Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СЕЛЕКЦИЯ ГРИБА BLAKESIEA TRISPORA-ПРОДУЦЕНТА БЕГА-КАРОТИНА И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВЫСОКОАКТИВНЫХ ШТАММОВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "СЕЛЕКЦИЯ ГРИБА BLAKESIEA TRISPORA-ПРОДУЦЕНТА БЕГА-КАРОТИНА И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВЫСОКОАКТИВНЫХ ШТАММОВ"



ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ им. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

На прам.х рукописи

\

ЮВДАРЬ Ирин» Владимире вне

СЕЛЕКЦИЯ ГРИБА В1АКЕ5Ш ТМ£ РОНА-ПРОДУЦЕНТА БЕГА-КАРОТИЙА И' ФЮШЛОГО-ВИОХШНШКИЕ СВОЙСТВА ВЫСОКОАКТИВНЫХ вггдмюв

Специальность- 03.00.07- микробиология

Автореферат диссертации кв. соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киек- 1992

I с

Работа выполнена в отделе генетики микроорганизмов и радиационной микробиологии Института микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного АН Украины и в лаборатории микробиологии Зерхнеднепровокого крахмало-паточного комбината Госпшцепрома Украины.

Научные руководители: член-корреспондент АН Украаны доктор биологических наук, . профессор Б.П.Мацелюх

старшая научный сотрудник,кандидат биологических неук А.С.Станы«) •

Официальные оппоненты;член-корреспондент АН Украины доктор Оиологичеокшс наук В. С. Подгорский!

доктор биологических наук с.С.Малига

Ведущая организация Киевский технологический институт пищевой Ерошшенности

У/") с'

Защита состоится *£() " ./¿¿XЛ- ХЭЭДг в -- - чао на заседании специализированного совета Д.016.03 при Институте микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного АН Украины по адресу¡262143,г.Киев 143,ул.ЗабеШ)»-ного,154

Автореферат разослав

"/У"

Ученый секретарь специализированного совета л/

ка яд адат биологических наук (Я/ло^ — Э, А. Коваленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, Бета-каротин широко распостранен в при^де и ооладает разносторонней и очень важной биологической активностью. Он обеспечивает нормальный рост организма и развитие плода,повыдает активность половых гормонов,стимулирует и нормализует рост эпителия, повшает устойчивость организма к инфекционным заболеваниям,обладает антигистаминной активностью, напнется полноценным заменителем витамина А, адаптирует организм к условиям гипоксии. Сопряженными двойными связями С=С молекула бета-каротина поглощает разные свободные радикалы,защищал клетки от мутагенного и канцерогенного действия ионизирующей радиации и химических соединений.

Бета-каротин широко применяется в пищевой промышленности,медицине, производстве комбикормов, косметических препаратов. В Украине и России бета-каротин получают микробиологическим синтезом в малых количествах. Основным сдерживающим фактором промышленного расширения производства бета-каротина является низкая продуктивность штаммов мухорального гриба Blakealea triapora , недостаточная изученность генетических свойств, а также физиологии и биохимии этого микроорганизма, лежащих в основе селекции высокопродуктивных штаммов.

Большая потребность в бета-каротине для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых радиоактивными и химическими загрязнениями продуктов питания, воды и почвы, о одной стороны, и недостаточно высокая активность штаммов гриба-продуцента бета-каротина, с другой стороны, делают весьма актуальным проведение систематических и целенаправленных генетико-селекционных и ^изиолого-биохи-мических исследований данного микроорганизма.

Цель и задачи исследования: Цель настоящей работы-оптимизация периодического процесса" синтеза микробиологического бета-каротина на основе селекции высокопродуктивных штаммов мукорального гриба Binkeaiea triapor« повышение эффективности их использования за счет изучения физиолого-биохимических свойств этих штампов, усовершенствования состава питательной среды и процесса промышленного культивирования.

Дня достижения поставленной цели необходимо было выполнить следующие задачи:

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сел ьскохоз ачадемии им. К. А. Тимирязева

1. Селекция, испытание и внедрение в производство новых, высокоэффективных штаммов грива Blakealea trispora _ Продуцента бета-карот ина.

2. Изучение морфологических,культуральных и фиэиолого-б иохи-мических особенностей селекционированных штаммов.

3. Оптимизация состава питательной среды и процесса промышленного культивирования для селекционированных штаммов гриба.

Научная новизна. Селекционированы высокоактивные разнополые формы К1(+) и KIÍ-) промышленного штамма ыукорового грибаBlakeslea tri sporn • образующие при совместном выращивании в колбах и ферментерах 1,56-2,24 г/л и 1,79-3,9 г/л бета-каротина соответственно. Штамм обладает повыоенной метаболической активностью к увеличенной проницаемость» клеточной оболочки, что придает ему технологические преимущества по сравнению с исходным штаммом, Разработаны методы получения, слияния м регенерации протопластов, метода поддерживающей селекции гриба В1. trispora , метод определения соотношения (+) и (-> форм гриба в сметанной культуре. Изучены морфологические, культуральные и физколого-биохимические свойства гетеро-талличных форм штамма КК+) и КК-). Осуществлена оптимизация состава питательной среди и процесса промшленного культивирования гриба. —___>

Практичное значение работы. Разработаны научные основы селекции высокоактивных штаммов гриба Bl. trispora ( получены, за-щщены авторским свидетельством и внедрены в производство на Вер-хнеднепровеном крахмалопаточном комбинате новый высокоактивный штамм продуцента бета-каротина КН+) ,КН-) и его варианты. Селекция и внедрение в производство выоокоактивного штата дали возможность увеличить выход целевого продукта на 20iE. Разработаны и внедрены кл комбинате предложения по оптимизации состава питательной среды н процесса промышленного культивирования гриба, что позволило значительно улучвшть производственные показатели, увеличить выход бета-каротина н снизить его себестоимость. Экономический эффект от внедрения научных разработок и рекомендаций за период 1903-1991г.г. составил 258,747 тыс.руб.

Апообашц работыг Материалы диссертации доложены на Всесоюзном семинаре "Биотехнология" в г. Николаеве 16,09.1991г.

-3- .

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 5 работ и одно авторское свидетельство.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста) содержит 17 рисунков, 24 таблицы и состоит из введения,обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, заключения, выводов и приложения. Список литературы включает 179 источников отечественных и зарубежных авторов. К диссертации приложен акт об экономической эффективности внедрения в производство предложенных разработок.

ОСНОВНОЕ СОДШШИЕ РАБОТЫ.

Обзор литературы. Включает данные о биологических функциях бета-каротина в микроорганизмах, водорослях, грибах, растениях, а также в жизнедеятельности человека и животных; содержит сведения о микроорганизмах-продуцентах бета-каротияа ,а также анализ работ по селекции му норового гриба В1. 1;г1арога с помощью современных генетических методов.

Магеш^алы,^.методы исследований» В работе использован продуцент бета-каротина гриб В1. гг1арога тта!м{+) 64, (~)490, партия 117. Гриб культивировали на сусло-агаре, цукоровом агаре, среде Чапека, МПА, агаре с добавкой 4-в£б кукурузной или ржаной муки. Глубинное выращивание (+) и (-) форм продуцента проводилось раздельно в качалочнмс колбах и посевных аппаратах емкость» Йм^ и совместно в ферментерах емкостью 10 мэ. При росте на сусло-агаре изучали состав каротиновдов в мицелии с помощью хроматографического и спектрометрического методов. При глубинном культивировании анализировали содержание аминного азота, неорганического фосфора, липидов, редуцирующих веществ, биомассы, бета-каротина по общепринятым методикам < Дудка И.А. и др.,1982). Экономический коэффициент и удельную скорость роста определяли по Пергу( Перт Дк., 1978).

Обработке мутагенами подвергали водную суспензию спор семисуточ-ной культуры, содержащей Кг-10® клеток/мл. В качестве мутагенных факторов применяли быстрые нейтроны, Я-метил-К-нитро-Г-нитроэогуани-дин, ультрафиолетовые лучи, антибиотики аминогликоэндной ( стрептомицин) и полиеновой природы ( нистатин и леворнн).

Нитроэогуанидин использовали в концентрации 200-500 мкг/мл в течение 5-10 минутной обработки; доза облучения спор быстрыми нейтронами составляла 250-350 Гр< уровень выживаемости 10/0»

при ультрафиолетовом облучении выживаемость снижалась до нистатин и леьорин вносили в среду & концентрации 25-45 тис, ел/мл, стрептомицин -450 мкг/мя. Применяли метод двойной селекции с использованием мутагенного {актора химической или физической природы с последующим рассевом на среды с Антибиотиками. На втором и третьем этапах селекционных работ били использовании методы получения, слияния и регенерации протопластов.

Оптимальное соотношение углерода,' азота и фосфора определяли на жидкой синтетической среде состава (г/л): Мв304-0,5; НС1-0,5;РеВ04-0,01; Ю^РО^-О.Б. Источником азота служил азотнокислый натрий,а источником углерода-глюкоэа. Подбор оптимального соотношения С/К осуществляли методом простого факторного эксперимент табл.1).

Таблица I.

Схема простого факторного эксперимента по влиянию соотношения С/К на каротиногенез гриба В1акез1еа 4г1врога

Компоненты сред : Варианты сред

Нк 304 КС1

?е 304 ХН2Р04 Ва НО. глюкоза

с/г

I : □ : Ш ; ХУ

0,6 0,5 0,5 0,5

0,5 0,5 0,5 0,5

0,01 0,01 0,01 0,01

0,5 0,5 0)5 0.5

30 15 7 4

I 10 40 90

0,4/4,9 4/2,4 '16/1,14 Эй/0,625

НЬмлокенты : Варианты сред

сРед : У * У1 : УН : УШ : IX

Мб 30, 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

КС1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Ре 304 0,01' 0,01 0,01 0,01 0,01

КК2Р04 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

11« ко. I I 4 15 30

глюкоза 120 I 10 60 120

с/* 48/0,163 0,4/Хбо 4/0,625 32/2,4 40/4,9

- б-

Реэультаты экспериментов обрабатывали методами математической статистики.

Селекция высокоаотивного штамма К1(+)■ КК-) и его вариантов

Перед началом серийных селекционных работ были проведены опыты по подбору оптимальных доз физических и химически* мутагенных факторов (Применительно к исходным штаммам гриба (+) 64 и (-) 490. На основании полученных данных были построены кривые зависимости выживаемости клеток от дозы таких мутагенных факторов,как ультрафиолетовые лучи, быстрые нейтроны и нитроэогуанидин. Кривые доза-аффект для (+) и (-) форт гриба строили отдельно из-эа их разной чувствительности к воздействию мутагенов.

При облучении спор ультрафиолетовыми лучами использовали световой погон интенсивность!) 3,98x10"^ Вт/ м^, длительность экспозиции составляла 10- 50 минут. Было установлено, что (+) форма гриба более устойчива к действию ультрафиолетовых лучей,чем (-) форма, и ее выживаемость при 50- минутной экспозиции составляла 20%. Кривая доэа-эффект для (+) форш принадлежит к сигмоидному типу, для (-) формы- к экспонекциальному( рис.1). Экспериментальные данные показали, что споры гриба В1. ^1эрог«бяада»>т низкой чувствительностью к ультрафиолетовому облучению и отбор более активных вариантов проводился при выживаемости

Полученные кривые выживаемости спор под действием нитроэогуа-нидина принадлежат к числу сложных экспоненциальных кривых. Отбор вариантов с ловшенной каротинообраэущей способностью вели при дозе облучения быстрыми нейтронами 260-350 Грей.

После мутагенной обработки споры высевали на сусло-агар с нис -татнном, стрептомицином или лево ридам н выросшие колонии (+) и (-) форм проверяли на каротинообраэуюцую способность.

Использование традиционных методов генетики в селекции гриба позволило повысить уровень продуктивности культуры гриба В1. 1г1эрога на 15-20® по сравнение с исходным родительским штаммом.

На втором и третьем этапах селекционных работ был использован метод получения, слияния и регенерации протопластов из мицелия 16-20 часовой культуры В1. 1г1эроа-а с использованием пищеварительного сока виноградной улитки НеИх рота1;1ь в оптимальной концентрации 100 мг/л в средах с осмотическими стабилизаторами-

^ I

100

300

500 700 Грей

12 3 4 6 6 7 Эрг/им2*1000

ТЗ^Й^О ^ Э0 . Время,мин Рисунок 1. Кривые зависимости выживаемости спор (+) и (-) половых м гриба В1. гг1эрога от дозы мутагенов: А- быстрые нейтроны; Б-улвтравиолетовые лучи; В-нитроэогуанидин ( 250 мкг/мл).

0,4-0,8 Ы сукцинатом натрия и мальтозой. В таблице 2 приведены данные по выходу протопластов в зависимости от природы используемого осмотического стабилизатора и его концентрации.

Таблица 2.

Образование протопластов В1.1г1эрога в зависимости от природы используемого осмотического стабилизатора.

Экспозиция сОсмотическийВыход протопластов,* 10 меркаптоэтанодом, стабилизатор, ч. Ы (+) форма {-) форма

I КаС1 ,0,8 0,90 -

I МкЗо4 ,0,4 0,56 -

I мвзо4 ,0,6 0,17

I М«304 ,0,8 0,56 0,37

Сукцинат натрия

■ I 0,4 3,0

I 0,5 1.5 0,3

2 0,5 ■ 1,5 3,0

3 0,5 0,1 0,14

I 0,6 1,8 2,1

I 0,8 2,4 4,8

Мальтоза

I 0,4 1,2 1.5

I 0,6 1,1 1,4

I 0,8 5,7 15

Как видно из таблицы 2, сукцинат натрия и мальтоза дают более высокий выход протопластов по сравнению еНаС1 им^зо^ . Установлено, что природа выбранного осмотического стабилизатора в дальнейшем влияла и на процессы регенерации клеточной стенки. Так, если протопласты получены при использовании в качестве осмотических стабилизаторов неорганических солей и мальтозы, то процент регенерации в исходные формы значительно ниже, чем при использовании сукцината натрия. При использовании в качестве осмотического стабилизатора в средах регенерации сукцината натрия

- &-

воестановление оболочки клеток достигало 10Х для (+) формы и 0*2 % - для (-) формы. Добавление лошадиной сыворотки в количестве 5-10 м на I л среды регенерации увеличивало часоту регенерации протопластов в 2-4 раза для обеих форм гриба.

В результате применения методов слияния и регенерации протопластов толученттамм К1(+) и КК-) с новыми генетически закрепленными свойствами, которые в значительной степени отличают его от исходного родительского штамма (+) 64,(-)490.

Штамм К1 имеет интенсивно окрашенный воздушный мицелий-КК+)-желто-белого и К1<-)— оранжево-желтого цвета, пигмент диффундирует в питательную среду; субстратный мицелий плотный, интенсивно окрашен, разветвлен умеренно. Половая форма КИ-) ютамма обильно спороносит при росте на сусло-агаре.

Нультуралъные свойства: Оптимальной средой для выращивания культуры штамма в пробирках является сусло-агар, агар с добавкой 8 % кукурузной муки и агар с 6-8® ржаной муки. Семи-десятвдневная культура гриба физиологически наиболее активна. Гриб хорошо растет на цукоровом агаре, хуже растет на ЫПА и среде Чапека. При совместном росте на сусло-агаре на месте их контакта образуется широкая зона от ярко-оранжевого до малинового цвета. Для вариантов шталма К1(+) и КК-), полученных на П и 111 этапах селекционных работ , наблюдалась утрата способности образовывать зигоспоры на месте контакта (+) и (-) шцелиев. Необходимо отметить, что мицелий штата КК+) и КК-) после проведения трех этапов селекции в значительной степени утратил плотность клеточной стенки, что Подтверждено предварительными отологическими исследованиями с помощь» электронной микроскопии ультратонких (&зов. Это важное качество повышает технологичность штамма и играет значительную роль при экстрагировании из мицелия кристаллического бота-каротина.

Результаты проверки каротинообраэования штатом К1(+) и К1 (-) на различных питательных средах в условиях лаборатории и в ферментерах показали их преимущество над контролем( табл.3).

Таким образом , в результате проведения трех этапов селекции гриба В1. *г1эр1га получен штамм КК+) и К1{-),который по каротинообразупцим свойствам в 2,$-3,5 раза превосходил исходную активность в колбах к в 3-4 раза в условиях цеха.

Таблица 3.

Активность образования бета-каротина селекционированными парами в условиях лаборатории.

Пара Соотношение родительских Содержание бета-кароти-

пар плюс— и минус-штатов на (г/л среды)

I пара 1:4 1,8

1:9 1,8

II пара 1:4 2,0

1:9 1,9

III пара 1:4 1.7

1:9 2,23

1У пара 1:4 1,8

1:9 2,6

У пара 1:9 2,9

Контроль 1:9 0,74

Физиолуго-биохимические свойства штацуа КК-^) д

Синтез бета-каротина селекционированнш! итэдаюм К1{+) и КН-) начинается уже в процессе выращивания культуры на косяках. При глубинном культивировании в колбах гриб проявляет ускоренное созревание- период наступления физиологической зрелости у (+) формы наблюдается на 28-35 ч. и у {-) формы- на 40-55 ч. ферментации, физиологически активная культура в колбах имеет густой, хорошо пигментированный мицелий желто-бежевого цвета. При выращивании гриба в колбах потребляется около 50 % редуцирующих веществ, 70 % неорганического фосфора и практически не потребляется аминтй азот. Максимальная скорость роста гриба обеих половых форы наблюдается между 12 и 32 часами инкубации.

При глубинном культивировании в посевных аппаратах рост гриба начинается сразу же после засева и к 44-45 ч. роста накопление биомассы составляет 5-20 г/л (рис.2).

ВиошкСС(к)Г/л Удельн&я скорость

роста,jU. (ч~Ъ

Рис. 2. Динамика роста биомассы и удельная скорость роста ■продуцента в посевных аппаратах: I- накопление биомассы (+) форш; II- накопление биомассы (-) формы; III- удельная скорость роста (+) формы; IУ- удельная скорость роста (-) формы.

Иэучение динамики ростовых процессов показало, что максимальная удельная скорость роста дня (+) формы гриба начинается в период между 24 и 32 ч выращивания и составляет 0,07-0,09 ч-1, а для {-) форш-0,07 к наблюдается между 20 и 26 часами культивирования. Таким образом, {+) форма продуцента обладает ,как правило, более интенсивным метаболизмом, чем {-) форма. За время роста в посевных аппаратах культура гриба потребляет 80-90 X глюкозы, 4070 % неорганического фосфора и 50 -66 % «шинного шгоа.

Экономический коэффициент выхода биомассы для К1(+) составил 0,97, тогда как для (+) формы прототипа- 0,79-0,87. ■

Исследование биохимических показателей в ходе промышленных ферментации показало, что основное количество редуцирующих веществ, амнкного азота и неорганического фосфора потребляется культурой гриба в первые 20 часов роста, причем редуцирующие вещества и лклады утилизируются из среды практически полностью, фосфор-нал од овину, содержание «минного азота составляет к концу ферментации 1/4-1/6 часть исходного уровня/ рис.3/. I П

о

о

о о

о м

Щ 1У ' У о 1—«

,8

.3 Я

о ■Я

-8 3

Время, ч

Рис.3. Динамика потребления питательных веществ грибом В1.

1г1эрога при росте в ферментерах: I- активная кис-

лотность; 2- редуцирующие вещества,56; З-аминкыЙ азот,ыг&; 4-неорганичэскй фосфор, мкг/ыл; 5-липнды,Х.

Иакскиальная удельная скорость роста гриба в ферментерах наблюдается в первые 20 часов роста и составляет 0,035-0,04, после чего снижается до 0,02-0,025 рис,4). Значение экономического коэффициента достигает максимума на 10-16 ч ферментации и составляет 0,64; после 20 ч роста и до конца ферментации значение экономического коэффициента остается практически неизменным и составляет 0,19-0,23. _

Рис.4 Метаболические показатели роста В1. trlspora в ферментерах: 1-биомасса,г/л; II- каротин,г/л; III- удельная скорость роста,1У- экономический коэффициент,у.

Основное количество бета-каротина в ходе прошлпленных ферментация синтезируется во время идиоф&зи, что соответствует представлении о нем, как о вторичном метаболите. Максимальная скорость биосинтеза бета-каротина совпадает с периодом затухания ростовых процессов и составляет 54-60 мкг/л за час.

Изучение метаболизма гриба в процессе промышленного культивирования позволило выделить следующие фазы роста:

а) ^в -фаза-О-Юч;

б) фаза экспоненциального роста-10-40 ч;

в) фаза сдержанного роста- 40-60 ч;

г) стационарная фаза- 60-100 ч ;

д) фаза отмирания - 70-100 ч.

Таким образом,для селекционированных штаммов характерен более интенсивный метаболизм, чем для прототипа; штаммы К1(+) и К1(-) активнее утилизируют ' вещества ив среды роста, значительно раньше начинают синтез бета-каротина, им необходим укороченный ферментационный процесс или дополнительное введение источников питания, препятствующих протеканию аналитических процессов.

Оптимизация состава питательной среды и процесса культивирования для штамма К1(+) и КК-)

Сравнение интенсивности каротинообразования селекционированных штаммов на разных типах питательных сред { табл.1) показало, что оптимальными для данного процесса являются среды 1У и У1 ( табл.3).

Таблица 3.

Результаты математической обработки данных по оптимизации соотношения С/К в питательных средах

Показатели 1 Варианты сред

_:_I_и_ш_

Доверительный интервал 0,284+°•067 0,280 10,0X24 0,306+0,0299

Среднее квадркгическое 0,238 0,01 0,024 отклонение, ¿V

Ошибка среднего ариф- 0,0129 0,01 0,024 магического, т1

Вариабельность 10,1 3,6 7,8

0,392+0,€627 0,272+0,0296 0,396+0,0335 0,290+0,0339 0,290+ 0,112+

0,0125 0,0183

0,0258 0,024 0,027 0,015 0,01 0,014

0,115 0,0107 • 0,01208 0,0068 0,0044 0,006

6,6 8,8 6,8 5,2 3,4 12,5

Анализ достоверности различий средних арифметических в экспериментальных группах показал, что уровень биосинтеза бета-каротина на среде 1У достоверно превышает таковой на остальных средах ,эа исключением среды 1У. Мелщу остальными средами полу-

чены достоверные и недостоверные различия по уровню каротинооб-разовакия.

На основании приведенных данных сделан вывод об оптимальном соотношении глюкозы и нитрата натрия в средах 1У и У1 соответственно 80/4 г/л С С/К* 32/ 0,635) и I/I CC/Jf- 0,4/0,163). Оба варианта сред содержали небольшое количество неорганического азота. Количество глюкозы в средах варьировало; большие концентрации глюкозы угнетали каротиногенез, т.е. наблюдалось явление кахаболитной репрессии .играющей важную роль в регуляции процессов вторичного метаболизма.

Таким образом, полученные результаты позволили определить оптимальное соотношение углерода и азота в питательной среде,а также наиболее благоприятные условия для биосинтеза бета-каротина. При соотношении С/1Г = 32/0,625 отмечалось значительное накопление биомассы при среднем уровне биосинтеза бета-каротина ( 1,11,3 г/л), тогда как при соотношении С/1Г = 0,4/0,163 наблюдалась Обратная зависимость- биомасса накапливалась в меньшем количест- 1 ве, а выход бета-каротина составлял 1,8-2,0 г/л.

Сравнение интенсивности каротинообраэования на питательных средах, содержащих различное количество неорганического фосфора, показало, что оптимальными для биосинтеза являются среды II, III и 1У С табл.4). Содержание фосфора в этих средах варьирует от 100 до 500 мг/л. При увеличении содержания фосфора в среде интенсивность каротиногенеэа снижалась.

Интенсификация процесса биосинтеза бета-каротина штаммом КН+) ,К1(-) достигнута изменением технологии промышленного культивирования. Введение в регламентную среду 1,5-3 % растительного масла в период сдержанного роста и увеличение длительности ферментации на 20-25ч привело к значительному увеличению выхода бета-каротина. Введение подпитки способствовало продлению стационарной фазы роста. Подпитка стимулировала жизнедеятельность (+) формы штамма, особенно сразу после ее введения в среду и, таким образом, продляла её жизненный цикл. Это свойство (+) формы штата Удалось установить с помощью разработанного метода определения соотношения (+) и (-) форм гриба в процессе ферментации, Установлено, что исходно «даваемое соотношение (+) и

(-) фор» гриба при ферментации постоянно изменяется-это обусловлено отсутствием синхронности в развитии отдельных половых форм

s сметанной культуре.

Проведенные работы послужили основанием для составления регламента производства с„ использованием штамма КН+) , КН-), который с 199Iг внедрен в производство на Ёерхнеднелрвеком крах-малопаточном комбинате.

шводи

1. Разработаны научные основы селекции гетероталличного гриба Blakeaiea triapora -продуцента бета-каротина, вкшчащие традиционные генетические и современные клеточно-инженерные ( слияние протопластов) методы исследования.

2. Селекционированы, защищены авторским свидетельством и внедрены в производство высокоактивные и технологически более совершенные разнополые формы гриба К1(+) и Щ(-) , образующие при совместном выращивании в колбах на качалках 1,56-2,24 и в производственных ферментерах 1,76-3,9 г/л бета-каротина соответственно.

Штаммы используются для получения наротиносодержащей биомассы' ( кормового препарата микробиологического каротина ) и масляных препаратов бета-каротина ( масла каротинового, провитамина А, 30 - процентной суспензии бета-каротина в лире и др.). Экономический э#ект от внедрения штаммов КК+) и KI(-) составил 258,747 тью. руб.

3. Изучены морфолого-культуральные и фмзиолого-биохимические свойства высокоактивных штаммов гриба. Синтез бета-каротина штаммами гриба начинается на стадии поверхностного выращивания. При глубинном культивировании в колбах период физиологической зрелости (+) и(-) форм гриба ускоряется и наступает на 28-36 и 40-56 ч соответственно. Максимальная удельная скорость роста штаммов КК+) и KI(-) при их выращивании в посевных аппаратах наблюдается на 12-32 ч.

4. Показано, что новые штаммы обладают повышенной метаболической активность» по сравнении с исходными штаммами, что особенно выражено у (+) формы. Экономический коэффициент выхода биомассы для К1(+) составляет 0,9?, тогда как для t+) формы прототипа-' 0,7b-0,S7. Максимальное значение экономического коэффициента составляет 0,64 на 10-15 ч ферментации.

5. Максимальная удельная скорость роста гриба при промышленном культивировании наблюдается в первые 20 ч роста и составляет 0,035

- 0,04 «Г1.

-166. Определено оптимальное соотношение углерода, азота и фосфора в питательной среде для культивирования гриба и биосинтеза бета-каротина. Показано, что оптимальным для биосинтеза бета-каротина является соотношение С/ Jf 32/ 0,625 и 0,4/ 0,163 при содержании неорганического фосфора в питательной среде от 100 до 500 мг/л.

7. Осуществлена оптимизация питательной среды и процесса промышленного культивирования гриба, что позволило удлинить стационарную фазу роста и стимулированть высокую жизнедеятельность штамма.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Бондарь И.В.,Санникова В.М.,Гриценко H.A..Стужук Г.М. Зависимость каротиногенетической активности культурыв1акеэ1еа trispora от условий хранения./ Бкотехнология.-1985.-№4,-о.47-40.

2. Санникова В.М..Бондарь И.В.,Огужук Г.М. Определение времени наступления физиологической зрелости посевного материала Б1. trispora - продуцента ß -каротина./ Бмотехнология.-1985.- *6,-с, 107-НО.

3. Васильченко С. А., Ну щи ко ва И.С., Бондарь И.В. Ассимиляция аминокислот культурой bll trispoга .// Микробиологический журнал,.- 1990.-Т. 52.-If I.- с. 32-34.

4. Огенько A.C., Мацеяюх Б.П..Нунцикова U.C.,Горная U.C., Беэкоровайная Н.К., Бондарь И.В. Штамм гетероталличного грмба

Б1. trispoга - продуцента бета-каротина.// A.c. СССР №1476900.-Не подлежит опубликованию в открытой печати,

5. Стенько A.C.,Бондарь И.В.,Мацелкх Б.П. Влияние соотношения азота и углерода на биосинтез ß -каротина мукоровым грибом В1. triSpora .// Микробиологический журнал,- 1990.-Т.52.-

» 3.-с.47-51.

6. Санникова В.М.,Сирко Ю.Г.,Бондарь И.В., Нунщикова И.С., Стенько A.C. Выделение половых форм гриба иэ культуралькой . жидкости.// U, МПО" Медбиоэкономика".- ВНИИСЭНТИ, серия " Передовой производственный опыт медицинской и микробиологической промыпленности, рекомендуемый для внедрения".-Вып.6-1989.-c.&-II.

Подписано в печать 09,СЛ.92г. фориат 60x84/16 Втиага писчая.Тсп.псч.п. 1.0. Тираж 100 »ка. Заказ WTOft

Отпечатано ЦУОП Нф "Плодмавпрвакт" г.Км«»,Саж«»га»»><»го ,1