Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антигенная гомология и особенности эволюции полипептидов глицинина сои и IIs-глобулинов растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Антигенная гомология и особенности эволюции полипептидов глицинина сои и IIs-глобулинов растений"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

УДК 575.862' 1|12:57.088.3:638.34

АЛЕКСЕНКО Алексей Юрьевич

АНТИГЕННАЯ ГОМОЛОГИЯ И ОСОБЕННОСТИ ЭВОЛЮЦИИ ПОЛИПЕПТИДОВ ГЛИЦИНИНА СОИ И Ш-ГЛОБУЛИНОВ РАСТЕНИЙ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(специальность 03.00.03 — молекулярная биология)

Москва 1988

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции /промышленных микроорганизмов Министерства медицинской и микробиологической промышленности СССР.

Научный руководитель: доктор 'биологических наук, профессор Ю. П. Винецкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А. С. Антонов •доктор биологических наук А. М. Соболев

'Ведущее учреждение: Всесоюзный научно-исследовательский институт растениеводства им. Н. И. Вавилова.

Защита диссертации состоится « » ■ 1988 г.

в '/Ч> часов ^О мин. на заседании Специализированного Совета Д 053.05.70 три Московском Государственном Университете имени М. В. Ломоносова, г. Москва.

С диссертацией можно ознакомиться в 'библиотеке МГУ им. М. В, Ломоносова.

Автореферат разослан _ 1988 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат химических наук

В. Н. «агреманов

г г,,./','""'

Актм^льнЬсФк; теш. Проблемы структуры и функционирования ' генома высших' организмов занимают в настоящее время ведущее место среди молекулярно-генетических исследований. Поэтому вполне понятен интерес к таким модельным системам, которые позволяют исследовать структурно-функциональную организацию индивидуальных генов и мультигенных семейств у различных организмов. Наряду с рибосомальными генами, генами гистонов, глобинов и иммуноглобулинов животных одной из перспективных моделей являются гены запасных белков семян растений. Запасные белки представлены несколькими семействами, близкими функционально, но различными по структуре и происхождению (Соболев, 1985). Продукты генов запасных белков являются преобладающим белковым кошонентом семян и не представляют трудностей при аналитической работе. Наконец, запасные белки растений сочетает качества теоретической модели с большим практическим значением, так как составляют важнейший кошонент белкового рациона человека и животных. Рядом исследовательских групп в нашей стране и за рубежом были проведаны работы по изучению структуры и клонировании генов-запасных белков ряда растений. Определены, и опубликованы нуклеотидные последовательности клонированных единичных генов запасных белков (Ьусе« et а1., 1934! Не1с1еБсег, Messi.Bg, 1983 ), • а для глицинина сои - по-видимому, всех генов мультигенного семейства (Д1е18еп, 1984 ).'_■'

Изучение нуклеотидных последовательностей генов создает надежную базу для исследования происхождения, механизмов эволюции и структурно-функциональной организации запасных белков. Однако эти вопросы могут решаться также путем анализа полипептидных продуктов, в частности, иммунохимическими методами. Преимуществом методов иммунохимии является их чувствительность к характеру. вторичной структуры белка, что дает возможность непосредственно тестировать структурно- и функционально-значимые замены (Ьегаег, 1964 ).

Важной составной частью проблема эволюции мультигенных семейств запасных белков яв>шется происхождение и поддержание вну- --тривидового полиморфизма. Кроме теоретического интереса, эта проблема имеет серьезное практическое значение, так как именно полиморфизм запасных белков дает непосредственный материал для селекции на качество белка семян (Созинов, 1985).

Запасной белок семян сок глицинии, выбранный в качестве основного объекта настоящей работы, относится к классу Ils -глобулинов. Он является гексамером, составленным из гомологичных субъеданиц, кодируемых генами, по степени гомологии разделяемыми на два подсемейства ( lioraira et al., 1981). Каждая субъединица состоит из кислого (А) и основного (Б) полипептидов, кодируемых одной молекулой мРЖ. Кислые полипептиды Aj и Ag составляют 1-е подсемейство, а А3 и А^ - П-в подсемейство семейства полшептидов глицинина (Sielsen, 1934 ),

Цель работы заключалась в изучении структуры и происхождения двух подсемейств полипептидов и мультигенного семейства Ils -глобулинов в целом путем анализа кодируемых ими полипептидов. Первый этап работы состоял в изучении внутривидового и внутри-родового полиморфизма глицинина культурного и диких видов сои; на втором этапе изучалась антигенная гомология долипепгидов Ils -глобулинов у различных видов растений. . .

Научная новизна

- Исследован субъеданичный состав глицинина различных сортов культурной СОИ G. иах {L.)Ыегг. и диких видов сои подрода Glycine ; показано, что глицинии культурной сои характеризуете;: мономорфизмом субъединичного состава и постоянством общего количества в семенах.

- Показано, что белки семян видов подрода Glycine характеризуются вариабельностью; признак электрофоретического спектра белка семян может быть использован, как таксономический критерий.

- Показано, что глицинии видов подрода Glycine состоит из основных пешшептадов молекулярной массы 18-20 кД и двух типов кислых полипептидов мол. массы 38-39 кД и 45-55 кД; последняя ■ фракция обнаруживает гетерогенность по мол. массе и вариабельность мезду образцами.

- Получены антитела к полипептидам глицинина G. шах , специфичные к антигенным детерминантам, общим для двух подсемейств полипептидов, а также к детерминантам, маркирующим характерные особенности каждого подсемейства. Антитела использованы в имму-ноблотинге с белком семян видов подрода Glycine ; показано, что антигенные детерминанты 1-го и П-го подсемейства полипепткдов глицкнина локализуются на кислых полипептидах соответственно

молекулярной массы 38-39 и 45-55 кД Ils -глобулинов видов под-рода Glycine .

- Методом иммуноблотинга исследованы полилептиды легуминодо-добннх белков бобовых, гомологичные полипептидам глицинина сои. Показано, что у большинства исследованных триб антигенные детерминанты двух подсемейств глицинина локализуются на различных полн-пептидах, причем антигенные детерминанты 1-го подсемейства обнаружены у всех исследованных видов, а П-го подсемейства - у большинства видов.

- Методом иммуноблотинга исследованы белки семян различных видов растений. Антигенные детерминанты полипептида Aj глицинина обнаружены у различных видов однодольных и двудольных, а также-голосеменных растений. Образцы белка семян подвергнуты центрифугированию в ..градиенте плотности сахарозы, и показано, что полипептиды, гомологичные полипептидам глицинина, локализуются во фракциях с константой седиментации II-I2S . и отсутствуют в остальных фракциях белка семян. ■

Практическая ценность. Разработанная методика использования высокоспецифичных антител в иымунеблотинге с гетерологичлыми белками используется для анализа эволюционных закономерностей различных семейств белков растений. Полученные антитела исполь-■ зованы в работах по клонированию и экспрессии генов запасных белков в гетерологичных системах. Данные по количеству и структуре глицинина у различных образцов сои могут непосредственно использоваться в практике селекционной работы.

Апробация работы. Материалы диссертационной, работы докладывались на Ш Всесоюзном совещании по генетике соматических клеток (Звенигород, 1986), конференции по эволюционной биохимии и хемосистематике высших растений (Звенигород, 1986), 1У симпозиуме по белкам семян (Гатерслебен, 1987), семинаре отдела биотехнологии ВНЙИгенетика (май 1987 г.).

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 7 печатных работах.

Объем работы. Диссертация изложена на 155 страницах машно-пиского текста, состоит кз введения, обзора литературы, описа-

ния материалов и методики, результатов экспериментов, обсувде- • ния к выводов, содержит 21 рисунок и II таблиц. Список использованной литературы содержит 214 наименований отечественных и зарубежных работ.

МАТЕРИМ И МЕТОДИКА

Образцы семян были получены из Всесоюзного Института Растениеводства им. Н.К.Вавилова, Ботанического института АН СССР и Всесоюзного селекционно-генетического института; семна репродуцированы на опытных станциях и полях институтов в 1977-1983 гг.

Выделение суммарного глобулина семян проводили путем экстракции в течение 3 ч 35 мМ натрий-фосфатным буфером с 0,4 М НаС1 и 10 мМ 2-меркаптоэтанола при 37°С, после чего нерастворимый материал удаляли центрифугированием (Hill, Breidenbach, 197*).

Выделение глицшшна проводили по методике Kitamura et al. (1976); дяя очистки небольших количеств белка использовали центрифугирование в градиенте плотности сахарозы.

Выделение полипепиидов глицинина после восстановления и пири-дилэтилярОБанкя по методике Hernodsea et al,, (1977) проводили хроматографией на ионообменнике Uoao Q или ДЕАЕ-сефадексе А-50 ( Kit&Eura, Shibasaki, 1975).

Иммунизацию кроликов проводили ПО методике Horeira et el. (1981); антитела выделяли из ишуноглобулкновой фракции методом иммуноаффинной хроматографии на иммобилизованных на ВгСЗ -сефа-розе полипептидах глицинина (Сазеу, 1979). Специфичность антител устанавливали в реакции двойной таеднодайзузии (Garvey et al,1976)

Конънгат антител осла к иммуноглобулину кролика с пероксидазой приготовляли по методике Ktlaon, Eakaae (1978) периодатным методом.

Электрофорез белков(ДСН-электрофорез) проводили по Laeamli (1970); изоэлектрофокусировалие проводили по методике Jäcle (1979) в присутствии 6М мочевины.

Электрофоретический перенос белков на нитроцеллмозу Шлей-хер эта Шулль ВА 85 к иммуноферментннй анализ (икмуноблотинг) проводили по Towbic et el. (1979); проявление вели в 0,06? растворе 4-хлор-1-нафтола и 0,01? переклеи водорода.

Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 10-30? проводили в роторе s^ -41 центрифуги "Бекман" в течение 18 ч при скорости 35000 об/мин И 20°С (Hill, Breidenbach, 1974).

Определение концентрации бедка проводили ПО Sadmac, Grossberg,1977-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Мономорфизм глицинина сортов и линий сои подрода Soja .

На первом этапе работы была исследована субъединичная композиция глицинина у различных сортов и линий культурной и дикой уссурийской сои (подрод Soja ). Выбор сортов для анализа был продиктован следующими соображениями. Во-первых, сорта должны были составить по возможности полное представление о состоянии генофонда на основе анализа сравнительно небольшого числа образцов. Исходя из этого, были взяты образцы различных подвидов, от |щоокультуренного ssp. gracilis до высококультурных сортов китайского и манчжурского подвидов. Генофонд вида G. ussuriensis легко скрещивающегося с G. Вях (Седова, 1982), также можно рассматривать как часть генофонда культурной сои. Во-вторых, в набор образцов были включены сорта, используемые в современной селекции.

Исследование образцов суммарного белка семян и очищенного глицинина методами электрофореза, изоэлектрофокусирования (ИЭФ) и высокоразрешахвдей жидкостной хроматографии показало, что все изученные образцы, включая глицинин дикой уссурийской сои,, идентичны по электрофоретическому спектру и практически идентичны (за исключением соотношения интенсивности минорных компонентов) по спектрам разделения полипептидов в ИЭФ. Высокоразрешащая хроматография позволила выявить отдельные различия в относительных количествах полипептидов Aj и Ag, а также Ад и А^, не превосходившее, однако, 10-15;?. Поскольку метод ¡©5 чувствителен даже к некоторым одиночным заменам, то следует заключить, что даже такие замены редки для генов глицинина культурной сои.

Манипулирование аминокислотным составом белка семян в принципе возможно не только на основе полиморфизма субъединлчной композиции глицинина, но и путем увеличения его доли в семенах. Седиментация глицинина в градиенте плотности сахарозы в виде четко ограниченного пика (Рис.1) позволяет определить долю глицинина в белка семян как площадь пика Iis -фракции. С помощью этого метода было показано, что различия в количестве глицинина у разных сортов и подвидов не превосходит ошибки анализа.

Совокупность данных позволяет заключить, что глицинин семян

о

И

в ¿2 Номер фракции 6 11 Номер фракции

Рис. I. Профили седиментации белка семян культурной сок (а) и дикой сои саяевсевз (б) в градиенте плотности сахарозы ГС-30/ь. Указано положение пика II 2 -глобулина.

Рис. 'I. Разделение полипептидов Б-пиридилзтилглицинина видов С. в ах (а,б), 5> из8иг1ввв18 (в) и саавЕсеав (г) на ДЕАЕ-сефадексе А-50 (а) и на ионообменнике Копо ч (б,в,г). Сплои-кая линия - оптическая плотность элтта; пунктир - градиент концентрации 0-0,5 Ы. Указаны фракции кислых полилентядов.

- ? -

подрода soja рода Glycine характеризуется мономорфизмом еубъ-единичной композиции и постоянством доли среди других белков семян. Таким образом, генофонд культурной сои не располагает внутренними возможностями улучшения аминокислотного состава белка семян за счет глицинина.

Вариабельность белков семян и структура глицинина многолетней сои подрода Glycine Wjlld.

Исследованные образцы многолетней сои (подрод Glycine вша. ), в отличие от культурной сои, проявляют значительную вариабельность электрофоретического спектра белка семян. По типу электрофорети-ческого спектра 28 исследованных образцов оказалось возможным разделить на 10 групп (Табл.1), причем внутри каждой группы спектры разделения полипептидов в ДСН-электрофорезе были идентичны, а различия между группами касались более чем одной преобладающей зоны. Картина электрофоретического разделения белка семян не зависела от года и места репродукции образца. Это указывает на возможность использовать электрофоретическпй спектр белка семян как один из таксономических критериев на уровне вида к ниже. Распределение на группы, выполненное на основании этого критерия, в целом не противоречит данным кумерической таксономии ( Hewell, Ejmowits, 1978 .) по филогенетической близости исоледо- ■ ' ванных образцов. Интерес представляет образец G. toEentella к-8039, оказавшийся в одной группе с образцами вида clandestina; по данным Ньйэла и Хаймовица, эта линия сходна с G. clandestina и по морфологически;,i признакам.

При анализе состава белка семян образцов методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы было обнаружено, что в области II -I2S на профилях седиментации имеется пик различной интенсивности. Электрофоретическпй анализ соответствующих фракций градиента показал наличие трех групп полипептидов: 49-55 кД, 38-39 кД и 18-20 кД. Установление принадлжености этих фракций глицинину потребовало провести выделение Iis -глобулина по схеме, разработанной для глицинина о. аах . Полученная фракция се-диментировала в виде одного пика с константой lis л При хроматографии lia ионообменнике Mono Q после восстановления дает три группы пиков: основных полипептидов, не сорьирущихся на ионообменнике (мол. масса 18-20 кД) и кислых полдпептидов Ф1 и Ф2 о мол. массами соответственно 38-39 и 49-55 кД (Рис.2).

ТАБЛИЦА I

Распределение образцов лодрода С1ус:1ле на группы в соответствии со спектром разделения белков семян в ДСН-электрофорезе

tëfé Вид, линия Другие линии, отнесенные

группы образца (№ кат» иле иктр.ВИР) к данной группе

I I G, canescens

8027 8026 •

о 2 G. claadestiaa:

8030

3 3 интр.№367139 8032

4 4 8033

5 5 8035 8034

е интр.$367143

7 G. tomentella:

8039

6 8 8037 8040

9 интр.гё367189

7 . 10 G. tabacinaj

интр.Л387145 8017, 8018, 8020, 8021,

8022, 8005, 8008, 8015,

интр.Ж367157, 8016.

8 II 8023

S 12 8019

10 13 8007

Фракция Ф2 характеризовалась как гетерогенностью ло молекулярной массе для каждого образца в отдельности, так и вариабельностью меаду образцами. Чтобы установить отношение фракций Ф1 и Ф2 к двум подсемействам полипептидов глицинина культурной сои, были использованы иммунохимииеские метода.

Иммунохимическак характеристика полипептядов глицинииа культурной и дш:ой многолетней сок

Кислые полипептиды глицинина были разделены хрсматографически на колонке с ДЕАЕ-сефадексом А-50 (Рис.2); полученные электрофоре-тически чистыз фракции полипептидов Aj, А2. Ад и А4 использованы для иммунизации животных. Полученные сыворотки характеризовались значительной перекрестной активностью (Табл.2); поэтому с целью

ТАБЛИЦА 2

Характеристика препаратов антител к полипептидам, глицянина

Антиген исходной Характеристика препарата■ Кстощаыц. сорбент Связыв. сорбент Специфичность:

А2 А3 А4

сыворотки А1

А1 Иммуноглобулиновая фракция + + +'. +

А3 — „ — - - + + + +

А1 Антитела к детерминантам 1-го подсе-

мейства - Ат + + + +

. А1 Антитела к детерминантам, специфичным для 1-го подсемейства А3 Ат +

' Аз Антитела к детерминантам, специфичным для П-го подсемейства А1 h -г +

Аз Антитела к общим детерминантам двух подсемейств Aj, A3 + + + +

При?,очанке к таблице: специфичность антител опседеляли в реакции двойной ишунодкффузии и непосредственно в кммуноблотииге.

повышения специфичности антител.была предпринята очистка по сле-дущей схеме: сыворотку, полученную к полипептиду Ар истощали на колонке с иммобилизованным полипептидом Ад, затем наносили на колонку с ишобилизованным полипептидом Aj, с которой элюировали связавшиеся антитела. Аналогично очищали антитела к полипептиду A3. Эта процедура позволила получить фракции антител к антигенным детерминантам, маркирующим характерные особенности полипептидов каждого подсемейства, а также к общим детерминантам подсемейств (Табл.2). Антитела, различающие полнпептиды внутри каждого подсемейства получить не удалось вгяду высокой гомологии этих полипептидов (кммунохимической идентичности).

Полученные антитела были использованы з иммуяоблотинге с суммарным белком диких многолетни! видов подрода Glycine . Результаты " . свидетельствуют, что антитела к общим детерминантам подсемейств проявляют в лммуноблотинге те же зоны, что вины на электрофорезе очищенного глицинина; антитела к 1-му подсемейству - только зоны Ф1 (38-39 кД), а антитела ко П-г-ту подсемейству - только зоны Ф2 (49-55 кД)(Рис.3).

i 2 2 A 5 В to и и to в q.max

Ф2. С

CS r ; м <

+

1 t s h s 6 X J ю n _ {Z_i3 ¿¡.max

Ф2 j; ^^

СЙ «58» ■=» £3 '

&

Рис. 3. ДСН-электрофорез очищенного глицинива (а) и кмкунобл гинг белка семян видов подроде Glycine с антителами я Aj (б к А3 (в). Нумерация образцов соответствует табл.1. Указаны з соответствующее хроматографическим фракциям Ф1, Ф2 и основнк полияеятидов.

Полученные дяннне позволяют сд&адтъ следующие выводы. Во-пер-вкх, выделенные белки семян подрода Glycine действительно является Ils -глобулинами, гомологичными глицинину культурной сои. Во-вторых, эти белки проявляют, в отличие от глицинина культурной сои, некоторый полиморфизм. Поэтому следует заключить, что строгий мономорфизм глицинина культурной сок не связан с npini-ципиальными причинами (структурно-фушадональными ограначенияла на изменчивость белка), а определяется особенностями истории культивирования сои: вероятно, его причина в строгой генетической изоляции дикого предка при окультуривании с посдедущиш широкими селекционными скрещиваниями. Что касается диких многолетних видов, то они существуют в природе как географические кзоля-ты, что, возможно, и определяет поддержание полиморфизма. С практической стороны этот вывод предполагает перспективность привлечения неиспользованных возможностей генофонда дикой многолетней сои к селекции на качество белка семян. Третий вывод из полученных данных состоит в том, что при наличии определенного полиморфизма у глицинина подрода Glycine сохраняется не только само разделение полипептидов на два.подсемейства, но и характерные особенности полипептидных цепей двух подсемейств, ябля-вдиеся антигенными детерминантами. Это говорит о том, что к моменту эволюционного разделения подродов Glycine и s0ja дивергенция: двух подсемейств полипептидов полностью завершилась, причем наиболее важные функции сохранили за собой полипептиды 1-го подсемейства, что определило меньшую их вариабельность по сравнении с полипептидани П-го подсемейства.

Иммунохимический анализ полипептидов дегумпноподобних белков бобовых,гомологичных полипептидам глицинина сои

Для более детального выяснения происхождения двух подсемейств полипептидов lis -глобулинов анализу методом иммуноблотинга с антителами к полилелгидам глзщинива сои были подвергнуты суммарные белет семяк представителей различных триб бобовых. 3í-ло обнаружено, что антитела к полипептиду Aj связызаится с определенными электрофореткческгага зонами у всех исследованных видов бобовых (криле фасоли, у которой, согласно литературным данным, отсутствует легуминоподобный компонент запасного белка),

а антитела к Ад - у большинства видов. Предполагалось обнаружить таксономический уровень начала дивергенции подсемейств, т.е. такую степень филогенетического удаления, начиная с которой антитела к двум подсемействам глицинина будут связываться с одними и теш же пошшептидами, либо антигенные детерминанты, специфичные для подсемейств, вообще перестанут тестироваться. Анализ полученных результатов показал, что у большинства исследованных триб антитела к А^ и А3 связываются с различными по-липептидсми (Табл.3). Исключение составляют представители три<&

ТАБЛИЦА 3

Характеристика иодилептидов дегушноподобннх белков бобовых, гомологичных пслипентвдам двух подсемейств глицинина сои

Вэд Триба Мол. массы (кД) полипептидов в ДСН-эяектрофорэзе, проявляемых антителами: только только К Ат Е К А' к К Ад х

Glsditsia triacanthos sf.Caesal- ■ 36 70

Lotus cormiatus picioideae Loteao 28 52, 53 -"

Desncdium сanadeeаe Eesmodea© 35,5 • 43,58-60 -

Caragaaa arbcrcsceno Galegeae 38

Astragalus r.axiaue и 35; 40 43-78 -

irifoliUB! pratense ÜSrifoleae 32 - -

Lupibus albus Genisteae 33;38-40 - -

L. polyfillus и 39 - -

L. luteue n 32-37 - -

Иеии sativum Viceae - - 40; 41

Vicia sativa и - 52 37; 37,5

Ijatliyrus satiwm ti 37; 55 38; 50 39; 41

Faba bona ■i 21; 55 - 38

Cicer arietinum Cicereao 39; 39,5 16 -

Jhus.eolus vulgaris ihaseoleae - - -

Примечание. Совпадение или несовпадение полипептидов, тлеющих 'близкие подвижности в ДСН-электрофорезе, проверяли при совместной обработке реплики антителами к двум подсемействам глицинина.

Viceae » 7 которых обнаружены полипептиды с антигенными детерминантами обоих подсемейств. Это, однако, не означает, что у этих видов отсутствует строгое разделение на два подсемейства (напротив, такое разделение было обнаружено при анализе последовательностей клонированных генов легумина гороха) ( Lycett et аа,, I9S4). Возможно, что у шкошх характерные участки молекул ле-гуминоподобных белков распределены между подсемействами икачо, чем у глицинина сои, т.е. распределение функций в ходе дивергенции шло по иному пути. С другой стороны, за пределами семейства бобовых ни у одного исследованного вида растений (подробнее см. ниже) антигенные детерминанты двух лодсемейстЕ не локализовались на разных полипептидах. Это позволяет предположить, что дивергенция двух подсемейств началась не позже,-чем на ранних этапах эволюции семейства бобовых (до выделения современных триб семейства) .

Антигенная гомология белков семян различных клюсов растений и полкпептидов глицинина сои

Для исследования происхождения мулътигенного семейства IIS -глобулинов в целом образцы белка семян представителей различных классов семенных растений были подвергнуты анализу методом ишу-ноблотинга. Полипептида, проявляющие антигенную гомологии с полипептидом Aj глицинина, были обнаружены у представителей всех подклассов двудольных (лотоса, конопли, подсолнечника, табака, моркови, пиона, хлематиса), подкласса лилиидов однодольных (овса и лука), класса хвойных голосеменных (лиственница). Гомология антигенных детерминант не нарушалась действием восстанавливающего агента и додецилсульфата натрия и обнаруживалась антителами к восстановленным к £ -алкзетрованяым полипептидам; это позволяет заключить, что детерминанты определяются последователь-костью аминокислот либо стабильным элементом вторичной структуры, а не третичной структурой белка. Поскольку такие элементы могут с заметкой вероятностью возникать независимо у негомологичных белков, был предпринят эксперимент с целью подтвердить неслучайный характер обнаруженных антигенных детерминант. Белки семян исследованных видов были подвергнуты центрифугированию в градиенте плотности сахарозы; профили седимннтацте у видов, у которых обнаруживались гомологичные глицикину полгпептиды, содержали пик е области II-I2S . При анализе фракций градиента

ч

и

а

м 0,6_

м ч

XD

tí

tí . ей Р, t* К о

sr

к аз.

о

Picus sylvestri3

Alliua capa

Lcxix siblrica

Elootioaa tabacun

Номер фракции

/2

Фракции

S

Рио. 4. Профшга седиментации в градиенте плотнов-ти сахарозы 10-30? (а)• белков семян растений; электрофорез (б) и иммуно-блотинг (а) фракций градас: ента белка семян лука (АШиш сора) . Нанесено 2-4 мг белка на пробирку и 1/20 объема фракции на электрофорез. Нумерация фракций от дна пробирки. Указаны фракции, проявляющие гомологии с глицкнином.

в иммуноблотинге обнаружено, что голмунохимически гомологичные глицинину полипептяды локализуются во фракциях с константой седиментации 11-125 , и отсутствуют в остальных фракциях гра-. диента (Рис.4). Это подтверждает неслучайный характер обнаруженных антигенных детерминант, и позволяет заключить, что в семенах различных классов семенных растений присутствуют II s -глобулины, составленные из полисептадов, гомологичных полипептидам глицинина сои.

Природа гомологичных антигенных детерминант и происхождение семейства II s -глобулинов

Тот факт, что в проведенных экспериментах гомологичный сигнал в иммуноблотинге проявлялся при одинаковой нагрузке белка и одинаковой концентрации антител независимо от филогенетической •удаленности видов растений, позволяет предположить, что у IIS -глобулинов яммет место не постепенное уменьшение сродства многих антигенных детерминант, а высокая консервативность небольшой доли икмуяогеншх эпитопов белка. Данные позволяют заключить, что IIS -глобулины растений содержат высококонсервативные фрагменты паютептидной цепи, характерные только для этого семейства белков. Мояяо предположить, что эти фрагменты являются своего рода "функциональными центрами" IIS -глобулинов. При анализе последовательностей нуклеотидов клонированных генов Ils -глобулинов (Borroto, Dure, 1987 ) такге показано, что области генов, кодирующие кислые псшшептида, содержат непротяженные области гомологии для сравнительно удаленных видов (например, соя а овес). Некоторые из этих областей могут определять обкаруяеннув в настоящей работе акткгекнуг гомологию.

Данные позволяют оценить эволюционную древность семейства Ils -глобулинов. Не вдаваясь в рассмотрение происхождения голосеменных и покрытосеменных, можно указать, что семейство Ils -глобулинов древнее их эволшнонного разобщения; таким образом, возможно, что IIS -глобулины формировались одновременно с дифференциацией запасающей функции семени, и являются неотъемлемым компонентом запасадяей ткани селян. Лишь впоследствии у некоторых групп растений они были вытеснены другими, эволю-ционно более молодыми классами запасных белков.

Что касается конкретной функции обнаруженных высококонсервативных структур, то важнейшей функцией запасных белков, как

полагают, является участие в клеточной системе компарментализа-ции, т.е. направление белков от мест синтеза в белковые тела, агрегация, и, возможно, последующий транспсрт к клеткам зародыша (секреция). Белкове тела, позволяющие клетке запасать большое количество белка без кристаллизации, являются важным эволюционным приобретением семенных растений, и могут определять давление стабилизирующего отбора, обусловившее обнаруженный консерватизм Ils -глобулинов.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании глицинина различных сортов культурной и дикой уссурийской сои методами электрофореза, изоэлектрофокуси-рованкя и вксоксраорешахщей. жидкостной хроматографии не обнаружено отличий в молекулярных массах, и зарядовых свойствах newmnsn-тидоз Ар Ар (1-е подсемейство), A3, А^ (П-е подсемейство) и основных полипептидов, составляющих молекулы глицинина у всех исследованных образцов, что указывает на мономорфизм субъединичного состава. Методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы показано, что общее количество глицинина (IIS -глобулина) постоянно у всех исследованных образцов.

2. Показано, что IIs -1'лобулин представителей подрода Glycine содержит два типа кислых полипептидов, гомологичных соответственно 1-му и П-му подсемействам полилептидов глицинина G* в3* , причем полипептиды, гомологичные П-му подсемейству, проявляют вариабельность по молекулярной массе и зарядовым свойствам.

3. Показано, что признак электрсфоретического спектра белка семян Может быть использован для уточнения таксономии в подроде

Glycine..

4. Методом иммуноблотинга с антителами к антигенным детерминантам, специфичным для каждого подсемейства полипептидов гли-цшшка, к с«5:ц:2л детерминантам подсемейств и к основным полипептида:.!, выделенными из сывороток с помощьк имууноаффинной хроматографии-, исследована гомология полипептидов IIS -глобулинов семейства бобовых, различных видов других семейств семенных растений. Показано наличие на полипептидах легуминоподобных белков консервативных антигенных детерминант, гомологичных детерминанта.; дйух подсисейств глицинина. Показано, что антигенные детерминанты полилептида Aj глицинина являются более консервативными по сравнению с детерминантами полипептида A3.

5. На основания анализа распределения антигенных детерминант двух подсемейств среди полипептидов легуминоподобных белков различных триб бобовых сделано предположение, что дивергенция . двух подсемейств началась не позже формирования основных триб семейства бобовых.

6. Обнаружена антигенная гомология полипептидов глицинина з запасных белков различных классов цветковых и голосеменных растений. Показано, что гомологичные глицинину сок антигенные детерминанты принадлежат белкам, имеющим константу седиментации в градиенте плотности сахарозы порядка IIS, и не обнаруживаются у других компонентов белка семян. Сделан вывод, что формирование семейства II S-глобулинов произошло не позже эволюционного разделения голосеменных и покрытосеменных и проходило одновременно с дифференциацией запасаицей функции семени.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Алексенко А.Ю., Егшпин С.М., Киселев С.Л. ,.Химич Н.М., Вкнец-кий Ю.П. Экспрессия генов в созревающих семенах сои. В сб.: Геном растений: структура и экспрессия. Уфа, 1983, с.ПО-118.

2. Алексенко А.Ю., Сичкарь В.И,, Тимохина Е.А., Мусатова A.A., Винецкий Ю.П. Консервативность субъединичного состава глицк«и-

- гна у различных образцов сои - культурной и дикой уссурийской. Генетика, 1985, т.21, C.II85-II9I.

3. Alexenko A.J., Sichiar V.l., ELmokhiaa Е.А., Musatova A.A., Yinetaki Ju.P. Subunit composition of glycinin fron various s&nples of soybean. Soybei^'Genet.Newsletter,1985,v.12,рЛ03~11О

4. Алексенко А.Ю., Николаев И.В., Винецкий Ю.П. Особенности эволюции двух групп полипептидов, составлягщих молекулы легуминоподобных белков в семействе Fabacese . Тез. ÏÏ Всесоюзного совещания по генетике соматических клеток. Звенигород, 1986,

с.12.

5. Алексенко А.Ю., Седова Т.С., Николаев Й.В., Винецкий Ю.П. Полиморфизм запасных белков многолетней сои подрода Glycine Генетика, 1987, т.23, с.135-143.

6. Алексенко А.Ю., Николаев И.В., Винецкий Ю.П. Характер вариабельности запасного II s-глобулина сои. С.-х. биология, 1987, »2, с.13-18.

7. Николаев И.В., Алексенко А.Ю., Химич Н.М., Винецкий Ю.П. Особенности эволюции запасных белков бобовых, юямунохвми-

чески родственных ползшептидам глицинина сои. Журн. эволпц. биохимия и физиологии, 1987, т.23, с.174-179.