Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Секретируемая альфа-амилаза базидиомицетных дрожжей Filobasidium Capsuligenum. Выделение и характеристика фермента

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Секретируемая альфа-амилаза базидиомицетных дрожжей Filobasidium Capsuligenum. Выделение и характеристика фермента"

РГб од

! q ДПР ШЯЗ

AKWW1 ПАУЙ ршимикн 7НБТО1С1ДЯ

шишш' ШОХШШ

Ня 1тр.ч!'.пх" рукописи

МУСАЕВ ДШШ!ВД ШЛНШЗОВИЧ

СЕКРЕТ ИРУ ШАЯ АЛШ-АШШЗА БЛ!Щ!{Ш1ЩЕТШГ /О ЖШ FILOMSIDIUM СAKUlrlGЬМUМ. ВЦШБШП?, -ПСА И ХАРАКТЕРИСТИКА. «ЙЕШ'А

03.00,04 - бпоушня

Автореферат

диссертаций на соискание ученой отопячя

кпидпдата биологических наук

Ташкент - 1993

Работа выполнена в лаборатории регуляции биохимических процессов Института биохимии и физиологии микроорганизмов Российской АН

Научные руководители: доктор биологических тук

член-корр. РАН, профессор Кулаов И.С, ■

кандидат биологических наук • Циоманко А,Б,

Официальные сшоненты: доктор биологических наук

член-корр. РУз, профессор Ибрагимов А.11,

доктор биологических наук, профессор Давранов К Д.

Ведущая организация - Институт биохимия им. А.Н. Ьаха РАН.

Защита состоится Л*1*1/Г)Т£\ 1993 г. в ¡У часов

на заседании специализированного оопета Д 015.16,01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Института биохимия АН ЕУз (700143, г. Ташкент, проспект Ц, Горького, 56).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН РУз,

Автореферат разослан "_" _ 1993 г.

УчвкаА секретарь Специализированного совета' доктор биологических

наук БУШИ® О А.

Актуальность пройдош. Ло интенсивности «сиольэопания в различиях отрослчЧ »«¡родного хозяйства аг.шлчяя занимают первое место ipenn друггег гТор/,'9!!тог. ибо г о миогил лролэ«»адстврниих процессах . при обработке ряэлпчпих яилов ciipbjl тюзникаэт необходимость в более пли мядос глубоком рпотеплении крошима. Я последние тря десятилетия ггри ООРврШЧНСТИОВаИЙЙ МНОРйЧ ТПХЧОЛОГЙЧРОКЙХ ТТрОИРСССР ffltf-

тот! ««юльчустсл у!-'план?! мн^росрганизмоя, которие заменяют и вн-твсшшг аиалази растительного и животного происхождения. Суцест-зеишм преимуществом амилаз миктюорргимвмпр ярлв&тоя «« бол«" вн~ ооняя йн-тивкоо'гь и твоом«« оитиФячноотъ i Ирпирнввпв амилаз микроорганизмов в различите технологических Процессах позволяет сэкономить значительное количество Дорогостоящего пищевого оцрья - ооло-чп, ячменя.

Одним кз продуцента -амилаз являются дрожжи. Дрожжевые ямшшы й сравнений о байтериалыетми й грибными йзучеш в М: -шей степени» Поэтому представляет интерес выделение я язучепйе своП-. «тв дрожжевых амилаз. Помямй вшмлаайого. ймяачзн мйкроорйййзида

предстаялягт ккгерос для иаулшх иослгДойзнйЯ. Они удобны как мзр--кернне фермент rm:« язучепяи в.чу ? ряклеточаого транспорта белк.оп, л такжэ широко аспользуюгел л &ачео*вв 061.01: toB клонирования в го-мологйчшх л готорологйлнш: системах» Э свлзП с этйм вопроси выделения я изучения акгглолктичесипх ферментов, особенно из новых псточкянов, лзллютоя элжними й актуальными»

'л задачу лоелддоватш аходпяо:

I, Подбор атаммов йазидиомяцетпых Дрожжей, хранящихся в БКМ 'Шй АН СССР, ойоообинх секратиройа*ь в культуральную среду оС-амилаз? .

3, Разработка схеш получения гомогенного препарата -амилазы дрожжей jfilobdaidium dapBullgenuw.

3. Йооледоиаме фйэяяо-хйшчеонюс свойств выделенной <=С -амилазы,

■1. Исследование характера локализации фермента в дрожжевой клетке,

.-'стал ловизна.

Г, fзаработана .аффективная схема очистки <£ -амилазы, дрожжей iilobasldiuo tapauligeuun.

2, Олределевд флзш;о-х»и11чоШ1е свойства £ермацта.

■1. с помощью биОХШШЧООШПС, электронно- Ш.1?.гу И 01ШТ ОХ ИМ ичв ск их

пспхыюп определена локализация фериента.

4. аочучени предварательше данние, свидетельствующие о су-. ьи.^»оаан«ш иредиастввнняка -амилааи с большой, пому зрвпой фц.ч; форманта о молекулярной пассов 93 кДа.

Я„:и:увеская значимость. Разработанная схема очистки может йШ'Ь п>шильэаааиа для получения гомогенного препарата для научных и практических целой. Результата проведении*: исследований расширяют [шй!й онания о сп о!! ста ах амилаз. Кроме того, получении о данные с ь у иродпосилиой- для дальнейших детальш« исследований процессов оаьрации у базициомицетких дрсшшй,

апробация работ». Работа обсуждена на совместном заседании лаборатории регуляции биохимических процессов, лаборатории анаэробных процессов и временного научно-трудоаого коллектива "Цито логин и биохимия мембранних структур" РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 таааса и I статья.

Объом и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, списания материалов и методов исследования, результатов и юс оосуадошм, заключения и выводов. Работа изложена на 143 страницах Машинописного текста, содержит 9'таблиц, 30 рисунков. Библиография включает 213 ссилок Наименований работ На русском и английском нзшсах. . ;

Материалы и методу

В работе использовали штамш дрожжей ?11о1ав1й1цш сдрвиНве-пии ЫШ 1--1439, ыш Х-1513 и вки Х-2623.Дроажи поддерживали на косяках с плотной сусло-згароаой средой.Для получения инокулю-ма клетки, виращенние в течение суток на косяках при 29°С, переносили в жидкую питательную среду, содержащую (г/л): ТШВ(Б1£со) -1,7; казаминокислоты - 5 ( 81вша ){ мальтозу - 20. Перед автокла-вированием реакцию среди доводили до рН 6,5 добавлением I М НаОН. Носло 24 час. культивирования в жидкой среде инокулюм рассевалй в кол Он с 200 мл, жидкой среди того же состава из расчета I мл иио-кулгш на колбу. Основную культуру выращивали в том же режиме в течение 48 часов. По окончания культивирования клетки осаждали

шпщигГ-угирогат'яем прп S Ш tum. Ücnобожданную от клеток КУЛЪТУРПЯЫЯ'М ЯгпкОР.ТЬ (KS!) К01Ч'П)ПЧ ПрОРЭЛП уЛТ>Трт1!ЯЛЬТрЭППеЙ 40-

рез г-пм(1ряну ии-Ю( Aaicfii ) приг'.'иплтолт-яо л .п?счть раз. При необходимости ДЛИТЭШЮГО ГРГ«"!!ПЯ КОНЦ'ЗПТраТ КЖ ЛКО'Т.ИЛГЛО лнсушива-лп п полученный г; г ой прп";;р->т использовали г качестпе исходного материала для выделения -зыилчзы.

/•-тирность (Т^рпентп опродплял« с попоим* Сампера,

содержащего 3,5-дш!атрос£!лш1пловую кислоту. За единицу активности лрпшляля количество фермента, 'пцсвобожпятчго I wont глкг.озы яа I мян. тгрт? 30°С из растворимого криумчла.

Волок определяла по Лоуря я др. (1951). Электрофорез в ПААГ проводлля по Лсммлй (1970). Кроличьи пайиклоналыше антитола r гомогенному препарату амилазы получали стандартном методом (.Остер-Г'лнн Л.А., 1983). Нммуноблоттипг осуществляли с использованием пятроц0ллюлозио5 мембраны ВА-03,02 мкм (Schleicher 6s Sciiuel ) по Тоубипу Я др. (1979). .

Молекулярную массу определяли двумя кот одами: электрофорезом в присутствии долечтлсульфата нотрпя л гпльфгльтргшяоП на Суперо-зе В-12,

Для определения изозлет;три«е.с:"Т! -андлаэн пропозши

»зоэлоктрофокусиронанио п 7%-ном полп»"|<и'пияяпом геля о амфоли-аоч pH 3,5/10 на приборе GB-л í-r.prti l'fvascia по метод tri некому

РУКОВОДСТВУ фпр№.

Аминокислотный состоя фрр'юнт-'! определяли после 24- л 4Р-ча-зового гидролиза в G N HCl при ТШГ:С, ЛчянокислогшЯ анализ п_ро-'одиля на пряборе Amlnoacid auaiyz«r а'539 (Чехословакйя).

Углотодпый анализ проводили в .тппгеотчом я.валиэаторе Biotro-nik iß soco (ФРГ). В качестве отпилаpi mix углеводов яспользова-[Я мотчики фирм Merck Й Serva. .

Окраску гелей na гликопротеины проводили по методу ¡Захаряуса 1969), в модификация Кошта и др. (I9B4).

результаты и их оретлешш

I, Подбор штаммов микроорганизмов

Ibnii было кпучено 63 штамма базядяошшотных лрожадП предстоятелей родов Rhodotorula и Fllobasidiuai. У всех изученных птам-ов определяли общее количество секретируемого белка я полисаха-

pímou,

У клеток., достигших стационарной фазы роста, общее количество оопка в среде широко варьировало, достигая в максимальном случав 150 мг/л ( r. .muciiuE.eimiia шд Y-1? ). Содержание внеклеточнш: нояиаахарвдов у некоторцх штаммов достигало 600 мг/л ( к. шииИаць-uoia bKU Y-S3).

ЗлектрофорвуичвскиЦ анализ показал, что количество полипептидов в с ре до редко совпадает даже у штатов одного вида. Иг число и молекулярные массы колебались в очень широких'"пределах, Для более детального изучения экспорта балков у исаледованних штаммов били отобрани продуценты внеклеточних амилаз„ Три из шес (е. сар-s.uli£5eraim BKí.1 Y-1459, -'1515, -2625 ) хорошо рООЛЦ На Ореда С крахмало«.

Анализ культуральвшс кидкоотей этих ьташсэ показал,-что штамм ВKM Y-262J помимо амилазц, экспортировал v культуIальнуд среду еще один балок неизвестной природу. 3' штагдма SKM Y-15'iá амилаза бала единотввншш балком, вцявдявшш после окраокк геля кумасск. Шташ ВКМ Y-14Ü9 отадчалом от двух Была назвдщшх тем, что он внделял в ореад киллер-токсин, подавляющей рост указашш. двух штаммов.

Из трех проверенных наш? итдашв, окончательный выбор пал на штамм l'ilobaaiclium capsuligenuui BKÍ.'J Y-2326 ПО i'Oii прМИб, ЧТО он Обладал наивыощей ащщолит ячейкой актщзноатбщ. Уровень с£ -апп-лазы (aFc ) 5 культу ральной ороде Достигал 3 Ь'/гдл й канала стационарной фазы роста (рис. I)» В то ка время, о клетками оставалось ассоциированной около £Ю# суммарной активности. У Двух осталыш; штаммов 143Э и 15ГЗ уровецЬ амилазМой аНтпвцооти в предо достигал t,2 й 2,3 E/luí соотаетсувайно, Рост кульгуры бил нанеслае шйанокв-ним в течение 43-46 чаоов* В дальнейшем набладаяооь'Умзньншияе роста -и активности, MaKüiumtiíaff шигйвнооть проявлялась 'tía 98-44 часах роста» ■•■.•>

Поскольку выращщзанйе "культу ри Как о нераотворвмйм крахмалом, так и с мальтозой не -обличалась fio интенсшвйосгй роста и активности, нами была выбрана среда культивирований с мальтозой.

2, получение очищенного препарата

игадиа получений частично очищенного препарата а?с приведены в табл. I.

£

Таблица. I

Стадии Объем актив- ТТелок, {.Актив- Выход, Степень

очистки пробы ность мг |нг)сть, {К/мг % очистки

Культу толь-

пат срола OTTO IIЗГО 56 55 И 100 I

ДЗЛЭ-сйа-

д0ко А-50 960 II07D 254 37,6 97,9 19

Как видно иа таблицы, о помощью несложной процедура нам удалось достичь 19-кратной очистки фермента и в«ход его составлял около 90^. Такая обработка приводила к удалению значительной части балласттшх белков и полисахаридов без существенной потери фермента. При очистке Фермента m последующих стадиях вся активность сосредотачивалась я несвязанно! о анпоиообменником фракциях (рпс. 2),

По-видимому, тго объясняется высоким содяртанием полисахаридов, которые препятствовали связыванию фермента с анионообменнл-ком. Активные фракции собирали и пор торно наносили на колонку Mono q HR 5/5 .в полученном пике была сосредоточена вся активность аТв ( рис. 3),

Э. Определение молекулярной массы

Молекулярную массу фермента определяли методами гельхромато-гравии на Супорозе B-I2 и электрофореза в полиакриламидном геле.

Очищенный ферлент при электрофорезе в полиакриламидном геле мигрировал одной полосой (рис, 4).

По данным гель-фильтрашт молекулярная mcca aPc составила 33 кДо. Однако, электрофорез в денатурирующих условиях покапал do-лее високиб знччедия молекулярной массы фермента. Молоку лярв.чя вдо-са aFc , определенная указанным методом равнялась 56 кйа, что ¡от ходилось в близкой аналогии с амилазами микробного происхождения ( Vihinen к., 1989).

Подобное расхождение в определении молекулярной мае от -амилаз наблюдалось я другими авторами ( De Mot R., 1987).

А

4Í-1

К /ип g

.1

ta

ЧАС

Рио.1. Динамика роста и активности секратяруемой аРс Дрожжей i. capeuligenum ЫШ Y-2623 I. Рост. 2. Активность а?с

» « . Вш»р If иди)

Ppot 2. Профиль элюции препарата аРо на колоше Mono Q HR . 20Д0. На колонку нанесен препарат после обработки концентрата культу рольной жидкости ДЕА.Е Свфадексом А-®

лп» л.

Rouep

*m

Рис.З, Повторная хроматография препарата • aFc на колонке Mono Q HR 5/5 . Нанесены фракции о 2 по 4 из рио. 2

3

" «ф«' ■ » ■«ЛЕЙ» л

fcD

119 92

66

46

29

Рис.4. Электрофорез препаратов aic на различных отадиях очистки.

1. аРо после очистки на Mono q HR 5/5 •

2. Препарат aic после обработки Сефадексом ДЕЛЕ А-50

3. Маркерные белки

Очевидно, аналогии в структурной организаций агарозо содержащих гелей о естественным субстратом оС -амилаз - крахмалом приво-■дит к взаимодействию и неспецифической сорбции фермента на матрице, а ото, в свою очередь, вызывает значительные расхождения в вычислении молекулярной маоси,

Вероятно, метод электрофореза является оолее достоверным, В дальнейших расчетах мы использовали значение молекулярной массы вычисленную методом электрофореза,

Данные гель-фильтрации и электрофореза в присутствии ДС-на показывают, что aïe-мономерный фермент.

4. Определение углеводной части фермента

Известно, что секратируемые белки не имеют особой предрасположенности к глйноэшшрованию. Иными словами потенциально гликоэп-лированннми могут быть многие белки, но реализуется эта возможность только тогда, когда они попадают в секреторный поток (Циомен-ко А.Б,, 1990).

Поскольку aïe является евкретируемым ферментом, нас интересовало, подчиняется ли она общему правилу в отношении гликозилиро-вания. Для выявления втого вопроса, мы провели окрашивание геля по Шиффу, который позволил'заключить, что aïe является гликопротеи-ном, причем углеводная часть составляет 4% от общего веса фермента.

Проведенный наш анализ углеводной .части aïe показал, что ооновными мономерными нвеньями в углеводной части фермента по данным хроматографии являются глюкоза, галактоза и ксилоза ,* Кроме того в составе фермента также был обнаружен непдентифицированный дисаха-рид, совпадающий по хроматографичеокой подвижности о л акту лоз ой. Не был обнаружен характерный Для многих глинопротеинов Гексозоамин.

5. рН стабильность и термостабильность aïe

Результаты проверки устойчивости фермента к температурному воздействию показали* что при нагревании его раствора без субстрата происходила потеря S0% активности в течение 10 мин при температуре 35°С. aïe проявляла температурную стабильность в диапазоне *еипвратурц от 5 - 85°С»

Уо*ойчявость к воздействие рН определяли в интервале рН 3-10, #0риант бил наиболее стабилен в близком к значению оптимума его-jsôSotbiot - в интервале рН 5,5.

1!р0ДИ JL -амилаз микробного происхождения высокой термоста-бнлшостью отличаются амилази бактериального происхождения (Кнеои-тадзв i'.M., 1990). По своей термостабильности aFc несколько уступает последним ферментам. Она проявляла низкие значения термостаои-льностп в сравнении с бактериальными и грибными "¿-амилазами. По полученным характеристикам aFc. можно отнести к термолабилышм ферментам.

Обычно сС-амилазы микробного происхождения лабильны npi: кислых значениях рН, лшпь неноторю представители чарьых аспергиллов обладают способностью образовывать кислотостабильную аС -амилазу, выдерживающую без потери активности рН=2,0 1Квеситадзе Г.И.,1990).

Как показали результаты измерений активности aie , при кполых значениях рН в течение 10 минут происходила инактивация фермента.

6. Влияние pli и температуры на активность аРс

Исследования влияния рН на активность фермента проводили в

диапазоне рН от 3 до 8. Как уже отмечалось выше, фермент проявлял максимальнун активность при значении рН 5,5„

Зависимость активности aïe от температуры изучала в интервале температуры от 5 до 65°С,

При значениях рН 5,5 и при температуре 45°С фермент проявлял наивысшую активность4

По данным свойствам выпаленная была близка к изиостша». оС -амилазам»

При 25°0 фермент сохранял свою активность в течение 8 дной.

Снижение активности на 20? отмечалось к 13 дню хранений. При 4°С фермент сохранял свсю активность в теченяз 3 меояпзь,

7. Аминокислотный состав aïe

По оонврчаки» оотатноп различных ямкнекггелот aFr- отличалась от описанных микробных <£-амилаз. Обнаружено поыдоетсв по сравнение с литературными данными содержание серина. Кроме того, в аминокислотном составе фермента не были обнаружены пролпновне остатка, Существенным отличием от описанных в литература данных явилось необычно низкое содержание метионина и аргинина.

8. Влияние ионов металлов на активность aFc

Большинство 'еС-амшгаз бактериального происхождения требую г для проявления максимальной активности иош Са, в то время как „£-амилазы выделенные из других источников не требуют их присутствия. Исходя из вышеизложенного, мы поставили своей задачей изучить влияние различных ионов металлов на акФивность выделенного нами формента. В результате исследований было установлено, что ионы Мп и Со слабо активировали фермент. Некоторое снижение активности отмечалось в присутствии ионов Li . Следует отметить, что некоторые ионы такие, как Ав,Си , Fe , Zn ,Cd, обсуждаемые в литературе как ингибиторы активности некоторых о£ -амилаз микробного происхождения ( Vihinen M. , 1989), не оказывали влияния на активность aïe. Активирующего и ингибирующего действия не оказывали ион Са и ЭДТА. .

Таким образом, полученные данные позволили заключить, что не требует для проявления максимальной активности присутствия ионов металлов.

9. Продукты гидролиза крахмала при действии aFc

Амилолитические ферменты, образующиеся в культурах микроорганизмов, хотя и действуют на один и тот же субстрат - крахмал, могут в значительной мере различаться как по своим свойствам и механизму дейотвия, так и по конечным продуктам гидролиза..

Для выяснения отличия либо сходств в отношении продуктов гидролиза крахмала, мы провели инкубацию aie с растворимым крахмалом. Анализ продуктов гидролиза показал, что основными продуктами являются мальтоза и глюкоза, что характерно для большинства «>С -амилаз микробного происхождения.

Ю. Изоэлектрическая точка и константа Михаэлиса aFc

Км по отношению к растворимому крахмалу у aFc была равна 2 мг/мл. Изоэлектрическая точка aFc равнялась 4,8.

II. Биохимическое определение локализации aFc

С целью изучения локализации нами были получены кроличьи антитела против aFc . Проверка полученных антител показала, что они реагируют с единственной белковой полосой при электрофорети-

1 2 з 4 1 а 3 4 ь

¿(4

«Ей!;*

Рис, 5. Иммуноблотипг а). Препаратов культуральной жидкости I. ВКМ Y~"Ui59i 2. DKM Y-Wi 3. ВКМ Y-2623; 4. afc

Л) Субклеточных фракций У. capauligoium

I. Культу ральнал с рода; Клеточная оболочка и плазма лемма; 3. Митохондрии; 4. Цитозоль; 5, Микроиоглы.

3 2 3

t

• Рис. 6-, Иммуноблотинг продуктов трансляции

I. Лиэат ретикулонитов без U-PHK, 2. Лиза« ра-тикулоцитов с добавленной и-РНК. 3. Препарат айа

ческом анализе культуральной жидкости штаммов F. capsuligenum В KM 't-гьгз, В КМ 1-1513 , которая соответствовала очищенной aFc. Шташ ВКМ í-1439 не содержал иммунореактивного материала в культу ралыюй жидкости (рис, 5а).

Так как приблизительно одна треть от всего синтезированного Вермонта остается связанной с клеткой, било интересно изучать локализацию этой фракции aFc . Как следует из рис, 5 б, зрелая форда aFc сосредоточена в растворимой фракции клеток, которая представляет собой сумму цптозольннх и периплазматических компонентов. По овоим иммунологическим и электрофоретическим свойствам эта форма идентична внеклеточной секротяруемой aFc.

Интересным явилось то, что мы не обнаружили различий между внутриклеточной и внеклеточными формами aí'q. Если принять, что секреция aFc осуществляется но известно^ механизму, установленному для-дрожжей .( Schekman н. , 1982), то вполне ожидаемым было'наличие зрелой формы фермента в мембранных фракциях (микросомах). Однако, этого ш не обнаружили. Вместе с тем в этой фракции наблюдались иммунореактирнне полосы с большей чем у aFc молекулярной массой, которые могли бить предшественниками фермента, процессирован-ные в различной сгепони.

- 12. Синтез aFc в in vitrocncTeMe

С целью определения предполагаемого предшественника aFc мы провели опыты, используя бесклеточную систему синтеза белка в ли-затах ретикулоцитов кролика. Как видно из рис. С, продукты трансляции иРНК разделились на несколько полос с молекулярными массами около 63, 71, 79, 83, 93 кДа. Из всех присутствующих в смеси полипептидов наибольшую иммунореактивность проявлял полипептиц с молекулярным массой 93 кДа, что приблизительно соответствовало молеку-' лярпой маосе предшественника, полученного при выделении микросома-льннх фракций.

13. Ипмуноцитохимичоскоо определение локализации

aFc

Мэтодом ультраструктурной иммуноцитохимии была выявлена следующая закономерность распределения aFc п клетках. В основном, 'независимо от фазы роста, .иммунная i-.ютка выявлялась на периферии

к летел; в зоне нигоплазгдазчг-юской'шибраш'. Контрастирование uguS' гашшк структур у5«кпя-ацетатои и идтратои опшш» позволили om>r делить, что локализована преимущественно меклу питоплазиатичес-üoii ламбрансп i: nüVTpjHHBii стороной кл^то-шой l-t-j:-;;:.;. то есаъ ь нерапАнаматичйОком проограшяаь.

'' чполнптоаьчя ии.гпр'.э'.ь'л о дпкйлюзлл.. ■.-. ¿л ru^^'sj.^ при iijj'MöHüi; у л г ''j.cn'pv н тури й^й^ил^.^-нкл.у i ' — л;^, '¡¡.л; готол.л! наблюдалась аналогичная картина.

что нам не удалось уловить движение el» сквозь галщу клеточной стенки. Действительно, до о их пор остается загалке:« способ прахок-дашш релков, экспортируемых из клетки в культурал&кую ицднооть, через клеточную стенку. Несмотря на то, что большая часть синтезированной iäi'o сосредоточена вне клетки, момент прохождения ее сквозь стенку зафиксировать не удает-оя. Даже в том случае, когда фермент полностью исчезает из клеточной оболочки, выходе при этом

I. Показано, ; v ло-'лл . : -....-^-f. i "озоа^дотхллл ..'j —..¡.¿'-.a*. -.-¿r-nii. .

в культуральной средо достигал 3 h/u.nt

Ç irf» ПО а р»я aurgnpaia tS'r ¡13 {Г<ГЛЬ?1>—

рапл^пЛ ;.л'л...г', г.азг-очш«*-. • " i—¡-. /-. - г

3» ЭлектроЗ'Сретичеоки .гомогенный препарат ооыошаг мп-дующими свойствами:

•1} Молекулярная масез - 55 цЦа 2; н^еьлектричесяая точ;;г. - -1," S) Оптимум рН - 5,5 4 5 ТошератУрнн« оптг«.?.'м - 45"0

5) pîi стабильность - 5,5

6) Температурная стабильность -

7) Км - 2 мг/мл

4. Установлена гликопротеиновая природа aïe . Фермент содержит 4% углеводов от общей массы, в вида глюкозы, ксилозы и галак-

t'I:7";,

5. Иммунонитояимичяоким методом определена внутриклеточная локализация фермонта. Зрелая фк.рма фермента проямущеотденно локализована в нертлазматичоском пространстве клетки. Микрооомы не со-пвр*ят зрелой <Тормы, но в них присутствуют галлунореактгоные поли-■тентшш с большей молекулярной массой.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Секреторная способность базидпешцетных дрожжей. Ферменты п другие белки, экспортируемые в культуральную среду /А ,Б. Циомен-г<>, И,tfycaen, С.В. Кононова п др. // Биосинтез ферментов микроорганизмами: Тез. докл. Бсосоюзн. конф. - Ташкент, 1ЭВ8. - С. 164161.

2. Исследование экспорта'белков у дрожжей / В.В. Лупашин, ГЛ. Туймотова, Д.Ш. Муса ев и др..// Рефляция микробного метаболизма: Тоз, докл. Всесслозн. конф. - Пущино, 1989. - С. 69.

3. Alpha-amylase cf bacldiomycetic yeast Filobasidium capsu-Jii5?rium. Isolation, properties and localization / D.Sh. IJusaev, V.V. I'aytryev, K.A. Lusta and utb. // 15th international specialized symposium on yeastj Th. dokl.^- Riga, 1991.; - P. 96.

4. Сякретируемая альфа-амилаза Оазидиомицетных дрожжей Filobasidium capsuiigenum. Выделение, очистка и характеристика фермента / А.Б. Циоменко. Д.Ш. tvfcaeB, В.В. Лупашин, И.С.-Кулаев // Биохимия. - 1992. - Т. 57, Выл; 3. - С. 444-451.

„ ' .. ■"■ -

Подписано в печать_

Формат бумаги С0Х841/,,,. Бумага типографская № 1. Печать «РОТАПРИНТ». Объем с-Тираж /«>Э] Зака.1 З'ЧЗ

Типм'рэфия издательства «Фан» АН УзССР. 7001711. Ташкент, пр. М. Горького, 79.