Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка инактивированной вакцины против классической чумы свиней

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка инактивированной вакцины против классической чумы свиней"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 619.616.988.73:578.833.31-85. 371 УСТ АРОВ Руслан Джамалутинзвич

РАЗРАБОТКА ИКАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

03.00.06 — вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПОКРОВ 1993 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Жестерев В. И.

Официальные оппоненты — Доктор биологических наук, профессор Орпянкин Б. Г. (ВИЭВ),

— Кандидат биологических наук Рудобельский Э. В (ВНИИВВиМ).

Ведущее учреждение — Всероссийский Государственный НИИ по контролю, стандартизации и сертификации вет. препаратов.

Защита состоится 28 апреля 1993 гсда в /Л часов на заседании специализированного совета Д 120.61.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, г. Покров, Владимирской области, ВНИИВВиМ.

С диссертацией мосно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

.1 г~

Автореферат разослан « » марта 1993 гсда.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук.

Федоров Г. П.

' 1. СЕДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ . .

ктуадькость тзтЫ. В комплексе мероприятий по борьбе с классной Tfi/cti свиуей. Несмотря на наличие достаточного колкчаства «нас срэдств спешщфической запиты, чука свиней остается г . э опасны?: я распространенных вирусных болезней, занося®* зяа-лакьй экономический утзгрб свиноводству многих стран ыира. ¡ послэднзе зрэмл Сохьзое признанна получила кудьтурагьные ви-вакцикы иа штатов К: АСБ.ЕГШИ, Ж-БНИЙЕ&Ш sij-p., которые аи-приманяится как варубемпм, так.и у нас в. стране С£К.Мвд=в-980; В. Й.ПЭПОВД931; 8.11633,1933; I. Aunaxid,.lS8S и др.). Ви-вакцнны кмэйт высскуз иммуниэнрукщуя , . активность,' что обсгвует формирования напряженного иммунитета в Coses корог-сроки :j на' продолжительное время. зто особенно ваяно при принта вакцинных препаратоэ.. в неблагополучии1 и угрожаемых по свиней хозяйствах ( I. Sasahara и др. 1976}. >дкако использование вирусвакцин небезопасно- с- точки зрения- • одной реверсии ига непредсказуемой селекции штамма в сторону эния вирулентных свойств, контаминации материала другими ;биоа-ами а прсчэссэ приотовлеяия вирусного сырья, ^длтдьности за* носителъства у вакцинированных животных и поражения плодов че-плаценгарнуи ободочку ( В. tiesa Д938). Ткзкгивирозанные препараты против .'«зсскческой чумы свирей, 'дьэуешэ в прошлом, не наши широкого применении в виду нетех-¡гичности производственного процесса' приготовления' тканевой рки, слабого иммунологического аффекта и дороговизны получае-) препарата. Бшсте с тем, необходимость надежной и безопасной знк против классической чуиы свиней очевидна. .

*

Учктьзая безвредность ^активированных вакцин для свиней лабьж возрасных групп и хозяйственного напрагленлл,, появление новых эффективных адьаваатов, ичашшаторов и биостимуляторов, а "тгкж расд¡прения знаний к опыта в области культивирования укгзгяног-с возбудителя, ш сочли целесообразным возобновить лолск средств ; методов для создания рационального к эффективного биопрепарат: против классической чумы свиней.

Дела и задаед. Цель с наша исследований квлялась разработка инактивироваяной вакцины против классической • -чумы овпе&й, ш достижения которой н&рбходиш было решить Еледукцаг -задача 1.' Поиск источника вирусного :сырья. г. Разработка усгов^й .зыращаванш :и '.хранения .вируса. .

3. Выбор шакткватора и фзрда вакщаного препарата.

4. Оценка шмунобнологичёских свойств опытных партий вакцин: Шучная новизна, В результате 'дроведевных "исследований экспериментально обоснована возможность 'изготовления эффективной .ккзк.-тивировавш'й вакцины против классической чумы свиней.

.' Впервые разработана технологические -.принципы 'зголученкя вирусного сырья разной вирулентности с высокой активности в пёрззш-ныг и перевиваемы* клеточных системах, оценены различнее .инакти-ваяты для вируса'X© и по надежности инактивации, Гбееопаскостк л: сохранению иммунобиологических. свойств инактивирсванного 'препарата выбрана сернокислая медь. ''"'., : .

Показана высокая 'эффективность икактивированной вакцины, со-

г

держащей до 90 X цельной суспензии ннактивированногр вируса вирулентного штамма и 10 I ГОД. . -

Практическая знаадмосга". Разработана безвредная для свиней различных групп и хозяйственных направлений,- экологически безопасная и ььсокоиьмукогеннаа инактивированная вакцина против КЧС, позволяющая рекомендовать ее для профилактики в племенных к репрсдуктиг-

свиноводческих хозяйствах. Основные результаты разработки были- учтены при оформлении -труктивных документов (инструкция и ТУ) ка изготовление и кант-' ь икактивированной вакцины против КЧС.

Изготовлено для практического испытания, оцененная комиссиса-

в ЕНИИЕБиМ, опытная серия вакцины в количестве 10000 доз.

Апробаша и дубликата работы! Результаты исследований долоае-

на заседаниях ученного совета'ЕНИШВиМ в июле и ноябре 1592 г.,

чной конференции ШКВБиМ г. Покров,1392 г.

На всесоюзном конкурсе аспирантских .научных работ, оргаякзо-.

ной Ветеринарной ассоциацией СССР ( Ветеринария, н 3, 1992 г.),

еделена победителем и удостоена диплома.

По результатам исследований опубликовано 5 печатных работ.

Сеяовкш положения диссертационной работы, выдвигаемый на га-

Ь.

- Экспериментальное обоснование перспективности использовании изготовления инактивировайной вакцины против ОТ культурально-

вирулентного игёша над аттенуированньши вариантами зируеаХЧС . ■-

- Технологические принципы получения культурального вирусного еркала разной вирулентности в первичных й --газревивзбмьх' клеточ-

: слотах.. '...■',..'

- Обоснование перспективности использования в качеству инакти-■ора 'здругз КЗС сернокислой меди над другими химичедкирреагеа-¡и. • ' '

05осД:оваяиб -безопасности инактизированной вакцины из зиру-:таого ^©турагеяого вируса К<Ю. '..''.

' йД5ор серепекглздой модели "ияаК1гивнроаааного вакцинного-прет >ата против *

Обьем и структкра работа Диссертация изложена на 93 страна . : машинописного текста, Состоит пэ ваэдо.чия, обгсра литературы, ¡ственных-исследования, обсуждения результатов, вьэодое и орак-

ТКчсСхСггл предложений, иллюстрирована

список нс польэсбз.нной ляхсратура егслючс1<гт нз,}1мск0вэ.к!г1п> к ' них 67 отечественных к 100 гар^беакья.

г. СОБСТВЕН II И Е % С С Л Е I О В А Н К Я

2. 1. ¿¿З/ГсрГ.сШЬ' я ыетольъ

вп?"са. В р3.50те 11сл0ль80в=1ли: зписоотическии шТоЛ-шГ ЦП" 5ИруС5. . £Иру"с-КрОВЬ гс ппссс1л!!1 кз пи/есеинкал с вкти2к0сть

■А С 1,4 Л|п ... ^ »1-.Т-ТГ"—п

п&сса.ъ-гп па культуре клеток ?Ь.—15,с активностью 5, о-1 ЫиЩБ^'/ил^ вакцинные варианты вируса КчС ¡итпшМ ■ЛК-ВШьЛп^ц-ц, прс шедшего 33-78 пэссаж&й б культуре клетск ТЯ, с активностью 4,5-5, - ЕКРПШО/мл; штамм Лй-К, прошедшего 8-12 пассажей на культур клеток РК-15,- с активностью 5,5-6,5 КлИЛ5Э/ыл.

Культуры клеток: - ■первичные культуры клеток;. тестикулы ягкя: (ТЯ), лейкоцитов свиней (1С); костного мозга свиней (КМ2); переь* Баемые клеточные линии почек поросенка. (РК-15), свинья (ТГ-ШС), ш: кисвнньи (ГСМ), сибирского горного козерога (ПСГК-50),,ам5риойа £ риканской козы (ПЗАК), зайца (ПЗ), овцы (7Р11), сирийского хомяч? ■ (ВКК-21/13), эмбриока кролика С ГГЭЕр), ЕРС (ЬТГЕК), а также тэсткк} поросенка (ИЛ).

Среды: - 0,25Х ФГМ на растворе Зрла; ИГЛА-Ш1 ка растворе Зрл; .0,1% ГЛА ка растворе Хзнкса

ЗКивотные: подсвинки крупкой белой породы.2-3 месячного воз раста, массой 25-45 кг; супоросные свиноматки 1,5-2 лет второй пс .лозины супороскостя и подсосные поросята 1-1,5 месячного возраст;

'Вкрааязаккз вируса КЧО з культуре клеток. При выращивании зи руса к11С, . сформировавшийся ыокослой в роллерных или стациокарнз сосудах заражали вирусом е доге 3,0-5,0 ИШЗО/мл. После 2-ч:?.:о5ой адсорбции при температуре 37°С добавляли поддергавахн;

5У аналогичного состаза с 2 % сыворотки к инкубировали з таче- -2-4 суток з зазисишсти от клеточной системы, вирулентности зльзуешго вируса и условий выращивания.

При- суспензионном выращивании вируса я первичных клетках ШЗ | бутыли с инфицированной суспензией клеток вравши на горизонта • рэсиолпжэккьх залах аппарата стелаяка-ярусного. типа, при ■йкой скорости врзшэниз 31 С-350 см/мин. ' Стерильность вирусного сырья определяли высеаои на среды 1ЯА, Китт-Тароипи, Сабурро и инкубированием пзрвьк трех сред при :ерагуре 37 С в течение 10 дней, а последней - при комнатной герахуре (22-24 С) в течение 14 дней,

&ф9кцй0кнух) активность вируса определяли в. прямой ®А в Т'Ур* клеток РК-15 (по кетодика Курганова ЕВ. и соавт. Д994Г) ;ра.чали з клеточно-культуральньк инфекционных дозах(НШС50/мл). гкактквашгя вирусе Г-Г-ГС. . Использовали различные реагенты: глу-еьй альдегид, прэпарат А-24, серкоюзслуэ медь (Си50ч-5НГ0), ди-зтилзн^мика (Д3;0, детергенты №-40 и Тритон Х-100. Через оп-ллгнкьэ промежутки времени, отбирали пробы, оценивали остаточ-ккфекционкость в них прямым ША и вычисляли по формуле танту скорости инактивации (К) к определяли кинетику инактива-вируса:

1г со - 1г а К -----X 2.3 '

г.

1|Г,Со - исходный титр вируса; ь- вреия инактивации вируса; 1® а -титр вируса через определенный промежуток вреыдки; 2,3- коффициент перевода натуральных логарифмов в десятичные, йкстаяту скорости инактивации (К) выражали г час"'(потеря 'вига единицу времени, т.е. за час).

оредедениэ полноты инактивации вируса. Полноту инактивации ви-определили параллельно на культуре клеток (три пассажа) и'

подсвинках сразу после окончания инактивации с последующим йсы довэнием материала третьего пассажа и крови на культуре клеток '-15 в прямом Шк на наличие кедолнактивироЕзнного вируса.

Приготовление икактивирозаякой вакшшы. Сорбированные ващиг готовили путем добавления к инактивированному сырью ГОА (до коне ной концентрации 0,6 % сухого вещэства). .

изготовлении /эмульгированных вакцин использовали масляш адъвванты ВНКЯК 2404 и 3110) или парфшеркое масло с 10% лаь лика, которые сиейивали с инакгивлрозаннш вируснш сырьем в сое ношении 1:1 или 1:3 (сорбнрованно-эмульгированнкй вариант -1 час концентрированного с ГОД сырья, £ части адгювакта) и'эмульгировз с помощью высокоскоростного гомогенизатора 0.5Е) или на коллоида мельнице. Качество имудьсии оценивали по общепринятым методам.

Оценка ишуногенаости вакцин. Жмуногенные свойства опыты серий вакцин проверяли на неиммуных к КЧ2 подсвинках

' За жшлшш ■ в; течение всего периода опытов вели' клинически? наблюдения с термометрией, определением • количества ^ируснейтрали зуицих антител, а также исследования .крови -и органов ;на .вкрусо выделение после контрольного заражения.

Контрольное заражение проводили через 14-23 дней после .нерве прививка вирулентным шт. Ши-Шнь зируса ЖЕ (вирус-кровь) ■ з до 100-1000 ККИД50/Щ. Учитывали температурную реакцию-ййвсшйе

степень их устойчивости к онтрольному заражению. *

Токсичность препаратов проверяли -на Салют .мигах путем введения каждой формы вакцин в дозе 0,2 и 0,5 ш -подкожно.

Статистическая обработка результатов исследований. . Цыфров! данные подвергали статистической обработке средних величин и оамбок ( Меркурьева Е. К., 1979; УрбахВ.»., 1975; Лакин Г. Ф 1980). Достоверность статистической разницы между средними-велич нами определяли по разносному методу Стввдента-йшера. .

2-Е, РЕЗУЛЬТАТЫ ГДСЛЗДОВШЙ.

2.2.1. Поиски источника вирусного сырья.

' S-S. 1.1."'Бь;5ор чувствительной клеточной системы.

Исследовали чувствительность к вирусу КЯС 3 первичных (ТЯ, ЛС, KMC); и перевиваемых клеточных линии. (Рй-15, ПКПС, ПОЙ, П0ГК-50, ПЗАК, ИЗ, УРИ.ГЕХр, ВД2К, ШП).

Результаты исследований показали, что степень чувствительности испытуемых клеточных систем к эпизодическому ( Еи-&кь) и

вакцинному ( ЛК ) штампам вируса КЧС различна. , Одинаковую- репро-

•i

дуктивную активность к обоим птаммам вируса КЧС и максимальное накопление (4,5-6,0 1еКЩЕ50/мд) отмечали в культурах клеток FK-I5, • КШ, ЛС, ТЯ,. ПМС. Другие клеточные систем были слабо чувствительны (КЗ, ГОАК, ВДЕК, 13ЭКР -накопление 0,5-1,5 ККЙД50/мя) или чувствительность некоторых культур (ШГК, ПТП, ПКЮ, УТИ) зависила от используемых штаммов вируса КЧС. Так, в культуре клеток ПСГК, УРН максимально накапливался вакцинный иташ JK-ВНИИБВиМ (4,0-5,5 lg йКИД50/мл), а в культуре клеток ПИК и ШЛ - вирулентный штаум пат-ЬЬгкь (3,5-4,5 lg ККИД50/мл). Как правило, ргзнпца В накоплении вируса различной вирулентности в одной клеточкой с-исгеме составляла более 1,5-lg ШЩ50/мл.

Учитывая высокую чувствительность культур клеток FK-J5; I&D (ЛС) к обоик итаммам вируса КЧС,; круглогодичную возможность их получения и использования, в -отличии от сезонности лреебретенкя-тестикул ягнят и клеток ТЯ, эти клеточные системы были использованы в дальнейших исследованиях для получения-вирусного сырья.

2.2.2. Разработка технологи;, акрагппзазия вируса, в первична; клеточных системах.

Для проведения этих исследований бил ззя? вакцин-кы? аг&мм ЖХ-ШШВВиМ S7-78 пассачзй в культуре клех-ок Ш и ос-ёмгк г гур9 клеток Ж и ТЯ с активность» 5,G lg НКГЦрС/ьл ; -

2*5 О 4 'Oi^.nrviinm ттлгт.-чгчл^ ТГчггт г.т^пАр.ту*я *г(\ гтг»,

, с, с. j. jj^eyct'wl ^упу/ууд _ yfvonjrl» _ и л ycx\j\j х г-jm ^су^'л/ы uvjxj ч7.".лл

клеточного'( КМЗ) и вирусного сырья использовали поросят 2-; месячного возраста которые слуаили донора;® клеток в течение последухвдх .4-х месяцев. Полученную клеточную суспензию в сред; йгла-ШМ с 10 7» антологической ( донорской ) сыворотки помесэла i стационарные или роллэрные сосуды ( роллеркый ыокослой ) и заражали вирусом черег £ суток инкубирования температуре 37" С в статк-■ ческах условиях или постоянно перемешивая'( линейная скороссь 310 см/час) и продолжал:-: выращивать еще 4-5 суток.

Б ходе исследований вняс.чилось, что вьзод рабочей суспензии клеток -ТаП возрастает с увеличением возраста доноров клеток. Юз от доноров 2,5-3,5 .месячного возраста ( масса 30 кг) выход раСоче; суспензии составлял 11-1.3 литров, то от свиней етарзе 5,5 месяце; ( шсса более 50 кг) 15-24 литра. Репродукция вакцинного атзь-а;: Ж в шкослов Клеток KMC, получении;-: от доноров 2,5-5 ыесячногс .возраста, приблизительно одинаковая' и составляет 5,0+0,15 -5,12+0,18 lg КЩБО/мл. Использование в качестве доноров тканей более взрослых свиней (старше 5,5'месяцев, массой 51,8+7,0 кг.)

снижает репродуктивную активность клеток РИС в 10 раз ( 4,1+0,IS > •

lg . КОД' 'БОЛИ). При этой технологии ' от . одного донора до I

месячного возраста южно получить 13-15 литров .рабочей суспеязи:

клеток KMC и от 1 до 1,5 литра сыворотки. В некотрьн случаях, пр;

максимальном "выходе клеток Ki.SC, донорской сыворотки для рабочей .»

суспензии не хватает. Единственный выход- испытать для этой цел; сыворотки свиней, получаемые на мясокомбинате ( сборная, гетероло-гичная). . Исследование этих сывороток показали, что они содержа: ВН-антитела 1:32-1:64. Использование этих сывороток в питательны; средах для вьграцнзания' клеток KMC не влияло на их морфодогис : жизнеспособность, ко -.снижало накопление вируса на 1,37 If ЕЩБО/мл. (3,751g ЩД50/мл).' Обработка такой сызорогк; ПЗГ( м. а. 6000; снижало содержание ВН-антител до 0-1:2. Очищэнш

кворстка не .теряла прол1я$8ративных свойств для клгток KJC, ко ещэ ¡олье» кнгкбировала репродукций вируса (2,5+ 0,25 lg ККИДБО/шО.

2.2.2.2. Лоза заражения. Исследовали влияние зараяаючзй дозы rraj.a,:ob Шн-1&нь (37 пассах на FX-15, В. О lg СТД 5С/мл) н ЛК (78 ¡ассзж нз ЛС,- 5,0 lg ШЩ 50/мл) вируса. К1® на репродукции их в фуговом ыонослсе клеток МЗ.

■ С этой цель» вирусный инокулят з разведениях 1:10-1:10СС вносила в суспензия клэток и инкубировали в течение 6 суток, ежзд-5SBHQ отбирая пробы для оценки динамики накопления вируса:.

Исследования показали,при оптимальной дозе заражения. -4,0-5,0 lg ККйД SO/мл для игакма ши-Ifiino и 3,0-4,0 1g ККИД 50/мл для втам-г?а ДК-ЕНИИВВиМ, что соответствует разведению вирусного инокулята 1:10-1:100, каксгадальксе накопление отвечали на 3-4 сутки для пер-5ого к 4-5 сутки для- второго шташа вируса КЧС ( 5,5 lg ?КВД50/кл). Уменьшение дозы заражения в 10 раз снижало на 1 порядок урозень накопления вируса и увеличивала на 1 сутки врамя инку-Зироваьия. • _

2.2.2.3.Мзтод культивирована вируса.

- Учитывая,-что клетки КЖ можно.культивировать различными тех-юлогическими приема,и (стационарный и роллерный монсслой,суспензия ) ыа испытали их для выраыиваяия вируса. Результаты показали, wo наиболее продуктивным по активности получаешго вирусного :ырья были роллерный и суспензионный метод. При вырастании вак-динкого вташа, титр вируса.при указанной технологии был на 0,4 lg ¡ОВД 50/iu ЗЫйЗ-(Е1-1&яь-5,2 2g ККНД 50/ш, Ж- 5,5 Iff ЮВД SO/wt) sем при выращдваниа в статических условнвиах. Отмечено, что зпизо-

4

этический йирус накапливался во всех случаях в первичных клетках Н.С ниже, чем вакцинный. ■;"

. Таким образом, предложена технология выраздазания вирулентного и вакцинного штаммов вируса ЕЧЗ з клетках Ш в роллерйьк г сус-яензионных условиях, позволяющие получать вирусный-материал с ак-

тивностыо не ниже ' 5,0 lg ЕВД50/мл в среде игла-НЕМ с 10 Z д норской сыворотки свиней, при разведении икокулята' 1:100.

' S. 2.3. Разработка технологии вырашвакия вируса КЧС б перевиваемых клеточных системах/ • g. 2.3.1. , Доза. заражения.

Для определения оптимальной дозы заражения использовали va: ровую расплодку вируса штамма Ш-Мть (37-41 пасса» на РК-15, 6 lg Кг32Д50/мл) и шташа ЯК (79 пассаж на КНМЗ, 5, G 1еКгЗЩ50/мл) заражали км культуру клевок ÎK-15 в дозах соотэестзущих развед наи вирусного инокулята lac - laoooo. Ежедневно отбирали про для определения активности и динамики накопления вируса,

Отмечена зависимость' времени максимального накопления виру ор -дОеы заражения к характеристики используемого вируса. Каибо, ярко она проявляется щ>н вырадавакии эпизоотического -вируса, боль сей зарахашэй доэе '( 5,0 1еККИД50/>мл ) максимальное -накоп. юге вируса (6,0 lg кгл350/мд) наблюдали на 2-3 cjtkk. ТЬследуи снижение зарахавдай дозы в 10 к 100. раз (4,0-и 3,0 lg ;КЕКД50/! отодвигало сроки максимального накопления вируса на 3-е и 4-е с: ки соответственно. При выращивании в. клетках РК-15 вакцин® штамма такой зависимости se отме'чено. йаксимальше накопление !

руса наблюдали на 4-5 сутки (5,0 lg ЕЭДТО/мл) при разведении ш

*

куллта 1:10 -1:100. Таким'образом, оптимальной дозой зараже] можно считать для штамма Вй-Мынь 4,0-5,0 lg КККД50/мл, для егш ЛК- 2,0 - 4,Q lg ШЩ50/МЛ, что соответствует разведению-вируанс инокудята 1:10 - laoo. -■ 2.2.3.2. Температура выраииЕавия. . . ' 'Изучение динамики накопления ' штаммов Ш-Шнь и ЛК в культу клеток РК-15' при 30* 37^ 41® С показала, что эпизоотический етг вируса' максимально накапливался (6,3+0,13 - '6,5+0,11) при 41"С 2-3, при' 37"С - на 3-4 сутки. -При ЗО'С титр вирулентного вир; был' на 0,8-1,0 le О/мл.ниже. 1$>и вкрздивании вакцинного стг

а отмечали обратную зависимость. Так, максимально© накопление ви-уса (5,5 1д ккщбо/мл наблюдали при 30*и 37*с, а 41* С накопление пруса было на 0,5 1| ККИДБО/ьц ниже;

2.3. 3.3. Сыворотки различных видов животных.

При выращивании вируса КЧС в 'культурах клеток РК-15, ПМС, ПТП, 3, ПКЛС, ШШК к поддершвакнрй среде йгла-Щ добавляет 2-5 X до-о'гостояцей дефицитной сыворотки ;телят. Учитывая это бьш проведе-ы исследования по возможности замены фатальной сыворотки телят на ругне, более доступные, сыворотки.

При использовании сывороток овец, коз, лоаадей наблюдали, что . акопление . вирулентного вируса был максимальным (6,1*0,11 5,3+0,17 ККИДбО/мл) и ке отличалась от контроля (среда с фк-альной сывороткой телят). При использовании сывороток КРС и оле-ей . активность вируса была несколько нияе (5,8+0,14 - 5,9+0,18 1д ШЯБОУыл). Внесение в среду сыворотки свиней ке обеспечивало нсокого накопления.вируса и титр был ка 1 порядок низ® контроля, налогичные результаты получены и при выращивании вакцинного итам-а с использованием указанных .сывороток.

Учитывая, что комерческие сыворотки КРС содержат БН-антитела к прусу диареи крс (1:16 - 1:32), были предприняты попытки осво-ождения от них обработкой раствором -ПЭГ (м.в.6000). . одномоментная смена, сыворотки телят ка сыворотки взрослых яи-сгных (• КРС+'ЧЗГ) в поддершвакдей среде при внрадивании зпизоотя-еского штамма ке влияла существенны« образом на накопление вируса 5,7+0,28 Ш5Д 50/мл). Использование сыворотка КРС, обр&ботан-ой ПЗГ, для вырадивакия клеток и вируса приводило при длительном ассировании' (20 пассажей) к изменение мсрфоЛтот клетки, что влек-ок снижению активности получаемого вирусного' сырья .,на 0,5 КИД 50/мл.- Вероятно, такая замена должка сопровождаться более кимательным наблюдением га культурой (морфология ■ клеток, уровень ассажа в новей среде,качество используемой сыворотки). .

2.2.3,4. .Изтод культивкрозакия вируса.

Учитывая хорошее накопление вируса КЧС э мснселое клесо:-Е-М5,. Сьшо -целесообразно сравнить эффективность двух методов вы раа^аайия: стационарной в 1,5 литроэьк мэтрасах и роллеркь& (кру г'овой ыокоелсй)- в 3,5 жгровых бутылях, отечественного производс тва для получения вирусного сырья.

При оптимальных условиях выращвания роллерным способом, актш ноеть вирулентного вируса достигала 3,68+0,11 ЕВдаз/ма, а вэ цинного - 5,02+0.14 1% НЕйД50/.мл, что, соответственно, на о,?з 0,5 1£ КХЩрО/мл выше активности вируса, получаемого в зтой кл точной системе стационарным методом. Креме зтгго, сбгеа получаем го вирусного оырья с одного куготурального сосуда на 0,3-0,4 лит больше, чем при стационарной методе выращивания.

Следует отметить, .. что'эпизоотический гггаьа« вируса, адапгирс ванный к указанной меточной системе в течение 33 паосажй, кака ливался в ней значительно вьпзе ( ка'1', 7-1,5 1» ККИД50/мл ), ч вакцинный еташ. .

Таким образом, отработана технология вкращнва.вйя вируса К^ разной вирулентности в перевиваемых клетках гК-15 в стационарных / ррллерных /условиях, позволяющих получать- ьируенчй материал с а тивностьв не ню© Б,0 ККИД50/мл в среде }5гла-МЕМ с 27. сыворот телят или других видов животных.

' 3.2.4. Хранение вирусного сырья.

Изучали влияние . положительнкх (4...8*С) температур, состав питательных сред, условий вырапдавания вируса и других факторов эффективность хранения вирусного сырья. .

Результаты исследований показали, что едкое натиансе сырь вакцинного штамма бол^е термолабильнее вирулентного, как п пжсових, так и при минусовых температурах и' требует более раки го освежения (не позже 1 года хранения). При -40*0 сохранное

вируса, особенно вирулентного кгамма, более значи телька, чем при плюсоэых температурах бытогого холодильника. Снижение колгаестэа сьаоротки в среде хранения до 0-2 % снимает активность вирулентного вируса при 4... 8°С на so-SO Z за 3 месяца. Добавление к таким суспензиям стабилизаторов (пептон, сахароза, си лотран) несколько_ улучзает -эти характеристики. Сник&ние активности вируса равной вирулентности, выраженного в культуре клеток Ш2, при плюсовых температурах происходит медленнее, чем выращенного в куль туре клеток 5К-15. Вероятно зтс связано с содержанием в НЕ® 10 % сыворотки, тогда как в культуре клеток ?К-15 ее в 2 раза «еньзе.

2.2. 5. Разработка i условна -инактивации.

2.1. -5.1. 2ыбор. инактиватрра. В качестве 'инактиваторов испыты-вэлись; препарат А-24; . димерзтиленимкна (¿¡ЗИ), сернокислая кедь, глюяарсвый альдегид (ГА),"детергенты ИР-40 й Тритон Х-100 в конеч-' ных концентрациях, соответственно, .0,03 %, 0,1 7., 5 мУ, 0,05 Т., 5Z, 5 ~ и экспозиции 24, 24, б„ S3, 18, 18 часов при тешератур? 37"С U-24,E3!'!,rA,CuS0 ) и 4* С (Тритон Х-100 I! NP-4G).

Результаты контрольного заражения показали, что устойчивым;; к контрольному'заражения оказались свиньи привитые вирусным материалом для инактивации которого использовали ионы меди (Си*1) и препарат А-24. Применение других вакцинных препаратов не дало положительных результатов. Бее животные прореагировали гипертермией до 41, 2еС равной продолжительности (4-12 дней) на контрольное заразг-ние. Отмечали задержу гибели до 16 суток лгйчтных при использовании материалов, инакхивироваязых КР-40 и Тритон Х-100.

Подучив такие' результаты, были попытки оценить выбранные изак-тизаторы (Cuw, А-24, HP-40) и рбякм с вирусный материалом из вакцинного штамма полученным в ЩС (5,5 ККИД 50/ил). Предложенный режим инактивации был подтвержден и . с вакцинным штакюм вируса. Прививка этими препаратами свиней показала их безвредность. При контрольном заражении через 14 суток после однократного применения

Е доге 4 мл. , только препарат с ионами меди привитых по-

росят. Подсвинки привить® другими препаратами (А-24 и NP-40), погибли на 6 сутки после контрольного заражения.-

Таким образом, по оценке опытных образцов •икактивированньх препаратов в культуре клеток и на подсвинках, в качестве инактива-тора выбрана сернокислая медь' (_СиЗО,-5Кг0 ).

2.2. 5.2. Изучение кинетики инактивации.

Кепытывалк влияние различных физкко-химических факторов (температуры, рН среды, сернокислой меди) 'на инактивацию вируса КЧС.

Влияние температуры. Еультуральную жидкость содержаЕув вирулентный или вакцинный нгаммы вируса КЧС, выдерживали при температуре 56* 37] 24"С. Результаты исследований показали, чго скорость инактивации зависит от температуры инкубирования и степени вирулентности; используемого вируса Она тем быстрее, чем выие температура воздейтсвия .

Так при 56*С через 1 час титр вирулентного вируса снизился на 4 порядка и составлял 2,0 lg КЙЗД 50/мл, тогда как вакцинный итамм к этому времени Еолшстыз 1шактизировзлся, что соответсвует значениям константы скорости инактивации (Б) 0,2 и 11,5 час"4. При 37*с это показатель равен 0,027 и 0,055, а при 24* С- 0,019 и 0,033 час"4

Влияние рБ. Исследовали влияние рН 5,5 и 5,7, сооТветсвувщих рН при внесений б и 3 мИ CuSQ,, а также рН 7,2 и 8,0

Результаты исследований доказали значительно быструр инактива-цию'при.более кислой( 6,5 ) и иелрчной. ( 8,0 ) рЕ Константа инактивации эпвеоотяческого вируса при этих значениях соответствует 0,110 - 0,115 (37* С) и 0,043 - 0,071 (24* С) час? а вакцинного, соответственно, 0,215 - 0,230 и 0,119 - 0,131 час'. Чем значение рН ближе к нейтральной- t уменьается в 1,5-2 раза.

' Влияние сернокислой меди. Вирусное сырье с 3 и'б Ш CuSO* выдерживала при температуре 24" и 37* С.

\ ■

Результаты опытов показали прямуо зависимость кинетики икакти-

ESU'ri;; вируса от концентрации исков меди, температуры инкубирования • и вирулентности вируса.

Так эпизоотический вирус при 37'С и концентрация инактиватора 5 мК кнактивировался за 18 часоз (К= 0,755 час*1), 3 мМ - за 21 час (К= 0,57 час ), 1 м!,1 - за 26 часов (Ь» 0,530 час*'), тогда как вакцинный при тех же условиях терял икфекцяоняость значительно быстрее, соответственно за 7, S и 13 часов (К» 1,55; 1,259; 0,973 час"1). При снижении температуры инактивироваяия до 24*С наблюдали збычнуи коррелятивную зависимость от концентрации меди и штамма вируса.

Таким образом изучены условия инактивации вируса КЧС разной аирулекткости: эпизоотический штамм Ек-!»1ынь сказался более устойчи-зкм к различным физико-химическш воздействиям, с уменьшением концентрации инактиватора и температуры инкубирования удлиняются сро-ai полной инактивации вируса его инактивации.

2.2. 5.3. Безопасность инактивирозанных препаратов.

Безопасность опытных серий инактивирозанных вакцин оценивали ю.-остаточной инфекциоаности, реактогенности и 'безвредности. С • ¡¡елью надежного доказательства полноты инактивации применяли раз-щчные.методы его обнаружения: выделение вируса в культуре клеток в ^активированных препаратов и крови привитых животных. В первом ;ассаже в каждый матрас, после .слива ростовой среды вносили по 0-30 мл натизного или 10-15 мл ¿концентрированного материала с pH ' ,0-7,2. После 1,5-2 часового контакта с клеточным монослоем при 7 С инокулят сливали, Z-2-x кратно промывали монсслой.и затем в*, атрасы вносили поддергсгаювув среду с 51 сыворотки животных и убывали 2-3 сутг-к при '37*С. Последующе -пассз*а проводили по бирпринятой методике, используя б качестве инокулята нативный.«а-ериад предыдущего пассажа или клеточный 'концентрат суточного ультивировакия, получаемый после слива 75-£?0 Z поддераовакЕ-й

среды и последующего заморажгания и дефростаиии. Последний способ предпочтительнее. Материал 3 пассажа исследовали в прямом А для определения остаточной вирулентности. Ни в одном из исследованных проб, опытны/ серий вакцин вирус не был выделен.

Учитывая появление впреши после экспериментального'заражения, остаточнуэ икфекционнссть инактизкрозаниых препаратов такж оценивали исследованием крови привитых /¡¡цветных на наличие вируса При исследования кроея и суспензии тканей селезенки и миндалин в 3-х пассажах на культуре .клеток вирус не выделен. Проверка реактогек-кости, безвредности к токсичности опытных серий вакцин на подсвинках и белых мыиах показала полную безвредность.

Таким образом, использованные нами методы оценки остаточной инфекционности (азирулеятности), безвредности и ареактогенности предлагаемых нами разных форм ваш-ш показали надежность предложенного способа инактивации вируса раствором сернокислой меди при -температура З7'с в течение -4 суток.

2.2.6. Выбор формы вакпинкого препарата.

Для повышения иммуногенной активности препарата, длительности иммунитета изучали влияние различных адьюзантоз ( вазелиновое или парфюмерное масло с ЮХ ланолина, адыозантов ЕН11Я2 МК 3404 и 3110, ГОД), а также иммуностимуляторов 1-32, 1.-35 ( полимеры на-основе К-винилпиродидонов). Помимо оценки иммуногенных свойств разных форм ; вакцин, "оценивали такие, физические качества получаем эмульсий «.удобство его применения в практических условиях.

2.3.6.1. Сорбированные и эмульгированные вакцины .

« Яри изготовлении ГОА-вакцины препарат представлял из себя прозрачную зеленоватую жидкость с рыхлым осадком. При встряхивании образовывалась зеленовато-бурая суспензия, легко набираемая и вводимая с помощью шприца. При' изготовлении эмульгированных вакцин, инактизированное сырье сыеаивали с указанны»; выше адыовантами ;

ютнсгэниа 1:1. Однако, при использовании адькзакта ЕНИЯИ ¡J3110 и • ффьмерного масла с ланолином получилась сметанообраэная Седая 'спекзия, которая,с трудом набиралась в шриц и вводилась живот-•м. Наиболёе удачным, на наш взгляд, была эмульсия полученная при >у.огенизации с:-.рья с адьввантом 3404. Плотность такой эмульсии ьта незначительна (10-15 Сет} и удобна в использовании практи-■скш работникал При использовании иммуностимуляторов, последние Убавляли к кативному зшачтивированксму сырья'в количестве 25 - 50 '/голову. Перечисленные выае форш вакцин испытывала иа имму^о-■нкость' введением их подсвинкам. Учитывали общую и месткуз реак-:ю организма на введение препарата, уровень БН-антитед' перед отрольным заражением, и реакцию на котрольное заражение..

Результаты контрольного заражения показали иммунизация живот-ас сорбированными и эмульгированными вакцинами из ияактивирован-;го- штамма ШкЧЬмь обеспечивает ico X залету при использовании дивного и сорбированного препарата при незначительной темпера-ряой реакции ( до 40,1- 40,3еС ) у некоторых животных на конт-¡льное заражение. Подсвинки, привитые эмульгированными препалата-содержание 50 Z нативногс. сырья, отвечали'на кояторольное задние сильной гипертермией (40,5"- 41,О*С) в течение 1-4 дней.

ЯНачт ивированкые вакцины и© втамма ЛК-ВНЖВВиМ зациззли всего i Z пришитых животных. Причем эмульгированная вакцина вообщэ не щкзэла от контрольного заражения,- Б натианом или сорбированном . ГОА виде препарат предохранял в обцей сложности 5 из 8-ми житных от гибели при контрольном заражении.

' Учитывая, что ыаслянкые препараты содержат БО I нативного активированного материала, предприняли попытки сконцентрировать тиген. Для этого инактивированный материал сорбировали на ГОД О минут), сливали.2/3 надосадка, остаток смезивали с 3 частями сланного адькзакта. Полученный сорбированкр-амульгированный пре-рат обеспечивал ICO Z защиту привитых жшотньк, при незначите ль-

кой гипертермия до 40,5" С Б течение 2-4 дней. Титр ЕН-антите, вакцинированных животных перед контрольным заражением на 14 сутки СЫл в пределах 1: 4-1:16 после-'введения ГОА-вакцинк к 1:4-: - маслянной вакцины. Применение иммуностимуляторов не оказывала димого положительного влияния ка иммунный ответ у вакцинирован; животных. ■ Таким образом, по технике изготовления, удобству в п| менении, иммунологическим к; экономическим Характеристикам, настояфй момент, мокно считать кнактивирозанную ГОАтвакцину Еггамма Еи-Шнь. Использование вакцинного «гамма при прочих рав? технологических параметрах для изготовления кнакгивировакной ванн не приемлем в гиду более' низкой нмыукогеняостк вирусного сырг 2.2. б. 2. Доза и кратность применения. ■

Описанные в предыдущем разделе сорбированные и масляные кка

тивгфсЕашше вакцины из разных штаммов вируса КЧС, испытывали пр

одно- (4 мл) или двухкратном <2+2 мл) с интервалом между приви

ками 7-14 дней и контрольным заражением на 14-29 сутки после пер

вой прививки. Результаты показали, что существенной разницы в за

а$гге привитых подсвинков от контрольного заражения не отмечаете

несмотря на исследуемые ' различные варианты условий применен;;

препаратов. Следует, однако,отметить, что, несмотря на дозу

кратность применения,, при контрольном заражения в ранние срок

(на 14 сутки) наблюдали длительную (4-5 суток) температурную ре

акцию с достижением максимума до 41, 4*0 у подсвинков. Более позд

нее контрольное заражение ( на 24-20 сутки) не сопровождаете:

столь длительной гипертермией. Эти наблюдения относятся и к вак/

данным препаратам из штамма Пй-Шнь в натигном и' сорбировании ■виде. .

2.2.6.3 Хранение вакцины.

Приготовление-экспериментальные образцы инактивированных сор бированной и маслянной вакцины да ЕтаммаЕи-КЬшь по<йе хранения

условиях бытового холодильника ( 4. ..з'с ) оценивши ка подсвкн ках по титрам ВН-антител или контрольным заражением.. Результаты показали что инактизирозанкая вакцина сохраняет свои иммунобиологические свойства не менее Б месяцев (срок наблюдения)* при указанных условиях. При этом сохраняется исходные товарный вид и иммукогекность ( ICO % зашита от контрольного/заражения , уровень ВН-антител 1:'6 - 1:32 ).

2.2.7. Пг.ояззодственные испытания-инактивированной вакцины.

По договоренности с ветеринарным управлением КСХ республики Дагестан, в одном из хозяйстз республики было проведено производственное испытание вакцины. -В' опыт взяли подсосных поросят 1-1,5 месячного возраста и.супоросных свиноматок 2-х лет -второй половины супоросности. которым прививали вакцину одно ( 4 из)-а двукратно ( 2+2 мл с интервалом 10 дней). Для определения безвредности и реактогенностН вакцины двум супоросным свиноматкам ввели по 10 мл препарата. Результаты исследований показали',;, что вакцина Зеэвредна и ке оказывает .отрицательного воздействия на организм ззшноиатка л плода. Уродившийся от аачциняров&ша сзиноматок, • жглодняк был жизнеспособным и без аномалий. .Исследования ЕН- антител .показали, что прививка свиноматок йнактивиу-бзакной ГОА- вакциной за месяц до опороса индуцирует у них максимальное накопление Зй- антител до 1:16 независимо от кратности привязки. При передаче латёринских с -тител народивяиыся поросятам было оточено постепенное -их снижение до :1:.5,1--1:-5,Б -у -последних к 30 дна после рождения. При иммунизации торосят 1,5 - -2 месячного вогрзста уровень ВН •антител в крови через -месяц составляет i г 4 —1x16'- с пос^еду^кш Увеличением ах в два раза при .двукратной вакцинации к 2,.5 кгсязм. Аналогичное явление отмечена и при вакцинации свиноматок.

, Таким образом, максимальнее накопление давня ЕЯ - антител ,у грлвиткх киЕОТт-п; достигается з более поздние -сроки (>- «ícbicV, íto долгаэ служ-iib критерием рекомендации по применение вакцины на

супоросных свиноматках. Длительность пассивной защаты народившегося поголовья от вакцинированных свиноматок зависит от уровня приобретенных материнских антител.

В Ы В О Ж Ы.

1. Разработан? икактиаиооваккая вакпина против' классической чумы свиней ( КЧС ), содерлсайгал культуральный материал £ирулектко*~ го штамма ILíi-.'/^ikl. . сернокислую шедь в качестве инактиватора и гидроокись алюминия.

2. Определены чувствительность и условия выращивания вируса •КЧС различной вирулентности в первичных ( кш, до ) и перевиваемых ( PK-Í5, ШС ) клеточных сктемах. •■

3.. Технологические условия выращивания вируса КЧС вклкчают мо-нослойнук 2 -.3 .суточную культуру клеток, дозу заражения 3,0 -4,0 lg КККД БО/'мл и. дальнейшее инкубирование инфицированной культуры в статических или роллерных условиях при 37'С в 'течение 3 су-;ток для шт. Ши-Нынь и 4 суток для Ж

■ 4/. Максимальное накопление (на 0,5-0,В - lg ККИДБО/мл больие) ■ вирулентного штамма вируса в перевиваемых клеточных системах ( РК-15 ) отмечали при-37'к 41* с", а вакцинного - при 33%; 37'С. Сыворотки .овец, коз, лошадей, оленей, телят не влияла существенным,образом на накопление вируса.

5. Вирус КЧС, выращенный любыми технологическим;! приемами, надежна инактивировался сернокислой медью (3-5 м10 при 37"С в течение 95 часов,. с сохранением антигенных и'иммуногенккх свойсте. Использование других кнактиваторов ( глутаральдегид, ДЗИ, МР-40, Тритон Х-100 ) ке обеспечивало получения иммувогезных препаратов ; нативном виде ( максимальная доза антигена ).

.5. Надежность инактивации вируса сернокислой медью подтзеруде-

ны отсустзием инфекцисннсстл 2 элективных клеточкой системе (з 3 пассаже, прямой 2-ЗА) и эиремии у лодсз;пксз посла введения 2,5- 5 кратных доз препарата.

7. Кнактивированныэ препарзты из культурального итамма DSi-Шкь в нативком, сс-рбирсЕанком на ГСА и эмульгированном виде обеспечивали 100 X зацкту вакцинированных животных от контрольного заражения вирулентным вирусом (1003-10000 ЛД 50), в то время как аналогичные препараты vis ггамма Ж обеспечивали, а .сба^й сложности, 30 % зацчту.

-3. Защитный ?ффзк? инактявироЕакккх. препаратов зависит не только о? используемого штамма'вируса и выбранной формы препарата, ко и от количества антигена з прививной дезе.

• 9. По разработанной технологии кзгогозлеяяа опытно-производственная партия инакткзирозаккой вакцина з количестве 10000 доз, пос-веренз комиссионно и испытана, с положительным эффектом, в хозяйстве. • _

прщитажиг гозташя

1. Использование з практике научных и производственных учреждений технологии выращивания вируса' КЧС разной вирулентности в первичных- (КУС) и п-резизаеыых (РК-15, ШС) клеточных культурах.

2. -Результаты технологических процессов изготовления зффектив-ной атнактивкрованной вакцины против 1Ж.

з: Нормативно-техно логическую документация (ТУ, инструкция) по изготовлений и контролю инактизирозанкой вакцины против КЧС.

СПИСОК ОПУВЖКОгАНБЫХ РАБОТ ПО Ш£?',аЛАМ~ Дй&ЕРТАЖРГ

1. Жестерев .Б, К., Балшква В. Я , Чурбакоьа Г. Е , Устароз Р. Д., Куршжов ЕЕ, . Вилняков 11 С., Зубаиров Я IL Излучение инакткзирс ванных препаратов вируса Ш2 и их кымуногенкке свойства // Вопрос ветеринаркой вирусологии,микробиологии и зпкзоотологш: Тезис докладов научной конференции БШИВБиК Покров, 199S г.-с.1С2.

2. Устаров Р. Д., Чурбакоза'Е Я , Еестерез Е И., Еальиева В. И. Размножение ■ аттенуированного и вирулентного штаммов вируса КЧС

1. Репродуйда вируса ЮЮ ? культуре, клеток // Там хе. -с. 122.

3. Устаров P. JL , .Чурбанозг В.К., Жэстерег В.IL , Бзльигева Е И. Размножение*- аттенуйрованногй и вирулентного ктаммав вируса КЧС

2.' Условия выращивания // Там т. -с. 12а-

4. Устаров Еестераз IE.31 Ждуееи® /условий хранения куль-турального вируса КЧС //Таи'т. -с. 130. . '

: 5. Истерев В. Е , .йпрнин Ж А., Чурбакова Е.И. ,БалыЕева E ll Устаров Р. Д, Возможность зкгадасс-аащиты от заболевания класс* ческой чумой свиней // Там де. -г. 104.