Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Са 2+ и фрагментация хроматина в ядрах лимфоцитов тимуса и селезёнки крыс при радиационном апоптозе.

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Са 2+ и фрагментация хроматина в ядрах лимфоцитов тимуса и селезёнки крыс при радиационном апоптозе."

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

і ^ '

2 Г, І' '■■■- ( ; Борисов Сергій Ілліч

УДК 577.24/352.4

Са2+ ТА ФРАГМЕНТАЦІЯ ХРОМАТИНУ > ЯДРАХ ЛІМФОЦИТІВ ТИМУСУ ТА СЕЛЕЗІНКИ ЩУРІВ ЗА РАДІАЦІЙНОГО АПОПТОЗУ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультет}' Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет імені Тарасг Шевченка,

професор кафедри біохімії біологічного факультету

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Капралов Олександр Олександрович,

НДІ фізіології імені академіка Петра Богачг Київського національного університету' імені Тарасг Шевченка,

старший науковий співробітник відділу загально фізіології

кандидат біологічних наук Лавренчук Галина Йосипівна,

Інститут експериментальної патології, онкології радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України, старший науковий співробітник відділу радіобіології

Провідна установа: Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України м. Київ

Захист відбудеться “{& 2000 р. о годині на засіданн

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у Київському національном\ університеті імені Тараса Шевченка за адресою: вул. академіка Глушкова

2, біологічний факультет, ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національногс університету імені Тараса Шевченка ••

Автореферат розісланий “/6 “ листопада 2000 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Брайон О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Останнім часом значний науковий інтерес привертає дослідження біохімічних особливостей апоптичної загибелі лімфоїдних клітин. Це пов’язано з тим, що апоптоз є основним механізмом загибелі лімфоцитів за їх розвитку, диференціювання та патологій імунної системи. За цим механізмом здійснюється знищення аутореактивних Т-юіітин у тимусі, селекція зрілих лімфоцитів у відповідь на активацію рецепторних комплексів Т-клітин та мембранних імуноглобулінїв В-клітин у периферійних органах імунної системи (Cohen J.J., 1991).

Однією з досліджених моделей апоптозу лімфоцитів in vitro с їх загибель, яка відбувається у ранній термін після дії іонізуючої радіації у діапазоні доз 0,5 - 5 Гр (Meyn R.E., el аі, 1993; Zhivotovsky В., et al, 1993). Малодослідженим залишається апоптоз лімфоцитів у різних імунних органах та за умови опромінення цілого організму. Однак, вважається, що такі ефекти, як лімфопенія та імунодепресія розвиваються внаслідок порушення взаємодії між різними субпопуляціями лімфоцитів через апоптичну загибель більш радіочутливих лімфоїдних клітин (Meyn R.E., el аі, 1993; Ярилин A.A., 1996). ' '

Встановлено, що апоптоз супроводжується значною структурною перебудовою таких ядерних компонентів, як хроматин, ядерна мембрана, ядерний матрикс та розщепленням ДШС і ядерних білків внаслідок активації нуклеаз і протеїназ (Jones D.P., et al, 1989; Ríbeiro J.M., et al, 1993; Chandra J., et al., 1997; Juin P., et al, 1998; Saido T.C., et al, 1994). Хоча однією з кінцевих подій апоптичної деструкції лімфоїдних клітин є фрагментація хроматину, початкові механізми апоптозу можуть бути неоднаковими у лімфоцитах, що належать до різних субпопуляцій та перебувають на різних етапах диференціювання. Так, припускається, що основний механізм ініціації радіаційного апоптозу лімфоцитів тимусу полягає у індукції білка р53, який контролює експресію генів, залучених до системи регуляції апоптозу (Lowe

S., et al.; 1993), а більш диференційованих лімфоцитів селезінки - у активації певних сигнальний механізмів, функціонально пов’язаних з поверхневими рецепторами (Hotchkiss R.S., et al., 2000).

Однією з умов апоптозу лімфоцитів може бути підвищення концентрації Са2+ у цитозолі та нору'шення внутрішньоклітинного Са2т-гомеостазу (Nicotera Р et al., 1994; McConkey D.J. and Orrenius S., 1997). Згідно сучасних уявлень, важливим компонентом внутрішньоклітинної системи Са2т-обміну є ядро (Malviya A.N., 1997; Gerasimenko О.V., et al., 1996). Вважається, що підвищення внутрішньоядерної концентрації Са‘* за апоптозу може призводити до активації ядерної Са^-залежної ендонуклеази

(Соколова I.A. та ін., 1988; Nicotera P., 1993), порушення структури хроматину та підвищення його чутливості до дії нуклеаз внаслідок зміни йонного мікрооточення хроматину (Kas E., et al., 1993). а також активації Са2’-залежних ядерних протеїназ та розщеплення білків ядерного матриксу (Chandra J., et ai., 1997; Juin P., et al., 1998; Saido T.C., et al, 1994; Traub P., et al., 1988). Крім того, внутрішньоядерний Са2т-сигнал може активувати експресію специфічних генів, які регулюють клітинний цикл та ініціацію апоптозу (Bartlett J.D., et al., 1992; Boemefoy-Berard N., et al., 1994).

Проте, питання щодо внутрішньоядерної концентрації Са2", механізмів її підвищення та транспортування Са2+ у ядро як у нормі, так і за апоптозу лімфоїдних клітин, залишаються нез’ясованими. З одного боку, припускається, що підвищення концентрації Са2+ у ядрі може відбуватись шляхом його пасивного транспорту через периферійні канали ядерної пори (Digwall С. and Laskey R., 1992; Allbritton N.L., et al., 1994). З іншого боку, показано існування ядерно-цитозольного Са2+-градісшу (Nicotera P. and Rossi A.D., 1994; Waybill M.M., et al, 1991; Williamce D.A., et al., 1987) та здатність ядерної оболонки до автономної генерації Са2+-сигналу (Malviva A.N., 1997; Gerasimenko О.V., et al., 1996).

У зв’язку з цим, особливої актуальності набуває питання щодо зміни цитозольної га внутрішньоядерної концентрації Са +, його впливу на процес розщеплення хроматину та механізмів транспорту цього катіону у ядро за апоптозу лімфоцитів тимусу та селезінки після тотального рентгенівського опромінення тварин.

Зв’язок з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана у рамках теми № 97083 “Біохімічні механізми розвитку променевого ураження після дії іонізуючої радіації” комплексної наукової програми “Здоров’я людини", а також тем 5.3 / 34 та 5.4 / 483 Міністерства України у справах науки та технології.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було охарактеризувати фрагментацію хроматину та транспорт Са2+ у ядро, оцінити цитозольну та внутрішньоядерну концентрацію Са2+ за радіаційного апоптозу лімфоцитів тимусу та селезінки.

Об'єкт дослідження - механізм радіаційного апоптозу лімфоцитів тимусу і селезінки.

Предмет дослідження - фрагментація хроматину, цитозольна і внутрішньоядерна концентрація Са + та транспорт Са2+ у ядро.

Відповідно до цього, були поставлені такі задачі:

з

- визначити особливості морфологічних ознак клітин у популяціях лімфоцитів тимусу та селезінки на ранньому етапі після рентгенівського опромінення тварин у дозі 1 Гр;

- дослідити та порівняти концентрацію вільного цитозольного і внутрішньоядерного Са2т, рівень внутрішньоклітинного інозитолтрифосфату та стан хроматину у лімфоцитах тимусу та селезінки контрольних та опромінених тварин; '

- оцінити вплив Сан на процес деградації хроматину лімфоцитів тимусу та селезінки за радіаційного апоптозу;

- дослідити пасивний транспорт та активність системи АТФ-залежного транспорту' Са2+ у ядрах лімфоцитів тимусу та селезінки у нормі та після опромінення тварин.

Методи дослідження - електронна мікроскопія, оцінка фрагментації ДІЖ а допомогою дифеніламінового реактиву, електрофорез ДІЖ у агарозному елі, визначення концентрації Са2+ за допомогою Са^-флюоресцентиих ондів квін-2 та індо-1, дослідження транспорту Са2~ за використанням іадіоактивної мітки 4~Са2+, визначення Са2"-АТФ-азної активності шляхом пектрофотометричного визначенім вмісту неорганічного фосфату, оцінка творення інозитол-1,4,5-грифосфату за використанням радіоактивної мітки Н-2-міо-інозитолу та хроматографічного розділення фракції -юзитолфосфатів.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті проведених .осліджень показано, що динаміка зниження кількості клітин та розвитку ■іохімічних ознак апогозу у популяціях лімфоцитів тимусу та селезінки після отального рентгенівського опромінення щурів у дозі 1 Гр є різною.

Вперше показано, що у ядрах лімфоцитів існує високочутлива до онів кальція система АТФ-залежного транспорту Са*’’, що активується за ого субмікромолярних концентрацій.

Вперше встановлено, що за радіаційного апоптозу лімфоцитів слезінки підвищується внутрішньоядерна концентрація Са"+ Показано, що аке підвищення є результатом зростання Са2+-АТФ-азної активності ядер, осилення АТФ-залежного накопичення Са2+ та пасивного входу цього атіону у ядро. Виявлено, шо рівень внутрішньоядерного Са2+, активність истеми АТФ-залежного накопичення та інтенсивність пасивного входу Са2+ ядра лімфоцитів тимусу за радіаційного апоптозу не змінюються.

Вперше показано, що вихід Са2* з ядер лімфоцитів селезінки, яділених після дії радіації та навантажених кальцієм, пригнічується, а івень Са2+, зв’язаного з внутрішньоядерними структурами зростає. Вихід а2+ з ядер лімфоцитів гимусу опромінених тварин не змінюється порівняно з знтролем.

Теоретичне та практичне значення роботи. Результати досліджень свідчать про різні механізми радіаційного апоптозу у лімфоцитах центральних та периферійних органів імунної системи. Ініціація та розвиток апоптозу лімфоцитів селезінки після дії радіації відбувається за Са2"-залежним механізмом, а лімфоцитів тимусу - за Са^-незалежним механізмом, ймовірно, шляхом індукції гену р53 внаслідок радіаційного ушкодження структури ДНК.

Отримані дані розширюють уявлення щодо механізмів регуляції внутрішньоядерної концентрації Са2+ у лімфоцитах. Показано, шо підвищення внутрішньоядерної концентрації Са2+ може відбуватись не лише шляхом пасивного входу йонів кальцію, а й у результаті АТФ-залежного транспорту.

Дані щодо впливу Са2+ на процес деградації хроматину, а також механізму підвищення внутрішньоядерної концентрації Са2" у лімфоцитах селезінки після дії іонізуючої радіації, можуть бути використані при розробці заходів контролю апоптозу лімфоїдних клітин викликаного радіаційним ураженням чи дією інших апоптогеннкх факторів.

Особистий внесок автора. Текст дисертації, формулювання основних положень та оформлення роботи виконано безпосередньо автором. Дисертантом особисто здійснені підбір та обробка літературних даних, статистична обробка результатів, а також оформлення рисунків і таблиць. Всі результати отримані дисертантом особисто або за його безпосередньої участі. Результати розділу 3.7. отримані за участі м.н.с. кафедри біофізики Семенова Ю.В. Електронно-мікроскопічний аналіз препаратів лімфоцитів тимусу та селезінки здійснено у співробітництві з с.н.с. Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Чернишовим В.І.

Апробація роботи. Основні результати дисертації були представлені на І Міжнародній практичній конференції “Sustainable Development: Environmental Pollution and Ecological Safety” (Дніпропетровськ, 1995), VU Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), II з’їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), Міжнародному екологічному конгресі “Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности” (Санкт-Петербург, 2000).

Публікації. Результата робота представлені у 3 статтях і 4 тезах, які опубліковані у профільних вітчизняних журналах та збірниках матеріалів з’їздів та конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну робот}' виконано на 143 сторінках друкованого тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури, характеристики методів, результатів дослідження та їх

обговорення, заключения, висновків, списку використаних джерел з 212 найменувань, 31 рисунка, 7 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Методи дослідження

Досліди проводили на щурах обох статей масою 120 - 150 г, яких утримували на стандартному раціоні віварія. Тварин піддавали тотальному одноразовому опроміненню на рентгенівській установці РУМ-17 за експозиційної дози 2,58x10'2 Кл/кг (поглинута доза - 1 Гр). Умови опромінення: потужність дози - 0,24 Гр/хв, фільтри 0,5 мм (Си + А1), напруга 200 кВ, сила струму 5 мА, фокусна відстань - 50 см.

Лімфоцити селезінки отримували методом градієнтного центрифугування суспензії клітин у розчині Ficoll-Paque або фікол-верографіїгу (р = ] ,077) (Boyum А., 1968). Тимоцігги отримували шляхом дво-етапного центрифугування клітинної суспензії тимусу (500 g, 10 хв). Препарат ядер лімфоцитів отримували методом дифереіщійного центрифугування клітинного гомогенату у градієнті 1,3 М сахарози в присутності інгібітора протеїназ фенілметилсульфанілфториду.

Концентрацію вільного цитозольного кальцію у клітинах визначали із застосуванням флюоресцентного зонду квін-2 (Tsien R., et al., 1982) на спектрофлюориметрі Shimadzu RF-510 (Японія), X збудження - 339 нм, А емісії - 490 нм. Концентрацію Са2+ у ядрах визначали за допомогою флюоресцентного зонду івдо-1 (СеменовЮ.В. та ін., 1999).

Оцінку фрагментації ДНК проводили після лізису клітин розчином 5 мМ трис-НСІ (pH 8,0), 2 мМ ЕДТА та 0,5 % тритону Х-100. Проби центрифугували (15000 g, 20 хв) для розділення інтактного хроматину (осад) від відщеплених фрагментів ДНК (супернатант). Вміст ДІЖ у зразках визначали із застосуванням дифеніламінового реактиву (Burton К., 1956).

ДНК екстрагували сумішшю хлороформ : ізоаміловий спирт (24 : 1) після депротеїнізації проб (Skalka М., et al., 1976). Електрофорез ДНК проводили у 1 % агарозному гелі за напруги поля 2 мВ/с протягом 15 год (20° С). Як маркерні використовували фрагмента ДНК фага к, утворені рестриктазою Pstl. Гелі фарбували розчином броміду етидія (1 мкг/мл) і після збудження флюоресценції ультрофіолетом фотографували на плівку Мікрат-300. Негативи денситометрували на мікроденситометрі MD-100 (Німеччина).

Вхід Са2+ у лімфоцити визначали за інкубації суспензії клітин у буфері, що містив 1 мкКі 45Са2~. Реакцію зупиняли швидкою фільтрацією проб через фільтри Синпор № 6.

Оцінку утворення інозитолтрифосфату проводили з використанням клітин, яга прєінкубували протягом 1 год у середовищі 199, що містило 5 мкКі/мл іН-2-міо-інозитолу. У середовище інкубації мічених клітин додавали

0,1 % бичачий сироватковий альбумін та 10 мМ LiCi для пригніченім активності фосфомоноестераз. Реакцію зупиняли додаванням суміші хлороформ : метанол (1:2). Для отримання фракції інозитол-1,4,5-трифосфату водну фазу наносили на колонки Partisil 10 SAX та елюювали 2 мл 0,8 М КН2Р04(рН 3,35) (Sugiya Н. Et а!., 1987).

Визначення пасивного входу Са2+ у ядра проводили, інкубуючи суспензію ядер (100 мкг ДНК на 500 мл проби) при 35°С у середовиші, яке містило 25 мМ HEPES, pH 7.2, 4 мМ К2НР04, 4 мМ MgCl2, 25 мМ КС1, за додаванням 0,5 мкКі 4'Са2+. Концентрацію Са2т у діапазоні 0,08 мкМ - 0,2 мМ створювали за допомогою Са2" - ЕГТА буферу. Реакцію зупиняли швидкою фільтрацією проб через фільтри Синпор № 6. АТФ-залежне накопичення Са2_г у ядрах досліджували за тих же умов, додаючи у середовище інкубації 2 мМ АТФ. АТФ-залежне накопичення визначали як різницю між загальним накопиченням Са2+ у присутності та відсутності АТФ. Для визначення адсорбції кальцію суспензію ядер відмивали на фільтрі відразу після початку інкубації. Радіоактивність проб вимірювали на рідинносцинтиляційвому лічильнику Delta (СІЛА).

Загальну М^‘,Са2+-АТФ-азну активність ядер визначали за інкубації ядер (100 мкг білка на пробу) у середовиші, яке містило 25 мМ HEPES, pH 7.2, 4 мМ MgCl2, 100 мМ КС1, 2 мМ АТФ та Са2+ у діапазоні 0,08 мкМ - 0,2 мМ. Вміст неорганічного фосфату визначали за методом Чена. М§2"-АТФ-азну активність визначали за присутності у середовищі 1 мМ ЕГТА. Са2’"-АТФ-азну активність розраховували як різницю між загальною Mg2+,Ca2"-АТФ-азною та Mg2+-AT®-a3H0i0 активностями.

Вихід Са2+ досліджували на ядрах, які попередньо навантажували Са1+ шляхом інкубації (35° С) протягом 40 хв у середовиші, що містило 0,25 М сахарозу, 10 мМ HEPES, pH 7.2, 3 мМ MgCh, 25 мМ КС1, 2 мМ СаС12та 0,25 мкКі 4;,Са"т. Для ініціації пасивного виходу кальцію проводили 15-кратне розведеная проб (Тутай В.А., 1991). Реакцію зупиняли швидкою фільтрацією проб через фільтри Синпор № 6. Неспецифічне зв’язування визначали за інкубації ядер у присутності 0,1 % тритону Х-100. Радіоактивність проб вимірювали на рідинносцинтиляційному лічильнику Delta (СІЛА).

Статистичну обробку даних проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Плохинский М,, 1981). Розрахунки та побудову графіків виконували на IBM РС-486 з використанням прикладних програм.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Морфологічна та біохімічна характеристика стану лімфоцитів тимусу та селезінки після дії радіації. За результатами морфологічного аналіз}' досліджувані препарати лімфоїдних клітин тимусу та селезінки були представлені малими та середніми лімфоцитами, які характеризуються значною чутливістю до дії радіації (Бударков В.А., та ін„ 1990; Gerber M., et al, 1983) '

Після опромінення тварин спостерігалось зниження кількості клітин у досліджуваних популяціях, яке через 24 год після дії радіації у популяції тимоцитів становило 32,6 %, а у популяції лімфоцитів селезінки - 51,5 % від контрольного рівня. Через 6 діб кількість лімфоцитів у популяціях лімфоцитів тимусу та селезінки частково відновлювалась.

Вважається, що інтерфазна загибель лімфоїдних клітин, яка спостерігається протягом першої доби після дії іонізуючої радіації, відбувається за механізмом апоитозу (Meyn R.E., et al, 1993; Zhivotovsky В., et al, 1993). Для з’ясування природи загибелі клітин в умовах досліджуваної експериментальної моделі ми проводили морфологічний аналіз препарату лімфоцитів тимусу та селезінки опромінених тварин. Встановлено, що через З год після опромінення тварин серед лімфоцитів тимусу з’являються клітини з нерівномірним розміщенням хроматину в середині ядра та інвагінаціями ядерної оболонки. У препараті лімфоцитів селезінки були виявлені клітини з більш значними морфологічними змінами - конденсацією тетерохроматину біля одного з полюсів ядерної мембрани, пікнотизацією ядер, зменшенням клітинного об’єму. Такі морфологічні зміни відповідають ознакам ранньої стадії апоптозу.

Відомо, що за апоптозу клітин різного типу має місце конвергенція сигнальних біохімічних шляхів до обмеженого числа спільних механізмів, одним з яких є фрагментація хроматину (Cohen G.M., et al, 1994; Nicotera P., et al, 1994). Для визначення ступеню деградації ДНК у лімфоцитах тимусу та селезінки досліджували утворення полідезоксирибонуклеотидів (ПДН) -фрагментів ДІЖ, які екстрагуються у розчин з низькою йонною силою. Як видно з рис. 1, у тимоцитах через 3 год після дії радіації вміст ПДН не змінювався порівняно з контролем, а через 6 год зростав вдвічі і становив 12 % від загального вмісту ДНК у клітинах. У лімфоцитах селезінки опромінених тварин спостерігалось більш значне і раннє підвищення вмісту ПДН - до 18 % через 3 год та до 24 % через 6 год після дії радіації. Отже, загибель лімфоцитів тимусу та селезінки після дії радіації супроводжувалась інтенсифікацією ендонуклеолізу хроматину.

Згідно даних електрофоретичного розділення у агарозному гелі

фрагментів ДНК, у лімфоцитах тимусу та селезінки пісдя дії радіації, утворювались фрагменти довжиною 200, 400, 600 та 800 пар основ, тобто рівні чи кратні довжині нуклеосомної ДНК - 200 пар основ (рис. 2). Отже, у лімфоцитах тимусу та селезінки опромінених тварин відбувалась впорядкована міжнуклеосомна деградація хроматину, яка є основним біохімічним показником апоптозу.

К50 ХЮ

п.о

SM

Рис. 2.

*£0 З»

Рис. 1. Вміст ПДН у лімфоцитах тимусу (А) та селезінки (Б) у контролі (1), через 3 (2) та 6 (3) год після опроміненая тварин.

Рис. 2. Денситограми електрофореграм фрагментів ДНК лімфоцитів тимусу (А) та селезінки (Б) у контролі (1) та через 6 год після опромінення тварин (2).

Вважається, що ініціація апоптозу лімфоїдних клітин внаслідок дії радіації може відбуватись шляхом активації чи порушення функціонування певних внутрішньоклітинних сигнальних механізмів (Cohen-Jonathan et al., 1999). Одним з таких сигнальних механізмів може бути підвищення у клітині концентрації Са2+ - вторинного месенджера, що регулює активність гідролітичних ферментів, структурний стан хроматин)' та експресію генів апоптозу (Nicotera P.. et al., 1994; McConkey D.J. and Orrenius S., 1997).

Як показали експерименти з використанням кальцієвого зонду квін-2, у ранній післяпроменевий період концентрація цитозольного Са2+ у лімфоцитах досліджуваних популяцій підвищувалась, але характер цього підвищення у лімфоцитах тимусу та селезінки був різний. Так, у лімфоцитах тимусу концентрація цитозольного Са2т підвищувалась через 3 год після дії радіації, після чого поверталась до контрольного рівня. У лімфоцитах селезінки концентрація цитозольного Са2+ підвищувалась через 3 год після опромінення тварин, досягала максимального рівня через 6 год та

залишалась підвищеною через 12 год (табл.1).

Для дослідження сигнальних механізмів радіаційного апоптозу лімфоцитів був обраний термін 3 год після опромінення тварин, який передус міжнуклеосомній деградації хроматину у клітинах досліджуваних популяцій, але вже характеризується проявом ранніх морфологічних ознак апоптозу та підвищенням іштозольної концентрації Са2т.

Таблиця 1

Концентрація вільного цитозольного Са1+ (нМ) у лімфоцитах тимусу та

селезінки після опромінення тварин (п = 6 - 8 )

Контроль Час після опромінення тварин, год

3 6 12 24

Іімфоцити имусу 93 ±7 132 і 15 * 110 ± 12 98 ±6 96 ± 12

Іімфоиити елезінки 117 ± 10 167 ±21 41 245 ± 32 * 195 ±25 * 145 ±21

*р < 0,05 порівняно з контролем

Причинно-наслідкові зв'язки між підвищенням шітозольної концентрації Са2+ та біохімічними змінами у внутрішньоклітинному просторі протягом усіх етапів апоптозу залишаються нез’ясованими. Тому, наступним етапом нашого дослідження було оцінити вплив йонів кальцію на процес деградації хроматину за радіаційного апоптозу лімфоцитів тимусу та селезінки. Для цього клітини, виділені через 3 год після опромінення тварин, інкубували у середовищі, яке містило 2 мМ СаСЬ, тобто за умов створення направленого в середину клітини градієнта Са2+, або у номінально безкальцієвому середовшці (за присутності 0,1 мМ ЕГТА), що призводить до поступового зниження цитозольної концентрації Са2^. Інкубація гимоцитів як у середовищі з 2 мМ СаСЬ, так і у номінально безкальцієвому середовищі супроводжувалась незначним накопиченням ПДН, рівень яких через 60 хв інкубації відповідно становив 8,2 ± 0,7 % та 10,8 ± 1,2 % від загальної кількості ДНК у клітинах. За інкубації лімфоцитів селезінки у середовищі 2 мМ СаСЬ спостерігалось більш значне накопичення ПДН - до 32 ± 2,1 % через 60 хв інкубації. На відміну від тимоцитів, у номінально безкальцієвому середовищі процес накопичення ПДН у лімфоцитах селезінки пригнічувався

- рівень ПДН через 60 хв інкубації знижувався у 2 рази порівняно з ним показником за інкубації клітин у середовищі, яке містило 2 мМ СаСЬ. Таким чином, хоча концентрація цитозольного Са2~ через 3 год після опромінення тварин підвищена у клітинах обох типів, можна припустити, що підвищення внутрішньоклітинного рівня Са2+ не є обов’язковою умовою посилення ендогенного гідролізу ДНК у лімфоцитах тимусу опромінених тварин.

Отримані дані свідчать, що Са2+ може бути одним з індукторів та/або модуляторів процесу деградації хроматину за радіаційного аполтозу лімфоцитів селезінки.

Одним з основних механізмів підвищення цйтозольної концентрації Са"” у лімфоцитах є мобілізація цього катіону з внутрішньоклітинних Са2"-депо, які активуються інозитол~1,4,5-грифосфатом (ІФз). Оцінку загального внутрішньоклітинного рівня ІФз проводили через 1, 3 та 6 год після опромінення тварин, використовуючи клітини, попередньо мічені за інозитолом, включеним у фосфоінозитиди. Згідно отриманих даних, у тимоцитах через 3 год після дії радіації спостерігалось підвищення внутрішньоклітинного рівня ІФз у 1,5 рази. У лімфоцитах селезінки підвищення внутрішньоклітинного рівня ІФ? було виявлено вже через 1 год після дії радіації, через 3 год рівень ІФ3 перевищував контрольний у 2,2 рази. Через 6 год рівень внутрішньоклітинного ІФз як у лімфоцитах тимусу, так і лімфоцитах селезінки нормалізувався.

Виявлене підвищення загальноклітинного вмісту ІФ3 у лімфоцитах вказує на те, що на ранніх етапах радіаційного апоптозу може відбуватись мобілізація Са2+ з таких ІФ3-залежних кальцієвих депо, як ендоплазматичний ретикулюм та ядерна оболонка. Для з’ясування особливостей порушення внутрішньоклітинного Са2+-гомеостазу за радіаційного апоптозу лімфоцитів ми визначали концентрацію цього катіону у ядрах через 3 год після дії радіації - у період, коли спостерігалось підвищення концентрації цитозольного Са2+ та внутрішньоклітинного ІФз. Згідно отриманих результатів, внутрішньоядерна концентрація Са2+ у лімфоцитах тимусу становила 265 ± 6,7 нМ і після опромінення не змінювалась.

Внутрішньоядерна концентрація Са2+ у лімфоцитах селезінки контрольних тварин дорівнювала 249 ± 6,9 нМ і через 3 год після опромінення зростала до 638 ± 12,3 нМ. Дані свідчать, що за радіаційного апоптозу лімфоцитів селезінки підвищення внутрішньоядерної концентрації Са2+ передує інтенсифікації процесу деградації ДНК цих клітин. Можна припустити, що підвищення концентрації Са2~ у ядрах лімфоцитів селезінки є наслідком порушення Са2'-тракспортної чи Са2т-бар’єрної функції ядерної оболонки.

Дослідження механізмів транспорту Са2+ у ядра лімфоцитів тимусу та селезінки контрольних тварин. Для з’ясування питання про існування системи АТФ-залежного транспорту Са2+ у ядрах лімфоцитів тимусу та селезінки досліджували вплив АТФ на рівень внутрішньоядерного Са2’“' за умов інкубації ядер, навантажених індо-1, у середовищі, яке містило 1 мкМ Са2т. Додавання АТФ у середовище інкубації викликало швидке посилення Са2+-залежного флюоресцентного сигналу, що свідчило про АТФ-залежну акумуляцію йонів кальцію у ядрі (рис. 3).

п

Подальше дослідження процесів транспорту Са2+ у ядрах лімфоцитів тимусу та селезінки проводили з використанням радіоактивної мітки 45Са2" Як видно з рис. 4, додавання АТФ (2 мМ) у середовище інкубації, яке містило 1 мкМ Са2", призводило до значного підвищення рівня Са2+ у ядрах лімфоцитів тимусу та селезінки порівняно з рівнем пасивного входу цього

катіону. Стаціонарний рівень АТФ-залежного накопичення встановлювався вже -через 1 хвилину після початку інкубації.

Са

АТФ

Рис.

60 с Рис. 3. 3. Вплив

час. хв

Рис. 4.

АТФ (2

Са" -залежного

мМ) на інтенсивність флюоресцентного сигналу індо-1 у ядрах лімфоцитів селезінки.

Рис. 4. Накопичення Са2+ у ядрах лімфоцитів тимусу (2,3) та селезінки (1,4) за інкубації у середовищі без (1,2) та з додаванням АТФ (3,4).

Згідно даних, представленими на рис. 5, АТФ-залежне накопичення Са"+ у ядрах лімфоцитів залежало від концентрації Са2+ у середовищі інкубації. При підвищенні концентрації Са2+ від 0,08 до 2 мкМ рівень накопиченого Са2+ підвищувався і досягав максимального значення. При подальшому підвищенні концентрації йонів кальцію рівень акумульованого Са2+ знижувався. Оптимальний рівень АТФ-залежного накопичення Са2^ у ядрах лімфоцитів селезінки спостерігався у більш вузькому діапазоні концентрацій Са2+ порівняно з ядрами лімфоцитів тимусу і значно пригнічувався за підвищення концентрації цього катіону до 0,2 мМ.

Ферментом, який здійснює активний трансмембранний перенос Са2", є Са2\АТФ-аза. Щоб з'ясувати, чи супроводжується процес накопичення Сз.^ у ядрах лімфоцитів гідролізом АТФ, ми досліджували Са2+-АТФ-азну активність ядер лімфоцитів тимусу та селезінки. Підвищення Саі+-АТФ-азної активності спостерігалось у діапазоні субмікромолярної концентрації цього катіону, а за її підвищення до 0,2 мМ ферментативна активність знижувалась (рис.6). Отже, характер залежності Са2+-АТФ-азної активності ядер від

концентрації йонів кальцію співпадав з відповідною залежністю, яка спостерігалась для АТФ-залежного накопичення Са2~ у ядрах. Це дає підстави вважати, що процес АТФ-залежної акумуляції Са2+ у ядрах лімфоцитів є результатом активації ядерних Са +-АТФ-аз. Отримані результати узгоджуються з даними про наявність Са2+-АТФ-азної активності та АТФ-залежного акумулювання Са + у ядрах міоцитів (Kulikova O.G., et al, 1982) та гепатоцитів (Nicotera P., et al., 1989).

[Са2"]. М 18 |Са2_]. М

Рис.. 5. Рис. 6.

Рис. 5. Залежність АТФ-залежного накопичення Са2+ у ядрах лімфоцитів

гимусу (1) та селезінки (2) від концентрації Са21".

Рис. 6. Затежність Са2+-АТФ-азної активності ядер лімфоцитів тимусу (І) та селезінки (2) від концентрації Са2+.

Виявлено, що рівень АТФ-залежного накопичення Саі+ та Са2"-АТФ-азної активность ядер лімфоцитів тимусу був нижчим порівняно з ядрами лімфоцитів селезінки. Більш низька активність АТФ-залежної системи транспорту Са2" ядер тимоцитів може бути пов’язана як з особливостями регуляції ядерних Са2+-АТФ-аз цих клітин, так і з меншою експресією Са2+-АТФ-аз на мембрані ядерної оболонки лімфоцитів тимусу порівняно з лімфоцитами селезінки.

Важливим компонентом ядерного транспорту йонів Са2+ є пасивний вхід цього катіону через канальні структури ядерної пори. Процеси пасивного транспорту Са2" досліджували на ядрах, попередньо навантажених кальцієм, за умови розсіюваній градієнту цього катіону. Згідно отриманих даних, через 2 хв після початку інкубації з ядер лімфоцитів вивільнювалось біля 40 % акумульованого Са2+ (рис. 9). Відносно незначний відсоток виходу Са‘+ може бути пояснений особливостями структурної організації ядерної

оболонки, яка являє собою двомембранний бар’єр, та значною Са2’-буферною ємністю ядра. Додаванім у середовище інкубації нейонного детергента тритону Х-100, який викликає дезінтеграцію ядерної оболонки та підвищує неспецифічну проникність мембран для йонів, призводило до значного зростання кількості вивільненого Са2+ - через 2 хвилину інкубації рівень Са2+, накопиченого у ядрах лімфоцитів тимусу та селезінки, знижувався до 24 %, тобто до рівня, обумовленого зв’язуванням Са*+ з внутрішньоядерними структурами.

Таким чином, отримані результати вказують на існування у ядрах лімфоцитів тимусу та селезінки системи АТФ-залежного транспорт;,’ Са2+, яка може одночасно з ендоплазматичним ретикуліомом виконувати роль компонента внутрішньоклітинної системи перерозподілу Са2+ та бути одним з механізмів підвищення внутрішньоядерної концентрації йонів кальцію.

Дослідження транспорту Са2+ у ядрах лімфоцитів тимусу та селезінки за радіаційного апоптозу. Однією з причин виявленого нами підвищення внутрішньоядерної концентрації Са2+ у лімфоцитах селезінки через 3 год після опромінення може бути порушення функціонування механізмів транспорту Са2+ у ядро. Показано, тцо у цей термін пасивний вхід Са2+ та АТФ-залежне накопичення цього катіону у ядрах лімфоцитів тимусу не змінювались порівняно з контролем. Не змінювались також Са2+-АТФ-азна активність та характер залежності Са2+-АТФ-азної активності' ядер цих клітин від концентрації йонів кальцію.

У ядрах лімфоцитів селезінки опромінених тварин було виявлено посилення пасивного входу Са"+ та підвищення активності системи АТФ-залежного транспорту цього катіону. Так, рівень Са2+, накопиченого у ядрах лімфоцитів селезінки опромінених тварин за 2 хвилини інкубації у середовищі без АТФ, зростав у 1,8 разів порівняно з контролем, а за присутності АТФ перевищував контрольний рівень у 1,6 разів (рис. 7). Виявлено, що після дії радіації рівень АТФ-залежного накопичення Са2*" та Са2*-АТФ-азної активності ядер лімфоцитів селезінки підвищувався у діапазоні субмікромоляриих та мікромолярних концентрацій кальція. У діапазоні 10" - 10 ~б М Са2+ підвищувалась чутливість процесів АТФ-залежного накопичення Са2+ та Са2+-залежного гідролізу АТФ до йонів кальцію (рис. 8).

Виявлений нами однонаправлений характер змін процесу АТФ-залежного накопичення Са2т та Са2+-АТФ-азної активності ядер лімфоцитах селезінки опромінених тварин вказує на те, що підвищення внутрішньоядерної концентрації кальцію у лімфоцитах селезінки через 3 год після дії радіації є результатом активації ядерної АТФ-залежної Са2+-транспортної системи.

0,5 1

час, хв Рис. 7.

1,5

1§[Са21; М

Рнс.

Рис.

Рис.

■ Рис. 8.

7. Накопичення Са2+ у ядрах лімфоцитів селезінки за інкубації у середовищі без (1,2) та у присутності АТФ (3,4): 1,3 - контроль; 2,4 - 3 год після опромінення тварин.

8. Залежність АТФ-залежного накопичення Са2+ у ядрах лімфоцитів селезінки від концентрації Са2+ у контролі (1) та через 3 год після опромінення тварин (2)

Характер виходу Са2+ з ядер тимоцитів, отриманих через 3 год після дії радіації та навантажених кальцієм, не змінювався порівняно

з контролем. Нами виявлено пригнічення виходу Са2т з

навантажених кальцієм ядер лімфоцитів селезінки - через 2

хвилини інкубації з ядер

вивільнювалось лише 20 %

акумульованого Са2". Рівень Са2", який залишався зв’язаним з внутрішньоядерними структурами після обробки ядер лімфоцитів селезінки опромінених тварин

тритоном Х-100, також

підвищувався (рис. 9). Можна припустити, що пригнічення

виходу Са2+ з ядер лімфоцитів селезінки опромінених тварин

час, хв

9. Вихід Са2+ з ядер лімфоцитів селезінки у присутності 0,25 М сахарози (3,4) та 0,3 % тритону Х-100 (1,2): 1,3- контроль; 2, 4 - через З год після опромінення.

пов’язане зі зростанням вмісту білків, які зв’язують йони кальцію, або підвищенням доступності Са2+-зв’язуючих ділянок для цього катіону, шо може супроводжувати розвиток Са2+-залежних деструктивних процесів у ядрах лімфоцитів селезінки.

Таким чином, механізми апоптозу лімфоцитів тимусу та селезінки за дії такого апоптогенного фактору як іонізуюча радіація є різними. У тимоцитах не виявлено взаємозв’язку між посиленням ендонуклеолізу хроматину та підвищенням цитозольної концентрації Са2'г, не спостерігалось підвищення внутрішньоядерної концентрації Са2+ та активації системи АТФ-залежного транспорту та пасивного входу нього катіону у ядра. Тригером апоптозу у тимоцитах можуть бути викликані дією радіації порушення стуктури ДНК, які викликають індукцію р53 та ініціацію апоптозу за Са2+-незалежним механізмом. За радіаційного апоптозу лімфоцитів селезінки спостерігалось підвищення концентрації вільного цитозольного кальцію, активація системи АТФ-залежного транспорту та пасивного входу цього катіону у ядро та зростання рівня внутрішньоядерного Са2+, що передувало посиленню міжнуклеосомної фрагментації хроматину. Очевидно, що ініціація та розвиток апоптозу лімфоцитів селезінки відбувається за Са2+-залежним механізмом.

ВИСНОВКИ

1. Після тотального рентгенівського опромінення щурів у дозі 1 Гр знижується кількість клітин у популяціях лімфоцитів тимусу та селезінки, виявляються клітини з морфологічні ознаками апоптозу (конденсацією хроматину, пікнотизацією ядер, зменшенням клітинного об’єму) та активується міжнуклеосомна фрагментація хроматину. Посиленню фрагментації хроматину’ лімфоцитів селезінки передує підвищення концентрації вільного цитозольного кальцію, активація системи АТФ-залежного транспорту та посилення пасивного входу Са2+ у ядро, зростання рівня внутрішньоядерного Са2'“', пригнічення виходу Са2+ з ядер. У тимоцитах не виявлено взаємозв’язку між посиленням ендонуклеолізу хроматину та підвищенням цитозольної концентрації Са2+, не спостерігалось змін у системі транспорту Са2т у ядро та його внутрішньоядерної концентрації. Це свідчить про різні механізми радіаційного апоптозу лімфоцитів тимусу та селезінки.

2. У очищених ядрах лімфоцитів тимусу та селезінки щурів відбуваються процеси АТФ-залежного накопичення Са2* та М§ ",Са2+-залежного гідролізу АТФ, які активуються у діапазоні субмікромолярних концентрацій Са2". Са2+-АТФ-азна активність та АТФ-залежне

накопичення Са2т у ядрах лімфоцитів селезінки є вищими порівняно з лімфоцитами тимусу.

3. Після дії радіації у лімфоцитах тимусу та селезінки щурів відбувається міжнуклеосомна впорядкована фрагментація хроматину, яка призводить до накопичення полідезоксирибонуклеотидів довжиною 200, 400, 600 та 800 пар основ. Вміст полідезоксирибонуклеотидів у лімфоцитах селезінки опромінених тварин зростає у більш ранній термін після дії радіації і є більш значним порівняно з лімфоцитами тимусу.

4. У ранній післяпроменевий період у лімфоцитах тимусу та селезінки підвищується цитозольна концентрація Са'+ та рівень Са*’-мобілізуючого месенджера інозигол-1,4,5-трифосфату. У лімфоцитах тимусу значення цих показників зростає через 3 год після дії радіації, після чого повертається до контрольного рівня. У лімфоцитах селезінки концентрація цитозольного Са2+ підвищується через 3 год, досягає максимального значення через 6 год та утримується на підвищеному рівні через 12 год після дії радіації, а утворення інозитол-1,4,5-трифосфату посилюється через 1 год після дії радіації і досагає максимального рівня через 3 год.

5. Інкубація лімфоцитів тимусу та селезінки, виділених через 3 год після опромінення тварин, у середовищі 2 мМ СаСЬ супроводжується фрагментацією хроматину, яка відбувається більш інтенсивно у лімфоцитах селезінки порівняно з тимоштами. За інкубації у безкальцієвому середовищі інтенсивність процесу деградації хроматину' у у лімфоцитах селезінки знижується порівняно з інкубацією клітин у середовищі 2 мМ СаС12, а у тимоцитах - не змінюється

6. На раїшьому етапі радіаційного апоптозу лімфоцитів селезінки зростає внутрішньоядерна концентрація Са2+. У цей термін підвищується Са2+-АТФ-азна активність ядер, посилюється АТФ-залежне накопичення та пасивний вхід Саі+ у ядра. У лімфоцитах тимусу рівень внутрішньоядерного Са2+, активність системи АТФ-залежного транспорту та пасивний вхід Са2+ у ядра не змінюються порівняно з контролем.

7. Вихід Са2" з ядер лімфоцитів тимусу, виділених через 3 год після дії радіації та навантажених кальцієм, за умови розсіювання кальцієвого градієнту не змінюється порівняно з контролем. У лімфоцитах селезінки опромінених тварин вихід Са2+ з ядер пригнічується, а рівень Са2", зв'язаного з внутрішньоядерними структурами, підвищується.

Список опублікованих за темою дисертації робіт

1. Солодушко В.О., Гринюк 1.1., Борисов С.І., Матишевська О.П. Залежність від кальцію індукованого радіацією ендонуклеолізу хроматину у

лімфоїдних клітинах // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. - 1998. - Т.28. - С. 16-18.

2. Борисов С.І., Гринюк І.І., Ковальова В.А., Птиця О.М., Матишевська О.П.

Отримання та характеристика препарату' ядер лімфоцитів тимуса і селезінки щурів // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. - 1999. - Т. 29. - С. 12-14. ' '

3. Борисов С.І., Матишевська О.П., Кучеренко М.Є. Са2+-АТФ-азна

активність ізольованих ядер лімфоцитів тимусу та селезінки щурів // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. - 2000. -Т. 31,-С. 21-23. '

4. Matyshevska O.P., Solodushko V.A., Pastuch V.N., Borisov S.I.. Kucherenko

N.E. Biochemical aspects of postirradiation modification of lymphocytes injury // Abstracts of First Practical Conference “Sustainable Development: Environmental Pollution and Ecological Safety. - Dnepropetrovsk. - 1995. - P. 150-151. ’

5. Солодушко В.А., Борисов C.I., Матишевська О.П. Упорядкований характер деградації ДНК лімфоцитів селезінки щурів після рентгенівського опромінення // Тези доповідей VII Українського біохімічного з’їзду. - Ч. Щ. - Київ. - 1997. - С. 78.

6. Матишевська О.П., Борисов С.І., Сировець Т.О., Кучеренко М.Є. Вхід кальцію як фактор посилення деградації хроматину лімфоцитів селезінки після рентгенівського опромінення щурів у невисоких дозах // Тези доповідей II З’їзду Українського біофізичного товариства. - Харків. -1998. -С. 252.

7. Матышевская О.П., Борисов С.И., Ковальова В.А.. Дворщенко К.А. Окислительный стресс в развитии индуцированного радиацией апоптоза клеток // Труды Международного экологического конгресса “Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности”. - Т. 2. - Санкт-Петербург. -2000. - С. 331.

Борисов С.І. Са2* та фрагментація хроматину у ядрах лімфоцитів тимусу та селезінки щурів за радіаційного апоптозу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2000.

Дисертація присвячена порівняльному дослідженню фрагментації

... - ' ... г, 2+

хроматину, цитозольної і внутрішньоядерної концентраті Са та транспорту Са2+ у ядра лімфоцитів тимусу і селезінки за радіаційного аиоптозу.

Показано, що у ядрах лімфоцитів тимусу та селезінки присутня система

АТФ-зшіежного транспорту Са2т, яка активується за субмікромолярних концентрацій цього катіону. Встановлено, що загибель лімфоцитів тимусу та селезінки після дії радіації супроводжується впорядкованою міжнуклеосомиою деградацією хроматину. Результати досліджень свідчать, що механізми радіаційного апоптозу у лімфоцитах тимусу та селезінки с різними. За радіаційного апоптозу лімфоцитів селезінки спостерігалось підвищення концентрації вільного цитозольного кальцію та внутрішньоклітинного інозитол-1,4,5-трифосфату, активація системи АТФ-залежного транспорту та посилення пасивного входу Са2" у ядра, зростання рівня внутрішньоядерного Са‘" та пригнічення виходу Са'~ з навантажених цим катіоном ядер, що передувало посиленню процесу міжнуклеосомної фрагментації хроматину. Дані свідчать, що ініціація та розвиток радіаційного апоптозу лімфоцитів селезінки відбувається за Са2+-залежним механізмом. За радіаційного апопгозу тимоцитів не було виявлено взаємозв’язку між посиленням ендонуклеолізу хроматину та підвищенням цитозольної концентрації Са2+, а також змін транспорту Са2т у ядро та внутрішньоядерної концентрації цього катіону.

Ключові слова: апоптоз лімфоцитів, Са2*, ядерна Са2"-АТФ-азна активність, фрагментація ДНК, радіація.

Борисов С.И. Са2+ и фрагментация хроматина в ядрах лимфоцитов тимуса и селезёнки крыс при радиационном апоптозе. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Киевский национальній университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2000.

Диссертация посвящена сравненительному исследованию фрагментации хроматина, цитозольной и внутриядерной концентрации Са"*, а также транспорта Са2+ в ядра при радиационном апоптозе лимфоцитов тимуса и селезёнки.

После рентгеновского облучения крыс в дозе 1 Гр в популяциях лимфоцитов тимуса и селезёнки наблюдалось снижение количества клеток, которое через 24 часа после действия радиации в популяции лимфоцитов тимуса составляло 32,6 %. а в популяции лимфоцитов селезёнки - 51,5 % от контрольного уровня. Методом электронно-микроскопического анализа в препарате лимфоцитов через 3 часа после облучения животных были выявлены клетки с морфологическими признаками апоптоза. Показано, что гибель лимфоцитов тимуса и селезёнки после действия радиации сопровождалась интенсификацией процесса гидролиза хроматина и накоплением фрагментов ДНК равных и кратных длине нуклеосомной ДНК

- 200 о.п. Полученые результаты свидетельствуют, что в лимфоцитах тимуса

и селезёнки после действия радиации происходит межнуклеосомная фрагментация хроматина, которая является главным биохимическим показателем апоптоза.

С помощью флюоресцентного зонда квин-2 показано, что концентрация цитозольного Са2+ в тимоцитах повышалась через 3 часа после действия радиации, после чего возвращалась к контрольному уровню. В лимфоцитах селезёнки концентрация цитозольного Са^+ повышалась через 3 часа после облучения животных, достигала максимального значения через 6 часов и оставалась повышеной через 12 часов. Исследование влияния Са2+ на процес деградации хроматина показало, что инкубация лимфоцитов селезёнки облучённых животных в номинально безкальциевой среде приводит к снижению выхода в цитозоль фрагментов ДНК по сравнению с инкубацией в среде с 2 мМ СаСЬ, а накопление фрагментов ДНК в тимоцитах после действия радиации не изменялось.

Предполагается, что раннее повышение концентрации Са2+ в цитозоле клеток связано с его мобилизацией из внутриклеточных депо. Показано, что в лимфоцитах тимуса через 3 часа после действия радиации усиливается образование инозитол-1,4,5-трифосфата. В лимфоцитах селезёнки уровень внутриклеточного инозитол-1,4,5-трифосфата повышался через 1 час после облучения животных и достигал максимального уровня через 3 часа.

Выявлено, что через 3 часа после облучения животных в лимфоцитах селезёнки повышается внутриядерная концентрация Са2+. В ядрах тимоцитов облучённых животных внутриядерный уровень Са2+ не изменялся. Исследование механизмов повышения концентрации Са2+ в ядрах лимфоцитов контрольных крыс показало, что при добавлении АТФ в среду инкубации ядер наблюдается повышение внутриядерного содержания этого катиона. Процесс АТФ-зависимого накопления Са+ в ядрах лимфоцитов тимуса и селезёнки активировался в области субмикромолярных концентраций ионов кальция. Аналогичная зависимость от концентрации Са2+ была получена для Са2+-АТФ-азной активнисти ядер лимфоцитов. Результаты свидетельствуют о наличии в ядрах лимфоцитов тимуса и селезёнки АТФ-зависимой системы Са2+-транспорта.

При радиационном апоптозе лимфоцитов селезёнки активировались процессы АТФ-зависимого накопления кальция и Са2+-зависимого гидролиза АТФ в ядрах, в лимфоцитах тимуса облучённых животных интенсивность этих процессов не изменялась. Показано, что после облучения происходит торможение выхода Са2+ из ядер лимфоцитов селезёнки и повышение уровня Са2+, который остаётся связаным с ядерными структурами после дезинтеграции ядерной оболочки неионным детергентом тритон Х-100. Предполагается, что после действия радиации в ядрах лимфоцитов селезёнки

повышается содержание Са24-связываюших белков или доступность Са‘"-связываюгцих участков для этого иона, что может сопровождать развитие Са2+-завнсимых деструктивных процессов. В ядрах тимоцитов облучённых крыс показатели выхода этого катиона не изменялись по сравнению с контролем.

Результаты исследований свидетельствуют о различных механизмах радиационного апоптоза в лимфоцитах тимуса и селезёнки. При радиационном апоптозе лимфоцитов селезёнки наблюдалось повышение концентрации свободного цитозольного кальция и внутриклеточного инозитол-1,4,5-трифосфата, активация системы АТФ-зависимого транспорта и усиление пассивного входа Са2+ в ядра, повышение уровня внутриядерного Са2+ и угнетение выхода Са2+ из нагруженных этим катионом ядер, что предшествовало усилению процесса междунуклеосомной фрагментации хроматина. Очевидно, что инициация и развитие радиационного апоптоза лимфоцитов селезёнки происходит по Са"т-зависимому механизму. При радиационном апоптозе тимоцитов не було обнаружено взаимосвязи между усиленнием эндонуклеолиза хроматина и повышением цитозольной концентрации Са2т, а также изменений транспорта Са2+ в ядро и внутриядерной концентрации этого катиона.

Ключевые слова: апоптоз лимфоцитов, Са2+, ядерная Са2+-АТФ-азная активность, фрагментация ДНК, облучение.

Borysov S.l. Са"4 and chromatin fragmentation in rat thymus and spleen lymphocyte nuclei during radiation-induced apoptosis. - Manuscript.

Thesis for a candidate degree in speciality 03.00.04 - biochemistry'. Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2000.

The dessertation is devoted to investigation of chromatin fragmentation, cytosolic and intranuclear Са2т concentration and nuclear Ca^-transport in thymus and spleen lymphocytes during radiation-induced apoptosis.

It has been shown that there is an ATP-dependent Ca2+-transportmg system in thymus and spleen lymphocyte nuclei activated by submicromolar concentration of the cation. It has been shown that death of the cells after irradiation is accompanied by regular intranucleosomal DNA cleavage. The results suggest that radiation-induced apoptotic death of thymus and spleen lymphocytes occures by different mechanisms. During apoptosis of spleen lymphocytes increasing of cytosolic Ca^-concentration and intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate level, activation of nuclear ATP-dependent Ca2+-transporting system and increasing of passive diffusion of Са2т nuclei, increasing of intranuclear Ca2^ level precede intensification of the chromatin degradation. The results suggest that initiation and development of spleen lymphocyte radiation-induced apoptosis occurs by Ca2+-