Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рост и морфогенез в культуре неоплодотворенных завязей пшеницы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Рост и морфогенез в культуре неоплодотворенных завязей пшеницы"

ГЛАВНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

На правах рукописи УДК 581.1.035.

МУХАЛ1БЕТЖАНОВ Сернк Копжасарович

РОСТ И МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУ®* НЕ0ПЛ0Д0ТВ0РЕННЫХ ЗАВЯЗЕЙ ПШЕНИЦЫ

03.00.12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата, 1992

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Казахского государственного университета им. Аль-Фараби.

аучныи руководитель

доктор биологических наук, профессор И. РАХИМБАЕВ

Официальные оппоненты: — доктор биологических наук,

л. к. лимонов

кандидат биологических наук, 3. АЙТАШЕВА

Ведущее учреждение — Казахский научно-исследовательский

институт земледелия им. В. Р. ВИЛЬЯМСА.

Защита состоится 29 мая 1992 г. в 14.00 часов на заседании специализированного Совета при Главном ботаническом саде Академии паук Республики Казахстан по адресу: 480070, Алма-Ата, ул. Тимирязева 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Главного ботанического сада АН Республики Казахстан.

Автореферат разослан « лС_? » _ _1999,-.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

АЗАРЕНКО

ОБЩ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЮК

Актуальность проб л омы. Б последние годи в физиологических исследованиях ocodoe шимие уделяется кул муре репродуктивных органов - пнльн'иков, завязей и семяпочек. Интерес этот обусловлен тема большими якспершентальншл возможностями, которые открывают метода культур! изолированных тканей для фундаментальных исследований н прикладных разработок по Оиотезшо--логин и физиологии. Б теоретнчеокш аспекте особую актуальность приобретай? познание механизмов переключения х'аметофатов на спо1>-офитннй путь развитая, а в практическом - совершенствование гаплоидной технологии для быстрого создания новых сортов в процессе селекции.

Интерес к культуро завязей и с шапочек обусловлен шюпк.-.и причинами. Так, культивирование завяэеД мужски стерильных раотёН -nli начнется единственной возможностью для получения у них гаплоидов (/¡ад, ^ñou , 1982) . венский гамотодтг может явиться источни-icrsj получения гаплоидных регенерантов у тех растении, андрогенн-uá каллус которнх обладает низкой мор1югеиетической потопшей (Павлова, I{jû7 ) . Частота регенорапри зеленых растшни в культуре несшшдотворшш.х завязей выше, чем из пыльников (ISyrapa, Русины, l'.'bb). С раин ит ильное изучение растений, регенерировавших из гшль-nobujt зерен и ниогшодотБореиних завязей показало, что среди i'.iuo-Генетических растений процент шшондов выше, чем cJhiuh растении, иил^чишшх в результате шщрогеноаа ( ¿«и Пошил, Ai«r..»(ii , 19СО ) .

Сиичас 11|ш.одятсн исследования, направленные un да«!.иейш«е соь(ц.иь»«тьо1ни1И1. катода культуры иеошшдот;н>рпишх ¡««ияаеЁ я се ; hiki iijh. Г.днгко, раооты нронч'.кмые в атом ннпраы;« инк ¡h»v:'í

рическпн характер. Это неизбежно, пока нет глубокого теоретического знания сущности физпологкч оских процессов, протекавших в культуре венского гачет офита, в частности, недостаток знаний о закономерностях протекания, морфогенеза б культуре изолированных завязей, что в значительной мере тормозит разработку метода. Пра этом в ряду других проблем - актуальна! является изучение факторов , "переключающих" кекскну. гаг.ето^кт на елороУитнш. путь развития, ó тот вопрос остается открыты:,', для такой в.<укнок хозяйственной культуры, как пкеклца.

Цели и задачи. С учете:/, этого, целями предпрг. пятого нами исследования явились:

1 в теоретическом аспекте - выяснение некоторых закономерностей морфогенеза в культуре неоплодотворенкых завязей лшениш;

2 в прикладном аспекте - поиск возможностей совершенствова-ная методов и приемов культивирования неошходотворенных завяяои. пшеницы.

Для достижения указанных целей необходимо было решить следующие задачи:

I' обнаружить генотипы пшеницу с внеокои отзывчивостью к культивировании для их использования в экспериментах;

2 усовершенствовать некоторые процедуры культивирования не-ошюдотворенных завязей пшеницу путем подбора оптимальных питательных сред, срокоь изолирования женского гаметофита, условии и способов культивирования;

3 изучить особенности роста и развития неоплодотворенных завязей в условиях in vivo и in vitro;

4 выявить пу*1и развития женского гамета^ита, приводящие к реалкьаиди морфогенеза.

Научная новизна. Обнаружена возможность индукции аподиктического развития' у изолированного женского гяистофи-та пшеницы. Ранее на экспериментальную возможность получения отдельных элементов апомиксиса у пшениц* указывали З.А.Подцубная-Арнолзда (1564 Д.О.Петров С1СР8 ). Однако, б этих случаях речь тг только о партеногенезе, визьшает.см при задеркке опыления пли при межродовых скрещиваниях. Нами впервые показана возможность индукции в культура изолированного менского гаметофита не только гиногенеза, но и апогачетии, нуцеллярной н штегумеятальной эмб-рионии. Крокд того выявлено, что к новообразованиям способны соматические клетки тканей стенки завязи и рнльщ пестика.

Получена дополнительная информация 'о порядке и сроках деге-нерацж зародышевого меша, завяза пшеницу как в естественных, так и в условиях культуры. Установлены различия в степени развития зиготических и апомиктических зародышей, в пх морфологии.

Практическая ценность. Полученные результаты могут иметь такие и практическую ценность для дальнейшего . совершенствования методов культивирования неоплодотворенных завязей. При этом мы нмеш ввиду следующие данные прикладного характера. Нш удалось выявить генотип (Саратовская 29 ) обладавший высокой моррогенетической потенцией.

Для культивирования неоплодотворенных завязей пшенида наиболее пригодной является питательная среда Мурасиге и С куга с учетом наших модификаций. Необходимым является присутствие в среде 2,4-Д в сочетании с ИУК и кинетиноы. Применение сахарозы в качестве трофического и осмотического фактора в концентрации - 30 г/л дает наиболее положительные результата.

Показано, что женский гаметофит пшенида способен к реализа-

ы'га слое го моррогенетического потенциала на всех стадиях своего развития, однако лучшими являются поздние стадии.

Апробация работы. Материалы диссертации долоя;-Ы1в на сессии Научного совета ВОГис (Алма-Ата, Ш<8), 20 научной ¡и>н|,ереяций молодых ученкх биологического факультета MIT (Москва, П'Ш), XI Международном симпозиуме по ауОриологки и семенному ра-¡аднокению (Ленинград, ISS0), Всесоюзной научной конференции по биотехнодопи (Целиноград, 1^91).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 7 глав, е которых приведены: обзор литературы, материалы и методы, а также основные результаты и их обсуждение, вывода. Работе изложена нпЦО страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, иллюстрирована 27 рисунками. Список литературы включает 149 источников.

МАТЕРИАЛЫ и метода исслвджия

Сбьекгоы исследования служили неоплодотворенные завязи пшеницы. Б экспериментах по изучению роста и морфогенеза неоплодот-ьоренных завязей in vitro в зависимости от комплекса факторов генотип исходного материала, стадия разьития донсряого растения, холодовая предобработка эксплантатов и способы их культивирования , испытаны 17 сортов мягкой пкеници, t межвидовых гибридов, а также 13 линии отдаленных гибридов пшеницы с эгилспссы.

Колосья изолировала на равных фенологических фазах развития растения: трубкование, начало колошения, конец колошения. Основания срезанных колосьев погружали в воду и въдаеряивали в холодильнике при температуре 4-7 °С в течении 16 дней. Периодически, каздие 4 дня завязи вычленяли из колосьев и переносили но цитат-

елыше среди.

Для приготовления питательных сред и стерта запзи материала и инструментов использовала общие методические принцип« и приемы, списанные Р.Г.Бутенко (1564), Ф.Л.Каллшшш н др. (1980), И.Р.Ра» хиибаевым с сотрудниками (1583).

Питательный среды готовила по прописи Мураеиге д Скуга. Щит -иМес, Зкоо^ , 1962), Ху а др.(с1п. е+ с.1 .. 1975), Мнллера ЩНег , 1968), Пэта (ппкси , 1951), Уай'Га ('.'.'МП, , 1943).

Для приготовления цнтоенбрислогаческих препаратов пользовались общепринятой методикой, описшшой В.П.Паугаевой 1908 . Матерная фиксировали в смеси спирт этиловый (70 %) - 100 мл, лодочная уксусная кислота - 7 мл, формалин - 7 мл. Средняя толпглна срэкоь - 16 нкм. Окраску препаратов проводили реактивом Шнфп (по Фвльге« ну) о подкраской гшотоисплисом по Эртаху а аяциаиошм синем (Дненсеа, 1965).

Препараты просматривали под микроскопом МБ1-15. Фотогрефиро-ваий на фотопленке "Микрат-200" при различных увеличениях в зави~ снмости от целей эксперимента.

Бее экспериментальные данные статистически обработан» о применением общепринятых методик.

ВЛИЯНИЕ ШЮТШТА НА РОСТ И КАЛЛУСОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ

НЕОШОДОТВОШШХ 2АБЯ?Ш ГШЕНИЩ

На образование кадлуса генотип докориья растений оказывая существенное влияние. Высокая частоту каллусогенеза омочат у сорта Саратовская 25 (19,4 %) и у сорта Казахстанская 7 (3,0 $5 на среде М}рнеиге и С куга. Необходимо отметить, что на ершь инвдкда ^аллусогснвзд била незначительной но сдаюнш со ср«?аоЗ

Мурасиге к Скуга. На среде II6 формирование каллуса с частотой -0,7-2,1 % вызвано только у трех сортов (Саратовская 29, Целинная Юбилейная, Казахстанская Ь) и о десяти испытанных, аналогичная картина наблюдалась при культивировании завязей межвидовых гибридов. На среде Мурасиге и Скуга число завязей, способных к калл-усогенезу, у тестированных межвидовых гибридов, варькрировало от 2,1 % у К 36346 х Гостианум 88 ( Г2 ) до II,5 % у К 1С55 х Гостаан-уы 88 ( Г2). Ка среде Ы6 только 3,9 % завязей гибрида Казахстанская Ь х Грекуг( 476 ( Г3) и О,С % завязей гибрида Казахстанская 4 х Грекум 476 ( Тд) били способны к формированию кгллуской ткани. Остальные генотипы такой способности) не обладали.

У межродовых гибридов наиболее высокая частота каллусогенеза вызывалась на обеих средах у следующих генотипов: Безостая I х Ае.су11пси'1са(ДГ 634 ( ) (20,0 %) на среде Мурасиге и Скуга и 15,2 % - ка среде Ы^. Выход "каллуенои ткани при культивировании на среде Мурасиге и Скуга по сравнению со' Хр погашался с 10,1 до 2,8 % у Безостой I х Ае. ЧЦГ. 333 ( Г3 ),с 8,8

до. 0. % у Безостой I х Ае. triaгistata (ЦТ <333 д 1314 ( Г4). Генотипы Безостая I х Ае. triагistаtа (ЦТ 1072 ( Т6 ) и Безостая I х Ае. суигкЫса (ЦТ 434 д 23 ( Т6) не бклк способны к кзллусо-генезу ни на одной из испытанных сред. Зто монет свидетельствовать о тем, что по мере повышения уровня гокозиготности у гибридных поколений снижается гетера зисный эффект по признаку "способность к каллусогенезу". Установлено, что в отличии ст сортов и ыеньвдовых гибридов, у межродовых гибридов для индукции каллусогенеза благоприятнее среда Ы6.

Проведенные нами эксперимента показали зависимость каллусогенеза от генотипа исходного растения. В процессе культивирования неоллодотворенных завязей пшеницы большинство исследованных

генотипов облгчата способностью к формированию каллусной ткани, но частота каллусогенеза била высокой только у двух генотипов -Саратовская 25'' 19,4 %'■ и Безостая I х Ае, суИтЭгиа (ЦТ 634 ( (20,С %). Установлено, что гибриды обладали более высокой частотой индукция каллусогенеза по сравнен?» с сортами, однако по пере стабилизации линий. в последующих поколениях этот показатель снижается.

ЕИЫЩ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СР53£> НА МОКОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ

!!ЕОШ:О^ОТВЭРЫЖХ ГЛВЯЕЫ1 ШЕ1ШШ.

Б нагом эксперименте, по обыей концентрации минеральных элементов, рааппчата среды с вксокьм и низким их содертаяием. К первой группе относятся среды Мурасиге я Скуга, Ко второй -Уайта, »".аллера и Нпча.

Влияние минеральных питательных вешеств на культуру изолированных завязей особенно сильно проявлялось при индукции процесса эмбриоцдогенеза. Образование эыбрисядов, так ка как и формирование каллусной ткани, протекало только на твердых средах с высокой обшей концентрацией солей. Эмбриспдогенез нами был обнаружен у завязей двух сортов: Саратовская 29 и Саратовская 42 па среде а на»среде Мурасиге и Слуга - только у завязей сорта Саратовская 29.

Шест о с тем следует отметать, что прагстовлеггае сложных по минеральному росааву питательных смесей не всегда дает положительные результаты. По-видимсыу, не всехда удается учесть всо элементы, необходимые для нормального протекания процессов жизнедеятельности клеток вне организма. Это касается и культуры неовло-дотворешшх завязей пшеницы.

Одним ля действенных факторов, вдшвдаа на реализацию тоти-

иотентности. культивируемых клеток и тканей является гормональный' состав сроды. Б культуре изолированных завязей а семяпочек широко используется пркндап комбинирования ауксинов и штоюшинов. Такая комбинация фитогормонов ( 2,4-Д 4 ИУК + кинетин) может оказаться наиболее прнемдимой для культивирования кенского гаметофита ¡ше-ш1ш.

Для решенкя это*. задачи наиболее эффективным является метод математического планирования эксперимента. Нами был поставлен эксперимент по схеыаы ортогональных латинских прямоугольников, где тестировалось тра фактора( 2,4-Д, КУК, кинетнн) на 12 уровнях. В таблице I приведены наиболее оптидальные для культивирования соотношения фитогормонов.

Тайлида I

Влияние соотношения различных фнтогормонов на ыорфогенетпче-ские процесса в культуре неогиодотторенных завязей пшониш сорта Саратовская 29 (среда Мурасиге н Скуга).

ы$Д ! КаЛЛ5ТГеНе3 ; Вюогенвв ; эмбриогенез

2,0 . 6,0 8,0 0 - +

3,2 3,6 ' 4,0 41,7 + 1,7. - -

4,4 2,8 10,0 50,0 + 2,Ь - +

2,6 . 2,0 6,0 11,6 + 3,6 . - +

Ь,2 . 3,8 0,2 25,0 + 1,5 - -

Ь,0 4,4 2,0 11,7 + 0,7 - -

3,8 4,4 6.0 21,7 + 3,3 - -

5,0 . , 3,6 0,2 28,3+ 1,9 - -

3,2 _ 2,8 В,0 0 - +

2,0 " Ь,2 4,0 ' 23,3 + 1,8 + -

На среде, содержащей 4,4 ыг/д 2,4-Д, 2,8 мг/д ГОК, 10,0 мг/л

кинетина к&члу .огенез индуцировался с максимальной частотой -¿0,0 %. Такой высокий выход Каллуса в культуре изолированного женского гачотофита, ранее отазчался только у представителей семейства мотыльковых (Роп1«са,' 31иза-г5с1еуг.1е2^йГ21па • 1287). Кроме того, на этой среде иддущровалось развитие зародыш из клеток яйцевого аппарата. Каллусогенез с высокой частотой (41,7 % ) отмечен на среде с 3,2 мг/л 2,4-Д, 3,6 мг/л ИУК, 4,0 мг/л юшетгаа.

Интересно отметить, что эмбриогенез вызывался из разных структур и тканей кенского гаметофита, в зависимости от соотношения гормонов. Ка. среде, вклэчаощей 2 мг/л 2,4-Д, 6 мг/л ИУК и 8 мг/л кинотина зародыши образовывались из клеток нуцеллуса и внутреннего ынтегумента. Внесение в среду культивирования 2,4-Д в концентрациях 2,6 и 4,4 мг/л, ИУК - 2,0 и 2,8 мг/л, кинетана - 6,0 и 10,0 мг/л приводило к изменению в программе развития клеток яйцевого аппарата. Соотношение 3,2 мг/л 2,4-Д, 2,8 мг/л МУК, 8,0 мг/л кмнетина инициирует клетки яйцевого аппарата и антипод формировать зародыша. Среда, содержащая 2 мг/л 2,4-Д, 5,2 мг/л ИУК и 4,0 мг/л кинитнна инициировала образование корней непосредственно из завязей.

Из результатов проведенного эксперимента можно заключить, что жидкие среды обеспечивают максимальный рост завязей, тогда как только на твердых средах наблюдается калдусообразование и эмбриогенез. Наиболее отчетливо влияние минерального состава сред проявляется при индукции каллусообразования и зародышеобразования , тогда как в процессе роста растяжением больших различий мезду средами не бшо. Поэтому можно полагать,' что низкая концентрата солей не препятствует росту завязей," тогда как потребность в высоком содержании солей возрастает при каллусогенезе и эмбриоидо-

генезе.

Результаты эксперимента показывает, что в присутствии ИУК и кинетина активность 2,4-Д возрастает. Креме того выявлено, что морфогенез в культуре неоплодотверешщх завязей пшенигл зависит, преимущественно, от концентрации регуляторов роста. Если концентрация кинетина била высокой, то стим/лкровелся эмбриогенез. При этом интересно отметить, что если су?,мерная концентрация ауксинов была равна концентрации кинетина, то зародкии образовывались из соматических тканей нуцеллуса и интегумента. Если содержание ки- ' нетина в среде было большим, чем ИУК и 2,4-Д клесте взятых, наб-лвдалось образование зародышей из клеток конского гаметофита. При высоком отношении ИУК к 2,4-Д и кинетиьу о бы арутавала сь тенденция к инициации корней. Отсюда следует, что для успешного культивирования неошюдотвореннкх завязей пшеницу необходимо присутствие в среде одновршенно ауксинов и кинетика.

ВЕШНИЕ СТАДИИ РАРВИТШ ЕЕНСКОГО ГАМьТОФИТА НА КШУСОГЕКЕЗ

В КУЛЬТУРЕ НЕОПЛСЩОТБОРЕНКЫХ ЗШРЕ! ШЕНИф.

Целыо данного эксперимента являлось определение оптимальных периодов в развитии зародышевого мешка, наиболее отзывчивых на индукцию моррогенеткческих процессов в культуре неоплодотаоренных завязей пшеница. Для этого были поставлены эксперименты по изолированию и культивированию неоплодотворенных завязей у различных генотипов пшеницы. Завязл изолировали из колосьев растений находившихся на разных фенологических Фазах развития. ?авяза культивировали в течении 2-х месяцев на среде Мура сиге и С куга с добавлением 2 ыг/л 2,4-Д.

Выделение зародышевых мепков методом ферментативной мацерации. позволило нам установить определенную херрелядав между разв-

ЕК

КК

8 -1

4 -

ХП_

гЬ г*1

гЬ

гТх

1 2 3 4 5 Б

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

8 ■

4-

гЬ

А

И

гЬ

Лй1

А

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 генотип

12 3 4

Рис.1. Зависимость каллусогенеза в культуре неоплодотворен-ных завязей пшеницы от стадии развития растения донора.

. Т - труб^ование: НК - начало колошения: КК - конец колошения.

А - сорта: I - Саратовская 29; 2 - Саратовская 42; 3 - Казахстанская 5; 4 - Казахстанская 7; 5 - Казахстанская 8.

Б - межродовые гибриды: X - Безостая I х Ae.tri.arie-СШТ' 333 д 1319 (!,)', 2 - Безостая I х Ае.суи-П4г1са (ЦТ 434 д 23 < )"? 3 - Безостая I х Ае.

оуПпсЫса (ЦТ 434 (Р6) ; 4 - Безостая I х Аелг1а~

ri.ata.ta (БГ 333 {Г^ ; 5 - Безостая I х Ае. еуипа -

(ЦТ 434 Д 1282 (Р3) . "

О

итием женского гомета].ита и растения в целом ( тайл.2 ). Б фазу

Таблица 2.

Взаимосвязь менду Фенологической фазой развития растения и стадией развития зародышевого меска (сорт Саратовская 29).

: Общее :Кол-во зародышевых мешков на стедда:

Фаза :кол-ъо ввде-:----—-------- — — —

¡ленных заро-:одко-:двух-¡четырех-¡восьми- : развития :дыаеькх меш- :адер- :адер- :ядерной : ядерной ¡зрелой :ков :нои ¡ной : : :

Трубкование ЬО 3 10 37 0 0

Наложение

начало 51 0 0 4 41 , 6

Колошение

конец "Ю ООО 13 £7

трубкоьашя зародышевый кешок Есенины проходил путь от одноядерного до четырехвдерного состояния. Больиннскзо колосков содержало цветки с четырехядерным зародышевым мешком. Начало фазы колошения характеризовалось^ основном, восьмкядерным зародь-шашм мешком. 3 конце Фазы колошения преобладающее большинство колосков имели цветки со зрелш зародышевым мешкал. Эта фаза наступала за 1-2 дня до цветения.

Полученные данные свидетельствуют о том, что индукция калл-усогенеза возможна на разных стадиях развития венского га-.!с;сбита шеницы, в отличии от андрогенеза, когда оптимальной является только стадия одноядерной шшроспоры( рис. I). Для большинства исследованных сортов каллусообразушая активность выие у растении в конце Фазы колошения. У межродовых гибридов наибольшая каллусообразушая способность в культуре неоплодотворенных завязей на Зло дается в начале фазы колошения.

ВШНИЕ СГЮСОЕОВ И УСЛОВИЯ ШЬТИВИГОШШ НА КАЛЛУСОГЕНЕЗ.

В'КУЫЛУРЕ КЪОШЮДОТЬСЙНШХ РАБЯРЕп ШИЕШ-ПШ.

Для изучения влияния холодовой предобработка материал б виде срезанных колосьев помешала на 4, 8, 12, 16 'суток при 4-7 °С в воду. Контролем служила колосья не подвергавшиеся воздействии низких положительных температур.

Эксперименты показали, что процесс каилусообразопагои положительно коррелировал с продолжительное«® обработки. Выявлено, что диапазон проявления действия холодовой обработки на индукцию каллусогонеза у межродовых гибридов лежит в пределах от 8 до 12 дней. Наиболее эффективный был 12-ти дкевжй режим холодовой обработки.

Установлено, что разные сорта нуждаются в менее длительном низкотемпературном воздействии. Так, 4-8-ья дневная предобработка способствует формироьаша каллусной ткани, причем, оптимум приходится на 8-ма дневный ретам.

В ходе эксперимента показано, что метродовне гибриды нуждаются в более длительной инкубации при низких положительных температурах по сравнении с сортами. Однако з обеих случаях выдерта-ванне материала свыше оптимальных сроков оказывает ингибирушее действие.

Еавязи культивировались двумя способами. Первый способ: завязи помещали на поверхность питательной среди ркльгем пестика вверх, то есть с сохранением естественной ориентации. Этот способ был назван - "вертикальное культивирование". Второй способ -"горизонтальное культивирование", когда завязи помещали на среду в боковом положении.

.Культивирование за"л:'ей в вертикальном и горизонтальном по-

ломенкц в равной степени приводит к их набуханию в первые дни культивирования .10-15 дней . При дальнейшем культивировании в горизонтальном положения завязи прекращали рост, зате:л начинается их некроз, Это, по-вэдимому происходят вследствие того, что стшка завя зл в отличии от стенки шльшжа ойладаэт бате о низкой способностью к адсорбдая питательных веществ. Культивирование завязей в вертикальной положении способствует поддержанию казне-способности в теченяи 6-ти месяцев. При таком способе культивирования питательные компоненты среды могут проникать через трано-фуаиошуа ткань в базальной части завязи, что позволяет предполагать существование определенной полярности при транспортировке питательных веществ в культуре изолированного яенского гаме торита.

Плотность посадки эксплантатов в культуре изолированных репродуктивных органов также имеет существенное значение. Установлено, что наиболее оптимальным является культивирование 10-15 завязей на пробирку в 8-ми мл питательной среды. Частоту калл у сообразован кя мохно било несколько увеличить при той же плотности посадки (10-15) и объема среда (8 мл), увеличивая площадь поверхности питательной среды методом "косою" агара. Это показывает, что при культивировании неошюдотворенных завязей пшенида необходимо учитывать соотношение количества эксплантатов на единицу объема среда, а также количества завязей на единицу нлошади поверхности питательной среда.'

ШоштшошижкЕ особенности кгаиивиртамх равней!

•ШЕНИф.

При кудьтквмрованиж изолированных завязей шганицл происходи? аотерд присущего т типа организации, рост ваи.зей протекает с

разрушением олемектов зародышевого мешка и семяпочки, а также с-образование,! каллусной ткани. Показало, что каллус пая масса может быть получена из различных тканей завязи. На 15-20 день от начала культивирования нэйдодалось образование каллуса" на базальной части завязи, что являлось следствием пролиферации клеток наружной части стенки завязи ( рис.2 а,б I Иногда.каллус формировался через 30-40 дней, и тогда клетками, инициирующими каллусогенез служили элементы яйцевого аппарата, клетки нуцеллуса и интегументов (рис. 2 в,г 5, внутренней часта стенки заьяэи и.рыльца пестика (рис. 2 д,а 1

В некоторых случаях, в зависимости от состава питательной среды, наблюдали ризогеннуп активность каллусов. Анализ числа хромосом в кончиках корней показал гаплоидность (п=21) и диглондао-сть (п=42) полученных структур. Кроме того, интересным фактом являлось индувдм вторичного каялусогенеза на полученных ризоге1шых структурах и образование корней непосредственно из завязей.

У большинства сельскохозяйственных растений, в том числе пшеницы, способность к устойчивому апомикткческсму развитию отсутствует, и да:;:е- отдельные элемента апомиксиса встречаются редко и слабо ■ выражены. Преимуществом метода культуры изолированных завязей является возможность индукции некоторых элементов апомиксиса, не связанных с псевдогамией.

На 10-14 дни культивирования в микропилярной части зародышевого мешка клетки яйцевого аппарата (яйцеклетка, синергида) начинали делиться, форлируя 4-Б клеточньй; прозы бри о. Однако, в своих исследованиях нам не удалось четко определить, какие именно клетки яйцевого аппарата принимали участие з их образовании. Поскольку синергзды и яйцеклетка находящиеся на.торце микропиле, тесно

Pao. 2. Образование каллуоной ткани в культуре неоплодотворен-ных завязей яшенида:

а,б - перебран ескими клетками стенки вавязи ; в - клетками яйцевого аппарата; г - клетками нуцеллуса; д - внутренними клетками стенки завязи; а - клетками рыжьда. пестика.

сшзшш ме.т.пу собой и при первичных делениях, трудно пронести • границу между их ядрами. Кроме того, по своей форме и физиологическим особенностям синергиды наиболее близки к яйцеклетке и по сравнению с другими элементами зародышевого мешка обладают нешб-олшими возможностями к формирования эмбрионов. Поэтому мы можем предполоуить, что источником образования зародышей в напшх экспериментах могут слукить как яйцеклетка, так и синергиды, т.е. мажет иметь место либо гиногенез, либо синергидпая япогометия. Полученные михроплляргше зародкяя были орленглровагш э центр эя-родышевохч мешка (рис.З я).

В условиях культуры неоплодотворегошх завязей гпяеници формирование и развитие зародышей происходило значительно медленнее, чем в естественных условиях. Так, если в естественных условиях уже на второй день после оплодотворения модно набяюдать 10-тн клеточной прогмбрио, а трехдневный прозыбрао содержал более 30-та клеток, то в условиях in vitro фондирование 4-6 клеточного прозы брио происходило лишь на 10-14 день от начала культивирован»!. Причем, такие зародызш не имели характерной грутаевзгдяой формн. Образование многоклеточных зародышей наблюдалось па 20-25 дня культивирования. В условиях in vivo , рост зародышей в перше дни после оплодотворения, обеспечивался, в основном, за спет деления клеток, процесс растяжения бия ¡¡езначлтедьнш. Прозмбрпо состояли аз мелких, ярко окрашенных, гмгаких густув ттоплаегду клеток, то in vitro такой закономерности не наблюдается. Проэмбрво состояла из крупных клеток, занимая значительную част» полости зародышевого мешка. Дальнейшее развитие многоклеточных проэмбрио сопровождалось образованием омбрзодерлы. Еародшехзая оболочка образовывалась в виде перофирпческого сдоя,, бовншшящого а резуль-

V г^с ...

4 * 8

Л, Л

•. ■ л • г'-:' - "

' -. -•*•- -л" •' , V'-.

, V! -ч

Л'''¡г

1

Д

V

Рис.3. бмбриогенез в культуре неодлодотворенных завязей пшениц*:

в. - гародш образовавшийся в макрошшяриой часта зародышевого межа; б - зародта&ши мешок, содержаний два зародыка, верхний обракован в микропиляриой части, ваяний - в халазальноа; б - днтегументалышй зародыш; г - нуделляраый зарода а; д - макрошышрннй зародш через 2 месяца от начала культивирования; е - гапяоиднш набор хромосом а=21.

тате периклинального деления клеток проэмбрио. Однако, если на . этой стадии развития in vivo зародыши полностью лишены связи с нуцелкуссм и окружены клетками эндосперма, микропилярные зародыши имеют подвесок, соединяющий его с тканями зэеязи.

Щтозмбркологичесхие исследования свидетельствуют о начале ор~ гакообразовательных процессов и в условиях in vitro , Через 2 месяда от начала культивирования на срезах можно наблюдать сильно разроииеся зародыша, почти полностью занимающие полость зародышевого мешка (рис.3 д). Можно обратить внимание на то, что некоторые из них по свое;! форме налсминггот нормальный &-€ дневный' зародыш, однако, значительно больших рагмеров. Зародыши состояла из морфологически неоднородных клеток, в них отмечались как мелкие меристематические клетки, так и крупные, лишенные ядер. Присутствие таких безядерных клеток свидетельствует о начале дегенерации зародыша.

Таким образом, сравнительное изучение развития зародыша в условиях in vivo - in vitro выявило различия, выражавшиеся в значительном отставании в темпах развития зародыша и аномалиях в их развитии. Так, если на материнском растении зародыш заканчивает дадэренщацЕо на 12-14 день, то зародыш в культуре доходил в своем развитии за этот период только до стадии глобулярного проэмбрио. Завершали же сбоя развитие зародншн in vitro стадией многоклеточного проэмбрио, имеющего змбриодерму, однако без видимых признаков даоеренциаци основных органов зародыша.

В болылмнетве случаев в полости зародышевого мешка образовывался один зародыш, расположенный в микропилярной части. В то яе вршя нами обнаружены зародышевые мешки одновременно содержание два зародыта( рис.3 б). Однако, такое проявление полиэмбраонии

ьстречадось крайне редко. Как правило, аародшли имели полярное рылшоийаии. Один из них был расположен ь цикропилярной части и dji&a начало ог яйцевохчз аппарата, другой - халазальной части, ис-исчцакш сто образования служила анткяиди. Оба типа народыша били лишены четко выраженного иодвеска и ориентированы в центр зародышевого мешка, где они состыковывались.

Параду с обнаруженными ыакропшшршаш зародышами, развивв»-шшиоя аз алшшто» зародышевого мешка, иш удалось наблюдать явление нуцоллярцой я кятегуыентальиой эмбрионам. Нуцеллус представляет собой ткань семяпочки, которая по мере дифференциации и образования зародышевого мешка постепенно исчезает. После оплодотворения у большинства покрытосшешшх растений остается один ряд вакуолизаровашшх клеток, окрухаощих зародышевый мешок. В условиях культуры клетки нуцвьлуса подвергались дегенерации Однако, в редких случаях клетки приступали к делению, образуя глобулярные ofpyKi7pu( pue,3 в). Нуцаяляраые зародыши, по своей структуре, цдо-гаоети расположения ядер, интенсивности их окраски напоминали ааготйческие многоклеточные проэмбрио. Образование зародышей начиналось, как правило, из клеток нуиеллуса, обращенных к внутреннему иитегуившу. Развитие нуцеилярных зародышей приостанавливалось на стадии многоклеточного проэмбрио. Б дальнейшем не происходило их дирфарендаада, в центральной части зародыша появляются клетки, лвышние ядьр. Как правило, такие зародыши сильно разрасталась, вторгаясь в полость зародышевого мешка.

lipa интегуыентальной эмбрионш, наблюдаемой при культивиро-еьшк. нсояладоторенных завязей пшенищ, зародыши образовывались на клс,тик внутреннего иитегумеита (рис.3 г). Но морфологии интвг-ум-гДП'ййыше »аредцю* представляли собой плотные структуры с ярко

икрашенными ядрами.

В некоторых случаях у образован™хся илтегументилышх уеро-дышеи наблгдалось развитие гаусториалышх клеток, не характерное для зародышей злаков. Роль гаусторий, как известно , заключается в снабжении зародышей питательными веществами из окружяших их тканей. Однако, во всех случаях полученные зародили не достигали стадии диВДереидаровки. По всей видимости, это связвно о отсутствием развитая эндосперма.

Наблюдавшиеся в наших экспериментах различные ><ор| огеж'ти-ческие процессы при культивировании неонлодотворенных завязей ¡ШХ'НЯШ могут быть обоошены в виде схшн.

Каллусогенез

рвеязь

Эмбряоидогенез

Рнзогенез

Из соматических клеток (2п)

!з клеток зародышевого ме шка (п)

Из соматических клеток (2п)

йэ клеток зародышевого ме яка (п)

Прямой (из завязи)

Из каллус£

Из нуцелл-уса (нуце-ллярнан эм бриония) (2п)

Из интегу-ментов (ин тегумента-льная эмб-риония(2п)

Из яйцеклетки (гиног-

енез) (п)

Из синерг-ид или антипод (ап~ огпметия)

(а)

li if В О Д II. Установлено, что в культуре неоплодотворенных завязей ншешну программа морфогенеза мохет реализоваться на основе процессов каллусогенеаа, органотенеза и ьмбркоидогенеза.

2. В культуре неоплодотворенных завязей получаны каллусные ткани, содержащие клетки с одинарном набором хромосом, что указывает на участие гаплоидных клеток зародшегдго мешка в их происхождении.

3. Апомиксис у пшаницм vitro осуществляется на основе "переключения" клеток женского гаметсфита на спорофитный путь развития. При атом в клетках зародышевого мешка и окружающих его тканей могут протекать следующие морфогенетические процессы: ги-ногенез (из яйцеклетки), апогаыетия (из синергид или антипод), адвентивная змбраония (из клеток нуцзллуса или интегументов) .

4. В результате испытания 26-ти генотипов пшенида еж плен сорт- (Саратовская 29 ), обладавший высоким морфогенетическим потенциалом в культура неоплодотворенных завязей. Указанный генотип рекомендуется использовать в качестве модельного объекта в исследованиях, направленных на разработку гаплоидной технологии.

Ь. Оптимальной для культивирования неоплодотворешшх завязей пшенида является питательная среда Мурасиге и С куга, с добавлением 2 ,4-Д и кинбтина. Повышение концентрации кинетина до 6-10 мг/л позволяет индуцировать эмбраоидогенез.

СШСОК РАЮТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО TIME ДИССЕРТАЦИИ;

' I. Ережепов А.Е., Мухамбетжанов С.К. Культура изолированных заязей и семяпочек шшшда. //Тез. докл. IX Всессюз. совешания по эмбриологии растений. Гематогенез, ошюдотворение и эмбриоге-

нез семоникх растений, папертников и мхос. // Тез. докл. IX Есес. совешан. по эмбриологии растении. - Кишинев, I8E6. - С.215

2. Ерехыпов А.Е., Омирбекова Н.л... Колумбаева С.5'., Азимова Е.Д., Мухамбетжанов O.K. Культура неоплодотвореиных завязей пшен-ищ в условиях in. vitro // Физислого-генетические оснош повышения устойчивости продуктивности сельскохозяйственных растении. Алма-Ата, 19Ё8. - С. 123-124

3. Кухамбетааков С .К. Цитоэмбриология ноопподотвореннкх завязей пшекипы ir. v:"vj.'o // Проблемы современной биологии: Тр.20 науч.коиу.моя.ученых бяод. 4'ак. МГУ. МГУ.М., I9P9. - Ч.1., С.7Р-81. Леи. з ВИНИТИ 5.02.S0, Г* 641-3?О

4. Мухамбеткааов С.К. Культура ха vitro неотшодотворенных завязей пшениц,'. // Тез.докл.Всес.ковд.мол. ученых: Изучение, охрана и ращональное использование природных ресурсов. - Уфа,

- С.131

Ь. Мухамбетжанов С.К., Еретепов А.Е., Рахимбаев И.Р., Еогус-паев K.K. L^tosi,криологическое исследование развитая зародышевого мешка пшекипу. // Известия АН КазССР. Серия биологическая. - I9SI. - яе. - С.70-73

6. Мухачбетжанов С.К., Ережепов А.Е., Рахимбаев И.Р. Нуцелл-ярная и интегументальная зм бриония в культуре неоплодотЕоренных завязей! пшениц. // Известия АН КаэССР. Серия биологическая. -19Ы. - У,2. - С.84-86

7. UuhftjOsqi; Литот S.k. , л.'З., КвЫвЪаог Х.Л. ApoaJL--is vi.] cll:.;j?.-;c-d cv..rifc cv.L'.v:-:<; o:? r". oai'. // - ., o.? 1-1 TijJj."

8. Мухачбетхансв C.K., Азимова EJU, Ережепов А.Е., Рахимбаев И.Р. Культивирование неоалодотворенных завязей пшенигы. // Катер.Всес.коад. по биотехнологии, -цалхаоград, 1991. - С.С2-63