Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селекция популяции злокачественных клеток по признаку "частота клеток с мостами"

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Селекция популяции злокачественных клеток по признаку "частота клеток с мостами""

РГ6 од

На правах рукописи

ПРО ШИН

Сергей Николаевич

УДК 575:616-006:612.086.3

СЕЛЕКЦИЯ ПОПУЛЯЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ПО ПРИЗНАКУ «ЧАСТОТА КЛЕТОК С МОСТАМИ»

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

СЛ И КТ-ПКТЕРБУ1>Г—ПУШКИН 1996

Работа выполнена в отделе генетики и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных, в лаборатории генетики клеточных популяций Института цитологии и в Научно-исследовательском центре клинической радиологин Военно-медицинской Академии.

Научные руководители — доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ А. Ф. Яковлев; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник В. Ю. Кравцов.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор В. Е. Комар; доктор биологических наук, профессор А. Ф. Смирнов.

Ведущее учреждение — НИИ Онкологии им. проф. Н. Н. Петрова МЗ РФ.

Защита состоится

1996 г. в часов на за-

седании диссертационного совета Д.020.07.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, С.-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55-А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных.

Автореферат разослан ССгС^-Л. 1990 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор сельскохозяйственных наук,

профессор в И. Волгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение, взаимосвязи процессов отбора и наследственной изменчивости в популяциях соматических . клеток . животных представляет существенный интерес для разработки генетических основ селекции. Искусственный отбор по любому признаку, на ооне изменяющихся условии жизнедеятельности приводит к генотипическим и Фенотапическим изменениям. В результате неизбежно нарушается ранее сложившееся взаимодействие генотип-среда, что отражается на спонтанном уровне наследственной изменчивости в популяции. Вместе с тем, уровень наследственной (в первую очередь кариотипической) изменчивости в популяциях соматических клеток in vivo и in vitro можно эффективно регулировать с помощью искусственного отбора.

К настоящему времени подавляющее большинство исследований частот хромосомных аберрация в клеточных популяциях выполняются на метаФазных клетках. Вместе с тем. Фенотип ядер интерФазных клеток также может отражать цитогенетическия го-меостаз клеточных популяций ^Монахова 1990, Qumsigeh, ispg), а определение частот встречаемости клеток с аномальными ядрами mowt использоваться как экспресс-тест частот хромосомных аберраций в популяциях клеток в ходе их селекции на стабильность кариотипа.

Хромосомные аберрации дщцентричес.кого типа могут влиять и изменять морфологический Фенотип интерФазных ядер, приводя к Формированию клеток с мостами (Алов, 1972). Поскольку в злокачественных опухолях наблюдаются повышенные спонтанные частота хромосомных аберрации, в том числе и дицентрического

типа (Dljkhuizen et al., 1993; Mondelo et. al., 19°,ЗЭ , ТО ДЛЯ

получения достоверных значении частот клеток с мостами в клонах злокачественных клеток требуется незначительное количество клеточного материала. Не прибегая к хромосомному анализу, по Фенотипу ядра интерФэзной клетки (мостзм) можно определять частоты хромосомных аберраций в клеточных популяциях in vivo, по этим причинам представляется возможным и перспективным клональныи анализ и искусственный отбор по призер

наку "частота клеток о мостами" в клеточных популяциях перевивных опухолей. é .

Шлью_и_задачащ_настоящей_даботы являлось исследование характера наследственной обусловленности и особенностей фо-нотипического проявления in vivo признака "частота клеток с мостами" в' клеточных популяциях перевивной органотропной рабдомиосэркомы РА-23 крыс. Особое внимание предполагалось уделить вопросу о возможности повышения и снижения с помощью искусственного отбора по этому признаку степени спонтанной нестабильности кариотипа злокачественных клеток. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Изучить нзследственЕую и Фвнотипическую гетерогенность клонов перевивном рао'домиосаркомы РА-23 крыс по признаку "частота клеток с мостами".

2; Провести искусственный отбор клонов клеток перевивной рабдомиосаркомы РА-23 крыс с повышенными и с пониженными частотами встречаемости клеток с мостами. Использовать показатели динамики отбора для вычисления коэффициентов реализованной наследуемости ь2 признака "частота клеток с мостами" в исследованных клеточных популяциях.

3. Провести сравнительный анализ показателей кариотипи-ческой изменчивости в клеточных популяциях, отселектирован-ных на повышенную и пониженную частоты клеток с мостами.

4. Определить_ степень злокачественности по показателю "метастатический потенциал" популяций - клеток с повышенной и с пониженной в результате отбора частотами клеток мостами.

■ 5. Определить взаимосвязь между показателями "частота клеток с мостами"' и "частота клеток с полумостами". Исследовать возможные механизмы образования клеток с полумостами.

Научная_новизна:

Показана степень Фёаотипическоя и наследственной гетерогенности клонов перевивных опухолевых клеток in vivo по признаку "частота клеток с мостами".

Впервые разработана и апробирована методику селещии в популяциях соматических клеток на повышение и снижение частоты встречаемости клеток с мостами, получены популяции клеток, представляющие уникальную модель для исследований механизмов Формования стабильности генома клеток. В процессе

такой еелейш' обнаружено градуальное изменение признака

"частота клеток с мостами", свидетельствующее о его полигенной обусловленности.

Впервые показано, что искусственный отбор на повышение спонтанной частоты клеток с мостами приводит к репродуктивной ГИбеЛИ популяции селектируемых КЛОТОК".' -----Впервые выявлена положительная корреляция между оОр-ззо-взнкем мостов в зла- и телоч>азе, Формированием клеток с мостами и возникновением клеток с полумостами в популяциях опухолевых клеток.

Практическая _ 1^ннд<эть_рдботы. Разработанный и апробированный способ селекции клеточных популяций перевивных опухолей на стабильность генома «отбор на. частоту клеток с мостами:» рекомендуется использовать в биотохнологпчеаск производстве с целью генотипической и Фвнотипической стабилизации клеточных линии-продуцентов. Рекомендуется использование показателя "частота клеток с мостами" в качестве количественного критерия кариотипическои гетерогенности и мутабильности опухолевых клеток в диагностике и терапии онкологических заболевании. Определение аномалий интерфазных ядер в виде полумостов рекомендуется использовать для выявления повышенных частот хромосомных аберрация в меточных популяциях.

Апробация рэботц. Материалы диссерташонноя работы доложены на Международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных" 1С.-Петербург, Пушкин, 1994>, Второй международной научно-практической конференции "Проблемы охраны здоровья и социальные аспекты освоения газовых и неФтяпых местороятений в арктических регионах (Надым, 1995).

Публикации.;, По результатам исследовании опубликовано 4 печатных работы.

Структура_и_обг«м_диссертации^ Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, включающий 143 публикации отечественных и зарубежных авторов. Объем диссертации составляет 138 страниц машинописного текста. Представлено 5 таблиц и 40 рис.ункоз.

Сокращения: ЧКМс - частота клеток с мостами, ЧМК - частота мостов на клетку. ЧКП - частота клеток с полумостами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали белых беспородаых крыс разводки питомника РАМН "Рзпполово". Работу проводили на самках весом 180-200 г. Перевивная рабдомиосаркома крыс РА-2 отселектирована в лаборатории генетики клеточных популяций Инстагута цитологии РАН из высокодиФФеренцированнон рабдоми-осаркомы крыс, индуцированной 20-метилхолантреном, путем массового отбора клеток на тропность к легочной ткани, й процессе пассирования опухоль утратила характерные признаки миогенной домяренщровки и приобрела высокий уровень эффи-нитета'к легочной ткани (Степаньян,. Бахтин, 1980). В работе использованы субштамм перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс: РА-23, отселектированный из РА-2 на высоким метастатический потенциал (Каминская, Бахтин, 1989). Клетки субштамма РА-23 обладают тропностью к легочной ткани: после ь^в введения суспензии клеток экспериментальные метастазы образуются только в легких привитых животных. Свыше 95% экспериментальных метастазов рабдомиосаркомы РА-2 и полученных та неё субштаммов имеют уницеллюлярное происхождение (Степаньян, Бахтин, 1080; Каминская, 1986), т.е. являются клонами.

Частоту клеток с мостами <ЧКМс> в клеточных популяциях исследуемых опухолей определяли в мазках-отпечатках, для чего' отпрепарованные клоны рабдомиосаркомы РА-23 крыс разевали пополам скальпелем и получали от них отпечатки на предметных стеклах, смоченных средой 199. Мазки-отпечатки Фиксировали в 96% этиловом или метиловом спирте, высушивали и окрашивали Флуорохромом Хёхст-33258. В каждом мазке-отпечатке анализировали то 600 - 1000 целых клеток, Клепси с признаками дегенерации не учитывались. Частоту клеток с мостами выражали в процентах. Частоты патологических митозов определяли на препаратах, приготовленных таким же способом.

Отбор клонов на повышение и снижение частоты встречаемости в них клеток с мостами осуществлялся следующим обра-у зом. Отпрепэрованные клоны разрезали надвое, одну половину

каждого клона использовали для приготовления мазка, другую полову клона помещали во флзкон со средой 199. В мззкэх от каждого клона просчитывали по 200-500 целых клеток. Как правило, продолжительность определения частоты клеток с мостами для выбор >:и из 40-53 клонов не превышала 6 ч. После определения ЧКМс отбирали " по 3-4 клона с минимальными и макси- . -мальными ЧКУс для данной выборки, готовили суспензии клеток (отдельно из клонов с максимальными и минимальными ЧКМс) и вводили их внутривенно крысах. Таким же образом проводились все последующие циклы отборов.

Через 5 циклов отбора 5 клонов сублинии, селектируемой на понижение частота ¡слеток с мостами и 8 клонов сублинки . РА-23, селектируемой на повышение частоты клеток с мостами Ош целиком использованы для приготовления мазков-отпечатков. Частота патологических митозов в этом опыте определяли "вслепую", т.е. на зашифрованных препаратах.

Содержания ДНК в популяциях клеток определяли методом проточной цитометрии суспензии клеток (1 млн клеток в 1 мл) после окрашивания их бромистым этидием и оливомицином (Розанов, 1988) совместное Н.В. Бычковой (Центр Экологической Медицины).

Для получения препаратов метзФазных хромосом приготовленную из опухолевых узлов клеточную суспензию инкубировали с колхицином (Фирма "Мерк"). Клетки подвергали гипотонии и Фиксировали метанол-уксусным Фиксаторим (Каминская и др., 1990; Макгрегор, Вэрли. 1886). Для подсчета хромосом отбирали окрашенные по Гимза метаФазные пластинки округлой формы, сохранившие ореол цитоплазмы.

Для оценки метастатического потенциала использовали величину КОЕ (колонеобразующие единицы) - число опухолевых узлов в легких привитых животных в пересчете на 100 тыс. внутривенно введенных жизнеспособных клеток (Степаньян, Бахтин, 1.980).

Коэффициент реализованной наследуемости ь2признэка "частота клеток с мостами" определяли по отношению селекционно- • го дифференциала (и) к селекционному ответу (к) по П.Ф. Ро-

кицкому (1978) з модификации для клеточных популяций, предложенной Ю.Б. Бахтиным (1080).

■ КоэФФИценты корелляции и уравнелия регрессии определяли С ПОМОЩЬЮ программы,, составленной на языке QuickBASIC 7.1 с использованием графики на персональном компьютере звбрх.

Распределения, отличающиеся от нормального распределения, сравнивали с помощь» непараметрического и-крдаерия Вил-коксона - Макаа - Уитни. КоэФФИценты корелляции вычисляли методом ранговых королляшя по Спирмену (Гублер, Генкин, 1972) и по t - критерию Стъюдента <Седатлиев, 1968>.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

И^0Тки_с_мостами_в_!«еточных_допул __!а_^1^о_клонов

Наблюдаемые и регистрируемые нами интерФазные мосты полностью соответствовали всем морфологическим критериям моста, описанным Аловым <1Э72> и ПрокоФъ-евой-Бельговскои d961>.

Мекклональные__

субштаммов__Б5бдомиосаркомы_РА-33_К2Ыс__по_П2Шнакх_"частота

МбХоК-С-Мостами^ Прежде чем приступить к изучению популяций клонов РА-23 по признаку "частота .клеток с мостами", и определению межклональных различии по частоте клеток с мостами, мы определяли степень вариабельности этих признаков в пределах клеточных популяций отдельных клонов субштамма РА-23. Было выявлено, что в изученной выборке наблюдались клоны с высокими, так и с низкими, а также клоны со средними ЧШ.1с. По всем статистическим критериям между такими клонами аргументированы 'достоверные различия по признаку "частота клеток с мостами" <Р < 0.001>. Также были выявлены достоверные межпопуляадонные различия по признаку "ЧКМс" между различными субштаммами РА-^: РА-23 и РА-22 < Р < 0.005 РА-22 И РА-24 ср< 0.001 а также РА-23 и РА-24 с Р < 0.001 >.

Отбор__клонов__Еаб^омиосаркомы__субиггамма_РА-йЗ_^ыс_на

повышение частоты встречаемости в них клеток с мостами." Отбор индивидуальных клонов РА-23 был оФФективиым: средняя ЧКМс достоверно повысилась с 0.8% до 3.0% отбора на повышение ЧКМс <Р < 0.001>. Популяции клонов-потомков, полученные ь в результате такого отбора оказались гетерогенными то приз-

наку "ЧКМс": среди них встречались как клоны с ЧКМс большей, так и клоны с ЧКМс меньшей, чем в родительском клоне. Среди клонов-потомков, подученных от родительского клона с ЧКМс 3.0%, показатели ЧКМс не превышали 8.6« • Для прово деши очередного 2гго цикла отбора на повышение ЧКМс были перевить 3 клона с ЧКМс от 5% и выше, однако, они оказались репродук-" тивно стосильными, несмотря на то, что доза призкээ?мь:х ¡слеток этих клонов на крысу была .увеличила десятикратно, а сроки от прививки до дякапитаг,ки привитых животных быта увеличены до 30 с.ут. Вероятно, таким образом, отбор на гидерку-т.э6ййьность, вероятно, привел к ропрояуктшозсу вымиранию. Результаты повторного эксЕергоюита по отбору клопов ?Л-?,3 на повышение ЧКМс сданные 5 циклов* представлены в табл. 1. В результате 5 циклов отбпрэ клонов РА-23 о повышенными ЧКМс средняя ЧКМс достоверно повысилась с 0.6?* до 10.0% с Р < 0.001 >. Так как после отбора, на повышение ЧКМс стали наблюдаться опухолевые клетки с несколькими мостами, то для изучения взаимосвязи между показателями "ЧКМс" и "частота мостов на клетку" (ЧМК) была проанализирована выборка из 38 клонов 1- го цикла отбора на повыиенную ЧКМс . (первым зкепе-римент>. Коэффициент корэлляции менту показателями "ЧКМс" и "ЧМК" составил 0.82 с по »• - критерию Стъюдента. Р < 0.01 что указывает на тесную связь между изучаемыми явлениями. В результате регрессионного анализа подучено уравнение вида: у сх> - -о.ю + 0.25 » х, т.о. изменение частоты клоток с мостами на 4% вызывает изменение частоты мостов на клетку на 1 % . Эта результаты позволяют сделать вывод о том, что частота мостов на клетку закономерно изменяется в зависимости от поведения признака "частота клеток с мостами".

Отбор__клонов_23й50миосэекокы__с^баггамма__Р^23_крыс_на

понюкенке частоты^ От-

бор клонов субштамма РА-23 на поникение спонтанной частоты встречаемости в них клеток с мостами проводился одновременно и параллельно с первой попыткой отбора клонов РА-23 на . повышение ЧКМс. В результате 5 циклов отбора на понижение ЧКМс средняя ЧКМс достоверно понизилась с 0.8^ в выборке исходного цикла отбора до 0.3% в выборке 5-го цикла отбора, т.е. в 2.6 раза с Р < 0.001 з стабл. V. В ходе отбора частота кле-

XАБЛЩЛ_1. Шмвнвние частоты клеток о мостами <ЧКМо> в клонах рабдомиосаркомы РА-23 крыс в результате отбора клонов на повышение «первая и вторая попытка? . и на понижение частоты клеток с мостами.

Направ- Шаг '1исло Средняя Пределы ЧКМс Коэффици-

ление от- иссле- ЧКМс в варьи- отобран- ент реа-

отбора бо- довзн- выбор- рования ных кло- лжюванноя

ЧКМс, у. нов? *

ра ных ке, к клонов

наследуе- . мости с ь2>

4

0 53 0.8 0.0-3.0 3.0 <13 -1

1 44 3.0 0.0-8.6 '3.0 <3> 1.0

0 48 0.6 0.0-2.0 1.1 __

1 50 0.8 0.0-3.0 2.5 <3> 0.5

2 52 1.7 0.0-5.С 1.8 С1> 0.5

3 4в 1.6 0.0-3.2 5.0 <1>

4 47 4.3 1.0-15.0 11.7 <2> 0.0

0 53 0.8 0.0-3.0 0.2 С1Э 0.0

1 47 0.6 0.0-1.0 0.2 С1> 0.3

2 . 47 0.3 0.0-1.8 0.1 0.23

3 43 0.6 0.0-2.0 0.0 <15 -

4 81 0.5 0.0-2.2 0.0 <15 0.25

Ч/

*

<0 *

А

4

В'скобках указано число отобранных клонов.

ток с мостами изменялась постепенно, без скачков; Фракция клонов с низкими ЧКМс в ходе отбора увеличивалась. В выборках клонов всех ' циклов встречались клоны с высокими ЧКМс (1%-2%), несмотря на то, что в отбираемых клоках спонтанная ЧКМс была низкой (меньше 0.2%) и среди полученных дочерних клонов появлялись клоны с высокой ЧКМс (1%-2Ж). Таким образом, проведению искусственного отбора клонов на понижение ЧКМс препятствуют изменчивость признака "ЧКМс" и естествен-»•ный отбор, направленный в противоположною сторону. Однако.

предложенным нами способом, удается заметно понизить частоты клеток с мостами в популяциях клонов РА-23.

КоэФФВДент___реалтаов5ннои__наследуемоста__h^__признака

"ч§С101'3_клеток_с_мостами^_в_клеточны __ШйШШО-Z

~~~ ~ ** ~ ~ — - — — — — —

саркомы_субштамма_РА-23д Полученные величины ь (0,25 - 1.0) показали, что вклад наследственных Факторов не оказывает опрзделяю'дего влияния на вариабельность клонов по ЧКМс. Представленный данные об эффективности отбора клонов по призна-

2

ку "ЧКМс" и о величине ь свидетельствуют о генетической детерминированности этого признака, а также о наследственной гетерогенности популяции клоногенных клеток РА-23 по этому признаку. По-ьщхимому, признак "ЧКМс" является количественным, полигенно обусловленным признаком,о чем свидетельствует постепеннное изменение ЧКМс в популяциях клонов в процессе отбора, а также характер варьирования этого признака в популяциях , .>>

Сравнщвльныи_анадаз_показателей_каш

^®2е™__в_меточных_пощляшях_оонов

шншеннши__ь_роз^льтате_отбора_частотами_ктат

Клоны рабдомиосаркомы РА-23 крыс с повышенной ЧКМс отличаются от клонов с пониженной ЧКМс достоверно большими частотами патологических митозов: частотой ана- и телоФаз с мостами < Р < 0.001 > и частотой ана- и телоФаз с мостами и отставаниями хромосом и их Фрагментов с р < 0.001 >, частотой мета-Фаз с разбросанными хромосомами t Р < 0.01 > • и метаФаз с отставаниями хромосом и их Фрагментов Р < 0.001 а также частотой многополюсных ана- и телоФаз < Р < 0.001 По частоте анз- и, телоФаз с отставаниями хромосом и их Фрагментов между клонами с повышенной и пониженной ЧКМс достоверных различий не обнаружено < Р > 0,05 >. Следует подчеркнуть, что нэтмоныпие частоты всех перечисленных выше видов патологических читозов, кроме ана- и телоФаз с отставаниями, наблюдались в клонах, отобранных на пониженную ЧКМс, Выявлено также <табл. 2>, что достоверно меньшая частота встречаемости клеток с микроядрами наблюдается в клонах с низкой ЧКМс по сравнению с клонами с высокой частотой встречаемости клеток с мостами < Р < 0.001 з. Очевидно, что признак частота клеток с мостами положительно коррелирует с признаком частота

2А5ЛША_Й. Характеристика клонов, рабдомиосаркомы РА-23, полученных после одного цикла отбора на повышение и на понижение частоты встречаемости клеток с мостами.

Номер Частота Частота Частота

клона клеток клеток клеток с

с мос- с микро- мостами и

тами, % ядрэми, % микроядрами, %

Клоны после отбора на повышение частоты мостов

С 4 3,0 18,0 .5,0

В 8 4к5 15,8 2,9

А 3 0,8 18,6 6,5

В 12 1.8 18,2 3,8

д 9 2.8 16,8 • 2,8

Б 9 4,0 16,0 1>2

Клоны после отбора на понижение частоты мостов

С 1 0,1 3,5 Не обнаружены

С 2 0,2 4,2 - уу -

С 3 0,2 4,7 - УУ -

А г 0,2 2,8 - УУ -

Д и 0,2 2,8 - УУ -

Д 12 0,2 2,9 -// -

клеток с микроядрами.

Методом проточной цитометрии было выявлено, что в результате отбора клонов на повышение ЧКМс повысилась плоид-ность клеток.

После проведения 5 циклов селекции на снижение встречаемости клеток с мостами было исследовано число хромосом данной популяции. Проведенный анализ показал, что метаФэзы с 56

хромосомами иатрочаютоя ивийолво часто и «оставляют до 4 О* из всех 123 исследованных метаФаз. Причем во всех 123 исследованных мвтаФазах не было обнаружено доцентрических хромосом <рис. 1,а>. Важно отметить, что число хромосом в клетках рэбдомиосаркомы РА-23 крыс, исследованной до проведения отбора да частоте клеток"с" мостами (Каминская " и др., 1990э, составлявших модальный класс, находилось в области 60-70 хромосом <рис. 1,б>. В популяции клеток РА-23, в которых проводили селекцию на повышение частоты клеток с мостами, определить число хромосом не удалось, т.к. эта популяцля отличалась высокой гоюидаостъю, как указывалось ранее.

а.

¿К

уг ■ !Д'Л;

иг ю »гг

ю

20

10-

Л 40 Ч! ¡г ¿0 ГГ 10 »К

Рис. 1. Распределение клеток рэбдомиосаркомы РА-2 ирыо по числу хромосом, а -до отбора на понижение частота мостов; 6 - после отбора на понижение частоты мостов.

По горизонтали - число хромосом; по вертикали - процент клеток.

Метастззшесда. дотенщвд. мош. схвшгатз. рагззл. qtc§: дакпдавэввь®— us. доеышен®. вз_ оовшенш. ззсшгу. im®tpb_ _ s ИОЕГЗМи, После, проведения 5 циклов отбора на повышение и отбора на понижение ЧКМс популяции РА-23 были специально протестированы на метастатический потенциал. Установлено, что при всех исследованных прививочных дозах популяции клеток с повышенной ЧКМс имела достоверно меньший метастатический потенциал, чем популяция клеток с пониженной ЧКМс сво всех случаях Р <„0.05, n-6>. Причем различия по величине метаста-статического потенциала между популяциями с высокой и низкой ЧКМс были более, чем тридцатикратными. Среднее значение метастатического потенциала клеточной популяции с повышенной ЧКМс в субштамме РА-23 составило 1.4 - 0.43, а значение метастатического потенциала клеточной популяции этого субштам-мэ с пониженной ЧКМс составило 33.6 - 7.4. Таким образом, полученные данные, свидетельствуют о снижении метастатического потенциала в ходе отбора клонов РА-23 на повышение частоты встречаемости в них клеток с мостами.

Аномал™_штерФазных_ядар_в_ввде пощлящях_субщтамма_РА-ЯЗ^ Данные наблюдений за'клетками с полумостами, образованными спонтанно в клеточных популяциях клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс, свидетельствуют, что по внешним признакам, наблюдаемые нами полумосты, полностью соответствуют всем морфологическим критериям полумоста, описанным ПрокоФЪвваои-Бельговскоя <19615, Atkin и др. «19743, Hsu <1974>.

Взашосвязь_частоты_щеток_с_мостами пощмостами_в._гаеточных_пощляция хГрк се-

лекции на пониженную и на повышенную ЧКМс было выявлено, что клоны с повышенной ЧКМс характеризуются также и высокой ЧКП, тогда как клоны с пониженной ЧКМс характеризуются низкой ЧКП <Тэбл. 3>. Так, средняя частота клеток с полумостами в 8 клонах 5-го цикла отбора на повышение ЧКМс составляет 9,0%, а средняя ЧКП в 5 клонах 5-го цикла отбора на понижение ЧКМс составляет 0,5% < Р < 0.001 по непараметрическому критерию Вилкоксона - Мана - Уитни>. Очевидно, что отбор на повышенную и пониженную ЧКМс также привел к повышению и понижению, соответственно, по частоте клеток с полумостами. Для точного

ТАБЛИЦА_3. Характеристика клонов рабдомиосаркомы РА-23, полученных после 5 циклов отбора на повышение и б циклов отбора на понижение частоты встречаемости клеток с мостами.

Номер клона . Частота клеток с мостами,% Частота клеток с полумостами,Ж

Клоны после отбора на повышение частоты мостов

А 6 11,6 3,6 1

0 1 18,6

0 в 16.2 14,4

г 1 12,7 8,6

е 4 17,4 16,8

г 3 11,2 5,6

е 1 11,2 6,8

в 5 9,0 6,0

Клоны после отбора на понижение частоты мостов

В 9 0,0 0,8

о 12 0,0 0,6

В 7 0,0 0,4

0 2 0,0 0,8

С 11 0,0 0,6

определения связи между ЧКМс и ЧКП был применён корреляционный и регрессионный анализ в выборке из 135 клонов отбора на повышенную ЧКМс. Коэффициент корелляции между показателями "ЧКМс" и "ЧКП" составил 0.85 <по - критерию Стыодента, Р < 0.01>, что указывает на тесную связь между изучаемыми явлениями. В результате регрессионного анализа получено уравнение вида: у<х)=о.49+о.бб»х, т.е. изменение частоты клеток

с мостами на 4.Ей .вызывает изменение частоты клеток с полумостами на ЗУ', что указывает на неслучайный характер возникновения мостов, и образования'полумостов. Положительная корреляция по Спирмону была выявлена также' мезду признаками "ЧКП" и "частота ана- и телоФаз с мостами", "ЧКМс" и "частота ана- и телоФаз с мостами" сг « 0.823, Р < 0,0005 для ранговой корелляции по Спирмену>.

ВЫВОДЫ

1. Клоны всех субштаммов РА-Я различаются между собой по показателю "частота клеток с мостами" в 5 - 10 раз. Гетерогенность выборок клонов РА-23 по признаку "частота клеток с мостами'"воспроизводится во всех экспериментах.

2. Разработаны и апробированы способы селекции клеточных популяций перевивных опухолей, с помощью которых можно получать популяции опухолевых клеток с повышенными и с пониженными частотами спонтанных кариотипических нарушении.

В результате 2-5 циклов отбора клоков перевивной раб-домиосаркомы крыс субштамма РА-23 с повышенными частотами клеток с мостами средняя частота клеток с мостами повысилась с 0.6% - 0.8Ж до З.ОХ - 10.0% . За 5 циклов отбора клонов перевивной рабдомиосэркомы крыс субштамма РА-23 с пониженными частотами клеток с мостами средняя частота клеток с мостами в популяциях понизилась с 0.8% до О.ЗЖ .

3. Эффективный отбор на изменение частоты клеток с мостами в популяциях РА-23 характеризуется градуальным .вменением селектируемого Признака и сохранением гетерогенности на всех циклах отбора. Полученные' результаты позволяют рассматривать признак "частота клеток с мостами" как количественный (полигенно обусловленный). Определение коэффициентов ре-

о

алиэованой наследуемости <ь - 0.25 - 1.0> свидетельствует о высоком вкладе средовых Факторов в вариабельность признака "частота клеток с мостами".

4. В результате отбора клеточных популяция с повышенными частотами клеток с мостами и в результате отбора клеточных популяции с пониженными частотами клеток с мостами.

полученные клеточные популяции стали ооотвеуствонно различаться по частоте клеток с микроядрами, частотами патологических митозов, полумостами. Следовательно, спонтанная частота клеток с мостами в клеточных популяциях перовивной раб-домиссаркомы крыс РА--23 является информативным показателем спонтанных частот геномных и хромосомных мутации."

5. Между признаком "частота клеток с мостами", характеризующим каркстигмческую нестабильность, и признаком "метастатическим потенциал", характеризующим злокачественность, существует отрицательная корреляция. Клоны клеток РЛ-Г-. 1, содержащие свыие Ь% клеток с мостами не удавалось эффективно реклонироватъ. По-видимому, искусственный о'1бор на повышение кариотипической нестабильности может приводить к репродуктивной гкСе.гл популяции опухолевых клеток.

6. Эффективный отбор на повышение встречаемости клеток с мостами привел к повышению частоты клеток с множественными мостами. Таким образом, выявлена сильная положительная корреляция между параметрами "частота клеток с мостами" и "частота мостов на клетку" о - 0.82, по 1- - критерию Стыодента р < 0.01>.

7. Установлено, что между параметрами "частота клеЛгок с мостами" и "частота 1слеток с полумостами" существует сильная

положительная корреляция <>«0.85, по I - критерию Стъюдента р < 0.01>. Следовательно, спонтанная частота клеток с полумостами в клеточных популяциях перевивной перевивной рабдо-миосаркомы крыс РА-23 является информативным показателем спонтанной частоты хромосомных мутаций.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработанный и апробированный способ селекции клеточных популяций перевивных опухолей на стабильность генома (отбор на частоту клеток с мостами) рекомендуется использовать в биотехнологическом производстве с целью генотипичес-кой и Фвнотипической стабилизации клеточных линий.

2. Рекомендуется использование показателя "частота клеток с мостами" в качестве количественного критерия кариоти-

пической гетерогенности и мутабилыюети опухолевых клеток в диагностике и терапии онкологических заболеваний,

3. Определение аномалий интерФазных ядер в виде полумостов рекомендуется использовать для оценки частоты кариоти-пических нарушений у человека и животных в различных экологических зонах.

СШСОК_Р№ОТА_ОШЪвВШЩХ_ШЛЕМЕ_®ССЕРТШ!

1. Прошин С.Н..Кравцов В.Ю.. Субклонирование по признаку "частота клеток с мостами" в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы крыс РА-23. Менщ. Симп. Молекулярная генетика и. биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных жйвотных. 1994, С.-Петербург, 90-91.

2. Дудин М.Г., Прошин С.Н., Кравцов В.КЗ., Краснов А.И., Мельников В.П. Исследование частоты микроядер в клетках костного мозга и эритроцитах периферической крови у детей с ортопедической патологией. Материалы Всероссийской научно-практической конференции детских ортопедов - травматологов. 1895, С.-Петербург, 293-294.

3. федорцева Р. Ф., ■ Кравцов В. Ю., Прошин С. Н., Треус В. В., Яковлев А, Ф., Никифоров А. М. О возможности выявления частот возникновения хромосомных аберрации в экстремальных условиях с помощью краткосрочных цигоге-нетических методов in vivo. Вторая Менщ. Научно-практическая конференция. 1995, г. Надым. сРоссия>, 58.

4. Прошин С. Н.,. Кравцов В. Ю., Яковлев А. Ф., Каминская Е.В.,' Бахтин ' Ю.Б.' Селекция in vivo в клеточных популяциях рабдомиосаркомы РА-23 крыс по признаку "частота клеток с мостами" /v Генетика. 1998. т.32. n.3. С. 406 -410-

РГП. Тип, ВИР. Зак Л 87. Тир .100. 16