Диссертации » Биологические науки » Вирусология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование методов диагностики оспы овец и оспы коз
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов диагностики оспы овец и оспы коз"

1.1 np.iu.ix рукописи

□03058 Юо

ОРЛОВА Елена Сер!сейма

С ОКМЧШЛК 1(КЖЛНПЬ 1ЧЬIОДОЙ ДИЛ1 П()(111К11 ОСПЫ ОН1.Ц II ОС ИМ КО $

03.00.06 «Вирусоло! ия»

Лпюрсфср.и

лнссеркшии на соискание ученой сюпснп канлпл.11.1 биоло! п'ихкпч наук

п

9 £

Владимир - 2007

003058106

Работа выполнена и Федеральном государы венном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г Владимир)

Научный руководитель - кандидат биоло! нческих наук

ЩЕРБАКОВ Алексей Владимирович

Официальные оппоненты - РЫБАКОВ Сергей Сергеевич

доктор биологических наук, профессор (ФГУ «Федеральный цешр охраны здоровья животных, г Владимир), - ЦЬ'ПАПОВ Содном Жамьянопич, доюор ()иоло1 ических наук, профессор (I ПУ ВИИИВпМ, i Покрои)

Ведущая организация ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и

стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ», г Москва)

Зашита лисссрiакии состоится «#» MCuZ. 2007 гола в 10 часов па заседании дисссргациоппот совеы Д 220 015 01 при ФГУ «Федеральный цетр охраны здоровья животных» но адресу 600901 i Владимир мкр Юрьевен

С лисссрыцпеп можно ознакомимся в библиои.ке ФГУ «Федеральный цетр охраны (доровья живо1 пых»

Автрефера! разослан «#» апреля 2007 юла

Ученый секрсмарь диссертационного совета, кандидат биоло! ических наук,

1.01.ЩЛЯ \Л1'Л1С1 lilMICI MICA I'AhOlhl

Ahiiira'ibiiiHiiib темы Olii.i овец и очи koj - ni.iLOKOKoiuai iiojiii.ii. имруспыс

I.IIMUILII.IIIIIM МСЛКИХ ЛИ.1Ч11Ы\ По кл.кспфпк.щип М )Ь OIIII OIIIOLMILM К I p.HILI pal шчпым Gdjiljii'im жиношых способным вызываи. jiiiuooimh и п.нюшп, большой ЖОПОМИЧССКИИ ущерб OclUI ОМСК И ОСИП КО) ЗНДеМИЧПЫ 11.1 Ьлпжнем НосIОКС, II

Цешральнои Азии, Индии, Китае, а ыкже и Цешралыюи и Южной Африке В 1996-2003 и неб ииополучпыми по эшм заболеваниям были 55 сIрам, и юм числе 7 стран СИГ В Рои, и и оспа pel иприровалась и 1994-2000 и 2002-2003 п (Woikl Animal I Icallh, 19961997)

Возбуди i елями Gojilihcii являкжя Гымикоролсшснпмс по ыксономнчески tlMOCIOMICJIbllUC НИДЫ - UHpyL OL11I.1 OIICU (BOO) II IIHpyL OLIII.I KOJ (ВОК) - опюсящисся к роду Caprypox семсистна Powiridae BOO и BOK не обладаю! че1ко иыраженнои озяисшй специфичностью iillmoiph на ю, что обычно uiipyLW вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец либо у коз, некоторые нламмы патогенны для )бои\ видов животных-хозяев (Kitching R Р and Cam V М, 2000) Ото делает актуальной задачу видовой дифференциации возбудителей оспы

Для Liiemi(|)iitieLKOH нрофилак i ики оспы использую!ся живые а1"1енуированные п.) Ki it 111 ы BaKiuniitponaiiiii.iL жпиошыс в peiyjn.iaie кош.жм с мпиоошчсскнмн имаммамп Moiyi сишовшься Ollciimii i oMiii.iMti мосиклмми нпр\са и служим, к icpiiwipoM инфекции В ищи! с ним при обнаружении v вакциппронаппыч жмношмч mIр\с.1 оспы поншкаеч необходимоеiь и ;iHi|ii|iepcHiuiamin нанцннпыч и шипим ическич

И1.1ММ0И

Лабораюрная диаиюешка жим основана на обнаружении вируса или ею ос ыв шющич (белков ДНК) н к шнпческом Mdтриале либо .шипел к вирусу в ыморожс крови живошыч

1 радиционпые меюды дпаиюстки оспы овец и ко! (реакция пешрализации iti.I (с и'ипс Hiipycd на кулыхре клсиж) пс способны дифференцирован. ипр\сы оспы овец I оспы коз друг о! дру1а и тем более вакцинные штаммы вирусов oi шпзоо! ических На cciолняиший момеш различай, инрусы рода Capivpox можно юлько методом ice I рпкциопного кар1иронапия или п\kjicoiидпо1 о секвенироваппя вирхспыч leHOMOB ) шан) в силу сложности и фудоеммкт они неприменимы для р\ шшиш диагностики

В соответствии с требованиями МЭБ при подозрении на оспу овец и коз патологический материал должен тестироваться также и на наличие вируса контагиозной эктимы (ВКЭ) Этот парапоксвирус вызывает заболевание, которое, также как и оспа, проявляется поражениями кожи, однако не относится к особо опасным болезням из-за незначительной смертности среди пораженных животных Метода обнаружения вируса контагиозной эктимы с помощью ПЦР в России пока разработано не было

Для выявления антител к BOO и ВОК традиционно используется реакция нейтрализации Метод достаточно дорог, отличается невысокой чувствительностью и может выполняться лишь в условиях специализированных лабораторий с высоким классом биологической защиты Первые попытки применения ИФА для выявления антител к BOO и ВОК были основаны на использовании в качестве антигена частично очищенных препаратов вируса (Sharma et al, 1988b, Rao, 1997) Однако из-за невозможности избавиться от примесей клеточных белков в препаратах антигена специфичность реакции была низкой С целью решения этой проблемы Н G Heine et al (1999) предложили для выявления антител к BOO и ВОК ИФА, основанный на использовании рекомбинантного антигена Р32, полученного экспрессией в Ecoli Разработанный метод ИФА имел ряд преимуществ перед традиционными тест-системами, поскольку рекомбинантный антиген был биологически безопасен, дешев в получении и легко чистился, что обеспечивало высокую специфичность реакции Однако в России подобные работы не проводились

Таким образом, в диагностике оспы овец и оспы коз нерешенными оставался ряд проблем Отсутствовали простые и быстрые методы видовой и штаммовой дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз Не разрабатывались в России и высокоспецифичные иммуноферментные методы для выявления антител к этим вирусам

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в совершенствовании методов диагностики оспы овец и оспы коз

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие

задачи

- провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома вирусов рода ( чр/урох, выявить участки генома, пригодные для видовой

пфференциации каприпоксвирусов и для дифференциации вакцинных и эшиоо i ических штаммов эги\ возбуди i слеп,

разработать простой и быстрый метод обнаружения и дифференциации прусов оспы овец и оспы коз, основанный на ПЦР и не требующий проведения uiMix пополнительных процедур, как ресфикцпоннып анализ пли нуклсошдпос сквенпрованпе амплпконои,

- pajpaOoiaib меюд, позволяющий различап> вакцинные и эпизоошческис шаммы вируса оспы овец,

- для проведения дифференциальной диашостики оспы овец и оспы коз ог oniai позной эктпмы разрабо!агь на основе ПЦР метод обнаружения вируса ■ouiai мозной эктимы,

- получи ib рскомбннаншыс анинены вируса оспы овец jKciipecciieii u L loIi,

- на основе рскомбинашых ашшенов paipaGoiaib иммупофермешный меюд uiH выявления анппел к вирусам оспы овец и оспы коз

Научная повили/ исследовании Впервые разработан экспресс-метод, озволяющий выявлять и дифференцировать виды каприпоксвирусов только на спове ПЦР, без дополнительных исследований (рестрикционного анализа или 1уклеот идного секвенирования)

Предложен мегод дифференциации вакцинных пиаммов «НИСХИ», <ВНИИЗЖ» и «Б 5/96» вируса оспы овец ог эпизоотических изолятов на основе 1ЦР с последующим ресфпкцпонпым анализом ампликопов, пе имеющий аналогов i днш пост ике оспы овец

Предложен метод дифференциальной диагностики вируса оспы овец и вируса спы коз от вируса контагиозной экт имы

Экспрессией в Не oh получены рекомбинантные белки Р17, PI8 и Р32 вируса спы овец

Разрабо1а» пепрямоп варили i ИФА с использование рскомбинаптиых белков '17 и Р18 в качестве антигенов для обнаружения анппел к каприпоксвирусам в ыворотках крови мелких жвачных

Практическая шччи woe un, luc'ieôoaauuu И резулылк- проведенных ^следований разрабо!апо 5 методик которые успешно прошли комиссионные

испытания, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

«Методика обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции» (2005 г ),

«Методика обнаружения вируса контагиозной эктимы с использованием полимеразной цепной реакции» (2005 г ),

«Методика дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец с использованием рсстрикционного анализа продуктов ПЦР» (2005 г ),

«Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена PI7 вируса оспы овец» (2006 г ),

«Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена PI8 вируса оспы овец» (2006 г )

Разработанные метлики немользунися в Ф1 У «Федеральным центр охраны здоровья животных» в диагносшческнх исследованиях

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ

Апробация работы Материалы диссертации представлены и обсуждены на Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезнен животных» (Владимир, 2004 г ), а также на заседаниях ученою concia Ф1 У «Федеральный центр охраны ¡доронья жнпошых» » период 2002-2006 п

Онишиме положения, выносимые ни шщиту

Метол обнаружения и вндовоП дифференциации каприпоксвирусов с пеполыопанием мультиплексной 11ЦР (мПЦР)

Метод дифференциации вакцинных н эпиюошчсскнх штаммов вируса оспы овец с исполыопаннсм pecipiiKiiiioinioio ппалша продуктов ПЦР

Meiод обнаружения вируса кошапюшой ikiiimi.ic пеполыопапием ПЦР Получение рекомбинантных антигенов вируса оспы овец и оценка их антигенной активности

Использование рекомбинантных антигенов Р17 и Р18 вируса оспы овец в пепрямом варианте ИФА

Структура и объем работы Диссертация изложена на 133 страницах и одержит следующие разделы введение, обзор литературы, собственныу сследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных езультатов, выводы, практические предложения и приложения Список спользуемой литературы включает 188 источников, из которых 149 на iHocipíiiinoM языке Работа иллюстрирована 10таблицами и 16 рисунками

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы н методы Патологический материал. В работе использовали органы и ткани от кспериментально зараженных оспой овец и коз, от здоровых невакцинированных ротив оспы овец и коз, а также от коз, больных контагиозной эктимой

Вирусы. В работе использовали штамм "ВНИИЗЖ" и изоляты Афганский", "Приморский", "ЕАО" вируса оспы овец, штаммы "ВНИИЗЖ", Pellor" и изоляты "Таджикский", "ЕАО" вируса оспы коз, а также вирус бугорчатки PC и изолят «Таджикский» вируса контагиозной эктимы из коллекции вирусов ГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Вирусы получены из лаборатории «Общих болезней для разных видов ивотных» и отдела «Биологического и технологического контроля» ФГУ Федеральный центр охраны здоровья животных» (г Владимир)

Сыворотки. Использовали полевые сыворотки от овец и коз из хозяйств азличных регионов России, а также сыворотки крови от экспериментально араженных вирусом оспы овец или вирусом оспы коз мелких жвачных животных с одтвержденным в реакции нейтрализации серологическим статусом, редос гавленные отделом «Биологического и технологического контроля» ФГУ Федеральный центр охраны здоровья животных» (г Владимир)

Плазмиды. Для получения экспрессируюшей конструкции была спольювана плазмида pQE (фирма «Qiagen»)

Бактериальные штаммы. Для трансформации и экспрессии екомбинантных плазмид использовался штамм M15 Ecoh [pREP4] Е coli К12 (nals, trs, rif, lac, ara", gal, mtl", F'", recA+, uvr\ Ion*) pREP4 - kan' Источник штамма ->ирма «Qiagen»

Пероксидазнын конъюгат. Использовали коммерческий препарат меченных пероксидазой хрена моноклонапьных антител, реагирующих с IgG коз и овец (Sigma, США)

Выделение ДНК. Выделение суммарной ДНК из патологического материала и культуры клеток проводили по модифицированному методу О Г Грибанова с соавторами (О Г Грибанов, 1996)

Расчет и синтез праймеров. Расчет праймеров выполняли на основе нуклеотидных последовательностей каприпоксвирусов, представленных в базе данных GenBank Синтез праймеров осуществляла фирма «Синтол» (Москва)

ПЦР проводили в реакционной смеси следующего состава 2,5 мкл 10* буфера для Taq-полимеразы, 3 мМ Mg2\ 0,2 мМ dNTPs, 1,0 ед Taq-полимеразы, по 10 пмоль праймеров, 3 мкл раствора вирусной ДНК и вода до конечного объема 25 мкл Амплификацию проводили на ДНК-амплификаторе РТС-100 (MJ Research, США) при следующем температурном режиме 2 мин предварительной денатурации при 94°С, 35 циклов амплификации (30 с денатурации при 94°С, 30 с отжига праймеров при 55°С, 30 с элонгации при 72°С) и 2 мин заключительной элонгации При необходимости проводили второй раунд амплификации с внутренними праймерами в смеси аналогичного состава в течение 20-25 циклов Продукты реакции анализировали с помощью электорофореза в 2,0% агарозном геле, содержащем 0,001% бромистого этидия, при силе тока 50 мА

Молекулярное клонирование продуктов ПЦР. Продукты ПЦР очищали от компонентов реакционной смеси по методике, аналогичной выделению ДНК Реакции рестрикции и лигирования проводили в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей ферментов Трансформацию и приготовление компетентных клеток Е coli проводили по методике Ханаана (1988) Культивирование Е coli проводили в среде LB и на LB-arape при 37°С Скрининг клонов, несущих рекомбинантные плазмиды, проводили с помощью аналитического выделения плазмид и последующего рестрикционного анализа Выделение плазмидной ДНК из клеток Е coli осуществляли методом щелочного лизиса, модифицированного Н Г Холодиловым (1990)

Экспрессия рекомбинантных белков. Экспрессию рекомбинамтных белков оводили добавлением индуктора (ИПТГ) в культуру клеток Г coli, достигшую гарифмичеекой фазы роста

Очистка рекомбинантных белков Очистку рскомбинапшых белков проводили помощью мета лл-хелат ной хромат oiрафии Осадок клеток I coli обрлб.иывали зирующим буфером, затем центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин К падоелдку бавляли Ni-NTA agarose («Qiagen») и инкубировали при помешивании 15 мин рбент дважды промывали лизирующим буфером Белки элюировали с сорбента с мощью раствора имидазола Уровень экспрессии и степень очистки препарата белка епивали с помощью электрофореза в ПЛАГе Концентрацию белков определяли по едфорду (Т Маниатис и др , 1984)

Непрямой вариант ИФА. Тестирование сывороток п ИФА методом следовательных разведений проводили по общепринятой методике с некоторыми дификациями (Егоров, 1991)

Статистическая обработка результатов. Определение среднего ифметического ( х ) при количестве опытов (п), среднего квадратичного отклонения ) средней арифметической проводили соимсно руководству И В Полякова (1975)

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

РнзраПшкл мультиплексной ПЦРдля индикации и видовой дифференциации кпприпоксвирусов

В резулы.не анализа полных пуклеошдпмх жклелопенелмюыей 1Снома припоксвирусов, представленных в базе данных GenBank, были установлены доспецифичные участки для BOO, ВОК и вируса бугорчатки (ВБ) На основе этих иных для видовой дифференциация каприпокспирусов были сконструированы 1доспецифичпые праймеры SI и S2 - для BOO, Gl иС|2-дляВОК

Род каприпоксвирусов, кроме BOO и ВОК включает и ВБ, также вызывающий особо асиое заболевание животных Несмотря па то, что этот вирус поражает еимуществсппо КРС, описаны случаи, когда он вызывал заболевание у овец и коз оэтому мы ввели третью пару праймеров (LI и L2), специфичных для вируса горчатки, чюбы сделать метод логически законченным

Видоспецифичные праймеры были рассчитаны таким образом, что синтезируемые с их участием ампликоны имели разную длину 415 п н для ВОК, 311 п н для BOO и 254 п н для ВБ Это позволяло использовать все три пары праймеров в одной реакции и различать продукты мультиплексной ПЦР по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле Взаимное расположение праймеров на геноме представлено на рисунке 1

Для увеличения аналитической чувствительности метода система была дополнена двумя внешними родоспецифичными праймерами С1 и С2, универсальными для всех трех видов каприпоксвирусов

Для оценки специфичности метода видовой дифференциации каприпоксвирусов было исследовано 11 проб, содержащих различные каприпоксвирусы Среди них были вируссодержащие клеточные культуры со штаммом «ВНИИЗЖ» и изолятами «Афганский», «Приморский», «ЕАО» вируса оспы овец, штаммами «ВНИИЗЖ», «Pellor» вируса оспы коз, вирусом бугорчатки, а также

703 /693 п и

415 пн

5'| || ОРС 026 || |3'

Рис. 1. Схема расположения на геноме родо- и видоспецифичных праймеров для видовой дифференциации каприпоксвирусов

CI, С2 - родоспецифичные праймеры, SI, S2 - видоспецифичные праймеры для вируса оспы овец, Gl, G2 - видоспецифичные праймеры для вируса оспы коз, LI, L2 - видоспецифичные праймеры для вируса бугорчатки Сверху указана длина фрагментов ДНК, получаемых в ПЦР 703 п н - для ВОК, 693 п н - для BOO и ВБ

золатами «ЕЛО» м «Таджикский» ВОК В виде суспензии кожи больных животных, роме того, были нриюгоиисны пробы, содержащий смесь двух и трек видов рпршкксвирусов одновременно.

После проведения первого раунда 11ЦР с универсальными ираймерам» С1 и С2 пецифичеекий фрагмент расчетной длины (693/700 п.н.) был получен как дня проб, о держа них BOO, БОК" или В Б, гак и для проб с их смссыо (рис. 2Л), Подученные езультаты подтвердили универсальность праймеров С1 и С2 для всех трех видов

; aft и 11 о ксв пруео и.

!

А 12345678 -9 10 11 12 13

[i.

I

10 И 12 13.

■ :. zk 0

Р sc. 2. Обнаружение и видовой дифференциации капрнпоксвирусов. Электрофорез в 2%-ном а гя роз ном геле продуктов 11ЦР

А - первый раунд 11ЦР с универсальными прайм срам и С1 и С2; В - второй рауид ПЦР с кидоспсцифическимн ираймерами

(мультиплексный вариант); ) — отрицательный контроль;

2 - маркер (Снизу вверх - 100, 200,

300, 400. 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

3 - BOO, вакцинный штамм

"ВНИИЗЖ!

4 — BOO, эпизоотический штамм

"Афганский";

5 - BOO, эпизоотический штамм

^"Приморский";

6 - BOO, эпизоотический штамм

"CAO";

7 - ВОК, эпизоотический штамм

"Таджикский";

8 - ВОК, вакцинный штамм

"ВНИИЗЖ";

9 - ВОК, эпизоотический штамм

"ЕАО";

! 0 - ВОК, эпизоотический штамм

"Pellor"; 1 1 — вирус бугорчатки;

12 - смесь BOO и ВОК;

13 - смесь BOO, ВОК и ВВ

Специфический фрагмент ДНК отсутствовал в пробах, содержащих изоляты "Таджикский" и "ЕАО" ВОК Эти пробы отличались от остальных тем, что представляли собой суспензию органов и, вероятно, содержали вирус в концентрации, недостаточной для обнаружения с помощью одного раунда ПЦР Результаты второго раунда ПЦР подтвердили это предположение

На рисунке 2В отражены результаты второго раунда ПЦР с видоспецифичными праймерами (мультиплексной ПЦР) В пробах, содержащих ДНК BOO, был получен ампликон длиной 311 п н, что соответствует расчетному значению Фрагмент длиной 415 пн синтезировался в пробах с генетическим материалом ВОК Ожидаемый результат - ампликон длиной 254 п н - был получен и в пробе с ДНК ВБ В пробах, содержащих смесь ДНК BOO и ВОК, синтезировались два фрагмента, а со смесью ДНК BOO, ВОК и ВБ - три ампликона соответствующей длины

Неожиданный результат был получен при анализе пробы, содержащей изолят "Таджикский" ВОК Электрофорез продуктов мультиплексной ПЦР показал наличие в этой пробе фрагмента длиной 311 п н, специфичного для BOO, вместо ожидаемого фрагмента размером 415 пн, характерного для ВОК На основании полученных результатов было выдвинуто предположение, что изолят «Таджикский» в действительности является вирусом оспы овец Дальнейшие исследования другого фрагмента генома подтвердили это предположение

С использованием серии последовательных разведений вируса была определена аналитическая чувствительность метода. Она составила Ю2ЦПД50/мл для первой ПЦР и 10"2 ЦПД50/мл для nested-ПЦР

Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан высокочувствительный и специфичный метод, позволяющий выявлять каприпоксвирусы и определять их видовую принадлежность По результатам комиссионных испытаний «Методика обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции» одобрена ученым советом и утверждена директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Разработка метода дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов BOO

Для специфической профилактики оспы овец и коз используются аттенуированные вакцины В связи с этим при обнаружении у вакцинированных

животных вируса оспы возникает необходимость в определении его принадлежности к вакцинному или эпизоотическому штамму Решение этой диагностической проблемы составляло вторую задачу наших исследований

В настоящее время в России и странах СНГ для специфической профи шктики оспы овец наиболее широко используются вакцины из двух аттенуированных штаммов "ВНИИЗЖ" (В И Диев, 1998) и "Б-5/96" (И Ф Вишняков и др, 1999) Оба они являются производными аттенуированного штамма "НИСХИ", полученного В Н Иванющенковым с соавт путем пассирования в культуре клеток почки ягненка вирулентного штамма "Афганский" (В Н Иванющенков и др , 1990, Ф П Курченко и др , 1991)

Мы провели сравнительный анализ известной последовательности генома штамма "НИСХИ" и других каприпоксвирусов и выявили несколько областей, потенциально пригодных для дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов BOO

Одним из маркерных признаков штамма «НИСХИ» и его производных "ВНИИЗЖ" и "Б-5/96" является ючсчная мутация (замена нуклсотида А на 'Г) в 244 триплете, которая приводит к появлению стоп-кодона (AAA—>ТАА) В связи с этим у вакцинных штаммов BOO "ankyrm-repeat" белок состоит из 243 а о , тогда как у инрулсншых шгаммов — из 638 а о Возникновение дайной маркерной мупации у вакцинных штаммов сопровождается появлением сайта ТТТААА, узнаваемого рссфнктазоп Drn I (жирным шрнфюм выделен тимидин, появившийся и результ.пе точечной мутации). Наличие у российских вакцинных штаммов BOO сайта рестрикции, отсутствующего у эпизоотических штаммов, позволяет дифференцировать их методом рестрикционного анализа На расстоянии 214 п н от этого маркерного сайта геном BOO (как вакцинных, так и эпизоотических штаммов) содержит еще один сайт для рестриктазы Dra 1, отсутствующий в геноме ВОК, что позволяет путем рестрикционного анализа одновременно решать две задачи дифференцировать BOO от ВОК и определять штаммовую принадлежность BOO

Принцип разработанного нами дифференцирующего метода показан на рисунке 3 С использованием родоспецифических праймеров проводится амплификация участка гена "ankyrm-repeat" белка длиной 564 п и Затем проводится обработка ампликонов рестриктазой Dra I В пределах амплифицируемого фрагмента

генома у эпизоотических изолятов BOO расположен один сайт рестрикции Dra I, у

вакцинных штаммов BOO - два сайта, у ВОК - таких сайтов нет Анализ продуктов

рестрикции в агарозном или полиакриламидном геле позволяет легко отличать BOO от

ВОК и вакцинные штаммы BOO от эпизоотических изолятов по характерному набору

фрагментов ДНК

1 248 ПН I 214 ПН I 102 п н I

Dra I Dra I

._I_L

ВОО-ВШ I-2-

462 п н

102 пн

Dra I

ВОО-ЭИ

564 пн_

-1

Ген ankyrin-repeat белка_11_| 3

Рис. 3. Схема рестрикционного анализа продуктов ПЦР (сверху указаны размеры получаемых фрагментов)

ВОО-ВШ — вакцинные штаммы вируса оспы овец, ВОО-ЭИ - эпизоотические изоляты вируса оспы овец, ВОК - вирус оспы коз

Метод штаммовой дифференциации BOO был проверен на восьми штаммах и изолятах BOO и ВОК Для семи из них были получены ожидаемые результаты у вакцинного штамма "ВНИИЗЖ" BOO ампликон в результате обработки рестриктазой Dra I расщеплялся на три фрагмента, у всех эпизоотических изолятов BOO - на два фрагмента, а у вакцинного штамма и двух эпизоотических изолятов ВОК расщепления ампликона не происходило (рис 4)

Для изолята «Таджикский» ВОК была получена картина рестрикции, характерная для эпизоотических изолятов вируса оспы овец Данный изолят был

вок

»первые выделен от больной козы, в связи с чем рассматривался как 1ЮК. Однако пронесенный памп анализ двух областей генома вируса с применением разных тестов (мПЦГ с видоспецифичными праймерами и рестрикционным анализом rcira "ankyrin-гереаР белка) доказывает, что в действительности изолят "Таджикский" является BOO. Данный пример свидетельствует о том, что вид животного, от которого выделен вирус оспы, не может служить достоверным критерием при определении его видовой принадлежности, и убедительно демонстрирует необходимость генетического анализа капрнпоксвирусов.

]

12 3 4 5 6 7 8 9

564 н.—► г: ни wJ

248 н. ■ 214 н

102 п.

I'nc. 4. Электрофорез п полиакриламнднам геле продуктов рестрикции

1 - маркер (снизу вверх - 100, 200, 300, 400, 500,600, 700 п.н. и т.д.);

2 - ROO, вакцинный штамм "ВНИИЗЖ";

3 —BOO, эпизоотический изолят "Афганский";

4 - BOO, эпизоотический изолят "Приморский";

5 - BOO, эпизоотический изолят "RAO";

6 - ВОК, вакцинный штамм "ВНИИЗЖ";

7 - ВОК, эпизоотический изолят "КАО",

& - ВОК, эпизоотический изолят "Таджикский"; 9 - ВОК, эпизоотический штамм "l'ellor". Таким образом, п результате проведенных нами исследовании разработан

метод, позволяющий отличать вакцинные штаммы BOO от эпизоотических

изолятов. Одновременно, данный метол позволяет дифференцировать BOO or

ROK, то есть может служить дополнением к методу видовой дифференциации

капрппоксвирусов, основанному на мПЦР.

]

Метод штаммовой дифференциации BOO прошел комиссионные испьпапия, одобрен ученым советом и утвержден директором ФГУ «Федеральный цешр охраны здоровья животных»

Метод обнаружения вируса контагиозной эктнмы Для осуществления дифференциальной дилностпкп оспы овец и коз и контагиозной эктимы мы дополнительно разрабо1али меюд обнаружения вируса контагиозной эктимы с помощью ПЦР Для этого были рассчитаны две пары видоспецифичных праймеров Внешние праймеры позволяют в первом раунде ПЦР амплифицировать <|>ра1мемт генома вируса длиной 400 ни, внутренние ираимеры предназначены для использования во тором раунде ПЦР и 01рапичиваю1 фра1мсш длиной 320 п н

Специфичность метода проверяли на пяти канрипоксвирусах и двух имевшихся в нашем распоряжении образцах вируса контагиозной эктимы изоляте «Таджикский» -культуральном вируссодсржащсм материале из коллекции вирусов ФГУ «ВНИИЗЖ» и изоляте «Рязанский» - полевом ма1сриаие (соскобах кожи) oi больной козы из Рязанской области (рис 5)

В рсзулыа1е ПЦР со специфичными для вируса эктимы нраимерами фрашенг ДНК расчетной длины после первою раунда ПЦР был получен для обеих проб, содержащих ВКЭ В пробах, содержащих каприпоксвирусы, в ПЦР не наблюдалось сишсза фра1мешов ДНК Лпало1ичпые резулыап.1 были получены и во вюром раунде ПЦР с парой ннут ренпич праймеров 1акпм образом, полученные резулмаш подтвердили специфичность метода

Метод обнаружения вируса контагиозной эктимы прошел комиссионные испытания, одобрен ученым советом и утвержден директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Получение рекомбинантных белков Р17 и Р18 BOO в системе экспрессии Е. colt

Важным инструментом диагностики оспы овец и оспы коз является обнаружение ангшел к каприпоксвирусам в сыворотке крови животных В связи с этим, одна из задач нашей paöoibi состояла в разрабо!КС иммупофермешпою метода для выявления антител к BOO и ВОК

А

23456789

.fi',1|" -ы ж.

123456789

В

Рис. 5. Обнаружение вируса контагиозной эктимы.

Электрофор« и 2%-лом агарюном геле продуктов ПЦР

Л - первый раунд ПЦР с видосмсннфичшлмл праймерами Эк1 и Эк4; В - второй раунд ПЦР с вшюспецифнчными праймерами Эк2 и ЭкЗ; треки: 1 - отрицательный контроль;

2 -маркер (стпу вверх - 100, 200,300, 400,500,600, 700 п.н.итд);

3 - вирус контагиозной эктимы, шопят «Таджикский»;

4 - вирус контагиозной эктамы, итолят «Рязанский»;

5 - BOO, ващишши штамм «ВНИИЗЖ»;

6- BOO, эпизоотический и золят «Афгански fin;

7 - ВОК, яакнинный штамм «Ш1ИИЗЖ»;

8 - ВОК, эпизоотический штамм «РеИог»;

9 - вирус бугорчатки.

Результаты зарубежных исследований свидетельствуют о перспективности

применения рекомбинантных антигенов в ИФА для выявления антител к каприп'зксвирусам (Cam, 1994; /leine, 1999). Рекомбинаптныс белки биологически безопасны, дешевы в получении и легко подвергаются очистке от примеси клеточных j белков, что обеспечивает высокую специфичность реакции ИФА. Кроме того, j использование в ИФА родоспецифичных рекомбинантных белков позволяет избежать перекрестной реакции с антителами протки вируса контагиозной эктимы, что является существенным недостатком прочих серологических методов.

В данной работе в качестве антигенов для ИФА мы решили использовать рекомбипаитнме белки Р32, Р26, Р17 и Р18 BOO, Выбор белков Р26, Г17 и PI8 был обусловлен тем, что их аналоги у других поксвирусоп обладают высокой иммунигснной активностью {Hooper et al., 2003; Ramirez et al., 2002; Law, Smith, 2001;

Boulanger et al., 1998). РекомбиНйнтный белок i'32 должен был использоваться в качестве референтного антигена, поскольку он уже применялся успешно другими исследователями (Саш, 1994; Heine, 1999).

Схема конструирования плазм ид, экс п рессйру ющих рекомбин а ктные белки ВОО, показана на рисунке 6.

Е оном вируса о сны овец

1 ? Р17 PIS | Р26 |32 « 1

IJamHÏ Hindi II

Р17 (Р ! 8, Р2й, Р32)

] Hindlll

Цитирование

PHtl'iS Р32) BaniHI Hindi il

Рис. 6. Схема получения плазм ид, экспрессирующих белки PI7, ¡48, Р26 или Р32 ВОО

ДНК ВОО выделяли из культуральной суспензии, содержащей вакцинный штамм «ВНИИЗЖ» ВОО. Гены, кодирующие белки Р17, ¡48, Р26 и Р32 1ЮО, ам унифицировал и методом ПЦР, В реакции использовали праймеры, в структуру которых были заложены сайты рестрикции Bam HI и Hind III. I [осле обработки Соответствующими рестриктазами ампликоны клонировали и экснрсссируюший плазмидный вектор pQE.

В результате трансформации р екомбинантными плазм идам и компетентных клеток М15 E.coti получили клоны, экспрсссирующие белки Р17, PIS, Р26 и Р32 ВОО, содержащие на N-конце шесть остатков гнетилина. Молекулярная масса

рексмбинантных белков соответствовала расчётной: 20, 23, 28 и 30 кД, соответственно (рис. 7). Из клонов, экспреоЬирующих белки Р17, Р18, Р26 и Р32 BOO, выделили рекомбинантные плазмиды и проверили методом нуклеотидного секвеннрования на отсутствие нуклеотндных замен и сдвигов в рамке считывания, приводящих к изменению аминокислотного состава рекомбинантных белков.

PIS Pi7 Р32 PIS Р17 Р32

Рис. 7. Электроф еретический анализ рекомбинантных белков BOO в 12%-м л ол иакрил амиднем геле

М - маркер (кДа: 166,0; 66,2; 45,0; 35,0; 25,0; 18,4; 14,4);

Л: 1, 3, 5 — белки E.coli л о индукции;

2, 4, 6 - белки Е.сой через 4 часа после индукции;

В: 1,3, 5 - белки Kcoli через 4 часа после индукции;

2, 4, 6 - Очищенный рекомбинантный белок BOO

Экспрессию рекомбинантных белков проводили в течение 4 часов путем внесения в культуру E.coli ИПТГ в концентрации 0,2 мМ. Электрофорез в 12%-м 11ЛАГе показал очень низкий уровень экспрессии для белка Р26, поэтому в дальнейшей работе его не использовали. Рекомбинантный белок Р32 получили в «усеченном» варианте, без С-концевой гидрофобной части, поскольку она значительно снижает уровень экспрессии белка в E.coli.

Очистку рекомбинантных белков осуществляли методом металл-хслатной хроматографии с применением Ni-NTA агарозы в соответствии с инструкцией производителя («Qiageti»). Выход очищенных белков со 100 мл культуры E.coli составлял 2,2, 2,6 и 1,8 мг дли Р17, Р18 и Р32, соответственно.

Определение антнгеннон активности рекомбннантных белков

Специфическую антигенную активность полученных рекомбинантных антигенов оценивали по их взаимодействию с положительной и отрицательной контрольными сыворотками в непрямом варианте ИФА. В качестве положительной использовали сыворотку от экспериментально зараженной BOO овцы, в качестве отрицательной - сыворотку от здоровой не вакцинированной против оспы овцы Результаты проверки антигенной активности рекомбинантных белков отражены на рисунке 8 Предельное разведение для белков Р17, Р18 и Р32, при котором оптическая плотность положительного контроля в 2 раза превышала оптическую плотность отрицательного контроля, составило 1 10000, 1 640 и 1 80, что соответствовало концентрации рекомбинантных белков 0,16, 1,9 и 8,7 мкг/мл соответственно

1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

■ Р18 • Р17

■ Р32 К-

330

I2K0 2V.0 M 20 10240 20480

разведение антигена

Рис. 8. Антигенная активность рекомбинантных белков Р17, Р18 и Р32 в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками

По данным литературы, белок Р32 является одним из наиболее иммупогепным у каприпоксвирусов (Chand, 1992) В наших исследованиях он оказался значительно менее активным по сравнению с рекомбинантными белками Р17 и Р18 Причиной этого обстоятельства могут быть изменения во вторичной структуре белка, появившиеся в результате делегирования его гидрофобной С-концевой части, или нарушение конформации белка после выделения в денатурирующих условиях Из-за низкой антигенной активности рекомбинантный белок Р32 был исключен из

дальнейшей работы, а непрямой вариант ИФА для выявления антител против BOO и ВОК разрабатывался на основе рекомбинантных антигенов Р17 и Р18

Разработка непрямого варианта ИФА

При разработке непрямого варианта ИФА были решены следующие задачи определено рабочее разведение антигена и конъюгата, отработаны условия сенсибилизации лунок микропанелей (состав буферов для сенсибилизации и блокирования планшетов), установлены позитивно-негативный порог реакции и показатель воспроизводимости реакции (коэффициент вариации)

Критерии реакции, установленные в результате проведенных исследований, представлены в таблице 1

Таблица 1

Установленные показатели Р17-ИФА и Р18-ИФА для обнаружения антител ■с каприпоксвнрусам метолом последовательных разведений сывороток

Показатели

Р17-ИФА

Р18-ИФА

Рабочее разведение антигена

1 640 (2,5мкг/мл)

1 80 (15мкг/мл)

Условия сенсибилизации антигена

16-18ч 4°С в КББ

Условия блокирования свободных центров связывания на планшете

1 ч 37°С в 10% р-ре молока в буфере TBS-T

11ози I ивно-iiei ативный порог

1 40

Ко)ффициент вариации

4,9%

5,5%

Для оценки специфичности и чувствительности ИФА на основе рекомбинантных антигенов Р18 (Р18-ИФА) и Р17 (Р17-ИФА) были исследованы 155 заведомо отрицательных и 5 заведомо положительных сывороток крови мелких жвачных В качестве отрицательных использовали сыворотки крови от здоровых не вакцинированных овец и коз, полученные из хозяйств Тверской и Новосибирской обилией РФ Данные облает являются благополучными по оспе мелких жвачных, что дает основания рассматривать сыворотки крови овец и коз из этих областей как заведомо отрицательные При их исследовании на наличие антител к каприпоксвнрусам в Р18-ИФА отрицательный результат был получен для всех 155 сывороток При использовании Р17-ИФА две сыворотки крови показали

ложноположительный результат Таким образом, диагностическая специфичность Р17-ИФА составила 98,7%, специфичность Р18-ИФА равнялась 100%

Для оценки чувствительности разработанных тест-систем в нашем распоряжении были пять заведомо положительных (по результатам исследования в реакции нейтрализации) сывороток крови от овец и коз экспериментально инфицированных 1ЮО и ВОК, cooibctciпенно Все сыворожн были ноложшсльпымп как в Р17-ИФА, так и в Р18-ИФА

Сравнительная оценка показала, что при использовании Р17-ИФА положительные сыворотки показывают больший титр, чем при использовании Р18-ИФА, те непрямой вариант ИФА на основе рекомбинантного антигена Р17 обладает более высокой аналитической чувствительностью по сравнению с Р18-ИФА (рис 9) При этом титры положительных сывороток в ИФА с обоими рекомбинантными антигенами были не ниже, чем в ИФА, основанном на использовании в качестве антигена нативного вируса (Д К Басова и др , 2000)

Результаты проведенных исследований позволяют сделать заключение о том, что рекомбинантные белки Р17 и Р18 являются антигенно активными и специфичными и могут использоваться в качестве антигенов в ИФА, предназначенном для исследования сывороток крови овец и коз на наличие антител к каприпоксвирусам

2,4 п

20 40 80 160 320 640 1280 2560 разведения сыворотки

Рис. 9 Зависимость оптической плотности от разведения контрольных сывороток при исследовании в Р17-ИФА и Р18-ИФА

Одновременное использование Р17-ИФЛ и Р18-ИФЛ позволяем взаимно гдтерждачь получаемые резулыапл и, тем самым повыиыеч достверность |формации о ссролш пческом ci л гусе исследуемых сывороток кропи

«Меюлика обнаружения анипел к капрнноксвирхсам и непрямом шунофермешном анализе с использованием реномбнпашiioiо анмнена I'I7 вируса 111,1 овец» и «Меюлнка обнаружения анипел к канринокснирусам н непрямом шунофермеш ном анализе с иснользонаиием рекомбинацию!о аппнена 148 вируса пы овец» прошли комиссионные исньпапня, одобрены ученым совеюм и утержлены иректором ФГУ «Фелсральный центр охраны здоровья живошых»

3 выподы

1 Провелен сравни icmimimii анализ пуклеотдпих последов.ислыюоеи нолноразмерною генома вируса оспы опец, вируса оспы коз и вируса бутрча1кн Выявлены учааки иномл, позволяющие определяп. видовую прииадлежпоы ь канрииоксвирусон а также дифференцировать вакцинные штаммы вируса оспы опец от эпизоотических изолятов

2 Разработан метод обнаружения и дифференциации каприпоксвирусов основанный на мультиплексной ПЦР с видоспецифичными праймерами Метод отличается высокой специфичностью чувствительностью и технической нросююП

1 I'.I i11.1По 1.111 мипд оепоп.шпмп на амплификации il рее i рныиюппом .il 1.UIit te Ull,l . lllkynn-Kpc.lt C>1 Jllwl по ИЮЛЯ К >1111III лнффере ппироп.и I. 11,1 К111111111 IL III МММ ы «11ИСХИ» «ВПИЖЖ» н «IH/Wi» вируса оспы овен oi >нн iooihmccmix июляюв н одновременно раuiiri.iiь вирусы оспы овец н koi

'I Раipafîoми меюд обнаружения вируса koiii.ii ионюи жтмы с помощью ПЦР Ношоляютпи проподни, чифференцилльпую дн.н поешку тип опен и koi и

KOIII.II но IIIOII )К I IIMI.I

5 Получены рекомбшишные белки Р17 PI8 и Р32 вируса оспы овен жспрессиеи n I. coh 11оказаиа аш ш синая ак1 imnoci ь рскомбипат ных белков Р17 и Р18

h Па основе рекомПтытных атшепов PI7 и Р18 вируса оспы овей рафабтап непрямой вари.ни ИФА для обнаружения апппел к к.шрнпоксвируелм и емкорожах крови овен и коз

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практическою использования прсдлашкнся

«Меюдика обнаружения и видовои дифференциации клприпоксвирусов с использованием мультиплексной полимеразной ценной реакции» (2005 г ),

«Меюдика ди<|к|)ерепцпацин вакцинных п эпизоотческих пплммои пируем оспы овец с использованием реарнкционного анализа продуктов ИЦР» (2005 i ),

«Методика обнаружения вируса контагиозной экшмы с использованием иолимеразнои цепной реакции» (2005 г ),

«Меюдика обнаружения анинел к клпрнпокевпруелм в непрямом иммупофермешпом анализе с использованием рекомбппапшою .шпиона Р17 вируса оспы овец» (2006 i )

«Методика обнаружения антител к каприпоксвнрусам в непрямом нммуноферменшом анализе с нснользоваписм рскомбннанпюю лннпенл 1М8 вируса оспы овец» (2006 г )

Методики комиссионно испытаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Список работ, опублнковапнмх по теме диссертации

1 Орлова, Е.С Дифференциация вирусов оспы овец и оспы коз методом полимеразпой цепной реакции / С С Орлова, А В Щербаков, В M Захаров // Пробл мониторинга и генодиагност инфекцион бол ж-пых матер Междунар науч конф - Владимир, 2004 - С 79-82

2 Дифференциация вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец / Е С Орлова, А В Щербаков, В И Диев, В M Захаров // Тр Федерального центра охраны здоровья ж-пых - Владимир, 2005 -Т 3 -С 160-170

3 Орлова, Е С. Видовая дифференциация каприпоксвирусов методом мультиплексной ПЦР /ЕС Орлова, А В Щербаков // Тр Федерального центра охраны здоровья ж-ных - Владимир, 2005 -Т 3 -С 151-159

4 Видовая и штаммовая дифференциация каприпоксвирусов методом полимеразпой цепной реакции / Е.С. Орлова, А В Щербаков, В И Диев, В M Захаров//Молек биология -2006 -Т 40, № 1 - С 158-164

5 Рекомбинантные белки Р17, Р18 и Р32 как потенциальные антигены для иммуноферментного анализа / ЕС. Орлова, А В Щербаков, А С Яковлева, А В Каныиина, Д К Басова, В И Диев // Тр Федерального центра охраны здоровья ж-ных - Владимир, 2006 -Т 4 - С 51-61

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» тираж 90 жз апрель 2007г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орлова, Елена Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика оспы овец и коз.

1.1.1. Распространенность заболеваний.

1.1.2. Клиническая картина заболеваний.

1.1.3. Патологоанатомические изменения.

1.1.4. Эпизоотологические особенности.

1.2. Характеристика BOO и ВОК.

1.2.1. Таксономическое положение.

1.2.2. Видовая специфичность.

1.2.3. Физико-химические свойства.

1.2.4. Структура вириона.

1.3. Геном BOO и ВОК.

1.4. Патогенез BOO и ВОК.

1.4.1. Проникновение вируса в клетку.

1.4.2. Депротеинизация вирусной сердцевины.

1.4.3. Экспрессия генов.

1.4.4. Морфогенез.

1.5. Культивирование BOO и ВОК.

1.6. Иммунитет и специфическая профилактика.

1.7. Диагностика оспы овец и оспы коз.

1.7.1. Дифференциальная диагностика.

1.7.2. Вирусологические методы диагностики.

1.7.3. Серологические методы.

1.7.4. Молекулярно-биологические методы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование методов диагностики оспы овец и оспы коз"

Актуальность темы. Оспа овец и оспа коз - высококонтагиозные вирусные заболевания мелких жвачных. По классификации МЭБ они относятся к трансграничным болезням животных, способным вызывать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб. Оспа овец и коз эндемична на Ближнем Востоке, в Центральной Азии, Индии, Китае, а также в Центральной и Южной Африке. В 1996-2003 гг. неблагополучными по этим заболеваниям были 55 стран, в том числе 7 стран СНГ. В России оспа регистрировалась в 1994-2000 и 2002-2003 гг. [187].

Возбудителями болезней являются близкородственные, но таксономически самостоятельные виды - вирус оспы овец (BOO) и вирус оспы коз (ВОК), - относящиеся к роду Саргурох семейства Poxviridae. BOO и ВОК не обладают четко выраженной хозяйской специфичностью: несмотря на то, что обычно вирусы вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец, либо у коз, некоторые штаммы патогенны для обоих видов животных-хозяев [112]. Это делает актуальной задачу видовой дифференциации возбудителей оспы.

Для специфической профилактики оспы используются живые аттенуированные вакцины. Вакцинированные животные в результате контакта с эпизоотическими штаммами могут становиться бессимптомными носителями вируса и служить резервуаром инфекции. В связи с этим, при обнаружении у вакцинированных животных вируса оспы возникает необходимость в дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов.

Лабораторная диагностика оспы основана на обнаружении вируса или его составляющих (белков, ДНК) в патологическом материале, либо антител к вирусу в крови животных.

Традиционные методы диагностики оспы овец и коз (реакция нейтрализации, выделение вируса на культуре клеток) не способны дифференцировать вирусы оспы овец и оспы коз друг от друга и, тем более, вакцинные штаммы вирусов от эпизоотических. На сегодняшний день различать вирусы рода Саргурох возможно только с помощью рестрикционного картирования или нуклеотидного секвенирования вирусных геномов (ДНК). Однако в силу сложности и трудоемкости они неприменимы для рутинной диагностики.

В соответствии с требованиями МЭБ при подозрении на оспу овец и коз патологический материал должен тестироваться также на наличие вируса контагиозной эктимы. Этот парапоксвирус вызывает заболевание, которое, также как и оспа, проявляется поражениями кожи, однако не относится к особо опасным болезням из-за незначительной смертности среди пораженных животных. Метод обнаружения вируса контагиозной эктимы с помощью ПЦР в России до сих пор отсутствует.

Для выявления антител к BOO и ВОК традиционно используется реакция нейтрализации. Метод дорог, малопроизводителен, может выполняться лишь в условиях специализированных лабораторий с высоким классом биологической защиты. Первые попытки применения ИФА для выявления антител к BOO и ВОК были основаны на использовании в качестве антигена очищенных препаратов вирусов [48, 89, 142] Однако из-за невозможности избавиться от примесей клеточных белков в препаратах антигена специфичность реакции была низкой. Для избежания этой проблемы H.G.Heine et al. [40] предложили для выявления антител к BOO и ВОК ИФА, основанный на использовании рекомбинантного антигена Р32, полученного экспрессией в E.coli. Разработанный ими ИФА имел ряд преимуществ перед традиционными тест-системами, поскольку рекомбинантный антиген был биологически безопасен, дешев в получении, а также имел высокую степень очистки, что обеспечивало высокую специфичность реакции. Однако в России подобные работы не проводились.

Таким образом, в диагностике оспы овец и оспы коз нерешенными оставался ряд проблем. Отсутствовали простые и быстрые методы видовой и штаммовой дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз. Не разрабатывались в России и высокоспецифичные иммуноферментные методы для выявления антител к этим вирусам.

Цели и задачи исследования. Цель нашей работы заключалась в совершенствовании методов диагностики оспы овец и оспы коз.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома вирусов рода Саргурох, выявить участки генома, пригодные для видовой дифференциации каприпоксвирусов и для дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов этих возбудителей;

- разработать простой и быстрый метод обнаружения и дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз, основанный на ПЦР и не требующий проведения таких дополнительных процедур, как рестрикционный анализ или нуклеотидное секвенирование;

- разработать метод, позволяющий различать вакцинные и эпизоотические штаммы вируса оспы овец;

- для проведения дифференциальной диагностики оспы овец и оспы коз от контагиозной эктимы разработать на основе ПЦР метод обнаружения вируса контагиозной эктимы;

- получить рекомбинантные антигены вируса оспы овец экспрессией в E.coli;

- на основе рекомбинатных антигенов разработать иммуноферментный метод для выявления антител к вирусам оспы овец и оспы коз Научная новизна исследований.

Впервые разработан экспресс-метод, позволяющий выявлять и дифференцировать виды каприпоксвирусов только на основе ПЦР, без дополнительных исследований (рестрикционного анализа или нуклеотидного секвенирования).

Предложен метод дифференциации вакцинных штаммов «НИСХИ», «ВНИИЗЖ» и «Б 5/96» вируса оспы овец от эпизоотических изолятов на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом ампликонов, не имеющий аналогов в диагностике оспы овец.

Предложен метод дифференциальной диагностики вируса оспы овец и вируса оспы коз от вируса контагиозной эктимы.

Экспрессией в Е. coli получены рекомбинантные белки Р17, Р18 и Р26 вируса оспы овец.

Разработан непрямой вариант ИФА с использованием рекомбинантных белков Р17 и Р18 в качестве антигенов для обнаружения антител к каприпоксвирусам в сыворотках крови мелких жвачных.

Практическая значимость исследований.

В результате проведенных исследований разработано 5 методик, которые прошли комиссионные испытания, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:

Методика обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции» (2005 г.);

Методика обнаружения вируса контагиозной эктимы с использованием полимеразной цепной реакции» (2005 г.);

Методика дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец с использованием рестрикционного анализа продуктов ПЦР» (2005 г.);

Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р17 вируса оспы овец» (2006 г.);

Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р18 вируса оспы овец» (2006 г.).

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» (Владимир, 2004г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в период 2002-2006 гг.

Основные положения, выносимые на защиту:

Метод обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов, с использованием мультиплексной ПЦР.

Метод дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец с использованием рестрикционного анализа продуктов ПЦР.

Метод обнаружения вируса контагиозной эктимы с использованием

ПЦР.

Получение рекомбинантных антигенов вируса оспы овец и оценка их антигенной активности.

Использование рекомбинантных антигенов Р17 и Р18 вируса оспы овец в непрямом варианте ИФА.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и 5 приложений. Список используемой литературы включает 188 источников, из которых 149 на иностранном языке. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 16 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Орлова, Елена Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей полноразмерного генома вируса оспы овец, вируса оспы коз и вируса бугорчатки. Выявлены участки генома, позволяющие определять видовую принадлежность каприпоксвирусов, а также дифференцировать вакцинные штаммы вируса оспы овец от эпизоотических изолятов.

2. Разработан метод обнаружения и дифференциации каприпоксвирусов, основанный на мультиплексной ПЦР с видоспецифичными праймерами. Метод отличается высокой специфичностью, чувствительностью и технической простотой.

3. Разработан метод, основанный на амплификации и рестрикционном анализе гена ankyrin-repeat белка, позволяющий дифференцировать вакцинные штаммы «НИСХИ», «ВНИИЗЖ» и «Б5/96» вируса оспы овец от эпизоотических изолятов и, одновременно, различать вирусы оспы овец и коз.

4. Разработан метод обнаружения вируса контагиозной эктимы с помощью ПЦР, позволяющий проводить дифференциальную диагностику оспы овец и коз и контагиозной эктимы.

5. Получены рекомбинантные белки Р17, Р18 и Р32 вируса оспы овец экспрессией в E.coli. Показана антигенная активность рекомбинантных белков Р17 и Р18.

6. На основе рекомбинантных антигенов Р17 и Р18 вируса оспы овец разработан непрямой вариант ИФА для обнаружения антител к каприпоксвирусам в сыворотках крови овец и коз.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

Методика обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции» (2005 г.);

Методика дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец с использованием рестрикционного анализа продуктов ПЦР» (2005 г.);

Методика обнаружения вируса контагиозной эктимы с использованием полимеразной цепной реакции» (2005 г.);

Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р17 вируса оспы овец» (2006 г.).

Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р18 вируса оспы овец» (2006 г.).

Методики прошли комиссионные испытания, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

110

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлова, Елена Сергеевна, Владимир

1. Биологические свойства вакцинного штамма НИСХИ вируса оспы овец / В.Н. Иванющенков, О.А. Кореба, В.Т. Кекух и др. // Ветеринария. 1990. -№ 8. - С. 22-24.

2. Борисович, Ю.Ф. О распространении оспы овец и мерах борьбы с нею в некоторых странах / Ю.Ф. Борисович // Тр. ГНКИ. М., 1964. - Т. 12. - С. 24-31.

3. Ванновский, Т.Я. Оспа коз и ее специфическая профилактика: автореф. дис. д-ра.вет.наук / Т.Я. Ванновский. Воронеж, 1966.-43 с.

4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. М.: ВНИТИБП, 1998. - 928 с.

5. Гуненков, В.В. Сухая живая вакцина против оспы овец из штамма С 113/86 / В.В. Гуненков, В.П. Черняк, Г.Д. Кузнецов // Ветеринария. 1993. - № 11/12. - С.23-24.

6. Диев, В.И. Оспа овец и ее профилактика вакциной из штамма ВНИИЗЖ / В.И. Диев // Современные аспекты вет. патологии ж-ных: матер, конф., посвящен. 40-летию ВНИИЗЖ. Владимир, 1998. - С. 114-124.

7. Иванющенков, В.Н. Реактогенные свойства вирусвакцины против оспы овец / В.Н. Иванющенков, В.Т. Кекух, О.А. Кореба // Ветеринария. 1990. -№7.-С. 28-30.

8. Изучение патогенности вирусов оспы овец и оспы коз / М.С. Зиновьева, В.М. Захаров, В.И. Диев, Д.К. Басова // Вуз и АПК. Задачи, проблемы и пути решения: сб.науч.тр. Махачкала, 2002. - С. 288-290.

9. Инфекционные болезни овец / Р.А. Кадымов, А.А. Кунаков, В.А. Седов и др.. М.: Агропромиздат, 1987. - 303 с.

10. Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК-плазмид и РНК / О.Г. Грибанов, А.В. Щербаков, Н.А. Перевозчикова и др. // Биохимия. 1996. - Т. 21, № 6. - С. 1064-1070.

11. Испытания в производственных условиях сухой эмбрион-вирусвакцины против оспы овец / Н.В. Лихачев, А.Д. Смедов, Ю.Ф. Борисович и др. // Тр. ГНКИ.-М., 1962.-Т. 11.-С. 28-32.

12. Кадыров, У.Г. Оспа животных / У.Г. Кадыров, Ю.Ф. Борисович. М.: Колос, 1981.- 156 с.

13. Каныпина, А. В. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней: дис.канд.вет.наук / А. В. Каныпина. Владимир, 2004. - 123 с.

14. Керембекова, У.Ж. Получение диагностических препаратов для серологических реакций при оспе овец / У.Ж. Керембекова, Ю.М. Гононов, JI.H. Пасечников // Вестник с.-х. науки Казахстана. 1992. - № 3. - С. 122123.

15. Керембекова, У.Ж. Совершенствование средств и методов лабораторной диагностики оспы овец: автореф.дис.канд.вет.наук / У.Ж. Керембекова. -Алматы, 1994. -26 с.

16. Классификация и номенклатура вирусов позвоночных. Учебное пособие / под ред. В.Ю. Луговцева, Д.А. Васильева. Ульяновск, 2002. - С. 17-26.

17. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук: пер. с англ. М.: Мир, 1984.-480 с.

18. Машнин, А.В. Диагностика оспы овец и оспы коз / А.В. Машнин // Вест. РАСХН. 2003. - № 3. - С. 66-69.

19. Машнин, А,В. Получение гипериммунных сывороток для диагностики оспы овец и коз / А.В. Машнин // Докл. РАСХН. 2003. - № 5. - С. 57-59.

20. Машнин, А.В. Разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики оспы овец и оспы коз: автореф.дис.канд.вет.наук / А.В.Машнин. Покров, 2001. -23 с.

21. Оспа овец и коз // Частная патология и терапия дом. ж-ных / Ф. Гутира, И. Марек, Р. Маннингер, И. Мочи. М.: С.-х. литература, 1961. - Т. 1, кн. 1. -С. 431-450.

22. Патогенность и иммуногенность вирусов оспы овец и оспы коз на гетеровидовых животных / Л.Б. Кутумбетов, М.С. Зиновьева, С.В. Хлебопашникова, Н.И. Ковалишина // Вет. медицина: м1жвид. тем. наук. зб. 80 рок. IEKBM. Харьюв, 2002. - С. 359-362.

23. Поляков, И. О. Практическое пособие по медицинской статистике / И. О. Поляков. JL: Медицина, 1975. - 150 с.

24. Разработка и испытание вирусвакцины против оспы овец сухой культуральной / И.Ф. Вишняков, В.М. Балышев, В.В. Башаев и др. // Состояние, проблемы и перспективы развития вет. науки России (К 100-летнему юбилею ВИЭВ). М., 1999. - Т. 1. - С. 138-140.

25. Скалинский, Е.И. Структура и морфогенез вируса оспы коз / Е.И. Скалинский, Ю.Ф. Борисович // Ветеринария. 1975. -№7. - С. 39-41.

26. Скалинский, Е.И. Об электронномикроскопической диагностике оспенных болезней животных / Е.И. Скалинский, Ю.Ф. Борисович // Ветеринария. -1978.-№6.-С. 46-47.

27. Сюрин, В.Н. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Г.В. Белоусова, Н.В. Фомина. М.:Агропромиздат, 1991. - С. 366-369.

28. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова. -М.: Высшая школа, 1991. -288 с.

29. Ханаан, Д. Методы трансформации Е. coli / Д. Ханаан // Клонирование ДНК. Методы: пер. с англ.-М., 1988.-С. 140-173.

30. Холодилов, Н. Г. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса / Н.Г. Холодилов // Методы мол. генетики и генной инженерии. -Новосибирск: Наука, 1990.-С. 9-10.

31. Эффективность сухой культуральной вирусвакцины из штамма НИСХИ против оспы овец / Ф.П. Курченко, В.Н. Иванющенков, К.П. Уфимцев и др.//Ветеринария. 1991.-№ 10.-С. 21-23.

32. Яковлева, А. С. Экспрессия в E.coli рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура / А. С. Яковлева, А. В. Каньшина, А. В. Щербаков // Тр.

33. Федерального центра охраны здоровья ж-ных. Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 105-114.

34. A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32, the homolog of the vaccinia virus H3L gene / H.G. Heine, M.P. Stevens, A.J Foord., D.B. Boyle //J.Immunol.Methods. 1999. - Vol. 227, № 1-2. - P. 187-196.

35. A classical live attenuated vaccine for sheep pox / V. Bhanuprakash, B.K. Indrani, R. Hegde et al. // Trop. Anim. Health Prod. 2004. - Vol. 36, № 4. - P. 307-320.

36. A duplex PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Capripoxvirus and Orf virus / M. Zheng, Q. Liu, N. Jin et al. //Mol. Cell Probes. -2007.-Vol. 2.-P. 48-50.

37. A note on the antigenic relationship of sheep pox virus strains / Puranchand, V.D.P. Rao, R. Chandra, S.K. Garg // Indian J. Vet. Med. 1987. - Vol. 7. - P. 166-168.

38. A prominent antigenic surface polypeptide involved in the biogenesis and function of the vaccinia virus envelope / J. Gordon, A. Mohandas, S. Wilton, S. Dales//Virology. 1991.-Vol. 181, № 2. - P.671-686.

39. A Vero cell-attenuated goat pox virus provides protection against virulent virus challenge / M. Hosamani, S. Nandi, B. Mondal et al. // Acta Virol. 2004. -Vol. 48, № 1. - P.15-21.

40. Adaptation and growth cycle of sheep pox virus in MDBK cell line / K.D. Pandey, A. Rai, A.C. Goel et al. // Indian J. Virol. 1985. - Vol. 1. - P. 133138.

41. Adlakha, S. C. Studies on sheep- and goat-pox viruses. I. Adaptation of the viruses in laboratory animals and tissue culture / S. C. Adlakha, M.P. Bansal, B.S. Malik // Indian J. Anim. Sci. 1971. - Vol. 41. - P. 171 -175.

42. Application of ELISA in the detection of goat pox antigen and antibodies / B. Sharma, B.S. Negi, M.P. Yadav et al. // Acta Virol. 1988. - V.32. - P. 65-69.

43. Application of fluorescent antibody test in the diagnosis of sheep pox, and study of sheep pox virus multiplication in cell-culture / P. Sarkar, S.P. Singh, A.K. Pandey et al.J // Indian J.Anim.Sci. 1980. - V.50.

44. Assembly of vaccinia virus: role of the intermediate compartment between the endoplasmic reticulum and the Golgi stacks / B. Sodeik, R.W. Dom, M. Ericsson et al. // J. Cell Biol. 1993. - Vol. 121. - P. 521-541.

45. Autoradiographic study on sheep pox virus infection / A.M. Terinha, J.D. Vigario, J.L. Nunes Petisca et al. // J. Bacteriol. 1965. - Vol. 90.

46. Bakos, K. Studies on goat pox in Sweden / K. Bakos, S. Brag // Vet. Bull. -1957.-Vol. 27.-P. 571.

47. Baldick, C.J. Characterization and regulation of mRNAs encoded by vaccinia virus intermediate stage genes / C.J. Baldick, B. Moss // J. Virol. 1993. - Vol, 67.-P. 3515-3527.

48. Baroudy, B.M. Sequence homologies of diverse length tandem repetitions near ends of vaccinia virus genome suggest unequal crossing over / B.M. Baroudy, B. Moss // Nucleic Acids Res. 1982. - Vol. 10. - P. 5673-5679.

49. Bhambani, B.D. An immunodiffusion test for laboratory diagnosis of sheeppox and goatpox / B.D. Bhambani, D. Krishnamurtthi // J. Сотр. Pathol. Therap. -1963.- V. 73.-P. 349-357.

50. Bhat, P.P. Molecular characterization of pox (viral) DNA / P.P. Bhat // Indian J. Anim. Sci. 1993. - Vol. 63. - P. 857-862.

51. Bhat, P.P. Restriction enzyme profiles as molecular epidemiological tools for characterizing sheeppox virus genomes / P.P. Bhat, B.P. Mishra // Indian Journal of Animal Sciences. 1989. - Vol. 59. - P. 1475-1490.

52. Black, D.N. Genomic relationship between capripoxviruses / D.N. Black, J.M. Hammond, R.P. Kitching // Virus Res. 1986. - Vol. 5. - P. 277-292.

53. Black, D.N. The capripoxvirus genome / D.N. Black // Rev. Sci. Techn. OIE. -1986.-Vol. 5.-P. 495-501.

54. Buller, R.M.L. Poxvirus pathogenesis / R.M.L. Buller, G.J. Palumbo // Microbiol. Reviews. 1991. - Vol. 55. - P. 80-122.

55. Carn, V.M. An antigen trapping ELISA for the detection of capripoxvirus in tissue culture supernatant and biopsy samples / V.M. Carn // J. Virol. Methods. -1995.-Vol. 51, № 1. P.95-102.

56. Carn, V.M. Control of capripoxvirus infections / V.M. Carn // Vaccine. 1993. -Vol. 11, № 13. - P.1275-1279.

57. Cellular fatty acids during fowlpox virus infection of three different host systems / D.S. Lyles, C.C. Randall, L.G. Gafford, H.B.J. White // Virology. 1976. - Vol. 70. - P. 227-229.

58. Chand, P. Evaluation of the Western blot analysis of virus-specific antibody responses to capripox and contagious pustular dermatitis infections in sheep / P. Chand, R.P. Kitching, D.N. Black // Epidemiol. Infect. 1994. - Vol. 113, № 2. -P. 377-385.

59. Chand, P. Molecular and immunological characterization of a major envelope protein of capripoxvirus: Ph. D. Thesis / P. Chand. University of Surrey, 1992.

60. Cho, C.T. Monkeypox virus / C.T. Cho, H.A. Wenner // Bacteriol. Reviews. -1973.-Vol.37.-P. 1-18.

61. Coagglutination test: a simple and rapid diagnostic technique for goat pox / R.K. Joshi, R. Chandra, V.D.P. Rao, S.K. Gard // Trop. Anim. Health Prod. 1989. -Vol. 21, № 4. - P.233-235.

62. Comparative evaluation of sheep pox vaccines / I.P. Singh, V.D.P. Rao, R. Chandra, S.K. Garg // Indian J. Anim. Sci. 1984. - Vol. 54. - P. 650-653.

63. Counter-immunoelectrophoresis test for rapid diagnosis of sheep pox / Puranchand, V.D.P. Rao, S.K. Garg et al. // Brit. Vet. J. 1985. - Vol. 141. - P. 124-128.

64. Cultivation of goat pox virus in established cell line / Ved Prakash, R. Chandra, V.D.P. Rao, S.K. Garg // Indian J. Virol. 1994. - Vol. 10. - P. 60-63.

65. Cytopathogenicity of goat pox virus / R.K. Joshi, R. Chandra, V.D.P. Rao, S.K. Garg // Indian J. Сотр. Microb. Immunol. Infect. Dis. 1994. - Vol. 15. - P. 3536.

66. Dales, S. Biology of poxviruses / S. Dales, B.G.T. Pogo // Virology Monographs. 1981.-Vol. 18. - P. 1-109.

67. Dales, S. The cycle of multiplication of vaccinia virus in Earle's strain L cells. I. Uptake and penetration / S. Dales, R. Kajioka // Virology. 1964. - Vol. 24. - P. 278-294.

68. Datta, S. Dot-immunobinding technique in differential diagnosis of pox diseases of sheep and goats / S. Datta, J.P. Soman // Indian J. Anim. Sci. 1990. - Vol. 60. -P. 1186-1187.

69. Davies, F.G. The alteration in pathogenicity and immunogenicity of a Kenya sheep and goat pox virus on serial passage in bovine fetal muscle cell culture / F.G. Davies, G. Mbugwa // J. Сотр. Pathol. 1985. - Vol. 95. - P. 565-568.

70. Davison, A.J. The structure of vaccinia virus early promoters / A.J. Davison, B. Moss // J. Mol. Biol. 1989. - Vol. 210. - P. 749-769.

71. Davison, A.J. The structure of vaccinia virus late promoters / A.J. Davison, B. Moss // J. Mol. Biol. 1989. - Vol. 210. - P. 771-784.

72. Deletion of 55 open reading frames from the termini of vaccinia virus / M.E. Perkus, S.J. Goebel, S.W. Davis et al. // Virology. 1991. - Vol. 180. - P. 406410.

73. Detection of goat pox antigen and antibody by counter-immunoelectrophoresis / R.K. Joshi, R. Chandra, V.D.P. Rao, S.K. Gard // Indian J. Anim. Sci. 1990. -Vol. 60.-P. 34-35.

74. Detection of goatpox antigen and antibody by the CIE test / B. Sharma, B.S. Negi, A.B. Pandey et al. // Trop. Anim. Health Prod. 1988. - V.20. - P. 109113.

75. Detection of sheep poxvirus in skin biopsy samples by a multiplex polymerase chain reaction / P. Markoulatos, O. Mangana-Vougiouka, G. Koptopoulos et al. // J. Virol. Methods. 2000. - Vol. 84, № 2. - P. 161 -167.

76. Development of an attenuated live virus vaccine against sheep pox: a field trial / R. Chandra, V.D.P. Rao, V.P. Dixit et al. // Indian Vet. J. 1990. - Vol. 67. - P. 1-3.

77. Differentiation of sheep pox and goat poxviruses by sequence analysis and PCR-RFLP of P32 gene / M. Hosamani, B. Mondal, P.A. Tembhurne et al. // Virus Gene. 2004. - Vol. 29, № 1. - P. 73-80.

78. Easterbrook, K.B. Controlled degradation of vaccine virions in vitro: an electron microscopic study / K.B. Easterbrook // J. Ultrastructure Res. 1966. - Vol. 14. -P. 484-496.

79. ELISA: theory and practice / ed. by J.R. Crowther. -Totowa, New Jersey: Humana Press, 1995. 223 p. - (Methods in Mol. Biol.)

80. El-Zein, A. Preparation and testing of a goat pox vaccine from a pathogenic fiel isolate attenuated in cell culture / A. El-Zein, S. Nehme, K.V. Singh // Zentralblat Vet.-Med. 1983. - Bd. 30. - S. 341-348.

81. Evaluation of allergic test in goat pox / B.S. Negi, A.B. Pandey, M.P. Yadav, B. Sharma // Indian J. Virol. 1988. - Vol. 4. - P. 26-33.

82. Evaluation of an immunocapture enzyme-linked immunosorbent assay for detection of capripoxvirus / C.K. Ngichabe, Y.S. Binepal, J. W. Njiru, V.M. Cam // Vet. Rec.- 1999.-Vol. 145. P. 231-232.

83. Evaluation of immunocapture ELISA for diagnosis of goat pox / T.V. Rao, P. Malik, S. Nandi, B.S. Negi // Acta Virol. 1997. - Vol. 41, № 6. - P. 345-348.

84. Evaluation of latex agglutination test for rapid detection of goat poxvirus antigen and antibodies / T.V. Rao, B.S. Negi, P. Dhar, D. Asgola // Acta Virol. 1996. -Vol.40, №2.-P. 95-97.

85. Experimental immune response of Iranian goat pox vaccine virus strain against prevalent virus in Pakistan / M.A. Mahmood, M. Ahmad, S. Afzaal, M.S. Knah // Pakistan Vet. J.- 1993.-Vol. 13.-P. 125-127.

86. Gershon, P.D. A comparison of the genomes of capripoxvirus isolates of sheep, goats, and cattle / P.D. Gershon, D.N. Black // Virology. 1988. - Vol. 164, № 2. -P. 341-349.

87. Goat pox cell culture attenuated vaccine / H. Guo, Z.Y. Guo, Z.P. Shang, Q.G. Liu // Chinese J. Vet. Sci. Technol. 1986. - Vol.3. - P. 8-10.

88. Gomez, C.E. Recombinant proteins produced by vaccinia virus vectors can be incorporated within the virion (IMV form) into different compartments / C.E. Gomez, M. Esteban // Arch Virol. 2001. - Vol. 146, №5. - P.875-892.

89. Growth and cytopathogenicity of goat pox virus in MDBK cell line / R.K. Joshi, S.K. Garg, R. Chandra, V.D. Sharma // Indian J. Virol. 1995. - Vol. 11. - P. 3133.

90. Growth behaviour of Sambalpur strain of goat pox virus on chorioallantoic membrane of developing chicken embryo / R.K. Joshi, S.K. Garg, R. Chandra, S.N. Sharma // Indian J. Virol. 1996. - Vol. 12. - P. 109-111.

91. Hudson, L. Practical immunology / L. Hudson, F.C. Hay. Oxford: Blackwell Sci.Publ., 1989.-P. 257-258.

92. Ichihashi, Y. Proteolytic activation of vaccinia virus for penetration phase of infection / Y. Ichihashi, M. Oie // Virology. 1982. - Vol. 116. - P. 297-305.

93. Ink, B.S. Transcription of poxvirus early gene is regulated both by a short promoter element and by a transcriptional termination signal controlling transcriptional interference / B.S. Ink, D.J. Pickup // J. Virol. 1989. - Vol. 63. -P. 4632-4644.

94. Ireland, D.C. Improved detection of capripoxvirus in biopsy samples by PCR / D.C. Ireland, Y.S. Binepal //J. Virol. Methods. 1998. - Vol.74, № 1. - P. 1-7.

95. Jadhav, K.M. Field observations on sheep pox tissue culture vaccine / K.M. Jadhav, A.K. Pandey, N.S. Radadia // Indian Vet. J. 1989. - Vol. 66. - P. 908912.

96. Jaikumer, D. Virion polypeptides of SPV (Ranipet strain) / D. Jaikumer, P. Ramadass, V.D. Padmanaban // Indian J. Anim. Sci. 1996. - Vol. 66. - P. 35-36.

97. Janeczko, R.A. Studies on the mechanism of entry of vaccinia virus into animal cells / R.A. Janeczko, J.F. Rodriguez, M. Esteban // Arch. Virol. 1987. - Vol. 92.-P. 135-150.

98. Joklik,W.K. The replication and coating of vaccinia DNA / W.K. Joklik, Y. Becker // J. Mol. Biol. 1964. - Vol. 10. - P. 452-474.

99. Kirubaharan, J J. Adaptation of SPV (Ranipet strain) to BHK2i cell line / J.J. Kirubaharan, A.P.G. Sugirtha, V.D. Padmanaban // Indian Vet. J. 1993. - Vol. 70. - P. 4-6.

100. Kitching, R.P. A single vaccine for the control of capripox infection in sheep and goats / R.P. Kitching, J.M. Hammond, W.P. Taylor // Res.Vet. Sci. 1987. - Vol. 42.-P. 53-60.

101. Kitching, R.P. Clinical and antigenic relationship between isolates of sheep and goat pox viruses / R.P. Kitching, W.P. Taylor // Trop. Anim.Health Prod. 1985. -V. 17.-P. 64-74.

102. Kitching, R.P. Comparison of the external dimensions of capripoxvirus isolates I R.P. Kitching, C. Smale // Res. Vet. Sci. 1986. - Vol. 41. - P. 425-427.

103. Kitching, R.P. Poxvirus, infection and immunity / R.P. Kitching, J.M. Hammond // Encyclopedia of Immunology / Eds. A. Roit et al.. London, 1991. - P. 12611264.

104. Kitching, R.P. Progress towards sheep and goat pox vaccines / R.P. Kitching // Vaccine. 1983. - Vol.1, № 1. - P. 4-9.

105. Kitching, R.P. Studies on the major common precipitating antigen of Capripoxvirus / R.P. Kitching, J.M. Hammond, D.N. Black // J. Gen. Virol. -1986.-V.67.-P.139-148.

106. Kitching, R.P. The characterization of African strains of capripoxvirus / R.P. Kitching, P.P. Bhat, D.N. Black // Epidemiol. Infect. 1989. - Vol. 102. - P. 335343.

107. Kotwal, G.J. Analysis of a large cluster of nonessential genes deleted from a vaccinia virus terminal transposition mutant / G.J Kotwal, B. Moss // Virology. -1988.-Vol. 167.-P. 524-537.

108. Law, M. Antibody neutralization of the extracellular enveloped form of vaccinia virus/М. Law, G.L. Smith//Virology. 2001.-Vol. 280, № l.-P. 132-142.

109. Mahmood, M.A. Preparation of live sheep pox tissue culture vaccine / M.A. Mahmood, Z. Hasni, S. Afzal // Pakistan Vet. J. 1988. - Vol. 8. - P. 56-61.

110. Matthews, R.E.F. Classification and nomenclature of viruses / R.E.F. Matthews // Intervirology. 1982. - Vol. 17. - P. 1-199.

111. Merchlinsky, M. Resolution of linear minichromosomes with hairpin ends from circular plasmids containing vaccinia virus concatemer junctions / M. Merchlinsky, B. Moss // Cell. 1986. - Vol. 45. - P. 879-884.

112. Moss, B. Instability and reiteration of DNA sequences within the vaccinia virus genome / B. Moss, E. Winters, N. Cooper// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. -Vol. 78.-P. 1614-1618.

113. Pandey, A.K. Studies on sheep poxvirus. 2. Immune and antibody response with cell culture adapted virus / A.K. Pandey, B.S. Malik, M.P. Bansal // Indian Vet. J. 1969.-Vol. 46.-P. 1017-1023.

114. Pandey, R. Soluble antigens of sheep-pox and goat-pox viruses as determined by immunodiffusion in agar gel / R. Pandey, I.P. Singh // Acta Virol. 1972. - Vol. 16.-P. 41-46.

115. Parsons, B.L. Tandemly repeated sequences are present at the ends of the DNA of raccoonpox virus / B.L. Parsons, D.J. Pickup // Virology. 1987. - Vol. 161. -P. 45-53.

116. Passive haemagglutination test with goat pox virus / R.K. Joshi, R. Chandra, V.D.P. Rao, S.K. Garg // Indian J. Vet. Med. 1991. - Vol. 11. - P. 56-57.

117. Payne, L.G. Characterization of vaccinia virus glycoproteins by monoclonal antibody precipitation / L.G. Payne // Virology. 1992. - Vol. 187, № 1. - P. 251 -260.

118. Payne, L. Polypeptide composition of extracellular enveloped vaccinia virus / L. Payne // J. Virol. 1978. - Vol. 27. - P. 28-37.

119. Poxvirus genetic recombination during natural virus transmission / P.D. Gershon, R.P. Kitching, L.M. Hammond, D.N. Black // J.Gen. Virol. 1989. - Vol. 70, № 2.-P. 485-489.

120. Rafyi, A. Goat pox in Iran, serial passage in goats and developing eggs and relationship with sheep pox / A. Rafyi, H. Ramyar // J. Сотр. Pathol. Therap. -1959.-Vol. 69.-P. 141-147.

121. Ramyar, H. Goat pox:immunogenicity of vaccine virus modified in cell culture / H. Ramyar, M. Hessami, B. Ghaboussi // Vet. Bull. 1974. - Vol. 44. - P. 472.

122. Rao, T.V.S. A comprehensive review of goat pox and sheep pox and their diagnosis / T.V.S. Rao, S.K. Bandyopadhyay // Anim. Health Res. Rev. 2000. -Vol. 1, № 2. - P. 127-136.

123. Rao, T.V.S. Development and standartization of a rapid diagnostic test for sheep pox / T.V.S. Rao, B.S. Negi, M.P. Bansal // Indian J. Сотр. Microb. Immunol. Infect. Dis. 1997. - Vol. 18. - P. 47-51.

124. Rao, T.V.S. Diagnosis of sheep pox and goat pox by PCR technique / T.V.S. Rao, S. Nandi, B.P. Sreenivasa // Indian J. Anim. Sci. 2001. - Vol. 71. - P.

125. Rao, T.V.S. Evaluation of avidin-biotin ELISA for the detection of antibodies to goat poxvirus using noninfectious diagnostic reagent / T.V.S. Rao, P. Malik, D. Asgola // Acta Virol. 1999. - Vol. 43. - P. 297-301.

126. Rao, T.V.S. Evaluation of different serological tests for the diagnosis of goat pox using soluble antigens / T.V.S. Rao, B.S. Negi // Tropical Animal Health Production 1997. - Vol. 29, № 4. - P. 235-239.

127. Rao, T.V. Identification and characterization of differentiating soluble antigens of sheep and goat poxviruses / T.V. Rao, B.S. Negi, M.P. Bansal // Acta Virol. -1996.- V.40.-P. 259-262.

128. Rao, T.V.S. Isolation and characterization of soluble antigens of sheep poxvirus / T.V.S. Rao, B.S. Negi, M.P. Bansal // Indian J. Exp. Biol. 1997. - Vol. 35. - P. 597-602.

129. Rao, V.D.P. Standartization of single radial haemolysis test for detection of sheep pox antibodies / V.D.P. Rao, R. Chandra // Indian J. Vet. Med. 1986. -Vol. 6.-P. 138.

130. Rao, T.V.S. Use of purified soluble antigens of sheep poxvirus in serodiagnosis / T.V.S. Rao, B.S. Negi, M.P. Bansal // Indian J. Anim. Sci. 1997. - Vol. 67. - P. 642-645.

131. Replication and resolution of cloned poxvirus telomeres in vivo generates linear minichromosomes with intact viral harpin termini / A.M. DeLange, M. Reddy, D. Scraba et al.J // J Virol. 1986. - Vol. 59. - P. 249-259.

132. Rosel, J. Transcription and translational mapping and nucleotide sequence analysis of vaccinia virus gene encoding the precursor of major core polypeptide 4b / J. Rosel, B. Moss // J. Virol. 1985. - Vol. 56. - P. 830-838.

133. Roy, R.N. Identification and immuno-characterization of different structural polypeptides of sheep pox virion: Phd. thesis / R.N. Roy; Indian Veterinary Research Institute. Mukteswar/Izatnagar, India, 1994.

134. Saha, G.R. Studies on lymphoid lesion of goat pox / G.R. Saha, N.C. Nayak, M.K. Bhowmik // Indian J. Anim. Res. 1991. - Vol. 25. - P. 1-4.

135. Sambyal, D.S. Immunogenecity of soluble antigens of sheep-pox virus / D.S. Sambyal, I.P. Singh // Indian J. Anim. Sci. 1978. - Vol. 48, № 7. - P. 511 -514.

136. Sharma, P.C. Immunological response of RM/65 sheep-pox vaccine in lambs / P.C. Sharma, S. Prasad, S.K. Karla // Indian J. Anim. Sci. 1987. - Vol. 57, № 9. -P. 923-928.

137. Sharma, S.N. Detection of sheeppox virus multiplication in sheep cells by acridin orange staining / S.N. Sharma, B. Sambamurthi // Indian J.Exp.Biol. 1977.-V.15.-P.

138. Sharma, S.N. Studies on sheep- and goat-pox viruses. Relationship with CPD and vaccinia viruses / S.N. Sharma, M.R. Dhanda // Indian J. Anim. Sci. 1971. — Vol. 41. — P. 864-867.

139. Sheep pox and goat pox // OIE. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees). 5th ed. - Paris, 2004.-P.211-220.

140. Sheep poxvirus identification by PCR in cell cultures / O. Mangana-Vougiouka, P. Markoulatos, G. Koptopoulos et al. // J. Virol. Methods. 1999. - Vol. 77, № 1.-P. 75-79.

141. Singh, A. Rai // Indian Vet. Med. J. 1991. - Vol. 15. - P. 245-250. 160.Singh, B. Virion polypeptides of sheep poxvirus / B. Singh, A. Rai // Indian Vet.

142. Med. J. 1991.-Vol. 15.-P. 239-244. 161.Smadel, J.F. Elementary bodies of vaccinia / J.F. Smadel, C.L. Hoagland //

143. Bacterid Reviews. 1942. - Vol. 6. - P. 79-110. 162.Solyom, F. A live attenuated virus vaccine against sheep pox / F. Solyom, L. Perenlei, J. Roith // Acta Vet. Acad. Sci. Hung. - 1980. - Vol. 28, № 4. - P. 389398.

144. Soman, J.P. Occurrence of malignant goat pox in Bihar and confirmation of the causal virus / J.P. Soman, R.P. Singh, G.J. Jha // Indian Vet. J. 1985. - Vol. 62. -P. 907.

145. Negi et al. // Indian J. Virol. 1986. - Vol. 2. - P. 202-221. 166.Subba Rao, M.V. Antigenic relationships among sheep pox, goat pox and CPD viruses / M.V. Subba Rao, B.S. Malik, S.N. Sharma // Acta Virol. - 1984. - Vol. 28.-P. 380-387.

146. Subba Rao, M.V. Application of electroimmunodiffusion test for detection of antigenic relationship between sheeppox and goatpox viruses / M.V. Subba Rao, B.S. Malik // Acta Virol. 1983. - Vol.27, № 2. - P. 177-179.

147. Tantawi, H.H. Laboratory characteristics of four strains of goatpox virus / H.H. Tantawi, M.M. Al-Falluji // Acta Virol. 1979. - Vol. 23. - P. 455-460.

148. The genome of sheeppox and goatpox viruses / E.R. Tulman, C.L. Afonso, Z. Lu et al. // J.Virol. 2002. - Vol. 76, № 12. - P.6054-6061.

149. The immunological relationship of the poxvirus group / M. Takahashi, S. Kameyama, S. Kato, J. Kamahora // Biken J. 1959. - Vol. 2. - P. 27-29.

150. Tiwari, A.K. Comparative efficacy of dot-ELISA and single radial haemolysis (SRH) test in detecting goat pox antigen / A.K. Tiwari, B.S. Negi // Indian Vet. J. 1996b.-Vol. 73.-P. 1017-1020.

151. Tiwari, A.K. Single radial haemolysis for the detection of goat pox virus antigen and antibody / A.K. Tiwari, B.S. Negi // Trop. Anim. Health Prod. 1996. -Vol.28, № 1.-P. 117-120.

152. Tiwari, A.K. Spot agglutination test for the rapid diagnosis of goat pox / A.K. Tiwari, T.V.S. Rao, B.S. Negi // Trop. Anim. Health Prod. 1996. - Vol.28. - P. 213-215.

153. Uppal, P.K. Serological reaction in sheep pox. 2. Agar gel diffusion test / P.K. Uppal, P.R. Nilakantan // Indian Vet. J. 1967. - V. 44. - P. 374-382.

154. Use of a recombinant antigen in an indirect ELISA for detection bovine antibody to capripoxvirus / V.M. Cam, R.P. Kitching, J.M. Hammond, P. Chand // J. Virol. Methods. 1994. - Vol. 49, № 3. - P.285-294.

155. Use of a recombinant antigen in an indirect ELISA for detecting bovine antibody to capripoxvirus / V.M. Cam, R.P. Kitching, J.M. Hammond et al. // J. of Virol. Methods. 1995. - Vol.53, № 2-3. - P. 273.

156. Veda, Y. A specific surface antigen induced by pox virus / Y. Veda, M. Ito, J. Tagaya // Virology. 1969. - Vol. 38. - P. 180-182.

157. Veterinary Virology / F. Fenner, E.P.J. Gibbs, F.A. Murphy et al.. London: Acad. Press, 1993.

158. Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Virus. Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / F.A. Murphy, C.M. Fauquet, D.H.L. Bishop et al.. New York: Springer-Verlag, 1995. - P. 79-91.

159. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / Van M.H.V. Regenomortel, C.M. Fanguet, D.H.L. Bishop et al.. London: Academic Press, 2000.

160. Wang, S.H. Studies on attenuated goat pox virus vaccine. The manufacture of freeze-dried tissue culture goat pox modified virus vaccine / S.H. Wang, H.X. Jiang // Acta Vet. Zootechn. Sinica. 1988. - Vol. 19. - P. 279-284.

161. Wei, C.M. Methylated nucleotides block 5'-terminus of vaccinia virus mRNA / C.M. Wei, B. Moss // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. - Vol. 72. - P. 318-322.

162. Weintraub, S. Biogenesis of poxviruses: genetically controlled modifications of structural and functional components of the plasma membrane / S. Weintraub, S. Dales // Virology. 1974. - Vol. 60. - P. 96-127.

163. Wittek, R. Tandem repeats within the inverted terminal repetition of vaccinia virus DNA / R. Wittek, B. Moss // Cell. 1980. - Vol. 21. - P. 277-284.

164. Woodroofe, G.M. Serological relationships within the poxvirus group: an antigen common to all members of the group / G.M. Woodroofe, G. Fenner // Virology. -1962. Vol.16. - P. 334-341.

165. World Animal Health in 1997. / Reports on the Animal Health Status and Disease Control Methods and List A Disease Outbreaks. Statistics OIE. Paris, 1997.-P. 4.

166. Zaslavsky, V. Uncoating of vaccinia virus / V. Zaslavsky // J. Virol. 1985. -Vol. 55.-P. 352-356.

Информация о работе
  • Орлова, Елена Сергеевна
  • кандидата биологических наук
  • Владимир, 2007
  • ВАК 03.00.06
Диссертация
Совершенствование методов диагностики оспы овец и оспы коз - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Совершенствование методов диагностики оспы овец и оспы коз - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы