman E.B., Ren P. et al. High-throughput detection of West Nile virus RNA // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - № 4. -P.1264-1271.

153. Shieh G., Layton F.A., Miller J. et al. The Role of Pathology in an Investigation of an Outbreak of West Nile Encephalitis in New York, 1999 // Emerg. Infect. Dis. 2000. -Vol. 6.-№4.-P.370-372.

154. Smithbum K.C., Hughes T.P., Burke A.W., Paul J.H. A neurotropic virus isolated from the blood of a native of Uganda // Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1940. - Vol.20. - P. 471 -492.

155. Smithburn K.C., Jacobs H.R. Neutralization tests against neurotropic viruses with sera collected in Central Africa // J. Immunol. -1942. - Vol. 44. - № 1. - P. 9-23.

156. Smithburn K.C., Kerr J.A., Gathe P.P. Neutralization antibodies against certain viruses in the sera of residents of India // J. Immunol. -1954. Vol.72. - № 4. - P. 248-257.

157. Smithburn K.C., Taylor R.M., Rizk F. Kader A. Immunity to certain arthropod-borne viruses among indigenous residents of Egypt // Am. J. Trop. Med. -1954. Vol. 3. - №1. -P. 9-18.

158. Southam С. M., Moore A. E. Induced virus infections in man by the Egypt isolates of West Nile virus // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1954. - Vol. 3. - P.19-50.

159. Southam С. M., Moore A.E. Antivirus antibody studies following induced infection of man with West Nile, Ilheus and other viruses // J. Immunol. 1954. - Vol. 72. - № 6. -P. 446-461.

160. Southam С. M., Green E.L. Clinical application of the hemagglutination inhibition test for West Nile virus antibodies // J. Infect. Dis. 1958. - Vol. 102. - № 2. - P.174-178.

161. Southam C.M., Shipkey R.H., Babcock V.Y. et al. Virus biographies. I. Growth of West Nile and Guaroa viruses in tissue culture // J. Bacteriol. 1964. - Vol. 88. - № 1. - P. 187-199.

162. Spigland W, Jasinska-Klingberg W, Hofshi E, Goldblum N. Clinical and laboratory observations in an outbreak of West Nile fever in Israel in 1957 // Harefua. 1958. — Vol. 54. -P.275-281.

163. Sugamata M., Ahmed A., Miura T. et al. Seroepidemiological study of infection with West Nile virus in Karachi, Pakistan, in 1983 and 1985 // J. Med. Virol. 1988. -Vol.26. -№3.-P.243-247.

164. Sullivan E.J., Rosenbaum H. J. Metods for preparing tissue culture in disposable microplates and their use in virology // Am. J. Epidemiol. 1967. - Vol.85. - № 7. - P. 424-437.

165. Sureau P., Jaeger G., Pinerd G. et al. Sero-epidemiological survey of arbovirus diseases in the Bi-Aka pygmies of Lobaye, Central African Republic // Bull. Soc. Pathol. Exot. Filiales. 1977. - Vol. 70. - № 2. -P.131-137.

166. Swayne D.E., Beck J.R., Zaki S. Pathogenicity of West Nile virus for turkeys // Avian Dis. 2000. - Vol. 44. - № 4. - P.932-937.

167. Tahori A. S., Sterk V. V., Goldbliim N. Studies on the dynamics of experimental transmission of West Nile virus by Culex molestus // Amer. J. Trop. Med. Hyg. — 1955. — Vol. 4. —P. 1015-1025.

168. Tardei G., Ruta S., Chitu V., Rossi C., Tsai T.F., Cernescu C. Evaluation of immunoglobulin M (IgM) and IgG enzyme immunoassays in serologic diagnosis of West Nile Virus infection // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38. - № 6. - P.2232-2239.

169. Taylor R.M., Work Т.Н., Hurlbut H.S., Rizk F. A study of the ecology of West Nile virus in Egypt // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1956. - Vol. 5. - P. 579 - 620.

170. Tesh R.B., Travassos da Rosa A.P.A., Guzman H, Araujo T. P., Shu-Yuan Xiao. Immunization with Heterologous Flaviviruses Protective Against Fatal West Nile Encephalitis// Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8. - № 3. - P.245-251.

171. Tomori O., Fagbami A., Fabiyi A. Isolations of West Nile virus from man in Nigeria // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. -1968. Vol. 72. - P.103-104.

172. Trent D.W., Harvey C.L., Qureshi A., Lestourgeon D. Solid-phase radioimmunoassay for antibodies to flavivirus structural and nonstructural proteins // Infect. Immun. 1976 Vol. 13. -№ 5.-P.l325-1333.

173. Tsai T.F., Popovici F., Cernescu C., Campbell G.L., Nedelcu N.I. West Nile encephalitis epidemic in southeastern Romania // Lancet. 1998. - Vol.5. -№ 352(9130). - P. 767771.

174. Tsai T. F. Arboviruses // P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1999. - P. 1107-1124.

175. Turell M.J., O'Guinn M.L., Dohm D.J., Jones J.W. Vector competence of North American mosquitoes (Diptera: Culicidae) for West Nile virus // J. Med. Entomol.-2001.-Vol. 38.-№2.-P. 130-134.

176. Turell M.J., O'Guinn M., Oliver J. Potential for New York mosquitoes to transmit West Nile virus // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2000.- Vol. 62. - № 3. - P.413-414.

177. Varna M.G. Preliminary studies on the infection of culicine mosquitoes with the Tamilnad strain of West Nile virus // Indian J. Med. Research. -1960. Vol. 48. - № 4. -P.537-544.

178. Watson D.V. Cultivashion of the West Nile virus in developing chick embryo// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1943. Vol. 52. - № 1. - P. 204-205.

179. Weinberger M., Pitlik S.D., Gandacu D. et al. West Nile Fever Outbreak, Israel, 2000: Epidemiologic Aspects // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7.- № 4. - P. 686-691.

180. Weiss D., Carr D., Kellachan Т. C. et al. Clinical Findings of West Nile Virus Infection in Hospitalized Patients, New York and New Jersey, 2000 // Emerg. Infect. Dis. 2001. -Vol. 7. - № 4. - P.654-658.

181. Westaway E. G. Assessment and application of a cell line from pig kidney for plaqueassay and neutralization tests with twelve group В arboviruses // Am. J. Epidemiol, -1966.-Vol. 84. -P.439-456.

182. White D.J., Kramer L.D., Backenson P.B. et al. Mosquito surveillance and polymerase chain reaction detection of West Nile virus, New York State // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol.7. - № 4. - P.643-649.

183. Whitman L., Aitken T. N. Potentiality of Qrnithodorus moubata Murrey (Acarina, Argasidae) as a reservoir-vector of West Nile virus // Ann. Trop. Med. Paras. 1960. -Vol. 54.-№2.-P. 192-204.

184. Work Т.Н., Harlbut H.S. and Taylor R.M. Indigenous wild birds of the Nile Delta as potential West Nile circulatius reservoirs // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1953. - Vol. 4.- № 5.-P. 872-885.

185. Work Т.Н., Harlbut H.S. and Taylor R.M. Isolation of West Nile virus from hood crow and rock pigeon in the Nile Delta // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1953. - Vol. 84. - № 3. -P. 719-722.

186. Zeller H. G. West Nile virus: a migrating arbovirus of current interest // J. Med. Trop. -1999. Vol. 59. - № 4. - Pt 2. - P. 490-494.1. Благодарности./

187. Особую признательность приношу родителям и мужу за неоценимую поддержку и помощь.