Закономерности изменчивости мультигенных семейств

Гудков, Андрей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Закономерности изменчивости мультигенных семейств
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности изменчивости мультигенных семейств"

". а у

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДС 575.1:577.2

ГУДКОВ Андрей Владимирович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЧИВОСТИ МУЛЬТИГЕННЫХ СЕМЕЙСТВ

Специальность - 03.00.03 молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученей степени доктора биологических наук

в форме научного доклада

Москва, 1988

Работа выполнена в НИИ канцерогенеза Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АМН СССР, доктор биологических наук,

профессор В.И.АГОЛ

доктор биологических наук,

профессор В. А Л'ВОЗДЕВ

доктор биологических наук Ю. В.ИЛЬИН

Ведущая организация - Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР

Защита состоится " <5/ « ИСМ&рЛ юа/г. в /X часов на заседапии Специализированного совета по защите докторских диссертаций при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова (шифр Д.053.05.70) по адресу: 119899 Москва В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " Ш^Л^^ 198/г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

'С

В.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из главных особенностей генома эукариот является наличие генных семейств. Именно путем образовании семейств дивергирущих генов шло усложнение генома е ходе прогрессивной эволюции, создание основ для разнообразная дифференцировок; гомогенные мультигенные семейстза (гены рРНК, гистонов, тРНК, малые ядерше РНК и др.) обеспечивсвд зукариотическую клетку ее мажорными компонентами.Помимо зтих древних семейств, как правило, сцепленных генов, в геьомэ эукариот много относительно эволюционно молодых' повторяющееся элементов, образующих болзе или менее обширные семейства диспергированных последовательностей . Возникновелие этих семейств связано с появлением в геноме автономных элементов, распространение ко- орнх сопутствовало, если не способствовало, диьзргенции таксономических групп и видообразованию.Пробнема возшпповрния изменчивости гезома эукариот - это проблема возникновения, изменчивости к взаимодействия генных семейств, каждое из которых обладает свою.® особенностями и "стратегией". .Вопросы, связанные с проблемой генныт семейств, моязю разделить-на 3 группы: 1)путя г механизм возникновения семейства; 2) особенности эвоякнеш семейств: генетико-автоматические процессы внутри семейства, дивергенция и согласованная эволюция его членов и т.д.; 3) связь процессов, происходящих в генных семействах,с фенотипом организма. Не решив эти проблемы, невозмонко составить полноценные представления об организации и функционировании генома, закономерностях его изменчивости, о связи молекулярной эволюции и эволюции организмов.

Цели и задачи исследования. Целью работы было выявление и _описание закономерностей формирования и изменчивости мультигензых семейств клеточного происхождения и семейств, возникших из йсходао" внеклеточных автономных элементов (ретровирусов) с тем, чтобы составить представления о процессах, идущих в различных по структуре и происхождению компонентах генома эукариот.Существует 2 экспериментальных подхода к изучению изменчгаости генных семейств: I)анализ структуры, разнообразия, особенностей наследования реально существующих семейств; 2) годелирование возникновения новых

классов iиле удаления старых) генных семейств и прослеживание идущих при атом процессов - на молекулярном уровне и на уровне фенотипа.

Используя оба эти подхода, мы пытались решить следующие задачи:

Х)изучнть закономерности процесса возникновения de novo мультигенного семейства: мы показали, что селекция опухолевых клеток млекопитающих на так называемую множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) связана с формированием нового мультигенного семейства - амплификацией генов устойчивости; предполагалось получить гибридазационные зонды и клонировать последовательности ДНК, амшшфицироваыше в метках, обладающих МЛУ; с их помощью исследовать скорость амплификация генов, вариации амплифицированнш участков ДНК (амшшконов) внутри семейства и в разных независимо подученных клональных клеточных линиях, хромосомную локализацию i изменчивость структуры амплифгцированной днк;

2)на модели семейства генов рРНК человека изучить структурны! полиморфизм древнего мультигенного семейства и закономерности егс проявления: клонировать гены рРНК, методами рестрикционногс анализа оценить степень их структурного полиморфизма, определит! закономерности появления, наследования и хромосомной локализации структурных вариантов генов рРНК человека, а также вариацш размера этого мультигенного семейства, сопоставить наблюдения сделанные при изучении различных моделей, для возможного выявлена общнх закономерностей;

3)на модели эндогенных провирусов кур изучить одно и: секейств ретротрэнспозонов позвоночных: оценить рвзнообр^зи генетических локусов эндогенных прсвирусов кур, создать экспери-ыэБтальные модели для изучения структуры и функции эти генетических элементов; охарактеризовать структуру и экспресси различных представителей семейства эндогенных провирусов кур-сопоставлении с другими элементами этого класса выявит закономерности их изменчивости.

Предполагалось, что в результате реьения этих задач, удастс составить представления о существующем разнообразии, динамик изменчивости и направлениях эволюции отдельных, выбранных качества экспериментальных моделей мультигенных семейств, что, соцостгвлеши с другими сведениями, восможно, позволит лучд

понять закономерности эволюции генома.

Научная новизна, в ходе выполнения исследований было впервые доказано закономерное участие амплификации геноа в возникновении множественной лекарственной устойчивости; разработаны метода выявления и клонирования неизвестных амплифицированных последовательностей; клонированы протяженные участки ампликонов (амлликон -единица амплификации), в которых идентифицированы транскрибируемые последовательности; впервие показана закономерная эволюция ампликонов, заключающаяся п постепенном выпадении из их состава нефункциональных участков ДНК. Была определена хромосомная локализация гена mdr джунгарского хомячка, объяснившая закономерную эволюцию кариотипа резистентных клеток, происходящую при формировании! нового мультигекного семейства. Впервые показано, что амплификация генов МЛУ может происходить не только in vitro в культуре ткани, но и в организме в ходе экспериментальной химиотерапии.

Выявлены различные виды полиморфизма генов рРНК человека; найдено 8 структурных вариантов нетранскрибируемого спейсера (НТО} генов рРНК (3 - впервые); продемонстрировано сцепленное наследование и кластерная локализация генов рРНК, принадлежащих к одному структурному варианту; разработан комплексный молекулярно-цитологический метод хромосомной локализации структурных вариантов; обнаружены значительный гчриации в числе копий генов рРНК человека, связанные с амплмфкк?''.:'--!! и утратой отдельных структурных вариантов генов.

Выявлено широкое разнообразие локусов эндогенных провирусов кур: значительные вариации п числе копий; получена линия жизнеспособных кур, свободных от эндогенных провирусов класса ev; подробно охарактеризованы структура, распространение и экспрессия 10 локусов эндогенных провирусов {в результате число изученных генетических элементов этого класса достигло 29), что позволило выявить ряд закономерностей их изменчивости и обсуждать принципы взаимоотношений геномов вируса и организма, влияние эндогенных провирусов на фенотип. Выявлен новый класс повторяющихся последовательностей ДНК кур, отделенно родственных геному вируса лейкоза птиц.

"з;

Практическая ценность. Клонированы последовательности, ампли-$щщфованшб в клетках, обладающих МЛУ, которые можно использовать в качестве зондов для изучения генетических основ лекарственной устойчивости опухолей. Клонированы гены рРНК человека.Разработан? ноше методические подхода: метод выявления и клонирования неиз- } вэстных амашфядарованшхх последовательностей, хромосомой локализации отдельных структурных вариантов генов рРНК и бффэктивный метод определения тканеспецифической экспрессии генов на гистологических срезах, перенесенных на нитроцеллюлозу (гастоблоттинг). Создана новая экспериментальная модель - линия кур» свободных от эндогенных провирусов класса ev.

Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на совместной научной конференции лабораторий иммунологии онкогенных вирусов, иммунохимии, цитогенетики и механизмов канцерогенеза Hiüí Канцерогенеза ВОНЦ АМН СССР в феврале 1988 г. и на заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова в апреле 1988 г.

Основные результаты исследований докладывались на IV симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома" в октябре 1981 г.; на V Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва,IS83 г.; на Всесоюзных совещаниях по генетике соматических клеток в культуре, Звенигород, 1983 и 1986 гг.; на т Всесоюзном биохимическом съезда, Киев, 1966 г.; на I Всесоюзном съезде медицинских генетиков, Киев, 1966 г.; на Всесоюзном съезде гаштЕков и .селекционеров, Москра, .1987 г.; на Всесоюзной, конференции "Молакулярная биология генов высших организмов", Москва» 1987; на П Международном симпозиуме по молекулярной и аштечной оякобиологии, Таллин, 1988; а также неоднократно на Московском симинаре вирусологов (МГУ), семинаре Института кшекулярной генетики АН СССР и семинаре "Хромосоыа" Института молекулярной биологии АН СССР.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.00ПЩ9 методические подходы и принципы

Несмотря на различие объектов исследования (геном человека,курицы и линии клеток грызунов), при их изучении использовали принципиально сходные методические подхода. Определяли основные характеристики семейства генов: его состав, структуру отдельных членов, численность, хромосомную локализацию, а также параметры изменчивости: рестрикционшй и структурный полиморфгзм, генетическую стабильность, характер наследования, вариации численности.Эти вариации определяли либо внутри геназ индивидуума( внутригеномный полиморфизм) или клона клеток, либо популяции организмов или в ДНК разных клеточных линий (менгеномный полиморфизм). Эти задачи решали с использованием методов молекулярного клонирования, рестрикционного анализа, Слот-гибридизации ДНК и РНК. гибридизации 1л situ метафазных хромосом и гистологических срезов тканей с клонированными ДНК-зондами.

2.Амплификация генов в клетках, обладающих МЛУ: возникновение и изменчивость нового мультигенного семейства

Амплификация специфических участков генома закономерно наблюдается в тех случаях, когда выпивание или приобретение клетками селективных преимуществ связаны с повышенной экспрессией одного или нескольких генов. Клетки, в которых происходит •амплификация генов, можно рассматривать в качестве модели возникновения и эволюции мультигенных семейств. Они представляют интерес для изучения формирования единицы амплификации (ампликона), хромосомной локализации амплйфицированных последовательностей, их изменчивости, взаимодействий ампликонов внутри клетки и т.д. В НШ Канцерогенеза ВОНЦ АМН СССР Б.П.Костиным, Е.С.Какпаковой, Ю.С.Массино, А.А.Ставровской и др. было получено большое количество клеточных линий грызунов, селекционированных на устойчивость к высоким концентрациям колхицина, актиномицина D, адриабластина '. и обладающих МЛУ. МЛУ -резистентность опухолевых клеток одновременно к большой группе неродственных соединений (колхицину, виикристину, актиномицину D пуромицину, адриабластину/ этидиум. брсмиду и др.), возникающая вне

зависимости от того, какое конкретно соединение было использовано в качестве селективного агента. МДУ обусловлена понижением накопления перечисленных соединений в клетках, которое связано с активным 8нергозависимыы выбросом цитостатиков из клеток (см.СиЦ-ко* До рп1д, 1985,19874М*; Гудков.1987). Анализ кариотипа резистентных клеток показал наличие у них структур, которые являются характерными местами локализации амшшфицированных генов -хромосом с длинными темными гомогенно окрашенными областями (НБИа) б двойных микрохромосоы (Шэ) (Корп1л,1981, Копнин и др., 1962). Предстояло, не имея гибридизациокных зондов и не зная генов, вовлеченных в создание МЛУ, получить доказательства шшш&шации генов в резистентных клетках с тем, чтобы приблизиться к пониманию генетических основ ЫЛУ и исследовать сам феномен генной амплификации. В выполнении этого раздела исследований принимали участие Б.П.Копнин, О.Б.Чернова. А.Р.Назаров и др. соавтора цитируемых публикаций.

2.1.Выявление и клонирование последовательностей, амплифицированных в клетках, обладающих Ш1У

Мокно было использовать различные подходы к выявленш шядафщированных участков ДНК: идти к генам через их белковые продукта шш использовать сам факт умножения фрагментов генома. М) действительно обнаружили методом двумерного электрофорез: гиперпродукцшо резистентными клетками белка с мол. массой 22 кД и изоэлектрической точкой 5.7 (Полоцкая и др.,1983). Однако, дл клонирования амшшфицированных последовательностей был выбран дру гой путь.

Первые косвенные доказательства амплификации генов в клетках обладавших МЛУ, были получены в опытах по трансфекции, в которых помощью ДНК из высокоустойчивых к колхицину клеток удалое переносить в клетки дикого типа лишь низкие уровни резистентности (Си<1Коу е1 а1.,1985). Такой результат характерен для признака, кс уорый определяется большим числом генов.. В дальнейи. исследованиях мы исходили из того? что умножение определенно участка клеточной ДНК означает появление нового класса повторов геноме, который можно попытаться выявить гибридизацией в уелоеш конкуренции или обогатить, провод*, ступенчатую саморенатурац

ДНК.

Действительно, в блот-гпбрвдизации с Р-ДНК резистентных клеток в присутствии большого избытка ДНК клеток дикого типа удавалось выявлять в геноме резистентных клеток дополнительные фрагменты,соответствующие новому классу повторов (Гудков,Когшин, 1983). Этот метод обладал низкой чувствительностью, и, чтобы усовершенствовать его, мы занялись получением пробы, обогащенной амплкфицированными последовательностями в результате фракционирования ДНК из высокорезистентных клеток дм®^ (колхицин-устойчивые производные линии клеток днунгарского хомячка ДМ-15, а 700 раз более устойчивые к колхицину, чем исходные клетки) по скорости саморенатурацин. Разделение одно- и двуцепочечной ДНК проводили хроматографией на оксиапатите; фракции, отяигавдиеся з различных интервалах значений C0t, метили ник-трансляцией [32р] и использовали в качестве■зондов в конкурентной блот-гибридизации с рестриктированными образцами ДНК чувствительных и резистентных клеток. В результате была получена flHKCot 40-250° к0Т0Рая в Условиях конкурентной блот-гибридизации выявляла в ДНК клеток исходной линии ДМ-15 несколько фрагментов (в частности, рестрикционныэ фрагменты ДНК митохондрий), а в ДНК производных ДМ-15, отобранных на резистентность к колхицину, актиномицину D, адриабластину з обладающих высокими уровнями МЛУ, - десятки как общих, так я различающихся по подвниности фрагментов. Таким образом, в •®®Coti0-250 оказался обогащенным новый класс повторяющихся последодовательностей, закономерно появляющийся в клетках, обладающих МЛУ. Гибридизвция in situ 3H-JIHKCot10_2S0 с препаратами метафазных хромосом высокоустойчивых клеток показала преимущественную локализацию гранул серебра над маркерными хромосомами, несущими длинные HSRs (ГудкоЬ и др. ,1986; Gudkov„Kopnin,l987).

Таким образом, методом конкурентной блот-гибридизацш и- гибридизации in situ с помощью полученного ДНК-зонда (ДНК'Соt^0_250) было продемонстрировано появление нового класса повторов в клетках даунгарск огй хомячка ¿'обладающих' МЛУ в-результате селекции разными агентами. Эти последовательности локализованы в HSRs.

..; В ходе выполнения этого/ этапа работы мы Столкнулись с .интересным" явлением: во всех независимых линиях клеток, 'селекционированных-колхицином (но не актйчомицином D), обнаруживалась. фракция ДНК, представленная в значительно (20-50 раз) меньшей

степени в клетках дикого типа, локализованная вне хромосом и способная реплицироваться вне s-фаза клеточного цикла. Эту ДНК ш некоторое время ошибочно пригашала за ашлифицнрованные клеточные последовательности (Копшш, Гудков, 1982). Однако, ее детальный анализ показал, что ото - ДНК микоплазмы, ассоциированной с устойчивыми клеткаж, роль которой в возникновении резистентного фзЕотнпа в наетожцоз время изучается.

Используя даСоЬ1о_250 ú качестве 'и клонировали из

сконструированных на фаговом векторе Харон 4А библиотек генов клаяок ДМ5/1° к даакт_12(нро;:зводаыо ДО-15, высокоустоСчише к колхицину и актиношщипу D) фрагменты амшафцяровашшх последовательностей (Чернова к др., 1987; Gudlcov ot al., 1937). Скрининг библиотек проводили, ггбридкзуя идентичные отпечатки фаговых бляшек с о_25о 113 чувствительна и резистентных клаток. Отбирали клоннр гибридазущкося с первым. но не со вторым зондом, фаговую ДНК мотшш ж гибридазовали с ДНК чувствительных и резистентных клеток. Из ДНК клонов» содержащих амолифвдированнке последовательности 0 переклонировали в плазыиды фрагменты, свободные от частых повторов, к использовали их в качестве зондов для дальнейших исследований. Таким способом было получено 5 неперекрывающихся фрагментов геномл, содержащих более 50 т.п.н. ашлифицированных последовательностей (Таблица I). Помимо этих клонов, ш такие использовали любезно предоставленную И.Ронинсоном (США) шшзмиду PDK4-.7. содержащую фрагмент гена mdr, а(шшфицированного в клетках китайского хомячка, обладающих МЛУ.

Чтобы понять, содержатся ли среди клонированных фрагментов транскрибирующиеся последовательности, ш провели блот-гибршш-зашо тотальной РНК, выделенной из клеток дикого типа и обладающих МЛ."с u Р-дачешш клонированными ДНК. Помимо клона рШ4.7, кото-puñc как и ожидалось, выявлял 5 т.н. транскрипты.гена mdr даунгар-ского хомячка. лишь один мои - рС52 - выявлял РНК (3,5 т.н.), специфичную душ клеток, обладающих МЛУ (Gudkov et al.,1987).

Таким образом, мы клонировали часть генетического района, аы-шифнцированного в клетках, обладающих МЛУ. Его протяженность - не ызнее 100 т.п.н. (суммарная длина рестрикшюншх фрагментов, выявляемых 6 зондами) и в его состав входит не иенео 2-х транскрибирующихся участков.

г.2.Структура и состав ашлшсонов разлячаютс*-в независимо' полученных лилиях рвзи'стеитньог клетог.

На первом этапе работы било установлено, что клэтке, обладающие !ШГ, содержат в геноме амплпфттроватше послэдоватэлыгостЕ, включающие функционирующие гэны, првдстав.ггпшо в исходном генотипе единичны!® копиями. Следовательно» эти клетки mosho рассматривать в качества прпмора возникновения ds novo мультигенного семейства. Мы попытались, используя клоппроваяше фрзп/вкгп ашликона, определить характеристики этого семейства, сравнить его структуру в разных независим получение ляшин: рознстенткпг клеток. Для этого мы исследовали ДНК сублиний, прсизопгадяиг ? независимых низкорезистентных клонов. Ш начали с аналяза ггпэма высокорезистентвых вариантов, определив степень амплификации каждого из клонированных фрагментов (Чернова и др.,1987; Gua-ov et al.,1987).

Степень амплификации мы определяли по соотношению количеств ДНК клеток дикого типа и обладающих МЛУ, при котором уравгсгваются сигналы на радиоавтографах, соответствуйте клонированным последовательностям. Результаты этих экспериментов суммированы в таблнцэЪ!

Как следует из этих данных, шдшшфицированные последовательности можно разделить на облигатные и факультативные. Облнгаткые последовательности, содеркащиеся в клонах рС52, pDR4.7 и рС8, ам-шшфицированы во всех исследованных на?,и линиях резистентных клеток джунгарского хомячка, независимо от того,'отбирались они на устойчивость к колхицину или актиномицину D. Факультативные последовательности ашлкфицироваяы только в некоторых линиях клеток, обладающих МЛУ. Следует отметить, что степени умножения облигатных последовательностей были одинаковы менду собой и достигали 70-100-кратных значений в клетках, устойчивых к 5 мкг/ыл колхицина (ДМ5Л, ДМ5/10 и др.) или 2 гдкг/мл актиномицина в,(ДМакг). Факультативные последовательности иногда были амшшфицироваяы в меньшей степени, чем облигагные, при этом степень умножения клонов рС18 и рсвб всегда были одинаковы между собой и часто не совпадали .с рС19Возможно, облигатные участки составляют часть амшппсона, включающие гены и регуляторныа элементы, необходимые для .поддержания резистентного фенотипа и/или процесса амплификации генов,, или последовательности, тесно сцедлекные с ними. Факультативные последовательности, вероятно, не . обусловливают изменений

З'а&жща I. Степаия шшшфянацж клоаяроаанннх посладоватааьнеетвй а раажвчншс яятж£ о&аадааднх МЛУ

ЮГОЕШ

Япвиа клецек (а екобках ~ егемгш ^втоа^азкзгя)

Навва- Ш0 Равшр . | во тешет ■ (?„п,н,) . ! Ш-15 (1Д) „0.1/1 (202) га1.'1 (170х) Ш2'1 (400х) С750х) ВИ5'2 (750) „„5/5 (750х) Ш?'7 (750х) (750х) р^асЬ-Ю (>2000) "X - (>20005

рС8 4,3 1 2 20 40 80 40 80 80 60 100 • 100

р<П8 20 1 2 20 40 80 1 30 2 1 1 1

рС19 7.0 1 2 20 20 6 1 1 1 30 100 » 100

рС52 4,5 1 2 20 40 80 40 80 80 80 100 100

рОВб 16 1 2 20 40 80 1 30 2 1 1 1

рВВ 4.7 4,7 1 2 20 40 80 40 80 80 80 100 100

, Ь-53 ----------------- и* РЗвв*® ■ ■ ■ РЗвв1*

1 1 1

. 1 1 1

■ :5о 50 50

.1. 1 1

;5р 50* 50

®Часть вмплифицированных последовательностей перестроена

^Степени устойчивости не определяли. Судя по изменениям накопления цитостатиков, клетки имеют типичный фенотип ЫЛУ

фенотипа и коамглифицирукгся с облигатными.

Как соотносятся между собой структуры амгошконов и соответствующих участков генома нормальных клеток? Как следует из результатов блот-гибрадзации, в ходе амплификации обычно сохраняется физическая карта ДНК, однако, тногда, наряду с ожидаемыми фрагментами, выявляются дополнительные перестроенные участки амплифицированной ДНК ( Таблица I). Такие примеры показывают, что раз возникнув (иногда в перестроеном виде) , ампликон становится матрицей для следующих раундов репликации. Тасая "амшшфикационгая память" может быть важным фактором, обеспечивающим гомогенность состава мультигенного семейства - семейства ампликоьл резистентных клеток.

Итак, независимо полученные линии резистентных клеток различаются посоставу и структуре амплифицированных последовательностей. Эти разлишя, по крайней мере, отчасти "вязаны с тем* что сформировавшийся ампликон служит матрицей для последующ® ¡радядаз амплификации.

2.3.Закономерная эволюция ампликонов в ходе ступенчатой селекции

Мы пытались определи.ь, настолько стабильна структура аьлли-конов, насколько она определяется гяучайностью формзпюватг первичного ампликона при селекции клеток на МЛУ. Для этого мы определяли динамику амплификации различных клонированных последовательностей в различных независимых рядах селекции - в клетках шести клональных линий, находящихся на разных ступенях селекции (Гудков и др.,1987;оисШ:оу е! а1.,1987). Результаты этгх эксперименоЕ представлены на рисунках 1,2 .

Первым был изучен ряд ДМ-15 ■*» м 0,1/1 ДМ1/1 ~

ДГ.Г^. (Принципы обозначения здись и кике: знаменатьлъ индекса -номер исходного клона резистентных клеток, числитель - селективная концентрация колхицина в мкг/мл). № определили степени амплификации каждой из 6 клонированных последовательностей в ДНК всех сублиний. Оказалось, что для большинства клонированных последовательностей (5 из 6) наблюдается прямая корреляция между степенью их умножения и уровнем МЛУ (рис.1). Однако, тля одного из клонов (рС19) тг.кая корреляция отсутствовала. Число копий этой

Еос^одоваг-эльяостн возрастало вместе с остальными на первых ступенях селекции (см. рис.1) вплоть до линии ДМ*''1 (примерно 170-кратдая устойчивость). Затем амплификация этой последовательности прекратилась.' в клетках ДМ2^, также как и в ДМ1^» наблюдалась .примерно Х20-:сратная амплификация рС19; а затем число ее копий в генома даш ггтхишосъ (ло 4-краткоЛ - в клетках ДМ5/1).

СТЕПЕНЬ АМПЛИФММКШМ

О-в Зг.»ЕМ А-1С19

Э * з «а

КОЛХИЦИН, Г|

Рис.1.Динамика амшшфикации разных частей ампликона в ряду ДМ-15 -*~да50Л (пояснения в тексте)

Насколько закономерны выявленные изменения? Могут ш утрачиваться (или возникать) другие участки ампликона? Чтобь ответить на эти вопросы, мы исследовал;! ДНК из клеток, относящих« к другим рядам независимой селекции. Количественная интерпретацш этих результатов представлена на рис.2, где исследовании! фрагменты амплшсонов представлены столбиками, высота ко тори пропорциональна степеням амшшфикации. Таким образом, соста: шшшфщированных последовательностей разных линий клето: описывается набором из 6 столбиков, соответствующих 6 гибрвдизаци оеньш зондам. Положения этих наборов относительно горизонтально оси соответствуют степеням устойчивости клеточных линий или стада селекции. В 1-м ряда сверху показано изменение ампликонов в ряд клето:: ДМ-15 -»-ДМ5 , во 2-ом - ДМ-15 — ДМ5'5 и т.д. В 2-х нижи строчках показан состав гмшшконсз клетсч ДМакт-1^ и

Аншег dtîiz даншс. показывает., что сокращ»'- '.в чясла копий факультативных ошлшиштовашис: гослвловательност^З происходят к в других случаях и может затрагивать сезавасиио разные *:астЕ адшшкона. Маркером одаоР из таких частей является последовательность клона pCI9, а другой - клонов pCIS и р£Ш8.

abcder abcdpi

JT^'a.

_ППП Г? Ягл-у*-_

a Ь с cj е

H/V»

0,23 (50*!

Uno* !

лЖЛ.

Iсо ряс.2. Схеьсзгкчьсков йгоОргиапо пзмекевкй амшшкгюв в раккп: рядах селекции. Поясдаигд в гокс-' го. Клетки лили:;

¡м (I) -

^ (g) _ 1уг0-/£-'°

JElt (3) яР^па^т.

.„.t. ' (4)

iscapl/s ._д^«сар5/Б,

ш ib

-ДМ5/1:

,12о(5) да."

50 (3)" Д'СЙ?1А

ст i да

,пкт-1С„

„ДПСЩ55/4.

(Si Л!

ÏWÎOÏI13г ь. - pC13; b - рСВS; е-е

облнтатшкг Еослздзватагнюсгщ £ - r-c-iç.

й-ак, прекращение шяшфжащш зли утрата гшяяфшфовашых. факультативных последовательностей закономерно происходят в ходе селекции на МДУ. Тем не менео, врэш я скорость утраты строго не определены и различаются в разных рядах селекиъл.

С чем связаны различия в степзни амплифякацы! обшгатнше п факультативних частей тзитовов? Одна из розмокнсстей состоит в том, что в популяции резнегентпых клеток вознзпиет гетерогенность: часть клеток содераит длинные амнликоны» • часть - короткие, утратившие факультативные фрагменты. Реальность с:экой возиояностн была продемонстрирована в работе Roberts, Axel (1982), где било показч-но, что уникальные делеции быстро распространялись по всем ампликонам внутри одной клетки. В на^ем случае, однако, анализ '¿Q клеточных клонов, полученных из линии ДМ^^1, доказал, что в геноме

200 >1

каждого 13 них наблюдается одинаковое соотношение степеней умножения последовательностей рС52 и рС19 (20:1). Это означает, что гетерогенность ампликонов - характеристика каздой клетки г популяции ДМ5/1. Установленные факты согласуются с гипотезой с зом„ что в ходе селекции воишкают более "экономичные" ампликоны, которые содержат меньше балластных факультативнш последовательностей и постепенно вытесняют первичные.

Прояснить важные особенности изменчивости ампликонов удалое! в результате изучения ДНК из сверхвысокорезистентшх клеток, порученных в результате дальнейшей селекции Р.Абдрашитовым клето! линии ДО*' (СийКоу, Корп1п,1988). Динамика изменения степеш амплификации разных участков ампликонов показана на рис. I. Видно что почти полностью "деамшшфицированные" в клетках ДМ5''* последо; вательности клона рС19 вновь начали амшшфицироваться в ряду ДМ5,/' да150/1. причем с сохранением примерного соотношения числа копий < обчигатными последовательностями 1:15. Интерпретация эти: результатов дана в схеме эволюции ампликоноь (рис.3). Согласа этой модели, сначала формируются протяженные ампликоны, зате: случайно появляются более короткие варианты, которы амплифицируются, а затем вытесняют первые. Наконец, образуете полиамшткош, включающие как первичный, так и вторичный вариант в составе одной умножающейся единицы.

Л | А | и-*'-

. I М^М^

»-■■.■ЫПНЫПЫ

Рис.3. Схема эволюции ампликоно! в ходе ступенчатой селекцш (гипотеза)

Каков механизм замещения одного ампли::она другим? Возмок» это явление объясняется продемонстрированной ньми ран нестабпьностью наследоьания амшфшироврнных генов ССорп1п а1.,198^). Если в одной клегке сосуществуют две "субпопуляци ампликоног, то в силу нестабильности наследования будут чаОл.одат

ся флуктуации численности каждой из субпопуляций„ но при этом" общая численность генов будет поддерживаться на определенном уровне отбором. Поскольку селективное преимущество получают клетки, имеющие меньшие количества ДНК, они будут постепенно доминировать в популяции, что на молекулярном уровне будет выглядеть как замещение одного ампликона другим.

Таким образом, структурная индивидуальность новых мультигвнных. семейств в клетках, обладающих МЛУ, формируется в результате взаимодействия нескольких факторор: случайности состава и структуры первичных ампликонов, "амплификационной памяти" и нестабильности наследования ашлифицированных генов, ведущей г замещению одних вариантов амгпиконов другими.

?.4.Размер ампликонов

Как мы убедились, структура ампл.псо::а может быть сложной и претерпевать изменения в ходе эволюции клеточной популяции (селекция in vitro). Поэтому оценивая размер амшшфицгрувдвйся последовательности, мы, строго говоря, определяем не длину ампликона, а протяженность ДНК, приходящейся на дополнительную копию генов устой'згоост::.

Клонированные нами фрагментн ампликона вместе с клоном гDR4.7 выявляют несколько болео 100 т.п.н. ДНК (суша длин рестрикционных фрагментов, выявляемых в блот-гибридизации). Эта величина - шшшй предел в оценке размеров ампликона. Другой путь подсчета основан на следующих соображениях: степень амплификации ДНК облигатных клонов в клетках ДМ5^1 - около. 70. Это означает примерно 140-кратное умножение одного из аллельных участков, формирующга ампликон. Как показала гибридизация iu situ, эти 140 копий занимают около 5-10% общей длины всех хромосом, что при условии примерно одинакового содержание ДНК на единицу д,лш хромосом должно соответствовать 1,5-3'Ю5 т.п.н. Тогда на одну копию ампли-фицированной последовательности приходится около 1-2"I03 т.п.н. Несовершенство этого способа оценки может бы'гь связано с различным содержанием ДНК в разных частях хромосомы. Однако, поскольку в резистентных клетках джунгарского хомячка E3Ra состоят из поздно-решшцирующихся более конденсированных хромосомных участков, можно думать, что подсчитанная величина являемся скорее заьтжвнной, ,гем

завышенной (Чернова и др.,1987; audkov.Kopnin.1987). Отметим, что длина НБИа в клетках примерно _ соответствует таковой клеток

да5/1 (Корп1п ег а1.,1985) и, следовательно, длину амплифициро-вашого сегмента в их геноме можно оценить в 3-7"103 т.п.н. Таким обрезом, в ходе селекции ДМ^1 -»-ДМ5/1 утрачено около 3/4 исходно ашишфицироганных последовательностей.

2.5. Хромосомная локализация исходной копии ашлифщированных последовательностей

Ранее Б.П.Копнин обнаружил (Копнин,1982: Корп1п вt а1.,1985). что а годе селекция клеток даунгарского хомячка на МЛУ наблюдается закономерная эволюция кариотнпа: трисомия по хромосоме 4 на первых ступенях селекции, формирование' НБНа в определенном сегменте длинного шеча одной из хромосом 4, удлинение НБИз, нарушение стеСнльвооти кариотипа и перемещения НБИа на другие хромосомы набора (преимущественно 5,7,9), стабилизация или даже сокращение длены НЗКа, локализованных на 1-4-х хромосомах. Чтобы понять молекулярные основы этой эволюции, . мы локализовали последовательности клона рШ4.7 (фрагмент гена т<1г, облигатная часть вшишконр) на хромосомах эмбриональных фибробластов даунгарского хомячка (Сокова и др.,1988). Результаты анализа распределения гранул серебра над хромосомами 50 метафазных пластинок после гибридизации 1п вitu с 3Н-ДНН р№4.7 показаны на рис.4 (эксперименты по гибридизации 1п вitu выполнялись совместно с Е.Ю.Сияновой и 0.И.Соковой (Сокова и др.,1988)). ,

1 ■

Рис.*. Анализ распределения гранул серебра над хромосомами даунгарского хомячка после гибридизации ^ си с %-ДНК р1Ж4.7 (фрагмент гена пот)

Хорошо видно, что гранулы преимущественно располагаются над сегментом qi5-q22 длинного плеча хромосомы 4 - тем самым сегментом, который замешается ESRe в ходе селекции на МЛУ. Следовательно, мультигенное семейство, включающее амшшфищрованные гены mdr и сцепленные последовательности, формируется исходно в том участке хромосомы, где локализована исходная копия емшшфици-руемой последовательности, а первым этапом амплификации является трисомия по хромосоме, несущей ген mdr. Однако, длинные HSRs на хромосоме 4 оказываются нестабильны и перемешаются на другие хромосомные сегменты, критерии выбора которых неясны.

2.6. Амплификация генов МЛУ монет происходить in vivo в ходе химиотерапии опухолей

Чтобы определить, мохет ли быть устойчивость опухолей к химиотерапии связана с теми же процессами изменчивости генома, что и при селекции in vitro, мы исследовали ДНК из клеток перевивной опухоли мышей Р388, устойчивых в результате экспериментальной химиотерапии к терапевтическим дозам антрациклинов - рубомицяну (вариант Р388гЬ) и рубоксилу (РЗШ1^1) (линии получены и любезно предоставлены нам Н.С.Демидовой). Фенотшшчески эти клетки напоминали другие, обладающие МЛУ, поскольку значительно хуке накапливали меченые соединения "МЛУ-ряда" (Демидова и др.,1987). Оказалось, что оба гена, входящие в состав амшшконов клеток даунгарского хомячка (mdr и рС52) амплифицированы и в клетках, приобретших МЛУ в ходе селекции in vivo (примерно 50-кратная амплификация) (Демидова и др.,1987; OudJcov et al.,1987; Табл.I).Следовательно, наблюдаемая In vitro амплификация генов' МЛУ, служащая нам модельной системой для изучения возникновения и изменчивости мультигенных семейств, отражает процессы, которые могут происходить и в организме. ••'

2.7. Обсуждение результатов изучения амплификации генов МЛУ

Итак, при селекции клеток на .устойчивость к одному из большого набора гидрофобных, цитостатиков'ртбираются варианты, обладающие множественной устойчивостью - МЛУ. Развитие МЛУ связано с

амшшфжр'даей протяженного района генома, включающего ряд генов, характеристики которых были получены ь работах зарубежных авторов {т. 0ег1асЬ е% а!.,1986), проводивших независимое клонирование и изучение амплифицированных последовательностей в клетках, обладаю-вдх МЛУ (в основном кодирующих последовательностей). Главную роль в создании резистентнэго фенотипа играют гены тйг, продукты которых ~ трансмембранные гликопротеида, родственнее прокариоти-ческим пэрмеазам, видимо, являются энергозависимыми насосами, выбрасывающими токсические соединения из клеток. Роль остальных генов (а их обнаружено еще не менее 4-х) неясна, возможно они не участвуют в создании МЛУ. Нас же интересовала сьотема МЛУ в качестве модели для изучения возникновения и эволюции нового мультигенного семейства, существование которого диктуется необходимостью снабжения клетки большими количествами определенного продукта - семейства, аналогичного семействам генов рРНК, гис-товоз и т.д. В рамках этой аналогии каждую независимую таюнальную клэточную линию можно сравнить с дивергировэвпшми и независимо эволюционировавшими видами организмов. Возможно,что особенност структуры известных мультигенных семейств (типа рРНК и т.п.) сложились в хода эволюции в результате реализации тех же закономерностей, что и при возникновении и изменении амшшфициро-вашпх генов. Последние же можно сформулировать следующим образом: 1)вмшшфицируетс»» протяженный участок генома, содержащий, помимо необходимых для выживания последовательностей, сцепленные с ними -факультативные; 2)состав и структура ампликона строго не оцраделешг и могут быть случайными: 3)раз возникший амшшкон слуит матрицей для последующих раундов амплификации, определяя индивидуальность и относительное единообразие гновь возникшего семейства последовательностей; 4)могут возникать измененные варианты .'¿хликоков, способные вытеснять первичные, вероятно, в результате нестабильности наследования амплифицированных генов, что может приводить к смене одного типа амшшконов - другим л интерпретироваться как "согласованная эволюция"; 5^модифицированные гены локализуются в месте расположения исходной копии гена с последующим "расселением" кластеров генов по неслучайны?, хромосомным локусам; 6)на поздних стадиях амплификация может осуществляться протяженными сегментами, включающими несколькс первичных амшшконов. Э^и особетности амплификации генов ,АЛУ I большинстве звоем, вероятно являются закономерностями, поскольку

подтверждаются независимыми наблюдс-нн/ки, сдел£нш:гл при изучэягя других модельных систем (см.stark,lTahl,1S8S). Чтоб« псжггь, в какой степени обнаруженные явления сходны с тег,та;, которые происходят в реально существующих мультатекпнх сеиэйстзах» рассмотри« результаты изучения изменчивости одного зз пгпг. - секзйства генов рРНК человека,

3.Изменчивость нетранскрибируеглк. спойсоров генов pFHK человеке

Гены рИНК человека представлены в геноме несколькими септят копий тандегяю повторяющихся последовательностей, включакляг транскрибируемый и более протякешый не транскрибируемый участок (спейсер - КТО). Эта тандемные повтора образуют кластера на 5 парах акроцентрических хромосом (ядркиковых организаторах - ЯО), Транскрибируемые последовательности высококонсерватпвны а «ало различаются даг;е у представителей фллогенегспески отдалэяпдх шдов. НТС, напротив, дивергпрованн и характеризуются существопЕГм пзявидовым и незначительны;.? внутривидовым полиморфизмом.

Одна из основных проблем генетики мультигешшх семзйсгз тпша рРНК - Еысокая внутривидовая гомогенность семейства, чрезвн'к'Зноб сходство разных членов семейства в гекокэ одного вида кезду собой при существенной кеявпдовой дивергенции тех ко последовательное-' тей. Для объяснения этой гомогенности обычно привлекают представления о генной коррекция я "концертной" (согласованной) эволюции, точные механизмы которых,, несмотря на обилие гипотез, неизвестны (см. Dover,1986). Приблизиться к пониманию этих процессов можно, изучив особенности изменчивости . генов рРНН. Исследования такого рода проводились з основном' на- генах рРНК дрозофилы и растений. С этой точки зрения гены рРНК млекопитающих и человека не были изучены достаточно подробно. Мы пытались решить следующие задачи: I Определить вида и масштабы полиморфизма генов рРНК; 2)изучнть, как возникают структурные варианты генов рРНК, как они распространяются по семейству,, как взаимодействуют друг с другом. Исследования этого раздела.-.(¡tum проведены совместно с И.В.Гарькавцевым.

3.1. Полиморфные районы генов рРНК человека

Ранее было установлено, что отдельные участки генов рРНК человека характеризуются полиморфизмом, который проявляется в вариации размеров рестрикционных фрагментов (см. Ыап<5а1,1984). Мы стремились определить пределы этого полиморфизма и охарактеризовать районы изменчивости. Для этого было необходимо получить ДНК-зонды на разные участки рДНК.

S В В Е в В Е

• П ) .! ' ' 1

13$ 28S ¡MTS -1

рА

Ikb

Рас.5. Физическая карта фрагмента гена рРНК человека.

Еирные линии - участки, соответствующие 18 и 283 рРНК. КГБ - нетранскрибируемый спейсер. Сайты рестрикционного гидролиза: г 2 - ЕооИ1; В - Ват Н1; 8 - &ва*. I V - вариабельный участок. Отрезками помечены клонированные фрагменты.

Фрагменты гена рРНК человека, клонированные в нашей работе, представлена на рис.-5. Эти последовательности были клонированы из банка генов гепатомы Александера (получен и любезно предоставлен Н.О-Незвановым). Скрининг рекомбинантных фагов (штамм Харон 4А) еолз методом гибридизации отпечатков с 32Р-кДНК 18S и 28S рРНК дкунгарского хомячка. Клонированные фрагменты НТС рДНК были нам любезно предоставлены Р.Идикелем (США).

Для изучения гетерогенности различных областей рДНК мы исследовали ДНК лвдей, не связанных родством, сравнивая наборы рестрикционных фрагментов, выявляемых разными зондами (Гарькавцев, Гудков,1986). Применение 6 рестриктаз для анализа ДНК нескольких дэсятков индивидуумов не выявило полиморфизма транскрибируемой области рЦНК. Анализ НТС показал наличие минимум двух полиморфных районов, расположенных справа и слева от генов рРНК. При этом наборы рестрикционных фрагментов вариабельной области- бит-идентичны в ДНК разннх людей (внутригеномный .полиморфизм)/,-в'-то'

. 2Q.

время как состав структурные вариантов 3*-концевого гетерогенного участка различался в геномах изученных индивидуумов (меагеномиый полиморфизм). Дальнейшие исследования были посвящены изучению этого вида полиморфизма, который, как было установлено Кг1окбопь БсЬт1кв1(1985), обычно связан с различным содерпанием 800-нуклэо-тидного повтора в части НТО, прилеганиего справа к транскрипционной области. Соответственно, в нашил экспериментах, этот полиморфизм выранался в появлении на радиоавтографах гидроли-зованной Ваш Н1 ДНК (рис.5) различных наборов дяскретшх полос после гибридизации с 3аФ-ДНК рАВГ!. Всего мы обнаруетлн 8 структурных вариантов этой области НТО, 2 из которых (6,8 п 7,6 т.п.н.) присутствовали в геномах всех 54 изученных людей, остальные встречались с разной частотой и в разных сочетаниях. 3 из них ранее описаны не были. Их относительно высокая частота встречаемости в исследованных образцах ДНК, по-видимому, отранает особенности генотипа изучаемой популяции (большая часть экспериментального материала поступила из Казахстана).

Итак, семейство генов рРНК человека гетерогенно по структуре НТС. В ДНК каждого индивидуума присутствует несколько классов структурных вариантов. Структурное разнообразие определенных районов НТС означает, что темпы изменчивости отдельных участков "ри-босомного повтора" выше, чем скорость "гомогенизации" мультигенно-го семейства. Следовательно, структурные особенности НТС маркируют отдельные части семейства генов рРНК и позволяют следить за их появлением, распространением шш исчезновением.

3.2. Вариации численности генов рРНК

Помимо структурного полиморфизма, мы наблюдали.. значительные вариации числа копий генов рРНК, принадлежащих . к' разным структурным вариантам, в геномах разных индивидуумов (Сагка^зеу et а1.,1988). Мы провели количественную оценку числа копий структурных вариантов, сравнивая сигналы на радиоавтографах ДНК человека и ДНК клонированного фрагмента рАВЕ, взятых в разных разведениях. Наиболее стабильным был вариант 7,6 т.п.н. (100-200 копий на Неточный геном);'' численность 'остальных могла варьировать от ~10 до Нескольких сот копий. При Зтим не всегда наблюдалась корреляция между частотой встречаемости варианта и его копийностыо.

Обдан численность генов рРНК также существенно различается у разнил. индивидуумов: в двух образцах ДНК содэркение генов. рИН в 2-3 раза превышало средние значения этой величины в ДНК человека. Ваню откатить, что в обоих случаях это превышение было связано с амплификацией генов, прпнадяеяадах к одашу структурному варианту.

а.о. Наследование структурных вариантов НТС генов рРНК человека

Как часто возникают ноша структурные варианты? Как ош наследуются? Как она организованы в геноме? Мы надеялись ответить на эти вопросы, изучая генош членов семей - родителей и их детой.

В результате анализа ДНК представителей II семей ш установили: 1) генош потомков всегда содергсали комбинации родительски* структурных вериангоз; ш не обнаружили появления в потомстве ковах вариантов; 2) гени рРНК, принадлежащие к родео:,«у структурному варнаку к прнсутствувдао в ДНК лишь одного из родителе!?, наследуются сцашзшхо друг с другом с сохранением своей численности и чу-его ЕзаалзсЕго от других структурных вариантов как единый генети чоскеё .-:окус (рис.6).

Л™4) Г"~п1 г-~1 г—

Рис.6. Анализ наследования структурных вариантов генов рРНК в одной из се^ей. Гидролиз ДНК Бот Н1; гибридизация с ДНК: I- - ыатери; 2 - отца; 3-6 -детой. Два структурных варким генов рРНК отца независимо распределились в потомстве (и)

8ти наблюдения доказывают, что структурша варианты геног; рИЖ человека, по-вйдвшиу, образуют относительно стабилыас наследуете кластеры на отдельных ядршшообразувдше хрошеоиог №0). Существование структурных вариаций и вариаций численности поадзывЕог, что возникновение новых или 8ышшф1кащш отдельна структурных вариантов иногда происходит, но это - редкие события, коеосж не удалось зафиксировать в ходе сеиейного анализа.

г&

3.4. Хромосомная локализация структурных вариантов КТО генов рРНК человека!

Предполокение о кластерной локализация генов рРНК, принадлежащих к одному структурно?»? варианту» требовало независимого подтворздения методами, способными различать структуру генов рРНК на отдельных ЯО. Кроме того, представляло интерес выяснить, есть ли законсморнзя связь конкретных структурных вариантов с конкретным! хро!.;осома!.ш. Разрабатывая такой метод, ш использовали феномен инактивации генов pFIIK, локализованных на отделышх ЯО. Ранее было установлено (НШог ot al.,1977 и др.), что целые кластера гапов "pFEK .могут бить транскрипциокпо неактивны!«!, что сопрсвокдазтс/г ''"¿гатяпрозаЕзем этих генетических районов. Отличить активные и неактивные ЯО коЕНо иэтодом цитологического окрашвашт препаратов; мйтафззпнх хромосом нитратом серебра: гранулы серебра еыпадайт'''"лиаь над транскрпбирувдимися генами рРНК. Отличить мвтилирк ч/цгшхе и Евметплированше последовательности ДНК можно, используя рестршстазы, чуствительные к метилированию сайта рестрикции. Учитывая эта соображения, мы применили следующий подход:

1) используя окрашивание хромосом нитратом серебра, провели поиск индивидуумов с Азш3-негативнкш1 ЯО;

2) методом гибридизации In situ мзтафазных хромосом с ^Н-ДНК рА определяли, содерзат ли лако^-пэгативтае хромосомы гена рРНК;

3) методом блот-габрвдизацип ДНК анализировали геном отобранных индивидуумов, определяя наборы структурных вариантов (гидролиз Bsm BI) и метилирование сайтов рзстртсцин Sal I или Нра II (последовательный гидролиз Вша HI и Sal I или Hps II).

Такой подход мог быть эффективен лишь в том случае, если все структурные варианты генов рРНК в ДНК из клеток с полностью активными ЯО окакутся чуствительш к гидролизу Sal I или Hps II. Анализ таких примеров показал, что это условие выполняется: посла гидролиза второй рестриктазой все Ват Hl-голшэрфзнв фрагменты исчезали. !1ная картина наблюдалась, когда т исследовали ДНК аз клеток людей, несущих ш-ш<газированные кластеры генов рРНК на отдельных ЯО: честь генов рРНК оказывалась устойчивой к гадро.шзу Sal I и Нра и. В трах случаях из 4-х исследованных кэгияирсзан-шэ гены принадлэЕалн к одному структурному варианту.

Полученных сведений недостаточно для того, чтобы определить,, существует ли специфичность в хромосомно!! локализации отдельна; структурных вариантов - это покажут последующие исследования. Мох:-но лишь утверадать, что предположение о кластерной локализации структурных вариантов генов рРНК человека, выдвинутое на основ:: результатов изучения их наследования, подтверждается с. использованием независимого подходе.

Таблица 2. Хромосомная локализация отдельных классов структурных, вариантов генов рРНК человека

А^Оэ-нега-1 ЯО, ! ЯО с ре- ! Наборы ! Метилирование

тивные яд- I лишенные !прессирован-!структурных! структурных рышкообра- I генов рРНК I ными ! вариантов ! вариантов зувдие !(гибридизация1генами рРНК !генов рРНК ! хромосомы ! 1п а11;и) ! 5 !

(ЯО) ! ! ? $

I. 13 13 6,0;6,8;7,6 6,8

2„ 15,21,22 15,22 21 6,0;6,8;7,6; 6,0

8,0;8,е

3. 14 — 14 6,8;7,6 6,8:7,6

4. 14 14 6,0;6,8;7,6 8,8 7,6

Итак, несмотря на древность е консервативность семейства генов рРНК, при его анализе выявляются следы процессов изменчивости: наличие многочисленных структурных вариантов КГС, вариациЕ численности, включая амплификацию отдельных структурных вариантов и утрату целых ядрышксоОразувдих районов (см. табл.2).Кластерная локализация структурных вариантов показывает, что процессы "гомогенизации" семейства генов рРНК более эффективны для близкорасположенных генов, чем для генов, локализованных на разных хромосомах

3.5. Причины 'гомргешзацигг мул^йгенных' семейств

Анализ полученных сведений» касающихся генов рРНК -человека ш амшшфицированных геноЕ МЛУ в клетках грызунов, показывает, что есть.много сходных черт в структурной организации этих семейств и их изменчивости:

I) оба семейства состоят из повторяющихся 100-400 раз последовательностей, включающих транскрибирующиеся константные и не--'-

™ранскрибирующиеся вариабельные участки;

2) члвт семейств образуют кластеры на определенных хромо-:омах набора;

3) оба семейства состоят из комбинаций нескольких структурных вариантов;

4) для обоих семейств характерны вариации численности;

5) в ходе независимой эволюции видов организмов или линий •щеток семейства приобретают черты структурной индивидуальности.

Это сходство позволяет предположить, .. что процессы изменчивости, происходящие в обоих семействах, подчиняются общим закономерностям. В случае справедливости этого предположения, особенности семейств, подобных генам рРНК (высокая гомогенность, "концертная" эволюция), могут быть обусловлены не>,бпецяальнш механизмом "генной коррекции", а той ссвок/тгостью генетико-автоматических процессов, которые идут в иомейстее. Главные из них:

амплификация определенного структурного .варианта с образованием кластера гомогенных повторов ("амшшфикационная память" в случае генов МЛУ; кластерная локализация и амплификация отдельных структурных вариантов генов рРВК);

- нестабильность наследования генов семейства (утрата амшшфикационных генов МЛУ в отсутствие селективного давления; утрата отдельных кластеров генов рРНК);

-' способность к межхромосомной траяелокации кластеров амплифицированных структурных вариантов (транслокации ШВз, содержащих гены МЛУ, на определенные хромосомы набора).

Этих трех процессов достаточно (как показали расчеты ома 1981-1986), чтобы в отсутствие специального отбора в геноме вида или линии клеток формировались уникальные гомогенные семейства генов. Действуя вместе, они могут обеспечивать постоянную "концертную" изменчивость членов семейства - явление„ называемое "молекулярным драйвом" (Оо?ег,1982). Отметим, что все три постулируемые необходимые для гомогенизации семейства условия были зафиксированы нами экспериментально. При этом точные молекулярные механизмы умножения отдельных сегментов ДНК (избыточная

репликация, неравный хроматидный обмен") остаются неизвестны. * *

Vn рассмотрели экспериментальный материал, касающийся спонтанных, генетических процессов, идущих в мультигенши семействах "клеточного проксгоадения" и состоящих из сцепленных повторенных сегментов ДНК. Особенности протекания атих процессов связаны именно с организацией подобных семейств в кластеры сцепленно наследующихся и сцепленно перемещающихся или исчезающих генов. Ванным условием является и' отбор, поддерживающий численность семейства на определенном уровне. Очевидно, однако, что установленные закономерности неприемлемы для мультигенных семействсостоящих из рассеянных но геному последовательностей и, вероятно, возникших из исходно автономных элементов. Для них характерны и другие свойства, и другие проблемы, связанные в основном с разрешением вопроса о взаимодействии и совместной эволюции двух исходно чужеродных геномов. Без рассмотрения этих проблем представления о геноме эукариот не могут оыть полными.

4. Закономерности изменчивости генетических элементов ретровирусного происхождения

Рассеянные по геному повторяющиеся последовательности образуют различные по численности и структуре семейства элементов (рет-ропозоны и ретротранспозоны), происхождение которых связано с обратной транскрипцией. Если мультигенные семейства типа генов рРНК являются амшшфицированными "истинно клеточными" генами, то рассеянные элементы, судя по всему, возникают из экзогенных автономных последовательностей, имеющих собственную стратегии и способность к поддержанию и даке увеличению своей численности, за что часто и причисляются к "эгоистичной ДНК" 'Doolittle,Sapienza, 1980; Orgel,Crick,1980). Они составляют более 10% генома позвоночных и безусловно участвуют в процессах изменчивости организмов, в канцерогенезе, хотя и_ влияние на' фенотип организма, роль в видообразовании, в нормальной кизнедеятельности, направления эволюции еще далеко не ясны.

Существует несколько подходов к изучению закономерностей изменчивости этого класса элементов: I) сравнение свойсте элементов со свойствами элемента-прототипа (например, ретровируса, давшего начало соответствующему семейству эндогенных провирусов, ЭЩ, предполагая, что задача закрепления в геноме организма

накладывает на элемент определенные- траОовани»;: 2)> анализ полиморфизма членов семейств с выявлением закономерностей их изменчивости; 3) сравнение эволвдиавно молодых а более, древних элементов для определения эволюционных тенденций в .ix изменчивости. Еще болзе трудной задаче® является определение возможной роли ретротранспозонов в. нормальной жизнедеятельности, а создании определенного фенотипа организма,, р видообразовании -здесь перспективным представляется' создание экспериментальных моделей появления нового класса таких элементов в- геноме организма (Jaeniseh et ai.,1980) или г.в о'Эланаа существующих семейств из генома.

Мы стремились продвинуться в решенн» этих проблем, сосредоточившись на изучении эБолюционда молодого, семейства элементов генома кур ретровирусного 1фоисховдениа - ЭП класса е^.Этот раздел работы был в основном выполнен а соавторстве с ИЛЗ.Обух, М.В.Черновым и А.Т.Тихоненко.

4.1. Общая характеристика семейства ЭП кур (ev-локусы)

В геномах кур присутствуют элементы, близкородственные по своей структуре и последовательностям провирусной ДНК рчрусов лейкоза птиц (ALV) - андогенные провирусы. Известно несколько ev- локусов, которые встречаются с разной частотой и в разных комбинациях. ЭП кур - эяолюционаа молодое видоспецифичное семейство, возраст которого оценивают в 2-5 млн. лет. Разные локусы ЭП обличаются друг от адга не только локализацией, но и различными делециотшад и мутационными дефектами. Часть из них экспрессируется, обеспечивая продукцию вирусных белков - продуктов генов gag (ga-SHTJffen) и'или env (ohi-фактор, gp85) или даже продукцию клвтщмь ¡шфвкционных вирусных частиц - вируса RAV-О. В работах Asfrln и др. было охарактеризовано около 20 локусов ЭП, встречгорхся в геномах кур одной породы - белый леггорн. Мы пр^яещ исследование кур II различных плрод и выявили игроков разнаобрав^в локусов ЭП, существенно превышающее разнообразие даэдгсрр сзлых леггорнов (Gudkov et al., 1 ч81). Кроме того, ml .существенные

колебания численности ЭП в геномах разных рур - от 0 до 10-15 копий. Эти исследования показали, что -^П кур - вариабельное

семейство элементов, в котором либо происходят, либо недавно происходили процессы возникновения новых локусов - как полноценных, так и дефектных. Чтобы понять, существуют ли какие-либо закономерности в структурных вариациях ЭП, мы предприняли изучение этих элементов в геномах кур ^охарактеризованного ранее генотипе и содержащих уникальные наборы локусов ЭО..

4.2. Новые локусы ЭП кур

Для подробного анализа мы выбрали две популяции кур - коричневых леггорнов (КЛ) и итальянских куропатчатых (ИК), ДНК которых

оо

в блот-гибридизации с Р-клонированной ДНК вируса саркомы Рауса (более 90% гомологии с ЭП) давала уникальные наборы вирусспецифи-ческих фрагментов (Gudkov et al.,1981; Cnernov et al.,1983). ДНК из эритроцитов взрослых кур или эмбрионов гидролизовали Eco RI к анализировали наборы фрагментов, выявляемых в блот-гибридизации. Е результате все вирусспецифические фрагменты были разбиты на несколько груш сцепленно наследуемых фрагментов, которые предположительно относились к одному генетическому локусу. ДНК кур с разными генотипами анализировали с применением других рестриктаз, использованных для характеристики и классификации локусов ЭП белых леггорнов. Полученные результаты - наборы характеристических фрагментов ЭП (см. табл.3) - сопоставили с соответствующими характеристиками локусов ЭП белых леггорнов. Оказалось, что в геномах двух популяций кур распространены 10 локусов ЭП, встречающихся с разной частотой и в разных сочетаниях. Ни один из локусов не является необходимым компонентом куриного генома. Лишь 2 из 10 локусов совпали с теми, которые были найдены у белых леггорнов - это ev-э и ev-б. Другим локусам были присвоены новые номера - ev-22 - ev-29. Наиболее часто встречающийся локус - ev-3 (большая часть кур обоих популяций); оамйй'ф'едк,1й - ev-29 (2 случая из 116 кур КЛ) (Тихоненко и др.,1985).

Таким образом, исследование двух новых популяций кур привело к обнаружению 8 новых Фокусов ЭП, после чего их число достигло 29. Очевидно, что анализ других популяций приведет к существеному расширению этого множества.

Таблица 3. Вирусспецифические рестрикционные фрагменты ЭП кур

Рестриктаэы

Локусы ! Eco RI Bam HI Hind III Sao I Bgl II

ev-3 <101/150) 13,0®b 3,4el 4.9eL ao,8e 0.56p 13.0 3,0 5.4 3.0 ■ 2.4

ev-22 (106/116) 4.7еЪ U5& 5,OeL 2,8 2.0 . A»* , 3.4

ev-23 (35/116) *2,5P 2.25^ 2,05е1, 7.3eL 4.9L *1.0P ^0.43« 3.3 *a,i 1,85 '110,7 - , 3,6 j 1.55 -0.9

эу-24 (24/116) 1,OeL 7,10L 5,0^ *1t0P *0,8® 2,-5 ? 6,6 ■ 4.3 Л.55 / 1.15

ev-25 (58/116) 0.71, 7 /' / 2,3 4.0 ; 2,3

ev-6 (34/116) 6,OeL 5.0P 2,8PeL 2.0Р/ 5.0 4,0 13,1 7,5 5.8

ev-26 (2/116) 3,5^ 4,0 0,8е ? ? ?

ev-27 (19/34) 3,4eL ? 3,0 4.3 ?

ev-28 (14/34) "2.5P 3>5el 4,6^ 10,0 2,8 *1.0 *0,8 4.0 2,7 2.1 10,0 7

VJ.O_.__—

0v-29 7.3Р 8,8 5.6 3.6 ?

(22/34) 1.5

"■'¡¿олокулярилэ масса ун&занк в мегадальтонэх; звездочкой отмечены внутренние фрагмента произруса, знаком '?" - невде-нтифгцировзннш Фрагменты. . Для •.каждого локусэ приведена частота встречаемости в .поа,'/ляции.кур -(цифра',перед, чертой число..кур с;.данным генотипом, 'цифра после, чоргы.- общее, число обследованных кур*' Генетический состав фрагментов "помечен буквами .(если1 определяв): g - gag, l> - j;ol, e -• unv, L - MR. "'.._■-■

4,3, Генетическая структура новых ЗП зсур

Исследование ЭП сезшх жпщрнов показало, что несмотря на близость ¡их иоследоватезшиостей, "многие из 'них отличаются oi полноценного провируса о ¡наличием более или менее протяженные делецяй (см. Coffin, 1984!)ч 'что в значительной степени к обусловливает различный характер их экспрессии. Приступая к характеристике генетической структуры обнаруженных нами локусов, мы исходили из предположения о близком родстве их с провирусог.. rav-0 и интерпретировали получаемые результаты, считая, что ev-22 - ev-29 - производные этого провируса.

Чтобы огределить структуру провирусов, мы установили, какую часть генома älv представляет тот или иной рестрикционный вирус-специфический 'фрагмент.. .Для этого мы трсзодшш блот-гибридизашлс. ДНК кур разного генотипа, стдролизованных разными рестриктазами, с мечеными геноспецифическими фрагментами (см. рис.; 7) клонированной ДНК вируса саркомы ¡Рауса- ¡Полученная при этом совокупность данных представлена в таблице '3 .На рис.'7 показана интерпретация этих данных - видоизмененные ¡рестриктные карты rav-o, соответствующие исследуемым локусам.

Лишь 2 из 10 провирусов не имеют выраженных отличий от провируса rav-0 - это щьвирусы ev-24 и ev-28. Остальные несут делеции разной длины - от 0,7 т.п.н. у провируса ev-23 до всей кодирующей части генома с сохранением лишь последовательностей 1Як, как у ev-25. Как и ожидалось, структуры двух локусов совпали с ранее описанными ev-з и ev-б. Интересен провирус ev-29, не имеющий ни правой, ни левой части провируса AIv и являющийся, вероятно, результатом двух делений.

Итак, охарактеризовано 29 провирусов кур. Анализ всей совокупности данных показывает, что 10 локусов из 29 имеют неизмененную по сравнению с rav-о структуру (7 из них ассоциированы с продукцией инфекционных вирусных частиц; остальные несут более или менее протяженные делеции). Обращает на себя внимание особенность локализации большинства из них: в 6 охарактеризованных нами случаях, как и в ряде провирусов белых леггорнов утрачиваются фрагменты генов gag и/или pol с сохранением правой части генома. Именно такие провируса наиболее широко распространены в изученных популяциях (табл.3). Единственный

дефектный по правой части лровирус (ец~гбУ чрезвычайно редок.

"LTR'1- Т77П "роГ-

3AV-0 I ^

¿///¿/Л "env."- £22

LTR-GAG-1-POL-1-ENV-LTR

Bglll F-oRI Ball), EcoRI

J—-L_ '

I t '"i

SamHIBomHr- Hind III BamHI

A D I Ь ¡ev-24! f

1 ' i T

f I iev-28)

c-.QrH < 11 11

(ev-231

А д

lev-3]

л В lev-22,

lev-6) fc t * '

Hmdlll

1Г—I met

met

РНК:

H.O„

□р-Ц-ЕЧ-у^Ь

4-HZ3g3+f31S«,22S0 L19S

24S 223

(cv-291

A E

(ev-25)

.....V --с:: в.о.

ни

—

□гЧтт1- 'г' ■с:

Рис. 7 . Структура ЭП кур КЛ и Ш,

Вверху показаны генетическая карта провирусов и клонированные фрагменты генома вируса сяркомы Рауса, использованные в качестве зондов. Обозначения: А- ЭП КЛ; е- ЭП ИК; met - превкусная ДНК метилирована. Делецированные области показаны пунктирными линиями, "н.о."- не опреде.шщ к—'4 - РНК не выятет.

Таким образом, вторым (вслед за образованием нових локусов) направлением измеьчиьости яп кур являемся накопление делеционннх дефектов. Прежде чем обсудить возможпге причины этого феномена0 рассмотрим результаты исследования экспрессии ЭП кур.

йкспрессия ЗП кур, es связь с метилированием дьк:

При изучении экспрессии Sil кур ш использовали следунцш е^спорименталышК подход* выделяя;" ДНК и РШС из тканей большого .числа IO-дневншс вкорздаж к анализировали иг генотга; (блюг-ги0рад;юация РЖ), ßs^ascwsbco в цветной иммунопероксидазно!. роакцда ецзоделялк с помощью внтизыворотки к gag-белкам вирус?, саркокк рауса наличие gs-iятагана в тканях тех же эмбрионов. Аналогичном образом исследовали ткани взрослых кур. Част,, получениях результатов представлена на рисЛ.

Било установлено, что gst-$chotim имеют лишь тс ocool.. которые несут в геноме локус ev-з (изучались лишь куры иопуляциг. IÜI). Любые на "ори и комбинации других локусов, если среда ш; отсутствовал. ev-3, бш.; ассоциированы с фенотипов ge-. Следовательно» продукты гена gag в количествах, которые mojhk. выявить пршонетш:.*. методом, являются результатом экспрессии единственного из локусов кур KJí - ev-з. Остальные, включая 1. поляоцешшй локус ev-2i|, ген экспросснруют--

Розультатн ШЕйунофзрменлюго анализе корродируют с данными блот-гпбрпдизации РНЕС. Как sl ожидалось, куры разшьт. гонотшкш различались по наборам вирусспецифической РНК: был!': оонаруиею. транскрипты, характерше для ev-з (31Б и 22S, продукт сплайсинга.! ж ev-6 (22S); активно транскрибируется локус ev~22, дава^ единственный траискрипт (24S) ожидаемого размера (делецил roHOj: к отчасти pul). Не било выявлено транскрпптов для полноценного локуса- OV-2A- и слегка делоцировашого e¡v-23 -

Мы не можем дать точных сведений, кгсавщихся экспрессии генов env Эй ev-23 »24,22, поскольку провируск ev-з и ev-6 широко распространены в издавшихся популяциях, обеспечивая сЬГ+-феютип. Ествствзшхо окидать, что о1г:С+-ф0нотип будет ассоциирован и с локусом ev-22.

Выключение транскрипции генов высших эукариот часто связано с метилированием их ДНК по цитозину в комбшации es. Чтобы проварить, не связано .ли отсутствие транскрипции п^овирусов ev-23 и 24 с метилированием их последовательностей, мы применили чувствительную к метилированию сайта рестрикции ресриктазу Sma I в комбинации с Eco И. Совместный гидролиз ДНК Eco щ'и Sma I по-

'созывает, что наборы фрагментов провирусов ev-23 a-ev-24 устойчивы :с гидролизу Sma I, в отличие от фрагментов других провирусов (ev-з л qv-22). Таким образом, по крайней маре 3 цитозшш, входящие з состав 3-х са:!тов рестрттсции Sma I внутри провирусов ev-23 ss ev-24 летилироЕзны, что коррелирует с отсутствием экспресса! этях Фокусов. Аналогичным образом было показано метилировгтие ■:оследователыюстей локуса ev-28 кур Ш - второго полноценного локуйа из исследованных нами. Метилирование характерно и» по крайней мере, для двух других ЭП кур ev-1 я av-2 (Coffin,1994).

Таким образом, выявлена корреляция между метилированием ш экспрессией локусов ЭП кур. Метилированы 3 из 10 охарактеризованных локусов, включая оба полноценных нровируса. активно транскрибируются дефектные npcBKpycii ev-3, ev-6 п ov-22 наиболее распространенные в популяции кур :е сохранившие интактнот* ■?вн env.

4.5. Эндогенные провирусы и фенотип организма: экспериментальные подходы

Широкое распространение в геномах высила эукариот эндогенных провирусов ставит вопрос об их функции, .влиянии т:э Сзтхшш организма. Примеров "нормальной' йяви-шн*' этих fsr&sms-ciasx элементов пока очень мало. Известив' дё&ь* что .р^ектизз по левой части генома эндогенные провирусы .йур я имей могут слуетть защитой от экзогенной ретроьфуchoJ? дйилайШ! продукты их гена c«v - gp85 (или gp70 в случае вфуеадй timeй; интерферируют с экзогенными родственными ретровиру.рййЬ Возможно, им°нно эта защитная пункция обеспечивает широкое рас'йространегие дефектных экспрессирующих гликопротеид оболочки &11 в мышином и курином геномах.

Полноцэнное решение проблемы фу!й<цш! ЭП требует подробного изучения тканевой специфичности их ьксцрееойи,, экспрессии на разных стадшос развития, созданья новых экспериментальных моделей, например, аналогичной созданной R.Jaenisdh(M№t с новым ьскуственно введенным классом аП).

Мы сделали два практических шага S этом направлении: I)разработали простую и эффективную модификацию метода

гибридизаций in -situ tía тедстологических срезах с целью выявления закономерностей якетфессйй ¡реаровирусных РЕК (Кашкин и др., 1987).; 2)в результате селекции под контролем блот-гибридизации 'вывели на основе кур Ш -популяцию» «ьааеодную от эндогенных провирусов (Чернов и др..,1987^)-. MflnMiKSjrft згой системы., 'мы начали -исследования тканевой специфичности экспрессии ЭП, влияния '.их экспрессии не распространение "экзогенной шфекции. Кроме того., ® -геноме "беспровирусных кур'- были найдены среднеповторяюдаеся 'последовательности, слабо гомологичные ;геному ALV (Чернов и -др.,а986), возможно являющиеся более 'множественным классом ЭП птиц.

4.6. Направления изменчивости эндогенных прозирусов

Агализ результатов шастоадей работы и других сведений, касающихся различных <K)iscetffi ^эндогенным п^ювирусов птиц и млекощ?-таюпих, позволяем: ЩШТь ¡рьд 'обобщений (Гудков, 1986; Тихоненко, Гудков,1987; ;Гудкбв-Дихйне'нка,11.988.).. ЭП являются результатом более или менее давно случившегося '.заражения клеток зародышевой линии предков современных'51Ивбтны:; экзогенными ретровирусами. Дальнейшую судьбу элемента, 'пойа'ШёГо щ '.геном, определяет результат взаимодействия двух тенденций: '£>'"0 способность к распространению, увеличению числа Komffc, -созданию 'новых локусов, с одной стороны, и накопление дефектов, -выбраковка неблагоприятных вариантов взаимодействия вирусього и клеточного геномов - с другой. Возможность существования жизнеспособных особей, лишенных эволгционно молодых классов ЭП (кур без ev, 'мышей без эндогенных ШТУ и MuLY), без видимых изменений фенотипа говорит о том, что, по крайней мере, на ранних стадиях совместной эволюции провируса и организма необходимости в существовании провируса нет. Более того, накопление провирусов, дачрекдениых делециями, или полноценных провирусов, но метилированных и неактивных, - свидетельство существования тенденции к элиминации инфекционных локусов. в пользу этого предположения свидетельствует и широкое распространение провирусов, обеспечивающих противовирусную защиту. Движущие силы такого направления отбора не вполне ясны: известно лишь, что наличие в геноме локусов инфекционных эндогенных вирусов часто ассоциировано с высоким риском неопластического заболевания.

Существование древних ретровирусоподобных элементов (гоны

интрацистернальных А-частиц, ксенотропных ЭП мышей и др.) показывает, что, по крайней мере, иногда ЭП могут надолго закрепиться в геноме организма й создавать обширные (сотни и тысячи копий на геном) семейства элементов, часто утрачивая при этом черты автономных ретровирусов. Вопрос о взаимоотношении этих древних элементов с организмом хозяина, о возможном- приобретении ими нормальной функции остается открытым. Сравнение свойств эволюционно молодых и древних элементов, возможно, позволит понять

пути эволюции этих мультигенных семейств.

* *

Мы исследовали различные по структуре, .''фучк!;лям и происхождению мультигенные семейства: сетгейство амп имов в клетках, обладающих МЛУ, генов рРНК и эндогенных црог''ирусов. Изучаемые модели представляют оба основных вида мультигенных семейств - повторы, образующие кластеры, и диспергированные по геному. Для каждого из семейств были выявлены определенные закономерности изменчивости, складывающиеся из генетических процессов, происходящих в семействе, и отбора возникающих при этом фенотишческих вариантов. Несмотря на особенности каждой из систем, на различия организмов, гены которых мы изучали (даунгарс-кий хомячок, человек, курица), можно предполагать, что выявленные закономерности имеют общий характер, так как касаются изменчивости универсальных классов мультигенных семейств, эволщионирущих, вероятно, по сходным законам. И хотя полученные данные не могут в полной мере решить проблемы возникновения и эволюции мультигенных семейств, они, в совокупности со всеми работами в этом направлении, готовят основу для более разработанных гипотез и их экспериментальной проверки.

в ы в о a t

1.Применено два подхода к изучению происхоящения и изменчивостг мультигенных семейств позвоночных: а)анализ структуры, разнообразия, особенностей наследования реально существующих семейств; б Моделирование возникновения новых (или удаления старых) геншг семейств и прослеживание идущих при этом процессов - на молекулярном уровне и на уровне фенотипа. Использованы экспериментальные модели: а)амплификация участков генома соматических клеток дкун-гарского хомячка при селекции на множественную лекарственную устойчивость (модель возникновения de novo мультигенного семейства4 б)гены рРНК человека (пример древнего гомогенного "кластерного' семейства повторяющихся генов); в)эндогенные провирусы кур (пример семейства ретротраспозонов ретровирусного происховдения). Таким образом, изучены представители двух основных классов мульть-генных семейств: состоящих из сцепленных повторяющихся элементов * диспергированных по геному.

2. Основные результаты изучения феномена амплификации генов:

- разработан метод выявления и клонирования неизвестных амп-лифнцированных последовательностей, основанный йа обогащении да разными классами повторов и конкурентной гибридизации. С его помощью доказано, что при селекции клеток на устойчивость к большо* группе неродственных цитостатиков (множественная лекарственная устойчивость, МЛУ) происходит закономерная амплификация протякенногс до нескольких 1000 т.п.н.) участка генома, включающего ген mdr i и сцепленные гены; 'методом гибридизации in situ амплифицировантк последовательности локализованы в гомогенно-окрашенных области хромосом (HSRs).Амплификация генов МЛУ мокет происходить в организме в ходе химиотерапии антрациклинами экспериментальных перевивных опухолей мышей. Таким образом, клетки, обладающие МЛУ, являются примером закономерного возникновения do novo мультигенного семейства; ' . '

- ген mdr джунгарского хомячка, . амплификация которог< обусловливает МЛУ, локализован в длинном, плече, хромосомы .-4, меси формирования кластера- .амплифицированных' Последовательностей н первых ступенях селекции; по мере увеличении_степени амплификаци и ■ удлинения HSRs стабильность кариотипа нарушается, происходи1

тронслокация кластеров ашлифацированных генов на другие определенные хромосомы набора;

- структура л состав ачплифицированшх последовательностей различаются в ДНК независимо полученных клоналышх клеточных резистентных линий. Структурная шдаввду,альность семейств шшшконов обусловлена следующая факторами: возникши® ампликои ;луяит матрицей .для последующих раувдов ашлификащги '."зшлификационноя память"); в ходе умнонения генов МЯУ происходят закономерные умножения ампликонов, заключающиеся в выпадешга- части последовательностей, причем новые ампликоны постепенно замещаю первичные. Время возникновения, структура изменении аятликонов, скорость выпадения и размер утраченных последовательностей уникальны для каждой клеточной линии. •'

3.Основные рззультаты изучения изменчивости- гонов рРЩ человека

- при изучении полиморфизма длин рестршсционных'.-г'ф?,ч,ментов генов рРНК человека выявлено 2 вариабелен* гг района не транскрибируемого спейсера: область вблизи, начала трап: кришущ (внутригеномный полиморфизм) и вблизи терминации транскрипции (наборы структурных вариантов различаются у разных индивидуум:ов). Обнаружено 8 структурных вариантов области мекгеномного полиморфизма, встречающихся с, разной частотой и в разных -сочетаниях, структурные вариации использованы в качестве маркеров отдельных частей семейства;

анализ генотипов семей и изучение метилированных, расположенных на отдельных ядрышковых организаторах не-транскрибируемых генов рРНК показали, что гепи рРНК, принадлежащие :с одному структурному варианту, образуют кластеры на отдельных хромосомах и наследуются сцепленно как одна генетический локус; тагам образом, гомогенность кластера генов одной хромосомы вше, чем семейства в целом;

- обнаружены случаи амплификации генов рРНК человека; при этом амшифицируется отдельный структурный вариант. Общее число копий генов рРНК у таких индивидуумов может в 2-3 раза превышать обычные значения.

4. Основные результаты изучения эндогенных провирусов кур:

- продемонстрировано широкое разнообразие локусов эндогенных провирусов кур, значительные вариации числа копий этих элементов в

геноме разных особей. При исследовании кур двух пород выявлено в классифицировано 8 новых локусов эндогенных провирусов, i результате чего общее число охарактеризованных локусов достигло 2£ сравнение генетического состава и физических кар: обнаруженных провирусов и полноценного эндогенного провируса кух RAV-Q показало, что 8 из 10 изученных локусов дефектны и содержач протяженные делении, в основном повреждающие гены gag и pol. Три дефектных провируса транскрибируются: оба полноценных - метилированы и неактивны;

- в результате селекции под контролем блот-гибридизации выведена популяция кур, свободных от эндогенных провирусов класса ev, которая служит моделью для изучения функции эндогенных провирусов, При изучении генома этих кур обнаружен новый класс ALY-родственнш последовательностей, возможно являющихся новым классом эндогенны) провирусов кур.

5. Полученные результаты позволяют определить направлена генетических процессов, идущих в различных семействах, особенной! их формирования и эволюции. Сходство структуры семейсл амплифицированных генов МЛУ и рРНК позволяет „предполагать, чтс изменчивость обоих семейств подчиняется следующим общш закономерностям: семейства сцепленных генов могут возникать np¡ соответствующем селективном давлении в результате.; амплификацш протяженного сегмента генома, значительно' превышающего разме] гена; в таком семействе постоянно происходят изменения, связанны* со случайным формированием укороченных и/или перестроении: структурных вариантов, их амплификацией, утратой, перемещениям: между хромосомами. Эти процессы ведут к возникновению структурно] индивидуальности семейств (видовой или специфичной для клеточно] линии), что интерпретируется как "концертная" эволюция семейства.

Ретротранспозоны рстровирусного происхождения на первы: этапах своего существования в геноме _ о^таййзмс. (пример - ЭП кур не являются необходимыми элементами генома и могут быть утрачен без видимых последствий (куры без ЭП). Наблюдаются две основам тенденции в их изменчивости:-••возникновение новых локусов ЭП ; "инактивация" старых (накопление' деле'ций,">;метйлиравание). Эт; тенденции являются результатом ¿эа^одоЙстМя,'-вирусного генома : генома организма' й.,отбора';Прйемлемкх: вариантов,.'-среда которых..

сохранение безвредных'или- полезных (защита от." экзогенной йнфекций элементов^. " _ ' • ' . -■ V V

список

работ, опубликованных по теш диссертации

1.A.В.Гудков, с.М.Серов, И.Б.Обух, Б.С.Народицкий. Новые эндогенные провирусы в ДНК кур порода бурый леггорн. Вопр, ви-русол.,1981, N2, с.225-228.

2.А.V.Cudkov, I.B.Obukh, S.M.Serov, B.S.Naroditsky. Variety of L-ndogenoua proviruses in thw genomes of chickens of different breeda. J.Gen.Virol..1981, v.57, p.05-9*.

3.Б.П.Копнин, А.В.Гудков, Е.Л.Кадырова, Хромосомная и внехромо-сомная локализация амплифицированных Генов в резистентных к колхицину клетках. Докл. АН СССР,. 1982,. т.262, с.993-997.

4.Б.П.Копшн, А.В.Гудков. Амплификаш» участков генома в соматических клетках млекопитающих, устойчивых к колхицину. Сообщение II. Маркерные хромосомы с длинными; гомогенно окрашенными областями в колхицин-устойчивых клетках диуигарского хомячка. Генетика. 1982. т.18, с.ШЗ-1523.

5.Б.П.Копнин, А.В.Гудков. Сообщение Ш. Локализация амплифицированных генов в мелких хроматиновых образованиях. Генетика, 1982, Т.18, С.1603-1692.

6.Б.П.Копшш, А.В.Гудков. Сообщение IV. Генетическая транформа-ция с помощью амплифицированных генов из клеток дкунгарского хомячка, высокорезистентных к колхицину. Генетика,1983, т.19, С.864-871.

7.Б.П.Копнин, A.b.Гудков. Сообщение v. Индукция генной амплификации в клетках дкунгарского хомячка и мыши. ГанетикаДЭВЗ, T.I9, с.872-880.

8.А.В.Гудков. Б.П.Коннил. Сообщение vi. РестрикционныЗ анализ амплифицированных последовательностей ДНК. Генетика,1983, т.19, с.1045-1053.

Э.Б.П.Копнин, П.С.Массино, А.В.Гудков. Особенности изменений кариотипа в клетках дкунгарского хомячка, устойчивых к метотрексату. Генетика,¡963, т.19, с.1159-1169.

10.А.В.Полоцкая, А.В.Гудков, Б.П.Когааш. Гипврпродукиия спецдфи-ческого белка в клетках, резистентных к колхицину и адриаблас-тину. Бюлл.эксперим.биол.мед.,1983, N9, с.93-96.

11.A.V.Gudkov, I.B.Obukh, S.M.Serov. Localization of provirus DNA of Rous sarcoma virus in the DNA of infected, transformed and

tumor oells oX ohickena. Folia biologioa (Praha), 1983, v.2S, p. 221-229.

12.А.В.Гудков, в книге "Молекулярные механизмы вирусного и невирусного канцерогенеза".Глава 3. Взаимодействие ретровиру-сов с клеточным геномом. Глава 4.1. Эндогенные ретровирусы е канцерогенез. Итоги науки и техники. Вирусология, т.10, с. 64103. U., 1983.

13.М.У.Chernov, X.B.Obukh, A.Y.Gudkov. Variations of endogenous chicken proviruses: characterization of new looi of endogenous proviruses in the genomes of Italien ohickens. Folia biologio& (Praha), 1984, v.30, p.342-348.

14.А.В.Гудков, С.JI.Колобков, И.Б.Обух, С.М.Серов, М.В.Чернов. Структурное разнообразие эндогенных провирусов в геномах позвоночных. Вестник АМН СССР, 1984, N5, с.3-9.

15.А.Т.Тихоненко, И.Б.Обух,.М.В.Чернов, А.В.Гудков. Возмокные механизмы возникновения новых локусов дефектных эндогенных провирусов. Докл. АН СССР, 1985, т.282, с.1259-1262.

16.A.V.0udkov, Yu.S.liasslno, O.B.Chernova, B.P.Kopnin. Oene amplification in Djungarian hamster cell lines possessing decreased plasma membrane permeability for colchicine and some other drugs. Chromosoma, 1985, v.92, p.16-24-

17.B.P.Kopnin, Yu.S.Massino, A.Y.Gudkov. Regular , pattern of kariotypic alterations accompanying gene amplification in Djungarian hamster cells. Chromosoma, 1985. v.92, p.25-36.

18.A.V.Gudkov, B.P.Kopnin. Gene amplification in multidrug-resis-tant оеИв: molecular and karyotypio events. BioEssays, 1985. v.3, p.68-71.

19.И.В.Гарькавцев, А.В.Гудков. Два вида полиморфизма нетранскри-бируемых участков генов рРНК человека. Мол генетика, 1986, N2, с.28-32.

20.И.В.Гарькавцев, А.В.Гудков. Закономерности наследования полиморфных рестрикционных фрагментов нетранскрибируемых спей-серов генов рРНК человека. Мол.генетика, 1986, N4, с,24-28.

21.И.В.Гарькавцев, Т.Г.Цветко;ва, Н.А.Еголинг, Е.В.Мхитарова, А.В.Гудков, Е.Ю.Сиянова, А.Ф.Захаров. Молекулярно-цитогенети-ческий подход, к картированию метилированных полиморфных рестрикционных фрагментов генов рРНК человека. Бюлл.эксперим.биол. мед., 1986, N9, с.330-331.

22.Ы.В.Чернов. И.Б.Обух, Р.А.Денисова, Н.С.Горбачева, К.В.Злочев-ская, А.В.Гудков. Характеристика новых локусов эндогенных про-вирусов кур. Вопр.вирусол., 1986, N2, с.216-220.

23.А.В.Гудков. Эндогенные ретровнрусы и канцерогенез. Журнал ВХО им.Д.И.Менделеева, 1986, N3, с.303-306.

24.А.В.Гудков, О.Б.Чернова, Е.Ю.Сиянова, О.И.Сокова, Б.П.Кошшн. Получение ДНК-зонда, представляющего последовательности, ем-гашфацированные в колхицин-устойчивых клетках. Мол.биология,

1986, т.20, HI, с.146-153.

25.A.V.Gudkov, Е.Когео, МЛ.Chernov, A.Ï.Tikhonenlco, I.B.Obubh, I.Hlozanek. Genetic structure of tha endogenous proviruaes and expression or the gag gene In Brown Leghorn; ühiókena. Folia biologioa (Praha), 1986, v.32, p.65-72 V ,y ,, ,

26.A.V.Gudlcov, K.7.Chernov, A.T.Tikhonenko, I.B.Obukh,- riHlozanak. . Ua thy la t ion of endogenous proviruses of Brown Leghçyn.chickens. Folia biologioa (Praha), 1986, v.32, 73-77. V' "

27.A.B.Гудков. Экспериментальные подходы к изучений за-^нкйржзст-тей возникновения и изменчивости мультигенных семейств..Материалы Всесоюз.конф. по генетике сомат.клеток в культуре.

Ы.,1986, с.1-2. i

28.M.В.Чернов, А.Т.Тихоненко, Т.Е.Зайцевская, Р.А.Денисова, И.Б.Обух, А.В.Гудков. В геноме кур, свободных от эндогенных провирусов лейкозно-саркомного комплекса птиц, присутствуют последовательности, отдаленно родственнее вирусу саркомы Рауса. Мол.генетика, 1987, N3, с.6-10.

29.0.Б.Чернова, В.И.Шифрии, О.И.Сокова, Б.П.Копнин, А.В.Гудков. Клонирование и характеристика участков ДНК, амплифицированных в клетках дкунгарского хомячка, обладающих мнокественной лекарственной устойчивостью. Мол.генетика, 1987, N4, с.14-19.

30.А.В.Гудков, О.Б.Чернова, А.Р.Казаров, Б.П.Копнин. Закономерная эволюция амплкконов в ходе развития мнокественной лекарственной устойчивости клеток дкунгарского хомячка. Мол.генетика,

1987, N6, с.33-38.

31.А.Т.Тихоненко, А.В.Гудков. Эндогенные проретровирусы и другие автономные ретропозода: следа зарождения или распада вирусов? Мол.генетика, 1987, N7, с.3-11.

32.A.B.Гудков. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток: закономерности проявления, генетические основы,

41 1

клинические аспекты. Мол.генетика.1987. да, с.3-9.

33.Н.С.Демидова, С.Н.Гончарова, О.Б.Чернова, Б.П.Копнин. А.В.Гудков. Амплификация генов в лейкозных клетках мыши с приобретенной In vivo мнокественной лекарственной устойчивостью. Генетика, 1987, N10,1797-1806.

34.К.Н.Кашкин, С.М.Трояновский, А.В.Гудков. Выявление тканеслеци-фической экспрессии генов методом гибридизации In situ на отпечатках гистологических срезов. Мол.генетика, 1987, N9, С.16-18.

35.A.V.audkov, B.P.Kopnln. Gene amplification and multidrug resistance. Soviet Soientifio Revl«wes, Harwood Academic Publishers GmbH, 1987, v.7, p.95-136.

36.a.v.0udlcov, O.B.Chernova, a.R.Kazarov, B.P.Kopnln. Cloning and characterization of DNA sequences amplified in multidrug reeistant Djungarian hamster and mouse cells. Somatic Cell Mol. genet., 1987, 7,13, p.609-619.

37.0.И.СокоВ8, Е.Ю.Сиянова, А.В.Гудков, Б.П.Копнин. Локализация исходной и амплифицированной копий гена mdr в одном и том ке сегменте хромосомы 4 дкунгарского хомячка. Генетика, 1988, Ub^fJ

38.А.В.Гудков, А.Т.Тихоненко. Ретропирусоподобнне элементы и геном человека. Итоги науки я техники. Вирусология, т.16. М., 1988^

39.A.V.QudJ{ov, B.P.Kopnin. Karyotype and ampltcon evolution during stepwise development of multidrug resistance in Djungarian hamster cell lines. Ins Molecular and Cellular Biology of Multidrug reeiatanoe. Plenum Press (usa), 198Я.

40.1 .V.Oarkavteev, N.A.Yegolina, T.G.Tsvetkova, A.V.Gudlcov. Variability of human rwia gcnea. Human Genet., 1980.

участок множительной техники ьони амн ссср порп.'к печати э i . 5. в в л-а0073 3 ан. 4 5 1 тира» 100

Информация о работе

Гудков, Андрей Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 1988
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Закономерности изменчивости мультигенных семейств ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности изменчивости мультигенных семейств"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Закономерности изменчивости мультигенных семейств
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология