Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Селекция клеточных популяций перевивных опухолей на стабильность генома
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Селекция клеточных популяций перевивных опухолей на стабильность генома"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

СЕЛЕКЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ПЕРЕВИВНЫХ ОПУХОЛЕЙ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ГЕНОМА

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ—ПУШКИН 1992

На правах рукописи

КРАВЦОВ Вячеслав Юрьевич

УДК 575:6)6—006:612.086.3

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН и в лаборатории генетики клеточных популяций Института цитологии РАН.

Научные руководители — Лауреат премии Совета Министров СССР, доктор биологических наук, профессор А. Ф. Яковлев; академик РАЕН, доктор биологических наук, профессор Ю. Б. Бахтин.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор Л. 3. Кайданов (С.-Петербургский Университет); кандидат биологических наук Р. Ф. Федорцева (Институт цитологии РАН).

Ведущее учреждение — НИИ Онкологии им. проф. Петрова МЗ РФ.

Защита состоится « '7» 1992 г. в ' часов

на заседании Специализированного совета Д.020.07.01 по защите докторских диссертаций при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН по адресу: 189620, С.-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55-А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН.

Автореферат разослан » у^ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных наук

Ж. Г. Логинов

лшм'шст^темыг. Хромосомные аберрации и выраженная 'карио-типическая гетерогенность клеточного состава опухолей обнаруживаются практически во всех изученных злокачественных опухолях (Yunf'-¡, 1981; Colman, 1986). Кариотипическая изменчивость . опухолевых клеток затрудняет использование хромосомных маркеров при диагностике "и терапии опухолей в медицине и в ветеринарии, она же является одной го причин нестабильности и утраты пенных признаков штаммов опухолевых клеток-продуцентов» используемых в биотехнологии. CVa последние годы з области изучения цитогенетики рака и' в генетике соматических клеток достигнут большой прогресс, однако сам кардинальны» признак "частота кзриотипических нарушения" в популяциях опухолевых клеток in rivo изучен недостаточно.■ Для изучения частот кариотипических нарушений в условиях in vivo в больших выборках клеточных клонов, каждый из которых состоит из ограниченного числа клеток, требуются количественные методы, позволявшие быстро и достаточно эфофктивно измерять частоты возникновения клеток с измененными кзриотипами. Только при использовании подобных методов возможно дальнейшее манипулирование клонами в эксперименте. Для этих щелей представляется перспективным использование метода определения частот меток с микроядрзми. Микроядра в соматических клетках образуются в процессе митоза из хромосомного материала, потерявшего контакт с веретеном митотического аппарата. Они могут быть представлены либо ацентрическими Фрагментами, либо целыми хромосомами (хроматинами), а возможно и несколькими хромосомами. Частота встречаемости клеток с микроядрами свидетельствует о частоте возникновения клеток со структурными и численными хромосомными аберрациями, т.е. отражает стабильность генома клеток ( Hogstedt, 1983; Ильинских и др., 1992 ). -Особенно перспективным представляется изучение и анализ признака "частота клеток с ммсроядрами" в клеточных популяциях перевивных, опухолей, работа с которыми позволяет проводить клонэльный анализ и искусственный ОТбОр В УСЛОВИЯХ in vi tu,

Целью__и__задачами__настоядей__работы_ являлось исследование

характера наследственной обусловленности и особенностей Фенотипи-ческого проявления i" v-ivo признака "частота ¡слеток с микроядрами" в клеточных популяциях перевивных опухолей. При этом особое внимание предполагалось уделить вопросу о возможности повышения и снижения с помощью искусственного отбора стетюни спонтанной нестабильности кэриотипа опухолевых клеток и изучению злокачественности

популяций клеток с высокими и с низкими "частотами кариотигмческих нарушении. При1 этом были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияяиб времени роста и размеров экспериментальных легочных метастазов (имеющих клональное происхождение) перевивной раодомиосаркомы РА-2 крыс на ■частоту встречаемости в них клеток с микроядрами.

Я. Изучить «кшотипическую и наследственную гетерогенность клонов перевивном рабдомйосаркомы РА-З крыс и опухолевых узлов миеломы нр 2/а мышеи по признаку "частота клеток с михроядрами".

3. Провести искусственный отбор клонов клеток перевивной раодомиосаркомы РА-2 крыс и опухолевых узлов МИ9Л0МЫ БР 2/0 мьшэя с повышенными и с пониженными частотами встречаемости клеток с микроядрами. Использовать показатели динамики отбора для вычисления коэФФИпентов реализованной наследуемости ъ2 признака "частота клеток с микроядрами" в исследованных клеточных популяциях.

4. Провести сравнительный анализ показателен кариотипическоя изменчивости в клеточных популяциях, отселекгировэнных на повышенную и пониженую частоты клеток с микроядрами. Исследовать возможные механизмы элиминации хромосом из опухолевых клеток в результате спонтанного Формирования микроядер.

5. Определить степень злокачественности по показателю "метастатический потенциал" популяции клеток с повышенной и с пониженной в результате отСора 'частотами клеток с микропирами.

й§у.зн§8_н°§иэа§1

Впервые продемонстрирована Фенотипическая и наследственная гетерогенность опухолевых узлов и клонов перевивных опухолевых клеток Jn vivo по признаку "частота клеток с микроядрами".

Впервые разработана и апробирована методика проведения искусственного отбора в популяциях.соматических клеток на повышение и сншенио частоты встречаемости клеток с микроядрами. В результате получены популяции клеток, представляющие собой биотехнологический интерес и уникальную модель для исследований Фундаментальных проблем стабильности генома клеток. Показано, что при этом отборе происходит градуальное изменение признака "частота клеток с микроядрами", свидетельствующее о его полигонной обусловленности. Впервые показано, что спонтанная нестабильность кэриотми опухолевых клеток в большей степени зависит от Факторов внешней среды,'при несомненной рода наследственных Факторов.

В'.юрвые зарегистрирована отррагельная корреляция между пока-

ээтелями нестабильности кзриотипа опухолевых клеток и их злокачественностью ( метастатическим потенциалом > и показано, что искусственный отбор на погашение спонтанной частоты клеток с микроянра-ми может приводить к репродуктивной гибели популяций опухолевых клеток.

Впервые показана связь между отставаниями хромосом в митозе, Формированием микроядер и микроклеток и изменением кариотлпичес-кого профиля в сторону гипомодального числа хромосом в клеточных популяциях, селектируемых на повышение спонтанной частоты возникновения клеток с микроядрами.

0Е31Ш^?Якая_цон7_юсть_рэОоты^ Разработан и апробирован способ селекции клеточных популяций перевивных опухолей, с помощью которого можно получать популяции опухолевых клеток с повышенными и с пониженными частотами спонтанных кариотипических нарушений, что может в перспективе применяться в промышленной биотехнологии. Принято решение БНИШ1Э 1/9 от 03.01.92. о выдаче патента "Способ селекции популяций клеток кие ломы" ( заявка 4,90695 / 13 (000917).

ЛОШ?ация_вабота« Материалы диссертационной работы докладывались на научном семинаре Томского отделения Всесоюзного общества генетиков (Томск, 1988), 1 Всесоюзном съезде радиобиологов (Москва, 1989), на Всесоюзной конференции "Генетика соматических клеток" (Звенигород, 1989), на Международной конференции "Мигоз и расхождение хромосом" (Ленинград, 1990).

Вк^ликациид. По результатам исследования опубликовано 7

печатных работ.

!?1РУК1ХРа_и_об^м_дассертацшл Диссертация состоит из разделов: введение, обэ'.:. литературы, материалы и методы, результаты исследования,' обсуждение, выводы, "практические предложения и список литературы, включающий 160 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Объем диссертации состаачяет ■ 151 . страницу машинописного текста. Представлено 10 таблиц и 34 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на белых беспородных крысах и мышах линии ваш/о разводки питомника РАМН "Рапполово". В работе использованы субштаммы перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс: РА-2В (высокий метастатическим потенциал клеток (Каминская, Бахтин, 1984)), РЛ-2П (низкий метастатического потенциал (Гужова, Бахтин, 1988 )) и ГЛ-ЗТ ( повышенная терморезистептпость клеток (Федорова

а

и др, 1У8Й )). Клетки ьсех еуаштаммов после ваеденш^образует экспериментальные метастазы только в легких привитых животных. Свыше 95$ экспериментальных метастазов РА^уницеХяюлярное' происхождение (Степаньян. Бахтин, 1980; Каминская, 1986>, т.е. являются клонами.. Экспериментальные метастазы (клоны) РА-2 получали введением суспензий одиночных опухолевых клеток в хвостовую вену крыс. Посла прививки клеток животных, предварительно усыпив Эфиром, де-капитировэли, вычленяли легкие и отггрепаровывали клоны. Для получения Бнутрийрюшшшых (е^б) узлов мизломы БР 2x0 мышей 1 млн. клеток вводили внутрибушинао.

Частоту меток с микроядрами (ЧКМ) в клеточных популяциях исследуемых опухолей определяли в мазках-отпечатках, для чего отпре-парованные клоны рабдомиосаркомы РА-2 крыс' и ь/б узлы миеломы ар 2/0 мшен разрезали пополам и получали от них отпечатки на предметных стеклах. Мазки-отпечатки Фиксировали 98Ж этиловым спиртом, высушивали и окрашивали красителем Гимзы или •Флуорохромом Хехст 33258. В каждом мазке-отпечатке анализировали по 500 - 1000 целых клеток. Клетки с признаками дегенерации не учитывались. ЧКМ выражали в процентах. Частоты патологических митозов определяли? на препаратах, приготовленных таким же способом.

Схема отбора мои о в РА-2 на повышение и отбора на снижение

частоты встречаемости в них клеток с

П __ 1 микроядрами представлена на рис. 1.

^ I Отпрепэрованные клоны разрезали на-

двое, одну половину каждого клана использовали дли приготовления мазка, другую половину клона помещали ль^-ч щпришит о во Флакон со средой 199, В мазках от

Ц I каждого клона просчитывали по 200 -

500 целых клеток. После определения ЧКМ отбирали клоны с минимальными и с максимальными для • данной выборки ЧКМ, приготавливали из них суспензии клеток и вводили их внутривенно крысам. Таким же образом проводились все последующие циклы отборов. Отбор на повышенно и отбор на снижение ЧКМ в ъу'6 узлах шеломы вгг/о мышей проводился по такой же схеме (рис. 1).

приМл

1 /

МвЭКМ

Ш

| + +

О О л

ООО

§ йб-

1*ис. 1. Схема проведения искусственного отбора ¡ионов РА-«2 на изменение частоты клоток с микроядрами

Частоты микроклеток в мазкая-отпечаткэх в/Я узлов миеломы ер ?./<* мышеи определяли на 10 ООО'целых клеток в 3 ООО полях зрения.

Содержание. ЛШ в популяциях клеток определяли методом проточной штометрии суспензии клеток <1 млн клеток в 1 мл) после окрашивания их бромистым этидием и ожвомицином (Розанов, 1988) совместно с Ю.М. Розановым на установке, сконструированной в Институте цитологии-РАН.

Дяя получения препаратов метаадзних хромосом приготовленную из опухолевых узлов клеточную суспензию инкубировали с колхицином при 37°С, после чего готовили препарата стандартным способом. Для подсчета хромосом отбирали окрашенные по Гимзз метаФазные пластинки округлой Формы, сохранившие ореол цитоплазмы.

Кинетохоры в микроядрах клеток рабдомиосаркомы РА-2 крыс и миеломы яр я/« мышея определяли методом непрямой иммуноФЛуоресцен-ции ( и«пп1пд »1 э1., 19сч ), В качестве 1-го антитела использовали анппела, полученные из сыворотки крови пациентов больных склеродермией, любезно предоста&ченные М.В.Семеновым (Институт цитологии РАН). В качестве Я-го антитела использовался кроличий античеловеческий глобулин меченный ФИШ в ампулах (Институт экспериментальной медицины РАМН).

Для оценки метастатического потенциала использовали величину КОЕ ( колонеобразующие единицы ) - число опухолевых узлов в легких привитых, животных в пересчете на 100 тес. внутривенно введенных жизнеспособных клеток ( Пелевина и др., 1978 ).

КоэФФидант реализованной наследуемости ьг признака "частота меток с кикрояярэми" определяли по отношению селекционного дифференциала ( э ) к селекционному ответу ( к ) по П.Ф. Рокиц-кому ( 1978 ) в модификации для клеточных популяций, предложенной, ю. Б. Бахтиным ( 1880 ). '

Для статистической обработки данных использовали, программу для (Ж ро м1сговЬа, ь-критерия Стью,цента, и- критерия Вилкоксона - Манна - Уитни. КоэФФиценты корреляции вычисляли методом ранговых корреляций по Спирмону ( Лакин, 1980; Гублер, Генкгат, 197Я ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЩЕГОЕ

__клонов

Вэбдамиосщкож^ Наблю-

даемые и регистрируемые нами . микролдри полностью соответствовали всем морфологическим критериям микроядра. Пропоит микроядер с ки-

нетохорами в клетках в/б узлов миеломы бр 2/0 мышеи составил 88%, а в клетках клонов рао'домиосаркомы крыс субштамма РА-2В - 87%.

_Менвдональные_раз^^ия_1п_^го__^в_меточвд__шщлядиях__суб;

__"частота__клеток__с

мЩ20ЩЩ§ми"_£ЧКМ]1_^ Анализ выборки клонов РА-2В обнаружил наличие отрицательной корреляции между ЧКМ и возрастом клонов (г = - 0.еа, р < в.05 ) м отрицательную корреляцию между ЧКМ и размером клонов (г = - 0.60, Р < 0.05).

Гистограмма распределения 223 клонов субштамма РА-2В по признаку "ЧКМ" представлена на рис. 2,а. Среди исследованных клонов наблюдались как клоны, в которых клетки с микроядрами не были встречены, так и клоны с ЧКМ до 9% и более. Средняя ЧКМ в популяции клонов РА-2В составила 2,96 - 0,13%. В'выборке клонов субштамма РА-2Н (рис. 2,6) средняя ЧКМ составила 5,94-0,2435. Здесь также важно отметить значительный размах изменчивости клонов РА-2Н по величине ЧКМ- от 1,до 14,5Ж. Гистограмма распределения 128 клонов субштамма РА-2Т изображена на рис. 2,в. Около .20% клонов представленной выборки имеют1 ЧКМ, не превышающие 1,0%, модальный класс составляют клоны с ЧКМ от 1,03 до 1,5%, а средняя ЧКМ составила 1,89 - 0,1236. Представленные данные свидетельствуют о высокой степени гетерогенности популяций "клонов по признаку "ЧКМ" всех субштаммов РА-2. Следует подчеркнуть, что различия клонов РА-2 в пределах популяции могут быть более чем 10 кратными.

Частоту _патолдгичесм^ 2В. РА-2Н и РА-2Т. Частота всех исследованных типов патологических ана- и толоФаз в субштамме РА-2Н составила 56 - 6%, а в субштамме РА-2Т - 17,0 - 3,7%-, величина этого параметра у субштамма РА-2В занимала промежуточное положение (24 - 4%>.

1!Ш_частоты^ст£ечаемости^^^ Отбор .инди-

видуальных клонов РА-2В был зад*эктиБным: средняя ЧКМ достоверно повысилась с 1,3% до 7,8% (р < 0.001). Популяции клонов-потомков, полученные в результате такого отбора оказались гетерогенными по признаку "ЧКМ": среди них встречались как клоны с ЧКМ большей, так и клоны с ЧКМ меньшей, чем в родительском клоне. Среди клонов-потомков, полученных от родительского клона с ЧКМ 15$, значения ЧКМ 110 превышали 15%. Клон с максимальной ЧКМ (15%) из выборки 2 цикла отбора'был поревит для осуществления 3 цикла, причем прививочная .доза при этом была увеличеиа в 10 раз. Несмотря на это, в резуль-

Рис. 2. Частота клеток с микроядрами в клонах перевивной рабдомио-

саркомы РА-г крыс субшташа РА-2В (а). РА-2Н (б) и РА-21 (в).

По горизонтали - частота клеток с микроядрами ( ЧКМ ), %•, по вертикали - число клонов, %.

тате такой перевивки нам не удалось получить потомства и сохранить полученный субштамм. Результаты повторного эксперимента по отбору клонов РА-2В на повышение ЧКМ ( данные 4 циклов ) представлены в табл. 1. В результате 4 циклов отбора клонов РА-2В с повышеными ЧКМ средняя ЧКМ достоверно повысилась с 3,3% до в,9% (р < 0.001).

__пониже:

ние_ частота_встреч^моста_в_нга__1^ток_с_мжролдрами_ за 4 цикла

привел к достоверному изменению средней ЧКМ с 3,3% до 1,вЖ (р < 0.05) (табл. 1).

- Изменение частота клеток с микроядрами (liKM) в

клонах рабдомиоеаркомы РА-2В крыс в результате отбора клоноь на повышение и отбора на понижение ЧКМ.

Йатфав- лвние отбора Шаг отбора Число исследованных ' клонов Средняя ЧКМ в выборке к-Ь X Пределы варьирования ЧКМ, Ж ЧКМ отобранных клонов, % Коэффи-цен? ре-ализова-тюя на-следуе-емости(|1 )

ч) 3 ■ x 1 2 0 81 3,3-0,2 0,9-9,3 7,3 (3> -

1 49 4,5-0,3 1,5-12,0 9.5 (3) 0.3

2 50 5,7-0,3 2,7-11,5 12,9(4) 0,24

а с 3 48 a.iio.s"1 2,5-16,0 14,7(3) 0,33

<5 гс 4 47 8,9-0,6^ 0,5-17,0 14,5 -

0 81 Э,3±0,2 0,9-9,3 1,2 (4) -

О) 3 1 50 2,5±0,2 0-5,5 1,7 (4) 0,40

ш 3 2 10 Э.1-0,5 0-8,0 3.0 (3)

■х g 3 37 2,3-0,2 о-е,5 ■ 0,7 (3) -

<3 4 46 1,6-0,2 0-8.0 0.3 -

*В скобках указано число отобранных клонов!

Коэмщент_|жа2шзоващ __БЁ^ЗМ-э^Э__"частота

М§™к_с_микроя.драми^__субг

Величины ьг составили от 0,24 до 0.40 (см. табл. 1).

по.ШИзнаМ-^эстота мэтдк Результата 4 циклов

отборов в/б узлов миеломы яр 2/й мышей на повышение и на понижение в них ЧКМ приведены в табл. 2. Средняя ЧКМ достоверно снизилась с 2.1Ж до 0,С'.С ( р < 0,01 ); отбор на повышение ЧКМ к достоверному увеличению ЧКМ ъ в/б узлах не привел. КооФФИценты реализованной наследуемости у?- признака "ЧКМ" при этом составили от 0,04 до 0,6.

В целом, представленные данные об эффективности отбора, клеточных популяция рабдомиосаркомы РА-2 крыс и миоломы кр г/в мышея по признаку "ЧКМ" и о величинах ьг свидетельствуют о генетической детерминированности этого признака, а также о наследственной гетерогенности популяций клонегенних клеток по атому признаку в ис-

Тзблица Изменение частот клеток с микроядрами (ЧКМ) в в/й узлах миеломы нр 2/« мышей в результате' отбора в/й узлов на повышение и отбора на пониженна ЧКМ.

Направление отбора Шаг отбора Число исследованных ЪАЗ узлов Средняя ЧКМ в выборке Л х-ь X ЧКМ отобранных в/б узлов"* Козм>к~ цент реализованной на-слэдуе- .. емости и

0) Э X 1) * =3 :г о с о ¿с 0 40 2.1 0.5?<7) 0.5

1 20 1.1 0.22(5) 0,6

9 23 0,89 0.12(5) 0,24

3 33 0.75 0(6) 0,18

4 25 0.(5 - 0,20

<11 л. • О) 3 2 -в с <3 0 40 2.1 3,6(4) -

1 30 2,0 3,1(4) . 0,04

?. 25 2,6 3.8(4) 0.06

ч 30 2.4 4.6(4) -

4 23 2.3 - Г_-

*В скобках указано число отобранных в/б узлов

следованных перевивных опухолях. По-видимому, признак "'{КМ" является количественным, галигенно обусловленным признаком о чем свидетельствует постепениное изменение ТПСМ в популяциях в процессе отбора, а так«!» характер варьирования этого признака в популяциях, С-Р?1НИ'ГОльныа_анализ_показ^

§_мэточщх_популя1иях_ооноБ__РАг2В_с_пошшеш)ыми_и_с_шж

в..щаудьта1«, отбора .частотами, клеток „с ^шроя^рами. Клоны РА-2В с пониженной ЧКМ отличались от клонов с повышенной ЧКМ достоверно меньшей частотой эизф'зз и телоФэз с мостами и достоверно нень'лоа частотой анафаз и толоч.эз с отставаниями хромосом и Фрагментов (р <0,005). Клоны с попоенной ЧКМ, отличались также эиаЧителыю меньшими частотами мотзфэз с разбросанными хромосомами <к-мета*а-эами) по сравнению с клонами с повышенными ЧКМ (р < 0,001); различия по частотам мотэфэз с отставшими хромосомами между исследуемы-

ми выборками клонов с повышенной и с пониженной ЧКМ выявлены не были (р > 0,05).

Данные по ЧКМ и то частотам клеток с мостами в клонах РА-2В с максимально повышенными и с максимально пониженными отбором ЧКМ представлены в табл. 3. Видно, что во всех исследованных случаях клоны с высокими ЧКМ резко отличались по частоте клеток с мостами от клонов с низкими ЧКМ (р < 0,0001).

Таблица 3.. Частоты клеток с микроядрами (ЧКМ), с мостами, а также с микроядрами и мостами в клонах рабдомиосаркрмы РА-2В крыс после четырех циклов отбора на н^'ижение и на повышение ЧКМ.

Номер клона Частота клеток с микро-ядрами,(Ж) Частота клеток с мостами, (%) Частота клеток с минроядрами и мостами,(Ж)

клоны после отбора на понижение ЧКМ

В-10 0,5 0,6 - •

В-11 0,3 0,4

В-12 0,0 •0,0 -

"С-1 0,1'' 0,0 -

С-2 0.2 0,1 -

СГ3 0,3 0,3 -

клоны после отбора на повышение ЧКМ

А-1 17,5 13,6 7,9

В-7 16,1 8,2 4,8

А-11 11,3 3,2 2,0

А-12 . 10,0 5,3 3,2

0-7 12,0 4,0 -

Е-1 13,1 4,2 2,9

По данным проточной цитометрии взриабильность содержания ДНК в в-1 периоде в популяции клеток РА-2В, отселектированной на повышение 'ЧКМ, была выше, чем в популяции, отселектированной на пони-

жение ЧКМ: коэФФИцент вариации признака в первом случае был равен 4,14 %, а во втором - 3,12 % (различие достоверно, р < 0,01).

Сравнетельный_анализ^пдказателвй в^^точшхпощлщиях^

о'гбора_на_повшонш_и_пос.ю __5

никроапрами^ Б клеточных популяциях в/б узлов миелош 8Р '//« мышей. после отбора на повышенную ЧКМ, процент всех исследованных типов патологических митозов был достоверно выше <р <«.01 ), чем в популяциях после отбора на пониженную ЧКМ.

Отбор на понижение и отбор на повышение частоты клеток с микроядрами в вл5 узлах привел к резким изменениям распределения клеток по числу хромосом в отселектированных популяциях (рис; 3). В популяциях клеток, где поддерживалась повышенная ЧКМ, выраженный модальный класс по числу хромосом отсутствует, а клетки с числом хромосом 61-62 составляют всего 15%. Размах изменчивости по числу хромосом значителен - от 35 до более чем 220. Клетки с числом хромосом 35 -55 составляют около 5035 всей популяции (рис. 3, б). Напротив, в популяции, прошедшей отбор на снижение ЧКМ, преобладают клетки модальных классов ( рис. 3,а). а размах изменчивости хромосом уменьшен.

ап.

ггггЛ

аш

л

в л & *г я ■ & м . >№

Рис. 3. Распределение клеток вл> умов миеломы яр 2/в по числу хромосом после 4 циклов отбора на снихепие (а) и 4 циклов отбора на повышение (б) частоты клеток с микроядрами. По горизонтали - число хромосом; по вертикали - число мета«аз

{

При изучении меток в^б узлов шеломы нр г/о мы встречали микриклотки, которыо по всем морфологическим признакам соответствуют индуцнровзштмк- микроююткзм. описанным ранее ).>ь>,ч..п (107л), Следует ответить, что мы обнаружили микроклетки, которые образовались спонтанно. Частота вст[«чаемости микроклеток в клеточной популяции с пониженной ЧКМ (4-й цикл отбора) составила 0,28 -0,05%, а в клеточной популяции, в которой поддерживалась повышенная ЧКМ, - 0,68 - о,ив. Получонпыя результаты свидетедьствуи/г о том, что частоты образования клеток с микроядрами и част ты образования микрогслоток существенно влияют на кчриотишческую структуру популяций и могут быть основной из причин появления субшпуляцгот клеток с гипомодальным числом хромосом. Вероятно, вслед за образованием микроядар происходит их элиминация путем Формирования микроклеток, а клетки, утратившие хромосомы участвует в воспроизведении кариотипической структуры популяция.

Иетастет1тсюта,штецциал и.частота клеток., с ..микроядраш в ^§Т2!?нух_1юпулящях_рэбдд^иосаек В .процессе отбора

клонов РА -28 на повышенную ЧКМ метастатический потенциал клеток, используемых для проведения очередных циклов отбора, снизился с 40^168 до 13^6. После проведения 4-ых циклов отбора на повышение и отбора на понижение.ЧКМ популяции РА-2В были протестированы на метастатический потенциал (рис. 4). При всех исследованных приви-

10«

юМ 10'

10'

л

—г~ 20

{2)

' Рис. 5. Метастатический потенциал клеток РА-ЯВ после 4 циклов отбора на'повышение (1) и 4 циклов отбора на сникенио (¿) частоты' встречаемости клеток с микроядрами.

По гооизонтали - доза в^в введенных клеток; но вертикали -число сформировавшихся клонов

I

вочных дозах популяция клеток о повышенной ЧКМ имела достоверно меньший метастатический потенциал, чем популяция клеток с пониженной ЧКМ (во всех случаях р <0,001). Причем различия по величине метастатического потенциала в каждом исследованном случае были более чем пятидесятикратными. Среднее значение метастатического потенциала клеточной, популяции с пониженной ЧКМ в субштамме РА-2В составило 11 - 3, а значение метастатического потенциала клеточной популяции этого субштамма с пониженной ЧКМ составило Ô35 - 154. Метастатический потенциал клеточной популяции с пониженной ЧКМ в результате отбора не изменился и соответствовал метастатическому потенциалу исходного субштамма РА-2В ( различия пе достоверны, р >0,05). По-видимому, высокая мутабильность клеток РА-2, достигнутая отбором на повышение ЧКМ, приводит к снижению жизнеспособности клеток и, как следтвие этого, к снижению злокачественности.

ВЫВОДЫ

1. Клоны всех субштаммов РА-2 различаются между собой по показателю "частота клеток с микроя.црами" в 5 - 10 раз. Гетерогенность выборок клонов РА-2 по признаку "частота клеток с микроядрами" воспроизводится во всех экспериментах.

2. Разработаны и апробированы способы селекции клеточных популяций перевивных опухолей, с помощью которых можно получать популяции опухолевых меток с повышенными и , с пониженными частотами спонтанных кариотипических нарушений.

В результате 2-6 циклов отбора клонов перевивной рабдомиосар-комы крыс субштамма РА-2В с повышеныш частотами клеток с микроядрами средняя частота клеток с микроядрами повысилась с 1,3!?-3,3'Л до Q,Q%-7,(i%. За 4-6 циклов отбора клонов перевивной рабдомиосар-комы крыс субштамма РА-2В с пониженными частотами клеток с микроядрами средняя частота клеток с микроядрами в популяциях понизилась с 3,3% до 1,2-1,6%.

В результате 4 циклов отбора внутрибрюшшшых узлов миеломы sp 2/0 мышей на снижение чзстоты встречаемости клеток с микроядрами, среднее значение частоты клетм? с мжроядрэми снизилась с 2.155 до О,вж-, отбор на повышение частота клеток с мгасроядрами оказался не ЭФФеКТИВНЫМ.

3. Эффективный отбор нэ изменение частоты клеток с микро-ллрами в популяциях РА-2 и sp я/й характеризуется градуальным

изменением селектируемого признака и сохранением гетерогенности на всех послах отбора. Полученные результаты позволяют рассматривать признак "частота клеток с микрояярчми" как количественный (полипэшю обусловленный). Определение козФФИценгпв реализовано« наследуемости ( = 0.04 - «.о ) свидетельствует о высоком вкладе средовых Факторов в вариабильность признака "частота ¡слеток с микроядрами",

4. В результате отбора меточных популяции с 'повышенными частота'* клеток с микроядрами и в результате отбора клеточных популяций с пониженными частотами встречаемости клеток с микроядрами. полученные клеточные популяции стали соотпегевенно различаться частотами клеток с мостами, частотами патологических-штгозов. Частота клепок с микролдраки может отражать интенсивность процесса элиминации хромосом из геномов клопогонных меток, о чем .свидетельствует повышенную частоты микроклеток и появление класса клеток с гипоподальными кариотипами в популяциях йр 2/0, селектируемых на повышение частоты встречаемости клеток с микроядрами. Следовательно, спонтанная частота клеток с микропдрэми в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы РА-?, крыс и перевивной миеломы яр я/о мышеи является информативным показателем спонтанных частот геномных и хромосомных мутаций.

6. Между признаком "частота клеток с микроядрами", характеризующим кариотипическую нестабильность, и признаком "метастатический потенциал", характеризующим злокачественность, существует отрицательная корреляция. Клоны меток РА-2, содержащие, свыше 1Ъ% меток с микро ядрами не удавалось эф<)чэктивно реклониро-вать. По-видимому, икусственньм отбор на повышение кариотипической нестабильности может приводить к репродуктивной гибели популяция опухолевых клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработанный и апробированный способ селекции моточных популяций перевивных опухолей на стабильность генома ( отбор на частоту моток с микро ядрами) рекомендуется использовать в бйотех-нологическом производстве с долью хглотипической и Фенотипической стабилизации меточных линий.

2. Рекомендуется использование .показателя "частота клеток с микроя,прими" в качестве количественного критерия кариотипической

гетерогенности и мугабильности опухолевых терапии онкологических заболеваний.

клеток в диагностике и

Gî™Çiik_ jadgr, .Опуйжкованных _ по „теме _дассертации

1. Кравцов В.Ю., Ильинских H.H. Гужова И.В., Каминская Е.В., Бахтин ¡O.B. Отрицательная корреляция между частотой клеток с микроядрами и метастатическим потенциалом в популядаях клеток рабдомиосаркомы Рк-2 крыс // в кн.: Тез докл. на Всесоюзной конференции по генетике соматических меток в культуре (Звенигород, 13-15 октября lö89), M., 1989, с. 20.

2. Кравцов В.Ю., Гужова К.В., Каминская Е.В., Ильинских Н.Н, Бахтин Ю.Б. Нестабильность генома и метастатический потенциал клеток рабдомиосаркоми РА-2 крыс// Доклады АН СССР, 1090, Том 310, Н.5, С.1239-1241.

3. Кравцов В.Ю.Гужова И.В., Каминская Е.В., Ильинских Н.Н, Бахтин Ю.Б. Клональпыя анализ кариотшшческоа нестабильности и метастатического потенциала в популяциях опухолевых клеток // Генетика, 1990,Том 28, Н.9, С.1584-1589;

4. Кравцов В.Ю., Яковлев А.Ф.. Федорова Е.В,, Бахтин Ю.Б. Отбор на снижение и повышение спонтанной нестабильности кариотипа в клеточных популяциях перевивной шеломы ер 2/в мышея // Доклада АН СССР. 1991, Том 320, Н.4, C.1000-ÏD03.

5. Кравцов В.Ю., Горохов C.B., Каминская Е.В.. Ильинских H.H., Бахтин Ю.Б. Зависимость частоты встречаемости клеток с микроядрами в экспериментальных метастазах рабдомиосаркомы крыс от длительности роста и размеров этих метастазов // Цитология, 1992,

■ Том.34, N.3, С. 28-30.

.. 6. Кравцов В.Ю., Яковлев А.Ф., Каминская Е.В., Вахтин Ю.Б. Частота клеток с мостами при отборе клонов перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс на повышение и снижение частоты клеток с микроядрами // Доклады РАН, 1992, Том 234, N.2, С. 440-444.

7. Кравцов В.Ю., Розанов К^.М., Каминская Е.В., Яковлев А.Ф., Бахтин Ю.Б. Изменение частота клеток с микроядрами в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс в результате отбора на повышенную и пониженную частоту таи« клеток // Цитология, 1992, Том 34, N.7, 0.