Иммунобиологическая характеристика вакцинных и вирулентных штаммов вирусов оспы овец и оспы коз

Кукушкина, Мария Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунобиологическая характеристика вакцинных и вирулентных штаммов вирусов оспы овец и оспы коз
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологическая характеристика вакцинных и вирулентных штаммов вирусов оспы овец и оспы коз"

На правахр\

КУК> ШКИНА Мария Сергеевна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАКЦИННЫХ И ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ВИРУСОВ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ коз

03.00.06 Вир>сотоп1я

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание \ченой степени кандидата биоюшческнх на_\ к

00317221а

Владнчнр-2008

003172219

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г Владимир)

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник ДИЕВ Вячеслав Иванович

Официальные ошюпешы - доктор биологических наук, профессор

СТРИЖАКОВ Александр Анатольевич

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН (ГНУ ВНИИВВиМ), г Покров Владимирской обл

- доктор биологических наук, профессор ЕРЕМЕЦ Владимир Иванович ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и 1ехнологический институт биологической промышленности» (ГНУ «ВНИТИБП»), г Щелково Московской обл

Ведущая организация Г НУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко» (ГНУ «ВИЭВ»), г Москва

Защита диссершции состоится « 24 » июня 2008г в К) часов на заседании диссертационного совсы Д 220 015 01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу 600901, г Владимир, мкр Юрьевец

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья живошых»

Автореферагразослан « 22 » мая 2008г

Ученый секрсырь по защите доморскнх и кандидатских диссертации кандидат биологических наук.

старший научный сотрудник

Г М Семенова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Оспу овец и оспу коз относят к особо опасным болезням животных, способным вызвать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб По классификации МЭБ до 2004 года они относились к списку «А», а в соответствии с новой классификацией они включены в список болезней МЭБ, подлежащих обязательному уведомлению, в категорию «Болезни овец и коз» В последние годы оспу овец и оспу коз стали рассматривать как две самостоятельные болезни По современной классификации, возбудители этих болезней ДНК - содержащие вирусы sheeppoxvirus и goatpoxvirus входят в род Capnpoxvirus семейства Poxviridae Считают, что возбудители оспы овец (BOO) и оспы коз (ВОК) состоят в близком генетическом, антигенном и серологическом родстве, но по патогенное™ обладают строгой видовой специфичностью и являются отдельными таксономическими видами [В H Сюрин и др ,1998]

Оспа овец и оспа коз эндемичны на Ближнем Востоке, в Центральной и Южной Азии, Китае, а также в Центральной и Северной Африке По данным Международного эпизоотического бюро, в 1996-2007 гг неблагополучными по этим заболеваниям были 55 стран, в том числе семь стран СНГ, в России оспа мелких жвачных регистрировалась в 1994-2000 гг и 2002-2003гг [В M Захаров и др ,2003, В И Ди-ев и др ,2004, OIE 1996-2004]

Несмотря на то, что каприпоксвирусы преимущественно поражают свой вид животных-хозяев, жестко детерминированной специфичностью они не обладают и способны инфицировать гетерологичные виды животных Описана способность штаммов BOO и ВОК в экспериментальных условиях вызывать заболевание как у овец, так и у коз [В H Сюрин и др,1998, ДВ Грачев,2006, Davies F G ,Otema С , 1981, Kitching R P, 1989]

Способность каприпоксвирусов относительно легко преодолевать межвидовые барьеры и сходство клинических признаков вызываемых ими заболеваний у мелких жвачных животных делают недостаточной диагностику оспы овец, оспы коз и нодулярного дерматита КРС (бугорчатки) на основании только клинических данных, вызывают необходимость разработки лабораторных методов видовой дифференциации вирусов

Как показали недавние исследования, идентичность полных нуклеотидных последовательностей генома каприпоксвирусов составляет 97% [Е С Орлова и др ,2004-2006, Bhat Р Р ,1998] Чрезвычайно близкое родство не позволяет различать каприпоксвирусы вирусологическими и серологическими методами Видовую дифференциацию каприпоксвирусов до недавнего времени удавалось проводить только рестрикционным картированием или секвенированием геномной ДНК [Е С Орлова и др ,2004-2006, Black D N et al ,1986, Bhat P P et al ,1998]

В то же время эпизоотологические наблюдения показали, что оспа возникала неоднократно среди коз, привитых против оспы овец, в то время как заболевания среди вакцинированных овец не регистрировали [И Т Сатторов и др ,2003]

В связи с этим изучение иммунобиологических характеристик вакцинных и вирулентных штаммов вирусов оспы овец и оспы коз имеет как научное, так и практическое значение

Цели и задачи исследования Основная цель данных исследований заключалась в сравнительном изучении иммунобиологических характеристик вакцинных, вирулентных штаммов и полевых изолятов вирусов оспы овец и оспы коз

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- дать сравнительную характеристику иммунобиологических свойств штаммов вирусов оспы овец и оспы коз, хранящихся в музее ФГУ «ВНИИЗЖ»,

- выделить и изучить иммунобиологические свойства полевых изолятов вирусов оспы овец и оспы коз при возникновении оспы мелких жвачных на территории Российской Федерации и стран СНГ,

- изучить особенности репродукции вирусов оспы овец и оспы коз в первичных и перевиваемых культурах клеток и провести поиск наиболее технологичных и производительных систем культивирования этих вирусов,

- разработать методы получения препаратов для диагностики оспы овец и оспы коз, а также выявления антител в крови животных,

- изучить на восприимчивых животных и в серологических реакциях степень антигенного родства между каприпоксвирусами - вирусами оспы овец, оспы коз и нодулярного дерматита КРС, а также с вирусами оспы крупного рогатого скота, свиней, лошадей и верблюдов,

- определить уровень поствакцинальных и постинфекционных антител в крови овец против вирусов оспы овец и оспы коз,

- изучить устойчивость вакцинированных и не вакцинированных овец и коз к перекрестному заражению

Научная повита исследований В результате проведенных исследований

- изучены иммунобиологические свойства выделенных в 2003 году штаммов «Приморский 2003» и «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз,

- дана сравнительная характеристика иммунобиологических свойств штаммов вирусов оспы овец и коз,

- изучены особенности репродукции вирусов оспы овец и оспы коз в первичных и перевиваемых культурах клеток и отработана технология получения их в культурах клеток гонад козы (КГ-91), трофоварианте культуры клеток гонад козы (ГК), производственной линии клеток ВНК-21 стационарным, роллерным и суспензионным методами,

- изучены на восприимчивых животных и в серологических реакциях степень антигенного родства между вирусами оспы овец, оспы коз и нодулярного дерматита КРС, а также с вирусами оспы КРС, свиней, лошадей и верблюдов,

- экспериментально оценена устойчивость вакцинированных и непривитых овец и коз к перекрестному заражению вирусами оспы овец и оспы коз,

- определено влияние длительного хранения на биологическую активность вирусов оспы овец и оспы коз ■ -

Практическая значимость исследований Практическое значение работы состоит в том, что производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз после изучения иммунобиологических свойств был депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14 06 2006г ), - контрольный штамм «Приморский 2003» вируса оспы коз после изучения был депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14 06 2006г)

Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» методические рекомендации

- «Методические указания по получению гипериммунной сыворотки крови для диагностики оспы коз», 2006 г ,

- «Методические указания по диагностике оспы коз методом постановки реакции длительного связывания комплемента», 2006 г,

- «Методические рекомендации по стационарному и роллерному культивированию аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы коз», 2006 г ,

- «Методические рекомендации по оценке иммуногенной активности вирус-вакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» и ассоциированной вакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003», 2006 г

Результаты научных исследований вошли в следующие нормативные документы

- СТО «Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая» утвержденный заместителем руководителя Россельхознадзора 07 08 2007 г ,

- СТО «Набор для диагностики оспы овец иммуноферментным методом», утвержденный заместителем руководителя Россельхознадзора 21 04 2008 г ,

- СТО «Набор препаратов для диагностики оспы овец в реакциях длительного связывания комплемента и диффузионной преципитации», утвержденный заместителем руководителя Россельхознадзора 21 04 2008 г

Основные положения, выносимые на защиту

- иммунобиологические свойства штаммов вирусов оспы овец и коз,

- иммунобиологические свойства выделенных в 2003 году вирулентного «Приморский 2003» и вакцинного «ВНИИЗЖ 2003» штаммов вируса оспы коз,

- особенности репродукции вирусов оспы овец и оспы коз в первичных и перевиваемых культурах клеток стационарным, роллерным и суспензионным методами,

- устойчивость вакцинированных животных к перекрестному заражению вирусами оспы овец и коз,

- антигенное родство между вирусами оспы овец, оспы коз, нодулярного дерматита КРС и оспы других видов животных

Публикация научных исследований По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в т ч 1 работа в издании по перечню ВАК

Апробация работы Материалы диссертации доложены и опубликованы на научных конференциях «Роль ветеринарной науки в развитии животноводства» (Алматы, 2000), «Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота» (ФГУ ВНИИЗЖ, 2002), «ВУЗ и АПК задачи, проблемы и пути решения» (Махачкала, 2002), «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе, 2003), а также доложены на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2000-2007гг

Личный вклад соискателя Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно Отдельные этапы выполнены совместно с к б н Т И Корпусовой, к в н Д К Басовой, Г А Блотовой, к в н Н В Мороз, за что автор выражает им сердечную благодарность

Структура и объем работы Диссертация изложена на 157 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения Список литературы включает 164 источника, в том числе 71 на русском языке Работа иллюстрирована 8 рисунками и 41 таблицей

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2 1. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

Вирусы В работе использованы следующие штаммы вирусов

- вирусы оспы овец эпизоотический контрольный штамм «Афганский» в виде органно-тканевого лиофилизированного материала с инфекционной активностью 5,33 ИД50/0,5 см3, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ», полученный в перевиваемой культуре клеток гонад козы (КГ-91), титр 5,0-6,0 ИД5()/см3 лиофилизированный,

- вирусы оспы коз вирулентный штамм «Ре11ог» в виде органно-тканевого лиофилизированного материала с инфекционной активностью 7,0 ^ ИД50/0,5 см3, производственный контрольный штамм «Приморский 2003», органно-тканевой лиофилизированный с инфекционной активностью 7,1 ^ ИД50/0,5 см3, произведет-

венный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003», полученный в перевиваемой культуре клеток гонады козы (КГ-91), лиофилизированный, титр 5,5-7,0 lg ИД50/см3,

- вирус оспы КРС штамм Cowpox, лиофилизированный, расплодка на культуре клеток куриных эмбрионов, титр 5,0 Ig ТЩЬс/см3, получен в 1981 г,

- вирус оспы лошадей штамм МНР-76, лиофилизированный, выделен от лошадей в 1976 году, в Монголии, расплодка на культуре клеток ГШ, титр 5,0 lg ТЦД50/см3,

- вирус нодулярного дерматита (бугорчатки) крупного рогатого скота вирулентный штамм «Эфиопский»

Животные В работе использованы овцы романовской породы (93 гол ), беспородные козы и их помеси с зааненской породой (68 гол), крупный рогатый скот 12-месячного возраста (6 гол), а также морские свинки и кролики породы «Шиншилла» массой 2,0-2,5 кг

Культуры клеток На различных этапах работы были использованы следующие культуры клеток первичная культура клеток почки овцы, перевиваемые клеточные культуры почки обезьяны Vero, Marc-145 (клоновый вариант клеток почки эмбриона макаки - резус МА-104), почки сирийского хомячка (ВНК-21), гонады козы (КГ-91), почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки теленка (MDBK), почки эмбриона свиньи (СПЭВ)

Питательные среды При культивировании первичных и перевиваемых культур клеток использовали питательные среды Игла, ПСС, 199 по стандартной прописи с добавлением 5-10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и содержанием 50 мкг/ см3 гентамицина, 2,5 мг/л амфотерицина В и 0,3 мг/ см3 глю-тамина

Культивирование вирусов оспы овец и коз Культивирование вирусов оспы овец и коз проводили на культурах клеток стационарным, роллерным и суспензионным методами

Для культивирования вирусов оспы овец и коз стационарным способом на перевиваемых культурах клеток использовали 48-72-часовой монослой культуры, выращенный в клинских матрасах в стационарных условиях

Для роллерного культивирования культуру клеток выращивали в 3-х литровых бутылях с использованием среды Игла с 5-10 % нормальной сыворотки КРС, 50 мкг/мл гентамицина, 0,03% глютамина

Для суспензионного культивирования использовали культиваторы КС-40 с рабочим объемом суспензии 10-15 литров Исходная концентрация клеток составляла 1,3-1,7 млн/см3 Культуру клеток инфицировали вирусом в дозе 0,01, 0,1 и 1,0 ТЦД50/кл, рН вирусной суспензии поддерживали в интервале 7,0-7,2

Репродуктивную активность вируса оценивали по времени появления ЦПД, интенсивности его развития и титру накопления вируса

Определение инфекционной активности вирусов оспы овей, и оспы коз Определение титра инфекционности вирусов оспы овец и оспы коз производили путем титрования на перевиваемой культуре клеток гонад козы Титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД50/см3

Изучение клинических признаков оспы при экспериментальном заражении овец и коз Клинический осмотр инфицированных и контрольных животных проводили по общепринятой методике При осмотре места введения вирусов оспы овец и оспы коз учитывали наличие утолщения кожи, местной гиперемии и других изменений в этой области Патологоанатомическое вскрытие проводили по общепринятой методике с описанием состояния всех органов и систем организма

Получение антигена для серологических и вирусологических исследований Антигены вирусов оспы овец и оспы коз получали путем культивирования их на культуре клеток гонад козы КГ-91 или после инфицирования ими естественно восприимчивых животных (овец и коз) и дальнейшего концентрирования антигена в 100 - 300 раз

Получение гипериммунной сыворотки для серологических и вирусологических исследований Специфическую сыворотку к вирусу оспы овец получали согласно «Методике получения гипериммунной сыворотки против оспы овец» (ВНИ-ИЗЖ, 2002) Специфическую сыворотку к вирусу оспы коз получали по разработанной нами методике путем трехкратной гипериммунизации предварительно вакцинированных или переболевших коз с использованием антигена, полученного на культуре клеток гонад козы или вирулентного тканевого вируса оспы коз и трех-

кратной гипериммунизации кроликов очищенным и концентрированным культу-ральным антигеном вируса оспы коз

Статистическая обработка полученных результатов При статистической обработке результатов исследований были использованы общепринятые методы, рекомендованные Гланцем С (1999) и другими авторами, а также компьютерная программа Microsoft Office Excel 2003

2 2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2 2 1 Анализ эпизоотической ситуации по оспе овец и коз в мире и Российской Федерации

Анализ неблагополучных стран по оспе овец и оспе коз в 1996-2006 гг по официальным данным МЭБ показал, что наибольшее количество неблагополучных по оспе овец и оспе коз государств приходится на Азию и Африку Наличие оспы овец и оспы коз ежегодно отмечают в 10-15 африканских государствах и в 9-17 странах Юго-Восточной Азии Из европейских стран оспа овец и оспа коз регистрировалась только в странах Балканского полуострова (Болгария, Греция и Турция) Из стран СНГ за указанный период неблагополучными по оспе овец и оспе коз являлись Россия, Грузия, Азербайджан, Казахстан, Киргизия, Туркменистан, Таджикистан, Узбекистан К настоящему времени свободными от оспы овец и оспы коз остаются страны Америки, Австралия и Океания

Анализ вспышек оспы среди овец и коз в мире по видам заболевших животных в 1996-2004 гг свидетельствует, что наиболее часто в неблагополучных по оспе странах заболевали овцы (около 35% стран), а также овцы и козы (50-60% стран) Вспышки оспы только среди коз регистрировали практически ежегодно в государствах, составляющих 2-6% от общего количества стран, неблагополучных по оспе

Оспа мелкого рогатого скота в течение 1993-1999 гг в России отмечалась ежегодно В течение этих лет было зарегистрировано 85 очагов оспы в различных регионах Российской Федерации преимущественно среди овец, с общим количеством заболевших 17295, из которых пало 10773 Летальность составила 68,55%

В течение 2000, 2002 и 2003 гг заболевание среди овец и коз оспой установлено в Астраханской области, Приморском крае и Еврейской автономной области В эти годы отмечалось 18 очагов оспы среди овец и коз с общим количеством забо-

левших 1096, из которых пало 589 животных Летальность составила 53,7% В 2001, 2004, 2005-2007 гг наличие оспы овец и оспы коз на территории России не регистрировали

2 2 2. Изучение иммунобиологических свойств известных штаммов вирусов оспы овец и коз

Вопросы дифференциальной диагностики оспы овец и оспы коз, изучения инфекционной патологии, вызываемой этими вирусами при перекрестном заражении животных, являются актуальной проблемой

С этой целью нами были проведены сравнительные исследования иммунобиологических свойств некоторых штаммов и полевых изолятов вирусов оспы овец и коз

Для изучения культуральных свойств этих штаммов использовали первичную культуру почки овцы (ПО) и перевиваемые культуры клеток КГ-91, ПСГК, ППК, MDBK, СПЭВ, Vero, ВНК-21, Магс-145, ЭН Репродуктивную активность вируса оценивали по времени появления ЦПД, интенсивности его развития и титру накопления вируса Было установлено, что чувствительными является только первичная культура почки овцы и перевиваемые культуры клеток гонад козы КГ-91 и ВНК-21

В первичной культуре клеток ПО штаммы «Афганский» и «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец вызывали характерное ЦПД, титр вируса составлял 4,75-5,0 lg ТЦД50/СМ3 В перевиваемых культурах клеток КГ-91 и ВНК-21 вирус также репродуцировался с появлением специфичного ЦПД, титр вируса составлял 6,0 и 3,5 lg ТЦД50/СМ3, соответственно Вирулентный штамм «Pellor» вируса оспы коз в перевиваемой культуре клеток гонад козы КГ-91 накапливался до 6,25 lg ТЦД50/СМ3

Изучение клинических признаков оспы проводили при экспериментальном заражении овец и коз У двух овец, зараженных вирулентным вирусом оспы овец штамм «Афганский», болезнь проявилась на 3 сутки и характеризовалась повышением температуры тела, образованием ярко-красного плотного отека кожи в месте введения вируса с последующим развитием тяжелой генерализованной формы Овцы, оставались больными в течение 14 дней (срок наблюдения)

Козы, инфицированные штаммом «Афганский», на заражение реагировали только непродолжительной гипертермией и кожной реакцией в месте введения вируса

У овец и коз, привитых вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец температурная реакция и какие-либо клинические признаки отсутствовали

У двух зараженных штаммом «Pellor» коз на 7-8 сутки регистрировали подъем температуры тела до 40,6-41,1°С и на 11 и 17 сутки эти животные погибли У зараженной овцы на 6-7 сутки после заражения температура тела поднялась до 40,4-40,6°С и наблюдалась незначительная местная реакция в виде гиперемии

Таким образом, было показано, что вирулентные штаммы вирусов оспы овец и оспы коз имеют различную степень патогенности для гомологичного и гетероло-гичного видов животных

2.2 3. Идентификация полевых изолятов вирусов оспы овец и коз В течение 2002-2003 гг с подозрением на оспу овец и оспу коз в ФГУ «ВНИИЗЖ» поступали пробы патологического материала и сыворотки крови из Приморского края и Еврейской АО - Российской Федерации, а также Республики Таджикистан

Во всех случаях в ФГУ «ВНИИЗЖ» при подозрении на оспу овец и коз исследования проб проводили комплексным методом, т е путем заражения культуры клеток КГ-91, определением специфической активности в серологических реакциях, постановкой ПЦР и, в отдельных случаях, биопробой

В течение 2002-2003 гг в результате проведенных исследований в двух случаях был обнаружен вирус оспы овец и в двух случаях - вирус оспы коз

При заражении перевиваемой культуры клеток гонады козы патологическим материалом отмечали наличие ЦДП Вирус оспы коз, выделенный из проб патологического материала, присланного в 2003 году из Еврейской АО, был изучен, комиссионно испытаны его иммунобиологические свойства и штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» под наименованием «Приморский 2003»

Кроме патологического материала из хозяйств, где было подозрение на оспу овец и коз, также доставляли сыворотки крови от больных и переболевших животных, в которых обнаруживали специфические антитела к вирусам оспы овец и коз

Результаты этих исследований показали, что сыворотки крови овец и коз, содержащие антитела к вирусу оспы коз, активнее реагировали с гомологичным вирусом оспы коз, чем с гетерологичным вирусом оспы овец

2 2 4 Изучение иммунобиологических свойств штаммов «Приморский 2003» и «ВНИПЗЖ 2003» вируса оспы коз

Вирус оспы, выделенный от коз в Приморском крае, нами исследован на перевиваемой культуре клеток гонад козы, в РДП и РДСК со специфическими сыворотками и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую проводили совместно с к б н А В Щербаковым и Е С Орловой

Заражение перевиваемой культуры клеток гонад козы показало наличие ци-топатических изменений, характерных для вирусов оспы овец и коз

Ранее проведенными исследованиями было показано, что выделенный штамм «Приморский 2003» обладал патогенными свойствами и вызывал заболевание и гибель зараженных коз Уровень инфекционной активности вируса оспы коз штамм «Приморский 2003» на козах составил 7,1 lg ИД5о/0,5см3

Была испытана чувствительность разных линий культуры клеток - ПО, КГ-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, ВНК-21, Магс-145 При этом лучшие результаты получены при использовании 3-х суточной перевиваемой культуры клеток гонад козы КГ-91 Титр вируса к 10 пассажу достигал значения 6,5 lg ТЦД50/см3

Вирус оспы коз штамм «ВНИИЗЖ 2003» после наработки и лиофилизации был испытан в лабораторных условиях на козах Экспериментальными исследованиями было установлено, что иммунизация коз штаммом «ВНИИЗЖ 2003» защищала их при контрольном заражении штаммом «Приморский 2003» вируса оспы коз Аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003» был комиссионно испытан, депонирован и паспортизирован

В дальнейшем штамм «ВНИИЗЖ 2003» был использован для изготовления моновалентной вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной против оспы овец и оспы коз, которые были испытаны в эпизоотических условиях в Республике Таджикистан с положительным результатом Было установлено, что вакцинация овец и коз во всех случаях сопровождалась образованием антител, титр которых был выше на 30 день по сравнению с титрами антител через 10 дней после иммунизации

Изучение антигенной активности ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз проводили методом исследования сывороток крови вакцинированных овец в РН - против вируса оспы овец, а коз - против вируса оспы коз через

10, 20 и 30 дней после иммунизации животных, а в РДП - с антигеном вируса оспы овец

Было установлено, что иммунизация животных ассоциированной вакциной сопровождалась образованием вируснейтрализующих антител в крови животных, уровень которых был выше против вируса оспы коз

2 2.5 Разработка оптимальных условий культивирования вирусов оспы овец и оспы коз Для изучения особенностей репродукции вирусов оспы овец и коз различными способами были использованы вакцинный штамм вируса оспы овец «ВНИИЗЖ» и вакцинный штамм вируса оспы коз «ВНИИЗЖ 2003», перевиваемые культуры клеток гонад козы (КГ-91), ее производственный трофовариант и монослойно-суспензионная ВНК-21 Монослойную и роллерную культуру клеток заражали с адсорбцией и без адсорбции вируса на клетках

Результаты проведенных исследований показали, что оптимальной множественностью инфицирования культуры клеток является доза вируса 0,1 ТЦД5[)/кл В дальнейшем было проведено сравнение культивирования вирусов оспы овец и оспы коз стационарным, роллерным и суспензионным методами

Было установлено, что при стационарном способе культивирования с использованием перевиваемой культуры клеток КГ-91 вирусы оспы овец и оспы коз накапливались в титрах 5,35-5,6 ^ ТЦД50/СМ3, а при роллерном культивировании - 6,35 ^ ТЦД5о/см3 В трофоварианте культуры клеток гонад козы накопление вируса в среднем было выше на 0,75-1,25 ^ по сравнению с культурой КГ-91 при обоих способах культивирования Накопление вируса в культуре клеток ВНК-21 оказалось в пределах 3,55-4,3 ^ ТЦДл/см3, что значительно уступает показателям при получении вируса оспы в перевиваемой культуре клеток КГ-91

При суспензионном культивировании вирусов оспы овец и оспы коз в производственной линии клеток ВНК-21 средний титр был на 0,2-0,6 1§ ТЦЦ5о/см3 выше, чем при стационарном способе культивирования При стационарном способе максимальные сроки культивирования составляли 4-5 суток, а при использовании рол-лерного и суспензионного методов сокращались до 3-4 суток

Таким образом, результаты исследований показали, что для получения вирусов оспы овец и оспы коз пригодны перевиваемые культуры клеток гонад козы КГ-

91, трофовариант культуры клеток гонад козы (ГК), а также производственная мо-нослойно-суспензионная линия клеток ВНК-21 Более выраженное накопление вирусов отмечено в культурах клеток КГ-91 и ГК при использовании роллерного способа культивирования

2 2.6 Изучение патогенных и антигенных свойств вирусов оспы овец и коз Для заражения взрослых овец и коз местных пород были использованы вирус оспы овец штамм «Афганский» с инфекционной активностью 5,25 1я ИД50/см3 и вирус оспы коз штамм «Приморский 2003» с титром 7,1 ^ ИД5о/0,5см3

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что вирусы оспы овец и оспы коз обладали избирательной патогенностью, после инокуляции вирулентного гомологичного вируса оспы регистрировали генерализацию оспенного процесса и гибель большинства зараженных животных После инфицирования гетерологичным вирусом отмечали непродолжительную гипертермию и местную реакцию в виде гиперемии

Следующим этапом наших исследований было изучение иммуногенных свойств вакцинного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец на овцах и козах С этой целью 4-х овец и 4-х коз иммунизировали атгенуированным штаммом «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец по 10000 ТЦЦ5о/См3, затем через 21 день инфицировали вирулентными штаммами вирусов оспы овец и оспы коз

Было установлено, что у овец, привитых вакцинным вирусом оспы овец, после контрольного заражения вирулентными вирусами оспы овец и коз клинических признаков болезни не было выявлено

Заболевание отмечали только у привитых коз, из которых у двух, зараженных штаммом «Афганский», оно характеризовалось повышением температуры тела до 41,0°С, покраснением и развитием кожного отека в месте введения вируса, без генерализации заболевания У других вакцинированных коз, зараженных штаммом «Приморский 2003», болезнь протекала тяжело и характеризовалась гипертермией до 40,0-41,5°С продолжавшейся в течение 9 сут, отеком кожи в месте введения вируса, генерализацией оспенного процесса по всей поверхности тела, отеком головы, конъюнктивитом, ринитом, угнетением, снижением аппетита, истощением Специфичность болезни подтверждена постановкой РДСК

2 2.7. Получение антигенов и гипериммунных сывороток к вирусам оспы овец и оспы коз

Для получения специфической сыворотки к вирусу оспы овец использовали 4-х овец романовской породы 2-3-летнего возраста массой 30-40 кг, которым предварительно вводили подкожно вирусвакцину против оспы овец из штамма «ВНИ-ИЗЖ», согласно наставлению Через 21 день этих животных и трех не иммунных овец подвергали заражению вирулентным вирусом оспы овец, штамм «Афганский» Заражение невакцинированных овец проводили с целью получения от них реконва-лесцентной сыворотки Через 30 дней проводили цикл трехкратной иммунизации животных Для этого использовали культуральный концентрированный антиген, приготовленный из штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец, полученный в перевиваемой культуре клеток КГ-91 С целью активизации иммунного ответа вируссо-держащий материал вводили вместе с сапонином Антиген с содержанием 3-5 мг сапонина вводили трехкратно, подкожно, в бесшерстые места в несколько точек с интервалом 7 дней в объеме 5 см3 на каждую инъекцию Динамику накопления антител в крови иммунизированных животных определяли в РДСК, РДП и РН (табл 1)

Таблица 1

Специфическая активность сыворотки крови овец в процессе гипериммунизации

Животные Кратность иммунизации после Активность сывороток в

Характеристика кол-во в группе РДП РДСК

Вакцинированные 10 вакцинации н/и н/и 2,46±0,26

заражения Ц-1 2 1 10- 1 20 3,37±0,45

1-й иммуниз Ц-1 16 1 10- 1 30 5,55±0,35

2-й иммуниз 1 4-1 16 1 60- 1 120 6,11±0,2

3-й иммуниз 1 16- 1 32 1 120- 1 240 6,73±0,25

Реконва-лесценты 3 заражения 1 4 -1 32 1 120 - 1 240 4,73±0,5

1 -й иммуниз 1 4-1 32 1 120- 1 240 5,73±0,5

2-й иммуниз 1 8 - 1 32 1 120- 1 240 6,5±0,33

3-й иммуниз 1 16- 1 32 1 240 - 1 320 7,0±0,33

Примечание- Ц - активность сыворотки в неразведенном виде, н/и - не исследовали

Результаты проведенных исследований показали, что сыворотка крови обладала высокой активностью, которая зависела от кратности иммунизации или пере-болевания овец оспой

Гипериммунную сыворотку против вируса оспы коз получали путем подкожного введения козам вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в разведении 1 25 в объеме 1 см3 Через 21 день вакцинированных коз заражали вирулентным вирусом оспы коз штамм «Приморский 2003» методом введения суспензии вируса внутрикожно в область внутренней поверхности хвоста по 500 ИД5о/0,5см3 Через 30 дней проводили цикл трехкратной иммунизации антигеном, приготовленным из штамма «Приморский 2003» вируса оспы коз (табл 2)

Таблица 2

Специфическая активность сыворотки крови коз в процессе гнпериммуннзацни

Животные Кратность иммунизации после Активность сывороток в

Характеристика кол-во в группе РДП РДСК РН (10&)

Вакцинированные 10 вакцинации н/а н/а 2,76±0,48

заражения Ц-1 2 1 10- 1 20 3,77±0,22

1-й иммуниз Ц-1 16 1 10- 1 30 5,55±0,35

2-й иммуниз - 1 4-1 16 1 60- 180 6,23±0,33

3-й иммуниз 1 16- 1 32 1 120-1 160 6,55±0,33

Реконва-лесценты 3 заражения 1 8 - 1 32 1 80-1 120 4,73±0,5

1-й иммуниз 1 8-1 32 1 80- 1 120 5 73±0,5

2-й иммуниз 1 8 - 1 32 1 80- 1 120 6,11±0,2

3-й иммуниз 1 16- 1 32 1 120-1 160 6,73±0,25

Примечание Ц - активность сыворотки в неразведенном виде, н/а - не активна

Результаты исследований показали наличие высокой активности сыворотки крови при гипериммунизации вакцинированных и переболевших коз культураль-ным концентрированным антигеном оспы коз, приготовленным на перевиваемой культуре клеток гонады козы

В отдельных опытах была получена гипериммунная сыворотка крови кроликов С этой целью проводили заражение животных методом введения суспензии вируса оспы коз штамм «Приморский 2003» внутрикожно в 5-6 точек, в области паха в объеме 0,5 см3 на каждое животное Через 21 день кроликов подвергали гипериммунизации концентрированным очищенным антигеном

Через 7 дней после 3-й иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови Сыворотки крови расфасовывали в ампулы по 1,0 см3, лиофильно высушивали и исследовали в РДСК и РДП Активность гипериммунных сывороток крови коз и кроликов в РДСК была 1 80-1 160 и в РДП - 1 8-1 32 2 2.8. Изучение степени родства между вирусами оспы овец и коз с использованием серологических Методов С целью изучения степени родства между вирусами оспы овец и коз нами была исследована в РДСК активность вирусов оспы овец и оспы коз в различных материалах с использованием специфических сывороток (табл 3)

Таблица 3

Специфическая активность материалов в РДСК

Наименование материала Количество проб Сыворотка специфическая к

ВОК BOO

Органо-тканевая суспензия ВОК 15 1 30-1 240 н а

Концентрированный антиген ВОК 20 1 60-1 320 н а

Органо-тканевая суспензия BOO 15 1 10 1 40-1 80

Концентрированный антиген BOO 25 1 10 1 40-1 160

Примечание на-неактивна

Исследования показали, что сыворотки к вирусам оспы овец и оспы коз обладали высокой специфичностью к гомологичному вирусу и слабой к гетерологич-ному Вирус оспы коз в виде органо-тканевой суспензии или антигена давал положительную реакцию в разведении 1 30-1 240 или 1 60-1 320 только с гомологичной гипериммунной сывороткой крови, тогда как с гетерологичной к вирусу оспы овец реакция была отрицательной Органо-тканевая вирусспецифическая суспензия или антиген вируса оспы коз с гомологичной сывороткой был активен в разведении 1 40-1 80 или 1 40-1 160, а против оспы коз всего 1 10

2 2 9. Изучение специфической активности вирусов оспы овец и оспы коз при их длительном хранении

С целью изучения специфической активности в РДСК и РДП после длительного хранения при температуре 4±2°С были исследованы образцы лиофилизиро-ванного антигена вируса оспы овец штамм «ВНИИЗЖ» (табл 4)

Таблица 4

Активность антигена для РДСК и РДП вируса оспы овец штамма «ВШШЗЖ» при длительном хранении

№ п/п Срок хранения, мес Активность антигена в

РДСК РДП

исходный после хранения исходный после хранения

1 12 1 40 1 40 1 4 1 4

2 24 1 40 1 40 1 4 1 4

3 48 1 60 1 40 1 8 1 4

4 66 1 80 1 60 1 16 1 8

5 84 1 80 1 40 1 16 1 4

Установлено, что при длительном хранении отмечается некоторое снижение активности антигена вируса оспы овец для серологических реакций, которая зависела от сроков хранения Если через 24 месяца активность антигена в РДП не изменялась и была 1 4, то через 48 месяцев титр другого образца антигена был - 1 8, по сравнению с исходным он понижался до 1 4, через 66 месяцев - с 1 16 до 1 8 и через 84 месяца - с 1 16 до 1 4, соответственно, сохраняя пригодность для практического использования

Изучение длительности хранения вирулентного штамма «Приморский 2003» вируса оспы коз при температуре минус 40°С в лиофильно высушенном виде в ампулах показало, что титр вируса при хранении в течение 3-х лет не снижался и оставался на исходном уровне - 7,1 ^ ТЦД50/см3

Исследование биологической активности вакцинного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз после лиофилизации путем титрования десятикратных разведений вирусной суспензии в перевиваемой культуре клеток гонад козы КГ-91 показало, что титр вируса при хранении в течение 1-3 лет снижался не более чем на 0,5 1яТЦД5о/см3 и составлял 5,11 ±0,09 и 5,41±0,15 ^ТЦД50/см3

2 2 10 Определение антигенного родства между штаммами вируса оспы различных видов животных При изучении антигенного родства между вирусами оспы овец и нодулярно-го дерматита КРС были проведены исследования по возможности использования вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» для защиты животных от заболевания нодулярным дерматитом Для этого было вакцинировано 4 быка 2-х

летнего возраста, из которых 2 - в объеме 4 см3 и 2 - 10 см3, содержащих 160 ООО и 400 ООО ТЦД5о/см3, соответственно

В качествс; контроля использовали одно неиммунное животное Через 21 день после введения вакцины всех животных заразили вирулентным вирусом нодуляр-ного дерматита КРС, который вводили внутрикожно в область шеи в объеме по 5 ем3 по 0,1 см3 в 50 точек

Было установлено, что на 4 сутки у всех животных в месте введения вирусной суспензии отмечено образование узелковых уплотнений, которые на 14 сутки исчезли у 3-х из 4-х животных, привитых вирусвакциной против оспы овец в объеме 4 см3 и 10 см3 Контрольное животное и одно привитое в дозе 4 см3 болели ноду-лярным дерматитом в течение всего срока наблюдения (21 сутки)

При исследовании сывороток крови полученных на 21 день после вакцинации в РДСК антител против оспы овец не обнаружено, а через 14 дней после заражения вирусом нодулярного дерматита титр антител был в пределах 1 8

Полученные данные показали, что крупный рогатый скот, привитый против оспы овец, был частично защищен от заболевания нодулярным дерматитом при экспериментальном заражении

Изучение антигенного родства между вирусами оспы различных видов сельскохозяйственных животных овец, коз, КРС, свиней, лошадей и верблюдов проводили в РДСК (опыты проведены совместно с к в н Д К Басовой) Определение антигенного родства проводили методом учета результатов реакции по максимальным разведениям сывороток, вызывающих 100%-ную задержку гемолиза эритроцитов и рассчитывали по формуле Архетги и Хорсфала [3 Лярски,1980]

У всех вирусов оспы 100% уровень родства был определен только при взаимодействии гомологичных сывороток и антигенов В реакциях с гетерологичными сыворотками и антигенами уровень родства составлял от 12% (у вирусов оспы свиней и КРС) до 43% (у вирусов оспы верблюдов и лошадей)

Таким образом, проведенные исследования показали, что вирусы оспы овец, коз, КРС, свиней, лошадей, верблюдов и гипериммунные к ним сыворотки вступают в перекрестные реакции в РДСК, однако они имели существенные различия в антигенном отношении

2 2 11 Изучение поствакцпналыюго гуморального иммунитета против вирусов оспы овец и оспы коз

При изучении иммунитета использовали РН, РДСК и ИФА, с помощью которых определяли уровень поствакцинальных и постинфекционных антител в сыворотках крови овец и коз против вируса оспы

Изучение особенностей гуморального иммунитета проводили на 21 овце и 22 козах, которые были привиты моно- и ассоциированными вирусвакцинами против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в прививной дозе 1,0 см3, содержащей по 10000 ТЦД50/см3 Образцы ассоциированной вакцины против оспы овец и оспы коз имели разное соотношение антигенов 11,51 и 10 1, где в прививной дозе содержалось вируса оспы овец и коз по 10000 и 100000 ТЦД50/см3, по 50000 и 100000 ТЩЫем3, 100000 и 100000 ТЦД50/см3, соответственно Все овцы и козы, включая контрольных, через 21 сутки после иммунизации были заражены вирулентными штаммами «Афганский» вируса оспы овец или «Приморский 2003» вируса оспы коз соответственно

Установлено, что в крови овец, привитых против оспы овец, через 21 день титр антител в РН против оспы овец был выше, чем против оспы коз и соответствовал 3,70±0,23 log2 и 2,88±0,14 log2, соответственно (табл 5) Аналогичные результаты получены при иммунизации коз

Таблица 5

Результаты исследований активности сывороток крови овец и коз, вакцинированных против оспы в РН (п=3)

Введена Титр антител к вирусу оспы (Iog2>

о о с вирус- овец КОЗ

Ü о. U вакцина дни

Ч * £ = t против оспы 7 14 21 7 14 21

овцы I овец 1,10±0,32 2,76±0 48 3,70±0,23 н/и н/и 2 88±0 14

II коз 0,87±0,47 2,12±0,42 2,89±0,61 н/и н/и н/и

козы III овец 0,31 ±0,12 1,10±0 28 2,12±0,25 0,46±0 08 1,75±0,21 2,71±0 21

IV коз н/о 1,02±0 17 2,49±0,14 0 71±0 05 2,14±0,17 3,58±0,0

Примечание н/и — не исследовано, н/о - антител не обнаружено

При изучении комплементсвязывающей активности сыворотки крови овец, иммунизированных вирусвакциной против оспы овец, установлено через 14 и 21 день наличие антител в титрах 1 2-1 4 и 1 4-16, соответственно на гомологичный

I 20

вирус, тогда как антител против вируса оспы коз в этих же сыворотках не обнаружено После заражения животных вирусом оспы овец в крови выявлены антитела в титрах 1 32 у животных, которые были устойчивы к заболеванию и 1 128-1 512 у овец, у которых в месте введения вируса отмечено наличие местной реакции в виде небольшого отека и гиперемии

При изучении специфической активности сывороток крови в ИФА установлено наличие более высоких титров антител в крови животных, для которых предназначена вакцина Существенные отличия в активности сывороток крови выявлены у этих животных после экспериментального заражения вирусом оспы овец штамм «Афганский», когда против гомологичного вируса титр антител достигал 1 1600-1 25000, а против вируса оспы коз он был только в пределах 1 100-1 400 После иммунизации овец вирусвакциной против оспы коз на 21 день титр антител против вирусов оспы овец и оспы коз был невысоким - 1 50-1 100

После заражения этих животных вирусом оспы овец штамм «Афганский» титр антител против вируса оспы овец достигал больших значений 1 3200-1 25600, тогда как против вируса оспы коз он был значительно ниже - в пределах 1 200-1 400

В крови контрольных зараженных овец титр антител против оспы овец был равен 1 3200, а против вируса оспы коз - 1 100

3 ВЫВОДЫ

1 Оспа овец и оспа коз широко распространены в мире, в т ч и в странах СНГ По официальным данным МЭБ, с 1996 по 2006гг неблагополучными то этим заболеваниям являлись 60 стран 27 азиатских, 27 африканских и 6 европейских В последние годы вспышки оспы коз, как самостоятельного заболевания зарегистрированы в странах Азии и в России

2 Наиболее чувствительными клетками для репродукции вирусов оспы овец и оспы коз являются первичная культура клеток почки овцы, перевиваемая культура клеток гонад козы КГ-91, ее трофовариант и производственная линия клеток ВНК-21, в которых титр вируса достигал значений 5,5 lg, 7,0 lg, 7,5 lg, 4,5 lg ТЦД50/см3, соответственно Наибольшее накопление вирусов отмечается при роллерном методе культивирования

3 Экспериментально установлено, что у овец и коз после внутрикожной инокуляции вирулентного гомологичного вируса оспы (штамм «Афганский» вируса оспы овец и штаммы «Pellor» и «Приморский 2003» вируса оспы коз) регистрируется генерализация оспенного процесса и гибель большинства зараженных животных После инфицирования гетерологичным вирусом отмечается только непродолжительная гипертермия и местная реакция в виде гиперемии

4 В целях диагностики оспы овец и оспы коз использованы серологические методы РДСК, РДП, ИФА, для постановки которых разработаны методы получения концентрированного антигена и гипериммунных сывороток крови к вирусу оспы коз на кроликах и козах, активность которых составила в РДСК 1 120-1 160, в РДП 1 16-1 32 и в ИФА- 1 1000-1 4000

5 Установлены существенные антигенные отличия между вирусами оспы овец и оспы коз с вирусами оспы КРС, свиней, лошадей и верблюдов по данным, полученным в РДСК Уровень родства составлял от 13% с вирусом оспы КРС до 27% с вирусом оспы свиней

6 Вирусы оспы овец и оспы коз в лиофилизированном состоянии при хранении при температуре 4±2°С не снижают биологической активности в течение 24 месяцев

7 Крупный рогатый скот, иммунизированный вирусвакциной против оспы овец, частично защищен от контрольного заражения вирусом нодулярного дерматита КРС, что подтверждает наличие антигенного родства между этими каприпоксвиру-сами

8 Показано, что ассоциированная вакцина, приготовленная из вирусов оспы овец и оспы коз, защищает иммунизированных животных от прямого заражения вирулентными вирусами Установлена зависимость эффективности от соотношения в ассоциированной вакцине антигенов вирусов оспы овец и оспы коз

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Для практического использования предлагаются - производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации ле-

карственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14 06 2006г),

- контрольный штамм «Приморский 2003» вируса оспы коз, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14 06 2006г)

2 Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методические документы

«Методические указания по получению гипериммунной сыворотки крови для диагностики оспы коз», 2006 г,

«Методические указания по диагностике оспы коз методом постановки реакции длительного связывания комплемента», 2006 г ,

«Методические рекомендации по стационарному и роллерному культивированию атгенуированного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы коз», 2006 г,

«Методические рекомендации по оценке иммуногенной активности вирус-вакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» и ассоциированной вакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003», 2006 г

3 Результаты исследований вошли в следующие нормативные документы

- СТО «Набор препаратов для диагностики оспы овец в реакциях длительного связывания комплемента и диффузионной преципитации», утвержденный заместителем Россельхознадзора 21 04 2008 г

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Культивирование атгенуированного вируса оспы овец штамма «ВНИИЗЖ» в культуре клеток гонад козы роллерным методом / Л Б Кутумбетов, Т И Корпусова,

Ш К Куляшбекова, М.С. Зиновьева // Роль вст науки в развитии жив-ва матер междунар науч -произв конф , посвящен 75-летию КазахНИВИ -Алматы,2000 -С 128-129

2 Изучение патогенности вирусов оспы овец и оспы коз / М.С. Зиновьева, В М Захаров, В И Диев, Д К Басова // ВУЗ и АПК задачи, проблемы и пути решения сб науч тр межрегион юбил науч -практ конф -Махачкала,2002 -С 288-290

3 Цитопатогенная активность клона Г-35 вируса оспы коз в культуре клеток гонад козы / Л Б Кутумбетов, М С. Зиновьева, Н И Корчагина, А С Назаров // Акту-альн пробл патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота матер конф молодых ученых -Владимир, 2002 -С 7-11

4 Получение и использование стабильного производственного трофоварианта клеток гонад козы для вирусологических исследований / Т И Корпусова, Б Л Манин, Л Б Кутумбетов, М С. Зиновьева, В В Михалишин, Ш К Куляшбекова, С В Хле-бопашникова // Биолого-экологические пробл заразных болезней диких жив-х и их роль в патологии с -х жив-х и людей матер науч -практ конф -Покров, 2002 -С 290-293

5 Патогенность и иммуногенность вирусов оспы овец и коз на гетеровидовых животных / Л Б Кутумбетов, М С. Зиновьева, С В Хлебопашникова, Н И Ковали-шина // Вет медицина межвед тематич науч сб ИЭКВМ -Харьков,2002 -Вып 80 -С 359-362

6 Усовершенствование методов контроля вакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» / М.С. Зиновьева, А В Гарькин, Д К Басова, В И Диев, В М Захаров //Актуальн вопр зоотехн науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья с -х жив-х матер 2-й Междунар науч -практ конф -Ставрополь,2003 -С 317-320

7 Патогенность вируса оспы коз / Л Б Кутумбетов, К Р Кульбаева, А С Назаров, М С Зиновьева, О А Пронина, В И Диев // Актуальн пробл болезней жив-х в со-времсн условиях матер Междунар науч -практ конф , посвящен 60-летию Тадж-НИВИ -Душанбе,2003 -С 40-42

8 Влияние длительного храпения лиофилизированной пирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» на специфическую активность / Д К Басова, А В Гарькин, М С. Кукушкина, В И Диев, Ф П Курченко // Актуальн пробл инфек-

ционной патологии жив-х матер Междунар иауч -практ конф , посвящ 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» -Владимир,2003 -С 451-452

9 Получение препаратов для иммуноферментной диагностики оспы коз / О П Бьядовская, Г Н Дороненкова, М.С. Кукушки на, А П Пономарев, Л Б Прохвати-лова // Науч основы обеспечения защиты жив-х от экзотоксинов, радионуклеидов, возбудителей опасных инфекционных заболеваний матер Междунар симпоз -Казань.2005 -Ч 2 -С 70-73

10 Кукушкина, М.С Изучение репродукции вирусов оспы овец и коз в перевиваемых культурах клеток / М.С. Кукушкина //Вет патология -2006 -№4 -С 78-81

11 Изучение культуральных свойств аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз / Н В Мороз, В В Борисов, В И Диев, А В Гарькин, М.С. Кукушкина, Т И Корпусова, Д К Басова, Г А Блотова, А В Константинов // Молодежь и наука XXI века матер Н-й открытой Всерос науч -практ конф молодых ученых-Ульяновск,2007 -Ч 1 -С 116-121

12 Изучение патогенных свойств штамма «Приморский-2003» вируса оспы коз / М.С. Кукушкина, А В Гарькин, Н В Мороз, В И Диев // Вестн Кыргызского науч -исслед института жив-ва, ветеринарии и пастбищ имени Арстанбека Дуйшеева (КыргНИИЖВиП) -Бишкек,2007 -Xsl -С 229-233

13 Сравнительный анализ эффективности гомологичной и гетерологичной иммунизации овец и коз против оспы / М.С. Кукушкина, А В Гарькин, Н В Мороз, В И Диев // Вестн Кыргызского науч -исслед института жив-ва, ветеринарии и пастбищ имени Арстанбека Дуйшеева (КыргНИИЖВиП) -Бишкек,2007 -№1 -С 234-238

14 Изучение культуральных свойств аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз / Н В Мороз, В В Борисов, В И Диев, А В Гарькин, М.С. Кукушкина, Т И Корпусова, Д К Басова, Г А Блотова, А В Константинов//Вестник Кыргызского науч -исслед института жив-ва, ветеринарии и пастбищ имени Арстанбека Дуйшеева (КыргНИИЖВиП) -Бишкек,2007 -Xsl -С 254-259

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Тираж 90 экз , май 20081-

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кукушкина, Мария Сергеевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Историческая справка.

2.2. Характеристика вирусов оспы овец и коз.

2.2.1. Морфология.

2.2.2. Устойчивость возбудителя к факторам внешней среды.

2.2.3. Организация генома, структура основных белков и репликация вируса

2.3. Эпизоотические особенности оспы овец и оспы коз.

2.4. Культивирование вирусов оспы овец и оспы коз.

2.5. Средства и методы диагностики оспы овец и коз.

2.5.1. Электронная микроскопия.

2.5.2. Серологические методы диагностики.

2.5.3. Иммуноферментный метод диагностики.

2.5.4. Биологическая проба.

2.5.5. Молекулярные методы диагностики оспы овец и оспы коз.

2.5.6. Методы дифференциальной диагностики оспы овец и оспы коз.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунобиологическая характеристика вакцинных и вирулентных штаммов вирусов оспы овец и оспы коз"

Актуальность темы. Оспу овец и оспу коз относят к особо опасным болезням животных, способным вызвать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб. По классификации МЭБ до 2004 года они относились к списку «А», а в соответствии с новой классификацией они включены в список болезней МЭБ, подлежащих обязательному уведомлению, в категорию «Болезни овец и коз» [110,134139]. В последние годы оспу овец и оспу коз стали рассматривать как две самостоятельные болезни. По современной классификации, возбудители этих болезней ДНК - содержащие вирусы sheeppoxvirus и goatpoxvirus входят в род Capripoxvirus семейства Poxviridae. Считают, что возбудители оспы овец и оспы коз состоят в близком генетическом, антигенном и серологическом родстве, но по патогенности обладают строгой видовой специфичностью и являются отдельными таксономическими видами [12].

Оспа овец и оспа коз эндемичны на Ближнем Востоке, в Центральной и Южной Азии, Китае, а также в Центральной и Северной Африке. По данным Международного эпизоотического бюро, в 1996-2007 гг. неблагополучными по этим заболеваниям были 55 стран, в том числе семь стран СНГ; в России оспа мелких жвачных регистрировалась в 1994-2000 гг. и 2002-2003гг. [12,21,70,77,78,110,134-139].

Несмотря на то, что каприпоксвирусы преимущественно поражают свой вид животных-хозяев, жестко детерминированной хозяйской специфичностью они не обладают и способны инфицировать гетерологичные виды животных. Описана способность штаммов BOO и ВОК в экспериментальных условиях вызывать заболевание как у овец, так и у коз [12,19,96,120,124].

Способность каприпоксвирусов относительно легко преодолевать межвидовые барьеры и сходство клинических признаков вызываемых ими заболеваний у мелких жвачных животных делают недостаточной диагностику оспы овец, оспы коз и нодулярного дерматита КРС (бугорчатки) на основании только клинических данных и вызывают необходимость разработки лабораторных методов видовой дифференциации вирусов.

Как показали недавние исследования, идентичность полных нуклеотидных последовательностей генома каприпоксвирусов составляет 97% [11,44,45,82]. Чрезвычайно близкое родство не позволяет различать каприпоксвирусы вирусологическими и серологическими методами. Видовую дифференциацию каприпоксвирусов до недавнего времени удавалось проводить только рестрикционным картированием, в ПЦР или секвенированием геномной ДНК [44,45,82,84]. В то же время эпизо-отологические наблюдения показали, что оспа возникала неоднократно среди коз, привитых против оспы овец, в то время как заболевания среди вакцинированных овец не регистрировали [46].

В связи с этим изучение иммунобиологических характеристик вакцинных и вирулентных штаммов вирусов оспы овец и оспы коз, имеет как научное, так и практическое значение.

Цели и задачи исследования. Основная цель данных исследований заключалась в сравнительном изучении иммунобиологических характеристик вакцинных, вирулентных штаммов и полевых изолятов вирусов оспы овец и оспы коз.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- дать сравнительную характеристику иммунобиологических свойств штаммов вирусов оспы овец и оспы коз, хранящихся в музее ФГУ «ВНИИЗЖ»;

- разработать методы получения препаратов для диагностики оспы овец и оспы коз, а также выявления антител в крови животных;

- определить уровень поствакцинальных и постинфекционных антител в крови овец против вирусов оспы овец и оспы коз;

- изучить устойчивость вакцинированных и не вакцинированных овец и коз к перекрестному заражению.

Научная новизна исследований. В результате проведенных исследований:

- изучены иммунобиологические свойства выделенных в 2003 году штаммов «Приморский 2003» и «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз;

- дана сравнительная характеристика иммунобиологических свойств штаммов вирусов оспы овец и коз;

- экспериментально оценена устойчивость вакцинированных и непривитых овец и коз к перекрестному заражению вирусами оспы овец и оспы коз;

- определено влияние длительного хранения на биологическую активность вирусов оспы овец и оспы коз.

Практическая значимость исследований. Практическое значение работы состоит в том, что производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз после изучения иммунобиологических свойств был депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14.06.2006г.); - контрольный штамм «Приморский 2003» вируса оспы коз после изучения был депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14.06.2006г.).

Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» методические рекомендации:

- «Методические указания по получению гипериммунной сыворотки крови для диагностики оспы коз», 2006 г.;

- «Методические указания по диагностике оспы коз методом постановки реакции длительного связывания комплемента», 2006 г.;

- «Методические рекомендации по стационарному и роллерному культивированию атгенуированного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы коз», 2006 г.;

Результаты научных исследований вошли в следующие нормативные документы:

- СТО «Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культураль-ная сухая» утвержденный заместителем руководителя Россельхознадзора 07.08.2007 г.;

- СТО «Набор для диагностики оспы овец иммуноферментным методом», утвержденный заместителем руководителя Россельхознадзора 21.04.2008 г.;

Основные положения, выносимые на защиту:

- иммунобиологические свойства штаммов вирусов оспы овец и коз;

- иммунобиологические свойства выделенных в 2003 году вирулентного «Приморский 2003» и вакцинного «ВНИИЗЖ 2003» штаммов вируса оспы коз;

- особенности репродукции вирусов оспы овец и оспы коз в первичных и перевиваемых культурах клеток стационарным, роллерным и суспензионным методами;

- устойчивость вакцинированных животных к перекрестному заражению вирусами оспы овец и коз;

- антигенное родство между вирусами оспы овец, оспы коз, нодулярного дерматита КРС и оспы других видов животных.

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в т.ч. 1 работа в издании по перечню ВАК.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и опубликованы на научных конференциях «Роль ветеринарной науки в развитии животноводства»

Алматы,2000), «Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота» (ФГУ ВНИИЗЖ,2002), «ВУЗ и АПК: задачи, проблемы и пути решения» (Махачкала,2002), «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе,2003), а также доложены на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2000-2007гг.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с к.б.н. Т.И. Корпусовой, к.в.н. Д.К. Басовой, Г.А. Блотовой, к.в.н. Н.В. Мороз, за что автор выражает им сердечную благодарность.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 157 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 164 источника, в том числе 71 на русском языке. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 41 таблицей.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Кукушкина, Мария Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

1. Оспа овец и оспа коз широко распространены в мире, в т.ч. и в странах СНГ. По официальным данным МЭБ, с 1996 по 2006гг неблагополучными по этим заболеваниям являлись 60 стран: 27 азиатских, 27 африканских и 6 европейских. В последние годы вспышки оспы коз, как самостоятельного заболевания зарегистрированы в странах Азии и в России.

2. Наиболее чувствительными клетками для репродукции вирусов оспы овец и оспы коз являются первичная культура клеток почки овцы, перевиваемая культура клеток гонад козы КГ-91, ее трофовариант и производственная линия клеток ВНКо

21, в которых титр вируса достигал значений 5,5 lg, 7,0 lg, 7,5 lg, 4,5 lg ТЦД50/см , соответственно. Наибольшее накопление вирусов отмечается при роллерном методе культивирования.

3. Экспериментально установлено, что у овец и коз после внутрикожной инокуляции вирулентного гомологичного вируса оспы (штамм «Афганский» вируса оспы овец и штаммы «Pellor» и «Приморский 2003» вируса оспы коз) регистрируется генерализация оспенного процесса и гибель большинства зараженных животных. После инфицирования гетерологичным вирусом отмечается только непродолжительная гипертермия и местная реакция в виде гиперемии.

4. В целях диагностики оспы овец и оспы коз использованы серологические методы: РДСК, РДП, ИФА, для постановки которых разработаны методы получения концентрированного антигена и гипериммунных сывороток крови к вирусу оспы коз на кроликах и козах, активность которых составила в РДСК 1:120-1:160, в РДП 1:16-1:32 и в ИФА- 1:1000-1:4000.

5. Установлены существенные антигенные отличия между вирусами оспы овец и оспы коз с вирусами оспы КРС, свиней, лошадей и верблюдов по данным, полученным в РДСК. Уровень родства составлял от 13% с вирусом оспы КРС до 27% с вирусом оспы свиней.

6. Вирусы оспы овец и оспы коз в лиофилизированном состоянии при хранении при температуре 4±2°С не снижают биологической активности в течение 24 месяцев.

7. Крупный рогатый скот, иммунизированный вирусвакциной против оспы овец, частично защищен от контрольного заражения вирусом нодулярного дерматита

КРС, что подтверждает наличие антигенного родства между этими каприпоксвиру-сами.

8. Показано, что ассоциированная вакцина, приготовленная из вирусов оспы овец и оспы коз, защищает иммунизированных животных от прямого заражения вирулентными вирусами. Установлена зависимость эффективности от соотношения в ассоциированной вакцине антигенов вирусов оспы овец и оспы коз.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для практического использования предлагаются:

- производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14.06.2006г.);

2. Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методические документы:

Методические указания по получению гипериммунной сыворотки крови для диагностики оспы коз», 2006 г.;

Методические указания по диагностике оспы коз методом постановки реакции длительного связывания комплемента», 2006 г.;

Методические рекомендации по стационарному и роллерному культивированию атгенуированного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы коз», 2006 г.;

Методические рекомендации по оценке иммуногенной активности вирус-вакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» и ассоциированной вакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003», 2006 г.

3. Результаты исследований вошли в следующие нормативные документы:

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кукушкина, Мария Сергеевна, Владимир

1. Абдураимов, Е.О. Изучение свойств вируса оспы коз в клеточных культурах / Е.О. Абдураимов, М. Мамбеталиев, Л.Б. Кутумбетов // Актуал. пробл. С.-х. биотехнологии: матер. конф.-1998.-С.9-11.

2. Антитела: Методы. Т.2: пер. с англ./Под ред. Д.Кэтти.-М.:Мир, 1991.-382с.

3. Ашмарин, И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов / И.П. Ашмарин, И.П. Васильев, В.А. Амбросов.-Л.: Изд-во Лс-нингр. ун-та, 1974.-76с.

4. Басова, Д.К. Получение антигена и гипериммунной сыворотки для диагностики оспы свиней / Д.К. Басова, В.И. Диев // Пробл. патологии, санитарии и бесплодия в жив-ве: Междунар. научно-практ. конф.-Минск,1998.-С.49-50.

5. Басова, Д.К. Совершенствование технологии изготовления средств диагностики и специфической профилактики оспы овец: автореф. дис. канд. вет. наук / Басова Дарья Константинова.-Владимир,2001.-25с.

6. Биологические свойства вакцинного штамма НИСХИ вируса оспы овец /

7. B.Н. Иванющенков, О.А. Кореба, В.Т. Кекух и др. // Ветеринария.-1990.-№8.1. C.22-24.

8. Болезни овец и коз / сост. М.В. Загороднов.-М.:Колос,1973.-415с.

9. Борисович, Ю.Ф. О распространении оспы овец и мерах борьбы с нею в некоторых странах / Ю.Ф. Борисович // Тр. ГНКИ.-1964.-Т.12.-С.24-31.

10. Борисович, Ю.Ф. Об иммунобиологических свойствах эмбрион-вирусвакцины оспы овец / Ю.Ф. Борисович // Тр. ГНКИ.-1962.-Т.10.-С.105-109.

11. Видовая и штаммовая дифференциация каприпоксвирусов методом полиме-разной цепной реакции / Е.С. Орлова, А.В. Щербаков, В.И. Диев, В.М. Захаров // Молекулярная биология.-2006.-Т.40,№1.-С. 158-164.

12. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина.-М. :ВНИТИБП, 1998.-928с.

13. Вишняков, И.Ф. Диагностика вирусных болезней животных: состояние и перспективы / И.Ф. Вишняков // Вопр. вет. вирусол., микробиол. и эпизоотол.: матер. науч. конф. ВНИИВВиМ.-Покров,1992.-Ч.2.-С.221-230.

14. Волкова, А.А. Профилактика и меры борьбы при инфекционных болезнях овец / А.А. Волкова // Профилактика болезней с.-х. животных в пром. жив-ве.-МД975.- С.221-230.

15. Гарькин, А.В. Изучение иммунобиологических свойств вакцин против оспы овец и оспы коз: автореф. дис. . канд. вет. наук / Гарькин Алексей Викторович.-Владимир,2007.-25с.

16. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц: пер. с апгл.-М.:Практика,1999.-459с.

17. Горькавский, Ю.А. Использование препарата «Абактан» при вакцинации овец против оспы / Ю.А. Горькавский, В.М. Балышев// Науч. основы произ-ва вет. биол. препаратов: матер. Междунар. науч.-практ. конф,- Щелково,2005.-С. 195-197.

18. Грачев, Д.В. Адаптация вируса оспы коз к первичным и перевиваемым культурам клеток / Д.В. Грачев // Проблемы мониторинга и генодиагностики болезней животных: Матер. Междунар. конф. молодых ученых.-Владимир,2004.-С.97-99.

19. Грачев, Д.В. Иммунобиологические свойства вируса оспы коз, выделенного в Республике Таджикистан: автореф. дис. канд. вет. наук / Грачев Дмитрий Вик-торович.-Покров,2006.-27с.

20. Гуненков, В.В. Сухая живая вакцина против оспы овец из штамма С113/86 / В.В. Гуненков, В.П. Черняк, Г.Д. Кузнецов // Ветеринария.-1993.-№11/12.-С.23-24.

21. Диев, В.И. Оспа овец и коз: мониторинг распространения и профилактика / В.И. Диев, В.М. Захаров, A.M. Рахманов // Мониторинг распространения и предотвращения особо опасных болезней жив-х: сб.матер.конф.-Самарканд,2004.-С.63-65.

22. Дифференциация вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец / Е.С. Орлова, А.В. Щербаков, В.И. Диев, В.М. Захаров // Тр. Федерального центра охраны здоровья жив-х.-Владимир,2005.-Т.З.-С. 160-170.

23. Зайцева, Т.И. Очистка оспенной вакцины центрифугированием в градиенте плотности сахарозы / Т.И. Зайцева // Вакцины и сыворотки: республ. межвед. сб. -1974. Вып.8.-С.42-47.

24. Зайцева, Т.И. Очистка оспенной вакцины центрифугированием в градиенте плотности глицерина / Т.И. Зайцева // Вакцины и вирусные заболевания: республ. межвед. сб.-1976, Вып.4.-С.89-90.

25. Иммуногенная активность пылевидной вирусвакцины против оспы овец / С.М. Мамадалиев, Е.Н. Троицкий, К.Р. Кульбаева и др. // Биотехнология теория и практика.-1998.-Т. 1-2,№5-6.-С. 133-134.

26. Инфекционная патология животных в 2 т.-T.l. / под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина.-М.Академкнига,2006.-1911с.

27. Инфекционные болезни овец / Р.А. Кадымов, А.А. Кунаков, В.А. Седов и др. //М.: Агропромиздат,1987.-С.303.

28. Кадыров, У.Г. Оспа животных / У.Г. Кадыров, Ю.Ф. Борисович.-М.:Колос, 1981.-168с.

29. Кекух, И.Г. Роль сайгаков в распространении оспы овец / И.Г. Кекух, А.П. Демченко, А.И. Быков // Биолого-эколог. Проблемы заразных болезней диких жив-х и их роль в патологии с.-х. жив-х и людей: матер. Междунар. науч.-практ. конф. -Покров,2002.-С. 123.

30. Керембекова, У.Ж. Совершенствование средств и методов лабораторной диагностики оспы овец: автореф. дис. . канд. вет. наук/ Керембекова У.Ж.-Алматы.-1994.

31. Лихачев Н.В. Активная иммунизация против оспы овец: дис. д-ра вет. наук / Лихачев Н.В.- МД948.-С.272.

32. Лихачев, Н.В. Аттенуированный штамм вируса оспы овец / Н.В. Лихачев, Л.А. Жидкова // Тез. докл. науч. конф. ВГНКИ.-М.,-1974.-С.1-2.

33. Лихачев, Н.В. Изыскание методов получения авирулентной формол-депо-вакцины против оспы овец / Н.В. Лихачев // Тр. ГНКИ.-1952.-Т.З.-С.133-136.

34. Лярски, 3. Диагностика вирусных болезней животных / 3. Лярски; пер. с польск. Т.Г. Орловой, Я.С. Лянсберг.-М.:Колос,1980-400с.

35. Машнин, А.В. Диагностика оспы овец и оспы коз / А.В. Машнин // Вестн. РАСХН.-2003.-№3.-С.66-69.

36. Машнин, А.В. Получение гипериммунных сывороток для диагностики оспы овец и коз / А.В. Машнин // Докл. РАСХН.-2003.-№5.-С.57-59.

37. Машнин, А.В. Разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики оспы овец и оспы коз: автореф. дис. канд. вет. наук / Машнин Александр Валентинович.-Покров,2001.-24с.

38. Общая вирусология: пер. с англ. / С. Лурия, Дж. Дарнелл, Д. Балтимор, Э. Кэмпбелл.-М. :Мир, 1981 .-С.464-471.

39. Орлова Е.С. Совершенствование методов диагностики оспы овец и оспы коз: автореф. дис. канд. вет. наук / Орлова Елена Сергеевна.-Владимир,2007.-23с.

40. Орлова, Е.С. Видовая дифференциация каприпоксвирусов методом мультиплексной ПЦР / Е.С. Орлова, А.В. Щербаков // Тр. Федерального центра охраны здоровья жив-х.-Владимир,2005.-Т.З.-С. 151 -159.

41. Оспа коз в Таджикистане / И.Т. Сатгоров, И.Ю. Хухоров, С.П. Болтаев и др. // Ветеринария.-2003.-№6.-С.12-14.

42. Очистка вирусов оспы овец и оспы коз / А.П. Простяков, Е.И. Скалинский, Ю.Ф. Борисович и др. // Тр. ВГНКИ вет. препаратов. 1977.-Т.24-25. - С.156-160.

43. Пальгов, А.А. Иммуногенные свойства производственных штаммов вируса оспы овец / А.А. Пальгов // Тр. ГНКИ.-1964.-Т.12.-С.32-35.

44. Петри, А. Наглядная статистика в медицине / А. Петри, К. Сэбин; пер. с англ. В.П. Леонова М.: ГЭОТАР-МЕД,2003.-144с.

45. Платонов, А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы / А.Е. Платонов.-М.: Изд-во РАМН,2000.-52с.

46. Получение диагностических препаратов для серологических реакций при оспе овец / У.Ж. Керембекова, Ю.М. Гононов, JI.H. Пасечников и др. // Вестн. с.-х. науки Казахстана.-1992.-№3.-С. 122-123.

47. Поляков, И.О. Практическое пособие по медицинской статистике / И.О. Поляков. -JL: Медицина, 1975.-150с.

48. Пономарев, А.П. Электронная микроскопия вирусов животных и некоторых условно-патогенных микроорганизмов / А.П. Пономарев, В. А. Мищенко.-Владимир:Фолиант,2005.- 158с.

49. Разработка микромодификации РСК для диагностики оспы овец / У.Ж. Керембекова, JI.H. Пасечников, Е.Б. Никитин и др. // Вестн. с.-х. науки Казахстана.-1994,№2.-С.45-48.

50. Романенко, В.Ф. Изучение биологических свойств культуральных вариантов вируса оспы овец / В.Ф. Романенко, В.Н. Сюрин // Вопр.вирусол.-1963.-№2.-С.224-229.

51. Романенко, В.Ф. Размножение и цитопатогенное действие вируса оспы овец в культуре ткани / В.Ф. Романенко // Тр. ВИЭВ.-1961 .-Т.27.-С.51-56.

52. Скалинский, Е.И. Лабораторная диагностика оспы животных / Е.И. Скалин-ский, Ю.Ф. Борисович // Ветеринария.-1986.-№ 11.-С.67-69.

53. Скалинский, Е.И. Структура и морфогенез вируса оспы коз / Е.И. Скалинский, Ю.Ф. Борисович // Ветеринария.-1975.-№7 С.39-41.

54. Скалинский, Е.И. Цитопатические изменения клеток культуры тканей, зараженных вирусом оспы овец / Е.И. Скалинский // Тр. ГНКИ.-1967.-Т.10.-С.110-117.

55. Скалинский, Е.И. Электронная микроскопия вируса оспы овец / Е.И. Скалинский // Тр. ГНКИ.-1962.-Т.11.-С.40-42.

56. Сосов, Р.Ф. Методические указания по применению статистических методов в эпизоотологии / Р.Ф. Сосов, А.А. Глушков.-М.;1974.-67с.

57. Теория и практика иммупоферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дхантиев, Е.М. Гаврилова.-М.: Высшая школа, 1991.-288с.

58. Троценко, Н.И. Размножение вируса оспы овец на культурах тканей / Н.И. Троценко // Тр. ГИКИ.-1961 .-Т.9.-С.24-33.

59. Частная вирусология: Руководство. Т.2 / под ред. В.М. Жданова, С.Я. Гайда-мович,- М.:Медицина,1982.-С.340-374.

60. Черняк, Е.П. Биологические свойства производственных штаммов вируса оспы овец / Е.П. Черняк, Г.Д. Кузнецова, В.В. Гупенков // Ветеринария.-1991.-№3.-С.24-26.

61. Эпизоотическая ситуация по оспе овец и коз и ее профилактика в России / В.М. Захаров, В.И. Диев, A.M. Рахманов, Н.А. Яременко // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: тр. Междунар. науч.-практ. конф.-Покров,2003.1. C.345-354.

62. Эффективность сухой культуральной вирусвакцины из штамма НИСХИ против оспы овец / Ф.П. Курченко, В.Н. Иванющенков, К.П. Уфимцев и др. // Вете-ринария.-1991.-№10.-С.21-23.

63. A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32, the homolog of the vaccinia virus H3L gene / H.G. Heine, M.P. Stevens, A.J. Foord,

64. D.B. Boyle // J. Immunol. Metods.-1999.-Vol.227.-P.187-196.

65. A classical live attenuated vaccine for sheep pox / V. Bhanuprakash, B.K. Indrani, R. Hegde et al. // Mol. Cell Probes.-2007.-Vol.21.-№4.-P.276-281.

66. A duplex PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Capripoxvirus and Orf virus / M. Zheng, Q. Liu, N. Jin et al. // Trop. Anim. Health Prod.-2004.-Vol.36.-№4.-P.307-320.

67. Absence of lumpy skin disease virus in semen of vaccinated bulls following vaccination and subsequent experimental infection / U.I. Osuagwuh, V. Bagla, E.H. Venter et al. // Vaccine.-2007.-Vol.25.-N12.-P.2238-2243.

68. Altinel, C. Studies on the productin of a prototype sheep and goat pox vaccine in lamb testes cell culture / C. Altinel, F. Ozyoruk, F. Uyanik // Pendik Vet. Mikrob. Der-gisi.-1993.-Vol.24.-№l.-P.47-55.

69. Animal health yearbook 1996 / FAO-WHO-OIE.-Rome,1997.-284p.

70. Animal health yearbook 1997 / FAO-WHO-OIE.-Rome,1998.-290p.

71. Application of ELISA in the detection of goat pox antigen and antibodies / B. Sharma, B.S. Negi, M.P. Yadav et al. // Acta Virol.-1988.-Vol.32.-№l.-P.65-69.

72. Bafra, S.K. Adaptability of capripox virus in continuous cell line of ovine origin / S.K. Bafra, S.K. Kalra // Indian. J.Microbiol.-1990.-Vol.30.-№l.-P.85-88.

73. Bana, A.S.A1. Purification, physical and chemical analysis of sheep pox virus and the response of sheep and goats to infection with sheep and goat pox viruses / A.S.A1. Bana: Ph.D.Thesis, Control University-1978.-P.194.

74. Bhat, P.P. A comparison of genomes of sheep pox virus isolates / P.P. Bhat // Indian J. Exp. Biol.-1998.-Vol.27.-№8.-P.714-717.

75. Bhat, P.P. Identification and size variation of terminal fragments of sheep pox virus genome / P.P. Bhat, B.P. Mishra, P.N. Bhat // Indian J. Exp. Biol.-1991.-Vol.29.-N5.-P.434-436.

76. Black, D.N. Genomic relationship between capripox viruses / D.N. Black, J.M. Hammond, R.P. Kitching // Virus Res.-1986.-Vol.5.-P.277-292.

77. Cao, J.X. Sequence analysis of Hindlll Q2 fragment of capripoxvirus reveals a putative gene encoding a G-protein-coupled chemokine receptor homologue / J.X. Cao, P.D. Gershon, D.N. Black // Virology.-1995.-Vol.209.-Nl.-P.207-212.

78. Cam, V.M. An antigen trapping ELISA for the detection of capripox virus in tis-siue culture supernatan and biopsy samples / V.M. Cam // J. Virol. Methods.-1995.-Vol.51.-P.95-102.

79. Cam, V.M. Control of capripox virus infections / V.M. Cam // Vaccine.-1993.-Vol.ll.-№13.-P.1275-1279.

80. Chand, P. Molecular and immunological characterization of a major envelope protein of capripoxvirus: Ph.D Thesis, University of Surrey, 1992.

81. Counter-immunoelectrophoresis for rapid diagnosis of sheep pox / P. Chand, V.D. Rao, S.K. Garg, I.P. Singh, R. Chandra//Br. Vet. J.-1985.-Vol.l41.-N2.-P.124-128.

82. Crowther, J.R. ELISA. Theory and practice / J.R. Crowther // Methods in Molecular Biology.-Totowa, New Jersey, 1995.

83. Dardari, A.H. Sheep and goats pox / A.H. Dardari // Indian Forein Anim. Dis. Comm. Unit. St. Anim. Hlth. Assoc. Publ.-1984.-P.309-316.

84. Das, S.K. Effect of some physicochemicals characters of sheep pox virus strains after passage in lamb testicular cells / S.K. Das, B.B. Mallick // Indian. J. Anim. Sci.-1985.-Vol.55.-№3.-P.155-159.

85. Das, S.K. Evolving of live modified sheep pox viral strains: modification of indigenous viral strains / S.K. Das, B.B. Mallick// Indian J. Exp. Biol.-1986.-Vol.24.-N5.-P.282-286.

86. Das, S.K. Susceptibility of various cell culture systems to sheep pox virus strains / S.K. Das, B.B. Mallick // Indian J. Exp. Biol.-1984.-Vol.22.-№4.-P.205-208.

87. Davies, F.G. Characteristies of a virus cansing a pox disease in sheep and goats in Kenia with observation on the epidemiology and control / F.G. Davies // J.Hyg.Camb.-1976.-Vol.76.-№2-P.163-171.

88. Davies, F.G. Relationship of capripox viruses found in Kenia with two Middie Eastern strains and other orthopox viruses / F.G. Davies, C. Otema // Res.Vet.Sci.-1981.-Vol.31.-P.253-355.

89. Davies, F.G. The alterations in pathogenicity and immunogenicity of a Kenya sheep and goat pox virus on serial passage in bovine foetal muscle cell cultures / F.G. Davies, G. Mbugwa// J. Сотр. Path.-1985.-Vol.95.-№4.-P.565-572.

90. Davies, F.G. The antibody response in sheep infected with a Kenyan sheep and goat pox virus / F.G. Davies, C. Otema//J. Сотр. Path.-1978.-Vol.88.-№2.-P.205-210.

91. Differentiation of sheep pox and goat poxviruses by sequence analysis and PCR-RFLP of P32 gene / M. Hosamani, B. Mondal, P.A. Tembhurne et al. // Virus Genes.-2004.-Vol.29.-№1 .-P.73-80.

92. Douglas, H.W. Micro-electrophoresis of pox viruses in molar sucrose / H.W. Douglas // J. Gen. Virol. -1969.-Vol.5.-№3.-P.391-396.

93. Dubey, S.C. Propagation of goat-pox virus in monolayer cultures of embryonic caprine lung / S.C. Dubey, A.N. Sawhney // Indian J. Exp. Biol.-1975.-Vol.l3.-№3.-P.304-305.

94. El-Awar, F. Characterization of sheep pox virus attenuated in cell culture / F. El-Awar, A. El-Zelin // J. Vet. Med.-1986.-Vol.33.-№8.-P.601-608.

95. Epidemiology of sheep pox / L.M. Belwal, A.E. Nivsarkar, P.B. Mathur, R.M. Singh // Trop. Anim. Health. Prod.-1982.-№14.-P.229-233.

96. Evaluation of immunocapture ELISA for diagnosis of goat pox / T.V. Rao, P. Malik, S. Nandi, B.S. Negi // Acta Virol.-1997.-Vol.41.-№6.-P.345-348.

97. Evaluation of latex agglutination test for rapid detection of goat poxvirus antigen and antibodies / T.V. Rao, B.S. Negi, P. Dhar, D. Asgola // Acta Virol.-1996.-Vol.40.-№2.-P.95-97.

98. Fassi-Ferri, M. Etude experimentale de 1'immunite anticlaveleuse post-vaccinale / M. Fassi-Ferri, M. El-Harrak, D. Johnson // Ann. Rec. Vet.-1984.-Vol.l5.-№l-P.59-64.

99. Fenner, F. Poxviruses of laboratory animals / F. Fenner // Lab. Anim. Sci.-1990.-Vol.40.-№5.-P.469-480.

100. Gershon, P.O. A comparison of the genomes of capripoxvirus isolates of sheep, goats and cattle / P.O. Gershon, D.N. Black // Virology.-1988.-Vol.l64.-P.341-349.

101. House, J.A. Sheep and goats pox / J.A. House, A.E. Castro, W.P. Heuschele // Vet. Diagn. Virol.: A Pract. Guide. -St. Louis,USA,1992.- P.217-219.110. http://www.oie.int/wahid-prod/public.php?page=diseasetimelines&diseaseid:=10

102. Hunter, P. Lumpy skin disease in southern Africa: a review of the disease and aspects of control / P. Hunter, D. Wallace // J.S.Afr.Vet.Assoc.-2001.-Vol.72.-N2.-P.68-71.

103. Jadhav, K.M. Field observation on sheep pox tissue culture vaccine / K.M. Jadhav, A.K. Pandey, N.S. Radadia// Indian. Vet. J.-1989.-Vol.66.-№10.-P.908-912.

104. Jassim, F.A. Propagation of sheep pox virus in cell cultures / F.A. Jassim, B.T. Keshavamurthy // Acta Virol.-1982.-Vol.26.-№3.-P. 190-192.

105. Joklik, W.K. The preparation and characterization of highly purified radioactively labeled poxvirus / W.K. Joklik//Biochem. Biophis. Acta.-1962.-Vol.61.-№2.-P.290-301.

106. Joklik, W.K. The purification of four strains of poxvirus / W.K. Joklik // Virology.-1962.-Vol.18.-P.9-18.

107. Katiyar, M.C. Studies on adaptation of goats pox virus in goat kidney cell culture / M.C. Katiyar, J.P. Soman // Indian Vet. J.-1987.-Vol.64.-№4.-P.261-265.

108. Kirubaharan, J.J. Adaptation of sheep pox virus (Ranipet strain) to BHK-21 cell line / J.J. Kirubaharan, A.P. Sugitha, V.D. Padmanaban // Indian. Vet. J.-1993.-Vol.70.-№1.-P. 4-6.

109. Kirubaharan, J.J. Titration of sheep pox virus in BHK-21 cell line / J.J. Kirubaharan, A.P. Sugitha, V.D. Padmanaban//Indian. Vet. J.-1993.-Vol.70.-№ll.-P.1073-1074.

110. Kitching, P. Progress towards sheep and goat pox vaccines / P. Kitching // Vac-cine.-1983.-Vol.l.-№l.-P.4-9.

111. Kitching, R.P. Clinical and antigenic relationship between isolates of sheep and goats pox viruses / R.P. Kitching, W.P. Taylor // Trop. Anim. Health. Prod.-1985.-Vol.l7.-№2.-P.64-74.

112. Kitching, R.P. Comparison of the external dimensions of capripoxvirus isolates / R.P. Kitching, C. Smale // Res. Vet. Sci.-1986.-Vol.41.-№3.-P.425-427.

113. Kitching, R.P. Passive protection of sheep against capripoxvirus / R.P. Kitching // Res. Vet. Sci.-1986.-Vol.41.-№2.-P.247-250.

114. Kitching, R.P. Studies on the major common precipitating antigen of capripoxvirus / R.P. Kitching, J.M. Hammond, D.N. Black // J. Gen. Virol.-1986.-Vol.67.-N.l.-P.139-148.

115. Kitching, R.P. The characterisation of African strains of capripoxvirus / R.P. Kitching, P.P. Bhat, D.N. Black//Epidemiol. Infect.-1989.-Vol.l02.-№2.-P.335-343.

116. Kitching, R.P. The control of sheep and goats pox / R.P. Kitching // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1986.-V.5,№2.-P.503-511.

117. Kitching, R.P. Vaccines for lumpy skin disease, sheep pox and goat pox / R.P. Kitching//Dev. Biol. Standard.-2003.-V.114.-P.161-167.

118. Klotz, E.L. Somatic hypermutation of an artificial test substrate within an lg kappa transgene / E.L. Klotz, J. Jr. Hackett, U. Storb // J. Immunol.-1998.-V. 161,N2.-P.782-790.

119. Krishnan, R. Pathogenesis of sheep pox / R. Krishnan // Indian Vet. J.-1968.-V.45,№4.-P.297-302.

120. Lefevre, P.C. Sheep and goats pox / P.C. Lefevre // Ins. Elev. Med. Vet. Pays Trop. Prod.-1983.-P. 171.

121. Lumpy Skin disease / J.T. Timoney, J.H. Gillespie, F.W. Scott, J.E. Barlough // Hagan and Bruner's Microbiology and Infectious Diseases of Domestic Animals.-8th ed.-Comstock Publ. Assoc.-Ithaca; London, 1988.-P.577-579.

122. Mallick, B.B. Nonspecific immunostimulation against viruses. 2. Field use to prevent goat-pox virus infection / B.B. Mallick, S.K. Das // Indian J. Anim. Sci.-1989.-V.59,№32.-P.307-317.

123. Martin, W.B. Test in sheep of attenuated of sheep pox vaccines / W.B. Martin, H. Ergin, A. Koylii //Res. Vet. Sci.-1973.-V.14,№l.-P.53-61.

124. Murray, M. Experimental sheep pox. A histological and ultrastructural study / M. Murray, W.B. Martin, A. Koylu//Res. Vet. Sci.-1973.-V.15,№2.-P.201-208.

125. OIE. Animal Health Status and Disease Control Methods in Member Countries in1997.-Paris, 1998.-Part.2.-162p.

126. OIE. Animal Health Status and Disease Control Methods in Member Countries in1998.-Paris, 1999.-Part.2.-187p.

127. OIE. Animal Health Status and Disease Control Methods in Member Countries in1999.-Paris,2000.-Part.2.-204p.

128. OIE. Animal Health Status and Disease Control Methods in Member Countries in2000.-Paris,2001 .-Part. 1-3.

129. OIE. World Animal Health in 2003.-V.2.-Paris,2004.-750p.

130. OIE. World Animal Health in 2004.-V.2.-Paris,2005.-380p.

131. Pandey, A.K. Adaptation and neutralization of sheep pox virus in cell culture / A.K. Pandey, P. Sarkar, S.P. Singh // Indian Vet. J.-1984.-Vol.61.-№6.-P.l 11-114.

132. Pandey, R. Soluble antigens of sheep pox and goat pox viruses as determined by immunodiffusion in agar gel / R. Pandey, I.P. Singh // Acta Virol.-1972.-Vol.l6.-№l.-P.41-46.

133. Parthiban, M. Usefulness of BHK-21 (Razi) cell line in evolving a cell-line adapted sheep-pox virus for vaccine production / M. Parthiban, K. Kumanan, V.D. Pad-manabair // Indian. J. Anim. Sci.-1993.-Vol.63.-№65.-P.515-517.

134. Plowright, W. The growth and cytopathogenicy of sheep pox virus in tissue culture / W. Plowright, R.D. Ferris // British J. of Exp. Path.-1956.-№36.-P.424-435. 4

135. Plowright, W. The pathogenesis of sheep pox in the skin of sheep / W. Plowright, W.G. Mac Leod, R.D. Ferris // J. Сотр. Path.-1959.-V.69.-P.400-413.

136. Protective immune responses induced by different recombinant vaccine regimes to Rift Valley fever / D.B. Wallace, C.E. Ellis, A. Espach et al. // Vaccine.-2006.-Vol.24.-N49-50.-P.7181-7189.

137. Ramyar, H. Isolation, cultivation and characterization of camel pox virus / H. Ramyar, M. Hessami // Zentralbl. Veterinarmed, (B).-1972.-Vol.l9.-№3.-P.182-189.

138. Ramyar, H. Propagation of goat pox virus on monolayer cell cultures / H. Ramyar //Zentralbl. Veterinarmed, (B).-1966.-Vol.l3.-№4.-P.334-337.

139. Rao, T.V. A comprehensive review of goat pox and sheep pox and their diagnosis / T.V. Rao, S.K. Bandyopadhyay // Anim. Health Res. Rev.-2000.-Vol.l.-№2.-P.127-136.

140. Rao, T.V. Evaluation of avidin-biotin ELISA for the detection of antibodies to goat poxvirus using noninfectious diagnostic reagent / T.V. Rao, P. Malik, D. Asgola // Acta Virol.-1999.-Vol.43.-№5.-P.297-301.

141. Rao, T.V. Evaluation of different serological tests for the diagnosis of goat pox using soluble antigens / T.V. Rao, B.S. Negi // Trop. Anim. Health Prod.-1997.-Vol.29.-№4.-P.23 5-239.

142. Reddy, Y.K. Outbreak of sheep pox a case report / Y.K. Reddy // Indian. Vet. Med. J.-1993.-Vol. 13.-№2.-P.86.

143. Renshaw, H.W. Serologic and cross-immunity studies with contagious ecthyma and goat pox virus isolates from the western United States / H.W. Renshaw, A.G. Dodd // Arch. Virol.-1978.-Vol.56.-№3.-P.201-210.

144. Romyar, H. Observations on the use of live-modified tissue culture vaccine against sheep pox//Bull. Off. Int. Epiz.-1974.-Vol.81.-P.881-887.

145. Sahu, S.P. Susceptibility of mink to certain viral animal diseases foreign to the United States / S.P. Sahu, A.H. Dardiri // J. Wildl. Dis.-1979.-Vol.l5.-№3.-P .489-494.

146. Sawhney, A.N. Goat-pox: an anthropozoonosis / A.N. Sawhney, A.K. Singh, B.S. Malik // Indian J. Med. Res .-1972.-Vol.60.-№5.-P.683-684.

147. Sen, K.C. Studies on goat pox virus. 2. Serological properties / K.C. Sen // Indian J. Med. Res.-1968.-Vol.56.-№8.-P.l 157-1163.

148. Sen, КС. Immunobiological relationship of goat pox and sheep pox viruses / КС. Sen //Indian J. MedRes.-1968.-Vol.56.-№8.-P.l 153-1156.

149. Sharma, P.S. Immunological responce of RM/65 sheep pox vaccine in lams / P.S. Sharma, S. Prasad, S.K. Kalra // Indian J. Anim. Sci.-1987.-Vol.57.-№9.-P.923-928.

150. Sheep poxvirus identification by PCR in cell cultures / O. Mangana-Vougiouka, P. Markoulatos, G. Koptopoulos et al. // J. Virol. Methods.-1999.-Vol.77.-№l.-P.75-79.

151. Sheep poxvirus identification from clinical speciements by PCR, cell culture immunofluorescence and agar gel immunoprecipitation assay / O. Mangana-Vougiouka, P. Markoulatos, P. Koptopoulos et al. // Mol. Cell. Probes.-2000.-Vol.l4.-№5.-P.305-310.

152. Spread of lumpy skin disease in Israeli dairy herds / I. Yeruham, O. Nir, Y. Braverman et al. // Vet. Rec.-1995.-Vol.l37.-N4.-P.91-93.

153. Structural proteins of sheep pox virus: analysis by polyacrylamide gel electrophoresis / A.K. Chakrabarty, R. Pandey, VK. Sharma // Indian J. Pathol. Microbiol.-1978.-Vol.21.-N4.-P.325-328.

154. Subba Rao, M.V. Cross-neutralization tests on sheep pox, goat pox and contagious pustular dermatitis viruses / M.V. Subba Rao, B.S. Malik // Acta Virol.-1979.-Vol.23.-№2.-P.165-167.

155. Use of a recombinant antigen in an indirect ELISA for detecting bovine antibody to capripoxvirus / V.M. Cam, R.P. Kitching, J.M. Hammond, P. Chand // J. Virol. Meth-ods.-1994.-Vol.49.-P.285-294.

Информация о работе

Кукушкина, Мария Сергеевна
кандидата биологических наук
Владимир, 2008
ВАК 03.00.06

Диссертация

Иммунобиологическая характеристика вакцинных и вирулентных штаммов вирусов оспы овец и оспы коз - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы