Секвенирование и анализ генома вируса оспы обезьян

Уварова, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Секвенирование и анализ генома вируса оспы обезьян
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Секвенирование и анализ генома вируса оспы обезьян"

На правах рукописи

Уварова Елена Александровна

(

СЕКВЕНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ГЕНОМА ВИРУСА ОСПЫ ОБЕЗЬЯН

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Щелкунов С.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мертвецов Н.П. кандидат биологических наук Кочнева Г.В.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт биохимии СО РАМН, г-Новосибирск

Защита состоится 12 ноября 2004 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗСР РФ по адресу: ГНЦ ВБ "Вектор", Кольцово Новосибирской области, 630559 (тел. 3832-36-74-28).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан 11 октября 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

2005-4 12622

/63 9 £2.

Памяти Рязанкиной О.И. и Петрова H.A. посвящается

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Оспа обезьян - зоонозная инфекция, циркулирующая в тропических лесах Центральной и Западной Африки. Причиной заболевания является вирус из рода Orthopoxvirus — вирус оспы обезьян (ВОО), который поражает широкий круг млекопитающих и является патогенным для человека.

Заболевание оспой обезьян для людей нередко оканчивается летальным исходом (до 15%). Клинические проявления оспы обезьян у людей сходны с таковыми для натуральной оспы и на протяжении последних тридцати- лет неоднократно ставился вопрос об опасности адаптации ВОО к человеческому организму и переходу ВОО в ВНО-подобный вариант. Оспа обезьян с гораздо меньшей эффективностью передается от человека к человеку, чем натуральная оспа. В отличае от ВНО вирус оспы обезьян способен поражать широкий круг животных разных видов.

Вследствие прекращения после 1980 г. вакцинации людей против натуральной оспы за последние годы сформировалась большая прослойка людей, не защищенных от ортопоксвирусов, что обеспечивает возможность распространения в человеческих популяциях зоонозных ортопоксвирусов, таких, например, как ВОО. Таким образом, вирус оспы обезьян в настоящее время представляет реальную угрозу жизни и здоровью людей.

В связи со всем вышесказанным важно было выявить отличия и сходства в организации геномов ВОО и ВНО, оценить возможность эволюционного преобразования ВОО. Наиболее прямым и информативным подходом для решения подобных задач является расшифровка нуклеотидной последовательности генома вируса и сравнение его с геномами близкородственных вирусов.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования было изучение организации генома ВОО.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Получение библиотек рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты генома BOO штаммов ZAI-96-I-16 и Congo-8,

2. Секвенирование полной последовательности генома штамма ZAI-96-I-16 и концевых вариабельных участков генома штамма Congo-8;

3. Построение трансляционных карт генома BOO;

4. Сравнение организации вариабельных участков генома двух штаммов BOO;

5. Сравнение организации генома ВСЮ и других патогенных для человека ортопоксвирусов, таких как вирусы натуральной оспы, оспы коров и осповакцины.

Научная новизна и практическая значимость работы. Получены представительные библиотеки рекомбинантных плазмид, несущих фрагменты генома BOO-ZAI-96-I-16 и BOO-Congo-8. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность ДНК генома штамма BOO-ZAI-96-1-16 и нуклеотидная последовательность ДНК вариабельных районов штамма BOO-Congo-8. Проведен сравнительный анализ гомологичных районов двух штаммов. Осуществлен подробный анализ организации генома BOO-ZAI-96-1-16 и его сравнение с геномами BHO-IND, ВОВ-СОР и BOK-GRI. Изучена структура гена, кодирующего вирусный комплементсвязывающий белок для пяти центральноафриканских штаммов BOO, двух западноафриканских и впервые показано, что BOO кодирует либо укороченную форму VCP (центральноафриканский подтип вируса), либо ген, кодирующий этот белок, делегирован (западноафриканский подтип BOO). Так же для ряда штаммов BOO изучена структура двух генов, кодирующих внутриклеточные факторы устойчивости ортопоксвирусов к действию интерферона, и впервые обнаружено, что у BOO видоспецифичным образом нарушены гены C3L и F3L, кодирующие внутриклеточные факторы устойчивости ортопоксвирусов к действию интерферона. На основании полученных данных и проведенного анализа сделан вывод о том, что BOO не является эволюционным предшественником ВНО и наоборот.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 5 статей в реферируемых изданиях. Результаты работы

представлены на международных конференциях: 12th International Poxvirus Symposium (St.Thomas, USA 1998), International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors (Smolenice, Slovakia 2000), 13th International Poxvirus and Iridoviras Symposium (Montpellier, France. 2000). 15th Internationa] Poxvirus and Iridoviras Conference (Oxford, UK. 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», «Заключение» и «Выводы». Работа изложна на 189 страницах, содержит 21 рисунок, 15 таблиц и два приложения. Библиография включает 315 литературных источника.

Вклад автора. Экспериментальные данные представленные в диссертации получены лично автором, а также в соавторстве с д.б.н. Петровым H.A., к.б.н. Рязанкиной О.И., к.б.н. Тотмениным A.B., к.б.н. Сафроновым П.Ф., Гуторовым В.В.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1. Создание клонотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты геномной ДНК штамма ZAI-96-I-16 вируса оспы обезьян

Штамм вируса оспы обезьян ZAI-96-I-16 был выделен от человека в ДРК (Демократической республике Конго - ранее Заир) во время вспышки заболевания в 1996 году сотрудниками CDC (Атланта, США). ДНК вируса была выделена в CDC и передана нам доктором Дж. Эспозито.

При гидролизе вирусной ДНК эндонуклеазой НтдШ образуется 20 фрагментов длиной от 0,2 т.п.н. до 44 т.п.н. Размеры крупных ЯшсЦП-А- (44 т.п.н.) и В-фрагментов (24 т.п.н.) слишком велик для того, чтобы они могли быть клонированы в составе плазмидного вектора. Концевые фрагменты генома (#¿ndIII-J - 5 т.п.н.) содержат на одном конце терминальную шпильку, и в силу этого их встройка в плазмиду напрямую также невозможна.

Гидролизованный эндонуклеазой рестрикции ШпдШ препарат вирусной ДНК лигировали с ДНК векторной плазмиды pMGC20, линеаризованной этой же эндонуклеазой, затем лигазной смесью

трансформировали компетентные клетки Е. coli (JM-109 или XL-blue). Клетки выращивали на селективной агаризованной среде и отбирали белые и светло-голубые колонии. Для отбора клонов, несущих плазмиды, содержащие фрагменты ДНК генома BOO, проводили гибридизацию на нитроцеллюлозных фильтрах с радиоактивно мечеными зондами. В качестве зондов использовали рекомбинантные плазмиды, содержащие в своем составе фрагменты генома вируса оспы коров штамма GRI-90 и вируса осповакцины штамма ЛИВП). Отобранные клоны подвергали ресгрикционному анализу. В результате этих экспериментов в составе рекомбинантных плазмид были получены HindRl С, D, Е, F, Н, I, L, М, Р, Q фрагменты. Однако ряд //mdIII-фрагментов на этом этапе не был клонирован: крупные HindЩ-А и ЯгисНП-В-фрагменты, #mdIII-G, HinülH-К, -R, -N-фрагменты с левого конца генома и концевые Я/ис1П1-.Г-фрагменты.

Концевая шпилька (рекомбинантная плазмида pMZHSK302) была получена в составе вектора pCR-Blunt с использованием нуклеазы S1. Сначала вирусную ДНК гидролизовали Him11П, затем обрабатывали нуклеазой S1 и «затупляли» одноцепочечные концы фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli. Векторную плазмиду pCR-Blunt линеаризовали эндонуклеазой рестрикции Peel. Затем проводили реакцию лигирования. Из клонов, получившихся в результате трансформации, отбирали белые колонии и гибридизовали на нитроцеллюлозных фильтрах с радиоактивным зондом на основе ЯгжИП-D фрагмента ВОК штамм GRI-90.

Большую часть последовательностей из Я/ж1Щ-А- и Я/теИП-В-фрагментов и последовательностей с левого конца субклонировали с использованием эндонуклеаз рестрикции ВатШ, Pstl и Xhol.

Для клонирования последовательности ЯгЫШ-О-фрагмента и большей части из Я»кШ1-А-фрагмента с помощью процедуры протяженного ПЦР нарабатывали три фрагмента LDPCR1, LDPCR2, LDPCR3.

Созданная библиотека фрагментов ДНК BOO штамма ZAI-96-I-16 (рис.1) представлена 26 рекомбинантными плазмидами, которые в сумме содержат 195500 п.н. из генома данного штамма. Геном BOO штамма ZAI-

pMZHB 2 pMZH23 PMZH1Q7 4 PMZH14 g , s dMZBX3 pMZBI PMZP23 pMZHSK

1 PMZH30 3 PMZH5 5 PMZH28 pMZB119 8 10 pMZHX7 11 12 pMZX3

pMZHSK302

J D PO С

SQI G ML H

KRN J

Рис. 1. Геномная библиотеки BOO штамм ZAI-96-I-16

Серые прямоугольники обозначают локализацию клонированных ДНК-фрагментов относительно Hindlll -рестриктазной карты генома BOO. Названия соответствующих рекомбинантных плазмид в верхнем ряду приведены над соответствующим прямоугольником, в нижнем ряду; цифрами обозначены следующие плазмиды: 1 - pMZH 10/2,2 - pMZH 42, 3 - pMZH 114, 4 - pMZH 106, 5 - pMZH 125, 6 - pMZB 34, 7 - pMZC 18, 9 - pMZC 8, 9 - pMZC 1, 10 - pMZB 95, 11-pMZB 5, 12-pMZP22.

96-1-16 практически полностью представлен в этой библиотеке, за исключением последовательности около 1,300 т.п.н. из #ш<Ш1-А фрагмента.

1.2. Создание клоиотеки рекомбииантяых плазмид, содержащих фрагменты геномной ДНК штамма Congo-8 вируса ослы обезьян.

Штамм BOO Congo-8 был выделен от человека в 1970 году в ДРК. ДНК этого штамма была выделена в CDC и предана нам доктором Дж Эспозито.

Штаммы ZAI-96-1-16 и Congo-8 происходят из одного географического региона и выделены с интервалом в 26 лет. Таким образом, представлялось интересным сравнение нуклеотидных последовательностей концевых вариабельных районов генома данных вирусов. Так как именно в этих районах располагаются сравнительно небольшие //шсИП-фрагменты, которые удобно клонировать в векторных плаз мидах, то для штамма Congo-8 создавали только НииНП-клонотеку рекомбинантных плазмид.

Препарат вирусной ДНК подвергали гидролизу #wdIII. ДНК литеровали с линеарезованной той же рестриктазой ДНК векторной плазмидой (pMGC20 или pZero-2.1), затем лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli штамма XL-blue. Плазмиды, содержащие в своем составе фрагменты генома BOO-CNG, обнаружили рестриктазным анализом при скрининге 300 плазмид. Сначала проводили гидролиз эндонуклеазой НтбШ и отбирали плазмиды, содержащие вставку нужной длины. Затем отобранные плазмиды расщепляли эндонуклеазой, которую выбирали с помощью компьютерного анализа структуры гомологичных фрагментов других ортопоксвирусов.

В результате описанных процедур не удалось получить рекомбинантные плазмиды, содержащие в своем составе самые длинные фрагменты - А- и ЯгясЦП-В (56,5 и 27,3 т.п.н. соответственно), J-фрагменты (6,3 т.п.н.), содержащие концевую шпильку, и Hindll\-G фрагмент (9 т.п.н.). Библиотека Congo-8 (рис 2) представлена 24 рекомбинантными плазмидами. В сумме они содержат 103,8 т.п.н. из генома BOO штамма Congo-8, и таким образом, в библиотеке представлена большая часть генома, в том числе вариабельные районы, за исключением концевых 12,6 т.п.н.

При анализе рекомбинантных плазмид для обоих штаммов были обнаружены плазмиды, содержащие небольшие фрагменты (0,28 т.п.н. и 0,7 т.п.н. соответственно), не описанные ранее. Эти фрагменты получили название #mdHI-R и #i'wdIII-S соответственно, их принадлежность геному ВСЮ была позднее доказана секвенированием.

13. Расшифровка нуклеотндиых последовательностей генома BOO

Секвестрование большинства клонированных в составе гибридных плазмид фрагментов BOO штаммов ZAI-96-I-16 (BOO-ZAI) и Congo-8 (ВОО-CNG) проводили с помощью метода химической модификации и деградации нуклеиновых кислот по Махсаму-Гилберту.

Небольшой фрагмент (1300 п.н.) из левой части HindlII-A фрагмента генома BOO штамма BOO-ZAI не удалось получить в составе ни одной гибридной плазмиды. Структуру ДНК этого фрагменты определили с помощью процедуры автоматического секвенирования на приборе ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer.

Используя полученную коллекцию гибридных плазмид пами в итоге была секвенирована непрерывная последовательность 196858 п.н., представляющая полный геном BOO-ZAI за исключением нескольких нуклеотидов, входящих в состав концевых шпилек, которые были потеряны при обработке ДНК нуклеазой S1. Последовательность ДНК BOO-ZAI была аннотирована и депонирована в GenBank под номером AF 380138.

Из правого и левого концов генома BOO штамм Congo-8 суммарно секвенировано 28659 п.н.: определены последовательности HindHI-D, Hindm-P, Hindin-O, Hindin-N и Hindlü-K - фрагментов.

1.4 Анализ организации генома вируса оспы обезьян

Одним из первых результатов анализа генома BOO стало уточнение его Яг/кПП-рестриктционной карты (рис. 3). Оказалось, что ffiwdHI-N фрагмент находится только в правой части генома, хотя ранее считалось,

рМИА

iШн

pZHD234 г

jZHF3* ' jZBFas '

f£HK2 уНЫЪ .

plltfi jBHTI jffiW

pHtM 5 pHKX

J D PO С F SQI G ML H E

KRH J

Рис. 2. Геномная библиотеки BOO штамм Congo-8.

Серые прямоугольники обозначают локализацию клонированных ДНК-фрагментов относительно ШпсШ -рестрикгазной карты генома BOO. Названия соответствующих рекомбинантных плазмид в верхнем ряду приведены над соответствующим прямоугольником, в нижнем ряду; цифрами обозначены следующие плазмиды: 1 -2 - 3 - 4 -, 5 -

что его копия есть также на левом конце генома. HindUI-N фрагмент BOO, по-видимому, появился на правом конце генома в результате транслокации с левого конца генома и ряда последующих делеций.

Секвенирование позволило уточнить местонахождение HindlU-S и ////KflII-R-фрагментов. Уточненная карта расположения //шс/Ш-сайтов на ДНК BOO-ZAI в сравнении с ранее построенной представлена на рис. 3.

GC состав секвенированной геномной ДНК BOO-ZAI равен 33,1%, что сопоставимо с 32,7% для вируса натуральной оспы штамма Индия (BHO-IND), 33,4% для вируса осповакцины штамм Копенгаген (ВОВ-СОР), 33,4% для BOK-GRI и 33,1% для ВЭ-MOS. Инвертированные терминальные повторы на ДНК BOO-ZAI имеют размер 6379 п.н.

С помощью компьютерного анализа в геноме BOO-ZAI идентифицировали 190 потенциальных открытых рамок трансляции (ОРТ), содержащих в своем составе не менее 60 аминокислотных остатков. Длина кодирующей последовательности ДНК BOO-ZAI имеет размер 195118 п.н. Она меньше, чем длина кодирующей последовательности BOK-GRI (220881 п.н.) и ВЭ-MOS (206612 п.н.), но больше, чем длина кодирующей последовательности ВОВ-СОР (183190 п.н.) и BHO-IND (184150 п.н.).

1.4.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома двух штаммов BOO

При анализе гомологичных последовательностей из левого (20591 п.н.) и правого (8162 п.н.) концевых районов геномов двух штаммов BOO-ZAI и BOO-CNG выявили, что их нуклеотидные последовательности идентичны на 99,83%. Обнаруженные мутационные события описаны в таблице 1.

Все делеции/вставки обнаружены в межгенных областях. Самая крупная из них - 20 п.н. - находится в HindiYi-D фрагменте. Из 18 замен

а)

JNDPOC FQIGMLHE А В KNJ

II 1 [ 1 1 1 1 1

С 1 1 1 1 1 )

JDPOC FSQIGMLHE A

1 III 1 II I 111 1 1

Рис. 3. HindIII-рестрикционная карта генома BOO.

а) ранее построенная (Esposito, Knight 1985); б) уточненная карта, полученная после клонирования и секвенирования фрагментов вирусной ДНК

В KRN J

нуклеотидов 11 обнаружены внутри ОРТ; три такие замены приводят к замене аминокислотного остатка. Замена дезоксигуанозина на дезоксиаденозин во втором положении триплета 90 в ОРТ D7L приводит к замене в полипептиде аланина на валин. Замена дезоксиаденозина на дезоксицитидин во втором положении триплета 21 в ОРТ D9L приводит к замене изолейцина на серин. Замена тимидина на дезоксицитидин в первом положении триплета 136 в ОРТ 02L приводит к замене аспарагина на аспартат. Рамки D7L и D9L кодируют анкирин-подобные белки, ОРТ 02L функционально не охарактеризована. Полученные данные указывают на низкую скорость накопления мутаций в геноме BOO.

Таблица 1. Сравнение гомологичных районов геномов штаммов BOO-CNG и BOO-ZAI.

tfwdm- фрагмент Длина фрагмента, п.н. Общее количество мутационных событий Замены Вставки/делеции Идентичность*

D 16834 (CNG) 16842 (ZAI) 16 10 6 99,66%

Р 1564 (CNG) 1563 (ZAI) 2 1 1 99,87%

О 2193 (CNG) 2193 (ZAI) 5 5 0 99,78%

К 5218 (CNG) 5219 (ZAD 3 2 1 99,85%

N 16834 (CNG) 16842 (ZAI) 0 0 0 100%

Суммарно 28659 (CNG) 28676 (ZAI) 26 18 8 99,83%

•Идентичность иуклеотидных последовательностей вычислена с использованием программы Alignment service v 4 3 (Resenchuk and Blmov, 1995)

1.4.2. Сравнительный анализ последовательностей из генома BOO с гомологичными последовательностями из геномов других ортопоксвирусов

Инвертированные терминальные повторы (TIR). Районы инвертированных терминальных повторов (TIR) BOO-ZAI составляют 6379 п.н. Последовательность одной цепи концевой шпильки определена полностью за исключением четырех нуклеотидов, которые были потеряны

при обработке вирусной ДНК нуклеазой S1. Последовательности NR1 (85 п.н.) и NR2 (322 п н.) разделены двумя блоками тандемных повторов длиной 70 п.н.

Консервативная часть генома BOO. Консервативная часть генома BOO ограничена ОРТ C10L-A25R и имеет размер 101466 п.н.. Идентичность этого района аналогичным районам других ортопоксвирусов составляет: 96,2% - относительно BHO-IND, 97,4% - относительно ВОВ-СОР, 97,6% -относительно BOK-GRI. Именно в этом районе располагаются все необходимые для жизнедеятельности вируса гены, кодирующие вирусные ферменты, отвечающие за биосинтез ДНК и РНК, а также большинство генов структурных белков. Идентичность аминокислотных последовательностей белков, кодируемых в этом районе, как правило, превышает 90 % для ортопоксвирусов, патогенных для человека. В то же время для нескольких ОРТ из центрального района генома наблюдаются видоспецифичные отличия.

Основные видоспецифичные отличия BOO от других ортопоксвирусов располагаются в вариабельных концевых районах. В геноме ZAI-96-I-16 не обнаружено уникальных генов, в то же время по сравнению с геномом BOK-GRI отсутствуют 25 ОРТ, а по сравнению с BHO-IND - 19 ОРТ. Для части отсутствующих ОРТ функция не известна, однако в геноме BOO не обнаружен ряд генов, отвечающих за круг хозяев, вовлеченных в пролиферацию клеток, отсутствуют также некоторые гены, кодирующие модуляторы защитных реакций организма на инфекцию.

Комплементсвязывающий белок различных штаммов BOO. Белок 35 кДа, секретируемый из инфицированных вирусом осповакцины клеток, имеет структурное сходство с семейством эукариотических белков, к которым, в частности, относится человеческий белок С4Ьр. Белок С4Ьр способен связывать С4Ь компонент комплемента и ингибировать классический путь активации комплемента. Показано, что этот вирусный белок, получивший название комплементсвязывающий белок ортопоксвирусов (VCP - vaccinia virus complement control protein), способен связываться с производными четвертого компонента комплемента и

ингибироваа. классический путь активации комплемеша. Комплементсвязьтаюший белок ортопоксвирусов содержит четыре коротких вырожденных повтора (SCR - short consensus repeat), характерных для семейства белков регуляторов активации комплемента (RCA). Длина каждого повтора - около 60 аминокислотных остатков.

Обнаружено, что VCP' 1) связывается с компонентами комплемента СЗЬ и С4Ь; 2) блокирует каскад комплемента на разных его этапах и ингибируст как классический, так и альтернативный пути комплемента; 3) блокирует активируемую противовирусными антителами нейтрализацию вируса системой комплемента; 4) связывается с гепарин-подобными молекулами, покрывающими поверхность эндотелиальных клеток, блокируя связывание хемокинов и тем самым предотвращая передачу сигнала хемотаксиса.

Мы обнаружили, что ОРТ D14L BOO-ZAI укорочена по сравнению с ОРТ других ортопоксвирусов. Этот результат оказался неожиданным, и для того, чтобы подтвердить полученные данные, мы исследовали последовательность i ена, кодирующего VCP у различных штаммов BOO.

Для изученных нами центральноафриканских штаммов BOO аминокислотные последовательности VCP оказались идентичными, хотя в полученных нуклеотидных последовательностях фрагментов ДНК выявлены единичные отличия в некодирующих районах. Учитывая то, что данные штаммы BOO выделены от больных людей в центральной Африке в разные годы (CNG-8 - 1970 г., CDC#77-666 - 1977 г., CDC#v79-I-005 - 1979 г., ZAI-96-Т-16 - 1996 г., CDC#v97-I-004 - 1977), можно сделать вывод о высокой консервативности и уникальности VCP BOO.

Последоваетльность VCP BOO с сравнивали гомологичными белками других ортопоксвирусов - последовательностью VCP штаммов BHO-IND, BHO-GAR, BOK-GRI, ВОВ-СОР и с последовательностью представителя RCA семейства - клеточного белка HU-C4BP Выравнивание аминокислотных последовательностей представлены на рис. 4. Вирусы натуральной оспы,

VXC-COP VAC-WR

npv-cdc var-ixd var-bsh VUt-CU cpv-gri CPV-BRI hu-c4bp

vac-cop

vac-яп

mpv-ою

var-ibd

var-bsh

VAR-GAR

CPV-GRI

cpv-bri

hu-c4bp

VAC-COP

VAC-WR

MPV-ОЮ

VAR-IH3

var-bsh

VAR-SAR

CPV-QRI

cpv-bri

hu-c4bp

vac-cop

VAC-MR

MPV-ОЮ

VAR-XND

var-bsh

var-gar

CPV-SRI

cpv-bri

hu-c4bp

4 4

4 , 4

qivxqph tlsngybssgfkr-----—sgsssst^spgh----tjkpblpüqvr*

.......IDE»---.......■••••--«......!••*

ISMQQi

.L. . . .l. . . . .l...

AA*

S.T...

ekhkq#>v.h.div.

H H к

—R. .

5 5 5 5 Hu-c4Bp sBmi^)iphaaiihth>m'HuuvTwi. rv|u|npii Ди i 'ттргрттуфзкшв----|tpyqs-B

6 ess

hu-c4bp ealcgp^klknoe (4) rksrpanhcvmgdegs^sgietsrfsai------gqgdgt----|sprtpsg

7 7 7 7 bu-c4bp gdi^ilfpkiabgbtkqssstsrncee-----flf^kgllvoojlkls--gsysh-----|sapafgg

8 в8в bu-c4bp kai^ofelvherlsvdkdqtvepen------|l|^jlg^jirvgpqsit—flsgurt----grpbvpk^:«

Рис. 4. Выравнивание аминокислотных последовательностей комплемент-связьгеающего белка для вируса вакцины штамма Копенгаген - ВОВ-СОР, штамма WR - BOB-WR, вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-169 - BOO-ZAI, вируса натуральной оспы штамма Индия - BHO-IND, штамма Бангладеш - BHO-BSH, штамма Гарсия - BHO-GAR, вируса оспы коров штамма GRI-90 - BOK-GRJ, штамма Брайтон BOK-BRI, последовательностей а - пептида клеточного белка C4b - Ни-С4ВР и последовательности фактора DAF -Ни-DAF. Вертикальными черными блоками отмечены консервативные остатки цистеина, вертикальными серыми блоками остатки, характерные для консенсуса SCR; в рамку взяты остатки, образующие гепаринсвязывающие домены Цифры над черными блоками указывают номер SCR.

оспы коров и осповакцины содержат четыре SCR.

Изменения в последовательности гена VCP центральноафриканских штаммов приводят к преждевременной терминации рамки трансляции VCP. Как следствие, у VCP этих штаммов отсутствует С-концевой SCR 4 (рис. 4), что отличает вирус оспы обезьян от других изученных видов ортопоксвирусов, патогенных для человека.

Суммируя результаты проведенного анализа можно заключить, что VCP вирусов оспы коров и осповакцины наиболее близки друг другу. Наибольшие отличия по аминокислотной последовательности данного белка характерны для вируса натуральной оспы. VCP вируса оспы обезьян хотя и очень схож по аминокислотной последовательности с соответствующим белком вируса осповакцины, но укорочен. Выявленные различия в структуре VCP у изученных ортопоксвирусов, по-видимому, обусловливают различия их биологических свойств.

При попытке амплификации района генома, содержащего последовательность гена, кодирующего комплементсвязывающий белок, у западноафриканских штаммов BOO с помощью наборов праймеров D14-1 (структура праймеров консервативна для всех ортопоксвирусов) фрагментов не выявляли (рис. 5), в то время как фрагменты предсказанной длины (около 1000 п.н.) выявляли в пробах, где в качестве матрицы использовали ДНК центральноафриканских штаммов. Известно, что #;п<ЙП-Е)-фрагменти (в котором у BOO располагается ОРТ, кодирующая VCP) у западно- и центральноафриканских штаммов BOO отличаются по длине по крайней мере на 1500 п.н. и возможно, что протяженная делеция в данном районе приводит к исчезновению ОРТ D15L, а также соседних ОРТ.

Для подтверждения этой гипотезы были рассчитаны праймеры и подобраны условия для проведения протяженной ПЦР. Праймеры выбирали таким образом, чтобы их последовательность была консервативна для наибольшего числа ортопоксвирусов, а расстояние до предполагаемой делеций составляло около 1,5 т.п.н. Полученные в результате протяженной

Рис. 4. Результаты электрофореза продуктов ПЦР в агарозном геле. М-маркер молекулярных весов, 1 - контроль (ПЦР проводился в присутствии всех компонентов, кроме вирусной ДНК). 2, 3 - в качестве матрицы для ПЦР использовалась ДНК штаммов из ДРК (CDC# v79-I-005 и Zaire 1028 соответственно), 4, 5 - в качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК западноафриканских штаммов (CDC# v70-l-l 87 и CDC# v78-I-3945).

ПЦР (LD-PCR) фрагменты различались по длине у западноафриканских и центральноафриканских штаммов и составляли бббОп.н. и около 5000 п.н. (рис. 5). Секвенирование продуктов протяженной ПЦР штаммов CDC#v70-I-187 и CDC#v78-I-3945 показало, что в результате делеции в геноме этих штаммов исчезают не только ОРТ D15L, но и ОРТ D16L, D17L и D18L BOO. На рис.6 представлено сравнение трансляционных карт изучаемого района западноафриканских штаммов CDC#v70-l-187 и CDC#v78-I-3945 с картами для заирских штаммов BOO ZAI-96-I-16 и Congo-8, а также с картами штамма GRI-90 вируса оспы коров и штамма FND вируса натуральной оспы

Таким образом, в геноме западноафриканских штаммов вируса оспы обезьян отсутствует ген, кодирующий комплементсвязывающий белок.

Известно, что рекомбинантные вирусы осповакцины, лишенные последовательности данного гена, оказывались в значительной степени аттенуированными Кожные поражения у кроликов, зараженных таким вирусом, были менее выражены, чем у животных, зараженных диким типом вируса. Возможно, что западноафриканские штаммы BOO, лишенные последовательности гена, кодирующего комплементсвязывающий белок, вызывают более умеренные проявления заболевания.

1 2 3 4 М

Рис. 5. Результаты электрофореза продуктов протяженного ПЦР в агарозном геле.

М - маркер молекулярных весов, 1, 2- в качестве матрицы для ПЦР использован ДНК штаммов из ДРК (CDC#v79-I-005 и Zaire 1028 соответственно), 4,5 - в качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК западноафриканских штаммов (CDC#v70-I-187 и CDC#v78-1-3945)

D12L D13L D14L D15L D17L D19L

D16L D18L i- <- <— <-

CDC#v7 9-1-005 <--<— <- <—

и i" ■■■{ i

Congo-8

D12L D13L D19L - <-

CDC#v70-I-187 <-

CDC#v78-1-3945

D10L DHL D12L D13L D13.5L D14L <- <- <- <— <-

BHO-XND nr. .......... ■ i ■ ■ ■ |-i.......j i| .

C15L C16L CI 71. C18L C19L

BOK-GRI

Рис. 6. Сравнение трансляционных карт изучаемого района генома различных штаммов BOO (центральноафриканские Congo-8 и CDC#v79-I-005, западноафриканские CDC#v70-I-187 и CDC#v78-I-3945), а также вируса натуральной оспы (BHO-IND) и вируса оспы коров (BOK-GRI). Жирным шрифтом выделены ОРТ, кодирующие VCP.

Таким образом, нами впервые обнаружено, что BOO кодирует либо укороченную форму VCP (центральноафриканский подтип вируса), либо ген, кодирующий этот белок, вообще делегирован (западноафриканский подтип BOO).

Ингибиторы действия интерферона. Ортопоксвирусы на поздних стадиях цикла развития продуцируют в больших количеств вирусспецифичные дцРНК, но в то же время они весьма устойчивы к действию IFN. Обнаружено, что ОРТ E3L ВОВ кодирует белок ингибитор IFN-индуцируемой DAI киназы. Этот ранний вирусный белок обладает способностью связываться с молекулами дцРНК, конкурируя со специфичной протеинкиназой клетки за связывание с дцРНК и, тем самым, ингибируя фосфорилирование альфа субъединицы эукариотического фактора 2. У вируса осповакцины обнаружены две формы этого белка - 25К и 19К. Делеция ОРТ E3L из генома вируса приводит к увеличению чувствительности вируса к действию интерферона в некоторых клеточных линиях. Связывание с дцРНК обеспечивает последовательность, находящаяся на С-конце полипептида. При анализе генома BOO штамм ZAI-96-I-16 было обнаружено, что ОРТ F3L, гомологичная ОРТ E3L ВОВ-СОР, укорочена по сравнению с аналогичными ОРТ других вирусов, ее длина 131 п.н. Так же, как в случае с VCP, для подтверждения полученного результата мы провели секвенирование ОРТ E3L у различных штаммов BOO.

Первичная структура ДНК гена F3L у цеетральноафрикаяских штаммов оказалась идентичной, у западноафриканских пггаммов обнаружены четыре специфичные замены нуклеотидов, три из них приводят к замене аминокислот.

При анализе аминокислотной последовательности этого гена было обнаружено, что он укорочен у всех штаммов таким образом, что возможна экспрессия лишь 19К-формы полипептида. В аминокислотной последовательности домена, отвечающего за связывание с дцРНК

обнаружены две характерные для всех штаммов вируса оспы обезьяны замены, находящиеся, однако вне участка, который изначально был определен как необходимый для связывания (рис. 7). Таким образом, нами впервые было показано, что ОРТ F3L BOO значительно отличается от гомологичных ОРТ других ортопоксвирусови и для этого гена наблюдается внутривидовая вариабельность.

Другая ОРТ K3L ВОВ кодирует гомолог eIF-2a, который может конкурировать с эндогенным eEF-2a клетки за вступление в реакцию фосфорилирования активированной протеинкиназой. Продукт гена K3L имеет сходство с аминотерминальной частью eIF-2a. Мутантный ВОВ с нарушенным геном K3L проявляет повышенную чувствительность к INF и выход вируса при размножении на культуре клеток уменьшается на два порядка. При анализе генома BOO обнаружено, что ОРТ C3L, гомологичная ОРТ K3L, укорочена по сравнению с ОРТ других ортопоксвирусов. Для подтверждения полученных результатов мы изучили последовательность ДНК из данного района для ряда штаммов BOO. В результате секвенирования обнаружено, что последовательности ДНК данного гена у всех штаммов BOO оказались идентичны, независимо от подтипа вируса.

Аминокислотная последовательность теоретически рассчитанной ОРТ E3L BOO составляет 43 аминокислотных остатка, что в половину меньше, чем у других ортопоксвирусов (ВНО, ВОВ, ВОК) (рис 8).

Таким образом, все изученные штаммы BOO не кодируют один из внутриклеточных факторов устойчивости к интерферону.

Выявленные отличия по организации генов E3L и F3L BOO от гомологичных генов других ортопоксвирусов, по-видимому, могут приводить к снижению уровня размножения BOO in vivo и, как следствие, к снижению эффективности передачи данного вируса от больного человека к здоровому воздушно-капельным путем.

Основываясь на ряде незатронутых изменениями (относительно других ортопоксвирусов) генов, кодирующих белки-иммуномодуляторы, можно

СОР - E3L GAR - C3L IND - E31 CNG - F3L WA - F3L

HKSFDDVIPAKKIIDWKDA! 1PVTIINEYCQITKRDWSFRIESVGPSNSPTFYACVDIDGRVFDKADGKSKRDAKNNAAKLAVDKL jGYVIIRF

К.....V j Я .S......

V ! GV

Рис. 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей белка, связывающего дцРНК, для ряда ортопоксвирусов. Штамма BOK-GRI (GRI - F3L), штамма BOB-COP (СОР - E3L), двух штаммов ВНО - BHO-IND (IND - E3L) и ВНО-GAR (GAR-C3L) и двух штаммов BOO - BOO-CNU (CNG - C3L) и CDC#70-I-187 (WA - F3L, западноафриканский штамм). Голубым серым домен связывания с Z-формой ДНК, рамкой обведен домен связывания с дцРНК.

GRI - M3L MLAECYSLPNAGDVIKGRVYENDYALYIYLFDYPHSEAILAESVKMHMDRYVEYRDKLVGK1VKVKVIRVDYTKGYIDVNYKRMCRHQ*

СОР - K3L .....................К. .А...............................................................*

RAR - P3L ..V.......V. . . L . . К. . . . G . V. . VD...........V. . TQ... N.. FK................I..................*

IND - C3L ..V.......V. . . L . . К. . . . G . V. . VD.........V . . ТО . . . N . . FK................I..................*

TNG - C3L .......................Т................С*

Рис. 8. Выравнивание аминокислотных последовательностей белка гомолога эукариотического фактора трансляции (elF-2а) для ряда ортопоксвирусов: штамм BOK-GRI (GRI - M3L), штамма ВОВ- СОР (СОР - K3L), двух штаммов ВНО -BHO-IND (IND - C3L) и ВНО- GAR (GAR - P3L) и штамм BOO-CNG (CNG - C3L).

Таким образом, в геноме вируса оспы обезьян обнаружено множество белков, способных модулировать ранний иммунный ответ организма-хозяина. В то же время особенностью генома BOO является то, что ряд ОРТ, кодирующих белки, способные подавлять иммунный ответ хозяина, укорочены или отсутствуют, что может приводить к изменению взаимодействия вирус-хозяин.

Таблица 2. Иммуномодуляторные белки ортопоксвирусов

BOO-ZAI BHO-IND BOB-COP BOK-GRI

ОРТ AO OPT AO OPT AO OPT AO

Фактор роста (ШР-подобный), секретируемый из клеток D3R 142 D2R 140 C11R 142 C5R 138

Сегрегируемый белок, связывающий шггерлейкин -18 (1И 8) D6L 126 D5L 126 —t — C8L 124

Комплемент-связывающий белок, секретируемый из клеток D14Lt 216 D12L 263 C3L 263 C17L 259

Устойчивость к действию интерферона (П^Ы). Гомологичен эукариотическому фактору трансляции е№-2а -t — C3L 88 K3L 88 M3L 88

Устойчивость к действию интерферона, связывает дцРНК. F3Lf 153 E3L 190 E3L 190 F3L 190

3-^-гидрокси -Д 5-стероид дигидрогеваза A45L 346 A50Lt .61 A44L 346 A47L 364

Секретируемый из клеток белок, связывающий гамма интерферон B9R 357 B9R 266 B8R 272 B7R 271

Гомологичен белкам семейства ингибиторов сер иловых протеаз, БР1-2, ишибшор 1Ь-1Э конвергирующего фермента СппА B12R 344 B13R 344 B13Rf 116 B12R 345

Секретируемый из клеток, ЕЬ-1 р -связывающий белок B14R 326 B15Rf 63 B16Rf 290 B14R 326

Растворимый рецептор ГТО-а/р. B16R 352 B20R 354 B19R 353 B17R 351

Гомолог серииовых протеаз (вРЫ), ингибитор апоптоза B19R 357 B25R 357 C12L 353 B20R 375

Рецептор фактора некроза опухолей СппВ J2L* JZR* 348 348 G2R 349 C22L*f B28R*t 122 122 D2L* H4R* 351 351

Рецептор фактора некроза опухолей СппС —t — —t — A53Rf 103 A56R 186

Рецептор фактора некроза опухолей СппЕ —t — —t — -t — K2R 322

Рецептор фактора некроза опухолей СппС KlRf 70 —t — -t — K3R 167

Связывает хемокины СС-типа J1L* J3R* 246 246 G3R 253 C23L*f B29R*t 244 244 D1L* H5R* 255 255

веп^огт-подобяый -t — A42R 74 A39R 403 A41R 402

*- ОРТ дуплицирована в геноме в находится в правой н левой терминальных областях; | - ОРТ имеет ряд фунхпионалыю-важных различий с гомологичной ОРТ ВОК - вМ.

Гены ankyrin-подобных белков. В геноме BOO обнаружены все три, известные hr гена ортопоксвирусов. В геноме BOO им соответствуют ОРТ

D7L, Dl OL и CIL. В аминокислотной последовательности ОРТ BOO D7L обнаружены две небольшие делеции по сравнению с соответствующей ОРТ BOK-GRI C9L (СНО hr), но в целом аминокислотные последовательности этих ОРТ высокогомологичны (94,2%).

Аминокислотная последовательность ОРТ D10L идентична ОРТ BOK-GRI C13L и BOB-COP C7L на 96%, а ОРТ BHO-IND D8L - на 96,7%. Аминокислотная последовательность ОРТ CIL BOO идентична последовательности ОРТ BOK-GRI MIL на 93,7% и аминокислотной последовательности ОРТ BOB-COP K1L - на 95,8%, а у ВНО она распадается на две короткие ОРТ.

Белки СНО hr и K1L (ВОВ-СОР) относятся к семейству анкиринподобных белков. Одна из возможных функций таких белков -обеспечение взаимодействия между клеточными мембранами и элементами цитоскелета. В геноме ВОК обнаружено 16 генов, продукты которых могут быть отнесены к семейству анкиринподобных белков. ОРТ, кодирующие эти белки, располагаются исключительно в концевых вариабельных районах генома. В геноме BOO обнаружены 10 генов, содержащих анкириновые повторы, и гомологичные генам ВОК. Шесть (ОРТ J3L, DIL, D7L, D9L, OIL, CIL) расположены в левом концевом районе генома и четыре (ОРТ B5R, B17R, N4R, J1R) - на правом. ОРТ N4R - аналог ОРТ CIL BOK-GRI. Вероятнее всего на правом конце генома она появилась в результате транслокации. По количеству полноразмерных аналогов анкириновых генов на левом конце генома BOO уступает только ВОК: так, в этом районе для ВНО обнаружен лишь один ген, для ВОВ - 3 гена. На правом конце генома для ВОВ обнаружены 2 гена, для ВНО, как и для BOO - 4 и у ВОК обнаружены 6 таких генов.

Таким образом, в геноме BOO обнаружены все три известные hr гена и набор дополнительных генов, структурно схожих с hr генами, причем по количеству этих генов вирус оспы обезьян уступает лишь ВОК (если рассматривать ортопоксвирусы, патогенные для человека). Вероятно, что именно такой набор hr генов обеспечивает BOO широкий круг хозяев.

Гены kelch-подобных белков. Гены kelch-подобных белков ортопоксвирусов располагаются в концевых вариабельных последовательностях генома. BOK-GRI кодирует шесть белков из этого суперсемейства. У BOO обнаружен лишь один ген C9L, который на 97,3% идентичен G3L BOK-GRI. ОРТ D16L, D17L, D18L, D19L из левой вариабельной области генома вируса оспы обезьян соответствуют у вирусов оспы коров и осповакцины одной большой ОРТ. У вируса натуральной оспы данная ОРТ распадается на две.

5. Выводы

1. Получены и охарактеризованы библиотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты генома вируса оспы обезьян (BOO) штаммов ZAI-96-1-16 и Congo-8.

2. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность ДНК BOO штамма ZAI-96-I-16. Данная последовательность 196858 пар нуклеотидов (п.н.) аннотирована и зарегистрирована в GenBank под номером AF 380138. В результате компьютерного анализа в геноме BOO-ZAI идентифицировано 190 потенциальных открытых рамок трансляции (ОРТ), кодирующих полипептиды размером не менее 60 аминокислотных остатков. Длина кодирующей последовательности ДНК BOO-ZAI имеет размер 195118 п.н. G+C состав ДНК BOO-ZAI равен 33,1%.

3. Секвенировано 28659 п.н. из концевых вариабельных районов генома BOO штамма Congo-8. Обнаружена большая степень идентичности (>99%) гомологичных последовательностей ДНК двух штаммов BOO ZAI-96-I-16 и Congo 8, что позволяет сделать предположение о высокой консервативности генома центральноафриканских штаммов BOO.

4. Впервые обнаружено, что у вируса оспы обезьян, в отличие от других изученных ортопоксвирусов, нарушен ген, комплементсвязывающего белка. При этом у центральноафриканских штаммов BOO ОРТ, кодирующая комплементсвязывающий белок, укорочена, а у западноафриканских штаммов BOO - делегирована.

5. Впервые показано, что у ВСЮ видоспециф ичным образом нарушены гены C3L и F3L, кодирующие внутриклеточные факторы устойчивости ортопоксвирусов к действию интерферона.

6. Впервые доказано что вирус оспы обезьян представляет собой вид с множественными отличиями по структуре ДНК от вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Щелкунов С.Н., Уварова Е.А., Тотменин А.В., Сафронов П.Ф., Сандахчиев JI.C. Видоспецифичные различия в организации комплементсвязывающего белка ортопоксвирусов. // Докл. РАН. 2001, Т. 379, № 4, С. 553-557.

2. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Babkin I.V., Safronov P.F., Ryazankina O.I., Petrov N.A., Gutorov V.V., Uvarova E.A., Mikheev M.V., Sisler J.R., Esposito J.J., Jahrling P.B., Moss В., Sandakhchiev L.S. Human monkeypox and smallpox viruses: genomic comparison. // FEBS Lett. 2001. V. 509. P. 6670.

3. Uvarova E.A., Shchelkunov S.N. Species-specific differences in the structure of orthopoxvirus complement-binding protein. II Virus Res. 2001. V. 81. P. 39-45.

4. Щелкунов C.H., Тотменин A.B., Сафронов П.Ф., Гуторов В.В., Рязанкина О.И., Петров Н.А., Бабкин И.В., Уварова Е.А., Михеев М.В., Сислер Дж., Эспозито Дж, Ярлинг П., Мосс Б. Множественные генетические различия между вирусами натуральной оспы и оспы обезьян. // Докл. РАН. 2002. Т. 384. № 1. С. 126-130.

5. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Safronov P.F., Mikheev M.V., Gutorov V.V., Ryazankina O.I., Petrov N.A., Babkin I.V., Uvarova E.A., Sandakhchiev L.S., Sisler J.R., Esposito J.J., Damon I.K., Jahrling P.B., Moss B. Analysis of the monkeypox virus genome. // Virology. 2002. V. 297. P. 172-194.

6. Uvarova E.A., Shchelkunov S.N. West African monkeypox virus strains lack the gent of complement-binding protein. In: XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference. Keble College, Oxford, England. September 3-8, 2004.

P. 131.

Подписано в печать 05.10.2004 Формат 60x84 1/16

Заказ № 103 Бумага офсетная, 80 гр/м1

Печл.1 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

»1942«

РНБ Русский фонд

2005-4 12622

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Уварова, Елена Александровна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. Обзор литературы.

1.1. История открытия вируса оспы обезьян.

1.2. Оспа обезьян у животных.

1.3. Оспа обезьян у человека.

1.3.1. Вспышки оспы обезьян у человека.

1.3.2. Клинические проявления оспы обезьян у человека.

1.3.3. Эпидемиология и экология BOO.

1.4. Биологические свойства вируса оспы обезьян.

2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2 Методы.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Создание клонотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты геномной ДНК штамма ZAI-96-I-16 вируса оспы обезьян.

3.2. Создание клонотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты геномной ДНК штамма Congo-8 вируса оспы обезьян.

3.3. Расшифровка нуклеотидных последовательностей генома BOO.

3.4 Анализ организации генома вируса оспы обезьян.

3.4.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома двух штаммов BOO.

3.4.2. Сравнительный анализ последовательностей из генома BOO с гомологичными последовательностями из геномов других ортопоксвирусов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Секвенирование и анализ генома вируса оспы обезьян"

Оспа обезьян - зоонозная инфекция, циркулирующая в тропических лесах Центральной и Западной Африки. Причиной заболевания является вирус из рода Orthopoxvirus - вирус оспы обезьян (BOO), который поражает широкий круг млекопитающих и является патогенным для человека.

Заболевание оспой обезьян для людей нередко оканчивается летальным исходом (до 15%). Клинические проявления оспы обезьян у человека сходны с таковыми для натуральной оспы и на протяжении последних тридцати лет неоднократно ставился вопрос об опасности адаптации BOO к человеческому организму и переходу BOO в ВНО-подобный вариант (Breman and Henderson, 1998). Оспа обезьян с гораздо меньшей эффективностью передается от человека к человеку, чем натуральная оспа. В отличае от ВНО вирус оспы обезьян способен поражать широкий круг животных разных видов.

С момента открытия в 1970 году оспы обезьян у человека случаи этого заболевания у людей регулярно регистрировали в Африке. Подавляющее число случаев было обнаружено в Демократической Республике Конго (ДРК - ранее Заир). Недавно вспышка оспы обезьян у людей была зафиксирована вне африканского континента - в США в 2003 году.

Вследствие прекращения после 1980 г. вакцинации людей против натуральной оспы за истекшие годы сформировалась большая прослойка людей, не защищенных от ортопоксвирусной инфекции, что обеспечивает возможность распространения в человеческих популяциях зоонозных ортопоксвирусов, таких, например, как BOO. Таким образом, вирус оспы обезьян в настоящее время представляет реальную угрозу жизни и здоровью людей.

В связи со всем вышесказанным важно было выявить отличия и сходства в организации геномов BOO и ВНО, оценить возможный потенциал эволюционного преобразования BOO. Наиболее прямым и информативным подходом для решения подобных задач является расшифровка нуклеотидной последовательности генома вируса и сравнение его с геномами близкородственных вирусов. К началу нашего исследования сведения о структуре протяженных участков ДНК BOO отсутствовали.

Целью данного исследования было изучение организации генома BOO.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Получение библиотек рекомбинантных плазм ид, содержащих фрагменты генома BOO штаммов ZAI-96-I-16 и Congo-8;

3. Построение трансляционных карт генома BOO;

4. Сравнение организации вариабельных участков генома двух штаммов BOO;

5. Сравнение организации генома BOO и других патогенных для человека ортопоксвирусов, таких, как вирусы натуральной оспы, оспы коров и осповакцины.

Научная новизна и практическая значимость работы. Получены представительные библиотеки рекомбинантных плазм ид, несущих фрагменты генома BOO-ZAI-96-I-16 и BOO-Congo-8. Впервые определена^ полная нуклеотидная последовательность ДНК генома штамма BOO-ZAI-96-1-16 и нуклеотидная последовательность ДНК вариабельных районов штамма BOO-Congo-8. Проведен сравнительный анализ гомологичных районов двух штаммов. Осуществлен подробный анализ организации генома BOO-ZAI-96-1-16 и его сравнение с геномами BHO-IND, ВОВ-СОР и BOK-GRI. Изучена структура гена, кодирующего вирусный комплементсвязывающий белок для пяти центральноафриканских штаммов BOO, двух западноафриканских и впервые показано что BOO кодирует либо укороченную форму VCP (центральноафриканский подтип вируса), либо ген, кодирующий этот белок, делегирован (западноафриканский подтип BOO). Так же для ряда штаммов BOO изучена структура двух генов, кодирующих внутриклеточные факторы устойчивости ортопоксвирусов к действию интерферона и впервые обнаружено, что у BOO видоспецифичным образом нарушены гены C3L и F3L, кодирующие внутриклеточные факторы устойчивости ортопоксвирусов к действию интерферона. На основании полученных данных и проведенного анализа сделан вывод о том, что BOO не является эволюционным предшественником ВНО и наоборот.

Вклад автора. Клонирование фрагментов ДНК двух штаммов BOO осуществлено автором совместно с д.б.н. Петровым H.A. и к.б.н. Рязанкиной О.И.; секвенирование фрагментов генома BOO выполнено автором совместно с д.б.н. Петровым H.A., к.б.н. Сафроновым П.Ф., Гуторовым В.В. Клонирование и секвенирование генов C3L и F3L BOO осуществлено лично автором. Компьютерный анализ генома BOO выполнен автором при участии K.6.H. Тотменина A.B. и к.б.н. Сафронова П.Ф.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 5 статей в реферируемых изданиях. Результаты работы представлены на международных конференциях: 12th International Poxvirus Symposium (St.Thomas, USA 1998), International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors (Smolenice, Slovakia 2000), 13th International Poxvirus and Iridovirus Symposium (Montpellier, France. 2000), 15th International Poxvirus and Iridovirus Conference (Oxford, UK. 2004).

Основные положения, выносимые на защиту:

• Охарактеризованные библиотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты генома вируса оспы обезьян (BOO) штаммов ZAI-96-I-16 и Congo 8.

• Полная нуклеотидная последовательность ДНК 196858 п.н. BOO штамма ZAI-96-I-16. Последовательности 28659 п.н. из концевых вариабельных последовательностей генома BOO штамма Congo-8.

• Большая степень идентичности (>99%) гомологичных последовательностей ДНК двух штаммов BOO ZAI-96-I-16 и Congo-8.

• BOO кодирует либо укороченную форму VCP (центральноафриканский подтип вируса), либо ген, кодирующий этот белок, делегирован (западноафриканский подтип BOO).

• У BOO видоспецифичным образом нарушены гены C3L и F3L, кодирующие внутриклеточные факторы устойчивости ортопоксвирусов к действию интерферона.

• Вирус оспы обезьян представляет собой вид с множественными отличиями по структуре ДНК от вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов, патогенных для человека.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Уварова, Елена Александровна

5. Выводы

1. Получены и охарактеризованы библиотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты генома вируса оспы обезьян (BOO) штаммов ZAI-96-I-16 и Congo-8.

5. Впервые показано, что у BOO видоспецифичным образом нарушены гены C3L и F3L, кодирующие внутриклеточные факторы устойчивости ортопоксвирусов к действию интерферона.

Впервые доказано что вирус оспы обезьян представляет собой вид с множественными отличиями по структуре ДНК от вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов.

4. Заключение

В ДРК среди людей в последние годы увеличилась заболеваемость оспой обезьян, удлинились цепочки передачи вируса от человека к человеку, а также изменилась возрастная группа, чувствительная к вирусу. В то же время выполненые в данной работе сравнение структуры вариабельных районов генома двух центральноафриканских штаммов BOO, выделенных с промежутком в 26 лет от людей в ДРК, демонстрируют консервативность этого подтипа BOO. Таким образом, изменение эпидемиологической картины, сопутствующей оспе обезьян у человека, нельзя объяснить изменением генетической структуры вируса, а, по-видимому, можно объяснить тем, что в центральной Африке за последние двадцать лет существенно уменьшилась прослойка населения, иммунная к ортопоксвирусам.

В результате секвенирования и компьютерного анализа вирусного генома нами обнаружено, что особенностью генома BOO является то, что в его структуре отсутствуют или значительно изменены некоторые гены, кодирующие иммуномодуляторные белки, обнаруженные у других патогенных для человека ортопоксвирусов, таких как вирус натуральной оспы, оспы коров и осповакцины.

Так у центральноафриканских штаммов BOO укорочен ген, кодирующий вирусный комплементсвязывающий белок. Возможно, это значительно влияет на свойства вирусного белка как ингибитора воспалительных реакций и обусловливает у инфицированных BOO людей лимфаденопатию и снижение вирулентных свойств вируса. В геноме западноафриканских штаммов BOO этот ген отсутствует, что может приводить к дальнейшему снижению их патогенности для чувствительных животных и человека. По-видимому, именно этим обусловлено малое число случаев оспы обезьян, выявляемое у людей в Западной Африке, и отсутствие при этом летальных исходов.

В 2003 г. впервые вспышка оспы обезьян среди людей была зафиксирована вне Африканского континента. Возбудитель этой инфекции был завезен в США с больными грызунами из Ганы, предназначенными для продажи в качестве домашних животных. Доказано, что данную вспышку обусловил западноафриканский подтип BOO (Reed et al., 2004). Полученные нами в настоящей работе данные о делетировании у западноафриканских штаммов BOO гена, кодирующего VCP, по-видимому, могут объяснить причину отсутствия летальных исходов среди 72 человек, заболевших оспой обезьян во время этой инфекционной вспышки в США. Очевидно, что завоз в какие-либо страны центральноафриканского варианта BOO может привести к вспышкам инфекционного заболевания среди людей с более тяжелыми последствиями. Поэтому необходимо осуществлять тщательный контроль всех животных, вывозимых из Африки на другие континенты, на зараженность их ортопоксвирусами.

У вируса оспы обезьян разрушена ОРТ C3L, кодирующая гомолог elF-2а - один из внутриклеточных факторов устойчивости к интерферону. Кроме того, в геноме BOO укорочена ОРТ F3L, которая кодирует белок ингибитор IFN-индуцируемой DAI киназы, также являющийся внутриклеточным фактором устойчивости к интерферону. Это, возможно, приводит к снижению уровня размножения вируса in vivo и, как следствие, к снижению эффективности передачи BOO от больного человека к здоровому воздушно-капельным путем. Следует отметить, что последовательности этих двух генов были секвенированы нами для нескольких центральноафриканских и западноафриканских штаммов BOO и во всех случаях выявлено совпадение в организеции этих генов, что указывает на строгую видовую спецефичность в их структуре.

Обнаружены также видоспецефичные отличия в структуре генов, кодирующих хемокин-связывающий белок, TNF-связывающий белок, белок эпидермального фактора роста и yIFN-связывающий белок. Кроме того, геном BOO отличается от геномов других ортопоксвирусов по спектру генов, кодирующих ankyrin- и kelch-подобные белки.

BOO имеет существенные отличия от ВНО по строению нуклеотидных последовательностей как в правом, так и левом концевых районах генома. Эти отличия в первую очередь обусловлены протяженными делениями (см. Приложение 1). Исходя из наших данных, можно сделать вывод, что, несмотря на то, что оспа обезьян и натуральная оспа у человека очень похожи по клиническим проявлениям, BOO не является эволюционным предшественником ВНО и наоборот.

Множественные генетические различия BOO и ВНО указывают также на то, что оспа обезьян не является полноценной моделью натуральной оспы при разработке химиотерапии и вакцин против натуральной оспы. Поэтому вопрос о разработке системы модельных животных для ВНО имеет большое значение не только для фундаментальной науки, но и для медицины.

Суммируя результаты сравнительного анализа структуры геномов BOO-ZAI и других ортопоксвирусов, патогенных для человека, можно заключить, что вирус оспы обезьян представляет собой вид с множественными отличиями от других видов ортопоксвирусов. Эволюция BOO шла независимо от других ортопоксвирусов после отделения этого вида от общего предка, роль которого, по-видимому, мог выполнять вирус оспы коров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Уварова, Елена Александровна, Кольцово

1. Ежек 3., Ходакевич Л., Счениовский М. Обезьянья оспа человека: эпидемиологическая характеристика. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии 1988 - Т. 6 - С.23-30.

2. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. Под ред. Д. Гловера. М: Мир, 1988. - 538 с.

3. Ладный И.Д., Огородникова З.И., Шелухина Э.М., Герасименко Р.Т., Воронин Ю.С. Изучение распространения вирусов оспенной группы среди животных. // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов - 1975 -Вып. 3-4-С. 165-167.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М: Мир, 1984.-480 с.

5. Маренникова С.С., Шелухина Э.М., Мальцева H.H., Ладный И.Д. Вирус оспы обезьян возбудитель оспоподобного заболевания человека // Вопросы вирусологии - 1971 - Вып. 4 - С. 463-469.

6. Маренникова С.С., Шелухина Э.М., Шенкман Л.С. Мальцева H.H., Мацевич Г.Р. Результаты обследования дикоживущих обезьян наналичие противооспенных антител и вирусов оспенной группы // Вопросы вирусологии 1975 - Вып. 3 - С. 321-326.

7. Маренникова С.С., Шелухина Э.М., Ходакевич Л.И, Янова Н. Н. Выделение вируса оспы обезьян от дикоживущей африканской белки // Вопросы вирусологии 1986 -Вып.2.- С. 238-241.

8. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. КМК - 1998 - 386 с.

9. Сафронов П.Ф., Петров H.A., Рязанкина О.И., Тотменин A.B., Щелкунов С.Н., Сандахчиев Л.С. Гены круга хозяев вируса оспы коров // Докл. РАН 1996 - Т.249. - С. 829-833.

10. Ходакевич H.H. Экологические и эпидемиологические аспекты оспы обезьян./ Дисс. докт. Москва - 1990.

11. Щелкунов С.Н. Иммуномодуляторные белки ортопоксвирусов // Молекулярная биология 2003 -Т. 37 - С. 41-53.

12. Щелкунов С.Н., Рязанкина О.И., Крыкабаев P.A., Белавин П.А. Экспрессия последовательностей ДНК ортопоксвирусов в клетках Escherichia coli. II Молекулярная биология. 1992. - № 25. - С. 772779.

13. Щелкунов С.Н., Блинов В.М., Ресенчук С.М., Денисов С.И., Тотменин A.B., Сандахчиев J1.C. Семейство анкиринподобных белков ортопоксвирусов // Докл. РАН 1993- Т.328- С. 256-258.

14. Ярилин A.A. Основы иммунологии М. - Медицина, 1999. - 608 с.

15. Human monkeypox-Kasai Oriental, Zaire, 1996-1997. // MMWR Morb.Mortal.Wkly.Rep. 1997. - V. 46. - № 14. - P. 304-307.

16. Multistate outbreak of monkeypox-Illinois, Indiana, and Wisconsin, 2003. // MMWR Morb.Mortal.Wkly.Rep. 2003a. - V. 52. - № 23. - P. 537-540.

17. Update: multistate outbreak of monkeypox-Illinois, Indiana, Kansas, Missouri, Ohio, and Wisconsin, 2003. // MMWR Morb.Mortal.Wkly.Rep. -2003. V. 52. - № 27. - P. 642-646.

18. Adams J., Kelso R., Cooley L. The kelch repeat superfamily of proteins: propellers of cell function. // Trends Cell Biol. 2000. - V. 10. - № 1. - P. 17-24.

19. Ahn B.Y., Gershon P.D., Jones E.V., Moss B. Identification of rpo30, a vaccinia virus RNA polymerase gene with structural similarity to a eucaryotic transcription elongation factor. // Mol.Cell Biol. 1990. - V. 10. -№10.-P. 5433-5441.

20. Ahn B.Y., Jones E.V., Moss B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5' poly(A) leader on its early transcript. // J.Virol. 1990. - V. 64. - № 6. -P. 3019-3024.

21. Ahn B.Y., Moss B. Glutaredoxin homolog encoded by vaccinia virus is a virion-associated enzyme with thioltransferase and dehydroascorbate reductase activities. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1992. - V. 89. - № 15. -P. 7060-7064.

22. Ahn B.Y., Moss B. RNA polymerase-associated transcription specificity factor encoded by vaccinia virus. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1992. - V. 89. - № 8. - P. 3536-3540.

23. Aizawa Y., Akita K., Taniai M., Torigoe K., Mori T., Nishida Y., Ushio S., Nukada Y., Tanimoto T., Ikegami H., Ikeda M., Kurimoto M. Cloning and expression of interleukin-18 binding protein. // FEBS Lett. 1999. - V. 445. -№2-3.-P. 338-342.

24. Alcami A., Smith G.L. A soluble receptor for interleukin-1 beta encoded by vaccinia virus: a novel mechanism of virus modulation of the host response to infection. // Cell. 1992. - V. 71. - № 1. - P. 153-167.

25. Alcami A., Smith G.L. Vaccinia, cowpox, and camelpox viruses encode soluble gamma interferon receptors with novel broad species specificity. // J.Virol. 1995. - V. 69. - № 8. - P. 4633-4639.

26. Alcami A., Smith G.L. A mechanism for the inhibition of fever by a virus. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1996. - V. 93. - № 20. - P. 11029-11034.

27. Almazan F., Tscharke D.C., Smith G.L. The vaccinia virus superoxide dismutase-like protein (A45R) is a virion component that is nonessential for virus replication. // J.Virol. 2001. - V. 75. - № 15. - P. 7018-7029.

28. Amegadzie B.Y., Ahn B.Y., Moss B. Identification, sequence, and expression of the gene encoding a Mr 35,000 subunit of the vaccinia virus DNA-dependent RNA polymerase. // J.Biol.Chem. 1991. - V. 266. - № 21. -P. 13712-13718.

29. Antoine G., Scheiflinger F., Doraer F., Falkner F.G. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. // Virology. 1998. - V. 244. - № 2. - P. 365-396.

30. Arita I., Gispen R., Kalter S.S., Wah L.T., Marennikova S.S., Netter R., Tagaya I. Outbreaks of monkeypox and serological surveys in non-human primates. // Bull.World Health Organ. 1972. - V. 46. - P. 652-631.

31. Baek S.H., Kwak J.Y., Lee S.H., Lee T., Ryu S.H., Uhlinger D.J., Lambeth J.D. Lipase activities of p37, the major envelope protein of vaccinia virus. // J.Biol.Chem. 1997. - V. 272. - № 51. - P. 32042-32049.

32. Banham A.H., Smith G.L. Characterization of vaccinia virus gene B12R. // J.Gen.Virol. 1993. - V. 74 ( Pt 12). - P. 2807-2812.

33. Baroudy B.M., Venkatesan S., Moss B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. // Cell. 1982. - V. 28. - № 2. - P. 315-324.

34. Baroudy B.M., Venkatesan S., Moss B. Structure and replication of vaccinia virus telomeres. // Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 1983. - V. 47 Pt 2. - P. 723-729.

35. Bayliss C.D., Smith G.L. Vaccinia virion protein I8R has both DNA and RNA helicase activities: implications for vaccinia virus transcription. // J.Virol. 1996. - V. 70. - № 2. - P. 794-800.

36. Bayliss C.D., Wilcock D., Smith G.L. Stimulation of vaccinia virion DNA helicase I8R, but not A18R, by a vaccinia core protein L4R, an ssDNA binding protein. // J.Gen.Virol. 1996. - V. 77 ( Pt 11). - P. 2827-2831.

37. Beattie E., Kauffman E.B., Martinez H., Perkus M.E., Jacobs B.L., Paoletti E., Tartaglia J. Host-range restriction of vaccinia virus E3L-specific deletion mutants. // Virus Genes. 1996. - V. 12. - № 1. - P. 89-94.

38. Beattie E., Tartaglia J., Paoletti E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. // Virology. 1991. - V. 183. -№ 1. - P. 419-422.

39. Bedson H.S., Dumbell K.R. The effect of temperature on the growth of poxviruses in the chick embrio. // Journal of Hygiene. 1961. - V. 59. - P. 457-469.

40. Blasco R., Cole N.B., Moss B. Sequence analysis, expression, and deletion of a vaccinia virus gene encoding a homolog of profilin, a eukaryotic actin-binding protein. // J.Virol. 1991. - V. 65. - № 9. - P. 4598-4608.

41. Blasco R., Moss B. Extracellular vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-Dalton outer envelope protein. // J.Virol. 1991. - V. 65. - № 11. - P. 5910-5920.

42. Blomquist M.C., Hunt L.T., Barker W.C. Vaccinia virus 19-kilodalton protein: relationship to several mammalian proteins, including two growth factors. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1984. - V. 81. - № 23. - P. 73637367.

43. Born T.L., Morrison L.A., Esteban D.J., VandenBos T., Thebeau L.G., Chen N., Spriggs M.K., Sims J.E., Buller R.M. A poxvirus protein that binds to and inactivates IL-18, and inhibits NK cell response. // J.Immunol. 2000. -V. 164. -№6. -P. 3246-3254.

44. Breman J.G. Monkeypox: an emerging infection for humans? 2000. -Emerging Infections 4.

45. Breman J.G., Nakano J.H., Coffi E., Godfrey H., Gautun J.C. Human poxvirus disease after smallpox eradication. // Am.J.Trop.Med.Hyg. 1977. -V. 26.-№2.-P. 273-281.

46. Breman J.G., Henderson D.A. Poxvirus dilemmas—monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. // N.Engl.J.Med. 1998. - V. 339. - № 8. - P. 556559.

47. Breman J.G., Arita I., Fenner F. Preventing the return of smallpox. // N.Engl.J.Med. 2003. - V. 348. - № 5. - P. 463-466.

48. Brick D.J., Burke R.D., Minkley A.A., Upton C. Ectromelia virus virulence factor p28 acts upstream of caspase-3 in response to UV light-induced apoptosis. // J.Gen.Virol. 2000. - V. 81. - № Pt 4. - P. 1087-1097.

49. Brown C.K., Turner P.C., Moyer R.W. Molecular characterization of the vaccinia virus hemagglutinin gene. // J.Virol. 1991. - V. 65. - № 7. - P. 3598-3606.

50. Brown J.P., Twardzik D.R., Marquardt H., Todaro GJ. Vaccinia virus encodes a polypeptide homologous to epidermal growth factor and transforming growth factor. // Nature. 1985. - V. 313. - № 6002. - P. 491492.

51. Broyles S.S., Fesler B.S. Vaccinia virus gene encoding a component of the viral early transcription factor. // J.Virol. 1990. - V. 64. - № 4. - P. 15231529.

52. Broyles S.S., Moss B. Identification of the vaccinia virus gene encoding nucleoside triphosphate phosphohydrolase I, a DNA-dependent ATPase. // J.Virol. 1987. -V. 61. -№5. - P. 1738-1742.

53. Buller R.M., Chakrabarti S., Moss B., Fredrickson T. Cell proliferative response to vaccinia virus is mediated by VGF. // Virology. 1988. - V. 164. - № 1. - P. 182-192.

54. Calderara S., Xiang Y., Moss B. Orthopoxvirus IL-18 binding proteins: affinities and antagonist activities. // Virology. 2001. - V. 279. - № 1. - P. 22-26.

55. Cao J.X., Koop B.F., Upton C. A human homolog of the vaccinia virus Hindlll K4L gene is a member of the phospholipase D superfamily. // Virus Res. 1997.-V. 48.-№ l.-P. 11-18.

56. Cassetti M.C., Merchlinsky M., Wolffe E.J., Weisberg A.S., Moss B. DNA packaging mutant: repression of the vaccinia virus A32 gene results in noninfectious, DNA-deficient, spherical, enveloped particles. // J.Virol. -1998. V. 72. - № 7. - P. 5769-5780.

57. Chang H.W., Jacobs B.L. Identification of a conserved motif that is necessary for binding of the vaccinia virus E3L gene products to double-stranded RNA. // Virology. 1993. - V. 194. - № 2. - P. 537-547.

58. Chang H.W., Watson J.C., Jacobs B.L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1992. - V. 89. - № 11.-P. 4825-4829.

59. Chang W., Lim J.G., Hellstrom I., Gentry L.E. Characterization of vaccinia virus growth factor biosynthetic pathway with an antipeptide antiserum. // J.Virol. 1988. - V. 62. - № 3. - P. 1080-1083.

60. Chen W., Drillien R., Spehner D., Buller R.M. Restricted replication of ectromelia virus in cell culture correlates with mutations in virus-encoded host range gene. // Virology. 1992. - V. 187. - № 2. - P. 433-442.

61. Cho C.T., Bolano C.R., Kamitsuka P.S., Wenner H.A. Methisazone and monkey pox virus: studies in cell cultures, chick embryos, mice and monkeys. // Am.J.Epidemiol. 1970. - V. 92. - № 2. - P. 137-144.

62. Christen L.M., Sanders M., Wiler C., Niles E.G. Vaccinia virus nucleoside triphosphate phosphohydrolase I is an essential viral early gene transcription termination factor. // Virology. 1998. - V. 245. - № 2. - P. 360-371.

63. Chung C.S., Hsiao J.C., Chang Y.S., Chang W. A27L protein mediates vaccinia virus interaction with cell surface heparan sulfate. // J.Virol. 1998. -V. 72.-№2.-P. 1577-1585.

64. Douglass N., Dumbell K. Independent evolution of monkeypox and variola viruses. // J.Virol. 1992. - V. 66. - № 12. - P. 7565-7567.

65. Douglass N.J., Richardson M., Dumbell K.R. Evidence for recent genetic variation in monkeypox viruses. // J.Gen.Virol. 1994. - V. 75 ( Pt 6). - P. 1303-1309.

66. Duncan S.A., Smith G.L. Vaccinia virus gene SalF5R is non-essential for virus replication in vitro and in vivo. // J.Gen.Virol. 1992. - V. 73 ( Pt 5). -P. 1235-1242.

67. Dyster L.M., Niles E.G. Genetic and biochemical characterization of vaccinia virus genes D2L and D3R which encode virion structural proteins. // Virology. 1991. - V. 182. - № 2. - P. 455-467.

68. Earl P.L., Jones E.V., Moss B. Homology between DNA polymerases of poxviruses, herpesviruses, and adenoviruses: nucleotide sequence of the vaccinia virus DNA polymerase gene. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1986. -V. 83. -№ 11.-P. 3659-3663.

69. Engelstad M., Howard S.T., Smith G.L. A constitutively expressed vaccinia gene encodes a 42-kDa glycoprotein related to complement control factors that forms part of the extracellular virus envelope. // Virology. 1992. - V. 188.-№2.-P. 801-810.

70. Engelstad M., Smith G.L. The vaccinia virus 42-kDa envelope protein is required for the envelopment and egress of extracellular virus and for virus virulence. // Virology. 1993. - V. 194. - № 2. - P. 627-637.

71. Esposito J.J., Knight J.C. Nucleotide sequence of the thymidine kinase gene region of monkeypox and variola viruses. // Virology. 1984. - V. 135. - № 2. - P. 561-567.

72. Esposito J.J., Knight J.C. Orthopoxvirus DNA: a comparison of restriction profiles and maps. // Virology. 1985. - V. 143. - № 1. - P. 230-251.

73. Evans E., Klemperer N., Ghosh R., Traktman P. The vaccinia virus D5 protein, which is required for DNA replication, is a nucleic acid-independent nucleoside triphosphatase. // J.Virol. 1995. - V. 69. - № 9. - P. 5353-5361.

74. Fenner F. Risks and benefits of vaccinia vaccine use in the worldwide smallpox eradication campaign. // Res.Virol. 1989. - V. 140. - № 5. - P. 465-466.

75. Fenner F. Adventures with poxviruses of vertebrates. // FEMS Microbiol.Rev. 2000. - V. 24. - № 2. - P. 123-133.

76. Fenner, F. and Nakano, J. H. Poxviridae. In "Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases. Vol. II. Viral, Rickettsial and Chlamydial Diseases" (E. H. Lennette, P. Halonen and F. A. Murphy, eds.) Springer-Verlag, New York 1988a.

77. Fenner, F., Henderson, D.A., Arita, I., Jezek, Z., and Ladnyi I.D. "Smallpoxand Its Eradication". 19886. - World Health Organization, Geneva, Switzerland.

78. Fenner, F., Wittek, R., and Dumbell, K.R. The Orthopoxviruses. 1989. -Academic Press, Inc., San Diego.

79. Fine P.E., Jezek Z., Grab B., Dixon H. The transmission potential of monkeypox virus in human populations. // Int.J.Epidemiol. 1988. - V. 17. -№ 3. - P. 643-650.

80. Foster S.O., Brink E.W., Hutchins D.L., Pifer J.M., Lourie B., Moser C.R., Cummings E.C., Kuteyi O.E., Eke R.E., Titus J.B., Smith E.A., Hicks J.W., Foege W.H. Human monkeypox. // Bull.World Health Organ. 1972. - V. 46. - № 5. - P. 569-576.

81. Frischknecht F., Moreau V., Rottger S., Gonfloni S., Reckmann I., Superti-Furga G., Way M. Actin-based motility of vaccinia virus mimics receptor tyrosine kinase signalling. // Nature. 1999. - V. 401. - № 6756. -P. 926-929.

82. Funahashi S., Sato T., Shida H. Cloning and characterization of the gene encoding the major protein of the A-type inclusion body of cowpox virus. // J.Gen.Virol. 1988. - V. 69 (Pt 1). - P. 35-47.

83. Garon C.F., Barbosa E., Moss B. Visualization of an inverted terminal repetition in vaccinia virus DNA. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1978. - V. 75. - № 10. - P. 4863-4867.

84. Gershon P.D., Ahn B.Y., Garfield M., Moss B. Poly(A) polymerase and a dissociable polyadenylation stimulatory factor encoded by vaccinia virus. // Cell. 1991. - V. 66. - №6. - P. 1269-1278.

85. Gershon P.D., Moss B. Early transcription factor subunits are encoded by vaccinia virus late genes. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1990. - V. 87. -№ 11. - P. 4401-4405.

86. Gillard S., Spehner D., Drillien R., Kirn A. Localization and sequence of a vaccinia virus gene required for multiplication in human cells. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1986. - V. 83. - № 15. - P. 5573-5577.

87. Gispen R., Brand-Saathof B. "White" poxvirus strains from monkeys. // Bull.World Health Organ. 1972. - V. 46. - № 5. - P. 585-592.

88. Gispen R., Brand-Saathof B.B., Hekker A.C. Monkeypox-specific antibodies in human and simian sera from the Ivory Coast and Nigeria. // Bull.World Health Organ. 1976. - V. 53. - № 4. - P. 355-360.

89. Gispen R., Verlinde J.D., Zwart P. Histopathological and virological studies on monkeypox. // Arch.Gesamte Virusforsch. 1967. - V. 21. - № 2. -P. 205-216.

90. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus. // Virology. -1990. V. 179. - № 1. - P. 247-263.

91. Golini F., Kates J.R. Transcriptional and translational analysis of a strongly expressed early region of the vaccinia virus genome. // J.Virol. -1984. V. 49. - № 2. - P. 459-470.

92. Gross C.H., Shuman S. The nucleoside triphosphatase and helicase activities of vaccinia virus NPH-II are essential for virus replication. // J.Virol. 1998. - V. 72. - № 6. - P. 4729-4736.

93. Guan K.L., Broyles S.S., Dixon J.E. A Tyr/Ser protein phosphatase encoded by vaccinia virus. // Nature. 1991. - V. 350. - № 6316. - P. 359362.

94. Gvakharia B.O., Koonin E.K., Mathews C.K. Vaccinia virus G4L gene encodes a second glutaredoxin. // Virology. 1996. - V. 226. - № 2. -P. 408-411.

95. Hall, Nucl. Acids Symp. Ser. 1999,41 P. 95-98

96. Hay S., Kannourakis G. A time to kill: viral manipulation of the cell death program. // J Gen.Virol. 2002. - V. 83. - № Pt 7. - P. 1547-1564.

97. Hirt P., Hiller G., Wittek R. Localization and fine structure of a vaccinia virus gene encoding an envelope antigen. // J.Virol. 1986. - V. 58. - № 3. - P. 757-764.

98. Hsiao J.C., Chung C.S., Chang W. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the adsorption of intracellular mature virions to cells. // J Virol. 1999. - V. 73. - № 10. - P. 8750-8761.

99. Hu F.Q., Smith C.A., Pickup D.J. Cowpox virus contains two copies of an early gene encoding a soluble secreted form of the type II TNF receptor. // Virology. 1994. - V. 204. - № 1. - P. 343-356.

100. Hu X., Wolffe E.J., Weisberg A.S., Carroll L.J., Moss B. Repression of the A8L gene, encoding the early transcription factor 82-kilodalton subunit, inhibits morphogenesis of vaccinia virions. // J.Virol. 1998. - V. 72. -№ 1. - P. 104-112.

101. Hughes S.J., Johnston L.H., de Carlos A., Smith G.L. Vaccinia virus encodes an active thymidylate kinase that complements a cdc8 mutant of Saccharomyces cerevisiae. // J.Biol.Chem. 1991. - V. 266. - № 30. - P. 20103-20109.

102. Ichihashi Y., Takahashi T., Oie M. Identification of a vaccinia virus penetration protein. // Virology. 1994. - V. 202. - № 2. - P. 834-843.

103. Isaacs S.N., Wolffe E.J., Payne L.G., Moss B. Characterization of a vaccinia virus-encoded 42-kilodalton class I membrane glycoprotein component of the extracellular virus envelope. // J.Virol. 1992. - V. 66. - № 12.-P. 7217-7224.

104. Ishii K., Moss B. Role of vaccinia virus A20R protein in DNA replication: construction and characterization of temperature-sensitive mutants. // J.Virol. 2001. - V. 75. - № 4. - P. 1656-1663.

105. Jezek Z., Gromyko A.I., Szczeniowski M.V. Human monkeypox. // J.Hyg.Epidemiol.Microbiol.Immunol. 1983. - V. 27. - № 1. - P. 13-28.

106. Jezek Z., Arita I., Mutombo M., Dunn C., Nakano J.H., Szczeniowski M. Four generations of probable person-to-person transmission of human monkeypox. //Am.J.Epidemiol. 1986. - V. 123. - № 6. - P. 1004-1012.

107. Jezek Z., Szczeniowski M., Paluku K.M., Mutombo M. Human monkeypox: clinical features of 282 patients. // J.Infect.Dis. 1987. - V. 156.-Xs2.-P. 293-298.

108. Jezek Z., Fenner F. Human monkeypox In: JL Melnick, editor. Monographs in virology Volume 17. Basel: Karger 1988a

109. Jezek Z., Grab B., Szczeniowski M.V., Paluku K.M., Mutombo M. Human monkeypox: secondary attack rates. // Bull.World Health Organ. -19886. V. 66. - Xq 4. - P. 465-470.

110. Jezek Z., Szczeniowski M., Paluku K.M., Mutombo M., Grab B. Human monkeypox: confusion with chickenpox. // Acta Trop. 1988b. - V. 45.-Xo4.-P. 297-307.

111. Kane E.M., Shuman S. Temperature-sensitive mutations in the vaccinia virus H4 gene encoding a component of the virion RNA polymerase. // J.Virol. 1992. - V. 66. - X® 10. - P. 5752-5762.

112. Kane E.M., Shuman S. Vaccinia virus morphogenesis is blocked by a temperature-sensitive mutation in the 17 gene that encodes a virion component. // J.Virol. 1993. - V. 67. - № 5. - P. 2689-2698.

113. Kao S.Y., Bauer W.R. Biosynthesis and phosphorylation of vaccinia virus structural protein VP11. // Virology. 1987. - V. 159. - № 2. - P. 399407.

114. Karupiah G., Fredrickson T.N., Holmes K.L., Khairallah L.H., Buller R.M. Importance of interferons in recovery from mousepox. // J Virol. -1993. V. 67. - № 7. - P. 4214-4226.

115. Keck J.G., Baldick C.J., Jr., Moss B. Role of DNA replication in vaccinia virus gene expression: a naked template is required for transcription of three late trans-activator genes. // Cell. 1990. - V. 61. - № 5. - P. 801809.

116. Keck J.G., Kovacs G.R., Moss B. Overexpression, purification, and late transcription factor activity of the 17-kilodalton protein encoded by the vaccinia virus AIL gene. // J.Virol. 1993. - V. 67. - № 10. - P. 5740-5748.

117. Kerr S.M., Smith G.L. Vaccinia virus encodes a polypeptide with DNA ligase activity. // Nucleic Acids Res. 1989. - V. 17. - № 22. - P. 9039-9050.

118. Khodakevich L., Jezek Z., Messinger D. Monkeypox virus: ecology and public health significance. // Bull. World Health Organ. 1988. - V. 66. -№ 6. - P. 747-752.

119. Khodakevich L., Szczeniowski M., Manbu m.D., Jezek Z., Marennikova S., Nakano J., Messinger D. The role of squirrels in sustaining monkeypox virus transmission. // Trop.Geogr.Med. 1987. - V. 39. - № 2. -P. 115-122.

120. Klemperer N., McDonald W., Boyle K., Unger B., Traktman P. The A20R protein is a stoichiometric component of the processive form of vaccinia virus DNA polymerase. // J Virol. 2001. - V. 75. - № 24. - P. 12298-12307.

121. Kolodkin A.L., Matthes D.J., Goodman C.S. The semaphorin genes encode a family of transmembrane and secreted growth cone guidance molecules. // Cell. 1993. - V. 75. - № 7. - P. 1389-1399.

122. Koonin E.V. A highly conserved sequence motif defining the family of MutT-related proteins from eubacteria, eukaryotes and viruses. // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - № 20. - P. 4847.

123. Kotwal G.J., Moss B. Vaccinia virus encodes a secretory polypeptide structurally related to complement control proteins. // Nature. 1988. - V. 335.-№6186.-P. 176-178.

124. Kotwal G.J., Moss B. Vaccinia virus encodes two proteins that are structurally related to members of the plasma serine protease inhibitor superfamily. // J.Virol. 1989. - V. 63. - № 2. - P. 600-606.

125. Kovacs G.R., Moss B. The vaccinia virus H5R gene encodes late gene transcription factor 4: purification, cloning, and overexpression. // J.Virol. -1996. V. 70. - № 10. - P. 6796-6802.

126. Kovacs G.R., Vasilakis N., Moss B. Regulation of viral intermediate gene expression by the vaccinia virus B1 protein kinase. // J.Virol. 2001. -V. 75. - № 9. - P. 4048-4055.

127. Ladnyj I.D., Ziegler P., Kima E. A human infection caused by monkeypox virus in Basankusu Territory, Democratic Republic of the Congo // Bull World Health Organ 1972- 46(5)-P. 593-7

128. Lalani A.S., Masters J., Graham K., Liu L., Lucas A., McFadden G. Role of the myxoma virus soluble CC-chemokine inhibitor glycoprotein, MTl, during myxoma virus pathogenesis. // Virology. 1999. - V. 256. - № 2. - P. 233-245.

129. Law K.M., Smith G.L. A vaccinia serine protease inhibitor which prevents virus-induced cell fusion. // J.Gen.Virol. 1992. - V. 73 ( Pt 3). - P. 549-557.

130. Lee-Chen G.J., Bourgeois N., Davidson K., Condit R.C., Niles E.G. Structure o f the transcription initiation and termination sequences of seven early genes in the vaccinia virus Hindlll D fragment. // Virology. 1988. -V. 163.-№ l.-P. 64-79.

131. Lin S., Broyles S.S. Vaccinia protein kinase 2: a second essential serine/threonine protein kinase encoded by vaccinia virus. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1994. - V. 91. - № 16. - P. 7653-7657.

132. Lin S., Chen W., Broyles S.S. The vaccinia virus B1R gene product is a serine/threonine protein kinase. // J.Virol. 1992. - V. 66. - № 5. - P. 27172723.

133. Liszewski M.K., Atkinson J.P. In: The Human Complement System in Health and Disease. New York-Basel-Hong Kong: Marcel Dekker, Inc., 1998. P. 149-165.

134. Lux S.E., John K.M., Bennett V. Analysis of cDNA for human erythrocyte ankyrin indicates a repeated structure with homology to tissue-differentiation and cell-cycle control proteins. // Nature. 1990. - V. 344. -№6261.-P. 36-42.

135. Maa J.S., Esteban M. Structural and functional studies of a 39,000-Mr immunodominant protein of vaccinia virus. // J.Virol. 1987. - V. 61. - № 12.-P. 3910-3919.

136. Maa J.S., Rodriguez J.F., Esteban M. Structural and functional characterization of a cell surface binding protein of vaccinia virus. // J.Biol.Chem. 1990. - V. 265. - № 3. - P. 1569-1577.

137. Manshande J.P., Kabaya w.R. Human monkeypox transmitted by a chimpanzee. // Lancet. 1983. - V. 1. - № 8333. - P. 1110-1 111.

138. Marennikova S.S., Seluhina E.M. Susceptibility of some rodent species to monkeypox virus, and course of the infection. // Bull.World Health Organ. 1976. - V. 53. - № 1. - P. 13-20.

139. Marennikova S.S., Seluhina E.M., Mal'ceva N.N., Cimiskjan K.L., Macevic G.R. Isolation and properties of the causal agent of a new variolalike disease (monkeypox) in man. // Bull.World Health Organ. 1972. - V. 46. - № 5. - P. 599-611.

140. Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Shenkman L.S. Role of the temperature of incubation of infected chick embryos in the differentiation of certain poxviruses according to pock morphology. // Acta Virol. 1973. - V. 17.-№4.-P. 362.

141. Martin K.H., Grosenbach D.W., Franke C.A., Hruby D.E. Identification and analysis of three myristylated vaccinia virus late proteins. // J.Virol. 1997. - V. 71. - № 7. - P. 5218-5226.

142. Martinez-Pomares L., Thompson J.P., Moyer R.W. Mapping and investigation of the role in pathogenesis of the major unique secreted 35-kDa protein of rabbitpox virus. // Virology. 1995. - V. 206. - № 1. - P. 591600.

143. Massague J., Pandiella A. Membrane-anchored growth factors. // Annu.Rev.Biochem. 1993. - V. 62. - P. 515-541.

144. Massung R.F., Liu L.I., Qi J., Knight J.C., Yuran T.E., Kerlavage A.R., Parsons J.M., Venter J.C., Esposito J.J. Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain Bangladesh-1975. // Virology. 1994. - V. 201. - № 2. - P. 215-240.

145. Matsuguchi T., Okamura S., Aso T., Sata T., Niho Y. Molecular cloning of the cDNA coding for proline-rich protein (PRP): identity of PRP as C4b-binding protein. // Biochem.Biophys.Res Commun. 1989. - V. 165. -№ 1. - P. 138-144.

146. Maxam A.M., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. // Methods Enzymol. 1980. - V. 65. - № 1. - P. 499- 560.

147. McConel SJ., Herman Y.F., Mattson D.E., Erickson L. Monkey pox disease in irradiated cynomolgus monkeys. // Nature. 1962. - V. 195. - P. 1128.

148. McFadden G., Kane K. How DNA viruses perturb functional MHC expression to alter immune recognition. // Adv.Cancer Res. 1994. - V. 63. -P. 117-209.

149. McGeoch D.J. Protein sequence comparisons show that the 'pseudoproteases' encoded by poxviruses and certain retroviruses belong to the deoxyuridine triphosphatase family. // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. -№ 14. - P. 4105-4110.

150. Mcintosh A.A., Smith G.L. Vaccinia virus glycoprotein A34R is required for infectivity of extracellular enveloped virus. // J.Virol. 1996. -V. 70.-№1.-P. 272-281.

151. Meis R.J., Condit R.C. Genetic and molecular biological characterization of a vaccinia virus gene which renders the virus dependent on isatin-beta-thiosemicarbazone (IBT). // Virology. 1991. - V. 182. - № 2. - P. 442-454.

152. Meyer H., Pfeffer M., Rziha H.J. Sequence alterations within and downstream of the A-type inclusion protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction. // J.Gen. Virol. 1994. -V. 75 (Pt8). - P. 1975-1981.

153. Meyer H., Ropp S.L., Esposito J.J. Gene for A-type inclusion body protein is useful for a polymerase chain reaction assay to differentiate orthopoxviruses. // J.Virol.Methods. 1997. - V. 64. -N2 2.- P. 217-221.

154. Meyer H., Rziha H.J. Characterization of the gene encoding the Atype inclusion protein of camelpox virus and sequence comparison with other orthopoxviruses. // J Gen.Virol. 1993. - V. 74 (Pt 8). - P. 1679-1684.

155. Milhaud C., Klein M., Virat J. Analyse d'un cas de variola du singe (monkey-pox) chez le chimpazee (Pan troglodytes). // Exp.Anim. 1969. -V. 2.-P. 121.

156. Moore J.B., Smith G.L. Steroid hormone synthesis by a vaccinia enzyme: a new type of virus virulence factor. // EMBO J. 1992. - V. 11.-№ 5. - P. 1973-1980.

157. Morgan J.R., Cohen L.K., Roberts B.E. Identification of the DNA sequences encoding the large subunit of the mRNA-capping enzyme of vaccinia virus. // J.Virol. 1984. - V. 52. - № 1. - P. 206-214.

158. Morgan J.R., Roberts B.E. Organization of RNA transcripts from a vaccinia virus early gene cluster. // J.Virol. 1984. - V. 51. - № 2. - P. 283297.

159. Mukinda V.B., Mwema G., Kilundu M., Heymann D.L., Khan A.S., Esposito J.J. Re-emergence of human monkeypox in Zaire in 1996. Monkeypox Epidemiologic Working Group. // Lancet. 1997. - V. 349. - № 9063.-P. 1449-1450.

160. Najarro P., Traktman P., Lewis J.A. Vaccinia virus blocks gamma interferon signal transduction: viral VH1 phosphatase reverses Statl activation. // J.Virol. 2001. - V. 75. - № 7. - P. 3185-3196.

161. Nakanishi Y., Kamijo R., Takizawa K., Hatori M., Nagumo M. Inhibitors of cyclooxygenase-2 (COX-2) suppressed the proliferation and differentiation of human leukaemia cell lines. // Eur.J Cancer. 2001. - V. 37. -№ 12. - P. 1570-1578.

162. Nakano J. H. Human poxvirus diseases and laboratory diagnosis, In L. M. de la Maza, and E. M. Peterson (ed.), Medical virology. Elsevier, New York, N.Y. 1985 - p. 125-147.

163. Nash P., Barrett J., Cao J.X., Hota-Mitchell S., Lalani A.S., Everett H., Xu X.M., Robichaud J., Hnatiuk S., Ainslie C., Seet B.T., McFadden G. Immunomodulation by viruses: the myxoma virus story. // Immunol.Rev. -1999. -V. 168. P. 103-120.

164. Neubauer H., Reischl U., Ropp S., Esposito J.J., Wolf H., Meyer H. Specific detection of monkeypox virus by polymerase chain reaction. // J.Virol.Methods. 1998. - V. 74. - № 2. - P. 201-207.

165. Ng A., Tscharke D.C., Reading P.C., Smith G.L. The vaccinia virus A41L protein is a soluble 30 kDa glycoprotein that affects virus virulence. // J.Gen. Virol. 2001. - V. 82. - № Pt 9. - P. 2095-2105.

166. Niles E.G., Seto J. Vaccinia virus gene D8 encodes a virion transmembrane protein. // J.Virol. 1988. - V. 62. - № 10. - P. 3772-3778.

167. Novick, D. Kim, S-H., Fantuzzi, G., Reznikov, L.L., Dinarello, C.A. and Rubinstein, M. Interleukin-18 Bind ing Protein: A Novel modulator of the Thl cytokine Response. // Immunity 1999 - 10- P. 127-136,

168. Palumbo G.J., Pickup D.J., Fredrickson T.N., Mclntyre L.J., Buller R.M. Inhibition of an inflammatory response is mediated by a 38-kDa protein of cowpox virus. // Virology. 1989. - V. 172. - № 1. - P. 262-273.

169. Panicali D., Paoletti E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1982. - V. 79.-№16.-P. 4927-4931.

170. Parkinson J.E., Sanderson C.M., Smith G.L. The vaccinia virus A38L gene product is a 33-kDa integral membrane glycoprotein. // Virology. -1995. V. 214. - № 1. - P. 177-188.

171. Parkinson J.E., Smith G.L. Vaccinia virus gene A36R encodes a M(r) 43-50 K protein on the surface of extracellular enveloped virus. // Virology. 1994. - V. 204. - № 1. - P. 376-390.

172. Patel A.H., Gaffney D.F., Subak-Sharpe J.H., Stow N.D. DNA sequence of the gene encoding a major secreted protein of vaccinia virus, strain Lister. // J Gen.Virol. 1990. - V. 71 ( Pt 9). - P. 2013-2021.

173. Pearson W.R., Lipman D.J. Improved tools for biological sequence comparison // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1988. V. 85. - N 8. - P. 2444 - 2448.

174. Perkus M.E., Goebel S.J., Davis S.W., Johnson G.P., Limbach K., Norton E.K., Paoletti E. Vaccinia virus host range genes. // Virology. 1990. -V. 179. -№1.- p. 276-286.

175. Peters J.K. A monkeypox-enzooty in the "Biljdorp" Zoo. // Tijdschr.Diergeneeskd. 1966. - V. 91. - P. 387.

176. Prier J.E., Sauer R.M., Malsberger R.G., Sillaman J.M. Studies on a pox disease on monkeys. II. Isolation of the etologic agent. // Am.J.Vet.Res. 1960.-V. 21.-P. 381.

177. Rajagopal I., Ahn B.Y., Moss B., Mathews C.K. Roles of vaccinia virus ribonucleotide reductase and glutaredoxin in DNA precursor biosynthesis. // J.Biol.Chem. 1995. - V. 270. - № 46. - P. 27415-27418.

178. Ramsey-Ewing A., Moss B. Restriction of vaccinia virus replication in CHO cells occurs at the stage of viral intermediate protein synthesis. // Virology. 1995. - V. 206. - № 2. - P. 984-993.

179. Ravanello M.P., Hruby D.E. Conditional lethal expression of the vaccinia virus L1R myristylated protein reveals a role in virion assembly. // J.Virol. 1994. - V. 68. - № 10. - P. 6401-6410.

180. Ray C.A., Black R.A., Kronheim S.R., Greenstreet T.A., Sleath P.R., Salvesen G.S., Pickup D.J. Viral inhibition of inflammation: cowpox virus encodes an inhibitor of the interleukin-1 beta converting enzyme. // Cell. -1992. V. 69. - № 4. - P. 597-604.

181. Reed K.D., Melski J.W., Graham M.B., Regnery R.L., Sotir M.J., Wegner M.V., Kazmierczak J.J., Stratman E.J., Li Y., Fairley J.A., Swain

182. G.R., Olson V.A., Sargent E.K., Kehl S.C., Frace M.A., Kline R., Foldy S.L., Davis J.P., Damon I.K. The detection of monkeypox in humans in the Western Hemisphere. // N.Engl.J Med. 2004. - V. 350. - № 4. - P. 342-350.

183. Reid K.B., Day A.J. Structure-function relationships of the complement components. // Immunol.Today. 1989. - V. 10. - № 6. - P. 177-180.

184. Reid K.B.M. The complement system: A major effector mechanism in humoral immunity // Immunologist- 1995- 3 P. 206-211

185. Rempel R.E., Traktman P. Vaccinia virus B1 kinase: phenotypic analysis of temperature-sensitive mutants and enzymatic characterization of recombinant proteins. // J.Virol. 1992. - V. 66. - № 7. - P. 4413-4426.

186. Resenchuk S.M., Blinov V.M. ALIGNMENT SERVICE: creation and processing of alignments of sequences of unlimited length. // Comput.Appl.Biosci. 1995. - V. 11. - № 1. - P. 7-11.

187. Rivas C., Gil J., Melkova Z., Esteban M., Diaz-Guerra M. Vaccinia virus E3L protein is an inhibitor of the interferon (i.f.n.)-induced 2-5A synthetase enzyme. // Virology. 1998. - V. 243. - № 2. - P. 406-414.

188. Rochester S.C., Traktman P. Characterization of the single-stranded DNA binding protein encoded by the vaccinia virus 13 gene. // J.Virol. -1998. V. 72. - № 4. - P. 2917-2926.

189. Rodriguez D., Esteban M., Rodriguez J.R. Vaccinia virus A17L gene product is essential for an early step in virion morphogenesis. // J.Virol. -1995. V. 69. - № 8. - P. 4640-4648.

190. Rodriguez J.F., Esteban M. Mapping and nucleotide sequence of the vaccinia virus gene that encodes a 14-kilodalton fusion protein. // J.Virol. -1987. V. 61. - № 11. - P. 3550-3554.

191. Rodriguez J.F., Kahn J.S., Esteban M. Molecular cloning, encoding sequence, and expression of vaccinia virus nucleic acid-dependent nucleoside triphosphatase gene. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1986. - V. 83.- № 24. P. 9566-9570.

192. Rollins B.J. Chemokines. // Blood. 1997. - V. 90. - № 3. - P. 909928.

193. Roper R.L., Moss B. Envelope formation is blocked by mutation of a sequence related to the HKD phospholipid metabolism motif in the vaccinia virus F13L protein. // J.Virol. 1999. - V. 73. - № 2. - P. 1108-1117.

194. Roper R.L., Payne L.G., Moss B. Extracellular vaccinia virus envelope glycoprotein encoded by the A33R gene. // J.Virol. 1996. - V. 70.- № 6. P. 3753-3762.

195. Roper R.L., Wolffe E.J., Weisberg A., Moss B. The envelope protein encoded by the A33R gene is required for formation of actin-containing microvilli and efficient cell-to-cell spread of vaccinia virus. // J.Virol. -1998. V. 72. - № 5. - P. 4192-4204.

196. Ropp S.L., Jin Q., Knight J.C., Massung R.F., Esposito J.J. PCR strategy for identification and differentiation of small pox and other orthopoxviruses. // J.Clin.Microbiol. 1995. - V. 33. - № 8. - P. 2069-2076.

197. Rosales R., Sutter G., Moss B. A cellular factor is required for transcription of vaccinia viral intermediate-stage genes. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1994. - V. 91. - № 9. - P. 3794-3798.

198. Rosel J., Moss B. Transcriptional and translational mapping and nucleotide sequence analysis of a vaccinia virus gene encoding the precursor of the major core polypeptide 4b. // J.Virol. 1985. - V. 56. - № 3. - P. 830838.

199. Roulston A., Reinhard C., Amiri P., Williams L.T. Early activation of c-Jun N-terminal kinase and p38 kinase regulate cell survival in response to tumor necrosis factor alpha. // J Biol.Chem. 1998. - V. 273. - № 17. - P. 10232-10239.

200. Rutherfurd K.J., Chen S.A., Shively J.E. Isolation and amino acid sequence analysis of bovine adrenal 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/steroid isomerase. // Biochemistry. 1991. - V. 30. - № 33. -P. 8108-8116.

201. Rychlik W, Rhoads RE. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA // Nucleic Acids Res. 1989 Nov 11;17(21):8543-51.

202. Sanderson C.M., Parkinson J.E., Hollinshead M., Smith G.L. Overexpression of the vaccinia virus A38L integral membrane proteinpromotes Ca2+ influx into infected cells. I IJ Virol. 1996. - V. 70. - № 2. -P. 905-914.

203. Sanz P., Moss B. Identification of a transcription factor, encoded by two vaccinia virus early genes, that regulates the intermediate stage of viral gene expression. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1999. - V. 96. - № 6. - P. 2692-2697.

204. Sarov I., Joklik W.K. Studies on the nature and location of the capsid polypeptides of vaccinia virions. // Virology. 1972. - V. 50. - № 2. - P. 579-592.

205. Sauer R.M., Prier J.E., Buchanan R.S., Creamer A.A., Fegley H.S. Studies on a pox disease of monkeys. I. Pathology. // Am.J.Vet.Res. 1960. -V. 21. - P. 377.

206. Schmitt J.F., Stunnenberg H.G. Sequence and transcriptional analysis of the vaccinia virus Hindlll I fragment. // J.Virol. 1988. - V. 62. - № 6. -P. 1889-1897.

207. Schwarz D.A., Katayama C.D., Hedrick S.M. Schlafen, a new family of growth regulatory genes that affect thymocyte development. // Immunity. 1998. - V. 9. - № 5. - P. 657-668.

208. Seet B.T., McCaughan C.A., Handel T.M., Mercer A., Brunetti C.,

209. McFadden G., Fleming S.B. Analysis of an orf virus chemokine-binding protein: Shifting ligand specificities among a family of poxvirus viroceptors. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. V. 100. - № 25. - P. 15137-15142.

210. Seki M., Oie M., Ichihashi Y., Shida H. Hemadsorption and fusion inhibition activities of hemagglutinin analyzed by vaccinia virus mutants. // Virology. 1990. - V. 175. - № 2. - P. 372-384.

211. Senkevich T.G., Koonin E.V., Buller R.M. A poxvirus protein with a RING zinc finger motif is of crucial importance for virulence. // Virology. -1994. -V. 198. -№ 1. P. 118-128.

212. Senkevich T.G., Weisberg A.S., Moss B. Vaccinia virus El OR protein is associated with the membranes of intracellular mature virions and has a role in morphogenesis. // Virology. 2000. - V. 278. - № 1. - P. 244-252.

213. Seregin S.V., Babkina I.N., Nesterov A.E., Sinyakov A.N., Shchelkunov S.N. Comparative studies of gamma-interferon receptor-like proteins of variola major and variola minor viruses. // FEBS Lett. 1996. -V. 382. - № 1-2. - P. 79-83.

214. Shchelkunov S.N., Blinov V.M., Sandakhchiev L.S. Genes of variola and vaccinia viruses necessary to overcome the host protective mechanisms. // FEBS Lett. 1993a. - V. 319. - № 1-2. - P. 80-83.

215. Shchelkunov S.N., Blinov V.M., Sandakhchiev L.S. Ankyrin-like proteins of variola and vaccinia viruses. // FEBS Lett. 19936. - V. 319. -№ 1-2. - P. 163-165.

216. Shida H. Nucleotide sequence of the vaccinia virus hemagglutinin gene. // Virology. 1986. - V. 150. - № 2. - P. 451-462.

217. Shida H., Tanabe K., Matsumoto S. Mechanism of virus occlusion into A-type inclusion during poxvirus infection. // Virology. 1977. - V. 76. - № 1.-P. 217-233.

218. Shors T., Keck J.G., Moss B. Down regulation of gene expression by the vaccinia virus D10 protein. // J.Virol. 1999. - V. 73. - № 1. - P. 791796.

219. Shuman S. Vaccinia virus RNA helicase: an essential enzyme related to the DE-H family of RNA-dependent NTPases. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1992. - V. 89. - № 22. - P. 10935-10939.

220. Shuman S., Morham S.G. Domain structure of vaccinia virus mRNA capping enzyme. Activity of the Mr 95,000 subunit expressed in Escherichia coli. // J.Biol.Chem. 1990. - V. 265. - № 20. - P. 11967-11972.

221. Shuman S., Moss B. Identification of a vaccinia virus gene encoding a type I DNA topoisomerase. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1987. - V. 84. -№21. - P. 7478-7482.

222. Simpson D.A., Condit R.C. Vaccinia virus gene A18R encodes an essential DNA helicase. // J.Virol. 1995. - V. 69. - № 10. - P. 6131-6139.

223. Smith G.L. Vaccinia virus glycoproteins and immune evasion. The sixteenth Fleming Lecture. // J.Gen.Virol. 1993. - V. 74 ( Pt 9). - P. 17251740.

224. Smith G.L., Chan Y.S. Two vaccinia virus proteins structurally related to the interleukin-1 receptor and the immunoglobulin superfamily. // J.Gen.Virol. 1991. - V. 72 ( Pt 3). - P. 511-518.

225. Smith G.L., Chan Y.S., Kerr S.M. Transcriptional mapping and nucleotide sequence of a vaccinia virus gene encoding a polypeptide with extensive homology to DNA ligases. // Nucleic Acids Res. 1989. - V. 17. -№22. - P. 9051-9062.

226. Smith G.L., de Carlos A., Chan Y.S. Vaccinia virus encodes a thymidylate kinase gene: sequence and transcriptional mapping. // Nucleic Acids Res. 1989. - V. 17. - № 19. - P. 7581-7590.

227. Smith G.L., Howard S.T., Chan Y.S. Vaccinia virus encodes a family of genes with homology to serine proteinase inhibitors. // J.Gen.Virol. -1989. V. 70 (Pt 9). - P. 2333-2343.

228. Spehner D., Gillard S., Drillien R., Kirn A. A cowpox virus gene required for multiplication in Chinese hamster ovary cells. // J.Virol. 1988. -V. 62.-№4.-P. 1297-1304.

229. Spriggs M.K. Shared resources between the neural and immune systems: semaphorins join the ranks. // Curr.Opin.Immunol. 1999. - V. 11. - № 4. - P. 387-391.

230. Spriggs M.K., Hruby D.E., Maliszewski C.R., Pickup D.J., Sims J.E., Buller R.M., VanSlyke J. Vaccinia and cowpox viruses encode a novelsecreted interleukin-1 -binding protein. // Cell. 1992. - V. 71. - № 1. - P. 145-152.

231. Stuart D.T., Upton C., Higman M.A., Niles E.G., McFadden G. A poxvirus-encoded uracil DNA glycosylase is essential for virus viability. // J.Virol. 1993. - V. 67. - № 5. - P. 2503-2512.

232. Symons J.A., Alcami A., Smith G.L. Vaccinia virus encodes a soluble type I interferon receptor of novel structure and broad species specificity. // Cell. 1995. - V. 81. - № 4. - P. 551-560.

233. Takahashi T., Oie M., Ichihashi Y. N-terminal amino acid sequences of vaccinia virus structural proteins. // Virology. 1994. - V. 202. - № 2. - P. 844-852.

234. Tamagnone L., Comoglio P.M. Signalling by semaphorin receptors: cell guidance and beyond. // Trends Cell Biol. 2000. - V. 10. - № 9. - P. 377-383.

235. Tengelsen L.A., Slabaugh M.B., Bibler J.K., Hruby D.E. Nucleotide sequence and molecular genetic analysis of the large subunit ofribonucleotide reductase encoded by vaccinia virus. // Virology. 1988. - V. 164.-№ l.-P. 121-131.

236. Tracey K.J., Cerami A. Tumor necrosis factor: a pleiotropic cytokine and therapeutic target. // Annu.Rev.Med. 1994. - V. 45. - P. 491-503.

237. Traktman P., Caligiuri A., Jesty S.A., Liu K., Sankar U. Temperature-sensitive mutants with lesions in the vaccinia virus F10 kinase undergo arrest at the earliest stage of virion morphogenesis. // J.Virol. 1995. - V. 69. -№ 10.-P. 6581-6587.

238. Turner P.C., Baquero M.T., Yuan S., Thoennes S.R., Moyer R.W. The cowpox virus serpin SPI-3 complexes with and inhibits urokinase-type and tissue-type plasminogen activators and plasmin. // Virology. 2000. - V. 272. - № 2. - P. 267-280.

239. Ueda Y., Morikawa S., Matsuura Y. Identification and nucleotide sequence of the gene encoding a surface antigen induced by vaccinia virus. // Virology. 1990. - V. 177. - № 2. - P. 588-594.

240. Upton C., Macen J.L., Schreiber M., McFadden G. Myxoma virus expresses a secreted protein with homology to the tumor necrosis factor receptor gene family that contributes to viral virulence. // Virology. 1991. -V. 184.-№ l.-P. 370-382.

241. Upton C., Macen J.L., Wishart D.S., McFadden G. Myxoma virus and malignant rabbit fibroma virus encode a serpin-like protein important for virus virulence. // Virology. 1990. - V. 179. - № 2. - P. 618-631.

242. Upton C., Schiff L., Rice S.A., Dowdeswell T., Yang X., McFadden G. A poxvirus protein with a RING finger motif binds zinc and localizes in virus factories. // J Virol. 1994. - V. 68. - № 7. - P. 4186-4195.

243. Van Meir E., Wittek R. Fine structure of the vaccinia virus gene encoding the precursor of the major core protein 4 a. // Arch.Virol. 1988. -V. 102. -№ 1-2. - P. 19-27.

244. Varich N.L., Sychova I.V., Kaverin N.V., Antonova T.P., Chernos V.I. Transcription of both DNA strands of vaccinia virus genome in vivo. // Virology. 1979. - V. 96. - № 2. - P. 412-430.

245. Wang S., Shuman S. Vaccinia virus morphogenesis is blocked by temperature-sensitive mutations in the F10 gene, which encodes protein kinase 2. // J.Virol. 1995. - V. 69. - № 10. - P. 6376-6388.

246. Wang S.P., Shuman S. A temperature-sensitive mutation of the vaccinia virus El 1 gene encoding a 15-kDa virion component. // Virology. -1996. V. 216. - № 1. - P. 252-257.

247. Watson J.C., Chang H.W., Jacobs B.L. Characterization of a vaccinia virus-encoded double-stranded RNA-binding protein that may be involved in inhibition of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. // Virology. 1991.-V. 185.-№1.-P. 206-216.

248. Weinrich S.L., Hruby D.E. A tandemly-oriented late gene cluster within the vaccinia virus genome. // Nucleic Acids Res. 1986. - V. 14. - № 7.-P. 3003-3016.

249. Weir J.P., Moss B. Nucleotide sequence of the vaccinia virus thymidine kinase gene and the nature of spontaneous frameshifit mutations. // J.Virol. 1983. - V. 46. - № 2. - P. 530-537.

250. Wenner H.A., Bolano C.R., Cho C.T., Kamitsuka P.S. Studies on the pathogenesis of monkey pox. 3. Histopathological lesions and sites of immunofluorescence. // Arch.Gesamte Virusforsch. 1969. - V. 27. - № 2. -P. 179-197.

251. Wenner H.A., Cho C.T., Bolano C.R., Kamitsuka P.S. Studies on the pathogenesis of monkey pox. II. Dose-response and virus dispersion. // Arch.Gesamte Virusforsch. 1969. - V. 27. - № 2. - P. 166-178.

252. Wenner H.A., Macasaet F.D., Kamitsuka P.S., Kidd P. Monkey pox. I. Clinical, virologic and immunologic studies. // Am .J.Epidemiol. 1968. - V. 87. -№3. - P. 551-566.

253. Whitaker-Dowling P., Youngner J.S. Characterization of a specific kinase inhibitory factor produced by vaccinia virus which inhibits the interferon-induced protein kinase. // Virology. 1984. - V. 137. - № 1. - P. 171-181.

254. White C.L., Weisberg A.S., Moss B. A glutaredoxin, encoded by the G4L gene of vaccinia virus, is essential for virion morphogenesis. // J.Virol.- 2000. V. 74. - № 19. p. 9175-9183.

255. Whitehead S.S., Hruby D.E. A transcriptionally controlled trans-processing assay: putative identification of a vaccinia virus-encoded proteinase which cleaves precursor protein P25K. // J.Virol. 1994. - V. 68. -№ 11.-P. 7603-7608.

256. Williams O., Wolffe E.J., Weisberg A.S., Merchlinsky M. Vaccinia virus WR gene A5L is required for morphogenesis of mature virions. // J.Virol. 1999. - V. 73. - № 6. - P. 4590-4599.

257. Wittek R., Menna A., Muller H.K., Schumperli D., Boseley P.G., Wyler R. Inverted terminal repeats in rabbit poxvirus and vaccinia virus DNA.//J.Virol. 1978.-V. 28. - № l.-P. 171-181.

258. Wittek R., Moss B. Tandem repeats within the inverted terminal repetition of vaccinia virus DNA. // Cell. 1980. - V. 21. - № l.-P. 277284.

259. Wolffe E.J., Isaacs S.N., Moss B. Deletion of the vaccinia virus B5R gene encoding a 42-kilodalton membrane glycoprotein inhibits extracellular virus envelope formation and dissemination. // J.Virol. 1993. - V. 67. - № 8.-P. 4732-4741.

260. Wolffe E.J., Katz E., Weisberg A., Moss B. The A34R glycoprotein gene is required for induction of specialized actin-containing microvilli and efficient cell-to-cell transmission of vaccinia virus. // J.Virol. 1997. - V. 71.- № 5. P. 3904-3915.

261. Wolffe E.J., Moore D.M., Peters P.J., Moss B. Vaccinia virus A17L open reading frame encodes an essential component of nascent viralmembranes that is required to initiate morphogenesis. 11 J Virol. 1996. - V. 70. - № 5. - P. 2797-2808.

262. Wolffe E.J., Weisberg A.S., Moss B. Role for the vaccinia virus A36R outer envelope protein in the formation of virus-tipped actin-containing microvilli and cell-to-cell virus spread. // Virology. 1998. - V. 244. - № 1. -P. 20-26.

263. Xiang Y., Simpson D.A., Spiegel J., Zhou A., Silverman R.H., Condit R.C. The vaccinia virus A18R DNA helicase is a postreplicative negative transcription elongation factor. // J.Virol. 1998. - V. 72. - № 9. - p. 70127023.

264. Xue F., Cooley L. kelch encodes a component of intercellular bridges in Drosophila egg chambers. // Cell. 1993. - V. 72. - № 5. - P. 681-693.

265. Yang W.P., Kao S.Y., Bauer W.R. Biosynthesis and post-translational cleavage of vaccinia virus structural protein VP8. // Virology. 1988. - V. 167. - № 2. - P. 585-590.

266. Zajac P., Spehner D., Drillien R. The vaccinia virus J5L open reading frame encodes a polypeptide expressed late during infection and required for viral multiplication. // Virus Res. 1995. - V. 37. - № 2. - P. 163-173.

267. Zhang W.H., Wilcock D., Smith G.L. Vaccinia virus F12L protein is required for actin tail formation, normal plaque size, and virulence. // J.Virol. 2000. - V. 74. - № 24. - P. 11654-11662.

268. Zhang Y., Ahn B.Y., Moss B. Targeting of a multicomponent transcription apparatus into assembling vaccinia virus particles requires RAP94, an RNA polymerase-associated protein. // J Virol. 1994. - V. 68. -№3. - P. 1360-1370.

269. Zhang Y., Moss B. Immature viral envelope formation is interrupted at the same stage by lac operator-mediated repression of the vaccinia virus D13L gene and by the drug rifampicin. // Virology. 1992. - V. 187. - № 2. -P. 643-653.

270. Ziegler D.W., Hutchinson H.D., Koplan J.P., Nakano J.H. Detection by radioimmunoassay of antibodies in human smallpox patients and vaccinees. // J.Clin.Microbiol. 1975. - V. 1. - № 3. - P. 311-317.

Информация о работе

Уварова, Елена Александровна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Секвенирование и анализ генома вируса оспы обезьян - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Секвенирование и анализ генома вируса оспы обезьян ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Секвенирование и анализ генома вируса оспы обезьян"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Уварова, Елена Александровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Секвенирование и анализ генома вируса оспы обезьян"

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Уварова, Елена Александровна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Уварова, Елена Александровна, Кольцово

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Секвенирование и анализ генома вируса оспы обезьян
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология