Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование кинетики гибели лимфоидных клеток спектральными методами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование кинетики гибели лимфоидных клеток спектральными методами"

академия наук ссср, ..

мстит биологической шзшш

На правах рукописи

МАТШШВИЧ , НАТАЛЬЯ ПАВЛОВНА

УДК 578.088: 6I2.OI4.462: 611,43

исследование кинетики гйбзли лимоощинх клеток спбятральнью методам.

03.00.02 - ЗксфсЕййа

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисказхе учёной стегани кандидата физико-математических наук

Пуэдшс - 1990

Работе зшодаэка в Институте биологической физикк АН СССР. .

Научные, руководители: .докгор <^8ико-матаматичвскю: яаук-В^А.Пэчбкаке©«" ' .„•--'•, доктор акологкчеокйх.наук» профессор С.Р.Умансжий.. • ;.••".

Официальные :ошоквкты: доктор визихо-математйчвохзЕ наук, врофэесор ЗЛ^.Руугв, доктор биологических наук/ нрофэоеор АЛ.Гзэкэе. .

Ведущая оргезвЕедхк -Ленинградский зшаягсус ядерной ДН СССР, г-.Ленинград.

Защита дасаэргадак соогогкоа- ^ г..

е -У чесов на збсэд&ззе оазиды2зьрс2£нного сзвг\£ :•: 002.61,01

3 ЙНСТИТУМ б20КСТ26СК02 фезихк я: -СО?.. 14229?.,, ::-,лушео, Московской О'ХеСТЕ.

, С даоэряадйй »южно озкапэзоглс.'? & зизлиотек« Шсятутэ бнозогаиескоЕ Ф223ЕО: АК СЗСР.

Автореферат рагсояан " ^ 1990 Г.

УчЭкый секретарь Специализированного совать кандидат биологических наук

¥7

.Я .Б.. Олокзникзша

\

общая характеристика работы.

Актуальность темы. Гибель клеток является необходима« элементом формирования многоклеточного организма и з то же время одним из ваших элементов его функционирования. Последаий аспект включает как физиологическую гибель клеток в ходе терминальной дифферен-цировки и вследствие нарушений тканевого гомеостаза, так и гибель под действием различных (физических, химических и биологических) агентов, в том числе и в ходе терапевтических мероприятий. Поэтому .неудивителен возрастании® интерес к исследованию феноменологии и механизмов этого фундаментального явления. Чрезвычайно актуальным является вопрос о наличии общх, универсальных механизмов гибели у развнх тапов клзток, Так, общепринятым в настоящее время является вндэлэняо двух основных аорфологически л биохимически отличных типогз гибелч - некроза ч апоптоза. И если некроз есть процесс де-гопорация клетки, то отюптоа ~ активная, генетически запрограмми-ропаниая реакция саморазрушения клетки. 8 последние года достигнут сущоетззтшй прогросс в таучения закономерностей апоптоза (Иу1Ие, 1986; Хает, 1986; Умядаясий, 1982), однако многие стороны этого процесса до сих яор остаются навняонвншши. Это касается как моле-кулярних механизмов, так я кохачоствовных закономерностей клеточной гибели. В силу рядя причин (иовреадение единичных клеток, быстрое протекание процесса ч ,1ф.) изучение апоптоза представляет значительные трудности. 3 немалой степени это обусловлено ограниченностью применяемых биохимических я цитологических методов, не спосоОпнх одновременно адекватно оценивать гибель одиночной гадетки п давать достоверную картину гибели клеток в популяции.

а иоанздгао годи мирокоэ применение а клеточной биологии на-ш5л ме-год проточной цитомэтрш - кинетический метод исследования клэточпнх популяций, позволяющий на основе анализа функций распределения популяции выявлять картину структурш-функциональных изменений и клетке. Принципиальная возможность многопараметрового анализа клеток позволяет ■ развивать говне методические подходы да изучения конкретных биологических явлений, в том числе и для исследования закономерностей клеточной гибели (РесЬагпИсоу ех. а1., 1986; Афанасьев и др., 1986 ', 1987). Отметим, что метод имитационного моделирования клеточных популяций-, в основе которого лежит анализ случайных процессов, является адекватным цитометрическому исследованию и дабт возможность оценить характерные параметра различных клеточных процессов. '

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работа было нзу-

1

чеш£; ашсоншорностей (феноменом»™ и кинетики) гибель лслфоидннх клеток* Исходя из этого, быш сформулированы слодукоую надачи ис-следонагши I) Разработка iraüHS подходов да изучен««; ноиуляций тОлщнх клоток методом двунарамотровой цитофлуориметрии h анализа панучотпм. дашия.с помощью »«итедиовных моделей; 2) Сравнительное иошадоюаше вакономврностой 'шдо>рфазной гибели лтфоцшкю тимуса tn-vitro h lu' vitro; 3) Исслодовгнио закономерностей montosa про-лифэрируищи*. кяиток; 4) huiuw тхтпотх. особенностей гибели лиы-фонданх клеток.

Научная шкиаыа. раэработаи способ определена« доли погибших клоаок si мпудшции кэтодо« цроточмой цитометрии не остове коли-чествеюкп'о анализа содвршш ДНК л клетках. Ksyveim кшюздшя шторфвмюб. шбела лимфоцйФои уьмуса, уотавовлош количественные закоошо^осш Фрагментации v ыммипацни погибших клоток. Исследовано jwcî'mû цктоскелсть sr донфюн r¡ процессе юют-озк. Шорвиа ироведЗи орашитсльннй аиаш» вигорфазной гвбем ликфмш/нх шюк рвашх аддоь догоню: к человека после облучения. Кссаодоваш закономерности «гюпгоза ups рещюдукткшой гибели иролифорируэдих лдофавдяи* клеток.. Разработав новый способ двуперамотропого ШЖ/шкбраий) цитометричоского анализа кдеточянх поиулшдай; вау-чвко шаимодейстшс зтюфшжк фяуорэсцет™*, хондой с шдолшнмй к цдаточмыш шЩтиж. JKbíj анализе ддк-гистограмм, р тэкжо кино-•iïttcv; клеточкой i-йбелк тщшо исшль&овак i/атод имитац&овного t'o-додярования поведения клоточних популяций*

Праул'ИЧйскай дойность. Разработанный способ опродвлепик ти-носиособйосхк глоток кокет быть использован дат количественной оценки стокенк шкроедаодаго действия различных физических, и химически* факторов к частно с'г и в долях, биологической дозиметрии и дою скрининга физиологически активных создшюний. Данные, полученные на культуре пролиферируодих лимфоидных клеток s важны при разработке методов тарапонтичвского лечения гормон-зависимых опухолей! а также при радиационной терапии димфом.

Апробация работа. Материала диссертации бшш доложеш на Ш' Всесоюзном симпозиуме "Липида биологических мембран" (Пущина, 1984).. V Всесоюзном рабочем совещании но биоэлектрохимии мембран (Ленинград, 1986), IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), Рабочем совещании "Механизма радиационной гибели клеток и механизмы еб пострадиационной модификации* (Пущино, 3.987 h IV Всесоюзной конференции по проточной зщтометрш (Цущино, 1988), Международной конференции "Физическое исследование биологических клеток" (Росток, ГДР, 1988), III Мезду— 2 ..... ......

народной школе-койфервшгля молодых учЗннх яо Зйо'гехнологш (Ирие--рос, ГДР, 1989), I Всесоюзном радиобиологическом сьезде {Москва, 1989), Конференции молоднх учёных 1ЩВИ (Пущино, 1989) ч др„

Публикации. По материалам диссертации опубликовано .19 работ» Структура диссертации. Диссертации состоит из введения и семи глав, включащих обзор литературы, описания -аатериалоо я методов, изложение результатов исследования и их обсуждений, -сакам вдво--дов и списка цитированной литоратурн, содержите го гашенова-

ния, Диссертация изложена страницах, содержит гаФиздн и

рисунков.

;чатершдн и мегода,

Работу проводили на крнсах-самцах семейства "Внстар" массой T40-I6Ó р я белых беспородных мншах-еащах массой 13-20 г. В экспериментах ira определению неточности тимуса использовали крнс в возрасте 49-30 дней. Животннх я клетки облучали т-кванташ 13ТСя (мощность дозн ?.,а Гр/мин) на установке ГЭТТОО, Вещества, раство-рбншо в физрастворе, вводили впутршзряшинш .то расчета яа ТОО г веса животного в следующих количествах: гидрокортизон-ацетат - 10 иг, циклогоксямид - 0.3 мг, колтадиа - (0.QU3) мг, цитохалчзш В -- (0.3+0.9) ус. S3 различат сроки поело воздействия тиыуо удаляли» гомогенизировали в физиологическом растворе и фильтровали через нейлоновую сетку. Клетки тимуса круо и msom mm ВЯ5147 культивировали в орода RPííI-1640 о добавлением IOS эмбриональной сыворотка телят, Клетки фиксировала 5QS этанолом и хранили яри -18°С. Фиксацию культуральных клеток проводили, как описано в работе (Ма-талевич 51 др., 1990). Центрифугирование клеток в градиенте плотности Пзрколла выполняли по рекомендации фирмы "Pharmacia".

Выделение и электрофорез ДИК в 3% полиакриламид- 0.5S ягароз-пом геле проводили, как описано в (ШапзКу et al. ,1981).

ДНК-специфачну» окраску клеток (концентрация (1+2) »10<3 кд/мл) проводили в течение 15- мин а буферном растворе (ОЛ M NaCl 0.1 M ТПя-HCl (pli 7Л)), содержащем I мкг/мл Hoehst-33258 (IÍ-33258) либо 12.5 мкг/мл бромистого зтидая (ЕВ) + 25 мкг/мл митрэмицина (?Я) 4 мМ MgCla (Barlogie et al., Î9T6)„

йготограмш клеточных популяций: получали на проточном цито-флуоримзтрэ оригинальной конструкции (PechatnJLkov et al., !98б). Флуоресценцию возбуждали и регистрировали на слэдутадах .длинах вода: для Н-33258 в области (334+365) нм и (450+490) им соответственно, для ЕВ на 488 нм и >. 600 нм, для Di0-C6~(3)- на 488 ни я

3

г. шо им, да ])18-са-(») 578 нм ю 660 ш1 ляя мвм>,»(£-; ьео ш л ** Ш) ш соответственно, «яуоросцонцив ВТ ьоябуждам }•• оЧмгода (40Ы43&) ш. Математическую .обработку ДНК-гистоа-раш дд.о определений доли клеток в фазах меточного цикла проводили. пак шисаяо в О'ссПаШИсоу е1 а1., 1386), Црсшицаомоси. шшама'дноской кембрз-ш квшвс клеток для ЕВ определяли на проточном (дууоршетро как дол» клеток 11 суспензии, окрзвшиаешгх ЕВ в огсутмшо мтчшть (РпсОДп11хпг оЛ а1..4 1986).

Оав1ЩЯ1 гюгжтпт ([щоуосцопттх кадш> уоуищы^шт т спбктрофотокот!» Зресогй У40 (ГДР), йодо}юс>\пит>2о исследоваго«. .прсюодвт г«а аттрофлуохиадотрс СФР-3 для анализу ^ссоиващях ь чптйчосжй штатных сред а а!., 198?), Лшкккш из яачиогс

доцадшк коедчшш доуврттши кш-одом (БаоКб, 1900). Зчсихстат у рг!0«]Ч.'Д0ЛСЩ|«1 ЛШЮфИДЪШХ фПуорОСДОНТта :<ОУДО)-1 >. мембранной > определял« ткут-' обратного флуоршо-.т^иоокого тит--рОЛМИИЯ ГОДНО* рЯСТШрОН Мй-'Д* оуПИОШМОР .ШЮСОг' (.1\к(>\(1 !:1- »1. ,

<>>»<¡гл^оротичосау-я иод'чдаи'остъ ¡¿пот; иаыоря-чн шоктрофо--ТоНОТр!-: (Аш-лвя) )• ОУХЬрОЗНОМ буфере (• »узкой ИОННОЙ

0151.01; (!|.(Й5г «а»; <ЙМШ'а I: (^«»ПЙПОВ И Др., )0Г<6).

Л<нт*/>№ }.. одадщмк.

5>{1р5!(>ОТ>1Г. ПОШЛ МОУиДшЛЧЧ;КИХ ПОДХОДОВ ДОК нсимдинаюн.

iiOJjyA.5a.iaii истодом проточной цитомотрик.

Ь с- <л'иу»с15№0к огшдерина М0ТОДОК ЦйТОМОТрИЧОСКОК.

лкаюзс ио&улчций тбйувдх кнопок был разработай ряд новых метода-ПОДХОД»!!, 1Ю«ШЯМЩ0Х о помощью проточной. ВДТОШТрИК измо-?лч'я. концопур&цйю клеток )! оуоюекзии, относительный объем их мемб-тсоаюг-о кошошнга, в такс определять кинетические параметры кле-поиу.шдай о помощью иматадаонвых моделей.

Ояцодолимо концентрации клеток ь суспензии. Результатом и»--трений на проточном фдуориквтрв является функция распределения клеток )•. »апудмдаь по некоторому параметру, удовлетворяющая усло-и-4й корвгврожк ]/£?.,!-)<Зх ~ 1. В то же время, изучение количествен-шп ¡Фнащщтош»^ шогих процессов требует знания истинной функции рьш]юдодо)1«я; н(х,Х)

где К(1} ■ мйхдатюо количество клеток в популяции (в органе или и культура), хюгягл-рируомлх питометром. Обязательным условием яв-■т&оя онродолонкг. !■('! } и /(х,г) одним и тем же методом. Ыы_ разра-

ботаж . способ гпюзвбляккдай получать ДНН-гистограмму (f(x,t)) и определять концентрацию клеток (и соответственно S(t)) в исследуемой популяции. Для этого в суспензию клеток, окрашенных ЕВ, добавляли латексы, окрашенные по поверхности 4-амин-11-фталимндом» в известной концентрации (слат). Одновременно регистририровала в области 450+590 нм - число лэтексных частиц в области

лат

> 600 нм - число клеток ЦУ^) в некотором объбме суспензии. Концентрацию клеток определяли как:

скл я слт* ^кд ^.лат ^" Регистрация объёма мембранного компонента клеток. Мы исследовали взаимодействие ряда лгосфмьных флуоресцентных зондов с модельными бислойными мембранами к выбрали для измерения объбма мембранного компонента клеток карбоцианиновый краситель D10-C6-(3) по следущим соображениям (см. Табл.1):

1. Высокое сродство зонда к мембране.

2. При перераспределении зонда з мембрану его квантовый выход существенно возрастает.

3. Б10-Сб-(3) наименее чувствителен к изменениям трансмембранного потенциала лимфоцитов тимуса.

4. Di0-C6-(3) удобен для двупараметрового (ДНК/мембрана) анализа клеток в паре с ЕВ. Возбуждение обоих красителей осуществляется при длине волны 488 нм, регистрация флуоресценции ЕВ производится в области » 660 нм» Di0-C6-(3) - в области (490+520) нм.

Таблица I. Свойства липофильннх фуоресцентных зондов.

Зонд 'к-кг6 А-ртах /ттах и ^В *{(F-F О )/7 } о max

ms- с3- (5) 2.4 ± 0.1 1.0 ± 0.1 0.7 ± 0.2

diba-c4- (5) 7.1 1 2.0 2.5 ± 0.2 2.75 ± ОЛО

DiO- Сб- (3) 15Л * 4.3 7.5 ± 4.0 0.20 t 0.04

К - константа распределения зонда в мембранной ж водной фазах (в мольных долях).

ута-х^тдх _ ОТНОшешэ интенсивности флуоресценции -зонда (Ю"бМ) в мембранной и водной фазах при .

{- флуоресцентный ответ зонда (10~8 М) на снятие

О О л •

трансмембранного потенциала тимоцитов крнсы (2«10 кл/мл). Р и Р0 - средняя по популяции интенсивность флуоресценции клеток в присутствии и в отсутствие потенциала соответственно.

ti

гибель

ыетоктй цши

------z2 -

Рис Л. Функциональная схема популяции лшфоидах клочок.

Имитационная модель. Данные цитометрического анализа позволяют описать процесс гибели клеток в популяции в рамках функциональной схемы, представленной на рис.1. Модель описывает распределение популяции лимфоцитов по содержанию ДНК в клетке. В качества входных параметров задаются длительность клеточного цикла, . которую определяют из ДНК-гистограмм и кривых роста клеток, распределение клеток в цикле (в случае логарифмической фазы роста), а также параметры исследуемых процессов (пролиферации и гибели клеток). Молол^ позволяет оценить наличие блоков и задержек в цикле в результате воздействия на популяцию, а также характер и кинетику клеточной гибели.

В имитационных экспериментах последовательно разыгрывается "судьба" каждой из N клеток (Ат ~ I04). Положение клетки в цикло описывается переменной х (рис.2). Полуинтервал ]Х^\Хг] соответствует фазе Gj, ]Х2;Х33 - фазе S; 1Х3;ХЛ) - фазе G2/M. После деления [С'.>ХЛ) каждая из дочерних клеток с вероятностью Р вновь направляется г- клеточный цикл fcr^), а с вероятностью (i-P) необратимо гибнет (х^). Время, в течение которого клетка находится в состоянии "выбора пути" (2=Х ), является случайной величиной, распределенной по показательному закону и разыгрывается методом Монте-Карло. Для i-клетки, находящейся в fe-ой фазе клеточного цикла в момент времени t значение переменной х определяется следующим образом:

W + (V^J-*з-1>

up [ JL

«2

х1 G1 I£ ' S A'3 G2/M

Ряс.2. (¡хама имитационной модели.

где Хк)/Гк есть скорость продвижения клетки по фаза ?г

№=1,2,3), '/^-длительность й-фазы,. £ - случайная нормально распределённая величина, разыгрываемая методом Монте-Карло и отражающая стохастический характер деятельности клеточного цикла.

В процессе гибели клетка может дробиться случайным образом на п частей и (или) элиминировать фрагменты хроматина. Кинетика элиминации ДНИ из я-фрагмента i-клетки в первом приближении может быть описана как:

- (а + Е)

где - исходное количество ДНК в клетке (клеточном фрагменте), а - скорость элиминации ДНК, время, а течение которого клетка находится в состоянии гибели.

Определив для всех клеток, можно построить распределение клеточной популяции по ДНК. Сопоставляя результаты цитометричэско-го анализа и численного моделирования, мы корректировали входные параметры модели, добиваясь наилучшего совпадения результатов.

Феноменология и количественные закономерности пострадиационной гибели тимоцитоз.

ДНК-цитометрия облучённых клеток. Известно, что наиболее ранним регистрируемым событием при интерфазной гибели лимфоцитов является межнуклеосомная фрагментация ДНК. Продукты деградации хроматина хорошо растворимы л могут быть легко экстрагированы из клеток. При соответствущих условиях окраски ДНК-шецифичннш красителями клетки с частично деградированной и элиминированной ДНК имеют меньшую флуоресценции и появляются на ДНК-гистограммах левее основного пика, соответствующего клеткам с диплоидным (2С) набором ДНК (рис.3). Применяя различные процедуры окрашивания клеток: с экстракцией (Н-33258) или без экстракции фрагментов хроматина (ЕВ + Ml) - можно различать процессы деградации и элиминации хроматина в процессе гибели (Pechatnikov et al.,1986). Используя этот подход, мы провели сравнительный анализ гибели облучённых лимфоцитов тимуса крыс in viva и in vitro. Показано, что 7-облучение в обоих случаях вызывает межнуклеосомную фрагментацию хроматина. При этом, In vitro на ДНК-гистограшах в области <2С выявляются клетки, ■ имевшие исходно полный набор частично деградированной ДНК (рис.3,г) и элиминировавшие фрагменты хроматина в процессе окраски (рис.3,5), тогда как in vivo часть.клеток (47%) имела ДНК меньше 2С, так называемые я.<2С-клетки", 'на момент, фиксации , т.е. а

Т

toco

\%

Ji

Рис.3. ДНК-гистограммы тимоцитов крысы в контроле (а) и Фрез 6 часов носл •а облучения в дозе 10 Гр In vivo (б,в

•и in vitro {г,б). Окраска 11-3325; (б,г) и (EB+MI) (6,0). В процента: указана доля клеток с деградированно: (б,г) и елиминированной ДНК (о,б). II оси абсцисс - количество ДНК/клетку А по оси ординат - число клеток.

1000

70%

\ А

гс

rr¿%

«

1

№

№

t

Т--Т

\

I

2¿Z£fjgyai. «м i геЛТ^ТЬ

4С

КЙ-!

ií»-

«

органе (рис.3,6,в). Для выяснения природа 'чгс-клетоЗг"-была исследована кинетике "клеточности" тимуса, т.о. количество днк-содержащих частиц в органе.

Фрагментация и элиминация погибших клеток ín t>iuú. Наш былз получены кинетические кривые "клеточности" тимуса крыс (N(t.)) i содержания ДНК в органе (X(tJ = H(tJ>J/(x,iJdx) поело облучения Показано,что на 3-ий час после воздействия общее количество ДНК з тимусе остаётся па уровне контроля, тогда как общее число ДНК-содержащих клеточных частиц ("клеточность") возрастает на 402. Прз атом доля поврежденных клочок составляет "IOS (рис.4), что в сово купности говорит об иатоноишюй фрагментации погибших клеток. } б-ому часу рост "клеточности" замедляется, что, по-видимому, связано с удалением клеточных фрагментов из органа, о чйм свидетельствует уменьшение общего количества ДНК в тимусе облучённых животных.

))ля оценки характерных параметров процесса фрагментами : элгамкнащь погибших-" к леток ш провели численный экагорииов? с ис пользование?,; имитационной модели, функциональная схима которо в

Рис.4.

Кинотика изменений в популяции клеток тимуса крыс, поело облучения животных в дозе 10 Гр. I - "клото'шость" органа,

2 - содержание ДНК в органе,

3 - количество нефрагментиро-вэнных клеток. По оси абсцисс - время после облучения (часы), по оси ординат - количество клеток и ДНК {%), Сплошная линия - данные цито-метрического анализа, пунктирная - результаты численного модельног'о эксперимента.

представлена на гасЛ,tí. В качество варьируемых исследовали следующие величины: (I) с-корость гибели клеток в популяции, гдо первым регистрируемым событием гибели полагали дробление клетка на п фрагментов; (2) среднее количество Фрагментов (?Т) и (3) скорость элиминации поврождЗнных клеток из органа. На рис.4 пунктиром показаны результаты численного эксперимента. Модель адекватно описывает данные цитометрического анализа при условии, что погибшая клетка делится случайном образом в среднем на 3-4 фрахъганта и "среднестатистический" фрагмент "кивЗт" в тимусе (т.о. регистрируется на ДНК-гистограммах) в течение ~ 5 часов.

Остается, однако,, невыясненной природа регистрируемых днк-содеркащих частиц: являются ли они мембрано-замкнутыми клеточными Фрагментами (апоптозными тельцами) или фрагментами ядра? Ми провели двумерный (ДНК/мембрана) цитометрический анализ популяции облучённых тимоцитов. Как показано на рис.5, все ДНК-содержащие клеточные фрагменты имеют значительное (сравнимое о контролем) количество мембран. Фрагментации подвергаются клетки с непроницаемой плазматической мембраной и поверхность зпоптозных телец в течение некоторого времени сохраняет свои барьерные свойства.

Кинетика гибели тимоцитов. Установлено, что in vitro общее количество клеток и ДНК в культуре тимоцитов крысы не изменяется в процессе инкубации, т.е. в культуре погибшие клетки не дробятся и не элитятирую? фрагменты хроматина в процессе апоптоза, тогда как in vivo гибель тимоцитов облучённых животных сопрововдается фрагментацией погибших клеток и элиминацией клеточных фрагментов. На рис.6,а,ö ирэдставлвпа шеотяка гибели тимоцитов крнсн, облученных

3

Рис.5 Двумерная гистограмма тимоцитов крысы через 4 часа посла облучения In vivo в дозе 6 Тр. По оси абсцисс - количество ДНН/клэтку, по оси ординат - количество мембран/клетку.

in vivo и In vitro, Кривые накопления клеток е фрагмэятированной

ДНК совпадают в те чеша 8-ш часов после воздействия, однако общая

доля погибших, клеток различна: In vivo гибнет 80% популяции, тогда

как in vitro -- 100%, Т.о., система in vitro является адекватной

моделью для исследования пусковых механизмов и начальных этапов

гибели популяции лимфоцитов. Видно (рис.6,а), что учет процесса

фрагментации при определелешш доли погибших клеток как i гс

-«г n(x,t)úx (кривая I) несколько изменяет кинетику гибели кле-

N(0) о 2С

ток, оцениваемую по критерию "меньше 2С": ¡f(x,t)0x (кривая 2).

о

На рис.6,a,ü представлена также кинетика появления проницаемых клеток в популяции облучённых тимоцитов крысы клеток, проницаемых для ЕВ (кривые 3). Она совпадает In vivo и in vitro, однако, в первом случае наблюдается увеличение проницаемости мембран преимущественно у клеточных фрагментов, в культуре же проницаемым становятся сами клетки. Видно, что процесс деградации хроматин! опережает нарушение барьерных свойств плазматической мембраны.

Изменение поверхностного заряда клеток. На рис.7 показан! измэнение среднего значения электрофоратической подвижности клето: тимуса и селезёнки крыс после облучения. Аналогичные результат; были, получены в системо in vitro. Анализ формы гистограмм электро форетической подвижпоста свидетельствует о возникновении субдапу . ляции клеток с меньшим по сравнения с контролем значением подвил

ЮОт %

;)о яо

1

.г-''''

К

// £

йО

/

у-

1*1 31

по |

«50 |

4<>

1 /

Л

у

г

у,-/

О ------

П5

'КЗСЯ

■'О !

30

о

'У' .....

•3

(г?

т

•гаси

■44

Рис.6. Ктшотнка гибели тагацитов краен поросенка [¿¿г) пое-

ло облучения в дозах 10 л Я Гр соответственно.

"|.-"<2С-клетки", 2-клотки деградаровшшой ДНЯ, З-клотки, лрогещаемне для ЕВ. По оси абсцисс ■•• время после облучения ■■/¡пои), по оси ордшпт ■• количество клеток (,%).

ности -Х.7 и « -й.О ««.с"1 •В~' «см соответственно). Видно, что кинетика накопления клеток с проницаемой поверхностной мембраной и уменьгсовдщ отрицательного заряда клеточной поверхности имеют сходней характер. Это позволяет предположить, что оба процесса есть (•лодотб'-то структурных перестроек белково-липидаого комплекса в мембранах облучённых клеток.

/

•1

о----

Рис.7.

Изменение поверхностного заряда клеток тимуса (I) и селезёнки (2) крыс после облучения животного в дозе 10 1р. По оси абсцисс - время после облучения (часы), по оси ординат - электрофоретическая подвижность клеток

(МКМ'С"1.« В~1 • см)

Видовые особенности пострадиационной гибели лимфоцитов.

Следует отметить, что большая часть результатов, касающихся закономерностей апоптоза как in v'.vo, так и In vitra, была получена на лимфоцитах грызунов. Вопрос же об универсальности этого явления имеет принципиальное значение для понимания механизмов клеточной гибели. Мы облучали в летальных дозах клетки тимуса человека и животных разных видов. Во всех случаях происходит накопление клеток с деградированной ДНК (рис.8) и деградация ДНК носит упорядоченный мекнуклеосомный характер. При этом, однако, наблюдалось различие в кинетике клеточной гибели. Мы сравнили кинетику гибели лимфоцитов крыс и поросят in vivo (рис.6,а,б). Показано, что качественный характер кривых гибели лимфоцитов одного типа (тимоци-тов или спленоцитов) по критерию "меньше 2С" совпадает, однако степень гибели популяций неодинакова, что кокет быть следствием как различной радиочувствительности лимфоцитов у разных видов животных, так и видовой специфичности в отношении кипетики гибели. Последняя особенность может быть обусловлена различием в степени фрагментации и скорости элиминации погибших клеток (наш было обнаружено существенное отличие по этим параметрам у клеток тимуса крыс и мышей). Сравнение кинетики гибели тимоцитов крыс и поросят в системе In vitro (рис.6,6,г), где на происходит образования апоптозных телец, по-видимому, отракает истинную разницу в скоростях гибели популяций клеток тимуса в организме: тимоциты поросёнка гибнут в более поздние сроки, чем тимоциты крысы (гибель в конролэ 12

t !

i'yic- Д1!:1 ■ гмтграмш тшоцйтой крнон (о), поросбкка (о), толётс« {(<) у уолонока (г) чсрок 2f чзса после облучения в .вйтль--i»JX доыас. Обознячови:; щ> ооя<* то ке, что и im рис,?..

;.оо> рпссмотредаи.ч. случаях деградация хроматина Miwumww (.лсрг.кйяу уяоличсядап мткжицаекост'т »таяматичостсоЧ

!■,;>> я«>яоталч£ vw> ш<опвто ывкюяы к<лчш».чп», •нягмлчторя оборки wnqxrtjtyftww» млдул.чруот товмь vaosit к.мото«иол попултгдп,.

•сидуса, 1'!Л,1:С!.'.Г:1Т>(15; ИОСТИОГи fW)';» ,ч a^hiWUTOit 'J'oimo.w »МЯЮЧЛВД» «л

типу шшоти тболг, клеток шигоноуда^'л-.к ушредоадгк.'ой мтук лсоаатой фртчмнахвпй вдорпп« дщ м :имм'.тшгибй л« jui£ ■

.'0)5 XpOf.iOT'ffllH. Л/ХЩСООП "»ЛИВИП^ОЯ 1»VOAO ■•'.!> -VliWrtJOTO j'.ili1 -

^ергюдя к опгзТ.^ачй';' yr;o.i;i"l-!OiJ!M! :мро»«)тс;ж;о'.га ълпчй/ссмч^счгпц ¡¿оиб-jiailü К.';СТОТ. д.»!!) №». ДНЯ WO.il,П.^ОДУО'.! JitiO^i.tilf^-if-i JilIl№.(>HTO-

pa (¡o,iitit>№)vi umwtr. .

ciTlij Л Ti-Üiiii .WVr'OKi'i'ypt.m ,'i.VfjlHIJv '.Mf.\!i./Ai-'.:: Vf>üng;ivV.;b:njiL

i«if>) позволит высказач^ .''i^n0>i<*:or>VR; о голодно'* )ч>»м pnatfejw. ■'Ш^отрубочек как jiyc.j'.t!!«"!)'-!! дик н тхглч кис.--

ток, Чтобы убОДЯТО!; у! ¡no« hotfoopo.howwmo, .'i' .«»«оясдявялч яяоддо на яялоциты in nitre wonw«, т^я^ч^щие^л лслодх'йяйуацаг». сол, D O) и сборке шжротрубо^ш; >кгшсто>к), »юляя^&ъации

Г.оет.юкнал рлм. )1.«тос:;шлити

= )1рОГ(1/ЙЙ.«1 КлСЮЧПОЙ ГЯбвДН,

микрофиламентов (цитохалазин И). Установлено, что ни один из этих агентов но оказывает влияния на процесс; деградации хроматина в контроле к поело облучения- i'.о,, микротрубочки и мккрофиламенты, по-видимому» но участвует п пусковых к начальных этапах аноптоза tn vi tro. Индукция iwOgjik клеток при действий колхицина ln vivo, вороятное ость следствие ого опосредованного действия.

Особенности аноптоза нролиферируицих «лоток тимоми HWí> ¡ 4?.

Закономерности апоптоза подробно изучены на примера интерфазной гибели слабо пролифорирующих лимфоцитов, тем не менее, апоптоз характерен и для различных обновляющихся тканей и опухолей. Мы исследовали особенности "программируемой" гибели пролифорирующих клеток па примера тимоми мыши BW5147- Было показано, что под действием 7-облучения и дексаматазона клетки тимоми гибнут но типу апоптоза: гиболь сопровождается упорядоченной можнуклоосомной фрагментацией ДНК и кинетика накопления клеток с деградированной ДНК опережает (в случае 7-облучония) и совпадает (при действии дексаматазона) с ростом доля клеток с проницаемой наружной мембраной. Однако отличительной особенностью наблюдаемого процесса явля -ется длительный лаг-пориод (1й часов) и задервка продвижения клеток по циклу в С£/Ы-фазо после облучения и в о - и г: с /и-фазах с. присутствии гормона (рис.9), Н обоих случаях доля погибших клото;; .в популяции составляет около 50%, что может биту, обусловлено характером дифференцировки клеток тимомы.. Показано, что кинетик? гибели клеток в обоих случаях, зависит от среди культивирования: наблюдается сокращение лаг~порщцэ в средо о низки;,! (2%) содержанием сыворотки до 3;6 часов.

Наиболее существешшм представляется boujwc о ¡взаимосвязи цитостатического и цитолитичоского эффектов. Опытн со скопой среды (удалением гормона из среды культивирования) показ mam, что цито-статическое действие дексамотазона моют проявляться и в отсутствие гиооли клоток. Неясным оптайтся, является м вадоржа клеток г, цикле необходимым условием программируемой гибели пролифорирующих клеток. Мы провели анализ динамики и гибели популяции клоток тимо • мы я присутствии дексзметазо1ш котодом имитационного моделирования (функциональная схема популяции представлена на jjkc.I,«). Исследовались елодующие предположения о поведения скстогяп (I) горной вызывав!1 задержку всех, (или части) «лоток ¡¡ il&ata G, и o?/i,¡; (3) гибель но связана с продъшашон клеток ко циклу и (Я) гибель про исходит поело деления клетки- Цродполояошю (I) исследовали, 14

•(О

но

%

о

N

\

/о

X

/ \

JT

iz

»г

ЧШ1

и;

'40

iva.iK Ктиюгмк* ыякшлсшш клеток в о„/и фазе (I), клеток с деградированной ДНК, (3) и проницаемых для трипанового синего (3) r/оолп облучения клеток тимомн мыши BW5147 в доое 10 Гр - а,

■л лр'л инкубации « «зксаиотазонш (IQ"6 М) - б. Точки -- дан-шо цитоммричсского анализа, пунктиром показаны результаты •-ХКСЛ01ШОГО кодольного эксперимента. Обозначения по осям те

:'в.. wo sis pwfi.o.

уголичиная мездшшю длительность фаз о, и ог/и, предположения (И) » (3) - гаръируя вероятность гибели клеток из Gf (.Р) и ско-poow. элиминации погибших клеток (а). Модель адекватно описнвает дапкк'о изометрического анализа (рис.9), если цредоолсшть, что диитолышоть фаз ъ и?Л1 увеличивается соответственно )! 1.8 л З'.З pass по ораввепш и контролем, нри атом гибнут лишь дочерние is лейте (Р •■• Од;)» lie достаток тракторов роста при культивировании в сродо, содержащей Ш оигаротки, привода- к сокращению времени за-дерзиш (ддитолыюсм. фай увеличивается соответственно в 1.2 и I.I рапа) ]г, как следствие, Оожю ранней гибели клеток,

Соводуппость полученных данных подтверждает предположение о гам, что щтостатичоскяй аффект есть необходимое, да но достаточно условие гибели клеток. Длительность задержки, возможно, определяется временем г необходимым для переключения клетки с программы пролиферации на программу габож, что может быть причиной более дательного лаг-периода в случав лролиферирухщих геле ток тимомы в сравнении со слабо прашфзрирущиш лимфоцитами тимуса.

выводы

I..Предложен способ оценки жизнеспособности лимфоцитов in vivo, позволяющий проводить анализ гибели клеток в репопулирувдю органах. Способ основан на определении размеров клеточной популяции и выявлении клеток с деградированной ДНК методом проточ ной ДНК-цитшэтрии.

2» Показано, что интерфазная табель ликфвдных клеток разных ввдо1 животных и человека сопровождается мазшуклеосомной фрагментацией ДНК. Пострадиационная деградация ДНК в тшоцитах предшествует увеличению проницаемости их плазматической мембраны. Кинетика гибели лимфоцитов крис и поросят имеет близкий характер.

3. Установлено, что In viva пострадиационная гибель тагацктов со-нровоздается разделением погибших клеток на кембрано-замкнутно фра:'менты с посладущой элиминацией их из органа. Методом имитационного моделирования доказано, что габнугцая клетка распада ется случайным образом в среднем на 3-4 ДНК~содержащих фрагмента, которые регистрируются в органе в точение ~ 5 часов. Гибель тимоцитов in иtiro но сопровождается фрагментацией клеток.

4. Показано, что 7-облучениа вызывает уменьшение отрицательного поверхностного заряда лимфоцитов тимуса, селезЗнки и костного мозга крыс, коррелирующее с нарушением проницаемости плазматической мембраны клеток.

5. Исследована возможная роль цитоскелота в реализации прогрзьади клеточной гибели. Показано, что деполимеризация шкротрубочех и шкрофиламентов не является пусковым механизмом деградации ДНК и гибели тимоцитов in vttro,

6. Установлено, что 7-облучение и дексамотазои вызывают гибель но типу апоптоза ~ 50% популяции клеток тимомн мыпш BW514'/. Гибель наступает после 12-часового лаг-периода, сопровождается межнук-леосомной фрагментацией ДНК, которая происходит в клетках с интактной плазматической мембраной. На основании анализа ДНК-гистограмм и и данных численного модельного эксперимента показано, что дексаметазон вызывает задержку клеток в G1 и Gg/Ы-фазах клеточного цикла соответственно в 1.8 и 2.3 раза. Задержка клеток в Gg/Ы-фазэ является необходимым, но не достаточным условием перехода клеток от пролиферации к гибели.

7. Разработан метод деупарамзтрового (ДНК/мембрана) цитоматричес-кото анализа клеток с использованием липофкльных флуоресцентных зондов. . . ,

Стшсок основных работ, опубликованных по теме диссертации.

I. Матылэвич Н.П., Ивкова М.Н., Печатников В.А. Ивков В.Г. Взаимодействие флуоресцентного зонда dis-03~(5) с лецитин-

холестериновыми . мембранами. 1936, Биофизика, т.31. вып.6, с,997-1000.

Z. Мэталевич Н.П., Ивкова М.Н., Печатников В.А. Ивков В.Г. Особенности потенциал-зависимого ответа карбоцианинового зонда diS~c3~(5) в суспензиях холестеринсодержащюс мембран. 1988,

Биофизика, т.32, вып.6., с.1013-1017. 0. Афанасьев В.Н., Король Б.А., Матылевич Н.П., Печатников В.А.» Уманский О.Р. Захданомерности индуцированной колхицином гибели лсмфоидкых клеток. 1988, Цитология, t.3q, N9, c.ii03-iii6. L "atylevich N.P., Rochev Ya.A., Pechatnikov Y.A., Savriljuk 3.K. Plow cytometry of differentiated keratinooytes. Intranational meeting "Physical characterization of biological cells", "ostock, 1988, Book oi abstracts, p.39. 5. Лйаносьев Г?.Н., Король 3.A., Матылевич H.il.„ Печвткикоз З.А., Сорокина H.'i., Уманский С.Р., Филиппович Й.В„ Общие закономерности и различия, постпадиадиационной гибели лимфоцитов разных лядов животных и человека. 1939,. Радиобиология, т,28, Ш, с.731-736.

о. Psoliatnikov Y.A,, Afanasyev V.N., Korneev V.K., Korol' 3.A.r «'atylevich H.P., Umansky S.R. Death, oi lymphoid cells. New approach to analysis of injurities. XIX Yugoslav symposium on Viookysics, 1983, Book of abstracts, p.37. 7. Матылебич н.п., Афанасьев з.н.» Король б.а., Рочез Ю.а. У-'.асж клеточных структур в процессе апоптоза, индуцированного ^-облучением в лкмфоидкнх клетках. I Всесошый радиобиологический съезд. Тезисы докладов, тЛ, с.155. Матилешга К.П., Афанасьев В.К,, Король В.А., Рочев ю.а. Сходство фэьюлогической гибели клеток и табели, индуцированной покссгдазщймк агента?,®, 1989. Шйотм. бюлл. радиобиологии, mm".36, с.I3--I-",.

S. P.oonev Yu.A., tf.-itylevioh К.?. Mathematical model of keratino-cyte differentiation in vitro. Ill International Meeting of Young Scientists, Prieros.DDR, 19S9, Book of Abstracts, p.39. Ю. Матылевич И.П., Король В.А., Нелипович П.A., Афанасьев В.Н.,

Умйыокий С.Р. йвгибированиэ Вг0 интерфазной гибели тимоцктов.

ТЯро, Гэдиобиология, Т.29, Кб. .

11. Aianauyev УЛ., Korol' В.А., йгшаап I.I., Katylevioh Н. Р.,

?eo)uitrdkov V.A., Umansky S.R. Relationship between coll proliferation and cell death- In: "fiodulat ing factors in awl I lata«; chemical carcinogenesis." Plenu'.r. Press, li.Y., 1990,

12. Чруман Матклошч Ю. .Афанасьев З.Н., Уманский С.P. Репродуктивная гибель оолуч&шых клеток т.л'омы BV/5147 по типу зпсптоза. 1990, Радиобиология, т.29, Мб-

£0.06.90 г. Зак. 2767? Тир. 12а ока. Уч.-изд.л.- 1.0 Отпечатано «а ротапринте в 0НТИ НЦБИ