Секвенирование и анализ организации генома вируса оспы коров штамм GRI-90

Сафронов, Павел Федорович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Секвенирование и анализ организации генома вируса оспы коров штамм GRI-90
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Секвенирование и анализ организации генома вируса оспы коров штамм GRI-90"

На правах рукописи

Сафронов Павел Федорович

СЕКВЕНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМА ВИРУСА ОСПЫ КОРОВ ШТАММ GRI-90

03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор»

МЗРФ

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Щелкунов С.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Меркулова Т.И. кандидат биологических наук Кочнева Г.В.

Ведущая организация: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск

Защита состоится «27» февраля 2004 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздрава РФ по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Автореферат разослан «26» января 2004 г.

диссертационного совета

Ученый секретарь

Малыгин Э.Г.

2004-4 27624

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Существование природного резервуара ортопоксвирусов патогенных для человека, а также увеличение прослойки неиммунного к ортопоксвирусам населения, делает вероятным появление в природе эпидемически опасного для людей вируса, близкого к вирусу натуральной оспы по патогенности и контагиозности.

Выполненный ранее сравнительный анализ организации геномов вируса натуральной оспы и вируса осповакцины позволил установить тот факт, что эти два вируса обладают разными наборами генов, контролирующих свойства патогенности и детерминирующих круг хозяев вируса. Было сделано предположение, что эти два вида ортопоксвирусов не могли произойти друг от друга, а независимо эволюционировали от общего предка.

Какой же из ныне существующих видов ортопоксвирусов наиболее близок к вирусу-предшественнику, и какими свойствами он должен обладать? По всей видимости, одним из таких свойств должен быть широкий круг хозяев среди диких животных, позволяющий вирусу длительно циркулировать в природе на большом ареале. Способность к длительной персистенции в организме хозяина будет также способствовать стабильному присутствию вируса в популяции чувствительных животных. Логично предположить, что вирус, имеющий наиболее протяженный геном, гораздо ближе расположен в эволюционном плане к вирусу-предшественнику. В полной мере всеми этими качествами обладает вирус оспы коров. Следовательно, несомненный научный интерес представляет определение нуклеотидной последовательности генома ВОК, исследование его генетической организации и установление эволюционных взаимосвязей между разными видами ортопоксвирусов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было определение нуклеотидной последовательности ДНК вируса оспы коров штамм 0Ы-90, анализ организации его генома и сравнение с геномами других ортопоксвирусов.

В ходе исследования решали следующие задачи:

- получение библиотеки гибридных плазмид, несущих фрагменты генома ВОК штамм 0Ы-90, и ее характеризация;

- секвенирование вирусного генома;

- получение карт потенциальных открытых рамок трансляции (ОРТ) геномных последовательностей ДНК;

- выполнение компьютерного сравнительного анализа 5 полных ортопоксвирусных геномов (ВОК, штамм 0Ы-90, ВОК штамм Брайтон, ВЭ' штамм Москва, ВОВ штамм Копенгаген и ВНО штамм Индия);

- анализ взаимной гомологии генов и белков ортопоксвирусов разных видов;

- выявление уникальных для ВОК генов и поиск по банку данных их функциональных аналогов.

Научная новизна и практическая ценность. Получена библиотека гибридных плазмид, несущих фрагменты генома ВОК штамм 0Ы-90 (БОК-ОЫ). Геном ВОК-ОЫ представлен в коллекции на 97.8% в виде клонированных фрагментов.

Определена полная нуклеотидная последовательность генома БОК-ОЫ. Последовательность нуклеотидов БОК-ОЫ аннотирована и сдана на хранение в

Международный банк данных EMBL Data Library под регистрационным номером Х94355.

Впервые обнаружено, что вирус оспы коров обладает самым протяженным геномом и наиболее полным набором вирусных генов среди изученных ортопоксвирусов. На основании этих данных сделано предположение, что ВОК -наиболее древний среди изученных ортопоксвирусов, а такие виды как ВНО, ВЭ и ВОВ образовались в результате их независимой эволюции от общего ВОК-подобного вируса-прародителя.

Выявлена общая закономерность для всех видов ортопоксвирусов в отношении типа генов, разрушенных в процессе эволюции. Большинство делегированных или разрушенных генов BHO-IND, BOB-СОР и ВЭ-MOS принадлежат либо к генам анкирин-подобных белков, либо к kelch-генам, либо к генам, продукты которых модулируют иммунный ответ инфицированного организма.

Обнаружено, что на фоне высокой внутривидовой гомологии штаммов ВОВ, ВНО и ВЭ внутривидовая гомология генов ВОК в концевых вариабельных областях генома невысока, что может указывать на большее внутривидовое разнообразие ВОК по сравнению с другими видами ортопоксвирусов.

Нуклеотидная последовательность генома BOK-GRI может быть использована для поиска специфичных для вируса оспы коров районов с целью разработки аналитичеких систем для диагностики ортопоксвирусов.

Коллекция плазмид со встроенными фрагментами генома BOK-GRI может быть использована для изучения биологических функций индивидуальных вирусных генов.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации вошли в 6 опубликованных статей и были представлены на международных конференциях: 11th International Meeting on Poxviruses and Iridoviruses (Toledo, Spain 1996); 10-th International Congress of Virology (Jerusalem, Israel 1996); 5-th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems" (StPetersburg, Russia 1997); 12-th International Poxvirus Simposium (St. Thomas, USA 1998); 13-th International Poxvirus and Iridovjrus Symposium. (Montpellier, France. 2000).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста, включая 19 рисунков и 5 таблиц, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащий 327 наименований.

Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично диссертантом в соавторстве с к.б.н. Рязанкиной О.И., д.б.н. Петровым Н.А., Гуторовым В.В., Тотмениным А.В. и Михеевым М.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Создание и характеризация клонотеки фрагментов генома BOK-GRI

Задачей первого этапа данного исследования было секвенирование генома ВОК. Для осуществления этой работы необходимо было создать клонотеку фрагментов ДНК ВОК, покрывающих в совокупности весь геном данного вируса. В качестве объекта исследования выбрали штамм GRI-90 (BOK-GRI), так как он выделен от человека (1990 г.), прошел 3-4 пассажа на ХАО развивающихся куриных эмбрионов и обладает наиболее типичными вирусологическими и

иммунологическими характеристиками ВОК.

ДНК ВОК является крупной двухцепочечной линейной молекулой с ковалентно замкнутыми концами. Для клонирования была выбрана стратегия статистического встраивания HindIII-фрагмснтов ДНК BOK-GRI в векторную плазмиду pUC19, линеаризованную той же рестриктазой. При гидролизе ДНК BOK-GR1 рестриктазой HindIII образуется 21 фрагмент длиной от 03 до 50 тл.н. После трансформации компетентных клеток Exoli JM-109 были отобраны 470 клонов по Lac" -фенотипу, в которых определяли наличие вставок ДНК ВОК с помощью гибридизации in situ с НР-меченными клонированными фрагментами ДНК ВОВ штамма ЛИВП. Из клонов, дающих положительный ответ при гибридизации, выделяли плазмидные ДНК и осуществляли их рестрикционный анализ. В результате статистического клонирования HindIII-фрагментов ДНК GRI-90 была получена коллекция плазмид, содержащих все HindIII-фрагменты вирусной ДНК," за исключением крупноразмерных А, В, С и концевых D и I фрагментов (рис. 1).

Большую часть генома BOK-GRI из районов А, В и С HindIII-фрагмснтов субклонировали с помощью рестриктазы BamHI в векторе pMGC20. Клоны, полученные после трансформации компетентных клеток E.coli XL2-blue, гибридизовали in situ с меченными иР-ЗОвдами на основе Hindlll. А-, В- и С-фрагментов ВОВ ЛИВП, выделяли плазмидную ДНК и проводили рестрикционный анализ. Клонированные фрагменты представлены на карте вирусной ДНК (рис. 1).

Для клонирования недостающих участков генома BOK-GRI были получены коллекции гибридных плазмид pCEn, pCMSn, pCHEn, рСНВп и рСКл (см. рис. 1). При этом использовали фрагменты ДНК BOK-GRI, полученные в результате гидролиза суммарной вирусной ДНК следующими рестриктазами EcoRI, Mlul-SmaI, HindIII-BamHI, HindIII-EcoRI, Kpnl. Клоны, полученные после трансформации компетентных клеток E.coli XL2-blue, отбирали гибридизацией in situ с меченными нР-зондами поэтапно. В качестве зонда для поиска того или иного геномного локуса использовали перекрывающийся участок ДНК граничащего с этим локусом фрагмента BOK-GRI, клонированного и охарактеризованного на предыдущем этапе.

Отдельный этап работы представляло клонирование концевого геномного фрагмента вирусной ДНК. Обработка концевого KpnI-фрагмента нуклеазой S1 в течение 2 мин. приводила к гидролизу одноцепочечных участков ДНК в районе концевой шпильки. Полученный препарат ДНК обрабатывали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I E. coli в присутствии всех четырех dNTP для "затупления" концов молекул ДНК, образованных после гидролиза S1, и после этого встраивали в состав векторной плазмиды pUC19, обработанной рестриктазой SmaI.

В результате проведенных экспериментов была создана и охарактеризована коллекция гибридных плазмид со встроенными фрагментами - вирусной ДНК, перекрывающими вирусный геном на 97.8% (рис.1).

2. Секвенирование генома BOK-GRI

2.1. Секвенирование ДНК ВОК по методу Максама-Гилберта.

Полученная коллекция гибридных плазмид обеспечила возможность секвенирования генома ВОК. Секвенирование вариабельных концевых областей проводили по методу Максама и Гилберта. Этим методом были секвенированы районы 1-52283 п.н. и 137930 - 223666 п.н., за исключением не представленного в коллекции плазмид района 166386 - 170906 п.н.

с qp м g furl h nso j

16 2 2 4 4 131

109 44

74 60

□ 42

111 OJ I 4 61 19 41 09 40 16 ' 161

60 HHSO 141 144 30 111

12 I

pCHn

pCBn

pCEn

pCMSn

pCHEn

pCHBn

pCKn

Рис.1. Локализация клонированных фрагментов ДНК на ЯикЦН - карте генома ВОК штамма GRI-90. Справа приведены обозначения серий гибридных плазмид: р - плазмида; С - фрагменты генома ВОК (от cowpox virus); затем первая буква из названия рестрикТазы, используемой при клонировании фрагментов (H-tfindIII, Ъ-ВатШ, Е- EcoRI, M-Mul, S-Smal, K-Kpnl); n - порядковый номер бактериального клона, из которого выделена соответствующая плазмида. Под фрагментами указан их размер в т.п.н.

Последовательность нуклеотидов фрагментов ДНК, полученная при «чтении» радиоавтографов, набирали на компьютере с помощью программы ALIGNMENT SERVICE. Проверку набранной последовательности, а также состыковку секвенированных фрагментов осуществляли с помощью этой же программы.

2.2. Секвенирование ДНК ВОК на автоматическом анализаторе ABI PRISM 310

Отсутствующий в клонотеке район, а также центральную консервативную область 52283-137930 п.н. секвенировали на автоматическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer ("PE Applied Biosystems", США). Секвенирование этих районов проводили на длинных ПЦР-фрагментах, предварительно полученных на геномной ДНК BOK-GRI и элюированных из агарозного геля.

Первый этап состоял в расчете праймеров для длинного ПЦР. Праймеры расчитывали таким образом, чтобы соседние ПЦР-фрагменты перекрывались между собой в среднем на 1 т.п.н. Расчет праймеров проводили при помощи программы "Oligo" 6.31, используя в качестве расчетной матрицы нуклеотидную последовательность гомологичных областей BOB-COP и BHO-IND. Длина праймеров составляла 30-40 нуклеотидов, а температуру отжига праймеров подбирали приблизительно одинаковой как для прямого, так и для обратного праймера в диапазоне 60-62°С.

В результате этой работы секвенируемая область была разбита на 9 районов, средняя длина которых составляла 11 т.п.н. Амплификацию проводили в соответствии с указаниями фирмы производителя набора Gene Amp XL PCR Kit для получения длинных ПЦР-фрагментов (РЕ Applied Biosystems).

Для секвенирования этих фрагментов расчитывали набор праймеров индивидуальный для каждого фрагмента. Расчет проводили при помощи программы "Oligo"6.31, используя в качестве расчетной матрицы нуклеотидную последовательность гомологичных областей BOB-COP и BHO-IND. Длина праймеров составляла в среднем 25 нуклеотидов, а температура отжига лежала в диапазоне 49.5-51°С. Положения соседних праймеров как на плюс, так и на минус цепи ДНК секвенируемого фрагмента были разнесены друг от друга в среднем на 300 н.п. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили с использованием набора BigDye TCSK ("Qiagen GmbH", Германия) на автоматическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer ("PE Applied Biosystems", США) в соответствии с указаниями фирмы производителя.

Расшифровку первичных данных секвенирования (хромотограмм), их состыковку и проверку проводили с помощью программы «Sequencher» 4.0.5. (Gene Codes Corporation, США)

3. Построение трансляционной карты генома BOK-GRI

Данные о нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК генома вируса BOK-GRI, полученные в результате секвенирования на автоматическом анализаторе Genetic Analyzer и секвенирования по методу Максама-Гилберта, были объединены с помощью программы ALIGNMENT SERVICE в единую непрерывную последовательность ДНК. Эта последовательность представляет собой полную

нуклеотидную последовательность ДНК генома BOK-GRI, за исключением 30-35 нуклеотидов в районе каждой из концевых шпилек. Эти районы были утрачены после обработки концевых фрагментов S1 нуклеазой и последующей достройки одноцепочечных районов ДНК-полимеразой I E. coli. Длина расшифрованной геномной ДНК BOK-GRI составила 223666 п.н.. Компьютерный анализ геномной последовательности ДНК позволил выявить 211 потенциальных неперекрывающихся ОРТ размером от 60 аминокислотных остатков и более.

Была составлена аннотация, содержащая последовательность нуклеотидов BOK-GRI, названия и координаты инициирующего и терминирующего кодона каждой из 211 ОРТ, а также их аминокислотные последовательности, полученные с помощью компьютерного анализа. Файл, содержащий эту аннотацию, был отправлен в Международный банк данных EMBL Data Library на хранение, где ему был присвоен регистрационный номер Х94355.

1. Сравнительный анализ геномов ортопоксвирусов

Нуклеотидную последовательность генома BOK-GRI сравнили с последовательностями геномов BOK-BRI (регистрационный номер в базе данных EMBL AF482758), ВЭ-MOS (регистрационный номер в базе данных EMBL NC004105), BOB-COP и BHO-IND. Из этих вирусов только вирус эктромелии не является патогенным для человека.

Длина кодирующей области BOK-GRI составляет 220881 п.н. У BOK-BRI эта область меньше на 1639 п.н. и составляет 219242 п.н. Длина кодирующей области генома ВЭ, ВОВ и ВНО значительно уступает таковой для ВОК и составляет: ВЭ-MOS - 206612 п.н. (полная последовательность 209771 п.н.); BOB-СОР - 183190 п.н. (191737 п.н.); BHO-IND - 184150 п.н. (185578 п.н.).

Длина протяженных концевых инвертированных повторов составила BOK-GRI -8303 п.н.; BOK-BRI - 9710 п.н.; ВЭ-MOS - 9414 п.н..; BOB-СОР - 12068 п.н.

Последовательность геномной ДНК ортопоксвирусов имеет повышенное содержание нуклеотидных остатков аденина и тимина. Содержание (А+Т) высоко консервативно для ортопоксвирусов и составляет: BOK-GRI - 66.3%; BOK-BRI — 66.6%; ВЭ-MOS - 66.9%; BOB-COP - 66.6%; BHO-IND - 67.3%. Вероятно, это соотношение имеет большое значение для ортопоксвирусов.

С помощью программы ALIGNMENT SERVICE был составлен нуклеотидный элайнмент последовательностей геномной ДНК этих вирусов. На его основе был получен графический элайнмент с нанесением потенциальных ОРТ размером от 60 аминокислотных остатков и более. Аминокислотные последовательности белков BOK-GRI сравнили с гомологичными последовательностями ОРТ других вирусов.

Геном ортопоксвирусов состоит из высоко консервативной центральной области, занимающей около 50% генома, и вариабельных концевых районов, состоящих из концевых инвертированных повторов (TIR от Terminal Inverted Repeats) и уникальной неповторяющейся последовательности.

4.1. Центральная область генома

Сравнение трансляционных (генетических) карт геномов BOK-GRI, BOK-BRI, ВЭ-MOS, BOB-COP и BHO-IND показывает, что центральная консервативная область

генома, характеризующаяся высокой гомологией последовательностей ДНК, ограничена ОРТ G9L и A26R для BOK-GRI и имеет размер около 100 т.п.н., что составляет от 44 до 53% генома в зависимости от вида вируса. В этой области отсутствуют протяженные делеции и генетические карты для разных вирусов практически полностью совпадают. Центральный консервативный 'район генома ортопоксвирусов содержит все известные к настоящему времени ортопоксвирусные гены, контролирующие процессы биосинтеза вирусных молекул ДНК и РНК,' а также • подавляющее большинство генов структурных белков. Как правило, в данной Ъбласти генома ОРТ сравниваемых ортопоксвирусов имеют взаимную гомологию по аминокислотным последовательностям, превышающую 95%.

Однако консерватизм центральной области генома не является абсолютным. Так, видоспецифичные отличия наблюдаются для ОРТ, гомологичных G14L, F5R, J5R, A5L, A10L, A14L BOK-GRI. Белки, кодируемые A5L, A10L, AHL BOK-GRI, являются структурными белками вириона, при этом A5L является иммунодоминантным антигеном. Вероятно, что повышенный процент различий объясняется эволюционным отбором вариантов структурных белков с измененными антигенными детерминантами.

Гомолог Гена J5R у BOB-COP кодирует транскрипционный фактор VLTF-4. Причем только данный фактор поздней транскрипции имеет существенные отличия между разными видами ортопоксвирусов. Другие транскрипционные факторы VLTF-1,-2,-3 высоко консервативны.

Для генов G14L и F5R BOK-GRI функция неизвестна. Интересно отметить, что G14L BOK-GRI имеет высокий процент идентичности с F14L ВОВ-СОР (98.6%), тогда как уровень сходства этой ОРТ с гомологичными ОРТ других ортопоксвирусов, в том числе и BOK-BRI, самый низкий для ОРТ этой консервативной области (78.1-87.7%). По-видимому, это свидетельствует о высокой гетерогенности штаммов, относящихся к виду ВОК.

4.2. Концевой инвертированный повтор (TIR)

TIR можно считать гипервариабельным участком генома ортопоксвирусов, поскольку в этом районе наблюдаются множественные структурные различия не только между штаммами одного и того же вида ортопоксвирусов, но даже и среди субклонов одного штамма. Длина TIR тоже варьирует и составляет: ВОВ-СОР — 12.1 т.п.н., BOK-BRI - 9.7 т.п.н., BOK-GRI - 8.3 т.п.н., ВЭ-MOS - 9.4 т.п.н. У различных штаммов ВНО длина TIR. составляет от 583 до 1051 п.н. Несмотря на такие кардинальные различия имеется целый ряд характерных для этого района структур: концевая шпилька, две консервативные неповторяющиеся последовательности (NR - от Nonrepeated Region) NRI и NRII и два набора коротких тандемных повторов, фланкирующих NRII область.

Начинается TIR с концевой шпильки, которая ковалентно замыкает цепи геномной ДНК. Длина шпильки составляет 102 нуклеотида для ВОВ-СОР, 104 - для BOB-WR и 103 - для BHO-BSH. Для BOK-GRI нами определена последовательность 20 нуклеотидов из состава шпильки.

Длина NRI и NRII областей у BOK-GRI составляет 86 и 328 п.н., соответственно. Тот факт, что эти районы присутствуют у всех из изученных ортопоксвирусов, а также сходный размер и высокая гомология (93-98%) этих районов и концевых шпилек у

представителей различных ортопоксвирусов свидетельствуют об их важной функциональной роли, проявляющейся, по-видимому, при репликации вирусной ДНК. Так в NRI области обнаружена последовательность, необходимая для разделения конкатамеров, образующихся в процессе репликации ортопоксвирусной ДНК.

Области коротких тандемных повторов крайне гетерогенны по длине (рис. 2), однако они состоят из довольно консервативных субъединиц длиной 70 и 54 п.н. Кроме того, у ВОВ-КОП и BOB-WR обнаружено по два повтора длиной 125 п.н. У ВЭ-MOS во втором блоке тандемных повторов обнаружена новая субъединица длиной 85 п.н. Эта субъединица, а также субъединицы по 54 и 125 п.н. могут быть получены суперпозицией отдельных участков субъединицы длиной 70 п.н., что свидетельствует о сложном чередовании процессов делеций и дупликаций в области тандемных повторов.

Вариабельность TIR не ограничивается различиями в области коротких тандемных повторов (см. рис. 2). Кодирующая последовательность TIR также подвержена сложным перестройкам. У BOK-GRI в этой области обнаружено 5 ОРТ (D1L-D5L). В гомологичной этому району последовательности ВОВ-СОР, не содержащей крупных вставок и делеций, обнаружено уже 9 потенциальных ОРТ (C23L-C16L). Все ОРТ ВОВ-СОР кроме C16L являются фрагментами более крупных ОРТ BOK-GRI и обязаны своим происхождением множественным коротким делециям с последующим сбоем рамок трансляции.

Области ТШ BOB-СОР и ВЭ-MOS содержат ОРТ, не входящие в TIR BOK-GRI. Подобные изменения границ TIR можно объяснить рекомбинационными процессами, приводящими к транслокации-инверсии участков генома, расположенных в непосредственной близости от ТШ. В результате транслокации, произошедшей в геноме вирусов-предшественников BOB-СОР и ВЭ-MOS, участок с правого конца генома был транслоцирован на левый. У BOB-СОР транслоцированный фрагмент длиной более 3 т.п.н., кодирующий гены C15L-C12L, соответствует двум районам правого конца BOK-GRI: B20R-B21R (гомологи C14L-C12L BOB-СОР) и 5'-концевой части K1R (гомолог C15L BOB-СОР). У ВЭ-MOS транслокация произошла по аналогичной схеме. В этом случае транслоцированным оказался фрагмент 4.6 т.п.н. (район 7L, EVM003, 10L-14L), соответствующий ОРТ B22R, K1R-K3R BOK-GRI и Непосредственно примыкающий к правому TIR BOK-GRI. Следует отметить, что подобные перестройки довольно частое явление для ортопоксвирусов.

43. Уникальная последовательность концевых видоспецифичных районов ортопоксвирусного генома

В отличие от области тандемных повторов набор генов штаммов ВОК достаточно консервативен. В кодирующей области генома BOK-BRI обнаружены всего 2 относительно крупные делеции по сравнвению с BOK-GRI. На левом конце генома BOK-BRI делегирован фрагмент длиной 759 п.н., соответствующий району ОРТ D7L BOK-GRI, а на правом конце генома делеция длиной 1030 п.н. привела к утрате двух генов, K3R и TIR BOK-GRI. Кроме того, в результате мутаций исчезли или оказались раздробленными еще 3 гена BOK-BRI: D9L, C15L, A27L. В итоге из 211 ОРТ BOK-GRI у BOK-BRI отсутствует 6 ОРТ.

. .з, мм. , - - сад-

вов-сор •□ООООООООООООММ^НННММИММИИОСГЗ)-..........................ОООШШШОС

C1L

nr1 i-..................... .. п 13 nrh | ..........................................19 20 21 •+—

bo»-WR щщтт.....................................егзштжшжоооАшшн

BOK-BRi ФПОООЩЩЩААЩ'ШШ.....................&zb4ÎÂfÂ-...........................4M.........à I

V002

: nr il i

i 2 3

EVMOOl

ВЭ-MOS .....................................................<ПЗ*ШШШ.........................П^р

NRI 1................6 t nrii ,,

BOK-CRI ..............................................-013"

NRI I 2 NRII I

вио-САкф[]ф......-.....................................:.........КУ-

.10

03R

i nrii 1..............6 7 «

<*——>•[>•-................................................01 П0ЩН........................

Рис. 2. Схема чередования тандемных повторов в'области TIR ортопоксвирусов BOB-COP, BOB-WR, BOK-BRI, BOK-GRI, BHO-GAR и ВЭ-MOS. Белые прямоугольники обозначают неповторяющиеся последовательности T1R: NR. 1, NR II и кодирующую область. Черные ромбы соответствуют тандемным повторам длиной 70 п.н. Цифры над ними указывают номер повтора в первом и втором танДеме. Серыми треугольниками обозначены 54 п.н. повторы. Их порядковые номера приведены под треугольниками. Пятиугольники в последовательности TIR BOB-COP и BOB-WR соответствуют повторам длиной 125 п.н. Звездочками обозначены повторы 85 п.н. в последовательности TIR ВЭ-MOS Пустые ромбы и треугольники указывают на то, что эти повторы отличаются от консенсусной последовательное™ повтора (делеции, 'замены, вставки). Черный круг соответствует концевой шпильке. Делеции в последовательности ДНК обозначены пунктиром.

Более масштабные изменения наблюдаются при межвидовом сравнении организации вирусных геномов. В левой части генома BOK-GRI сразу за TIR начинается последовательность длиной 14171 п.н., кодирующая 12 потенциальных ОРТ (с D6L по C3L) и не имеющая аналога у ВОВ и ВНО. У BOK-BRI из-за делсции этот район короче на 759 п.н. и кодирует 10 ОРТ. У ВЭ-MOS эта область составляет 7982 п.н. и кодирует 7 ОРТ. Левый конец генома ВОК содержит в себе все последовательности ДНК, которые ранее считались уникальными для того или иного штамма ВОВ или ВНО.

В правой, части генома BOK-GRI наблюдается схожая картина. Имеются уникальные для ВОК последовательности размером 1579 и 3585 п.н., включающие ОРТ B8R, B9R, K1R-K3R и T1R, соответственно. У BOK-BRI, как упомянуто выше, в результате делеции утрачены ОРТ K3R и T1R. В геноме ВЭ-MOS делеции в этих районах менее протяженные, чем у BOB-СОР и BHO-IND, но из названных 6 ОРТ BOK-GRI у ВЭ-MOS осталась только одна полноразмерная ОРТ. По длине генома и наличию больших фрагментов ВОК-специфичных последовательностей ДНК ВЭ-MOS занимает промежуточное положение между штаммами ВОК с одной стороны и штаммами ВОВ и ВНО с другой. Длина генома ВЭ-MOS больше, чем у ВОВ и ВНО соответственно на 18 т.п.н. и 24 т.п.н., но уступает длине генома ВОК 13 т.п.н. Однако, по сравнению с BOK-GRI число делегированных или разрушенных в результате мутаций генов от вида к виду варьирует слабо и составляет в ряду ВЭ-MOS, ВОВ-СОР, BHO-IND - 37,42 и 51 ОРТ, соответственно.

Высокая степень идентичности аминокислотных последовательностей потенциальных ОРТ (лишь в редких случаях гомология снижается ниже 97%) выявлена для штаммов, принадлежащих к одному и тому же виду ортопоксвирусов (ВОВ или ВНО). Иная картина обнаруживается при сравнении последовательностей ОРТ двух штаммов ВОК. Так из 50 генов, расположенных в левой вариабельной области генома лишь у 13 ОРТ гомология превышает 97%. Для правой вариабельной области генома, число таких ОРТ составляет 17 из 65. При этом процент идентичности большинства ОРТ двух штаммов ВОК в этих областях сравним или даже ниже, чем процент идентичности, полученный при сравнении BOK-GRI со штаммами ВОВ, ВНО или ВЭ. Это может свидетельствовать о высокой гетерогенности вариантов ВОК, циркулирующих в различных географических областях, и служить объяснением вариабельности их биологических свойств.

Самым неожиданным при сравнении последовательностей ОРТ двух штаммов ВОК оказалось обнаружение 3 ОРТ с очень низкими показателями взаимной гомологии. Так процент идентичности ОРТ C2L, C11L и B8R BOK-GRI с гомологичными ОРТ BOK-BRI составил соответственно 58.7%; 67.2% и 66.2% (рис. 3), при этом процент нуклеотидной гомологии оказался лишь немного выше - 67%, 76% и 74%. В то же время, межвидовое сравнение этих трех ОРТ (см. рис. 3) показало, что для каждой из них можно обнаружить виды ортопоксвирусов, у которых аналогичные ОРТ высоко гомологичны либо BOK-GRI, либо BOK-BRI. Так для ОРТ C2L и B8R BOK-GRI (см. рис. 3 А и В) процент гомологии с BOO-ZAI составил 97.2% и 97.3 % соответственно. Для BOK-BRI обнаружена высокогомологичная ОРТ (аналог B8R BOK-GRI) у ВОВБ-CMS (95.6%, см. рис. 3 В). Для ОРТ C11L BOK-GRI большую гомологию имеют

BOK-CXI M-DSIUAiraVUSLLUVNCrovrrrNIJUl«»ITMT»XUI^

BOK-BRX .«MJTI..-«... —.v..10.........T8I.V.VT. .DSQ.I.......».*.». . I. SU, .TT. . .V. »...«.. .X.

boo-ux .................t......:......................................................v.......-,

»OK-CRI *v«saricuTTTB<snriMarTiKonnticinTitsii«KkiWKHSiaiTScr^^

bok-sxx ft.tt. .D.T.r.I____B.ia.FD.r.l.......--VXTQE.t.. .M. .T..x...X. . . .6____«......X____KK.TC-—*

boo-xai ..........................................t............................______

Ml-aa MWUDSMLTDKinT—nACtXOSlVCWDH-------mXTVWM MllimjVVHBU.Ba»MTiaHMD«lITrTIiaitt»IPVtxm

bofc-bkc .<-xm,xx........hz........l.saa.namam.........»...»...il....vd........: i..vc.~.,v.x...x

BOB-COP ..-H.XX........MI..s.....i.sek.pLTrroeiT*.........*...»...n.....vD............LC.....ID..X

BBO-IND M........i—...t......".....—--—-— HV..............».....T.........................

BOX-CBX uiMsuiMscironivzi^TCniTOvcvnawKKXMSinmcTiuxx^^ --WUCRIL

BOC-BRX ...I.......I.I........................X.. .T. .. XQ.....X. .QXBBAAY.MW. .IXn,.im>TTTDT. .DC. .V

BOB-COP .. .B. ,1. . . . X..........................X. ..T...XQ.....X. .Qnoucn.», ,I1D. .OTDTTTDT. .RK.. .V

BBO-XMD .........................................................IOLT.0.Sn<XTXTXtX.lU.t1t*

BOX-CM I.TTTTITXSRD—

BOI-BRX ........;Q.(Tt»T..... at l'..B... K»..... tu... T.. XSX. .X........r.l. .SGB.L.l. .«..'. .HOTR. . .TX....

bob-cof .........g.crxT......t...ik..x*.....xi...x..u>x..x........r.a..sca.L....a....KQntx..xx....

BBO-XMD

BOK-CKX XUnUJ£«CG9IS>II.VIJTMLK?NIXYTtI-IWIXX9XQ0LLTMISBSIVimaiK^^

BOK-BRX .v.x. .tXXOTrT..e.C.8L.m., .X9T.X....T0......«x.V.YBT.ÏX.V.........T. 1 .f. .X.X. .QKVCHX........

BOB-COB .V.Q. ,n>M>m. .c.C.BL.m. .IIII.I.. .TV......LX. V.YBT.TX.V.........T...».. I.X. .QKTCW*. .......

BBO-XMD

• ' I '

BOK-CRX LKNGVDWXDDM—HTXHXHPirPVTVXHMBDEPViaiLKLCKPTXDPIMmDT»CRBH.I tCVl IBMTlX.VXin.VDMaDXMXVTKCqT

BOK-BRX . ,..HV. .-M..-D.X........»TXJXBXBX......X............KB.C....X.IX9.BV9....;x..t.....f.TT.ft

BB-MOB K.... —-tf9xral....................U........x»b. *V4.....1........t. -I. (

BOB-COP____Ml. .CH. .DO.L........—TTBHMa....................KX.C____B.IM.1V».....X........I. .T.r

BBO-XMD

BOK-GRX TCXCXCXXUTeCXPEX*IX.TXQILICIUBUTXXCX»TVXMX-iaaiTrVXX-XMXaLXCMCXBXTXlVDTXTTCDTTrSTXXTXTn;

80x-srï ......v.m.ba.......x. .x.. .1.. .x........x. .btuxd.bu.xgmkt.. .liu. .x......................d.

m-k» .. .B. .wm.cxx.........x.. .1.. .x.....r. ,x. .ctxmi.l.bjuiib. .rxi.t. ,k..............l.......d.

BOB-COP ...T. .V. ..DKT.........X. ..X...X...... ..X. .SXLtS»..lrXCai....LKX. .X...........8M......P. .0.

bbo-xmd

BOK-CRX iCTiAWRorxxMgicHLTwnaMxprxiaiTvwipirnwiuixutM iMuxiTMMoajgpaxiuuucCTVBXODHiaBTLPLgxxai

bok-brx ..............m.xt.x......b......bb.v..x..xr.................i.h. ..m. . .a. .a.m... .1........

BB-MOB .........v....M...........B.....L0XSX.T3HXBriXK*

BOB-COP ......................M...................................................................

bbo-xmd M:..............................xx.txq.......................M..M. ..▼.H.........L. ..

BOK-CXX XrrrATL*

BOK-BRX .......* ,

BOB-COP.......»

bbo-xnd ....v..«

bok-grx hx«liivij^«iit8><siluun3crrj^t1<gijiclciiatortpxkttx:«vhitrtlftj^t тгкдкянуутчл/.ти'тл-ципу^т box-bri____v............v......и.....x... .m. .s.....bk.........dvo.........t. ...... .x. .mp. . .»т.к. .

bob-сор .....................................................................dxrmtoo.»

bob б ......г..........v......m.....x. .. .к. .в.....«к........bdvs..........т.. .v... .с. .hp. . .»т.к..

boo-zax ........................................................................т.................

BOX-CRX BLCBSBVTiicpaMmMBaxpKCsmJi(vxa>exAsuTuri^UBDXBXxvxxcsicxsxicxH9siM<icxiixxT—THD

boi-bxx IT. vt. В.. X... В.....em. .d. .exil.........«s.s.btuntv. .ktli.t. .. .t.. .mx. .».t......X.xl.bxtzt.

bobb ip.vt.t. ,x...«.. .v.ek..d. .xxxi., .1......bs.b.btlxtl. .hxlb.t.. . ,t.. .mb. .v.t......h.xusvyzs.

bcc-ux......t..........v.......................x.......-..................................t—..

bok-crx xz8cvgxdtqtxnktz.xbctmtkrdxbvxkxrxlxskaxjuuttel*

bok-brx t1.t.0ax.x. «bd... .t............ttwq...i..v.....

bobb tx.t.«k.x. .bd... ..............................

воо-хлх .....h....................m...................

Рис. 3. Сравнение аминокислотных последовательностей ОРТ, имеют*» саму» нижую гомологии мощу двумя штаммами вируса оспы коров (BOK-CRI и BOK-BRI). А - C2L CRI/BRI - (SS.7% ак); Б -CI IL CRI/BRI («7.1% ак); В - B8R CRI/BRI (6iJ% ак)

фрагменты этой ОРТ BHO-IND (D6.5L и D7L) - соответственно 86.8% и 96.2%, тогда как для BOK-BRI эта ОРТ высокогомологична аналогичным ОРТ ВОВ-СОР и ВЭ-MOS - 88.9% и 83.0% соответственно (см. рис. 3 Б). Следует заметить, что процент идентичности ОРТ ВОК, фланкирующих эти гены, не отличается от средних показателей гомологии ОРТ в этих районах. Эти данные позволяют выдвинуть предположение о том, что измененные варианты генов ВОК могли появиться в результате рекомбинации с сильно дивергировавшим видом ортопоксвирусов или с последовательностью клеточного гена в процессе ретротранспозиции.

На основании приведенных выше данных можно сделать вывод, что ВОК имеет наиболее полный геном по сравнению с такими изученными видами ортопоксвирусов, патогенных для человека, как ВНО и ВОВ. Поэтому ВНО и ВОВ; а также ВЭ, можно рассматривать как варианты, возникшие из ВОК или ЁОК-подобного вируса в результате делеций и мутаций, нарушающих и изменяющих определенные гены вируса-прародителя. Кроме того, длительная дивергентная эволюция и множественные рекомбинации, по-видимому, привели к усилению гетерогенности штаммов ВОК. Возможно, вирусы ВОВ, ВНО и ВЭ могли происходить из разных подвидов ВОК.

Следует отметить, что на примере ВОВ экспериментально доказано, что почти все гены, расположенные в левой вариабельной области генома, не являются жизненно важными при размножении вируса, по крайней мере, на некоторых культурах клеток млекопитающих. Гены, расположенные в вариабельных областях генома, можно разбить на три основные группы: гены круга хозяев - hr (от host range), гены, кодирующие семейство Kelch-белков, и гены иммуномодулирующих факторов.

4.3.1. Потенциальные гены круга хозяев

Наблюдаются существенные вариации в спектре видов животных, которые способен инфицировать тот или иной вид ортопоксвирусов. Так, ВОК имеет очень широкий круг хозяев: данный вирус выделен от множества видов животных, относящихся к 9 из 18 отрядов класса млекопитающих. ВОВ способен размножаться на разных видах животных, однако природный хозяин этого вируса не выявлен. Иное положение по данным свойствам занимает ВНО, являющийся строгим антропонозом. В этом плане определенное сходство с ВНО имеет вирус эктромелии (ВЭ), который инфицирует лишь некоторые линии лабораторных мышей. Для культур клеток выявлены, по крайней мере, три гена ортопоксвирусов, определяющих- возможность их размножения на тех или иных линиях клеток млекопитающих. Все три обнаруженных гена hr находятся в левой вариабельной части ортопоксвирусного генома. В геноме BOK-GRI им соответствуют ОРТ C9L, C13L и MIL (рис. 4). Самый консервативный из них - C13L. Он идентичен генам C7L BOB-COP, C17L BOB-WR и отличается от генов-гомологов ВНО заменой всего одного кодона. Известно, что этот ген необходим ВОВ-СОР, мутантному по гену K1L, для размножения в культурах клеток человека MRC-5 и свиньи LLC-PK1.

Остальные два hr-гена не обладают столь высокой консервативностью, как C13L. У ВНО гомолог M1L BOK-GRI распадается на две короткие ОРТ, тогда как у ВОВ этот ген (K1L у BOB-СОР) имеет идентичный с MIL BOK-GRI размер и сравнительно

высокую гомологию. Показано, что разрушение этого гена приводит к тому, что ВОВ теряет способность размножаться в культуре клеток почки кролика RK13.

Полноразмерный ген C9L, иначе обозначаемый СНО hr, был обнаружен только в геноме BOK-GRI и BOK-BRI (см. рис. 4): Показано, что этот ген ВОК, кодирующий белок 77кДа, после интеграции в геном ВОВ приводит к тому, что последний приобретает способность размножаться на культуре клеток СНО.

Важной особенностью белков СНО hr и MIL является то, что они относятся к семейству анкирин-подобных белков, одной из функций которых является взаимодействие с интегральными мембранными белками и элементами цитоскелета. Это самое многочисленное семейство ортопоксвирусных белков, кодируемых исключительно в левой и правой вариабельных областях генома. Так, только в левой части генома BOK-GRI и BOK-BRI обнаружено по 10 генов этого семейства, а в правой - по 6 (см. рис. 4). Характерно, что в геноме ВНО, ВЭ и ВОВ большинство этих генов либо отсутствуют, либо представлены короткими фрагментами. Тот факт, что BOK-BRI полностью сохранил все 16 генов этого семейства, свидетельствует о функциональной значимости этих генов для ВОК. В пользу этого свидетельствует также и высокая внутривидовая гомология этих генов для BOK-GRI и BOK-BRI - (от 87.9% до 98.6%). Исключение составляет лишь ОРТ C11L BOK-GRI с аномально низким процентом идентичности с ОРТ V016 BOK-BRI - 67.2% (см. рис. ЗБ). V016 BOK-BRI имеет намного большую гомологию с аналогичной ОРТ ВОВ-СОР (88.8%) и ВЭ-MOS (81.4%). По-видимому, у ортопоксвирусов этот ген представлен двумя разными аллелями, чья потенциальная роль может быть связана с изменением спектра чувствительных к вирусу животных и/или клеток.

Таким образом, вирус оспы коров содержит в составе своего генома все три из известных генов круга хозяев ортопоксвирусов и большой набор дополнительных генов, структурно схожих с генами hr. Возможно, эти гены в совокупности и обеспечивают ВОК чрезвычайно широкий круг хозяев в природе и его стабильное сохранение в биосфере.

4.3.2. Семейство Kelch-белков

Многочисленные гены, кодирующие белки этого семейства, локализуются только в концевых районах генома ортопоксвирусов и лепорипоксвирусов (вирусы миксомы и фибромы Шоупа) .В геноме BOK-GRI обнаружено 6 таких генов (рис. 5) размером около 500 ак каждый со взаимной идентичностью по аминокислотной последовательности в интервале 22-26%. Все 6 белков содержат в своем составе N-концевой ВТВ-Домен и С-концевой kelch-домен. Кроме того, BOK-GRI кодирует еще 2 белка, которые существенно короче (273 и 205 ак) и содержат только ВТВ-домен. Интересно, что в геноме BOK-BRI оба эти ВТВ-кодирующих'гена разрушены (см. рис. 5), тогда как оставшиеся 6 генов не только целы, но и выс£когомологйчны. Средняя гомология по этим генам у двух штаммов ВОК составляет 96.5%, что является высоким показателем, для вариабельных концевых областей генома. Мы предполагаем, что гены, кодирующие укороченные ВТВ-белки у BOK-BRI, могли разрушиться в результате многочисленных пассажей вируса в системе in vitro.

Геном ВЭ-MOS содержит 4 полноразмерных гена белков этого семейства и один укороченный, BOB-СОР кодирует 3 полноразмерных Kelch-белка и один короткий

BOK-GRI

bi<r. bi«a

v2ij v2i4

BOK-CRI bok-bri

ВЭ-MOS BOB<X)P BIIO-IND

Рис. 4 Графическое выравнивание левых (А) и правых (Б) концевых аидоспецифичных районов генома вирусов ослы коров B0K-GRI и BOK-BR1, эктромелии ВЭ MOS, осповакцины BOB-COP, натуральной оспы BHO-IND Светлыми стрелками обозначены направление и размер аикирнн-лодобных ОРТ, а темными-гены, гомологичные ОРТ C7L ВОВ-СОР Над стрелкам и приведены названиа соответствующих ОРТ Звездочками отмечены гены, с экспериментально доказан-ними hr-функшими Тонкими ликкхми обозначены районы делеиий в ДНК одних вирусов относительно других.

kir 1 , 's

1—н-

b23r d23r

<=>

oir

c=0

B0K-CR1

vi9s

BOK-GRI

BOK-BRI

ВЭ-MOS

BOB-COP

BIIO-IND

Рис 5 Схем» расположен«« ОРТ Kelch подобных белков вирусов ослы норов ВОК CRI и ВОК BRI, эктромелии ВЭ MOS, оспоеакцини ВОВ СОР. натуральной ослы BHO-1ND в левом (А) и правом (Б) концевых видоспецифичных районах ортопоксвирусного генома. Светлыми стрелками обозначены направление ktlch-подобных ОРТ, а серыми - »типичные гены этого семейства Тонкими линиями обозначены районы делеции в ДНК одних вирусов относительно других.

ВТВ-белок. Важно отметить, что в геноме ВНО рассматриваемое семейство представлено только значительно укороченными потенциальными ОРТ, а некоторые ОРТ и вовсе отсутствуют (см. рис. 5).

Несмотря на многочисленность Kelch-подобных белков у ортопоксвирусов, функция их до сих пор остается невыясненной. Отсутствие генов данного семейства у разных изолятов вируса натуральной оспы и возможность их делегирования у вирусов осповакцины и оспы коров без потери его жизнеспособности в культуре клеток указывают на то, что эти гены не являются жизненно важными для ортопоксвирусов По-видимому, данные гены важны для проявления видоспецифичных свойств ортопоксвирусов в системе in vivo.

433. Молекулярные факторы преодоления ортопоксвирусами защитных реакций организма.

Поксвирусы обладают беспрецедентным, по сравнению с вирусами других семейств, набором генов, белковые продукты которых эффективно модулируют многочисленные защитные функции организма хозяина. По мере изучения новых видов ортопоксвирусов число таких генов возрастает. Так, анализ генома BOK-GRI позволил нам обнаружить новые гены этого класса, гомологи которых у ранее изучавшихся видов ортопоксвирусов либо отсутствовали вообще, либо были сильно укорочены. К ним можно отнести следующие ОРТ: D13L, K2R, K3R, B2R, B8R, T1R. ОРТ D13L (CD30), K2R (CrmD), K3R (CrmE) принадлежат к суперсемейству генов TNF-рецепторов. У BOK-GRI нами впервые обнаружено 5 генов этого семейства, которые характеризуются относительно высокой взаимной гомологией, но одновременно имеют и выраженные различия (см. рис. б; табл 1)

Гены, кодирующие белки семейства TNF-рецепторов, представлены у ортопоксвирусов различным количеством копий. Так, ВОВ не способен синтезировать белки этого типа, ВНО содержит единственный ген рассматриваемого семейства, у ВЭ это семейство представлено 2 генами. У BOK-BRI делегирован один из генов этого семейства (гомолог K3R BOK-GRI). Беспрецедентно большой набор генов семейства рецепторов TNF в составе генома ВОК позволяет сделать предположение,что каждый из обнаруженных в геноме ВОК гомологов рецептора TNF может иметь в организме хозяина специфичный белковый" лиганд, который, скорее всего, будет входить в семейство TNF. Например, белок D12L BOK-GRI наибольшую гомологию имеет с рецепторной частью клеточного белка CD30. Недавно было показано, что этот белок специфично связывает CD153 (лиганд CD30), и полностью ингибирует взаимодействие CD153/CD30. Это может привести к блокированию опосредованного CD30L взаимодействия моноцитов и лимфоцитов и, вследствие этого, препятствовать развитию как клеточного, так и гуморального иммунных ответов на вирусную инфекцию.

TNF-связывающие домены белков CrraB, CrmC, CrmD, СгтЕ (соответственно D2L/I4R,A56R, K2R, K3R BOK-GRI) гомологичны друг другу (см. рис. 6), но имеют некоторые отличия в специфичности связывания с лигандом. СтВ и CrmD (48 кДа и 46 кДа соответственно), являются секретируемыми белками, которые связывают

1 п 1 . ., _

D2L MTSVLISIILTLECIIINOTDIA---галРЗЯСХЁГОЯ—IIBItH—KZOLSÍPPCT 51

K2R -MFKTP____bVTMTWVSe.-V---.UBI.. .feser—0..SHSH. .ffiKQCD. .H 52

A56R MDX. .L.AVCTILYXTTLVTADIFTPLP. ...V..S^DXQtTLDK..—.ойнМ.. .X _ 5a

и» .ix.—ii..sr—b...tksbs—m------,|iaovai..iq-il^ia^a... «4

d13b ..----мш...л.м1-----------------------------—---13 1

1 1 2 2 2"' 2 2 2 D2L lASRlfDSKTHTHTQbltaSCinSSNHBUACLS&tSl^SH^TItöblTTmiltlEz III

K2R .KTHSIMTIS". . KJMSPD.....Ii. .I.ljj. .ER.K?>S. ,iK. jsM.QD.Ebi' 11Q ■ i .

*5«R F.KVR^S~GSD~. . Y.AXP.TSHGOTG£!R*K£7TG5roKVF3TG.Q. SKkS 115 K3R . sdhbÍ . ктзо—. i JgbSp .d____ii.rs.wm^.pIot.r. .VTpfrp.r. ..pH 102

D13L-----JLVT.---SrcK^nmnb-lPEDeL-BrajVT-EL. .M. .IQPgOTKF.RiO' « ' "

3 3 3 3 3 3 ' 4

D2X. txPairEliKSSSS---ÍXk&V$QIl£eiCICVSSIITSTe-DVV-E»esLETTSHIVSS 16«

F2R I.S...tZFZ..H.--6rI§.P...LD3____T. IS.K.-. .I-EKHEPGÜI------158

A56R EL. .Я.1А-П>..qtedsri«.PKSICTC..FG-.IDIO.-l»»I-íltslcv.i.------ICS

КЗЯ B3SSS.B...X.D.--ByVT?APK. .ß.R. ..KIC.IDIM.-HIt-paÍRK. ...DI..D 151 D13L .LK^TVPAVNS---5л»|ТИ». TIKDEPTDQCCT. PDUTiaglHKTSS 111

4 4'

02L ÄDl^PVTSHirairDVEIHLTPVSDTSErRIIIIGbSZSISISILIIIMHHimCDPm« 224

X2R -..pM---S..S......H____K..ÍMSSV--.S.ST.........Llt.t..I...I 211

AS6R — |ЭТ1Л-----------.TRUirrfP$XLSKCH 186

K3R S.0.3Í.MTR 165

D2I> DCTFSVLWKVATSGrFTGZNRYQHISKVCTUfFXIKCNHKDS—SSJCQLTKTKNDMIM 283 K2R GD.T..VD.L.......kdicvb.dlttq.kz.l.........GSZ.R. . .P.JUtV-TF. 26«

D2L raSETVTLVfiDCLSSVDXYZLTSNTHTQDnTOTZSYHVQNVXjDVDSBMPGSCDnn&X 342 C2R .......V......Db.V. .V.X. .DXIXSDM.WX. .TSIK.H. .BIF.ND.ZRO 322

C2L THSKPTRXX 351

Рис 6. Сравнение аминокислотных последовательностей потенциальных ОРТ BOK-GRI, кодирующих белки семейства рецепторов фактора некроза опухолей. Серыми вертикальными блоками выделены консервативные остатки аистенка, цифрами над ними обозначены четыре шютенн-богетых домена.

как TNF, так и лимфотоксин-a,, в то время как CimC (25 кДа) и CimE (18 кДа) специфично связывают только TNF. Экспериментально было показано, что СгтЕ, синтезированный в бакуловирусной и осповакционной экспрессионных системах, связывается с TNF человека, крысы и мыши. Однако СгтЕ защищает клетки только от цитолитической активности человеческого TNF.

Таблица 1. Открытые рамки трансляции (ОРТ) BOK-GRI , входящие в

Вирусные TNF-связывающие белки, как и их клеточные аналоги, содержат четыре цистеин-богатых домена, и, кроме того, 2 белка, из этого семейства (D2L/I4R и K2R) содержат С-концевой домен, не имеющий какой-либо гомологии не только с последовательностями клеточных рецепторов TNF, но и вообще с каким-либо из известных белков. Для вируса миксомы кроликов было показано, что у гомолога TNF-рецептора (М-Т2) есть еще и вторая функция. Внутриклеточная форма М-Т2 способна блокировать апоптоз в лимфоцитах.

К многочисленным ингибиторам апоптоза ортопоксвирусов можно причислить еще два белка BOK-GRI, кодируемых ОРТ B8R и T1R. ОРТ B8R является гомологом гена М-Т4 вируса миксомы кроликов. Этот ген кодирует белок, удерживаемый в эндоплазматическом ретикулюме и ответственный за ингибирование апоптоза инфицированных лимфоцитов. Полноразмерный гомолог этого гена есть у ВОК, BOO и ВОВБ. Хотя уровень гомологии с М-Т4 невысок и составляет около 25%, десять из одиннадцати цистеиновых остатков сохранили свое положение. Интересно отметить, что у ортопоксвирусов этот ген, как и ген C11L BOK-GRI, представлен 2 аллелями. Первый тип аллеля встречается у BOK-GRI и BOO-ZAI, а второй - у BOK-BRI и ВОВБ-CMS (см. рис. ЗБ). Гомология ОРТ внутри каждой группы достигает в среднем 97 процентов, тогда как межаллельная гомология ОРТ составляет чуть больше 66, при этом гомология обеих групп с М-Т4 вируса миксомы кроликов лежит в диапазоне 2225 процентов. По всей видимости, наличие двух аллелей является следствием адаптации вируса к новому хозяину или к новому типу клеток.

Единственный гомолог гена T1R BOK-GRI был обнаружен в левой концевой области генома вируса оспы верблюдов (6L). Кодируемый им белок длиннее гомологичного белка BOK-GRI на 27 ак и имеет 94% идентичности на перекрывающейся аминокислотной последовательности. 6L является интегральным мембранным белком с 5 трансмембранными доменамм и сигнальным пептидом. Этот белок идентичен на 33-35% представителям Вах-ингибиторов (BI-1), которые являются семейством интегральных мембранных белков. Представители этого семейства ингибируют апоптоз, индуцированный повышенной экспрессией Вах-белка. Возможно, T1R BOK-GRI также является регулятором клеточной смерти инфицированных клеток.

Вирус оспы верблюдов, ВОК и ВЭ содержат ОРТ, гомологичную на 36% представителям недавно открытого семейства белков Schlafen (Slfn). Прототипный белок этого семейства, Slfnl, ингибирует рост и развитие Т-клеток. Этот белок является внутриклеточным и для того, чтобы вирусный аналог мог исполнить похожую функцию, вирус должен быть способным инфицировать Т-клетки. С другой стороны, можно предположить, что этот вирусный белок необходим для подавления нежелательных для вируса функций инфицированной клетки.

Как видно из таблицы 2, процент гомологии ОРТ двух штаммов ВОК для большинства генов оказался меньше, чем при сравнении с другими видами, и, следовательно, эти цифры дают недостаточную информацию о функциональных отличиях этих белков. Более значимым является тот факт, что каждый вид ортопоксвирусов обладает характерным только для него набором молекулярных факторов вирулентности. Из 22 генов, приведенных в таблице 2, у ВОВ отсутствуют

Таблица 2. Белки BOK-GRI и других ортопоксвирусов, модулирующие иммунный _ ответ организма_______________

ОРТ вок- GRI Функции белка Предполагаемое мшкАсгам на 9ргаямэм Идентичность (%)< BOK-CRI

ВОК-BRI ВЭ-MOS ВОВ-ТОГ BOB-WR BHO-LNO BHO-GAR

D2L I4R* ЮТ-смэ белок» СгтВ Иягибиромнме аповгоза к яоепалятеяьяих реакций, иммуномоауляиня 90S 905 II II II »0.9 90.»

A56R "П^-смз белок, СггоС Ингибироаание алоптоза к воспалительных реакций, иммупомодуяяиня 871 """ H

K2R ТМР-свяа белок, СгтО Ингибированне алоптоза н воспалительных реакций, иммуномо дум им

K3R Т№-свяэ. белок, СгтпЕ Ипгнбнрованне алоптоза х воспалительных реакций, яммуномодуяя им mt'

DHL Гомолог СБЗО, СП!53-св«э белок Иммуяомодуляши 901 94.4 ■■

BI2R БР1-2, СгтпА Иигмбирояакяе апоптеза ■ воспалительных реакций, имму номодуля цня 919 95.« - - 95.6 942

B14R иктерлейкин>1^> с вяз белок Ингибироаание »оспалкгел. реакций, имчумомодуляц 94 8 >2 6 98.3 969

B7R Г-интерферон» сап. белок Ингябнрованне воспалится реакций, устойчивость к действию иммукомодуляц 93 1 915 9U 960 92.1 912

OIL I5R* СС*хемокин-связ белок Ингибированне воспалительных реакций 806 80 6 ' £3.2 13 2 II II 92» »34

C17L компдемект-связ белок, УСР Ингибированне воспалнтель-них реакций 90) 9Z3 95 4 9SJ 9U 913

A41R Семвфорнн-поообный Ингибированне воспалительных реакций, нмютюмодуляа 95 S 94 S 95.5 ™ ■■

C7R 2п-саяэывак>ший белок Ингибированне алоптоза 97S 971 Ш 97.» »7.»

B8R Гомолог Т4 Ингибироаание алоптоза 662 ■■ ■H ШН H

B20R БРМ Ингибированне апоптта 917 94« 944 »50 91 S 91 5

TIR В ингибитор Ингибированне алоптоза ■■ ■■ ■M . ■I ■M ■Ш

F3L дцРНК связывавший белок Устойчивость к действию [Ж, мотивирование алоптоза 94.2 916 97 4 94» 95} 93.3

M3L Гомолог е!Р-2а Устойчивость к действию 93 2 »8» 97» «3 0 83 2

B17R нктерферончх/р-связ белок Устойчивость к действию ГТК 900 93Л 93.0 91 > 907 899

C8L 1Ь*18«смз белок И мму но модуля цня 797 79J ■Ш 92.1 789 764

A42R рецептор МС-клеток И ммуно модуляши 89 8 "" 97.8 93 4 *

A47L З-^Гядрокснсте-рояд дегидрогеназа Им муло модуляция 977 94 5 991 994

B2R $сМаГеп-лодобный Иммувомодуляиия 909 95.2 ■■ ■■ M

Примечания: Цифры, выделенные жирным шрифтом, указывают на максимальную гомологию данной ОРТ с BOK-GRL Черные прямоугольники соответствуют делегированным или сильно укороченным ОРТ Звездочками отмечены ОРТ, расположенные в инвертированных концевых повторах (TIR)

или разрушены 12 генов, у ВНО - 11, причем набор разрушенных генов специфичен для каждого вида. У ВЭ-М08 отсутствует 7 генов.

Обнаруженные различия по уровню идентичности набора белков штаммов ВОК-ОИ и В0К-ВЫ позволяют сделать вывод о том, что ВОК состоит из нескольких подвидов, у которых отдельные гены могут быть представлены разными вариантами (аналогия с аллельными генами). Наличие в одном географическом ареале таких подвидов ВОК может иметь мощное адаптивное значение для вируса, так как при изменении природных условий рекомбинационные процессы между различными подвидами ВОК могут привести к появлению множества новых вариантов вируса с измененными свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Получена и охарактеризована библиотека гибридных плазмид, несущих фрагменты ДНК ВОК штамм GRI-90 (BOK-GRI), покрывающие в сумме вирусный геном на 97.8 процента.

2. Определена последовательность 223666 пар нуклеотидов ДНК BOK-GRI, представляющая весь геном вируса за исключением концевых шпилек. Последовательность нуклеотидов BOK-GRI аннотирована и сдана на хранение в Международный банк данных EMBL Data Library под регистрационным номером Х94355. Установлено, что BOK-GRI кодирует 211 потенциальных открытых рамок трансляции (ОРТ) размером от 62 до 1933 аминокислотных остатков.

3. В результате сравнительного анализа 5 полных ортопоксвирусных геномов (ВОК, штамм GRI-90, ВОК штамм Brighton, ВЭ штамм Moscow, BOB штамм Copenhagen и ВНО штамм India-1967) впервые показано, что вирус оспы коров обладает наиболее полным набором вирусных генов среди изученных ортопоксвирусов. Высказано предположение о возможной эволюции ортопоксвирусов от общего ВОК-подобного прародителя в результате делеций, мутаций и рекомбинаций его генома и формирования видоспецифических наборов генов.

4. Обнаружена общая закономерность для всех видов ортопоксвирусов в отношении типа генов, разрушенных в процессе эволюции. Большинство делегированных или разрушенных генов BHO-IND, ВОВ-СОР и ВЭ-MOS принадлежат либо к генам анкирин-подобных белков, либо к kelch-генам, либо к генам, кодирующим молекулярные факторы преодоления защитных реакций организма.

5. Установлено, что на фоне высокой внутривидовой гомологии штаммов ВОВ, ВНО и ВЭ внутривидовая гомология генов BOK-GRI и BOK-BRI в концевых вариабельных областях генома невысока, что может указывать на большее внутривидовое разнообразие ВОК по сравнению с другими видами ортопоксвирусов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Сафронов П.Ф., Петров НА., Рязанкина О.И., Тотменин А.В., Щелкунов С.Н., Сандахчиев Л.С. Гены круга хозяев вируса оспы коров. 1996. Докл. РАН. Т. 249. С.829-833.

2. Щелкунов С.Н., Сафронов П.Ф., Тотменин AJ3., Рязанкина О.И., Петров НА, Гуторов В.В., Сандахчиев Л.С. Множественные гены белков семейства рецептора фактора некроза опухолей у вируса оспы коров. 1998. Докл. РАН. Т. 360. С. 702-705.

3. Shchelkunov S. N.. Safronov P. F., Totmenin A. V., Petrov N. A., Ryazankina O.I., Gutorov V. V., and Kotwal G. J. ТЪе genomic sequence analysis ofthe left and right species-specific terminal region of a cowpox virus strain reveals unique sequences and a cluster of intact ORFs for immunomodulatory and host range proteins. // Virology. - 1998. - V. 243. - N 2. - P. 432 - 460.

4. Рязанкина О.И., Туманова О.Ю., Колосова И.В., Сафронов П.Ф., Каблова Г.В., Щелкунов С.Н. Структурно-функциональная организация генома вируса оспы коров, штамм GRI-90.1. Получение клонотеки фрагментов ДНК полного генома ВОК. 2000. Молекулярная биология, т.34, № 1, с. 160 -168.

5. Сафронов П.Ф., Рязанкина О.И., Петров НА, Тотменин А.В., Колосова И.В., Щелкунов С.Н. Структурно-функциональная организация генома вируса оспы коров, штамм GRI-90. II. Сравнительный анализ структуры левого видоспецифичного района генома орто-поксвирусов. 1999. Молекулярная биология, Т. 33, № 2, С. 291-302.

6. Сафронов П.Ф., Тотменин А.В., Рязанкина О.И., Щелкунов С.Н. Структурно-функциональная организация генома вируса оспы коров, штамм GRI-90. Ш. Функциональная характеристика левого видоспецифичного района генома. 1999. Молекулярная биология, т. 33, № 2, с. 303-313.

Подписано в печать 08.00004 Формат 60x841/16 Печ.л. 1 Заказ №3 * Бумага офсетная, 80 ^/м2 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

»-2324

РНБ Русский фонд

2004-4 27624

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сафронов, Павел Федорович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ. ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОРТОПОКСВИРУСЫ: МЕЖВИДОВЫЕ И ВНУТРИВИДОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ.

1. Основы видовой дифференцировки ортопоксвирусов.

2. Белооспинные мутанты ортопоксвирусов.

3. Функциональная роль генов, расположенных в теломерных областях.

3. 1 Молекулярные факторы вирулентности.

3.1.1 Ингибиторы апоптоза инфицированных клеток.

3.1.2 Ингибиторы воспалительных реакций.

3.1.3 Ингибиторы действия интерферона.

3.1.4 Модуляторы иммунного ответа.

3.2 Гены круга хозяев.

3.3 Семейство Ке1сИ-белков

4. Тельца включения типа А ортопоксвирусов.

5. Внутривидовая вариабельность вируса оспы коров.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Секвенирование и анализ организации генома вируса оспы коров штамм GRI-90"

Исследование биологических свойств представителей рода

Orthopoxvirus имеет относительно долгую историю, но оно не потеряло своей актуальности и до наших дней. Многие вирусные виды, входящие в состав этого рода, вызывают заболевания человека, такие как известная с глубокой древности натуральная оспа и недавно открытая оспа обезьян у ^ человека. Уже более 25 лет прошло с того времени как была прервана естественная трансмиссия натуральной оспы, начавшаяся задолго до нашей эры, в период формирования так или иначе связанных между собой сообществ людей. Появившись однажды в Африке или Восточной Азии, как следствие изменчивости одного из вирусов животных, натуральная оспа постепенно распространилась по всему миру (Маренникова и Щелкунов, 1998). Сохранение до настоящего времени природного резервуара ортопоксвирусов, а также увеличение прослойки неиммунного к ортопоксвирусам населения, делает вероятным появление в природе эпидемически опасного для людей вируса, близкого к вирусу натуральной оспы по патогенности и контагиозности. С 1970-х годов в различных частях Европы и бывшего Советского Союза было выделено множество штаммов вируса оспы коров от коров (Dekking, 1964), домашних кошек (Bennet et al., ^ 1986), белых крыс (Marennikova et al., 1978а), многих видов экзотических животных в зоопарках и цирках (Marennikova et al., 1977, Baxby et al., 1982). Их удалось выделить .не только от больных животных с генерализованной сыпью и гнойничковыми поражениями кожи, но и от внешне здоровых грызунов (Marennikova et al., 1978b). Совсем недавно в Бразилии коровьей оспой заразились 37 человек и 1500 голов крупного ^ рогатого скота. Периодически возникающие вспышки этого заболевания являются в Бразилии давней проблемой. Однако биологические свойства вируса, выделенного во время одной из таких вспышек, больше напоминали вирус осповакцины, а не вирус оспы коров. На основании данных, полученных при сравнении рестриктных карт вирусной ДНК и нуклеотидной последовательности гена, кодирующего гемагглютинин, авторами (Damaso et al., 2000) было сделано предположение, что выделенный вирус мог произойти от вируса осповакцины штамм ЮС, который 20 лет назад использовали в Бразилии для вакцинации. Если сделанное заключение верно, то впервые выявлен случай длительной персистенции вируса осповакцины в Новом Свете, что свидетельствует о высоком эпидемиологическом потенциале ортопоксвирусов.

Первые попытки установить эволюционную удаленность видов ортопоксвирусов предпринимались при помощи построения рестриктных карт геномной ДНК. Esposito and Knight (1985) построили рестриктные карты геномов всех известных к тому времени представителей рода Orthopoxvirus. Такое картирование может служить критерием принадлежности вирусного штамма к роду Orthopoxvirus, и внутри рода критерием принадлежности к тому или иному виду. Однако этот метод оставляет без ответа вопрос о том, какой из видов наиболее близок к вирусу-предшественнику, и соответственно, какой из видов сохранил наибольший эволюционный потенциал для появления новых видов ортопоксвирусов.

Намного большую информацию дает секвенирование и исследование структурно-функциональной организации генома ортопоксвирусов. Впервые полная структура генома была расшифрована для вируса осповакцины (Goebel et al., 1990). Позднее в нашей лаборатории была определена полная кодирующая последовательность нуклеотидов всего генома вируса натуральной оспы (Shchelkunov et al., 1992). Сравнительный анализ организации геномов этих двух вирусов позволил установить границы изменчивости их генов, а также тот факт, что эти два вируса обладают разными наборами генов, контролирующих свойства патогенности и детерминирующих круг хозяев вируса (Shchelkunov, 1995). Представленные данные с очевидностью свидетельствуют о том, что эти два вида ортопоксвирусов не могли произойти друг от друга. С другой стороны, очень высокая гомология центральных районов генома доказывает, что у них когда-то был общий предшественник.

Какой же из ныне существующих видов ортопоксвирусов наиболее близок к вирусу-предшественнику, и какими свойствами он должен обладать?

По всей видимости, одним из таких свойств должен быть широкий круг хозяев ' среди диких животных, позволяющий вирусу длительно циркулировать в природе на большом ареале. Способность к длительной персистенции в организме хозяина будет также способствовать стабильному присутствию вируса в популяции чувствительных животных. Кроме того, сравнение нуклеотидных. последовательностей геномов вируса осповакцины и вируса натуральной оспы позволило обнаружить, что геномы этих вирусов часто имеют довольно протяженные делеции друг относительно друга (Shchelkunov, 1995). Логично предположить, что вирус, имеющий наиболее протяженный геном, гораздо ближе расположен в эволюционном плане к вирусу-предшественнику. В полной мере всеми этими качествами обладает вирус оспы коров. Следовательно, несомненный научный интерес представляет определение нуклеотидной последовательности генома ВОК, исследование его генетической организации, поиск не идентифицированных генов патогенности и установление эволюционных взаимосвязей между " видами ортопоксвирусов.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы было определение нуклеотидной последовательности ДНК вируса оспы коров штамм GRI-90, анализ организации его генома и сравнение с геномами других ортопоксвирусов.

В ходе исследования решали следующие задачи:

- получение библиотеки гибридных плазмид, несущих фрагменты генома ВОК штамм GRI-90, и ее характеризация;

- секвенирование вирусного генома;

- получение карт потенциальных открытых рамок трансляции (ОРТ) геномных последовательностей ДНК;

- выполнение компьютерного сравнительного анализа 5 полных ортопоксвирусных геномов (ВОК, штамм GRI-90, ВОК штамм Брайтон, ВЭ штамм Москва, ВОВ штамм Копенгаген и ВНО штамм Индия);

- анализ взаимной гомологии генов и белков ортопоксвирусов разных видов;

- выявление уникальных для ВОК генов и поиск по банку данных их функциональных аналогов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Получена библиотека гибридных плазмид, несущих фрагменты генома ВОК штамм GRI-90 (BOK-GRI). Геном BOK-GRI представлен в коллекции на 97.8% в виде клонированных фрагментов.

Определена полная нуклеотидная последовательность генома BOK-GRI. Последовательность нуклеотидов BOK-GRI аннотирована и сдана на хранение в Международный банк данных EMBL Data Library под регистрационным номером Х94355.

Обнаружено, что штаммы вируса оспы коров (BOK-GRI и BOK-BRJ) обладают самым протяженным геномом и наиболее полным набором вирусных генов среди изученных ортопоксвирусов. На основании этих данных сделано предположение, что ВОК - наиболее древний среди рассматриваемых ортопоксвирусов, а такие виды как ВНО, ВЭ и ВОВ образовались в результате их независимой эволюции от общего ВОК-подобного вируса-прародителя.

Выявлена общая закономерность для всех видов ортопоксвирусов в отношении типа генов, разрушенных в процессе эволюции. Большинство делетированных или разрушенных генов BHO-IND, ВОВ-СОР и ВЭ-MOS принадлежат либо к генам анкирин-подобных белков, либо к kelch-renaM, либо к генам, кодирующим молекулярные факторы вирулентности.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ

1. Сафронов П.Ф., Петров Н.А., Рязанкина О.И., Тотменин А.В., Щелкунов С.Н., Сандахчиев JI.C. Гены круга хозяев вируса оспы коров. 1996. Докл. РАН. Т. 249. С. 829-833.

2. Щелкунов С.Н., Сафронов П.Ф., Тотменин А.В., Рязанкина О.И., Петров Н.А., Гуторов В.В., Сандахчиев JI.C. Множественные гены белков семейства рецептора фактора некроза опухолей у вируса оспы коров. 1998. Докл. РАН. Т. 360. С. 702-705.

3. Shchelkunov S. N., Safronov P. F., Totmenin A. V., Petrov N. A.,' Ryazankina О. I., Gutorov V. V., and Kotwal G. J. The genomic sequence analysis of the left and right species-specific terminal region of a cowpox virus strain reveals unique sequences and a cluster of intact ORFs for immunomodulatory and host range proteins. // Virology. - 1998. - V. 243. - N 2. - P. 432 - 460.

4. Рязанкина О.И., Туманова О.Ю., Колосова И.В., Сафронов П.Ф., Каблова Г.В., Щелкунов С.Н. Структурно-функциональная организация генома вируса оспы коров, штамм GRI-90. I. Получение клонотеки фрагментов ДНК полного генома ВОК. 2000. Молекулярная биология, т.34, № 1, с Л 60 -168.

5. Сафронов П.Ф., Рязанкина О.И., Петров Н.А., Тотменин А.В., Колосова И.В., Щелкунов С.Н. Структурно-функциональная организация генома вируса оспы коров, штамм GRI-90. II. Сравнительный анализ структуры левого видоспецифичного района генома ортопоксвирусов. 1999. Молекулярная биология, Т. 33, № 2, С. 291-302.

6. Сафронов П.Ф., Тотменин А.В., Рязанкина О.И., Щелкунов С.Н. Структурно- функциональная организация генома вируса оспы коров, штамм GRI-90. III. Функциональная характеристика левого видоспецифичного района генома. 1999. Молекулярная биология, т. 33, №2, с. 303-313.

ВКЛАД АВТОРА

Секвенирование ДНК вируса оспы коров выполнено автором совместно с Н.А. Петровым, В.В. Гуторовым и М.В. Михеевым. Компьютерный анализ организации генома GRI-90 ВОК, анализ различий в нукпеотидных I последовательностях ДНК вирусов оспы коров, эктромелии, натуральной оспы и осповакцины выполнены лично автором. Создание и характеризация клонотеки фрагментов геномной ДНК штамма GRI-90 ВОК выполнено О.И. Рязанкиной при участии автора.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сафронов, Павел Федорович

ВЫВОДЫ

3. В результате сравнительного анализа 5 полных ортопоксвирусных геномов (ВОК, штамм GRI-90, ВОК штамм Brighton, ВЭ штамм Moscow, ВОВ штамм Copenhagen и ВНО штамм India-1967) впервые показано, что вирус оспы коров обладает наиболее полным набором вирусных генов среди изученных ортопоксвирусов. Высказано предположение о возможной эволюции ортопоксвирусов от общего ВОК-подобного прародителя в результате делеций, мутаций и рекомбинаций его генома и формирования видоспецифических наборов генов.

4. Обнаружена общая закономерность для всех видов ортопоксвирусов в отношении типа генов, разрушенных в процессе эволюции. Большинство делетированных или разрушенных генов BHO-IND, ВОВ-СОР и ВЭ-MOS принадлежат либо к генам анкирин-подобных белков, либо к £е/с/г-генам, либо к генам, кодирующим молекулярные факторы преодоления защитных реакций организма.

Установлено, что на фоне высокой внутривидовой гомологии штаммов ВОВ, ВНО и ВЭ внутривидовая гомология генов BOK-GRI и BOK-BRI в концевых вариабельных областях генома невысока, что может указывать на большее внутривидовое разнообразие ВОК по сравнению с другими видами ортопоксвирусов.

Глава IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного сравнительного анализа организации генома различных ортопоксвирусов нами обнаружено, что вирус оспы коров обладает самым полным набором вирусных генов. Многие гены являются уникальными для ВОК, но среди ортопоксвирусов с известной нуклеотидной последовательностью не было обнаружено ни одного гена, не имеющего гомолога в том или ином штамме ВОК. На основании этих данных можно заключить, что ВОК - наиболее древний среди рассматриваемых ортопоксвирусов, а такие виды как ВНО, ВЭ и ВОВ образовались в результате их независимой эволюции от общего вируса-прародителя, на роль которого может претендовать ВОК или близкий ему ортопоксвирус.

Два штамма ВОК, для которых осуществлено сравнение организации геномов, имеют почти идентичный набор генов, но, не смотря на это, внутривидовая гомология генов ВОК в вариабельных областях невысока и часто ее значения меньшие, чем при сравнении BOK-GRI с другими видами ортопоксвирусов. С другой стороны, внутривидовая гомология таких ортопоксвирусов как ВНО и ВОВ очень высока практически по всей длине генома. Эти данные согласуются с информацией о том, что штаммы ВОК, выделенные от различных животных и в разных географических зонах, гетерогенны по ряду биологических свойств: размеру бляшек, предельной температуре размножения ' на культуре клеток, патогенности для лабораторных животных, типу ATI-тел и др. (Маренникова и Щелкунов, 1998). Кроме того, у штаммов ВОК, выделенных от грызунов, в вариабельных областях часто обнаруживаются протяженные делеции, а ATI-тела не содержат вирусных частиц. Поскольку множественные факторы вирулентности, гены круга хозяев и «буферные» гены сосредоточены именно в этих районах, то было бы правомерным считать, что ВОК состоит из множества подвидов, различающихся по кругу природных хозяев, патогенности и способности к длительной персистенции в популяции животных. Возможно, что очень широкий круг хозяев ВОК является суммарным эффектом существования множества подвидов.

Обнаруженные у ортопоксвирусов ОРТ с необычно низким уровнем взаимной гомологии свидетельствует о том, что в процессе становления генома ортопоксвирусов шли активные рекомбинационные процессы с представителями других родов поксвирусов или с сильно дивергировавшими видами ортопоксвирусов. В результате этого в геноме ВОК отдельные гены представлены различными вариантами в разных изолятах. В связи с этим можно предполагать, что у ВОК существует свой генофонд, усиливающий эволюционный потенциал этого вида.

Более низкая внутривидовая гомология по целому ряду ОРТ двух изученных штаммов ВОК по сравнению с внутривидовой гомологией штаммов других видов ортопоксвирусов свидетельствует о том, что эти виды эволюционировали от разных подвидов ВОК. Следовательно, межвидовые различия во многом могут быть обусловлены исходными различиями ВОК-подобных предков каждого вида. В то же время очень высокий процент внутривидовой гомологии между изученными штаммами ВНО, BOO, ВЭ и ВОВ свидетельствует о том, что эти виды являются потомками одной эволюционной линии и повторного возникновения аналогичных видов либо не было вообще, либо они исчезли в процессе эволюции.

Сравнительное изучение организации генома ортопоксвирусов позволило выявить общую закономерность для всех видов ортопоксвирусов в отношении типа генов, разрушенных в процессе эволюции. Большинство делетированных или разрушенных относительно ВОК генов BHO-IND, ВОВ-СОР и ВЭ-MOS принадлежат либо к генам анкирин-подобных белков, либо к fe/сЛ-генам, либо к генам, кодирующим молекулярные факторы вирулентности. При этом следует отметить, что набор этих генов у каждого вида высоко- специфичен. Этот набор, или генетический «паспорт», можно считать главным критерием принадлежности вируса к тому или иному виду. Таким образом, такие ортопоксвирусы как ВОВ, ВНО и ВЭ не могли произойти друг от друга и не могут дать в процессе эволюции новые виды со свойствами, присущими другому виду. В то же время ВОК сохраняет за собой очень высокий эволюционный потенциал, и при определенных условиях дальнейшие изменения в геноме этого вида могут привести к появлению нового ВНО-подобного штамма вируса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сафронов, Павел Федорович, Кольцово

1. Мальцева Н.Н. Сравнительное изучение свойств различных штаммов вируса вакцины: Дисс. канд. биол. наук. М.,1965. - 210с.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии // Молекулярное клонирование двухцепочечной кДНК / Под ред. А. А. Баева. -Москва, «Мир», 1988.-С. 209-218.

3. Маренникова С.С., Мальцева Н.Н. Сравнительное изучение некоторых штаммов вируса вакцины. Сообщ.1. особенности поведения в куриных зародышах, гемагглютинирующая активность и терморезистентность // Вопр. вирусол. 1964. -№ 3. С. 280 - 286.

4. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. КМК Scientific Press Ltd., М., 1998. - 386 с. Маренникова С.С., Мальцева Н.Н., Юмашева М.А. К вопросу о происхождении вируса вакцины // Вопр. вирусол. - 1965. — № 6. — С. 716 — 719.

5. Маренникова С.С., Гашников П.В., Жукова О.А., Рябчикова Е.И., Стрельцов

6. B.В., Рязанкина О.И., Чекунова Э.В., Янова Н.Н., Щелкунов С.Н. Биотип и генетическая характеристика изолята вируса оспы коров, вызвавшего инфекцию ребенка // Журн. микробиол. 1996. -№ 4. - С. 6 - 10.

7. Пенмен Ш. Вирусология точная архитектура // Метаболизм вирусов и клеток / Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа. М., Мир., 1989. - Т. 1. - С. 307 - 328.

8. Приходько Г.Г., Дегтярев С.Х., Речкунова Н.И., Сосновцев С.В., Чижиков В. Е. Общий метод определения участков расщепления ДНК эндонуютеазами рестрикции // Биотехнология. 1990. - № 1. - С. 12-16.

9. Сафронов П.Ф., Петров Н.А., Рязанкина О.И., Тотменин А.В., Щелкунов

10. C.Н., Сандахчиев JI.C. Гены круга хозяев вируса оспы коров // Докл. Академии наук. 1996.-№ 249. - С. 829 -833.

11. Соловьев В.Д., Мастюкова Ю.Н. Вирус вакцины и вопросы оспопрививания. М : Медгиз., 1961.-311 с.

12. Уманский С.Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы // Молекуляр. биология. 1996. -№ 30. - С. 487-502.

13. Ханаан Д. Методы трансформации E.coli. // Клонирование ДНК. Методы / Под ред. Д. Гловера. М. Мир., 1988. С.140-173.

14. Шелухина Э.М. Биология и экология ортопоксвирусов, патогенных для человека. Дисс. докт. биол. наук., М., 1980.-23 с.

15. Щелкунов С.Н., Рязанкина О.И., Крыкбаев Р.А., Белавин П.А. Экспрессия последовательностей ДНК ортопоксвирусов в клетках Escherichia coli. // Молекуляр. биология. 1992. -№ 25. - Вып. 4. - С. 772 - 779.

16. Щелкунов С.Н., Блинов В.М., Ресенчук С.М., Денисов С.И., Тотменин А.В., Сандахчиев JI.C. Семейство анкирин-подобных белков ортопоксвирусов // Докл. РАН. 1993. - № 328. - С. 256 - 258.

17. Щелкунов С.Н., Тотменин А.В., Колосова И.В., Сандахчиев JI.C. Видоспецифические различия в организации генов £е/с//-подобных белков ортопоксвирусов, патогенных для человека // Докл. РАН. 2002. — № 383. — С. 271 -275.

18. Ahn B.Y., Moss, В. Glutaredoxin homolog encoded by vaccinia virus is a virion-associated enzyme with thioltransferase and dehydroascorbate reductase activities // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992a. - V. 89. - № 15 - P. 7060 - 7064.

19. Ahn B.Y., Moss, B. RNA polymerase-associated transcription specificity factor encoded by vaccinia virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992b. - V. 89. - N 8. -P. 3536-3540.

20. Ahn B.Y., Gershon P.D., Jones E.V., Moss B. Identification of гроЗО, a vaccinia virus RNA polymerase gene with structural similarity to a eucaryotic transcription elongation factor//Mol. Cell. Biol. 1990a. -V. 10. -N 10. - P. 5433 - 5441.

21. Ahn B.Y., Jones E.V., Moss B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5' Poly(A) leader on its early transcript // J. Virol. 1990b. - V. 64. - N 6. - P. 3019 - 3024.

22. Ahn B.Y., Rosel J., Cole, N.B., Moss, B. Identification and expression of rpol9, a vaccinia virus gene encoding a 19-kilodalton DNA-dependent RNA polymerasee subunit // J. Virol. 1992. - V. 66. -N 2. - P. 971 - 982.

23. AlcamiA., Smith G.L. A soluble receptor for interleukin-lb encoded by vaccinia virus: a novel mechanism of viral modulation of the host response to infection // Cell.-1992.-V. 71.-N l.-P. 153-167.

24. AlcamiA., Smith G.L. Vaccinia, cowpox, and camelpox viruses encode soluble gamma interferon receptors with novel broad species specificity // J. Virol. 1995. - V. 69. - N 8. - P. 4633 - 4639.

25. AlcamiA., Smith G.L. A mechanism for the inhibition of fever by a virus // Proc Natl Acad Sci U S A. 1996. - V. 93. - N 20. - P. 11029 - 11034.

26. Almazan F., Tscharke D.C., Smith G.L. The vaccinia virus superoxide dismutase-like protein (A45R) is a virion component that is nonessential for virus replication // J Virol. 2001. - V. 75. - N 15. - P. 7018 - 7029.

27. Amegadzie B.Y., Ahn B.-Y., Moss B. Identification, sequence, and expression of the gene encoding a Mr 35,000 subunit of the vaccinia virus DNA-dependent RNA polymerase//J. Biol. Chem. 1991a. -V. 266. -N 21. - P. 13712 - 13718.

28. Antoine G., Scheiflinger F., Dorner F., Falkner F.G. The Complete Genomic Sequence of the Modified Vaccinia Ankara Strain: Comparison with Other Orthopoxviruses // Virology. 1998. -V. 244. - N 2. - P. 365 - 396.

29. Archard L.C., Mackett M. Restriction endonuclease analysis of red cowpox virus and its white pock variant//J. Gen. Virol. 1979.-V. 45. -N 1. -P. 51 - 63.

30. Archard L.C., Mackett M., Barnes D.E., Dumbell K.R. The genome structure of cowpox virus white pock variants // J. Gen. Virol. 1984. - V. 65. - N 5. - P. 875 -886.

31. Baek S.H., Kwak J.Y., Lee S.H., Lee Т., Ryu S.H., Uhlinger D.J., Lambeth J.D. Lipase activities of p37, the major envelope protein of vaccinia virus // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - N 51. - P. 32042 - 32049.

32. BanhamA.H., Smith G.L. Vaccinia virus gene B1R encodes a 34-kDa serine/threonine protein kinase that localizes in cytoplasmic factories and is packaged into virions // Virology. 1992. - V. 191. - N 2. - P. 803 - 812.

33. BanhamA.H., Smith G.L. Characterization of vaccinia virus gene B12R // J. Gen. Virol. 1993.- V. 74.- N 12.- P. 2807-2812.

34. Baroudy B.M., Venkatesan S., Moss B. Incomplemetely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain // Cell. 1982. - V. 28. - N 2. - P. 315 - 324.

35. Baroudy B.M., Venkatesan S., Moss B. Structure and replication of vaccinbia virus telomeres // Cold. Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1983. - V. 47. - N 2. -P. 723-729.

36. Baxby D. Laboratory characteristics of British and Dutch strains of cowpox virus. // Zentralbl Veterinaimed.B. 1975. - V. 22. - N 6. - P. 480 - 487.

37. Baxby D., Shackleton W.B., Wheeler J., Turner A. Comparison of cowpox-like viruses isolated from European zoos. Brief report // Arch. Virol. 1979. - V. 61. -N4.-P. 337-340.

38. Baxby D., Ashton D.G., Jones D.M., Thomsett L.R. An outbreak of cowpox in captive cheetahs: virological and epidemiological studies // J. Hyg. (Lond). -1982.-V. 89.-P. 365-372.

39. Bayliss C.D., Smith G.L. Vaccinia virion protein I8R has both DNA and RNA helicase activities: implications for vaccinia virus transcription // J. Virol. 1996. -V. 70.-N2.-P. 794-800.

40. Beattie E., Tartaglia J., Paoletti E. Vaccinia-virus encoded eIF-2a homolog abrogates the antiviral effect of interferon // Virology. 1991. - V. 183. - N 1. -P. 419-422.

41. Bennett M., Gaskell C.J., Gaskell R.M., Baxby. D., Gruffydd-Jones T.J. Poxvirus infection in the domestic cat: some clinical and epidemiological observations // Vet. Rec. 1986.-V. 11814.-N 22. - P. 387 - 390.

42. Beutler В., Van Huffel C. An evolutionary and functional approach to the TNF receptor/ligand family // Ann. NY Acad. Sci. 1994. - V. 730. -P. 118 - 133.

43. Blasco R., Moss B. Role of cell-associated enveloped vaccinia virus in cell-to-cell spread // J. Virol. 1992. - V. 66. - N 7. - P. 4170 - 4179.

44. Blasco R., Cole N.B., Moss B. Sequence analysis, expression, and deletion of a vaccinia virus gene encoding a homolog of profilin, a eukaiyotic actin-binding protein // J. Virol. 1991. - V. 65. - N 9. - P. 4598 - 4608.

45. Blomquist M.C., Hunt L.T., Barker W.C. Vaccinia virus 19-kilodalton protein: relationship to several mammalian proteins, including two growth factors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - N 23. - P. 7363 - 7367.

46. Born T.L., Morrison L.A., Esteban D.J., Van den Bos Т., Thebeau L.G., Chen N., Spriggs M.K., Sims J.E., Buller R.M. A poxvirus protein that binds to and inactivates IL-18, and inhibits NK cell response // J. Immunol. 2000. - V. 164. -N6.-P. 3246-3254.

47. Brick D.J., Burke R.D., Minkley A.A., Upton C. Ectromelia virus virulence factor p28 acts upstream of caspase-3 in response to UV light-induced apoptosis // J. Gen. Virol. 2000. - V. 81. - N 4. - P. 1087 - 1097.

48. Brown C.K., Turner P.C., Moyer R.W. Molecular characterization of the vaccinia virus hemagglutinin gene // J. Virol. 1991. - V. 65. - N 7. - P. 3598 - 3606.

49. Broyles S.S., Fesler B.S. Vaccinia virus gene encoding a component of the viral early transcription factor // J.Virol. 1990. - V.64. - N4. - P. 1523 -1529.

50. Broyles S.S., Moss В. Identification of the vaccinia virus gene encoding nucleoside triphosphate phosphohydrolase I, a DNA-dependent ATPase // J. Virol. 1987.-V. 61.-N5.- P. 1738- 1742.

51. Buller R.M.L., Palumbo G.J. Poxvirus pathogenesis // Microbiol. Rev. 1991. — V. 55.-P. 80-122.

52. Buller R.M.L, Chakrabarti S., Cooper J.A., Twardizik D.R., Moss B. Deletion of the vaccinia virus growth factor gene reduces virus virulence // J. Virol. — 1988. -V. 62. -N 3. P. 866-874.

53. Calderara S., Xiang Y., Moss B. Orthopoxvirus IL-18 binding proteins: affinities and antagonist activities // Virology. 2001. - V. 279. - N 1. - P. 22 - 26.

54. Cao J.X., Koop B.F., Upton C. A human homolog of the vaccinia virus Hindlll K4L gene is a member of the phospholipase D superfamily // Virus Res. 1997. -V. 48.-N 1.-P. 11-18.

55. Cassetti M.C., Merchlinsky M., Wolffe E.J., Weisberg A.S., Moss B. DNA packaging mutant: repression of the vaccinia virus A32 gene results in noninfectious, DNA-deficient, spherical, enveloped particles //J. Virol. 1998. -V. 72.-N 7. - P. 5769 - 5780.

56. Cavallaro K.F., Esposito J.J. Sequences of the raccoon poxvirus hemagglutinin protein//Virology.-1992.-V. 190.-N l.-P. 434-439.

57. Chang H.-W., Watson,J.C., Jacobs B.L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - N 11. - P. 4825 - 4829.

58. Chen W., Drillien R., Spehnef D., Buller R.M. Restricted replication of ectromelia virus in cell culture correlates with mutations in virus-encoded host range gene // Virology. 1992. - V. 187. - N 2. - P. 433 - 442.

59. Christen L.M., Sanders M., Wiler C., Niles E.G. Vaccinia virus nucleoside triphosphate phosphohydrolase I is an essential viral early gene transcription termination factor // Virology. 1998. - V. 245. - N 2. - P.360 - 371.

60. Chung C.S., Hsiao J.C., Chang Y.S., Chang W. A27L protein mediates vaccinia virus interaction with cell surface heparan sulfate // J. Virol. 1998. - V. 72. — N 2.-P. 1577- 1585.

61. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis // Biochem. Review. 1997. -V. 326.-P.1-16.

62. Cohen J.J., Duke R.C., Fadok V.A., Sellins K.S. Apoptosis and programmed cell death in immunity. //Annu Rev. Immunol. 1992. -V. 10. - P. 267-293.

63. Cooper J.A., Wittek R., MossB. Extension of the transcriptional and translational map of the left end of the vaccinia virus genome to 21 kilobase pairs // J. Virol. -1981. V. 39. - N 3. - P. 733 - 745.

64. Crook N.E., Clem R.J., Miller L.K. An apoptosis-inhibiting gene with a zinc finger-like motif//J. Virol. 1993. - V.67. - P. 2169-2174.

65. Cudmore S., Cossart P., Griffiths G., Way M. Actin based motility of vaccinia virus // Xlth Poxvirus and Iridovirus Meeting. May 4-9 1996. Toledo, Spain. - P. 131.

66. Dalton D.K., Pitts-Meek S., Keshav S., Figari I.S., Bradley A., Stewart T.A. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes // Science. 1993. - V. 259. -N 5102. - P. 1739- 1742.

67. Damaso C.R., Esposito J.J., Condit R.C., Moussatche N. An emergent poxvirus from humans and cattle in Rio de Janeiro State: Cantagalo virus may derive from Brazilian smallpox vaccine // Virology. 2000. - V. 277. - N 2. - P. 439 - 449.

68. Davies M.V., Elroy-Stein O., Jagus R., Moss В., Kaufman R.J. The vaccinia virus

69. K3L gene product potentiates translation by inhibiting double-stranded-RNAactivated protein kinase and phosphorylation of the alpha subunit of eukaiyotic initiation factor 2 // J. Virol. 1992. - V. 66. - N 4. - P. 1943 - 1950.

70. Dekking F. Cowpox and vaccinia // Zoonosis / J.van der Hoeden ed. — Elsevier, Amsterdam, 1964. -411 p.

71. Demkowicz W.E., Ennis F.A. Vaccinia virus-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes in humans//J. Virol. 1993. - V. 67.-N3.-P. 1538- 1544.

72. Duncan S.A., Smith G.L. Vaccinia virus gene SalF5R is non-essential for virus replication in vitro and in vivo // J. Gen. Virol. 1992. - V. 73. - N 5. - P. 1235 -1242.

73. Dyster L.M., Niles E.G. Genetic and biochemical characterization of vaccinia virus genes D2L and D3R which encode virion structural proteins // Virology. -1991.-V. 182.-N2.-P. 455-467.

74. Earl P.L., Jones E.V., Moss B. Homology between DNA polymerase of poxviruses, herpesviruses, and adenoviruses: Nucleotide sequence of the vaccinia virus DNA polymerase gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - N 11.-P. 3659-3663.

75. Engelstad M., Smith G.L. The vaccinia virus 42 kDa envelope protein is required for envelopment and egress of extracellular virus and for virulencve // Virology. -1993. V. 194. - N 2. - P. 627 - 637.

76. Engelstad M., Howard S.T., Smith G.L. A constitutively expressed vaccinia gene encodes a 42-kDa glycoprotein related to complement control factors that forms part of the extracellular virus envelope // Virology. 1992. - V. 188. - N 2. - P. 801-810.

77. Esposito J.J., Knight J.C. Orthopoxvirus DNA: A comparison of restriction profiles and maps // Virology. 1985. - V. 143. - N 1. - P. 230 - 251.

78. Esposito J.J., Cabradilla C.D., Nakano J.H., Obijeski J.F. Intragenomic sequence transposition in monkeypox virus // Virology. 1981. - V. 109. - N 2. - P. 231 -243.

79. Evans E., Klemperer N., Ghosh R., Traktman P. The vaccinia virus D5 protein, which is requered for DNA replication, is a nucleic acid-independent nucleoside triphosphatase //J. Virol. 1995. - V.69. - N 9. - P. 5353 - 5361.

80. Fenner F. The biological characters of several strains of vaccinia, cowpox, and rabbitpox viruses // Virology. 1958. - V.5. - P. 502 - 529.

81. Fenner F., Sambrook J.F. Conditional lethal mutants of rabbitpox virus. II. Mutants (p) that fail to multiply in PK-2a cells // Virology. 1966. - V.28. - P. 600-609.

82. Fenner F., Wittek R., Dumbell K.R. The Orthopoxviruses. Academic Press, Inc., San Diego, 1989-432pp.

83. Freemont P.S., Hanson I.M., Trowsdale J. A novel cystein-rich sequence motif // Cell. -1991.- V.64. N 3. - P. 483 - 484.

84. Frischknecht F., Moreau V., Rottger S., Gonfloni S., Reckmann I., Superti-Furga G., Way M. Actin-based motility of vaccinia virus mimics receptor tyrosine kinase signalling // Nature. 1999. - V.401. - N 6756. - P. 926 - 929.

85. Funahashi S., Sato Т., Shida H. Cloning and characterization of the gene encoding the major protein of the A-type inclusion body of cowpox virus // J. Gen. Virol. -1988.-V.69.-N l.-P. 35-47.

86. Gagliardini V., Fernandez P.-A., Lee R.K., Drexler H.C.A., Rotello R.J., Fishman M.C., Yuan J. Prevention of vertebrate neuronal death by the crmA gene // Science. 1994. - V.263. - P. 826 - 828.

87. Gershon P.D., Moss B. Early transcription factor subunits are encoded by vaccinia virus late genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V.87. -N 11. - P. 4401 -4405.

88. Gershon P.D., Ahn B.-Y., Garfield M., Moss, B. Poly(A) polymerase and a dissociable polyadenylation stimulatory factor encoded by vaccinia virus // Cell. -1991. V.66. - N 6. - P. 1269 - 1278.

89. Gillard S., Spehner D., Drillien R., Kirn A. Localization and sequence of a vaccinia virus gene required for multiplication in human cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83. - N 15. - P. 5573 - 5577.

90. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus // Virology. 1990. - V. 179. - N l.-P. 247-266.

91. Golini F., and Kates J.R. Transcriptional and translational analysis of a strongly expressed early region of the vaccinia virus genome // J. Virol. 1984. — V.49. -N2.-P. 459-470.

92. Griffiths G., Roos N., Schleich S., Locker J.K. Structure and assembly of intracellular mature vaccinia virus: thin-section analyses // J. Virol. — 2001. -V.75. N 22. - P. 11056-11070.

93. Gross C.H., Shuman S. The nucleoside triphosphatase and helicase activities of vaccinia virus NPH-II are essential for virus replication // J. Virol. 1998. — V.72. -N6.-P. 4729-4736.

94. Guan K., Broyles S.S., Dixon J.E. A Tyr/Ser protein phosphatase encoded by vaccinia virus // Nature. 1991. - V.350. - N 6316. - P. 359 - 362.

95. Gubser C., Smith G.L. The sequence of camelpox virus shows it is most closely related to variola virus, the cause of smallpox // J. Gen. Virol. 2002. - V.83. -N 4.-P. 855-872.

96. H.Gvakharia B.O., Koonin E.K., Mathews C.K. Vaccinia virus G4L gene encodes a second glutaredoxin // Virology. 1996. - V.226.- N 2. - P. 408 - 411.

97. Hansen H., Sandvik Т., Tryland M., Olsvik О., Traavik Т. Comparison of thymidine kinase and A-type inclusion protein gene sequences from Norwegian and Swedish cowpox virus isolates // APMIS. 1999. - V. 107. - N 7. - P.667 -675.

98. Havell E.A. Evidence that tumor necrosis factor has an important role in antibacterial resistance // J. Immunol. 1989. - V. 143-N 9. - P.2894 - 2894.

99. Hiller G., Weber K., Schneider L., Parajsz C., Jungwirth C. Interaction of assembled progeny pox viruses with the cellular cytoskeleton // Virology. 1979. -V.98.-N l.-P. 142- 153.

100. Hirt P., Hiller G., Wittek R. Localization and fine structure of a vaccinia virus gene encoding an envelope antigen // J. Virol 1986. - V.58.- N 3. - P.757 - 764.

101. Hsiao J.C., Chung C.S., Chang W. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the adsorption of intracellular mature virions to cells //J. Virol. 1999. - V.73. - N 10. - P. 8750 - 8761.

102. Hu F.Q., Smith C.A., Pickup D.J. Cowpox virus contains two copies of an early gene encoding a soluble secreted form of the type II TNF receptor // Virology.• 1994. V. 204. - N 1. - P.343 - 356 .

103. Hu X., Wolffe E.J., Weisberg A.S., Carroll L.J., Moss B. Repression of the A8L gene, encoding the early transcription factor 82-kilodalton subunit, inhibits morphogenesis of vaccinia virions//J.Virol.- 1998. V.72.-N l.-P. 104- 112.

104. Kane E.M., Shuman S. Temperature-sensitive mutations in the vaccinia virus H4 gene encoding a component of the virion RNA polymerase // J. Virol. 1992. -V.66. - N10. - P.5752 - 5762.

105. Kane E.M., Shuman S. Vaccinia virus morphogenesis is blocked by a temperature-sensitive mutation in the 17 gene that encodes a virion component // J. Virol. 1993. - V 67. - N 5. - P. 2689 - 2698.

106. Kao S.-Y., Bauer W.R. iosynthesis and phosphorylation of vaccinia virus structural protein VP11 // Virology. 1987. - V. 159. - N 2. - P.339 - 407.

107. Keck J.G., Baldick C.J., Moss B. Role of DNA replication in vaccinia virus gene expression: A naked template is required for transcription of three late trans-activator genes//Cell. — 1990.- V61.-N 5.-P. 801 -809.

108. Keck J.G., Kovacs G.R., Moss B. Overexpression, purification, and late transcription factor activity of the 17-kilodalton protein encoded by the vaccinia virus AIL gene //J. Virol. 1993b. - V. 67. - N 10. - P. 5740 - 5748.

109. Kerr S.M., Smith G.L. Vaccinia virus encodes a polypeptide with DNA ligase activity // Nucl. Acids Res. 989. - V. 17. - N 22. - P. 9039 - 9050.

110. Klemperer N., McDonald W., Boyle K., Unger В., Traktman P. The A20R protein is a stoichiometric component of the processive form of vaccinia virus DNA polymerase //J. Virol. -2001. V. 75. -N 24. - P. 12298 - 12307.

111. Koonin E.V. A highly conserved sequence motif defining the family of MutT-related proteins from eubacteria, eukaryotes and viruses // Nucleic Acids Res. -1993. V. 21. - N 20. - P. 4847 - 4849.

112. Koonin E.V., Senkevich T.G., Chernos V.I. Gene A32 product of vaccinia virus may be an ATPase involved in viral DNA packaging as indicated by sequence comparisons with other putative viral ATPases // Virus Genes. 1993. - V. 7. - N 1 -P. 89-94.

113. Ml.Kotwal G.J. The great escape immune evasion by pathogens I I Immunologist. -1996.-V. 4.-P. 157-164.

114. Kotwal G.J., Moss B. Vaccinia virus encodes a secretory polypeptide structurally related to complement control proteins // Nature. 1988. - V. 335. - N 6186. - P. 76-178.

115. Kotwal G.J., Moss B. Vaccinia virus encodes two proteins that are structurally related to members of the plasma serine protease inhibitor superfamily // J. Virol. 1989. - V. 63. - N 2. - P. 600 - 606.

116. Kotwal G.J., Hugin A.W., Moss B. Mapping and insertional mutagenesis of a vaccinia virus gene encoding a 13,800-Da secreted protein // Virology. 1989. -V. 171. -N 2. -P. 579-587.

117. Kovacs G.R., Moss B. The vaccinia virus H5R gene encodes late gene transcription factor 4: purification, cloning and overexpression // J. Virol. 1996. -V.70. - N 10. - P. 6796 - 6802.

118. Kovacs G.R., Vasilakis N., Moss B. Regulation of viral intermediate gene expression by the vaccinia virus B1 protein kinase // J. Virol. 2001. — V. 75. — N 9.-P. 4048-4055.

119. Lake J.R., Cooper P.D. Deletions of the terminal sequences in the genomes of the white pock (u) and host-restricted (p) mutants of rabbitpox virus // J. Gen. Virol. -1980.-V. 48.-N l.-P. 135-147.

120. Lambert S., Yu H., Prchal J.T., Lawler J., Ruff P., Speicher D., Cheung M.C., Kan Y.W., Palek J. cDNA sequence for human erythrocyte ankyrin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 1730 - 1734.

121. Law K.M., Smith G.L. A vaccinia serine protease inhibitor which prevents virus-induced cell fusion // J. Gen. Virol. 1992. - V73. - N 3. - P. 549 - 557.

122. Lee-Chen G.-J., Bourgeois N., Davidson K., Condit R.C., Niles E.G. Structure of the transcription and termination sequence of seven early genes in the vaccinia virus Hindlll D fragment // Virology. -1988. V. 163. - N 1. - P. 64 - 79.

123. Lin S., Broyles S.S. Vaccinia protein kinase 2: A second essential serine/threonine protein kinase encoded by vaccinia virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -V. 91.-N 16.-P. 7653-7657.

124. Lin S., Chen W., Broyles S.S. The vaccinia virus B1R gene product is a serine/threonine protein kinase // J. Virol. 1992. - V. 66. - N 5. - P. 2717 -2723.

125. Lux S.E., John K.M., Bennett V. Analysis of cDNA for human erythrocyte ankyrin indicates a repeated structure with homology to tissue-differentiation and cell-cycle control proteins // Nature. 1990. - V. 344. - P. 36 - 42.

126. Maa J.-S., Esteban M. Structural and functional characterization of cell surface binding protein of vaccinia virus // J. Virol. 1987. - V. 61. - N 12. — P. 3910 -3919.

127. Maa J.-S., Rodriguez J.F., Esteban M. Structural and functional characterization of a cell surface binding protein of vaccinia virus // J. Biol. Chem. 1990. —V. 265. -N3.-P. 1569-1577.

128. Mackett M. Restriction endonuclease of orthopoxvirus DNA : Ph.D. Thesis. -Univ. of London., 1981. 211 pp.

129. Marchal J. Infectious ectromelia. A hitherto undescribed virus disease of mice // J. Path. Bacterid. 1930. - V. 33. - P. 713 - 728.

130. Marennikova S.S., Maltseva N.N., Korneeva V.I., Garanina N. Outbreak of pox disease among carnivora (felidae) and edentata // J. Infect. Dis. -1977. V. 135. -P. 358-366.

131. Marennikova S.S., Ladnyj I.D., Ogorodinikova Z.I., Sheliikhina E.M., Maltseva N.N. Identification and study of a poxvirus isolated from wild rodents in Turkmenia // Arch Virol. 1978a. - V. 56. - N 1 -2. - P. 7 - 14.

132. Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Fimina V.A. Pox infection in white rats // Lab Anim.- 1978b.-V. 12.-N 1.-P. 33-36.

133. Martin K.H., Grosenbach D.W., Franke C.A., Hruby D.E. Identification and analysis of three myristylated vaccinia virus late proteins // J. Virol. — 1997. -V. 71.-N7. P. 5218-5226.

134. Massung R.F., Knight J.C., Esposito J.J. Topography of variola smallpox virus inverted terminal repeats // Virology. 1995. - V. 211. - N 1. - P. 350 - 355.

135. Maxam A., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages // Methods Enzymol. 1980. - V 65.- P. 499 - 560.

136. McDonald W.F., Klemperer N., Traktman P. Characterization of a processive form of the vaccinia virus DNA polymerase // Virology. 1997. — V. 234. - N 1. -P. 168- 175.

137. McGeoch DJ. Protein sequence comparisons show that 'pseudoproteases' encoded by the poxviruses and certain retroviruses belong to the deoxyuridine triphosphatase family // Nucl. Acids Res. 1990. - V. 18. - P. 4105 - 4110.

138. Mcintosh A.A., Smith G.L. Vaccinia virus glycoprotein A34R is required for infectivity of extracellular enveloped virus // J. Virol. 1996. - V. 70. -N l.-P. 272-281.

139. Meis R.J., Condit R.C. Genetic and molecular biological characterization of vaccinia virus gene which renders the virus dependent on isatin-b-thiasemicarbazone (IBT) // Virology. 1991. - V. 182. - N 2. - P. 442 - 454.

140. Merchlinsky M., Moss B. Nucleotide sequence required for resolution of the concatemer junction of vaccinia virus DNA // J. Virol. — 1989. — V. 63. N 10. — P. 4354-4361.

141. Meyer H., Rziha H.-J. Characterization of the gene encoding the A-type inclusion protein of camelpox virus and sequence comparison with other orthopoxviruses // J. Gen. Virol. 1999. - V. 74. - P. 1679 - 1684.

142. Meyer H., Pfeffer M., Rziha H.-J. Sequence alteration within and downstream of the A-type inclusion protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. -N 8. - P. 1975 -1981.

143. Meyer H., Neubauer H., Pfeffer M. Amplification of 'variola virus-specific* sequences in German cowpox virus isolates. . Feb; ():. // J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. 2002. - V. 49. - N 1. - P. 17 - 19.

144. Miller C.G., Shchelkunov S.N., Kotwal G.J. The cowpox virus-encoded homolog of the vaccinia virus complement control protein is an inflammation modulatoiy protein//Virology. 1997.-V. 229.-N l.-P. 126-133.

145. Mohandas A.R., Dales S. Involvement of spicules in the formation of vaccinia virus envelopes elucidated by a conditional lethal mutant // Virology. 1995. — V. 214.-N2.-P. 494-502.

146. Moolenaar W.H., Kranenburg O., Postma F.R., Zondag G.C. Lysophosphatidic acid: G-protein signalling and cellular responses // Curr. Opin. Cell Biol. -1997. -V9.-N2.-P. 168- 173.

147. Moore J.B., Smith G.L. Steroid hormone synthesis by a vaccinia enzyme: a new type of virus virulence factor // EMBO J. 1992. - V. 11. - N 5. - P. 1973 -1980.

148. Morgan J.R., Roberts B.E. Organization of RNA transcripts from a vaccinia virus early gene cluster // J. Virol. 1984. - V. 51. - N 2. - P. 283 - 297.

149. Morgan J.R., Cohen L.K., Roberts B.E. Identification of the DNA sequence encoding the large subunit of the mRNA-capping enzyme of vaccinia virus // J. Virol. 1984. - V. 52. - N 1. - P. 206 - 214.

150. Mossman K., Upton C., Buller R.M.L., McFadden G. Species specificity of ectromelia virus and vaccinia virus interferon-g binding proteins // Virology.1995. V. 208. - N 2. - P. 762 - 769.

151. Moyer R.W., Graves R.L. IV. The late white pock (ц) host range (hr) mutants of rabbit poxvirus are blocked in morphogenesis // Virology. 1982. - V. 119. - N 2. -P. 332-346.

152. Moyer R.W., Graves R.L., Rothe C.T. The white pock (mu) mutants of rabbit poxvirus III. Terminal DNA sequence duplication and transposition in rabbit poxvirus // Cell. 1980b. - V. 22. - N 2. - P. 545 - 553.

153. Najarro P., Traktman P., Lewis J.A. Vaccinia virus blocks gamma interferon signal transduction: viral VH1 phosphatase reverses Statl activation // J. Virol. -2001.-V. 75.-N 7.-P. 3185-3196.

154. Nakano E., Panicali D., Paoletti E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue // Proc. Natl. Acad.Sci. USA.- 1982. V. 79. -N5.-P. 1593- 1596.

155. Ng A., Tscharke D.C., Reading P.C., Smith G.L. The vaccinia virus A41L protein is a soluble 30 kDa glycoprotein that affects virus virulence // J. Gen. Virol. -2001.-V. 82. -N 9. P. 2095-2105.

156. Niles E.G., Seto J. Vaccinia virus gene D8 encodes a virion transmembrane protein //J. Virol. 1988. - V. 62. - N 10. - P. 3772 - 3778.

157. Niles E.G., Lee-Chen G.-J., Shuman S., Moss В., Broyles S.S. Vaccinia virus gene D12L encodes the small subunit of the viral mRNA capping enzyme // Virology. — 1989.-V. 172.-N2.-P. 513-522.

158. Palumbo G.J., Pickup D.J., Fredrickson T.N., Mclntyre L.J., Buller R.M.L. Inhibition of an inflammatory response is mediated by a 38-kDa protein of cowpox virus//Virology. 1989.-V. 172.-N 1.-P. 262-273.

159. Palumbo G.J., Glasgow W.C., Buller R.M.L. Poxvirus-induced alteration of arachidonate metabolism // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V.90 . - N 5. -P. 2020 - 2024.

160. Palumbo G.J., Buller R.M., Glasgow W.C. Multigenic evasion of inflammation by poxviruses // J. Virol. 1994. - V. 68. - N. - P. 1737 - 1749.

161. Panicali D., Paoletti E. Construction of poxviruses as cloning vectors: Insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex into the DNA of infectious vaccinia virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - N 16. - P. 4927 -4931.

162. Panus J.F., Smith C.A., Ray C.A., Smith T.D., Patel D.D., Pickup D.J. Cowpox virus encodes a fifth member of the tumor necrosis factor receptor family: a soluble, secreted CD30 homologue // Proc Natl Acad Sci USA.- 2002. V. 99. -N12.-P. 8348-8353.

163. Parkinson J.E., Smith G.L. Vaccinia virus gene A36R encodes a Mr 43-50K protein on the surface of extracellular enveloped virus // Virology. 1994. - V. 204.-N l.-P. 376-390.

164. Parkinson J.E., Sanderson C.M., Smith G.L. The vaccinia virus A38L gene product is a 33-kDa integral membrane glycoprotein // Virology. -1995. V. 214. -Nl.-P. 177-188.

165. Patel A.H., Gaffney D.F., Subak-Sharpe J.H., Stow N.D. DNA sequence of the gene encoding a major secreted protein of vaccinia virus, strain Lister // J. Gen. Virol. 1990 . - V. 71. - N 9. -P. 2013 - 2021.

166. Patel D.D, Pickup DJ, Joklik W.K. Isolation of cowpox virus A-type inclusions and characterization of their major protein component. // Virology. 1986. - V. 149.-N2.-P. 174-189.

167. Payne L.G. Characterization of vaccinia virus glycoproteins by monoclonal antibody preparations // Virology. 1992. - V. 187. -N 1. - P. 251 - 260.

168. Pearson W.R., Lipman D.J. Improved tools for biological sequence comparison // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1988. V. 85. - N 8. - P. 2444 - 2448.

169. Perkus M.E., Goebel S.J., Davis S.W., Johnson G.P., Limbach K., Norton E.K., Paoletti E. Vaccinia virus host range genes // Virology. 1990. - V. 179. - N 1. -P. 276-286.

170. Perkus M.E., Goebel S.J., Davis S.W., Johnson G.P., Norton E.K., Paoletti E. eletion of 55 open reading frames from the termini of vaccinia virus // Virology. -1991.-V. 180.-N l.-P. 406-410.

171. Pickup D.J., Ink B.S., Parsons B.L., Hu W., Joklik W.K. Spontaneous deletions and duplications of sequences in the genome of cowpox virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1984. V. 81.-P. 6817-6821.

172. Prabhakaran K., Harris E.B., Randhawa B. Properties of lysophospholipase in Mycobacterium leprae // J. Basic Microbiol. 1996. - V. 36. - N5 . - P. 341 -349.

173. Rajagopal I., Ahn B.Y., Moss В., Mathews C.K. Roles of vaccinia virus ribonucleotide reductase and glutaredoxin in DNA precursor biosynthesis // J. Biol Chem. 1995. - V. 270. - N 46. - P. 27415-27418.

174. Reith R.A., Williamson J.D. Pathogenesis of vaccinia and cowpox infections // XI Poxvirus and Iridovirus Meeting. May 4-9 1996. Toledo, Spain. - P. 98.

175. Rempel R.E., Traktman P. Vaccinia virus B1 kinase: phenotypic analysis of temperature-sensitive mutants and enzymatic characterization of recombinant proteins // J. Virol. 1992. - V. 66. - N 7. - P. 4413 - 4426.

176. Resenchuk S.M., Blinov V.M. ALIGNMENT SERVICE: creation and processing Д of alignments of sequences of unlimited length. // Comput. Appl. Biosci. 1995.1. V. 11.-N 1.-P.7-11.

177. Rivas C., Gil J., Melkova Z., Esteban M., Diaz-Guerra M. Vaccinia virus E3L protein is an inhibitor of the interferon (i.f.n.)-induced 2-5A synthetase enzyme // Virology. -1998. V. 243. - N 2. - P. 406-414.

178. Robinson D.N., Cooley L. Drosophila kelch is an oligomeric ring canal actin organize // J. Cell Biol. 1997. - V. 138. - P. 799 - 810.

179. Rochester S.C., Traktman P. Characterization of the single-stranded DNA binding protein encoded by the vaccinia virus 13 gene // J. Virol. 1998. - V. 72. - N 4. -P. 2917-2926.

180. Rodriguez D., Esteban M., Rodriguez J.R. Vaccinia virus A17L gene product is essential for an early step in virion morphogenesis // J. Virol. 1995. - V. 69. -N 8.-P. 4640-4648.

181. Rodriguez J.F., Esteban M. Mapping and nucleotide sequence of the vaccinia virus gene that encodes a 14-kilodalton fusion protein // J. Virol. 1987. - V.61 . -N 11.-P. 3550-3554.

182. Rodriguez J.F., Kahn J.S., Esteban M. Molecular cloning, encoding sequence, and expression of vaccinia virus nucleic acid-dependent nucleoside triphosphatase gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83. - P. 9566 - 9570.

183. Rollins B.J. Chemokines // Blood. 1997. - V. 90. -P. 909 - 928.

184. Roper R.L., Moss B. Envelope formation is blocked by mutation of a sequence related to the HKD phospholipid metabolism motif in the vaccinia virus F13L protein // J. Virol. 1999. - V. 73. -N 2. - P. 1108 - 1117.

185. Roper R.L., Payne L.G., Moss B. Extracellular vaccinia virus envelope glycoprotein encoded by the A33R gene // J. Virol. 1996. -V. 70. - N 6. - P. 3753-3762.

186. Roper R.L., Wolffe E.J., Weisberg A., Moss B. The envelope protein encoded bythe A33R gene is required for, formation of actin-containing microvilli and efficient cell-to-cell spread of vaccinia virus // J. Virol. -1998. V 72. - N 5. - P. 4192-4204.

187. Rosales R., Sutter G., Moss B. A cellular factor is required for transcription of vaccinia viral intermediate-stage genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91.-N9.-P. 3794-3798.§

188. Rosel J.L., Moss B. Transcriptional and translational mapping and nucleotide sequence analysis of a vaccinia virus gene encoding the precursor of the major core polypeptide 4b // J. Virol. 1985. - V. 56. - N 3. - P. 830 - 838.

189. Ruby J., Senkevich Т., Buller M., Cuff S. A poxvirus protein inhibits apoptosis mediated by CD40 and the p75 TNF receptor. // XI Poxvirus and Iridovirus Meeting. Toledo, Spain. May 4-9 1996. Toledo, Spain. - P. 208.

190. Ryazankina O.I., Muravlev A.I., Gutorov V.V., Mikrjukov N.N., Cheshenko I.O., Shchelkunov, S.N. Comparative analysis of the conserved region of the orthopoxvirus genome encoding the 36K and 12K proteins // Virus Res. 1993. -V. 29. -N 3. -P. 281 -303.

191. Sanderson C.M., Hollinshead M., Smith G.L. The vaccinia virus A27L protein is needed for the microtubule-dependent transport of intracellular mature virus particles // J. Gen. Virol. 2000. - V. 81. - N 1. - P. 47 - 58.

192. Sanderson C.M., Parkinson J.E., Hollinshead M., Smith G.L. Overexpression of the vaccinia virus A38L integral membrane protein promotes Ca2+ influx into infected cells // J. Virol. 1996. - V. 70. - N 2. - P. 905 - 914.

193. Sanz P., Moss B. dentification of a transcription factor, encoded by two vaccinia virus early genes, that regulates the intermediate stage of viral gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - N 6. - P. 2692 - 2697.

194. Sarov I., Joklik W.K. Studies on the nature and location of the capsid polypeptides of vaccinia virions // Virology. 1972. - V. 50. - N 2. - P. 579 - 592.

195. Saraiva M, Alcami A. CrmE, A novel soluble tumor necrosis factor receptor encoded by poxviruses // J. Virol. 2001. - V.75. - N 1. - P. 226-233.

196. Schmitt J.F.C., Stunnenberg H.G. Sequence and transcriptional analysis of the vaccinia virus Hindlll I fragment J. Virol. 1988. - V. 62. - N 6. - P. 1889 -1897.

197. Schwarz D.A., Katayama C.D., Hedrick S.M. Schlafen, a new family of growth regulatory genes that affect thymocyte development // Immunity. 1998. - V. 9. -ft N5.-P. 657-668.

198. Seki M., Oie M., Ichihashi Y., Shida H. Hemadsorption and fusion inhibition activities of hemagglutinin analyzed by vaccinia virus mutants // Virology. -1990.-V. 175.-N2.-P. 372-384.

199. Senkevich T.G., Koonin E.V., Buller R.M.L. A poxvirus protein with a RING zinc finger motif is of crucial importance for virulence // Virology. 1994. — V. 198. -N 1.-P. 118-128.

200. Senkevich T.G., Weisberg A.S., Moss B. Vaccinia virus E10R protein is associated with the membranes of intracellular mature virions and has a role in morphogenesis // Virology. 2000. -V. 278. - N 1. -P. 244 - 252.

201. Seregin S.V., Babkina I.N., Nesterov A.E., Sinyakov A.N., Shchelkunov S.N. Comparative studies of gamma-interferon receptor-like proteins of variola major and variola minor viruses//FEBS Lett. 1996.-V.382.-N 1-2.-P. 79-83.

202. Shchelkunov S.N. Functional organization of variola major and vaccinia virus genomes // Virus Genes. 1995. - V. 10. - N 1. - P. 53 - 71.

203. Shchelkunov S.N., Blinov V.M., Sandakhchiev L.S. Genes of variola and vaccinia viruses necessary to overcome the host protective mechanisms // FEBS Lett. — 1993a.-V. 319.-N 1-2.-P. 80-83.

204. Shchelkunov S.N., Blinov V.M., Sandakhchiev L.S. Ankyrin-like proteins of variola and vaccinia viruses // FEBS Lett. 1993b. - V. 319. - N 1-2. - P. 163 -165.

205. Shchelkunov S.N., Blinov V.M., Resenchuk S.M., Totmenin A.V., Sandakhchiev L.S. Analysis of the nucleotide sequence of 43 kbp segment of the genome of variola virus India-1967 strain // Virus Res. 1993c. - V. 30. - N 3. - P. 239 -258.

206. Shchelkunov S.N., Blinov V.M., Totmenin A.V., Marennikova S.S., Kolykhalov A.A., Frolov I.V., Chizhikov V.E., Gytorov V.V., Gashnikov P.V., Belanov E.F., Belavin P.A., Resenchuk S.M., Andzhaparidze O.G., Sandakhchiev L.S.

207. Nucleotide sequence analysis of variola virus Hindlll M, L, I genome fragments // Virus Res. 1993e. - V. 27. - N 1. - P. 25 - 35.

208. Shchelkunov S.N., Resenchuk S.M., Totmenin A.V., Blinov V.M., Marennikova S.S., Sandakhchiev L.S. Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses // FEBS Lett. 1993f. - V. 327. -N 3. - P. 321 - 324.

209. Shchelkunov S.N., Ryazankina O.I., Gashnikov, P.V. Gene of the late nonstructural vaccinia virus 36K protein is essential for virus reproduction // Virus Res. 1993g. - V.28. -N 3. - P. 273 - 283.

210. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Sandakhchiev L.S. Analysis of the nucleotide sequence of 23.8 kbp from the left terminus of the genome of variola major virus strain India-1967//Virus Res. 1996.-V. 40.-N2.-P. 169- 183.

211. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Loparev V.N., Safronov P.F., Gutorov V.V., Chizhikov V.E., Knight J.C., Parsons J.M., Massung R.F., Esposito J.J. Alastrimsmallpox variola minor virus genome DNA sequences 11 Virology. 2000. - V. 266.-N 2.-P. 361 -386.

212. Shchelkunov S., Totmenin A., Kolosova I. Species-specific differences in organization of orthopoxvirus kelch-like proteins // Virus Genes. 2002a. - V.24. -N2.-P. 157-162.

213. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Safronov P.F., Mikheev M.V., Gutorov V.V., ф Ryazankina O.I., Petrov N.A., Babkin I.V., Uvarova E.A., Sandakhchiev L.S.,

214. Sisler J.R., Esposito J.J., Damon I.K., Jahrling P.B., Moss B. Analysis of the monkeypox virus genome 11 Virology. 2002b. - V. 297. - N 2. - P. 172 - 194. 261.Shida H. (1986) Nucleotide sequence of the vaccinia virus hemagglutinin gene //

215. Virology.- 1986.-V. 150.-N2.-P. 51 -462. 262.Shida H., Tanabe K., Matsumoto S. Mechanism of virus occlusion into A-type inclusion during poxvirus infection // Virology. 1977. - V.26.- N 1. — P. 217233.

216. Shuman S., Moss B. Identification of a vaccinia virus gene encoding a type I DNA topoisomerase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84. - N 21. P. 7478 -7482.

217. Simpson D.A., Condit R.C. The vaccinia virus A18R protein plays a role in viral transcription during both the early and the late phases of infection // J. Virol. -1994.-V. 68.-N6.-P. 3642-3649.

218. Slabaugh M.B., Roseman N., Davis R., Matthews C. Vaccinia virus encoded ribonucleotide reductase: Sequence conservation of the gene for the small subunit and its amplification in hydroxyurea-resistant mutants // J. Virol. 1988. - V. 62. -P. 519-27.

219. Smith G.L., Chan Y.S. Two vaccinia virus proteins structurally related to the interleukin-1 receptor and the immunoglobulin superfamily // J. Gen. Virol. -1991.-V. 72.-N3.-P.511 -518.

220. Smith G.L., de Carlos A., Chan Y.S. Vaccinia virus encodes a thymidylate kinase gene: Sequence and transcriptional mapping //Nucl. Acids Res. 1989a . - V. 17. -N 19.-P. 7581-7590.

221. Smith G.L., Chan Y.S., Kerr S.M. Transcriptional mapping and nucleotide sequence of a vaccinia virus gene encoding a polypeptide with extensive homology to DNA ligases // Nucl. Acids Res. 1989b. - V. 17. - N 22. - P. 9051- 9062.

222. Smith G.L., Howard S.T., Chan, Y.S. Vaccinia virus encodes a family of genes with homology to serine proteinase inhibitors // J. Gen. Virol. 1989c. - V. 70. -N9.-P. 2333-343.

223. Smith G.L., Chan Y.S., Howard S.T. Nucleotide sequence of 42 kbp of vaccinia viris strain WR from near the right inverted terminal repeat // J. Gen. Virol. -1991.-V. 72.-N 6. P. 1349- 1376.

224. Spehner D., Gillard S., Drillien R., Kirn, A. A cowpox virus gene required for multiplication in Chinese hamster ovary cells // J. Virol. 1988. - V. 62. — N 4. -P. 1297- 1304.

225. Spriggs M.K., Hruby D.E., Maliszewski C.R., Pickup D.J., Sims J.E., Buller R.M.L., VanSlyke J. Vaccinia and cowpox viruses encode a novel secreted interleukin-1-binding protein // Cell. 1992. - V 71. -N 1. - P. 145 - 152.

226. Stuart D.T., Upton C., Higman M.A., Niles E.G., McFadden G. A poxvirus-encoded uracil DNA glycosylase is essential for virus viability // J. Virol. — 1993.- V. 67. N 5. - P. 2503 - 2512.

227. Symons J.A., Alcami A., Smith G.L. Vaccinia virus encodes a soluble type I interferon receptor of novel structure and broad species specificity // Cell. 1995. - V. 81.-N4.-P. 551 -560.

228. Takahashi Т., Oie M., Ichihashi Y. N-terminal amino acid sequences of vaccinia virus structural proteins // Virology. 1994. - V. 202. - N 2. - P. 844 - 852.

229. Tengelsen L.A., Slabaugh M.B., Bibler J.K., Hruby D.E. Nucleotide sequence and molecular genetic analysis of the large subunit of ribonucleotide reductase encoded by vaccinia virus // Virology. 1988. - V. 164. - N 1. - P. 121 - 131.

230. Tracey K.J., Cerami A. Tumor necrosis factor: a pleiotropic cytokine and therapuetic target// Annu. Rev. Med. 1994. - V. 45. - P. 491 - 503.

231. Traktman P., Caligiuri A., Jesty S.A., Liu K., Sankar U. Temperature-sensitive mutants with lesions in the vaccinia virus F10 kinase undergo arrest at the earliest stage of virion morphogenesis // J. Virol. 1995. - V. 69. - N 10. - P. 6581 -6587.

232. Turner P.C., Musy P.Y., Moyer R.W. Poxvirus serpins. // Viroceptors, Virokines and Related Immune Modulators Ecoded by DNA Viruses / McFadden G. Ed. -R.G. Landes Company, Austin, 1995. P. 67 - 88.

233. Turner P.C., Baquero M.T., Yuan S., Thoennes S.R., Moyer R.W. The cowpox virus serpin SPI-3 complexes with and inhibits urokinase-type and tissue-type plasminogen activators and plasmin // Virology. 2000. - V. 272. - N 2. - P. 267 -280.чЬ

234. Ueda Y., Morikawa S., Matsuura Y. Identification and nucleotide sequence of the gene encoding a surface antigen induced by vaccinia virus // Virology. 1990. -V. 177.-N2.-P. 588-594.

235. Ulaeto D., Grosenbach D., Hruby D.E. The vaccinia virus 4c and A-type inclusion proteins are specific markers for the intracellular mature virus particle // J. Virol. -1996. V. 70. - N 6. -P. 3372 - 3377.

236. Upton C., Macen J.L., Schreiber M., McFadden G. Myxoma virus expresses secreted protein with homology to the tumor necrosis factor receptor gene family that contributes to viral virulence // Virology. 1991. - V. 184.- P. 370 - 382.

237. Upton C., Mossman K., McFadden G. Encoding of a homolog of IFN-g receptor by myxoma virus // Science. 1992. - V. 258. - P. 1369 - 1372.

238. Upton C., Stuart D., McFadden G. Identification of a poxvirus gene encoding a uracil DNA glycosylase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 4518 -4522.

239. Van Meir E., Wittek R. Fine structure of the vaccinia virus gene encoding the precursor of the major core protein 4a // Arch. Virol. 1988. - V. 102. — N 1-2. — P. 19-27.

240. Varich N.L., Sychova I.V., Kaverin N.V., Antonova T.P., Chernos V.T. Transcription of both DNA strands of vaccinia virus genome in vivo // Virology. -1979. V. 96. - N 2. - P. 412 - 430.

241. Venkatesan S. Gershowitz A., Moss B. Complete nucleotide sequences of two agjacent early vaccinia virus genes located within the inverted terminal repetition // J. Virol. 1982. - V. 44. - N 2. - P. 637 - 646.

242. Wang S., Shuman S. Vaccinia virus morphogenesis is blocked by temperature-sensitive mutations in the F10 gene, which encodes protein kinase 2 // J. Virol. -1995.-V. 69.-N 10.-P. 6376-6388.

243. Wang S., Shuman S. A temperature-sensitive mutation of the vaccinia virus Ell gene encoding a 15-kDa virion component // Virology. 1996. - V. 216. - N 1. -P. 252-257.

244. Watson J.C., Chang H.-W., Jacobs B. Characterization of a vaccinia virus-encoded double-stranded RNA-binding protein that may be involved in inhibition of the double-stranded RNA-dependent protein kinase // Virology. 1991. — V. 185. - N l.-P. 206-216.

245. Weinrich S.L., Hruby D.E. A tandemly-oriented late gene cluster within the vaccinia virus genome // Nucl. Acids Res. 1986. -V. 14. - N 7. - P. 3003 -3016.

246. Weir J.P., Moss B. Nucleotide sequence of the vaccinia virus thymidine kinase gene and the nature of spontaneous frameshift mutations // J. Virol. 1983. - V. 446.-N2.-P. 530-537.

247. Whayeb S.A., Yamamoto K., Castillo M.E., Tojo H., Honda T. Lysophospholipase L2 of Vibrio cholerae Ol affects cholera toxin production. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - V. 15. -N 1. - P. 9 - 15.

248. Whitaker-Dowling P., Younger J.S. Characterization of a specific kinase inhibitory factor produced by vaccinia virus which inhibits the interferon-induced protein kinase//Virology. 1984.-V. 137. -N 1. - P. 171 - 181.

249. White C.L., Weisberg A.S., Moss B. A glutaredoxin, encoded by the G4L gene of vaccinia virus, is essential for virion morphogenesis // J Virol. 2000. - V. 74. -N 19.-P. 9175-9183.

250. Whitehead S.S., Hruby D.E. A transcriptionally controlled trans-processing assay: putative identification of a vaccinia virus-encoded proteinase which cleaves precursor protein P25K // J. Virol. 1994. - V. 68. - N 11. - P. 7603 - 7608.

251. Williams G.T., Smith C.A. Molecular regulation of apoptosis: genetic controls on cell death // Cell. 1993. - V. 74. - P. 777 - 779.

252. Williams O., WolfFe E.J., Weisberg A.S., Merchlinsky M. Vaccinia virus WR gene A5L is required for morphogenesis of mature virions // J. Virol. 1999. - V. 73.-N6.-P. 4590-4599.

253. Wolffe E.J., Weisberg A.S., Moss B. Role for the vaccinia virus A36R outer envelope protein in the formation of virus-tipped actin-containing microvilli and cell-to-cell virus spread // Virology. 1988. - V. 244. - N 1. - P. 20 - 26.

254. Wolffe E.J., Isaacs S.N., Moss B. Deletion of the vaccinia virus B5R gene encoding a 42 kilodalton membrane glycoprotein inhibits extracellular virus envelope formation and dissemination // J. Virol. 1993. - V. 67. - N 8. - P. 4732 -4741.

255. Wolffe E.J., Moore D.M., Peters P.J., Moss B. Vaccinia virus A17L open reading frame encodes an essential component of nascent viral membranes that is required to initiate morphogenesis // J. Virol. 1996. - V. 70. - N 5. - P. 2797 - 2808.

256. Wolffe E.J., Katz E., Weisberg A., Moss B. The A34R glycoprotein gene is required for induction of specialized actin-containing microvilli and efficient cellto-cell transmission of vaccinia virus // J. Virol. 1997. - V. 71. - N 5. - P. 3904 -3915.

257. Xiang Y., Simpson D.A., Spiegel J., Zhou A., Silverman R.H., Condit R.C. The vaccinia virus A18R DNA helicase is a postreplicative negative transcription elongation factor// J. Virol. 1998. - V. 72. -N 9. - P. 7012 - 7023.

258. Xu Q., Reed J.C. Bax inhibitor-1, a mammalian apoptosis suppressor identified by functional screening in yeast // Mol. Cell. 1998. - V. 1. - N 3. - P. 337 - 346.

259. Xu X., Nash P., McFadden G. Myxoma virus expresses a TNF receptor homolog with two distinct functions // Virus Genes. 2000. - V. 21. - N 1 -2. - P. 97 - 109.

260. Xue F., Cooley L. kelch Encodes a component of intercellular bridges in Drosophila egg chambers // Cell. 1993. - V. 72. - P. 681 - 693.

261. Yang W.-P., Kao S.-Y., Bauer W.R. Biosynthesis and post-translational cleavage of vaccinia virus structural protein // Virology. 1988. - V. 167. - N 2. - P. 585 -590.

262. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors // Gene. — 1985.-V. 33.-N l.-P. 103-109.

263. Zajac P., Spehner D., Drillien R. The vaccinia virus J5L open reading frame encodes a polypeptide expressed late during infection and required for viral multiplication // Virus Res. 1995. - V. 37. - N 2. - P. 163 - 173.

264. Zhang Y., Moss B. Immature viral envelope formation is interrupted same stage by lac operator-mediated repression of the vaccinia virus D13L gene and by the drug rifampicin // Virology. 1992. - V. 187. - N 2. - P. 643 - 653.

265. Zhang Y., Ahn B.Y., Moss B. Targeting of a multicomponent transcription apparatus into assembling vaccinia virus particles requires RAP94, an RNA polymerase-associated protein // J. Virol. 1994. - V. 68. - N 3. - P. 1360 -1370.

266. Zhang W.H., Wilcock D., Smith G.L. Vaccinia virus F12L protein is required for actin tail formation, normal plaque size, and virulence // J. Virol. 2000. - V. 74. -N24.-P. 11654-11662.

Информация о работе

Сафронов, Павел Федорович
кандидата биологических наук
Кольцово, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Секвенирование и анализ организации генома вируса оспы коров штамм GRI-90 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы