Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Серологическая диагностика крымской геморрагической лихорадки с использованием методов иммуноферментного анализа
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Серологическая диагностика крымской геморрагической лихорадки с использованием методов иммуноферментного анализа"
005534121
На правах рукописи
Трусова Ирина Николаевна
СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КРЫМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО
АНАЛИЗА
03.02.02. - вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
3 ОКУ 2013
Москва, 2013 г.
005534121
Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Бутенко Александр Михайлович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, кандидат Борисевич Сергей Владимирович медицинских наук, профессор, начальник вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства Обороны
доктор медицинских наук, профессор, Воробьева Мая Сергеевна
главный эксперт Управления экспертизы противовирусных иммунобиологических препаратов Центра экспертизы качества МИБП ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Ведущая организация:
ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» РАМН
Защита состоится «Л/» сстлТрЧ013 г. в часов на заседании диссертационного
Совета Д 208.131.01 при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства
Здравоохранения РФ по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им.
Д.И. Ивановского Министерства Здравоохранения РФ
Автореферат разослан » ССМУЛГ]/^ 2013 г.
доктор медицинских наук
Ученый секретарь диссертационного Совета,
ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы
Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) - это природно-очаговая острая инфекция человека, протекающая с лихорадочной реакцией, общей интоксикацией и, часто, с геморрагическим синдромом, выраженным в виде кожных кровоизлияний и разнообразных полостных кровотечений. Вирус ККГЛ передается, главным образом, при укусе иксодовых клещей. Возбудитель относится к роду Л'ш'гау/гал- семейства ВипуаУ1Г1с1ае. Ареал этой инфекции охватывает многие эндемичные регионы Африки, Азии и Европы. В России заболеваемость КГЛ зарегистрирована в Астраханской, Ростовской, Волгоградской областях, Ставропольском и Краснодарском краях, Калмыкии, Дагестане, Ингушетии и Карачаево-Черкесии.
Для специфической диагностики КГЛ в эндемичных регионах России и зарубежных стран в настоящее время широко используются методы иммуноферментного анализа и ОТ-ПЦР. Однако, сведения по применению ИФА-^М, ИФЛ-^О и ОТ-ПЦР, опубликованные в отечественных и иностранных изданиях, весьма ограничены и основаны на анализе обследования незначительного числа сывороток больных. При большом объеме подобных исследований, выполняемых в диагностических лабораториях Астрахани, Волгограда, Ростова-на-Дону, Ставрополя и Элисты, полученные результаты недостаточно проанализированы. Не представлены данные по сравнению эффективности применения методов ИФЛ-^М, ИФА-^в и ОТ-ПЦР и динамике и ^О в разные периоды заболевания у больных с различными формами КГЛ, в разных возрастных группах, у мужчин и женщин.
Таким образом, актуальность темы диссертации определяется недостаточным качеством доступной информации по разделам диагностики, имеющим важное значение для быстроты, специфичности и точности выполнения анализов, лечения и, возможно, прогнозирования исходов заболевания КГЛ.
Цели и задачи исследования
Цели исследования заключались в определении динамики ^М и ^О антител в разные периоды заболевания у больных КГЛ с разными клиническими формами, в разных возрастных группах, у мужчин и женщин, и сравнительном определении эффективности использования тест-систем ИФА-1§М, ИФА-^О и ОТ-ПЦР для специфической диагностики КГЛ.
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи: • охарактеризовать чувствительность и специфичность использованных в работе
экспериментальных тест-систем производства НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского для обнаружения специфических IgM и IgG антител у больных КГЛ;
• обследовать сыворотки крови больных КГЛ из эндемичных регионов России методами ИФА-IgM, ИФА-IgG и ОТ-ПЦР;
• изучить динамику IgM и IgG антител у больных КГЛ в зависимости от тяжести заболевания, возраста и пола с использованием статистического анализа данных;
• определить вероятность заболевания КГЛ в эндемичном регионе среди лиц, покусанных клещами Н. marginatum;
• определить тактику специфической диагностики КГЛ.
Научная новизна исследований
Впервые по результатам обследования методами ИФА репрезентативного числа сывороток крови больных КГЛ (338 сывороток крови от 254 больных из Астраханской, Ростовской, Волгоградской областей, Ставропольского края, Калмыкии) с применением статистической обработки данных проведен анализ динамики обнаружения и титров специфических IgM и IgG антител в разные периоды заболевания, при разных клинических формах, в различных возрастных группах, у мужчин и женщин.
Установлена тенденция выявления более высоких титров IgM антител при легкой форме заболевания, по сравнению со среднетяжелой и тяжелой, а также более высоких титров при среднетяжелой, по сравнению с тяжелой (вероятность альтернативной гипотезы р < 0.02).
Титры IgM антител у больных КГЛ в возрастной группе до 40 лет значительно выше, чем в группе 60 и более лет (р < 0.009).
Впервые установлено, что частота регистрации клинически выраженных, лабораторно верифицированных случаев КГЛ среди лиц, покусанных в эндемичном регионе клещами Н. marginatum, составляет 0,3-0,4 %.
Практическая значимость
На основании полученных данных подтверждена целесообразность использования принятой в настоящее время схемы специфической диагностики КГЛ, включающей применение ОТ-ПЦР (в первые 8 дней болезни), а затем ИФА-IgM (с 8-го дня и позднее). Метод ИФА-IgG может использоваться как подтверждающий, но необязательный тест.
Положения, выносимые на защиту
1. По результатам обследования методами ИФА репрезентативного числа сывороток
крови больных КГЛ с применением статистической обработки данных впервые проведен анализ динамики обнаружения и титров специфических IgM и IgG антител в разные периоды заболевания, при разных клинических формах, в различных возрастных группах, у мужчин и женщин.
2. Частота выявления IgM-позитивных сывороток с 1 по 16 день болезни возрастает от 40,0 до 100 %. Средние геометрические значения титров IgM при этом увеличиваются от 1 : 8700 до 1 : 22 700, сохраняясь на высоком уровне до конца месяца (срок наблюдения).
3. Частота обнаружения специфических IgG с 1 по 16 день болезни возрастает от 24,4 до 92,3 %, а средние геометрические значения титров IgG от 1 :290 до 1 : 1100. Средний показатель титров 1 : 960 сохраняется до конца месяца.
4. Установлена статистически достоверная тенденция выявления более высоких титров IgM антител при легкой форме заболевания, по сравнению со среднетяжелой и тяжелой, а также более высоких титров при среднетяжелой форме по сравнению с тяжелой.
5. Титры IgM антител у больных КГЛ в возрастной группе до 40 лет значительно выше, чем в группе 60 и более лет.
6. Подтверждена целесообразность использования принятой в настоящее время схемы специфической диагностики КГЛ, включающей применение ОТ-ПЦР с 1 по 8 день заболевания, метод ИФА-IgM - с 8 дня и позднее, ИФА-IgG с 9-16 дня заболевания.
7. Впервые установлено, что частота регистрации клинически выраженных, лабораторно верифицированных случаев КГЛ среди лиц, покусанных в эндемичном регионе клещами Я. marginatum, составляет 0,3-0,4 %.
Апробация результатов исследования и публикации
Результаты работы были представлены на X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 2010 г.).
Основные положения работы заслушаны и обсуждены на заседании апробационного совета ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава России 25 апреля 2013 г. (Протокол № 22).
По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе в изданиях, рекомендуемых ВАК - 3.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 7 глав собственных исследований, обсуждение, выводы. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 34 рисунками. Список литературы содержит 161 источник, из которых 74 отечественных и 87 зарубежных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вирусы. В работе использовали следующие штаммы вирусов из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов: ККГЛ (штамм 10145, Узбекистан), Западного Нила (штамм 986, Астрахань), клещевого энцефалита (штамм 4072, Екатеринбург).
Сыворотки крови больных КГЛ, КЭ, ЛЗН. Сыворотки крови и сведения о больных КГЛ были получены в 2003-2010 гг. из вирусологических лабораторий ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области», Астрахань, ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области», Ростов-на-Дону, ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, Ставрополь, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Волгоградской области», Волгоград, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Калмыкия», Элиста.
Сахарозо-ацетоновые антигены. Антигены для серологических реакций готовили из мозговой ткани инфицированных вирусом ККГЛ мышей-сосунков, взятой на высоте клинических проявлений болезни, с последующей инактивацией вируса 0,01% раствором ß-пропилактона по методу Clark, Casals (1958). Через 7 суток экспозиции с ß-пропилактоном при 4° С проводили тест на безвредность препарата путем внутримозгового заражения новорожденных белых мышей.
Получение иммунных асцитных жидкостей мышей. В качестве источника антител к вирусам КГЛ, ЗН, КЭ использовали иммунные асцитные жидкости взрослых белых мышей. Материалом для иммунизации служила 10%-ная суспензия вируссодержащего мозга мышей-сосунков. Цикл иммунизации состоял из 4 - 5 инъекций мозговой суспензии в смеси с адъювантом Фрейнда с интервалом в 7 дней по 0,2 мл смеси.
На 5—7 день после окончания цикла иммунизации мышам вводили внутрибрюшинно в концентрации 2-4 млн. клетки саркомы 180/TG. На 10-14-й день объем асцитной жидкости у каждой мыши составлял от 5 до 10-15 мл. Полученную после пункции иммунную асцитную жидкость сливали в центрифужные стаканы и центрифугировали при 1500-2000 об/мин в течение 15-20 минут для осаждения клеток.
Получение иммуноглобулинов класса G. Выделение иммуноглобулинов класса IgG к
вирусам KTJI, КЭ, ЗН из типоспецифических иммунных асцитных жидкостей белых мышей проводили методом аффинной хроматографии в колонке 7х 1 см с протеин-А-сефарозой Ch-4B (Pharmacia). Полученный глобулин использовался в качестве подложки для адсорбции антигена на твердой фазе в реакции ИФА, а также для конъюгирования с ферментом пероксидазой.
Получение пероксидазных конъюгатов иммуноглобулинов. Для приготовления коньюгатов иммуноглобулинов применяли перйодатный метод (Лаврова Н.А., Краснобаева З.Н, 1984; Nakane Р.К., Kawaoi А., 1974). Готовили раствор, содержащий пероксидазу хрена RZ=3,0 в концентрации 4 мг/мл и 0,02М NaIC>4. Полученный раствор диализовали против 0,001М натрий-ацетатного буфера рН 4,4 в течение 12-14 часов. К полученному раствору добавляли натрий-карбонатный буфер рН 9,5 до конечной концентрации 0,004 М и IgG в концентрации 2 мг/мл. Реакционную смесь инкубировали в течение 2-х часов при комнатной температуре, непрерывно помешивая. После этого в реакционную смесь добавляли свежеприготовленный раствор NaBH4 до концентрации 0,4 мг/мл, инкубировали 2 часа при 40 С, непрерывно перемешивая. Полученный конъюгат очищали, используя мембранные фильтры "Владипор". Для стабилизации конъюгата добавляли бычий сывороточный альбумин до концентрации 1 %, мертиолят (0,02 %) или глицерин (50 %).
Иммуноферментный анализ. Оценку активности и специфичности полученных антигенов, глобулинов и конъюгатов, а также выявление вирусных антигенов и антител к ним в исследуемом материале проводили иммуноферментным анализом (ИФА). Состав буферных, рабочих и промывающих растворов был общепринятым (Н. А. Лаврова, О. В. Наволокин, 1986). Для выявления вирусных антигенов в лунки 96-луночных панелей сорбировали мышиные поликлональные иммуноглобулины G против вируса ККГЛ, разведенный в 0,05М карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) с рН 9,6. Затем вносили мозговые антигены, разведенные в фосфатном буфере, а после инкубации - мышиные поликлональные антитела против указанных выше вирусов, меченные пероксидазой хрена.
Выявление антител класса М. Определение специфических IgM антител к вирусу ККГЛ проводили методом MAC-ELISA (Meegan and LeDuc, 1989). В лунках полистеролового планшета сорбировали козьи антитела IgG (производство фирмы Sigma, США), против ц-цепи иммуноглобулина человека. Затем последовательно вносили обследуемые сыворотки, сахарозо-ацетоновый антиген вируса ККГЛ (или нормальный контрольный антиген из мозга неинфицированных новорожденных белых мышей) и мышиные моноклональные антитела против вируса ККГЛ (ГЕМА-12), меченные пероксидазой
хрена.
На каждом из этапов постановки ИФА-IgM реакционные компоненты инкубировались 1 час при температуре 37°С, а затем смесь тщательно промывали 0,01 М фосфатно-буферным раствором (ФБР) рН 7,4 с добавлением 0,15 М NaCl и 0,05 % твина-20.
Субстрат-индикаторной системой служил раствор тетраметилбензидина с 0,006 % перекиси водорода Н2О2. Реакцию останавливали 2N раствором серной кислоты. Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм. В каждом опыте использовали гетерологичные или нормальные контрольные антигены, а так же контрольные, позитивные на IgM антитела, сыворотки больных КГЛ. Реакцию считали положительной, если отношение экстинкции опытных и контрольных образцов составляло не менее 3,0 (при ОП450 не ниже 0,3 для опытных образцов и не выше 0,1 в контроле).
Выявление антител класса G. Определение специфических IgG антител к вирусу ККГЛ проводили методом ИФА-IgG в 96-луночных полистироловых планшетов с сорбированными поликлональными мышиными антителами IgG к вирусу ККГЛ в КББ (Meegan and LeDuc, 1989). Остальные реагенты вносили в следующей последовательности: блокирующий раствор 1 % бычьего сывороточного альбумина, специфичный вирусный антиген (или нормальный контрольный антиген), обследуемые сыворотки и мышиные антитела против иммуноглобулинов IgG человека, меченные пероксидазой хрена (ГНЦ РФ "Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства", г. Москва). Результаты реакции учитывали также, как при постановке MAC-ELISA.
Реакция связывания комплемента. РСК ставили микрометодом на холоду по общепринятой методике (Гайдамович С. Я., Кирющенко Т. В., 1972). Постановку реакции начинали с титрования антигенов и комплемента для определения их титра и рабочей дозы. Затем устанавливали специфическую активность индивидуальных проб ИАЖ, полученных от белых мышей, иммунизированных вирусом ККГЛ. Наиболее активные пробы (с титрами антител не менее 1 : 320 — 1 : 640) использовали для приготовления иммуноглобулинов и конъюгатов.
Метод ОТ-ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР использовали ОТ-ПЦР-тест-систему «АмплиСенсR КГЛ» производства ООО «ИнтерЛабСервис» Центрального НИИ эпидемиологии, Москва. Выделение РНК из образцов сывороток крови проводили методом сорбции на силикагеле с предшествующим лизированием пробы в растворе, содержащим гуанидин тиоционат из набора «Рибо-Сорб» производства ЦНИИЭ. В качестве внутреннего контроля качества выделения РНК применяли ВКО-1 CCHF-rec
(ЦНИИЭ). Реакцию ОТ проводили при 37° С в течение 30 минут, используя набор «Реверта-L» того же производителя. Реакцию ПЦР проводили в объеме 25 мкл на амплификаторе GeneAmp-2700 (Applied Biosystems) по стандартным методикам со специфическими праймерами, входящими в состав набора реагентов для амплификации кДНК вируса KKTJI производства ЦНИИЭ.
Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом гель-электрофореза в 2 % агарозном геле с окраской фрагментов кДНК этидиум бромидом и визуализацией в УФ-свете.
Раздел исследований с применением ОТ-ПЦР был выполнен Н. Г. Путилиной и соавт. (ЦГиЭ в Астраханской области). Участие автора диссертации заключалось в изучении сравнительной эффективности применения метода ИФА-IgM при параллельном обследовании сывороток крови больных КГЛ в ОТ-ПЦР.
Статистические методы. Статистическую обработку результатов исследований проводили по стандартным методикам (Прохоров Ю.В., 1973; Тутубалин В.Н., 1992; Ширяев А.Н.,1989).
Метод Манна-Уитни использовался для непараметрической оценки достоверности различий титров специфических антител, выявляемых у больных КГЛ методом ИФА. Различия между двумя величинами считали достоверными, если р < 0,05.
Достоверность отличий для средних значений встречаемости признаков (положительных значений в ИФА) рассчитывалась с помощью t-теста Стьюдента. Достоверным считали отличие при вероятности альтернативной гипотезы (отсутствия отличия) р < 0.05.
Практические расчеты проводили с помощью компьютерной программы Win Statistics SPSS 18.0.2.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Характеристика ИФА тест-систем для выявления IgM и IgG антител к вирусу ККГЛ, определение эффективности их использования в диагностических целях
В диссертационной работе были использованы экспериментальные тест-системы ИФА-IgM и ИФА-IgG, разработанные в лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии. В 2004 г. они прошли испытание в ГИСК им. Л. А. Тарасевича, на основании чего было получено заключение Комитета по иммунобиологическим препаратам с рекомендациями по их практическому внедрению в диагностических лабораториях России. На протяжении многих лет эти тест-системы были единственными, которые использовались в практических целях для диагностики КГЛ в эндемичных
регионах страны. По результатам их применения были получены положительные заключения из ЦГиЭ в Астраханской, Волгоградской областей и Дагестана. В данной главе диссертации содержится характеристика серий, которые реально использовались при выполнении работ, с тем, чтобы показать их чувствительность и специфичность.
Получение и характеристика антигенов, глобулинов и конъюгатов вируса ККГЛ
Антиген вируса ККГЛ получали методом сахарозо-ацетоновой экстракции из мозговой ткани инфицированных новорожденных белых мышей. Инактивацию полученного антигена проводили 0,01 % раствором Р-пропилактона. Иммуноглобулин класса О к вирусу ККГЛ получали из иммунной асцитной жидкости взрослых мышей методом аффинной хроматографии на протеин-А-сефарозе. Очищенный иммуноглобулин конъюгировали с пероксидазой хрена.
Специфичность и активность компонентов тест-систем оценивали с помощью ИФА. В качестве отрицательного контроля использовали нормальные антигены, полученные из мозговой ткани незараженных мышей-сосунков, и нормальные глобулины, полученные из асцитных жидкостей неиммунизированных мышей. Кроме того, для оценки специфичности применяли антигены и глобулины гетерологичных вирусов (клещевого энцефалита и Западного Нила).
Полученный сахарозо-ацетоновый антиген вируса ККГЛ оказался высоко активным в ИФА (Табл. 1). В результате многократного титрования мозгового антигена вируса ККГЛ в ИФА было установлено, что он имеет специфическую активность 1:102 400. Положительные сигналы в лунках с нормальным иммуноглобулином и гетерологичными иммуноглобулинами к вирусам КЭ и ЗН отсутствовали, что свидетельствовало о специфичности выявляемых результатов в ИФА. В дальнейших исследованиях использовали рабочее разведение антигена 1 : 3200.
Оценку специфичности и активности полученного иммуноглобулина класса О проводили в ИФА. Однотипные результаты, полученные при титровании иммуноглобулина к вирусу ККГЛ, показали отсутствие выраженной реакции с нормальным антигеном и антигенами гетерологичных вирусов КЭ и ЗН. Было отмечено, что реакция активно протекала при концентрациях иммуноглобулина от 4,0 до 0,25 мкг. По результатам исследования выбрано рабочее разведение иммуноглобулина к вирусу ККГЛ - 2 мкг/лунку.
Для определения активности конъюгата иммуноглобулина к вирусу ККГЛ, меченного пероксидазой хрена, его титровали в разведениях от 1 : 100 до 1 : 800. Полученный конъюгат иммуноглобулина к вирусу ККГЛ не реагировал в ИФА с нормальным и
гетерологичными антигенами вирусов КЭ и ЗН. При разведениях конъюгата от 1 : 100 до 1 : 800 оптические плотности в лунках с антигеном вируса ККГЛ варьировали от 1,763 до 0,563, что свидетельствовало о его высокой активности и специфичности при отсутствии реакции с антигенами вирусов КЭ, ЗН и нормальным антигеном (Табл. 1). Аналогичные результаты были получены неоднократно.
Таблица 1
Определение активности и специфичности конъюгата иммуноглобулина к вирусу ККГЛ в _ ИФА (пример)_
Разведение конъюгата (обратная величина титра) Оптическая плотность в ИФА с антигенами вирусов
ККГЛ N' КЭ ЗН
100 1,763 0,038 0,09 0,033
200 1,591 0,035 0,082 0,025
400 1,068 0,024 0,084 0,044
800 0,563 0,047 0,075 0,032
■%-
- нормальный антиген
На основе наших данных в последующих исследованиях использовали рабочее разведение конъюгата иммуноглобулина к вирусу ККГЛ 1 : 400.
Приготовленные антигены, глобулины и конъюгаты в дальнейшем были использованы в качестве компонентов ИФА-тест-систем для выявления антител классов М и G к вирусу ККГЛ. В реакции ELISA для выявления антител IgG в качестве конъюгата использовали мышиные антитела против иммуноглобулинов IgG человека, меченные пероксидазой хрена, производства ГНЦ РФ "Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства", Москва. Для выявления антител IgM методом MAC-ELISA применяли козьи антитела IgG против ц-цепи иммуноглобулина человека производства фирмы "Sigma" (США). Перечисленные компоненты использовались в разведениях, указанных производителями.
Определение эффективности ИФА тест-систем для выявления антител классов
MuG к вирусу ККГЛ
Для определения эффективности полученных тест-систем в диагностических целях были использованы 11 сывороток крови больных КГЛ, 9 сывороток крови больных КЭ, 18 сывороток крови больных ЛЗН. Их обследование было проведено ИФА на антитела класса IgM и IgG с антигенами вирусов ККГЛ, КЭ, ЗН и специфическими пероксидазными конъюгатами иммуноглобулинов к вирусам ККГЛ, КЭ и ЗН.
Среди 11 сывороток крови, взятых от 8 больных КГЛ, специфические IgM антитела были обнаружены в 9 пробах. У больного К. С. при отрицательном результате обследования на 7-й день болезни антитела в титре 1 : 600 были обнаружены на 13-й день
после начала заболевания. У больных К. А. и Г. М. так же установлена выраженная сероконверсия антител соответственно от 1 : 100 (на 6-й день болезни) до > 1 : 800 (на 17-й день) и от 1 : 3200 (на 9-й) до 1 : 12 800 (на 20-й). У больных, обследованных однократно на 8-16 дни болезни, титры ^М антител варьировали от > 1 : 800 до 1 : 6 400. Методом ИФА-^в специфические антитела обнаружены в 5 из 11 сывороток больных КГЛ. Результаты обследования тех же сывороток в ИФА-тест-системах, предназначенных для выявления IgM и антител к вирусам КЭ и ЗН, оказались отрицательными.
Все 9 обследованных сывороток больных КЭ, взятые в период от 7 до 17 дня от начала заболевания, содержали ^М антитела к вирусу КЭ в титрах от 1 : 800 до 1 :102 400. Антитела класса к вирусу КЭ обнаружены в 3 пробах. IgM и антитела к вирусам ККГЛ и ЗН в тех же пробах отсутствовали.
Методом ИФА на наличие IgM антител к вирусу ЗН были обследованы парные сыворотки 9 больных ЛЗН. У двух больных (К. Д. и К. Е.) выявлена сероконверсия антител от 0 (отрицательный результат при обследовании сыворотки в разведении 1 : 100) до 1 :6400 и 1 :25 600. Во всех других случаях обнаружены диагностические уровни специфических 1§М, нарастание или диагностическое значимое снижение титров антител. Методом ИФА-1§0 обнаружили специфические антитела в 6 пробах, взятых от больных ЛЗН. Результаты обследования тех же проб сывороток в тест-системах ИФА-^М и ИФА-^в, предназначенных для выявления антител к вирусам ККГЛ и КЭ, оказались отрицательными.
Отрицательные результаты обследования в ИФА-1цМ и ИФА-^й на антитела к вирусу ККГЛ в 27 сыворотках больных ЛЗН и КЭ указывают на специфичность использованных тест-систем.
Сравнительная оценка чувствительности и специфичности ИФА тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» и НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского при выявлении ^М и ^С к вирусу ККГЛ
Специфичность и чувствительность наших ИФА-тест-систем и тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирская область, п.Кольцово) для определения 1§М и к вирусу ККГЛ оценивали при сравнительном тестировании 21 сыворотки больных КГЛ из Ставропольского края с подтвержденным диагнозом КГЛ. Основное отличие ИФА-тест-систем заключается в использовании в системах НИИ вирусологии контроля испытуемых проб сывороток с нормальным антигеном (помимо специфического антигена вируса ККГЛ), что позволяет дифференцировать специфические ответы ИФА от ложноположительных.
Методом ИФА-1§М (МАС-Е1Л8А) в двух тест-системах были обследованы параллельно 21 сыворотка крови больных, перенесших КГЛ в 2009 г. в Ставропольском крае. Качественное совпадение результатов выявления специфических ^М наблюдалось в 19 случаях (90,5 %). Сыворотки пациентов №№ 4887 и 4927, взятые на 12 и 10 дни болезни, оказались отрицательными в тест-системе НИИ вирусологии, но реагировали в тест-системе «Вектор-Бест» в титрах > 1:3200 и > 1:1600. При титровании этих сывороток в тест-системах ЗАО «Вектор-Бест» с нормальным антигеном их титры составили > 1 :400 и > 1 :200, что свидетельствовало о ложноположительных результатах. В тест-системе ИФА-^М НИИ вирусологии при определении конечного разведения 1цМ в положительных пробах титры составляли 1 : 6400 (в одной сыворотке), 1 : 12 800 (в двух), 1 :25 600 (в четырех), 1 : 51 200 (в пяти), 1 :204 800 (в восьми) и 1 :409 600 (в одной). Только четыре сыворотки (№№ 4746, 4869, 4922, 4923) были протитрованы для определения конечного разведения ^М антител параллельно в системах НИИ вирусологии и «Вектор-Бест». Их титры оказались соответственно: 1 : 204 800 и 1 : 1600, 1 : 51 200 и 1 : 800, 1 :25 600 и 1 : 1600, 1 : 51 200 и 1 : 1600, т.е. значительно выше в системах НИИ вирусологии.
Методом ИФА-^О параллельно были обследованы 19 сывороток. 16 из них оказались положительными и две — отрицательными в обеих системах (процент совпадения результатов - 94,7 %). В одном случае (сыворотка № 4746) при положительном результате в тест-системе НИИ вирусологии (титр - 1 : 400) была отрицательной в тест-системе «Вектор-Бест». Проверка сыворотки в тест-системе НИИ вирусологии показала отсутствие положительной реакции с нормальным антигеном. При параллельном титровании 10 сывороток (№№ 4764, 4802, 4804, 4819, 4832, 4857, 4868, 4869, 4905, 4923) в тест-системах НИИ вирусологии и «Вектор-Бест» титры антител оказались соответственно: 1 :400 и 1 :200, 1 :3200 и 1 : 100, 1 :6400 и 1 :400, 1 :400 и 1 : 100, 1 : 1600 и 1 :200, 1 :3200 и 1 : 800, 1 :400 и 1 : 100, 1 : 800 и 1 : 200, 1 : 1600 и 1 : 100, 1 :800 и 1 :200. Полученные результаты указывает на значительно большую чувствительность систем НИИ вирусологии.
Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о большей чувствительности ИФА-1цМ и ИФА-^в тест-систем и большей специфичности ИФА-^М тест-системы производства НИИ вирусологии по сравнению с тест-системами «Вектор-Бест».
Динамика специфических у больных КГЛ
Суммарные данные по динамике специфических антител, выявляемых в сыворотках крови больных КГЛ в течение месяца от начала заболевания
На ^М к вирусу ККГЛ были обследованы 338 сывороток крови 254 больных с подтвержденным диагнозом КГЛ, полученные из Ростовской области (170 проб от 124 больного за 2004-2010 гг.), Астраханской области (100 проб от 77 больных за 20032010 гг.), Калмыкии (38 проб от 28 больных за 2005 г.), Ставропольского края (23 пробы от 22 больных за 2009 г.), Волгоградской области (7 проб от 3 больных за 2003 г.).
Специфические ^М к вирусу ККГЛ в целом были обнаружены в 297 пробах от 249 больных, взятых с 1 по 30 дни заболевания (87,9 %). В периоды с 1 по 5, 6-7 и начиная с 10 дня болезни, частота выявления 1§М-позитигшых сывороток составляла соответственно 40,0; 81,8 и 97,1-100% (р<0.02). Средние геометрические значения титров при этом составляли от 1 : 8700 на 1-5 сутки, достигали максимального значения 1 :22 700 на 14— 15 дни, достоверно превышая титры на 6-7 и 8-9 дни (р < 0.01 и р < 0.05). Титры ^М на 12-13 и 14-15 сут. от начала заболевания достоверно выше, чем на 6-7 сут. (р<0.02, р < 0.01). Высокие титры антител сохранялись у больных КГЛ вплоть до 30 дня заболевания. Наиболее демонстративной выглядит разница в титрах при обследовании на 20-30 и 6-7 дни заболевания (р < 0.02) (Табл. 2).
Таблица 2
Суммарные данные обследования в ИФА-1дМ сыво роток крови больных КГЛ
Дни от начала заболевания Число обследованных % положительных Средние геометрические значения титров
сывороток проб 1од ± с титры
1-5 40 40,0 13,1 ±2,8 1 : 8 700
6-7 44 81,8 13,1 ±2,4 1 :8 600
8-9 65 96,9 13,5 ±2,5 1: 11 400
10-11 70 97,1 13,8 ±2,1 1 : 14 600
12-13 35 91,4 14,4 ± 1,2 1 :22 000
14-15 33 100,0 14,5 ± 2,2 1 :22 700
16-17 19 94,7 13,1 ±3,1 1 :9 000
18-20 14 92,9 14,0 ±2,1 1:16 000
21-30 18 100,0 14,4 ±2,6 1 : 21 000
Всего 338 87,9 13,8 ±2,4 1 : 13 800
Динамика специфических ^М антител в зависимости от клинической формы
болезни
Для выявления особенностей динамики специфических антител у больных КГЛ с разной клинической формой болезни в течение месяца от начала заболевания средние геометрические значения титров ^М рассчитывали по результатам титрования в ИФА-^М 245 сывороток от 200 больных КГЛ. Клиническая форма заболевания была установлена лечебными учреждениями по месту госпитализации больного.
На долю тяжелых случаев КГЛ с геморрагическим синдромом приходилось 19% больных, тяжелых случаев без геморрагического синдрома - 4,5 %, среднетяжелых с геморрагическим синдромом - 25 %, среднетяжелых без геморрагического синдрома -36,5 %, легких форм с геморрагическим синдромом - 1,5 %, легких форм без геморрагического синдрома - 13,5 %. В целом проявление геморрагического синдрома наблюдалось у 45,0 % больных, из них - 41,1 % приходилось на случаи с тяжелой формой заболевания, 55,6 % - со среднетяжелой и 3,3 % - с легкой.
Среди 22 сывороток крови, собранных на 1-7 дни от начала заболевания у больных с тяжелым течением болезни, доля положительных сывороток составила 68,1 %, среднее геометрическое значение титров при этом было 12,4 ± 2,9 10© (1 : 5 400). На 8-11 дни доля положительных сывороток возросла до 95,2 % (р < 0.02), а титры до 12,7 ± 2,5 1о§2 (1 : 6 700). Максимального значения 13,7 ± 2,0 1о& (1 : 13 300) титры ^М достигли на 12-15 дни от начала заболевания при доле положительных сывороток 92,3 %. На 16-30 дни от начала заболевания титры уменьшились до 12,8 ± 4,4 ^2 (1 : 7 100), доля положительных сывороток составила 60 % (Табл.3)
Таблица 3
Динамика титров специфических 1дМ антител у больных КГЛ в зависимости от _клинической формы заболевания и времени обследования_
Дни от начала заболевания Форма течения заболевания
Тяжелая Среднетяжелая Легкая
число проб % положительных проб logia титр число проб % положительных проб logia титр число проб % положительных проб О ■н О) о титр
1-7 22 68,1 12,4 ±2,9 1 : 5400 39 48,7 12,811,7 1 :7100 13 61,5 12,9 ±3,6 1 :7600
8-11 21 95,2 12,7 ±2,5 1 : 6700 63 98,4 13,8 ±2,3 1 :14300 12 91,7 14,0 ±2,1 1 :16400
12-15 13 92,3 13,7 ±2,0 1 :13300 27 96,3 14,0 i 2,1 1 :16400 6 100 14,5 ±2,1 1 :23200
16-30 5 60,0 12,8 ±4,4 1 : 7100 19 100 14,0 i 2,4 1 :16400 5 100 14,8 ±2,4 1 : 28500
Всего 61 82,0 12,9 ±2,6 1 : 7600 148 84,4 13,7 ±2,2 1 : 13300 36 83,3 13,9 ±2,6 1 : 15300
От больных со среднетяжелым течением болезни было обследовано в ИФА-^М 148 сывороток. Среднее геометрическое значение титров у больных со среднетяжелой формой КГЛ на 1-7 дни болезни - 12,8 ± 1,7 1о£г (1 :7 100), доля положительных сывороток-48,7 %. На 8-11 дни титры возросли до 13,8 ±2,3 1од2 (1 : 14 300), доля положительных сывороток до 98,4 % (р < 0.001). Максимального значения титры достигают на 12-15 дни от начала заболевания 14,0 ±2,1 ^2 (1 : 16 400), и на 16-30 дни остаются на том же
уровне 14,0 ± 2,4 (1:16 400). Доля положительных сывороток равняется, соответственно 96,3 % и 100 % на 12-15 и 16-30 дни (Табл. 3).
Установлена статистически достоверная разница в группе пациентов со среднетяжелым течением болезни между титрами IgM, выявляемых в сыворотках крови на 1-7 сут. и 1215 сут. (р < 0.02).
От больных с легким течением болезни было обследовано 36 сывороток. В первые 7 дней заболевания специфические 1цМ были выявлены в 61,5 % проб, среднее геометрическое значение титров составило 12,9 ± 3,6 (1 : 7 600). На 8-11 дни титры возрастали до 14,0 ±2,1 (1 : 16 400). Высокие показатели титров отмечали также на 12-15 и 16-30 дни от начала заболевания, а именно 14,5 ± 2,1 (1:23 200) и 14,8 ± 2,41о;*2 (1:28 500) соответственно. После 12 дня заболевания частота положительных ответов в ИФА-^М возрастала до 100 %, достоверно отличаясь от значений в первые дни заболевания (р < 0.01) (Табл. 3).
У больных с легким течением болезни происходило нарастание титров 1;*М антител в 2 раза уже на 8-11 дни от начала заболевания (с 1 : 7 600 до 1 : 16 400), на 12-15 дни еще в 1,4 раза (до 1:23 200), сохраняясь на высоком уровне в более поздние сроки. У больных со среднетяжелым течением болезни титры значительно возрастали, по сравнению с первыми днями заболевания, на 8-11 дни (с 1 : 7 100 до 1 : 14 300) и 12-15 дни (с 1 : 7 100 до 1 : 16 400, р<0.02), оставаясь на этом уровне до 16 дня и позднее. При тяжелом течении заболевания титры ^М антител, по сравнению с 1-7 днями болезни, практически не возрастали на 8-11 дни (соответственно 1 : 5 400 и 1 : 6 700), на 12-15 дни заболевания увеличивались в 2 раза (с 1 : 6 700 до 1 : 13 300), однако после 16 дня снижались (Табл. 3).
Частота выявления специфических у больных КГЛ с разными клиническими формами заболевания различались несущественно (Табл. 3).
При сравнении титров у больных КГЛ во все анализируемые сроки обследования отмечалась постоянная тенденция выявления более высоких титров антител при легкой форме заболевания, по сравнению со среднетяжелой и тяжелой, а также более высоких титров при среднетяжелой форме по сравнению с тяжелой (вероятность альтернативной гипотезы р < 0.001). Например, у больных с легкой формой КГЛ наблюдались достоверно более высокие титры специфических ^М, чем при тяжелой форме (соответственно 1 : 15 300 и 1 : 7600, р < 0.05) (Табл. 3).
Таким образом, сравнение титров специфических ^М антител у больных КГЛ в первую неделю заболевания может иметь значение для прогноза клинического течения заболевания. Возрастание титров IgM антител в 2 раза на 8-11 сутки, по сравнению с
первыми днями, вероятно, может свидетельствовать о возможном развитии легкой и среднетяжелой форм КГЛ.
Динамит специфических антител в зависимости от возраста больных
Для выявления особенностей динамики специфических ^М антител у больных КГЛ разных возрастных групп в течение месяца от начала заболевания средние геометрические значения титров рассчитывали по результатам титрования в ИФЛ-ГцМ 334 сывороток от 251 больного КГЛ (у трех больных возраст неизвестен), из них 17 больных (6,8%) были моложе 20 лет, 80 (31,9 %) - в возрасте от 20 до 39 лет, 107 (42,6 %) - в возрасте от 40 до 59 лет и 47 (18,7%) - 60 и более лет. Вследствие малочисленности группы больных КГЛ младше 20 лет, при статистическом анализе ее объединили с группой больных в возрасте от 20 до 39 лет.
У больных в возрасте до 40 лет титры ^М возрастали от 13,0 ± 2,0 (1 : 8 200) на 17 дни от начала заболевания до 15,0 ± 1,9 1оё2 (1 : 32 800) после 16 дня заболевания. Доля положительных сывороток в ИФА-^М возрастала с 1 по 15 сут. заболевания от 63,3 % до 96,0% (р < 0.001). Достоверные различия в титрах ^М наблюдали в периоды 1-7 и 8-11 дни болезни (р < 0.01), а также 1-7 и 16-30 (р < 0.003) (Табл. 4).
Таблица 4
Динамика титров специфических 1дМ антител у больных КГЛ в разных возрастных
группах в зависимости от времени обследования
Возрастные группы
до 40 лет 40-59 лет 60 и более лет
с 5 ? 1 ? Ж ю X л I ю X jO X ю ж Л X
О Ь = X й Ч " CL с о 5 S т % положител! проб log ± о титр CL с О 5 £ % положител! проб log ± о титр о. с о 5 S т % положител* проб log ±о титр
1-7 30 63,3 13,0 ±2,0 1:8200 40 60,0 13,6 ±2,3 1:12400 15 66,7 12,7 ±3,0 1:6700
8-11 55 96,4 14,4 ± 2,0 1:21600 49 98,0 13,4 ±2,5 1:10800 27 96,3 13,0 ±1,9 1:8200
12-15 24 96,0 14,5 ±2,3 1:23200 33 93,6 14,4 ±1,8 1:21600 9 100 14,3 ±2,6 1:20200
16-30 17 94,1 15,0 ± 1,9 1:32800 23 95,6 14,0 ±2,9 1:16400 12 100 11,6 ±2,9 1:3100
Всего 126 88,1 13,9 ±2,6 1:15300 145 86,2 13,4 ±2,6 1:10800 63 90,5 12,6 ±2,7 1:6200
Титры IgM у больных в возрасте 40-59 лет увеличивались от 13,6 ± 2,3 log2 (1 : 12 400) на 1-7 дни заболевания до 14,4 ± 1,8 log2 (1:21 600) на 12-15 дни. После 16 дня наблюдали снижение титров до 14,0 ± 2,9 log2 (1:16 400). Доля положительных сывороток в ИФА-IgM возрастала от 60,0 % на 1-7 сут. заболевания до 98,0 % на 8-11 дни
(р < 0.0001), оставаясь на высоком уровне до конца месяца. Титры IgM на 12-15 дни были существенно выше, чем в первые дни болезни (р < 0.05) (Табл. 4).
В группе больных в возрасте 60 и более лет титры IgM возрастали от 12,7 ± 3,0 log2 (1 : 6 700) на 1-7 дни заболевания до 14,3 ± 2,6 log2 (1 :20 200) на 12-15 дни. После 16 дня титры снижались до 11,6 ± 2,9 log2 (1 :3 100), существенно отличаясь от титров на 12—15 дни (р < 0.04). Доля положительных сывороток в ИФА-IgM существенно возрастала на 8-11 сут. по сравнению с первыми днями заболевания (от 66,8 % до 96,3 %, р < 0.03) (Табл. 4).
Титры специфических IgM у больных KTJI в возрасте 60 и более лет оказались существенно ниже, чем в других возрастных группах. Максимальные титры IgM были отмечены у больных в возрасте до 40 лет на 12-15 дни (1 :23 200) и на 16-30 дни заболевания (1 : 32 800). Установлено, что с увеличением возраста пациентов титры специфических IgM снижались и составили: 1:15 300, 1:10 800 и 1:6200, соответственно, для групп до 40 лет, 40-59 лет и 60 и более лет. У больных KTJI разных возрастных групп наблюдали сходную картину частоты обнаружения положительных ответов в ИФА-IgM (Табл. 4).
Установлена достоверная разница титров IgM во все сроки заболевания для групп пациентов до 40 лет и 60 и более лет (р < 0.009). Титры IgM антител в группе до 40 лет на 8-11 дни болезни достоверно выше, чем в двух остальных группах (р < 0.02 и р < 0.003). На 16-30 дни заболевания выявлялись достоверно более низкие титры IgM у пациентов в возрасте 60 и более лет, по сравнению с группами до 40 лет и 40-59 лет (р < 0.001 и р < 0.003).
Таким образом, установлен факт выявления более низких титров специфических IgM антител у пожилых больных.
Динамика специфических IgM антител у мужчин и женщин, больных КГЛ
Для выявления особенностей динамики специфических IgM антител у мужчин и женщин в течение месяца от начала заболевания было обследовано 338 сывороток крови от 254 больных КГЛ, среди которых было 165 мужчин (65,0 %) и 89 женщин (35,0 %).
У мужчин титры IgM антител возрастали от 12,6±2,71og2 (1 :6 200) на 1—7 дни от начала заболевания до 14,1 ± 2,5 log2 (1:17 600) после 16 дня заболевания. Доля серопозитивных сывороток по данным ИФА-IgM с первых дней заболевания до конца месяца возрастала от 44,2 % до 97,3 % (р < 0.0001), причем существенное повышение частоты положительных ответов наблюдали уже на 8-11 сут. (р< 0.00001). Титры IgM, выявляемые в сыворотках крови мужчин, больных КГЛ, в первые дни болезни были
достоверно ниже, чем на 12-15 и 16-30 сут. (р < 0.03) (Табл. 5).
Таблица 5
Динамика титров специфических 1дМ антител у мужчин и женщин, больных КГЛ, в _зависимости от времени обследования_
Дни от начала заболевания Пол больных
мужчины женщины
число проб % положительных проб о +1 О) о о. ь х 1- число проб % положительных проб о -н СП о.
1-7 43 44,2 12,6 ±2,7 1:6200 42 69,0 13,4 ±2,4 1 10800
8-11 89 97,8 13,8 ±2,4 1:14300 45 95,5 13,3 ±2,0 1 10100
12-15 41 92,7 14,1 ±2,3 1:17600 27 100 14,8 ± 1,7 1 28500
16-30 39 97,3 14,1 ±2,5 1:17600 12 100 13,4 ±2,6 1 10800
Всего 212 85,7 13,8 ±2,5 1:14300 126 88,1 13,7 ±2,2 1 13300
У женщин титры ^М антител возрастали от 13,4 ± 2,4 1о§2 (1 : 10 800) на 1-7 дни заболевания до 14,8 ± 1,7 (1 : 28 500) на 12-15 дни, а после 16 дня болезни титры снижались до 13,4 ± 2,6 1оё2 (1 : 10 800). Доля положительных сывороток в ИФА-1§М увеличилась с первых дней заболевания до 8-11 сут. от 69,0% до 95,5% (р < 0.001), оставаясь на высоком уровне до конца месяца. Титры ^М антител у женщин были существенно выше на 12-15 сутки, чем на 1-7 (р < 0.02) и 8-11 (р < 0.002) (Табл. 5).
Динамика титров специфических ^М антител у мужчин и женщин, больных КГЛ, практически не отличалась. С первых дней заболевания в обеих группах наблюдали постепенное возрастание титров ^М до 16 дня. Частота обнаружения специфических 1§М в разные периоды обследования в течении месяца от начала болезни также совпадала (Табл. 5).
Обследование в ИФА сывороток крови больных КГЛ с летальным исходом Среди 254 больных КГЛ, обследованных при выполнении настоящей диссертации, было 5 летальных случаев. В ИФА-1§М и ИФА-^в обследовано 6 проб сывороток крови погибших. У четырех больных заболевание протекало в тяжелой форме с геморрагическим синдромом и у одного - в тяжелой форме без геморрагического синдрома. Двое умерших больных были в возрасте от 40 до 59 лет, двое - старше 60 лет и один больной - в возрасте 37 лет. Смертельные исходы наблюдались на 7-12 дни заболевания. Титры антител у больных с летальным исходом составили на 6 день заболевания 1 : 12 800, на 7 день - 1 : 6400, 1 : 12 800 и 1:51 200, на 8 день - 1 : 6400, одна проба сыворотки, взятая на 5 день заболевания, оказалась отрицательной. В ИФА-
положительный ответ (1 : 200) наблюдали только в одной сыворотке, взятой на 7 день болезни.
Результаты обследования в ИФА сывороток крови погибших совпадали с данными, полученными в ходе исследования динамики ^М и антител, выявляемых у всех обследованных больных КГЛ.
Динамика специфических у больных КГЛ
Суммарные данные по динамике специфических /¿>(7 антител, выявляемых в сыворотках крови больных КГЛ в течение месяца от начала заболевания
На ^О к вирусу ККГЛ были обследованы 332 сыворотки крови 254 больных с подтвержденным диагнозом КГЛ, полученные из Ростовской области (169 проб от 124 больного за 2004-2010 гг.), Астраханской области (98 проб от 77 больных за 20032010 гг.), Калмыкии (38 проб от 28 больных за 2005 г.), Ставропольского края (23 пробы от 22 больных за 2009 г.), Волгоградской области (4 пробы от 3 больных за 2003 г.).
Специфические ^О к вирусу ККГЛ были обнаружены в 172 пробах, взятых с 1 по 30 дни заболевания (52,1 %). Специфические ^О в периоды 1-7, 8-11, 12-15 и 16-30 дни были обнаружены соответственно в 24,4; 47,7; 68,7 и 83,6-92,3% случаев (р< 0.0004). Средние геометрические значения титров в сроки 1-7; 12-15 и 16-18 дни составляли 8,2 ± 1,8 1ой (1 : 290); 9,4 ± 1,9 1о& (1 : 680) и 10,1 ± 2,7 1о§2 (1 : 1100). Титры ДО на 12-15 дни от начала заболевания оказались достоверно выше, чем на 1-7 и 1-8 сут. (р<0.01, р<0.02), достигали максимального уровня 10,1 ±2,71о§2 (1:1100) на 16-18 дни заболевания, значительно отличаясь от титров на 1-7 и 8-11 сут. (р < 0.01, р < 0.02), но не на 12-15 сут. (р<0.44). У некоторых больных в этот период показатели составляли 1 : 128 000 и 1 : 16 000. Высокий уровень ДО - 9,9 ± 2,1 1о& (1 : 960) в период с 19 до 30 дня заболевания был также существенно выше, чем на 1-7 и 8-11 сут. (р < 0.01, р < 0.005) (Табл. 6).
Таблица 6
Результаты обследования в ИФА-1дС сывороток крови больных КГЛ с 1 по 30 дни _заболевания_
Дни заболевания Число обследованных сывороток % положительных проб Средние геометрические значения титров
1од ± а титры
1-7 82 24,4 8,2 ± 1,8 1 :290
8-11 132 47,7 8,6 ±2,1 1 : 390
12-15 69 68,7 9,4 ± 1,9 1 :680
16-18 23 83,6 10,1 ±2,7 1 : 1100
19-30 26 92,3 9,9 ±2,1 1 :960
Всего 332 52,1 9,1 ±2,2 1 :550
Динамика специфических антител в зависимости от клинической формы
болезни
Для выявления особенностей динамики специфических 1§0 антител у больных КГЛ в зависимости от клинической формы болезни в ИФА-^С было обследовано 270 сывороток крови 200 больных КГЛ. Клиническая форма заболевания была установлена лечебными учреждениями по месту госпитализации больного.
Среди 25 сывороток крови, собранных от больных с тяжелым течением болезни на 1-7 дни от начала заболевания, только 5 сывороток оказались серопозитивными (20 %), среднее геометрическое значение титров в положительных пробах 7,9 ± 1,9 1о^ (1 :240). На 8-11 дни показатели титров антител почти не изменились - 8,0 ± 1,5 к^г (1 :260). Доля положительных проб значительно увеличилась до 60,0 % на 12-15 дни заболевания (р < 0.01). На 16-30 дни от начала заболевания титры возросли до 10,4 ± 4,1 1оц2 (1 : 1400), а доля положительных сывороток до 83,3 % (р < 0.002) (Табл. 7).
Таблица 7
Динамика титров специфических 1дв антител у больных КГЛ в зависимости от _клинической формы заболевания и времени обследования_
Дни от начала заболевания Форма течения заболевания
Тяжелая Сред нетяжелая Легкая
число проб % положительных проб 1од ±а о. н X 1- число проб % положительных проб 1од ± о о. н ¡5 число проб % положительных проб 1од ± о а. ух К-
1-7 25 20,0 7,9 ± 1,9 1 :240 42 16,7 7,4±0,5 1 : 170 14 21,4 9,0 ±1,5 1 :510
8-11 23 30,4 8,0 ±1,5 1 :260 68 48,5 8,6±2,2 1 : 390 13 53,8 8,8 ± 1,8 1 : 450
12-15 15 60,0 9,6 ± 3,0 1 : 780 27 70,4 9,6±2,0 1 : 780 8 75,0 8,6 ± 0,8 1 : 390
16-30 6 83,3 10,4±4,1 1 :1400 23 73,9 10,3±2,9 1 :1300 6 100 9,8 ±1,1 1 : 890
Всего 69 37,7 9,0 ± 3,4 1 : 510 160 47,5 9,1 ±2,3 1 : 550 41 46,3 9,1 ±1,4 1 : 550
От больных со среднетяжелым течением болезни было обследовано в ИФА-^в 160 проб сывороток. Среднее геометрическое значение титров у больных со среднетяжелой формой КГЛ на 1-7 дни болезни составило 7,4 ±0,5 1о§2 (1 : 170), доля серопозитивных проб - 16,7%. На 8-11 титры возросли до 8,6 ± 2,2 (1 : 390), доля положительных сывороток до 48,5 % (р< 0.002). На 12-15 и 16-30 дни средние геометрические значения титров составили 9,6±2,0к>й (1 : 780) и 10,3 ± 2,9 (1 : 1300) соответственно. Доля положительных находок антител в сыворотках возросла до 70,4 % на 12-15 сут. (р < 0.0001), оставаясь уровне, близкому к этому значению, до конца месяца. Достоверные
различия в титрах IgG в группе пациентов со среднетяжелым течением болезни наблюдали при рассмотрении отдельных периодов болезни: между 1-7 и 12-15 сут. (р< 0.004), 1-7 и 16-30 сут. (р<0.01), 8-11 и 12-15 сут. (р<0.05), 8-11 и 16-30 сут. (р<0.05) (Табл.7).
От больных с легким течением болезни обследована 41 сыворотка. Средние геометрические значения титров возрастали с первых дней заболевания до конца месяца от 9,0 ±1,5 log2 (1 : 51) до 9,8 ± 1,1 log2 (1 : 890). Доля серопозитивных проб значительно возрастала по сравнению с первыми днями заболевания на 12-15 сут. (от 21,4 % до 75,0 %, р < 0.02) (Табл. 7).
Анализ динамики специфических IgG у больных с разными клиническими формами КГЛ не выявил существенных различий. При тяжелой, среднетяжелой и легкой формах заболевания наблюдали возрастание титров от 7,9 ±1,9 log2 (1 : 240), 7,4 ± 0,5 log2 (1 : 170) и 9,0 ± 1,5 log2 (1 : 510) на 1-7 сут. до 10,4 ± 4,1 log2 (1 : 1400), 10,3 ± 2,9 log2 (1 : 1300) и
9.8 ± 1,1 log2 (1 : 890) на 16-30 сут. соответственно. Достоверные различия в титрах IgG были обнаружены в группе пациентов со среднетяжелым течением болезни при рассмотрении отдельных периодов болезни (Табл. 7).
При тяжелой, среднетяжелой и легкой формах КГЛ наблюдали существенное возрастание доли положительных находок IgG антител в сыворотках крови, взятых на 1215 сут., по сравнению с первыми днями заболевания: от 20,0 до 60,0 % при тяжелой форме (р < 0.01), от 16,7 до 70,4 % при среднетяжелой (р < 0.0001) и от 21,4 до 75,0 % при легкой (р < 0.02) (Табл.7).
Динамика специфических IgG антител в зависимости от возраста больных
При выполнении данного раздела работы в ИФА-IgG были обследованы 334 сыворотки от 251 больного КГЛ, из них 17 больных (6,8 %) были моложе 20 лет, 80 больных (31,9 %) в возрасте от 20 до 39 лет, 107 больных (42,6 %) в возрасте от 40 до 59 лет и 47 больных (18,7 %) в возрасте 60 и более лет.
У больных в возрасте до 40 лет титры IgG антител возрастали от 7,9 ± 1,3 log2 (1 :240) на 1-7 дни от начала заболевания до 9,6 ± 1,9 log2 (1 :780) после 16 дня заболевания. Разница между этими показателями статистически достоверна (р < 0.02). Доля положительных ответов в ИФА-IgG при этом возрастала от 27,6 % до 96,0 % (р < 0.0001) (Табл. 8).
У больных в возрасте от 40 до 59 лет наблюдали возрастание титров IgG от
8.9 ± 3,0 log2 (1 : 480) на 1-7 дни заболевания до 10,0 ± 2,6 log2 (1 : 1000) на 16-30 сут.. Доля положительных находок IgG антител при этом увеличивалась от 22,5 % до 72,2 %
(р< 0.0002) (Табл. 8). Достоверное возрастание титров ^О наблюдали на 12-15 и 16-30 дни, по сравнению с 8-11 сут. (р < 0.01 и р < 0.02).
Таблица 8
Динамика титров специфических 1дв антител у больных КГЛ в разных возрастных группах в зависимости от времени обследования_
Возрастные группы
до 40 лет 40-59 лет 60 и более лет
Дни от начал; заболевания число проб % положительных проб log ±а а. н s к число проб % положительных проб log ±а а. н s >- число проб % положительных проб b ■н Е О. S к
1-7 29 27,6 7,9 ± 1,3 1:240 40 22,5 8,9 ± 3,0 1 : 480 14 28,6 8,1 ±2,8 1 : 270
8-11 55 60,0 8.9 ±2,0 1:480 48 35,4 8,3 ±2,6 1 : 310 27 44,4 9,4 ±1,2 1 : 680
12-15 25 68,0 8,9 ±1,3 1:480 33 66,7 10,0±2,4 1 :1000 8 87,5 10,0±1,2 1 :1000
16-30 25 96,0 9,6 ± 1,9 1:780 18 72,2 10,0±2,6 1 :1000 12 83,3 9,4 ± 2,2 1 : 680
Всего 134 61,0 9,0 ± 1,9 1:510 139 44,0 9,4 ± 2,7 1 :680 61 54,0 9,1 ± 1.9 1 : 550
У больных в возрасте 60 и более лет титры IgG антител увеличивались от 8,1 ± 2,8 log2 (1 :270) на 1-7 дни заболевания до 10,0 ± 1,2 log2 (1 : 1000) на 12-15 дни болезни. После 16 дня болезни титры снизились до 9,1 ± 1,9 log2 (1 : 550). Доля положительных сывороток в ИФА-IgG с первых дней заболевания до конца месяца изменялась от 28,6 % до 83,3 % (р < 0.003) (Табл. 8). Достоверные отличия в титрах IgG наблюдали у пациентов в возрасте 60 и более лет между 8-11 и 12-15 сут. (р < 0.05).
При анализе динамики титров IgG у больных всех возрастных групп наблюдали сходную картину: показатели титров антител увеличивались на 16-30 сут. заболевания по отношению к 1-7 сут. У больных в возрасте до 40 лет, 40-59 лет и 60 и более лет титры IgG возрастали от 7,9 ± 1,3 log2 (1 : 240), 8,9 ± 3,0 log2 (1 : 480) и 8,1 ± 2,8 log2 (1 : 270) на 1-7 сут. до 9,6 ± 1,9 log2 (1 : 780), 10,0 ± 2,6 log2 (1 : 1000) и 9,4 ± 2,2 log2 (1 : 680) на 16-30 сут. соответственно. Достоверных отличий в титрах IgG у больных КГЛ разных возрастных групп не выявлено (Табл. 8).
Установлено значительное изменение доли положительных сывороток крови во всех трех группах больных на 12-15 сут. и 16-30 сут., по сравнению с первыми днями заболевания: от 27,6% до 68,0 и 96,0% у больных в возрасте до 40 лет (р < 0.002 и р< 0.0001), от 22,5% до 66,7 и 72,2% у больных в возрасте 40-59 лет (р < 0.0001 и р < 0.0002), от 28,6 % до 87,5 и 83,3 % у больных в возрасте 60 и более лет (р < 0.002 и р < 0.003) (Табл. 8).
Таким образом, показатели титров IgG антител у больных KTJI не связаны с возрастом, однако у пациентов в возрасте до 40 лет частота обнаружения IgM на 8-11 дни выше, чем у больных более старшего возраста (р < 0.012).
Динамика специфических IgG антител у мужчин и женщин, больных КГЦ Для выявления особенностей динамики специфических IgG антител у мужчин и женщин в ИФА-IgG обследовали 325 сывороток от 254 больных КГЛ: 165 мужчин (65,0 %) и 89 женщин (35,0 %).
У мужчин титры IgG антител увеличивались от 9,4 ±2,4 log2 (1 : 680) на 1-7 дни заболевания до 9,7 ±2,3 log2 (1:830) после 16 дня болезни. Доля положительных сывороток в ИФА-IgG возрастала с первых дней до конца месяца от 15,0 % до 86,5 % (р < 0.0001) (Табл. 9). Было установлено достоверное нарастание титров IgG на 16-30 сут. у мужчин, больных КГЛ, по сравнению с 8-11 сут. (р < 0.01).
Таблица 9
Динамика титров специфических 1дС антител у мужчин и женщин, больных КГЛ, в _зависимости от времени обследования
Дни от начала заболевания Пол больных
мужчины женщины
число проб % положительных проб log±o о. t-к t- число проб % положительных проб log ± ст а. У-
1-7 40 15,0 9,4 ± 2,4 1 :680 40 30,0 8,1 ±1,4 1 : 270
8-11 89 47,2 8,5 ±2,1 1 : 360 40 52,5 8,9 ±2,2 1 :480
12-15 41 70,7 8,9 ±1,7 1 :480 26 65,4 10,3 ±2,1 1 :1300
16-30 37 86,5 9,7 ±2,3 1 : 830 12 83,3 10,9 ±2,3 1 :1300
Всего 207 52,7 9,0 ±2,3 1 : 510 118 50,8 9,5 ± 2,2 1 : 720
У женщин титры ^С антител возрастали от 8,1 ± 1,4 к^ (1 : 270) на 1-7 дни от начала заболевания до 10,9 ±2,3 log2 (1 : 1300) после 16 дня заболевания. Доля серопозитивных сывороток в ИФА-^О при этом изменялась от 30,0 % до 83,3 % (р < 0.0002) (Табл. 9).
Достоверные отличия у женщин наблюдали при сравнении титров в разные периоды болезни: между 1-7 и 12-15 сут. (р< 0.003), 1-7 и 16-30 сут. (р< 0.003), 8-11 и 12-15 сут. (р < 0.04), 8-11 и 16-30 сут. (р < 0.02) (Табл. 9).
Таким образом, динамика титров специфических у женщин и мужчин, больных КГЛ, оказалась сходной, за исключением того, что на 12-15 дни заболевания титры ^О у женщин были существенно выше, чем у мужчин (1 : 1300 и 1 :480 соответственно, р < 0.02) (Табл. 9).
Сравнительное применение ОТ-ПЦР и ИФА для специфической диагностики
КГЛ
В 2006-2009 гг. методом ОТ-ПЦР было обследовано 152 сыворотки крови, взятые у больных с подозрением на КГЛ. При этом диагноз КГЛ был подтвержден в 17,1 % случаев: в 2006 г. у 11 пациентов из 35 (31,4 %), в 2007 г. у 10 из 82 (12,2 %), в 2008 г. у двух из 13 (15,4 %), в 2009 г. у трех из 19 (15,8 %) (Табл. 10).
Таблица 10
Результаты обследования больных с подозрением на КГЛ методом ОТ-ПЦР
Годы Число обследованных Число верифицированных случаев КГЛ % подтверждения диагноза КГЛ
больных сывороток
2006 35 35 11 31,4
2007 82 85 10 11,8
2008 13 13 2 15,4
2009 19 19 3 15,8
Всего 149 152 26 17,1
В те же годы в результате обследования методом МАС-Е1Л8А (ИФА-1дМ) 233 сывороток, собранных от 164 больных той же группы диагноз КГЛ был верифицирован в 44 случаев (26,8 %), в том числе в 2006 г. в 33,3 %, в 2007 г. в 27,4 %, в 2008 г. в 25,0 %, в 2009 г. в 12,5 %.
В опытах ОТ-ПЦР, ИФА-^М и ИФА-^в были обследованы 50 сывороток крови 36 больных с подтвержденным диагнозом КГЛ. Положительные результаты наблюдались при этом соответственно в 26 из 43 (60,5 %), в 40 из 43 (93,0 %), и в 18 из 34 (52,9 %) обследованных сывороток.
В ОТ-ПЦР было обследовано 43 сыворотки от 36 больных КГЛ, взятые на 4-17 дни заболевания. На 4-8 дни болезни положительная реакция наблюдалась в 20 из 21 пробы (95,2%), на 9-12 дни в 6 из 16 (37,5%). Все 6 сывороток, взятые на 13-17 дни были отрицательными.
Параллельно в ОТ-ПЦР и ИФЛ-1§М было обследовано 36 сывороток, взятых у 33 больных с подтвержденным диагнозом КГЛ с 6 по 17 дни заболевания, и 29 сывороток от 28 больных - параллельно в ОТ-ПЦР и ИФА-^в. Из 36 проб, обследованных в ОТ-ПЦР и ИФА-^М РНК вируса КГЛ была обнаружена во всех 14 пробах, взятых на 6-8 дни болезни, и в 6 из 16 проб (37,5 %), взятых на 9-12 дни (но не позднее). При этом 33 (91,7 %) сыворотки оказались позитивными в ИФА-^М, а три (на 6 и 7 день болезни) -отрицательными. 1§0 антитела выявлены в одной из 10 сывороток, полученных на 6-8 дни заболевания, и в 15 из 19 (78,9 %) на 9-16 дни (Табл. 11).
Таблица 11
Результаты обследования сывороток крови больных КГЛ в ОТ-ПЦР, ИФА-1дМ и ИФАЧдв
Дни болезни 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Всего
Число обследованных в ОТ-ПЦР и ИФА-1дМ 3 7 4 5 5 3 3 1 2 1 1 1 36
Положительные в ОТ-ПЦР 3 7 4 1 3 1 1 0 0 0 0 0 20 (55,6 %)
Отрицательные в ОТ-ПЦР 0 0 0 4 2 2 2 1 2 1 1 1 16 (44,4 %)
Положительные в ИФА-1дМ 2 5 4 5 5 3 3 1 2 1 1 1 33 (91,7%)
Отрицательные в ИФА-1дМ 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 (8,3 %)
Число обследованных в ОТ-ПЦР и ИФА-1дС 1 6 3 4 4 3 3 1 2 1 1 29
Положительные в ОТ-ПЦР 1 6 3 1 2 1 1 0 0 0 0 - 15 (51,7%)
Отрицательные в ОТ-ПЦР 0 0 0 3 2 2 2 1 2 1 1 - 14 (48,3 %)
Положительные в ИФА-1дС 0 1 0 4 4 0 2 1 2 1 1 - 16 (55,1 %)
Отрицательные в ИФАЧдв 1 5 3 0 0 3 1 0 0 0 0 - 13 (44,8 %)
Среди 20 ПЦР-позитивных проб, параллельно обследованных в ИФА-^М, три пробы, взятые на 6 и 7 дни болезни, были отрицательными в ИФА-^М, а в 17 позитивных сыворотках титры антител составляли 1 : 400 (в одной сыворотке), 1 : 800 (в двух), 1 : 1600 (в двух), 1 :3200 (в трех), 1 : 6400 (в четырех), 1 : 12 800 (в двух), 1 : 51 200 (в одной), 1 :204 800 (в двух). Среднее геометрическое значение титров ^М в ПЦР-положительных пробах составило 12,5 ^2 (1 : 5800).
В 16 ПЦР-отрицательных пробах титры ^М были сходными: 1 :400 (в одной сыворотке), 1 : 800 (в одной), 1 : 1600 (в двух), 1 :3200 (в трех), 1 :6400 (в одной), 1:12 800 (в трех), 1:51 200 (в трех), 1:102 400 (в двух). Среднее геометрическое значение титров 1§М в ПЦР-отрицательных пробах составило 13,0 1о§2 (1 : 8200).
Среди 15 ПЦР-позитивных сывороток, параллельно обследованных в ИФА-^О, только 4 пробы содержали специфические в низких титрах (1 : 100 - 1 :200), а в 14 ПЦР-отрицательных сыворотках титры были 1 : 100 (в одной пробе), 1 : 200 (в двух), 1 : 400 (в трех), 1 : 800 (в трех), 1 : 3200 (в одной). Среднее геометрическое значение титров ^С в ПЦР-положительных пробах составило 6,9 что соответствовало разведению 1 : 120. При отрицательных результатах ПЦР в 14 сыворотках титры ^О были 1 : 100 (в одной пробе), 1 :200 (в двух), 1 :400 (в четырех), 1 : 800 (в трех), 1 : 3200 (в одной). Среднее геометрическое значение титров ^О в ПЦР-отрицательных пробах составило 8,8 1о§2 (1 :450).
По результатам наших исследований, полученным при обследовании сывороток больных КГЛ из Астраханской области, положительные ответы ОТ-ПЦР на 4-8 дни болезни наблюдались в 95,2 % случаев, на 9-13 дни в 37,5 %, на 13-17 дни отсутствовали. В ИФА-IgM антитела выявлялись с 6 по 16 дни болезни в 93,0 % случаев. Значительный процент IgG позитивных проб (78,9%) был выявлен лишь на 9-16 дни после начала заболевания.
Таким образом, ОТ-ПЦР обладает выраженной эффективностью при диагностике КГЛ до 8 дня болезни, ИФА IgM - с 8 дня и позднее, а ИФА-IgG может рассматриваться как подтверждающий, но не обязательный тест. Представленные результаты подтверждают высокую чувствительность и специфичность ОТ-ПЦР-тест-системы «Ампли-Сентск КГЛ»
000 «ИнтерЛабСервис» и ИФА-тест-систем НИИ вирусологии и их высокую эффективность при комбинированном использовании для верификации КГЛ в диагностических лабораториях.
Определение вероятности заболевания КГЛ в эндемичном регионе среди лиц, покусанных клещами Hyalomma marginatum
Среди 1100 клещей, снятых с людей в Астраханской области после присасывания, было 1076 экземпляров имаго Н. marginatum, 23 Н. niveus и 1 D. marginatus. Нападение и присасывание клещей происходило на дачных и приусадебных участках (46,4 %), при уходе за домашними животными (23,6 %), выполнении сельскохозяйственных работ в поле (14,9 %), во время поездок на рыбалку и отдых (11 %) и других поездок за город (5,1 %). Продолжительность присасывания клещей в момент их удаления с покусанных людей составляла от 1,5-2 ч до 10 дней.
Результаты обследования в ОТ-ПЦР 23 клещей Н. niveus и 1 экземпляра D. marginatus оказались отрицательными. Среди 1076 имаго Н. marginatum было выявлено 10 (0,9%) особей, содержащих РНК вируса ККГЛ: в 2007 г. - 6 (2,5 %), в 2008 г. - 2 (1 %), в 2009 г. -
1 (0,4 %) и в 2010 г. - 1 (0,3 %). Результаты обследования 67 экземпляров Н. marginatum в 2006 г. оказались негативными. Зараженность клещей этого вида, снятых в 2006-2010 гг. с покусанных людей, составила 0,9 %. В 2006 г. в области было зарегистрировано 16 лабораторно подтвержденных случаев КГЛ, в 2007 г. - 20, в 2008 г. - 5, в 2009 г. - 6, в 2010 г.-7.
Из 10 человек, покусанных клещами, которые по данным ОТ-ПЦР содержали РНК вируса ККГЛ, диагноз КГЛ был подтвержден у трех при обследовании сывороток крови в ОТ-ПЦР и ИФА.
Больной X., 56 лет, 10 июня 2007 г. в течение дня находился на дачном участке. Вечером возвратился в Астрахань, где при осмотре у него обнаружили присосавшегося
клеща. 13 июня почувствовал недомогание. Появилась ломота в теле, боли в животе, температура поднялась до 38,9° С. Госпитализирован в областную инфекционную клиническую больницу (ОИКБ) с предварительным диагнозом «вирусная инфекция неясной этиологии» (ВИНЭ). В лаборатории особо опасных инфекций ЦГиЭ клещ, снятый 10 июня, был идентифицирован как самец Н. marginatum. Продолжительность его присасывания составляла от 1,5 до 2 ч. В клеще методом ОТ-ПЦР была обнаружена высокая концентрация РНК вируса KKTJI. Результат обследования в ОТ-ПЦР сыворотки крови, взятой у больного 27 июня, оказался отрицательным при наличии специфических IgM в титре > 1 : 800 и IgG в титре 1 : 400. Окончательный диагноз: КГЛ средней тяжести без геморрагического синдрома. Инкубационный период заболевания - 4 дня.
Больной В., 53 года, был укушен клещом (самец Н. marginatum) 21 июня 2008 г. Заболел 24 июня, когда температура тела поднялась до 39,2 0 С. Появилось недомогание, слабость, головная боль, боли в икроножных мышцах. В суспензии клеща, снятого 22 июня, методом ОТ-ПЦР обнаружена РНК вируса ККГЛ, как и в сыворотке крови больного, взятой 23 июня. Сыворотка крови, взятая 30 июня, по данным ИФА, содержала специфические IgM к вирусу ККГЛ в титре 1 : 3200. Окончательный диагноз: КГЛ с геморрагическим синдромом без полостных кровотечений. В данном случае присосавшийся инфицированный клещ находился на теле пациента около 1 сут., инкубационный период болезни составил 4 дня.
Больной А., 39 лет, 18 июня 2010 г. работал в поле. Вечером того же дня при осмотре в подлопаточной области у него был обнаружен присосавшийся клещ (самка Н. marginatum). 24 июня температура тела поднялась до 40 0 С, появился жидкий стул (5-6 раз в сутки) и рвота. В течении 2 дней с высокой температурой находился дома. 25 июня был госпитализирован в ЦРБ, откуда 26 июня переведен в ОИКБ с температурой 390 С, головной болью, слабостью. Количество тромбоцитов: 25 июня — 83 000, 26 июня -61 000, 28 июня - 118 000. В суспензии клеща, снятого 18 июня, как и в сыворотке крови больного, взятой 28 июня (на 5-й день заболевания), методом ОТ-ПЦР обнаружена специфическая РНК вируса ККГЛ. Сыворотка крови, взятая 1 июля, содержала специфические IgM в титре 1 : 204 800 при отсутствии антител класса G. Инкубационный период болезни составил 7 дней. Окончательный диагноз: КГЛ без геморрагического синдрома, среднетяжелая форма.
Двое больных после укусов клещей, содержащих РНК вируса ККГЛ, были госпитализированы с острыми лихорадочными заболеваниями, но обследование их сывороток крови в ОТ-ПЦР, ИФА-IgM и ИФА-IgG не проводилось, поэтому этиологическая связь этих случаев с вирусом ККГЛ не установлена.
Больной С., 71 год, 18 мая 2008 г. был на дачном участке. 21 мая почувствовал сильное недомогание. Сутки пролежал дома с высокой температурой. 22 мая с предварительным диагнозом ВИНЭ госпитализирован в ОИКБ, где в области подмышки у него обнаружен присосавшийся клещ (самец Н. marginatum), который находился на теле в течение 4 дней. Результат обследования клеща в ОТ-ПЦР на РНК вируса ККГЛ оказался положительным.
Больная К., 70 лет, вечером 10 июня 2009 г. после однодневного пребывания на дачном участке обнаружила и сняла с себя клеща (самец Н. marginatum). На 3-й сутки после укуса у нее поднялась температура, появилось общее недомогание, боли в горле и мышцах. 15 июня госпитализирована в ОИКБ с диагнозом ВИНЭ. По данным ОТ-ПЦР, снятый клещ содержал высокую концентрацию РНК вируса ККГЛ.
Таким образом, в 2006-2010 гг. из 1076 лиц, покусанных клещами Н. marginatum, заболели 3 или 5 человек. Учитывая относительно низкий процент зараженности
H. marginatum вирусом ККГЛ (0,9 %), расчетные показатели инфицирования покусанных лиц, выражающиеся в развитии клинически выраженных случаев КГЛ, составили 0,30,4 %.
ВЫВОДЫ
I. Использованные при выполнении диссертационной работы экспериментальные ИФА-тест-системы производства НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского для выявления IgM и IgG антител к вирусу ККГЛ оказались высоко чувствительными и специфичными, и обладают значительными преимуществами по сравнению с аналогичными тест-системами производства ЗАО «Вектор-Бест».
2. Частота выявления IgM-позитивных сывороток с 1 по 16 день болезни возрастает от 40,0 до 100 %. Средние геометрические значения титров IgM при этом увеличиваются от 1 : 8700 до 1 : 22 700, сохраняясь на высоком уровне до конца месяца (срок наблюдения).
3. Частота обнаружения специфических IgG с 1 по 16 день болезни возрастает от 24,4 до 92,3 %, а средние геометрические значения титров IgG от 1 : 290 до 1 : 1100. Средний показатель титров 1 : 960 сохраняется до конца месяца.
4. При сравнении титров IgM у больных КГЛ во все анализируемые сроки обследования установлена достоверная тенденция выявления более высоких титров антител при легкой форме заболевания, по сравнению со среднетяжелой и тяжелой, а также более высоких титров при среднетяжелой форме по сравнению с тяжелой.
5. Титры IgM антител у больных КГЛ в возрастной группе до 40 лет значительно выше, чем в группе 60 и более лет.
6. Разница в титрах и частоте обнаружения специфических IgG антител у пациентов с
разными клиническими формами, а также в разных возрастных группах больных КГЛ статистически не достоверна. Динамика IgM и IgG антител у больных мужчин и женщин также не имеет значительных отличий.
7. На основании собственных данных подтверждена целесообразность использования принятой в настоящее время схемы специфической диагностики КГЛ, включающей применение ОТ-ПЦР с 1 по 8 день заболевания, ИФА-IgM с 8 дня и позднее, а ИФА-IgG с 9-16 дня заболевания.
8. Установлено, что частота регистрации клинически выраженных, лабораторно верифицированных случаев КГЛ среди лиц, покусанных в эндемичном регионе клещами
H. marginatum, составляет 0,3-0,4 %.
Список публикаций по теме диссертации
I. Путилина Н.Г., Мальков П.М., Куликова Л.Н., Азарян А.Р., Трусова И.Н., Гришанова А.П., Ковтунов А.И., Шендо Г.Л., Джаркенов А.Ф., Самарина О.Ю., Аршба Т.Е., Бутенко A.M. Детекция РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки в клещах Hyalomma marginatum, снятых с покусанных людей. // Вопросы вирусологии. -2012 -№3 - с. 37—40.
2. Путилина Н.Г., Азарян А.Р., Трусова И.Н., Мальков П.М., Гришанова А.П., Ковтунов А.И., Шендо Г.Л., Джаркенов А.Ф., Аршба Т.Е., Ларичев В.Ф., Бутенко A.M. Применение ОТ-ПЦР и иммуноферментного анализа для специфической диагностики крымской геморрагической лихорадки. // Вопросы вирусологии. - 2011. -№4. - с. 34-38
3. Трусова H.H., Бутенко A.M., Ларичев В.Ф., Щелканов М.Ю., Азарян А.Р., Гришанова А.П., Иващенко Е.И., Аршба Т.Е., Говорухина М.В., Асмолова Н.Ю., Сиденко И.С., Василенко Н.Ф., Русакова Н.В., Шишкина Л.В., Бушкиева Б.Ц. Динамика специфических IgM и IgG антител у больных Крымской геморрагической лихорадкой.//Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2013. - №2. - с. 17-24.
4. Варфоломеева Н.Г., Трусова И.Н., Василенко Н.Ф., Ларичев В.Ф., Романенко E.H., Бутенко A.M. Сравнительная оценка чувствительности и специфичности иммуноферментных тест-систем при выявлении IgM и IgG к вирусу Крымской-Конго геморрагической лихорадки.//Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государст-участников СНГ: Материалы X Межгосударственной науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010-с. 169.
БЛАГОДАРНОСТИ
Выражаю глубокую благодарность А. М. Бутенко за научное руководство, внимание и советы при выполнении и написании диссертации;
сотрудникам лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии к.м.н., В. Ф. Ларичеву и к.б.н., Н. В. Хуторецкой за оказанную мне неоценимую помощь и поддержку при выполнении диссертационной работы;
лаборанту Н. В. Титовой за квалифицированную помощь при проведении исследований;
д.б.н, кандидату физико-математических наук М. Ю. Щелканову за ценные консультации и помощь при выполнении статистического анализа полученных данных;
руководителям и специалистам-вирусологам региональных учреждений здравоохранения: А. И. Ковтунову, X. М. Галимзянову, А. Ф. Джаркенову, А. Р. Азарян, А. П. Гришановой, Г. Л. Шендо, Т. Е. Аршба (Астрахань), Г. В. Айдинову, М. В. Говорухиной, Т. В. Мазрухо (Ростов-на-Дону), А. Н. Куличенко, Н. Ф. Василенко (Ставрополь), А. Н. Жукову, Н. В. Русаковой, Л. В. Шишкиной, Н. М. Чемидовой (Волгоград) за активное сотрудничество при проведении исследований.
Автор выражает глубокую благодарность директору института академику РАМН Д. К. Львову и администрацию НИИ вирусологии за предоставленную возможность прохождения аспирантуры и выполнения диссертационной работы в институте.
Заказ № 35-Р/08/2013 Подписано в печать 22.08.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1.6
"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 1 I }, www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru
Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трусова, Ирина Николаевна, Москва
Министерство здравоохранения Российской Федерации
ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д. И. Ивановского»
На правах рукописи
04201362490
Трусова Ирина Николаевна
СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КРЫМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ
ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
03.02.02. - вирусология
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель: д. б. н., профессор А. М. Бутенко
Москва, 2013
Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................................6
ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................8
Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................12
1.1. История изучения Крымской геморрагической лихорадки...........................12
1.2. Классификация и таксономия вируса ККГЛ....................................................15
ч
1.3. Морфология, молекулярная организация и репликация вируса ККГЛ.........17
1.3.1. Характеристика и физико-химические свойства вирионов....................17
1.3.2. Стадии репродукции...................................................................................18
1.3.3. Структура и организация генома...............................................................18
1.4. Эпидемиология КГЛ...........................................................................................19
1.4.1. Распространение вируса ККГЛ..................................................................19
1.4.2. Заболеваемость КГЛ в мире.......................................................................20
і
1.4.3. Заболеваемость КГЛ в Российской Федерации........................................23
1.4.4. Сезонность заболеваемости КГЛ...............................................................24
1.4.5. Структура заболеваемости КГЛ.................................................................25
^ 1.4.6. Переносчики и теплокровные хозяева вируса ККГЛ...............................26
1.4.7. Пути передачи КГЛ.....................................................................................28
1.5. Клиническая картина КГЛ.................................................................................29
1.6. Патогенез и патологическая анатомия КГЛ.....................................................31
1.7. Лечение................................................................................................................32
1.8. Профилактика.....................................................................................................33
1.8.1. Неспецифическая профилактика...............................................................33
1.8.2. Специфическая профилактика...................................................................34
1.9. Лабораторная диагностика КГЛ........................................................................35
1.9.1. Вирусологическая диагностика.................................................................35
1.9.2. Молекулярная диагностика........................................................................37
1.9.3. Серологическая диагностика.....................................................................38
1.9.3.1 .Реакция нейтрализации........................................................................38
1.9.3.2. Реакция связывания комплемента......................................................39
1.9.3.3. Реакция диффузионной преципитации в агаре.................................40
1.9.3.4. Метод флуоресцирующих антител.....................................................42
1.9.3.5. Реакции гемагглютинации и торможения гемагглютинации...........42
1.9.3.6. Реакции непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации...............................................................................................43
1.9.3.7. Иммуноферментный анализ................................................................44
1.10. Дифференциальная диагностика....................................................................45
Заключение по литературному обзору........................................................................47
Часть И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................49
Глава 1. Материалы и методы.......................................................................................49
1.1. Вирусы.................................................................................................................49
1.2. Сыворотки крови больных КГЛ, КЭ, ЛЗН.......................................................49
1.3. Иксодовые клещи...............................................................................................51
1.4. Сахарозо-ацетоновые антигены........................................................................52
1.5. Получение иммунных асцитных жидкостей мышей......................................53
1.6. Выделение иммуноглобулинов класса G методом аффинной хроматографии на протеин-А-сефарозе..................................................................53
1.7. Получение пероксидазных конъюгатов иммуноглобулинов перйодатым методом.......................................................................................................................54
1.8. Иммуноферментный анализ..............................................................................54
1.8.1. ИФА для выявления вирусных антигенов................................................54
1.8.2. ИФА-IgM......................................................................................................55
1.8.3. ИФА-IgG.......................................................................................................55
1.9. Реакция связывания комплемента.....................................................................56
1.10. Метод ОТ-ПЦР..................................................................................................56
1.11. Статистические методы...................................................................................57
Глава 2. Характеристика ИФА тест-систем для выявления IgM и IgG антител к вирусу ККГЛ, определение эффективности их использования в диагностических целях................................................................................................................................59
2.1. Получение и характеристика антигенов, глобулинов и конъюгатов вируса
ККГЛ...........................................................................................................................59
2.2. Определение эффективности ИФА тест-систем для выявления антител
классов М и G к вирусу ККГЛ..................................................................................63
Глава 3. Сравнительная оценка чувствительности и специфичности ИФА тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» и НИИ вирусологии
им. Д. И. Ивановского при выявлении IgM и IgG к вирусу ККГЛ...........................66
Глава 4. Динамика специфических IgM у больных КГЛ...........................................69
4.1. Суммарные данные по динамике специфических IgM антител, выявляемых в сыворотках крови больных КГЛ в течение месяца от начала заболевания......69
4.2. Динамика специфических IgM антител в зависимости от клинической формы болезни...........................................................................................................70
4.3. Динамика специфических IgM антител в зависимости от возраста больных.......................................................................................................................76
4.4. Динамика специфических IgM антител у мужчин и женщин, больных
КГЛ..............................................................................................................................81
4.5. Обследование в ИФА сывороток крови больных КГЛ с летальным исходом.......................................................................................................................85
Глава 5. Динамика специфических-IgG.у больных КГЛ............................................86
5.1. Суммарные данные по динамике специфических IgG антител, выявляемых
в сыворотках крови больных КГЛ в течение месяца от начала заболевания......86
5.2. Динамика специфических IgG антител в зависимости от клинической формы болезни...........................................................................................................87
5.3. Динамика специфических IgG антител в зависимости от возраста больных.......................................................................................................................92
5.4. Динамика специфических IgG антител у мужчин и женщин, больных
KDI..............................................................................................................................97
Глава 6. Сравнительное применение ОТ-ПЦР и ИФА для специфической
диагностики КГЛ.........................................................................................................101
Глава 7. Определение вероятности заболевания КГЛ в эндемичном регионе среди лиц, покусанных клещами Hyalomma marginatum...................................................106
ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................................................109
ВЫВОДЫ......................................................................................................................117
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................119
ч ч
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВС - вирус везикулярного стоматита
ВИНЭ - вирусная инфекция неясной этиологии
ИАЖ - иммунная асцитная жидкость
ИФА (ELISA) - иммуноферментный анализ
КГЛ - Крымская геморрагическая лихорадка
ККГЛ - (вирус) Крымской-Конго геморрагической лихорадки
кРНК - РНК, комплементарная мРНК вируса
КРС - крупный рогатый скот
КС-антитела - комплементсвязывающие антитела
мРНК - матричная РНК
МФА - метод флуоресцирующих антител
н.б.м. - новорожденные белые мыши
н.о. - нуклеотидные основания
ОИКБ - областная инфекционная клиническая больница
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
РГА - реакция гемагглютинации
РДПА - реакция диффузионной преципитации в агаре
РН - реакция нейтрализации
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации
РНК - рибонуклеиновая кислота
РСК - реакция связывания комплемента
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
РЭС - ретикулоэндотелиальная система
СОЭ - скорость оседания эритроцитов
ПЭС - клетки почки эмбриона свиньи
ЦНС - центральная нервная система
HeLa - клетки карциномы шейки матки человека
ic - интрацеребральное заражение
IgG, IgM - иммуноглобулины класса G и М
NP - нуклеопротеин
SW-13 — клетки аденокарциномы надпочечника человека Vero Е6 - клетки почки африканской зеленой мартышки
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) - это природно-очаговая острая инфекция человека, протекающая с лихорадочной реакцией, общей интоксикацией и, часто, с геморрагическим синдромом, выраженным в виде кожных кровоизлияний и разнообразных полостных кровотечений. Вирус ККГЛ передается, главным образом, при укусе иксодовых клещей. Возбудитель относится к роду АЫгоуггия семейства Випуаутс1ае. Ареал этой инфекции охватывает многие эндемичные регионы Африки, Азии и Европы. В России заболеваемость КГЛ зарегистрирована в Астраханской, Ростовской, Волгоградской областях, Ставропольском и Краснодарском краях, Калмыкии, Дагестане, Ингушетии и Карачаево-Черкесии [4].
Для специфической диагностики КГЛ в эндемичных регионах России и зарубежных стран в настоящее время широко используются методы иммуноферментного анализа и ОТ-ПЦР. Однако, сведения по применению ИФА-^М, ИФА-^в и ОТ-ПЦР, опубликованные в отечественных и иностранных изданиях, весьма ограничены .и основаны на анализе обследования незначительного числа сывороток больных. При большом объеме подобных исследований, выполняемых в диагностических лабораториях Астрахани, Волгограда, Ростова-на-Дону, Ставрополя и Элисты, полученные результаты недостаточно проанализированы [1,2, 24, 36, 51, 63, 67]. Не представлены данные по сравнению эффективности применения методов ИФА-^М, ИФА-^в и ОТ-ПЦР и динамике ^М и в разные периоды заболевания у больных с различными формами КГЛ, в разных возрастных группах, у мужчин и женщин.
Таким образом, актуальность темы диссертации определяется недостаточным качеством доступной информации по разделам диагностики, имеющим важное значение для быстроты, специфичности и точности выполнения анализов, лечения и, возможно, прогнозирования исходов заболевания КГЛ.
Цели и задачи исследования
Цели исследования:
Определение динамики І^М и І^в антител в разные периоды заболевания у больных КГЛ с разными клиническими формами, в разных возрастных группах, у мужчин и женщин, и сравнительное определение эффективности использования тест-систем ИФА-1§М, ИФА-^О и ОТ-ПЦР для специфической диагностики КГЛ.
Задачи исследования:
• характеристика чувствительности и специфичности использованных в работе экспериментальных тест-систем производства НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского для обнаружения специфических 1§М и антител у больных КГЛ;
• обследование сывороток крови больных КГЛ из эндемичных регионов России методами ИФА-^М, ИФА-^С и ОТ-ПЦР;
• изучение динамики ^М и антител у больных КГЛ в зависимости от тяжести заболевания, возраста и пола с использованием статистического анализа данных;
• определение вероятности заболевания КГЛ в эндемичном регионе среди лиц, покусанных клещами' Н. та^ігіайті;
• определение тактики специфической диагностики КГЛ.
Научная новизна исследований
Впервые по результатам обследования методами ИФА репрезентативного числа сывороток крови больных КГЛ (338 сывороток крови от 254 больных из Астраханской, Ростовской, Волгоградской областей, Ставропольского края, Калмыкии) с применением статистической обработки данных проведен анализ динамики обнаружения и титров специфических 1§М и 1§0 антител в разные периоды заболевания, при. .разных, клинических формах, в различных возрастных группах, у мужчин и женщин.
Установлена тенденция выявления более высоких титров антител при
легком течении заболевания, по сравнению со среднетяжелом и тяжелом, а также более высоких титров при среднетяжелой форме, по сравнению с тяжелой (вероятность альтернативной гипотезы р < 0.02).
Титры IgM антител у больных КГЛ в возрастной группе до 40 лет значительно выше, чем в группе 60 и более лет (р < 0.009).
Впервые установлено, что частота регистрации клинически выраженных, лабораторно верифицированных случаев КГЛ среди лиц, покусанных в эндемичном регионе клещами Н. marginatum, составляет 0,3-0,4 %.
Практическая значимость
На основании полученных данных подтверждена целесообразность использования принятой в настоящее время схемы специфической диагностики КГЛ, включающей применение ОТ-ПЦР (в первые 8 дней болезни), а затем ИФА-IgM (с 8-го дня и позднее). Метод ИФА-IgG может использоваться как подтверждающий, но необязательный тест.
Положения, выносимые на защиту
1. По результатам обследования методами ИФА репрезентативного числа сывороток крови больных КГЛ с применением статистической обработки данных впервые проведен анализ динамики обнаружения и титров специфических IgM и IgG антител в разные периоды заболевания, при разных клинических формах, в различных возрастных группах, у мужчин и женщин.
2. Частота выявления IgM-позитивных сывороток с 1 по 16 день болезни возрастает от 40,0 до 100 %. Средние геометрические значения титров IgM при этом увеличиваются от 1 : 8700 до 1 : 22 700, сохраняясь на высоком уровне до конца месяца (срок наблюдения).
3. Частота обнаружения специфических IgG с 1 по 16 день болезни возрастает от 24,4 до 92,3 %, а средние геометрические значения титров IgG от 1 : 290 до 1 : 1100. Средний показатель титров 1 : 960 сохраняется до конца месяца.
4. Установлена статистически достоверная тенденция выявления более
высоких титров IgM антител при легкой форме заболевания, по сравнению со среднетяжелой и тяжелой, а также более высоких титров при среднетяжелой форме по сравнению с тяжелой.
5. Титры IgM антител у больных КГЛ в возрастной группе до 40 лет значительно выше, чем в группе 60 и более лет.
6. Подтверждена целесообразность использования принятой в настоящее время схемы специфической диагностики КГЛ, включающей применение ОТ-ПЦР с 1 по 8 день заболевания, метод ИФА-IgM - с 8 дня и позднее, ИФА-IgG с 9-16 дня заболевания.
7. Впервые установлено, что частота регистрации клинически выраженных, лабораторно верифицированных случаев КГЛ среди лиц, покусанных в эндемичном регионе клещами Н. marginatum, составляет 0,3-0,4 %.
Апробация результатов исследования и публикации
' | > I ' ' ч /' ' \ Vw*
Результаты работы были представлены на X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 2010 г.).
Основные положения работы заслушаны и обсуждены на заседании апробационного совета ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава России 25 апреля 2013 г. (Протокол № 22).
По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе в изданиях, рекомендуемых ВАК - 3.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 7 глав собственных исследований, обсуждение, выводы. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 34 рисунками. Список литературы содержит 161 источник, из которых 74 отечественных и 87 зарубежных.
Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. История изучения Крымской геморрагической лихорадки
Сведения о заболеваниях, весьма похожих на Крымскую геморрагическую лихорадку (КГЛ), совпадающие с современными данными об этой инфекции, приведены в трудах таджикского врача XII века Абу-Ибрахим Джурджани. В его сочинении «Сокровище Хорезмшаха» приводится описание лихорадочного заболевания, сопровождавшегося обильными носовыми, желудочно-кишечными, легочными кровотечениями, кровоточивостью десен и связанного с укусом членистоногого, паразитирующего на черном грифе [72]. На существование этой инфекции в Средней Азии в отдаленные времена указывают 3. В. Семятковская, Н. К. Сидтдыкова [54], А. Мелиев [42] и др. Среди коренного населения Южного Таджикистана КГЛ известна как редко встречающее опасное заболевание под названием «хуни-бини» или «хунгирифта» [31, 72].
По данным И. Р. Дробинского [19], случаи заболеваний, похожие на КГЛ регистрировались в румынских госпиталях в Симферополе и Богдановке с апреля по июль 1942 г. во время, оккупации Крыма. В 1944 г. П. В. Сиповский [55] в журнале «Клиническая медицина» опубликовал статью о 18 случаях своеобразного желудочного кровотечения, наблюдавшихся в Сталинабаде (Душанбе). Эта болезнь была названа острым инфекционным капиллярным токсикозом, но, как стало очевидно позднее, по клинико-эпидемиологическим характеристикам она полностью соответствовала КГЛ.
В качес
-
Трусова, Ирина Николаевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2013
-
ВАК 03.02.02
- Разработка тест-системы для выявления вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции
- Крымская-Конго геморрагическая лихорадка: этиология, эпидемиология и лабораторная диагностика
- Теоретические и прикладные аспекты конструирования магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем для экспресс-диагностики вирусного гепатита A, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей
- Диагностика буньявирусных инфекций и идентификация буньявирусов в Таджикистане (1991-1995 гг. )
- Исследование генетических особенностей вируса крымской-конго геморрагической лихорадки, циркулирующего на Юге России
