Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль клубеньковых форм аспартатаминотрансферазы у гороха (Pisum sativum L.)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль клубеньковых форм аспартатаминотрансферазы у гороха (Pisum sativum L.)"

РГ6 од

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ 7 ',.'.. '.I СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБЙОЛОГИИ

РАСХН ,

На правах рукописи

ФЕДОРОВА Мария Юрьевна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КЛУБЕНЬКОВЫХ ФОРМ АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ У ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.)

Специальность: 03.00.07 — Микробиология 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1993

Диссертационная работа выполнена в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Научный руководитель — доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН — И. А. Тихонович.

Официальные оппоненты — кандидат биологических наук Л. И. Па-роменская; доктор биологических наук С. В. Каменева.

Ведущее учреждение — институт биохимии им. А. Н. Баха РАН, г. Москва.

Защита состоится &3 * 1993 г. в час. на

заседании Специализированного совета К 020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкнн-6, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан » 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А. Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1

_Актуальность_проблемы± Способность бобовых растений усваивать молекулярный азот атмосферы является результатом их эффективного симбиоза с почвенными бактериями родов Rhizoblum и Bradyrhizobium. Фиксация молекулярного азота и его включение в метаболизм растения осуществляются в специализированных органах бобового - корневых клубеньках, формирование и функционирование которых основано на взаимозависимой экспрессии многих растительных и бактериальных генов (Quispel et al, 1988). Интенсивное изучение Ообово-ризобиального симбиоза в последнее время определяется не только ' экономической и экологической значимостью фиксации атмосферного азота, но и общебиологическими проблемами. Это связано с тем, что в ходе сложных последовательных взаимодействий между бактериями и. растением происходит взаимное влияние партнеров на такие фундаментальные процессы, как клеточное деление и

дифференцировка,' характер питания и метаболизм (Long, 1989). Возможность разнообразного экспериментального манипулирования-симбиотическим процессом делают его удобной моделью для изучения таких явлений. Поэтому всесторонний биохимический, генетический и молекулярно- биологический анализ симбиотических взаимоотношений является вкладом в'понимание механизмов явлений общебиологического порядка и, в частности, в углубление ■ наших представлений ■ о дифференциальной экспрессии растительных генов. Дифференциальная экспрессия генов растения в клубеньках приводит к синтезу de novo некоторых белковых продуктов (нодулинов - N) и к усилению синтеза ряда других, так называемых клубеньково- стимулируемых, полилептидов (Nst-полипептидов). Идентификация таких белковых продуктов и анализ- их роли в клубеньках бобовых представляют несомненный интерес. Известно, что N- и Nst- полипептидами в клубеньках могут являться,- в частности, субъединицы некоторых ферментов. Выбор в качестве объекта изучения аспэртаташнотрансферазы (ААТ) диктовался большой значимостью этого фермента для амид - транспортирующих бобовых, и предполагаемым существованием Nst-формн фермента у не изученного в этом отношении- гороха. Поскольку синтез N- и Nst- полипептидов подвергается контролю со стороны обоих симбиотических партнеров, то исследование таких ферментов перспективно и с точки зрения изучения регуляции дифференциальной экспрессии контролирующих их генов.

Цель__и__задачи__работыд Целью настоящей работы явились

гашшение растительных полипептидов, дифференциально гсштезирующихся в клубеньках гороха, а такзе подробный анализ одного из них - изоферуента ААТ-2, синтез которого стимулируется при клубенькообразовашш.

Конкретные задачи работы состояли в следующей:

- определить природу (растительную шш бактериальную) и характер синтеза (конститутивный или органоспецифический) идентифицируемых в клубеньках цитоплазматических водорастворимых пол!тептидов!

- определить количество водорастворшшх N- и Nat-полипептидов н проанализировать возможности различных методических подходов для ах выявления;

- выявить изменения в активности ААТ, происходящие при клубенькообразовании, и идентифицировать ААТ-2- подобную форму фермента;

- с помощью электрофореза и ишуноблоттинга • изучить субъединичную структуру ААТ-2;

- определить характер наследования ААТ-2 и хромосомную локализацию кодирующего ее гена;

- изучить особенности ААТ в неэффективных клубеньках с целью сравнения вклада шкро- к ыакросимбионтов в синтез ААТ-2.

На2чная_новизн!ь Продемонстрировано возрастание активности ААТ при клубенькообразовашш, обусловленное усиленным синтезом list- форш фермента - ААТ-2. Изучена экспрессия различных изофора ААТ-2 у разных форм гороха, определен их характер наследования п внутриклетйчная локализация. Проанализирован вклад растительного и бактериального партнеров в синтез и активность ААТ-2. Впервые, ..на базе ультраструктурного-и биохимического анализа 4-х типов Р1х~-клубеньков, образованных различными бактериальными мутантами, изучено влияние шкросимбионта на синтез и активность растительного фермента. Анализ ААТ-2 в онтогенезе Fix+-. и 1?1х--клубеньков позволил выдвинуть гипотезу о' контроле синтеза лзсфермента при симбиог'енезе. Обнаруженное влияние бактериальнЬго "партнера на синтез растительной ААТ позволяет значительно расширить круг моделей для изучения регуляции синтеза ферментов.

ОВ§ктическ0Я_зиачимость. Подобранные модели симбиоза могут быть использованы в исследованиях по изучению генетического

контроля и регуляции синтеза клубеньковых форм фёрментов. Исследование последних представляет практический интерес и при разработке селекционных программ: изучение регуляции N- и Nst-ферментов позволит понять биохимические основы эффективности ассимиляции азота в клубеньках и, на основе подбора сочетаний форм ферментов, определить пути повышения эффективности симбиотической азотфиксации.

Апробация_работы. Результаты работы были представлены на: VIII всесоюзном Баховскоы коллоквиуме по азотфиксации (Кобулети, СССР, I9Ó8), V международном симпозиуме по молекулярной генетике взаимодействия растений с микроорганизмами (Интерлакен, Швейцария, 1990), I всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, СССР, 1991), VIII восточноевропейской симпозиуме по биологической азотфиксации "Nitrogeníix-92" (Саратов, Россия, 1992), VIII (Ноксвилл, США, 1990) и IX (Канкун, Мексика, 1992) мевдународных конгрессах по азотфиксации.

Публикации^ По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и^объем работы^ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, описания результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа'изложена на 189 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 23 рисунка. Список литературы включает 283 наименований, в том числе 19 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследований .

Растительный мтертл. В работе были использованы следупцие формы гороха: Виола, Немчиновский, SG, К-3302, 3/3, 3/1I, К-6335, 32/4, 32/12, NGB 101238, Спринт-2, CnpHHT-2Fix", а также люцерна сорта "Saranac". Семена стерилизовали концентрированной серной кислотой, высаживали в керамические сосуда с песком и выращивали в условиях теплицы. Нитрогеназную активность растений измеряли ацетиленовым методом (Алисова, 1979). • ' ' -

• Батерналъчи? ет/.л'-чЛ Растения гороха инокулировали штамыаыя R.Legunínosafum: эффективном - 1026, либо неэффективными: VF39-23, VF39-32 (мутанты по синтезу липопояисахаридов), IMA-78 (Тп5-иисерция в НИН), IDG4 (незйективный почвенный изолят). Растения лщерин инокулирсвали г'Мективным штаммом R.mellloti CXM-I.

Бактерии выращивали в пробирках на скошенной бобовой агаре при 28°С либо в жидкой среде ТУ (Beringer, 1974). Инокуляцию проводили водной суспензией бактерий в количестве Ю^-Ю® клеток на растение.

Методы экстракции белков. Водорастворише белки из растительного материала выделяли гомогенизацией в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 6,8 и отбором супернатанта после центрифугирования при 14000 g в течение 20 мин. Для получения водорастворимых белков из бактерий последние предварительно подвергали Зх-4х-кратному замораживанию- оттаиванию. Водорастворимые белки из бактероидов получали после выделения последних методой ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы (2 мл 60% сахарозы, 2 мл 54% сахарозы) при 31000 грт в течение I часа и их кипячением в ДСН-буфере для проб. Выделение ферментов осуществляли гомогенизацией тканей в 100 мМ MES-буфере . рН 6,8, содержащем I53S этиленгликоля, 2% 2-ыеркаптоэтанола, 100 мМ сахарозу, центрифугированием гомогената при 14000 g в течение 20 мин и отобором супернатанта. Концентрацию белка в пробах определяли по методу Лоури (Lowry et al, 1951).

Системы гелъ-электрофореза. Электрофорез в неденатурируюцих условия проводили в вертикальных блоках ЮЖ полиакриламидного геля (ПААГ) по методу Орнштейна (Ornstein, 1964), Одномерный . и двумерный электрофорез в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия проводили в вертикальных блоках 12% ПААГ по методу Лзммли (Laemmli, 1970).

Трансляция мРПК в системе In vitro и имунопреципитация' продутой трансляции. Выделение клубеньковой мРНК, осуществляли методом фенольной экстракции (Клеменс', . 1987а). Трансляцию мРНК проводили 6 бесклеточной системе экстракта зародышей пшеницы, продукты трансляции осаждали соответствующими антителами • ■ и анализировали ДСН -электрофорезом (Клеменс, 19876).

Получение и очистка ' аншисывороток. ,Антисыворотки к водорастворимым белкам клубеньков и . водорастворимым белкам'. бактерий R.legumlnosarum 1026 получали подкожной иммунизацией кроликов соответствующими белконнми препаратами в течение I месяца с интервалом в 7 . дней'. Кровь отбирали ' через 10 дней после! 'последней инъекции из краевой вены уха, фракцию иммуноглобулинов осаждали преципитацией (ЯН^УрРОд до' 3555 насыщения. Истощение антисыворотки корновыми белками проводили иымуноаффинпой хроматографией на CNBr- активированной Сефзрозе 4В по' методике

фирмы 1 "Pharmacia". В работе были использованы' также Ионоспецифические антитела на леггемоглобин, AAT-I и ААТ-2 клубеньков люцерны, предоставленные профессором К.Вансом (Миннесотский Университет, США).

ИммуноОлошинг. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (1KB, диаметр ' пор 0,2 либо 0,45 мкм) осуществляли электрофоретическим способом в 0,25 М фосфатном буфере, pH 6,5. Нитроцеллюлозу блокировали 3% раствором молока на IBS-буфере и обрабатывали - первыми антителами. В качестве вторых .антител использовали козьи антитела против Ig кролика, конъюгированные с пероксидазой. Комплексы антиген-антитело обнаруживали выявлением пероксидазной активности с помощью HgOg, используя в ■ качестве субстрата раствор о-дйанизидна либо ,4-хлоро-1-нафтола (25 мкг/мл IBS-буфера). • J

Измерение активности ферментов in vitro. Активности $осфоенолпирува!гкарбоксилазы (ФЕПК), НАДН-зависимой

глутаматсинтазы (НАДН-ГОГАТ), малатдегидрогеназы (МДГ) и аспартатаминотрансферазы (ААТ) определяли в прямых или сопряженных реакциях, сопровождаемых окислением НАДН, мониторинг окисления осуществляли спектрофотометрически при 340 нм (Rosendahl et al, 1989; Griffith and'Vance, 1989).

Получение зимограля ААТ проводили по методу, описанному ^риффнтсом и Вансом (Griffith and Vance, 1989).

Трансмиссионная электронная микроскопия. Клубеньки фиксировали в 2,555 глутаровом альдегиде, IX ОвОд и IX галовой «слоте и после обезвоживания заключали в аралдит. Срезы толщиной 300-500 А приготовляли на ультратоме III (£КВ) и .контрастировали гранилацетатом и цитратом свинца.

* Методы генетического ажииза. Были использованы результаты жрещивания двух линий гороха: Сприга"-2Р1х"" и NGB-101238. Линия Jnpmrr-2Fix~ маркирована следующими морфологическими мутациями: a, d, I, Fs. Линия NGB-101238 - b, k, Bra, wb, tlw, il, fr, fr«, pro, .e, cp—1, te, gp, Bru, в, üst, i, . r, fn (Blixt, | 1975). 'енетический анализ проводили на растениях поколения Fg* юлученных путем самоопыления растений Fj. Соответствие реальных >асщеплений ' теоретическим рассчитывали с помощью критерия X2 Глотов и др.1982); частоту рекомбинации между генами определяли [о методу максимального правдоподобия • (СереСровский, 1970) с [омощью программ для 1Ш "PLANTS" и. "CROSS", написанных Розовым

- б -

С.Ы. (Институт Цитологии и Генетики РАН, г, Новосибирск).

Результаты и их обсуждение.

I. Идентификация полипешидов, специфических Зля клубеньков гороха

Основной задачей исследования, представленного в данной разделе, являлось описание спектра индуцирующихся в клубеньках гороха полипептидов и выявление среди них N- и Nat- белков. Многовариантное применение метода иммуноблоттинга с антисыворотками различной специфичности и постановка разнообразных контролей показали, что большая часть полипептидов конститутивно синтезируется и в корнях, и в клубеньках. После ■ истощения шш клубеньковой антисыворотки выявляется несколько Nst-полипептидов. И, наконец, большая часть специфических для клубеньков полипептидов имеет ' бактериальное происхождение. С помощью антисывороток в клубеньках гороха удается идентифицировать всего 5 мажорных водорастворимых нодулинов (включая леггемоглобин). Небольшое количество мажорных нодулинов было выявлено также путем, трансляции in vitro. Полученные результаты свидетельствуют о недостаточной разрешающей способности указанных методов для детального анализа грубых экстрактов клубеньков. Кроме ' того, функции выявленных N- и Nst-полипептидов остаются неизвестными, что делает использованный метод их изучения иалоперспективнш,' хотя, он и является важным для формирования представлений о природе и характере синтеза полипептидов в клубеньках.

Поскольку наиболее вероятная функция водорастворимых N- и Nst- полипептидов состоит в их участии в различных .ферментативных процессах, то среди них следует искать, прежде всего,, субъединицы ферментов,'активность которых-в клубеньках выше по сравнению с корнями. Последующие разделы диссертации посвящены исследованию таких ферментов и, в первую очередь, клубеньковых форм ААТ.

II. Активности некоторых ферментов из корней и клубеньков гороха,

. Были проанализированы удельные активности четырех ферментов; связанных с С- и N- метаболизмом (табл. I). Показано, что клубеньки характеризуются более высоким, по сравнению с корнями,'

Таблица I. Содержание врдорастворимого белка и активфсть ферментов в корнях и клубеньках гороха сорта Виола .

орган белок мг/г с.в. ■ активность ферментов (нмоль/мин мг)

ФЕПК НАДН-ГОГАТ МДГ ААТ

корни. 2,6±0,8 167±14 42+3 1172±314 155+29

Р1х+-клубеньки 9,1±0,2 210+06 63+1 1230±170 520t140

Р1х~-клубеньки 4,8±0,5 107±23 6б±9 1300±130 170+60

содержанием белка, а также возрастанием акивностей ФЕПК, НАДН-ГОГАТ и ААТ, причем наиболее значительное возрастание активности при клубенькообразовании наблюдалось для ААТ,' которая и была выбрана в качестве объекта для детального изучения. '

III. Дифференциальная экспрессия генов при развитии симбиоза на примере молекулярных форм' аспартатаминотрансферазы (ААТ).

III—I. ААТ при неэффективном симбиозе

XII—1-Х. Изоферментный спектр ААТ из корней и клубеньков. ' Анализ зимограмм ААТ из корней и клубеньков гороха и люцерны показал наличие двух групп изоферментов: AAT-I и ААТ-2 (рис. I)s AAT-I является доминирующей формой фермента в корнях, и при. клубенькообразовании его активность уменьшается, параллельно со значительным возрастанием активности ААТ-2. Следовательно,, возрастание тотальной активности фермента при формировании клубеньков.обусловлено возрастанием активности изофермента ААТ-2.

* П1-1=2±_Иммунох1^чесгай_анажз_изофериен

Йммуноблоттинг корневых и клубеньковых белков с анти-ААТ-1 люцерны выявил отсутствие иммунохимического родства AAT-I-подобных. белков у люцерны и'гороха, что должно быть связано с существенными различиями в первичной структуре изоферментов у этих бобовых, подтверждаемой их различной электрофоретической подвижностью. В то же время, иммуноблоттинг с*анти-ААТ-2 люцерны показал следующее:

1.* ААТ-2 является ферментом растительного происхождения, поскольку отсутствует перекрестная реакции анти-ААТ-2 с . бактероидннми полипептидами;

2. ААТ-2 у люцерны и гороха иммунохимически родственны;

' . 3. ААТ-2 этих видов бобовых имеет одинаковый молекулярный вес

субъединиц (около 40 кД);

4. количество ААТ-2 в корнях меньше, чей в клубеньках. Следовательно, возрастание тотальной активности ААТ при клубенькообразовании обусловлено более интенсивный синтезом ААТ-2, и ее ножно считать Ыв*-формой фермента.

Ш-1-3. Скрининг различных форм гороха по изоферментному спектру

Ш•

Анализ изоферментных спектров ААТ у шести форм гороха выявил одинаковый спектр ААТ-1 и вариабельность по электрофоретической подвижности ААТ-2, что позволило разбить изученные формы гороха на три фенотипических класса (рис. 2):

1. - формы, имеющие лишь медленную изоформу - ААТ-2а;

2. - формы, имевдие лишь быструю изоформу - ААТ-26;

3. - формы, обладающие обеими изоформами ААТ-2 одновременно*

Иымуноблоттинг с анти-ААТ-2 показал, что антитела узнают .обе

иэофорыы ААТ-2. Кроме того, молекулярный вес субъединиц, составляющих ААТ-2а и ААТ-26, оказался одинаковым (40 кД).

П1-1-4. Спектр ААТ из различных органов растения.

Анализ изоферментного спектра ААТ-2 показал, что.в различных органах одной, и той же формы гороха синтезируются одинаковые изоформы ААТ-2 (а или б). Отличия между разными органами растения заключаются лишь в количественных характеристиках:' наибольшая активность ААТ-2 была отмечена в клубеньках, промежуточная - в' листьях, и наименьшая - в коршйс. Выявление меньшего количества ААТ-2 не только в корнях, но и листьях, а также различный уровень экспрессии гена ААТ-2 в разных органах растения, подчеркивают ^-характер йзофермента, его наибольшее значение в клубеньке я, вероятно, наибольшую приспособленность к функционированию в физиологических условиях.клубеньковой ткани.

1Н-1-5. Генетический анализ наследования ААТ-2. '

' Наличие обеих йзоформ ААТ-2 (а и б) одновременно у растений с. Виола не позволяло предполагать Ьх ноногенный контроль. Однако/ при скрининге индивидуальных растений оказалось, что часть растений обладает только ААТ-2а; тогда как другая - только ААТ-26,. Это сделало возможным выдвинуть гипртезу : о кодировании изофорц

Рис.

I. Изоферментный спектр ААТ клубеньков люцерны и гороха.

А

из корней и

ААТ-1

ААТ-2

А - люцерна, Б - горох; I - корни, 2 - клубеньки.

РисЛ_2. Изоферментный спектр ААТ из клубеньков различных форм гороха.

б ААТ-2

I- 3302, 2- Немчиновский, 3- Спринт-2, 4- ВС, 5- ЫСВ 101238, 6- Виола

Рисх3, Схема изоферментного спектра ААТ у линий Спринт-2Р1х", ЫСВ 101238 и растений Р2-поколения.

- \

■ а

ААТ-2 б) г,

4

'5'

.1 2 3 .

Спринт-2Р1х~, 2- ИБВ 101238, 3-5- Р2~поколенив.

Б

ААТ-2 одним геном. Были проанализированы растения Р2-покрления, полученные при самоопылении гибрида Fj от скрещивания гороха линий Спринт-2Р1х~ и NGB 101238, обладающих • контрастными изоформами ААТ-2 (ААТ-2а и ААТ-26, соответственно). В результате анализа расщепления признака "изоформа МТ-2" растения были распределены по трем фенотипическим классам: I. - растения, имеющие только ААТ-2ai 2. - растения с еремя изоформами ААТ-2 одновременно: ААТ-2а, ААТ-26 и ААТ-2г;- 3. - растения, имеющие только ААТ-26 .(рис.3). Соотношение фенотипических классов составляло 13:18:10 и .соответствовало моногенному расщеплению 1:2:1 (Х^ОЛв; 0,3<р<0,4). Таким образом, ААТ-2а и ААТ-26 кодируются разными аллелями одного' гена, • а растения с тремя изоформами ААТ-2 одновременно являются гетерозиготными.

Биологический смысл(дифференциального синтеза разных изоформ ААТ-2 остается непознанным. Исследования на люцерне показали отсутствие корреляции между генотйпом ААТ-2 в популяции й эффективностью азотфиксации■ (Farnham et al, 1992). , Повидимому, .возможные' различия в, кинетических свойствах изоформ ААТ-2 могут компенсироваться другими механизмами, например, дифференциальным синтезом других ферментов, функционально связанных с ААТ.

III-1-6. Субклеточная локализация ААТ-2.

Линия NGB I0I238 является множественно маркированной генетической линией, несущей в своем генотипе маркеры a (anthocyan Inhibition) и М (тагтогёив),.сцепленные, соответственно, с генами для пластидной ААТ (I группа сцепления на расстоянии 25 сМ) и цитоплазматической ААТ (III группа сцепления на расстоянии 25 сМ) из листьев гороха (Weeden and Marx, 1984, 1987). . Мы проанализировали характер совместного наследования ААТ-2 - а и ААТ-2 - М у растений^¿-поколения . (таблица 2). Полученные данные свидетельствуют что ген, кодирующий ААТ-2, находится в I группе сцепления и кодирует, таким образом, пластидную форму.фермента.

III-2. ААТ при неэффективном симбиозе',

1Пг?г1л_ШуаЗ^§с™тельндго_и_бактери ■ ?ктмвности_ААТ_в_незф^ . Была определена' in vitro активность ААТ у Fix+-, а также Fix-- ю1убенькоэ, образованных:

Таблица 2. Численности фенотипических классов в поколении и

частота рекоибинации между генами А и ААТ-2, а также М и ААТ-2 после скрещивания тестерной линии ШВ 101238 и линии

Спринт-2Р1х~

гены количество растений I-I I—г 1-2 2-1 в классе 2-г 2-2 частота рекомбинации ^(О.б)

А - ААТ-2 8 14 4 2 4 9 26,6% ±7,8% 14,46 р<0,0005

М - ААТ-2 7. 11 5 6 6 4 ' 53,5% ±9,7% 1,30 р<0,3

* I - фенотип NGB 101238 (А m ААТ-26); 2 - фенотип Спринт-2Р1х" (а И ААТ-2а); г - гетерозигота по ААТ-2 (а,б,г)

I. Р1х+-растительнын и Р1х~-бактериальным партнерами; 2. Р1х~-растительным и Р1х+-бактериальным партнерами; 3. обоими Р1х~-партнерами.

В неэффективных клубеньках активность фермента была в 1,8-2,6 раза ниже по сравнению с эффективными,«при этом мутация у растения вызывала несколько большую редукцию активности ААТ, чем мутация бактериальная, а при использовании обоих Р1х~-партнеров было отмечено их аддитивное влияние. Было показано, что уменьшение активности ААТ в Р1х~-клубеньках вызывалось снижением синтеза ААТ-2. Это, возможно, было. обусловлено отсутствием своеобразных физиологических условий, присущих Р1х+-клубёнькам (высокая pH, низкое pOg), способных активировать экспрессию некоторых генов N-и Nßt-' балков.

1П-2;2._АЛТ_в_неэффек'1™ш1х_^убеньках1__образованных__различными

' ü^^^jofl^MyTai^Jiix^m •

'.Изучение ультраструктуры инфицированных клеток Pix*-, ö также Р1х_-клубеньков, образованных различными бактериальными мутантами, выявило, что все Р1х~-клубеньки отличались по ряду параметров не только от Р1х+-клубеньков, но и между собой, что позволило предположить блокировку нормального развития симбиоза в них на достаточно поздних, однако, разных этапах.

Сравнительный анализ (табл.3) показал разную степень редукции активности ААТ.за счет уменьшения количества ААТ-2 у различных типов Р1х~-клубеньков, не ' коррелирующую, однако, со степенью дифференцирова.нностн бактероидов, но пропорциональную уменьшению количества одного из нодулинов (леггемоглобина). Последний феномен

1 12 -

может .указывать на наличие общего сигнала/ов, регулирующих экспрессию генов ААТ-2 и леггеиоглобина.

Таблица 3. Биохимические характеристики Fix'*'- и Fix-- клубеньков.

характеристика - клубенька е 1026 штамм VF39-23 VF39-32 IMA-78 1064

количество леггеиоглобина уменьшается

активность ААТ- (нмоль/мин мг) 520 430 300 260 •170

количество ААТ-2 уменьшается

■_____ ______________ ________________

III-2-3, ■ Динамика активности ААТ при развитаи эффектавных_я

неэ$фективных_кл1бецьков± > ® «

Анализ динамики, активности ААТ в онтогенезе Fix'*'- и одной из ' вариантов Р1х~-клубеньков, образованных R.leguminoearum" 1064, показал, что в.первых возрастание активности фермента происходит в два этапа , тогда как во. вторых - лишь единожды и со сдвигом во времени (рис. 4). Профиль динамики в Flx^-клубеньках может отражать наличие двух сигналов, индуцирующих синтез фермента*, один действует на этапе морфогенеза клубеньков и может иметь

■ бактериальное происхождение; а второй - при начале азотфиксации и быть связанным .с эффективностью клубеньков; Характер динамики активности ААТ для неэффективных клубеньков отличался от таковой, известной из литературы для Р1х~-растительного мутанта (Gantt et äl, 1992), что может отражать различную .природу неэффективности

■ Р1х~-клубеньков. * - '

Анализируя полученные результаты, можно выдвинуть гипотезу, что при становлении симбиоза контроль за уровнем Синтеза ААТ-2 определяется взаимодействием растительного и , бактериального' генотипов. Повидимому, уже при выходе бактерий из инфекционных нитей синтезируются сигналы, которые активируют усиленную экспрессию гена ААТ-2. В зависимости ,от\ особенностей симбиотической системы они могут связываться с различными по • силе регулкторкиш последовательносанми по типу известных . для . гена .леггеиоглобина (Jensen et al, 1990). Этим можно объяснить

скоординированные уровни синтеза ААТ-2 и 1Ь в различных типах Р1х~-клубеньков. С началом азотфиксации образующейся аммоний может являться дополнительным активатором экспрессии ААТ-2 в

Рисл_4^ Динамика активности ААТ в онтогенезе Р1х+- и Р1х"-клубеньков.

Р1х+-клубеньках и приводить ко второму этапу повышения синтеза фермента, отсутствующему в неэффективных. Приведенная гипотеза требует экспериментальных проверок, связанных, прежде всего, . с анализом регуляторных элементов в промоторе гена ААТ-2.

вывода •

•. I. Проанализирован спектр клубеньковых полипептидов гороха, полученных непосредственным выделением водорастворимых белков, ймыунохимическое тестирование антисыворотками различной специфичности продемонстрировало, что большинство идентифицируемых полипептидов либо имеют аналогов среди полипептидов' корней,' либо являютбя макромолекулами бактериального происхождения. Среда цажорных водорастворимых полипептидов выявлено лишь 4 нодулина . и несколько полипептидов, синтез которых в клубеньках стимулируется (^-полипептйдов).

■ 2, Показано, что в эффективных клубеньках- гороха активности фосфоенолпируваткарбоксилазы, НАДН-зависимой глутаматсинтазы и

аспартатаминотрансферазы (ААТ), а также содержание общего водорастворимого белка в несколько раз выше по сравнёнию с корнями. •

3. Анализ зимограмм активности ААТ из корней' и клубеньков выявил наличие двух групп изоферментов - ААТ-1 и ААТ-2. Показан их дифференциальный синтез в разных органах гороха. ААТ-1 является доминирующей формой фермент? в корнях; при образовании клубеньков активность ААТ-1 уменьшается, одновременно с этин значительно возрастает синтез и активность ААТ-2. Следовательно, ААТ-2 можно считать Лв^изоферментом.

4. Показано, что изофермент ААТ-2 у. изученных форм гороха может быть представлен- разными изоформами, различающимися по заряду молекулы,' но образованными из субъединиц одинакового молекулярного весе (40 кд). В пределах одной и той же формы гороха изоферментные спектры ААТ из корней, клубеньков и -листьев качественно не различаются. Иммунохимическое исследование продемонстрировало также гомологию -белков ААТ-2 у гороха и люцерны. '

5. Генетический анализ выявил моногенный • характер наследования ААТ-2. Синтез разных изоформ ААТ-2 определяется различными аллелями одного и того же гена, который локализован нами на первой хромосоме гороха и кодирует пластидную форму фермента.

6. Показано, что при использовании как растительных, так -и бактериальных мутантов,' приводящих -к образованию неэффективных клубеньков, происходит уменьшение активности ААТ засчет уменьшения синтеза изофермента ААТ-2. При использовании обоих мутантных партнеров одновременно наблюдается аддитивный эффект.

7. Изучение неэффективных клубеньков, образованных различила по природе мутантныьш штаммами рпзобий, показало различную степеш, снижения ' синтеза ААТ-2. Выявлено, что этот феномен хотя . и обусловлен бактериальной мутацией, но не зависит впрямую от степени диффёренцнрованности бактероидов в таких клубеньках. Показано, что уменьшение количества ААТ-2 в различных типах иеэ'йективылх клубеньков происходит параллельно с уменьшением количества леггемоглобина, что может'свидетельствовать о наличии общих регуляторных сигналов, контролирующих -„пятуз этих белков.

3. Показано, что развитие зОДедаишиП клубеньков гороха сопровождается 2-х-ступенчатыч повышением активности ААТ, в то

г.15 -

время как при развитии неэффективных клубеньков происходит лишь однозтапное небольшое повышение активности фермента. Полученный характер динамики предполагает, что в эффективных клубеньках действуют, по крайней мере, два сигнала, контролирующие синтез и активность фермента; при неэффективном симбиозе один из сигналов отсутствует.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. М. ¡0. 'Муравьева, 0. А. Куликова. Репрессия синтеза корневого белка бобовых растений при формировании клубеньков'. Бюллетень ВНИИСХМ, 1988, N 51, С. 23-26.

2. 0. А. Куликова, М. Ю. Муравьева, А. 0. Заленский, А. А. Филатов, И. А. Тихонович. Идентификация белков, .связанных с сиыбиотической азотфиксацией у гороха (Pisum sativum L.). Прикладная биохимия и микробиология, 19906 Т. 26, вып. 4, С. 506513.

3. М. Ю.Федорова, А. 0. Аврова, А. А. Филатов, И. А. Тихонович. Получение и тестирование поликлоналышх антител к белкам, индуцируемым в клубеньках гороха (Pisum sativum L.). Бюллетень ВНИИСХМ, 1990, N 53, С. 24-28.

4. A. Filatov, М. Fedorova, 0. Kulicova, N. Kruchinina, I. Tikhonovich. The spectra of pea late nodulins. Proc. 5th Int. Symp. on.the Molecular Genetics of Plant- Microbe Interaction. Interlaken, Switzerland, 1990, P. 393.

5. I. Tikhonovich, li. Fedorova, 0. Kulikova, N. Kruchinina, A. Borisov, Yu. Vollchenko, A. Gutkina, A. Filatov. Nodulins in the course of effective and ineffective symbiosis. Proc. 8th Int. Congr. on Nitrogen Fixation, Knoxville, USA, 1990, P. 770. ■

6. N.G.Kruchinina, M. Yu. Fedorova, A. Yu. Borisov, К. V. Ushakov, 0. A. Kulicova, A A Filatov. In vivo and iv vitro expression of polypeptides specific for root nodules of pea. 1st Ail-Union Symp. "Trends in Plant Biotechnology", Pushchino, USSR, 1991, P. 193-194.

• 7'. Fedorova U., Kruchinina N., .Filatov A., Tikhonovich I. Aspartate aminotransferase from symbiotic nodules of pea (Pisum pativumL.). Atystr. 8th Easter Europe Sympoeiura on Biological Nitrogen Fixation "Nitrogenfix-92", Saratov, Russia, 1992, P. 27.

8. Fedorova M. Yu., Kruchinina N. G., Borisov A. Yu.,. Rosov. S. M., TsyganovV., Filatov A. A., Tikhonovich I. A. Aspartate

ajninotransIeaBe irora symbiotic nodules of pea (Pisum sativum I.). Proc. 9th Int. Congr. on Nitrogen Fixation, Cancun, Mexico, 1992, P. 532. • • '

PTn.Tiin.BM?. Saii .2 rn. T.ip.IOj. 12.04.93.