Совершенствование метода андрогенеза in vitro у земляники (Fragaria ananassa Duch.)

Протасова, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Совершенствование метода андрогенеза in vitro у земляники (Fragaria ananassa Duch.)
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование метода андрогенеза in vitro у земляники (Fragaria ananassa Duch.)"

ии4Ы:

.390

На правах рукописи

ПРОТАСОВА Екатерина Сергеевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА АНДРОГЕНЕЗА IN VITRO У ЗЕМЛЯНИКИ (Fragaria ananassa Duch.)

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

2 8 ОКТ 2010

Мичуринск-наукоград РФ 2010

004611390

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО «Мичуринский государственный педагогический институт»

Научный руководитель:

академик РАСХН,

доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Савельев Николай Иванович

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Расторгуев Сергей Леонидович

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Брюхина Светлана Александровна

Ведущая организация:

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства им. И.В. Мичурина»

Защита диссертации состоится 29 октября 2010 г. в 13 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 220.041.01 при Мичуринском государственном аграрном университете по адресу: 393760, Тамбовская обл., г. Мичуринск, ул. Интернациональная, 101.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мичуринского государственного аграрного университета, а с авторефератом дополнительно на официальном сайте университета: ИЦр:/Ау\у\у. mgau.ru.

Автореферат разослан 28 сентября 2010 г.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 220.041.01 кандидат сельскохозяйственных наук '""7 Н.М. Соломатин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время весьма актуальным является создание нового, ценного для селекции исходного материала, совмещающего высокую продуктивность, устойчивость к болезням и вредителям, генетическую стабильность. Большую помощь в успешном решении этой задачи могут оказать широко используемые в современных исследованиях биотехнологические методы, к которым относится культивирование на искусственных питательных средах пыльников и микроспор (андрогенез in vitro). Основной интерес к культуре пыльников связан с тем, что это эффективный и быстрый способ получения гаплоидных и гомозиготных растений и линий. Использование таких растений в селекции позволяет сократить срок создания сорта. Метод культуры пыльников разработан для получения гаплоидных и гомозиготных сельскохозяйственных растений, в основном зерновых и овощных. Однако у такой популярной ягодной культуры, как земляника, андрогенез in vitro пока не имеет широкого практического применения, поскольку технологии получения гаплоидных и гомозиготных растений на его основе недостаточно разработаны. Это обусловлено большой трудностью индукции у них как первичных андрогенных образований (каллусов, эм-бриоидов), так и морфогенетических, регенерационных процессов, отличающихся к тому же нестабильностью и плохой воспроизводимостью. В то же время, несмотря на указанные трудности, определенные успехи по культивированию пыльников различных сортов земляники имеются. Для отдельных генотипов были определены условия получения с различной частотой, но не всегда высокой, каллусов и растений-регенерантов. Однако разработанные для отдельных сортов приемы получения гаплоидов часто оказываются не эффективными для других, поэтому требуются исследования в этом направлении.

Цель и задачи исследований. Цель работы - изучить влияние различных факторов на процессы андрогенеза in vitro и разработать на этой основе методы получения андрогенных каллусов и растений-регенерантов у ряда сортов земляники.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• изучить влияние физиологически активных веществ, генотипа растений-доноров, стадии развития пыльцы, холодовой предобработки пыльников на каплусогенез в культуре in vitro;

• дать оценку формирования каллусной ткани;

• индуцировать морфогенетические процессы в андрогенных каллусах;

• выделить генотипы с наиболее высоким андрогенетическим потенциалом;

• определить условия размножения и укоренения побегов-регенерантов;

• провести морфологическое и цитологическое изучение растений-регенерантов.

• усовершенствовать способы адаптации растений-регенерантов к условиям открытого грунта;

• определить экономическую эффективность производства посадочного материала андрогенных растений земляники с применением метода клонального микроразмножения.

На защиту выносятся следующие основные положения.

1. Приемы индукции каплусной ткани и регенерация растений в культуре пыльников земляники.

2. Условия размножения и укоренения полученных побегов-регенерантов.

3. Морфологическая и цитологическая оценка растений-регенерантов.

4. Способы адаптации растений-регенерантов к условиям открытого грунта.

Научная новизна. Выделены генотипы с наиболее высоким андрогенети-ческим потенциалом в культуре пыльников земляники (Урожайная ЦГЛ, Фейерверк, Привлекательная, Золушка). Выявлены морфологические особенности андрогенных каллусов. Подобраны оптимальные физиологически активные вещества, на основе которых разработаны питательные среды, дающие высокий выход каллусов и растений-регенерантов. Определена наиболее благоприятная продолжительность холодовой предобработки пыльников (3 суток), которая оказывает положительное влияние на выход андрогенных образований. Установлено, что одноядерная стадия развития пыльцы является лучшей для индукции андрогенеза in vitro у земляники. Впервые получены андрогенные растения-регенеранты у сортов Урожайная ЦГЛ, Фейерверк с частотой около 10 %, у сорта Золушка до 46 %. Разработаны условия успешного размножения и укоренения андрогенных побегов-регенерантов сортов Золушка, Урожайная ЦГЛ, Фейерверк. Получены растения различных уровней плоидности: диплоидные (60 %), гаплоидные (26,7 %), у остальных регенерантов в соматических тканях встречались как гаплоидные, так и диплоидные клетки в соотношении 1:1. Усовершенствованы способы адаптации растений-регенерантов к условиям открытого грунта, позволяющие достигать до 90 % их приживаемости.

Практическая значимость. Разработаны воспроизводимые эффективные методики получения андрогенных регенерантов для сортов Урожайная ЦГЛ, Фейерверк и Золушка, позволяющие получать растения различных уровней плоидности, в том числе гаплоидные. Создана коллекция ценных андрогенных растений земляники, которые могут быть широко использованы в селекционной работе при создании гомозиготных растений и линий, а также в генетических исследованиях.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Международной науч.-практ. конф., посвященной 75-летию со дня рождения лауреата государственной премии РФ, заслуженного деятеля науки, проф. В.А. Потапова - Мичуринск-наукоград РФ, 14-16 окт. 2009; Всерос. науч.-практ. конф., посвященной 130-летию со дня рождения С. Ф. Черненко, Мичуринск-наукоград РФ, 4

21-23 ноября, 2007; 61-ой научно-практической конференции студентов и аспирантов, Мичуринск-наукоград РФ, 2009.

Публикация материалов исследований: По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 из них в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ к защите кандидатских диссертаций («Arpo XXI», 2009; Доклады РАСХН, 2010).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 122 листах компьютерного текста и состоит из введения, 7 глав, выводов, рекомендаций производству, списка используемой литературы из 206 наименований (129 отечественных и 77 иностранных). Диссертация иллюстрирована 37 рисунками, включая фотоснимки, и содержит 13 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методика проведения исследований

В экспериментах использовали растения земляники садовой (Fragaria ananassa Duch.) сортов: Фейерверк, Урожайная ЦГЛ, Привлекательная, Золушка, Львовская ранняя, Фестивальная ромашка, Десертная, Кама, Редгонтлит.

Культивирование пыльников, стерилизацию материала и инструмента, приготовление питательных сред, осуществляли согласно общепринятым методикам Р.Г. Бутенко (1964), Ф.Л. Калинина с соавторами (1980) и разработанной во Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина (ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина) О.С. Жуковым с соавторами (1994). Для определения стадии развития пыльцы проводили цитологический контроль, путем приготовления временных ацето-карминовых давленых препаратов (Паушева, 1974).

В качестве минеральной основы инициальных питательных сред для кап-лусообразования использовали прописи Мурасиге-Скуга (1962) и Кворина-Лепорье (1977).

Для стимуляции образования каллусной ткани в питательные среды вводили 6-БАП в концентрациях 1,0; 2,0 мг/л, кинетин, зеатин по 2,0 мг/л, НУК-0,5 мг/л, 2,4-Д - 0,5; 1,0; 2,0 мг/л, ИУК - 2,0 мг/л. Оценку интенсивности пролиферации каллусной массы проводили по пятибалльной шкале на инициальных питательных средах, применяя методику В.Г. Леонченко с соавторами (2007).

На этапе морфогенеза использовали среды, которые включали зеатин в концентрациях 1,0; 2,0 мг/л, 6-БАП - 2,0; 5,0; 7,0 мг/л, кинетин - 2,0 мг/л, ИМК, НУК по 1,0 мг/л, ИУК- 1,0; 2,0; 3,0 мг/л и ГК- 1,0 мг/л. На этапе размножения в среду вносили регуляторы роста: 6-БАП в концентрациях 1,0; 2,0; 3,0 мг/л. В качестве индуктора ризогенеза применяли ИМК в концентрациях 1,0; 2,0; 3,0 мг/л.

Определение плоидности полученных растений-регенерантов проводили на временных ацетогематоксилиновых давленых препаратах по методике

Л.А. Фроловой с соавторами (2002). Этап адаптации микрорастений осуществляли в малогабаритных пленочных теплицах с воздушно-капельным орошением, после чего проводили учет выживших растений и рассчитывали частоту адаптации (в процентах).

Полученные экспериментальные данные обрабатывали с применением методов статистической обработки (Доспехов, 1985), а также с помощью программы Microsoft Office Excel 2003.

Влияние различных факторов на процесс культивирования in vitro пыльников земляники

В проведенных исследованиях было установлено, что развитие пыльников у всех изученных генотипов земляники проходило по пути непрямого анд-рогенеза, то есть с образованием каллусных тканей, прямого андрогенеза -формирование эмбриоидов не отмечено. Каллусогенез, таким образом, явился важным промежуточным этапом в процессе получения из пыльников земляники растений-регенерантов. В связи с этим были изучены наиболее важные факторы, оказывающие влияние на процесс каллусообразования - это генотип исходных растений-доноров, состав культуральной среды, стадия развития пыльцы и холодовая предобработка пыльников.

Генотип растений-доноров

Проведены исследования по изучению способности различных сортов земляники к образованию в условиях in vitro андрогенных каллусных тканей. Среди испытанных генотипов выявлены существенные различия по способности их пыльников, культивируемых in vitro, образовывать каллусные ткани (табл. 1).

Таблица 1 - Влияние генотипа растений-доноров на каллусогенез in vitro у пыльников различных сортов земляники (2006 - 2009 гг.)

Сорт Количество посеянных пыльников, шт. Количество пыльников, образовавших каллусы Группа по интенсивности каллусообразования

шт. %

Золушка 814 282 34,6±1,67 Высокая

Урожайная ЦГЛ 882 296 33,5±1,59

Фейерверк 842 226 26,8±1,53

Привлекательная 717 175 24,4± 1,60

Фестивальная ромашка 724 100 13,8±1,28 Средняя

Десертная 772 70 9,1±1,04

Кама 794 62 7,8±0,95

Львовская ранняя 697 2,6±0,60 Низкая

Редгонтлит 668 14 2,1±0,55

Все изученные генотипы по интенсивности каллусообразования условно были разделены на три группы: в первую, с самой высокой активностью эгого процесса, включили формы с частотой каллусообразования свыше 20 %, во вторую, со средней активностью данного процесса - от 20 % до 5 % и в третью с самой низкой - менее 5 %.

В первую группу вошли сорта - Золушка, Урожайная ЦГЛ, Фейерверк и Привлекательная.

Вторую группу составили сорта - Фестивальная ромашка, Десертная и Кама. Наиболее низкая активность каллусообразования отмечена у сортов Львовская ранняя и Редгонтлит, они вошли в третью группу.

У изученных сортов земляники наиболее многочисленными оказались группы с высокой и средней активностью каллусообразования, а самой малочисленной с низкой активностью этого процесса. Установлено, что наибольшей каплусообразовательной способностью характеризуются сорта земляники отечественной селекции, в первую очередь полученные во ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина (Урожайная ЦГЛ, Фейерверк), а также сорт Золушка селекции ВСТИСП. Это, видимо, связано с их высоким адаптационным потенциалом к абиотическим и биотическим стрессорам.

Минеральный и гормональный состав питательных сред

В экспериментах по определению лучшего минерального состава питательных сред для культивирования пыльников использовали прописи - Мура-сиге-Скуга (МБ) и Кворина-Лепорье (<ЗЬ). Проведенные исследования показали, что все изученные сорта земляники имели наиболее высокую каллусоген-ную активность пыльников на среде М5. На этой среде показатель частоты каллусообразования у сортов Фейерверк, Десертная, Редгонтлит был в 2 раза, а у сорта Кама в 5 раз выше, чем на среде С?Ь (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние минерального состава питательных сред на каллусогенез в пыльниках некоторых сортов земляники

Сорт Среда Посеяно пыльников, шт. Количество пыльников с каллусами, %

Фейерверк МБ 30 26,7 ±8,08

<ЗЬ 63 14,3 ±4,41

Десертная Мв 29 10,3 ±5,64

ОЬ 44 4,6 ±3,16

Кама М8 39 20,5 ±6,46

ОЬ 77 3,9 ±2,21

Редгонтлит М8 45 17,8 ±5,70

ОЬ 95 9,5 ±3,01

Минеральный состав среды MS явился наиболее благоприятным для проведения исследований в культуре пыльников земляники.

Важным фактором в индукции процессов андрогенеза in vitro помимо минеральной основы являются физиологически активные вещества - ауксины и цитокинины (Полевой, 1982). Изучено влияние регуляторов роста на андроген-ную активность пыльников земляники.

Всего испытано восемь вариантов питательных сред, в которых были различные соотношения и концентрации ауксинов и цитокининов.

Выделены четыре наиболее продуктивные среды, на которых большинство изученных сортов образуют с высокой частотой андрогенные каллусы. Для каждого генотипа отмечена своя лучшая по этому показателю питательная среда (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние фитогормонального состава питательных сред на андрогенез пыльников ряда сортов земляники (2006 - 2009 гг.)

Сорт Регуляторы роста, мг/л Посеяно пыльников, шт. Количество пыльников с каллусами % регенери-

шт. % рующих каллусов

6-БАП 2,0 + НУК 0,5 198 55 27,8+3,18 12,7

Фейерверк кинетин 2,0 + НУК 0,5 61 29 47,5+6,39 0

зеатин 2,0 + НУК 0,5 170 44 25,9+3,36 2,3

6-БАП 2,0 + 2,4-Д 1,0 71 33 46,5+5,92 0

6-БАП 2,0 +НУК 0,5 167 69 41,3+3,81 7,2

Урожайная кинетин 2,0 + НУК 0,5 98 46 46,9+5,04 0

ЦГЛ зеатин 2,0 + НУК 0,5 182 89 48,9+3,71 6,7

6-БАП 2,0 +2,4-Д 1,0 105 44 41,9+4,82 0

6-БАП 2,0 +НУК 0,5 86 50 58,1+5,32 2,0

Золушка кинетин 2,0 + НУК 0,5 104 66 63,5+4,72 0

зеатин 2,0 + НУК 0,5 108 20 18,5+3,74 0

6-БАП 2,0 +2,4-Д 1,0 100 60 60,0+4,90 0

Так у сорта Фейерверк лучшей по выходу андрогенных каллусов была среда, содержащая кинетин 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л (47,5 %). У сорта Урожайная ЦГЛ наиболее продуктивной оказалась среда - зеатин 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л (48,9 %). Для сорта Золушка лучшие результаты по образованию каллусов отмечены на среде - кинетин 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л (63,5 %). Выделена одна среда (6-БАП 2,0 мг/л + 2,4-Д 1,0 мг/л), на которой с разной активностью, но у всех испытанных генотипов земляники образовывались каллусы. Эту среду можно использовать при испытании новых сортов как стандартную.

У сортов Фейерверк и Урожайная ЦГЛ на двух каллусогенных средах -6-БАП 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л и зеатин 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л были получены побсги-регенеранты. У сорта Золушка этот процесс отмечен только на среде первого состава.

С целью оптимизации содержания в питательной среде синтетического аналога ауксина 2,4-Д как одного из необходимых стимуляторов роста были испытаны три его концентрации - 0,5; 1,0; 2,0 мг/л (рис. 1).

ч Золушка

--Редгонтлит

—*—Фейерверк

Урожайная ЦГЛ 70 —Фестивальная ромашка

■-- Львовская ранняя

— Десертная

— Привлекательная

— Кама

8 га о.

с; с

50 -!

0.5

1.0

Концентрация, мг/л

Рис 1. Влияние концентрации 2,4-Д на интенсивность каплусообразования различных сортов земляники.

Отмечено, что присутствие в инициальной среде 2,4-Д в концентрации 1,0 мг/л дает лучший выход каллусов практически у всех изученных генотипов земляники. Только у сорта Фестивальная ромашка этот показатель был выше на среде с 2,0 мг/л 2,4-Д.

Установлено, что выход андрогенных каллусов земляники во многом обусловлен типом цитокинина. Для каждого сорта характерен свой тип цитоки-нина, который обеспечивает высокую частоту каллусообразования. Необходимо отметить, что концентрация всех цитокининов в среде была 2,0 мг/л (рис. 2).

У сорта Золушка лучшие результаты по выходу андрогенных каллусов были получены на средах, содержащих 6-БАП (59,1 %) и кинетин (51,2 %). Присутствие этих цитокининов в инициальной среде у сорта Привлекательная также обеспечило высокую частоту каллусообразования 39,9 % (6-БАП) и 37,1 % (кинетин). У сорта Урожайная ЦГЛ высокий процент каллусообразования дает наличие в среде как зеатина (45,1 %), так и 6-БАП (41,5 %), несколько ниже - ки-

нетина (37,2 %). Для сорта Фейерверк присутствие в средах 6-БАП, кинетина или зеатина давало близкое значение частоты каллусообразования (32,7 %, 31,7% и 31,0 % соответственно).

■ Золушка □Урожайная ЦГЛ N Фейерверк

в Привлекательная н Десертная ПЛьвовскэя ранняя

В Фестивальная рома шка В Кама В Редгонтлит

6-БАП KIN ZEA

Тип цитокинина

Рис. 2. Влияние типа цитокинина на выход андрогенных каллусов различных сортов земляники.

У сорта Десертная наибольшая частота каллусообразования'отмечена на среде с зеатином (18,3 %). Менее активно этот процесс протекал в присутствии 6-БАП - 12,9 %. Наличие в среде кинетина не стимулировало образование каллусов. Для сорта Львовская ранняя содержание в среде 6-БАП оказалось наиболее благоприятным (7,1 %). Процесс каллусообразования в присутствии кинетина и зеатина отсутствовал. У сорта Фестивальная ромашка частота каллусообразования была самой высокой на среде с 6-БАП (23,4 %), несколько ниже с зеатином (15,7 %), а наименьшая активность этого процесса была в присутствии кинетина (8,3 %).

У сорта Кама высокая каплусогенная активность оказалась на среде с зеатином (20,4 %). Наименьшая частота этого процесса была на средах с 6-БАП и кинетином (8,2 % и 3,8 % соответственно). У сорта Редгонтлит наличие в среде 6-БАП оказывало благоприятное воздействие на выход каллусов (5,1 %), несколько меньшая активность этого процесса была в присутствии зеатина (3,3 %). Совсем отсутствовал процесс, если среда включала кинетин.

Стадия развития пыльцы

Эффективность андрогенеза в значительной степени зависит от стадии развития пыльцы в момент введения пыльников в культуру in vitro. Этот фактор для некоторых культур может быть важнее, чем состав питательных сред.

По данным, полученным на разных видах растений, самой оптимальной для большинства видов является одноядерная стадия развития пыльцы. Именно на этой стадии наблюдается эмбрио- и каллусогенез и формирование растений. Однако в некоторых случаях положительные результаты были получены при культивировании пыльников с двуядерной пыльцой (Шамина, 1981; Атанасов, 1993).

Одним из условий успешной индукции каллусогенеза является правильный отбор бутонов, в которых находятся пыльники с пыльцой на определенной стадии развития.

Отмечено, что бутоны, размер которых был в пределах 4-5 мм, содержат пыльники желто-зеленой окраски (первая группа). Бутоны размером 7-8 мм имеют пыльники светло-желтого цвета (вторая группа).

Цитологический анализ, проведенный на временных ацетокарминовых препаратах, показал, что пыльники первой группы содержали одноядерную пыльцу (микроспоры). Пыльники второй группы соответствовали двуядерной стадии развития пыльцы.

Определяли зависимость каллусообразовательного процесса от стадии развития пыльцы (табл. 4).

Таблица 4 - Интенсивность каллусообразования в пыльниках земляники в зависимости от стадии развития пыльцы в условиях in vitro

Сорт Стадия развития пыльцы

одноядерная двуядерная

посеяно пыльников, шт. получено каллусов, % посеяно пыльников, шт. получено каллусов, %

Золушка 57 21,1 ±5,40 55 21,8 ±5,57

Привлекательная 58 22,4 ±5,47 74 27,0 ±5,16

Десертная 75 24,0 ±4,93 64 9,4 ±3,65

В результате проведенных исследований установлено, что одноядерная стадия развития пыльцы дает близкие по значению и довольно высокие показатели частоты каллусообразования у всех изученных сортов земляники. Дву-ядерная стадия развития пыльцы показала сортовые различия в активности ка-лусообразовательного процесса. Наиболее активным он был у сорта Привлекательная, а значительное его снижение, более чем в 2 раза, по сравнению с одноядерной стадией, наблюдалось у сорта Десертная.

Таким образом, для получения андрогенных каллусов лучше использовать пыльники, содержащие одноядерную пыльцу.

Холодовая предобработка пыльников растений-доноров Известно, что обработка бутонов перед посадкой пыльников на культу-ральную среду низкими положительными температурами (3-5 °С) в течение определенного времени увеличивает выход андрогенных образований (каллу-

сов, эмбриоидов). Продолжительность обработки зависит от вида и сорта растения и может варьировать от одного до пятнадцати дней (ХушаБ еЫ., 2001; Галиева и др., 2005).

Бутоны земляники сортов Львовская ранняя, Фестивальная ромашка, Урожайная ЦГЛ, предназначенные для инокуляции пыльников, подвергали обработке пониженными температурами 3-5 °С в течение 0, 1, 3, 6, 9 и 12 суток. Результаты опыта показали, что для сортов Львовская ранняя и Фестивальная ромашка экспозиция в 3 суток оказалась благоприятной для каллусообразова-ния. У сорта Урожайная ЦГЛ лучшей является экспозиция - 9 суток. Процесс каллусообразования у изученных сортов отсутствует при воздействии холодом в течение 12 суток (рис. 3).

Рис. 3. Влияние холодовой предобработки пыльников на активность каллусообразования в культуре in vitro некоторых сортов земляники.

Таким образом, холодовые предобработки, которые дают наибольший выход андрогенных каллусов, индивидуальны для каждого генотипа и находятся в диапазоне от 0 до 9 суток. Экспозиция в 3 суток стимулирует процесс каллусообразования и дает близкие показатели его значения у изученных сортов. При воздействии холодом более 9 суток процесс образования каллусов отсутствовал у всех испытанных генотипов.

Морфологические особенности андрогенных каллусов земляники Проведён морфологический анализ полученных андрогенных каллусов, который позволил выявить две их основные группы. Первая - это плотные каллусы, молочного иногда коричневого цвета, легко зеленеющие на свету, часто с опушением. У таких каллусов можно ожидать регенерации и получения зеленых растений; их можно назвать морфогенными. Вторая группа включает рыхлые, коричневого цвета каллусы, лишь небольшая часть которых со 12

временем зеленеет на свету. Такие каллусы также могут образовывать морфо-генные структуры, но в меньшей степени, чем каллусы первого типа.

Было отмечено, что у большинства изученных сортов, таких как Урожайная ЦГЛ, Фейерверк, Привлекательная, Золушка, Львовская ранняя преобладали каллусы первого типа, светлоокрашенные. У сортов Фестивальная ромашка, Редгонтлит и Кама встречались в основном каллусы первого типа, но темноок-рашенные. Рыхлые каллусы (второй тип) отмечены в основном у сорта Десертная, а также в небольшом количестве у сортов Фестивальная ромашка, Золушка, Привлекательная.

По каждому генотипу определяли интенсивность нарастания каллусной массы в зависимости от состава питательной среды. Для этого использовали пятибалльную шкалу: 0 баллов - отсутствие каллуса, 1 балл - до 10 % поверхности пробирки, 2 балла - 20 %, 3 балла- 50 %, 4 балла - 75 %, 5 баллов -100 % поверхности агаровой среды. В результате исследований, установлено, что активность нарастания каллусной массы зависит как от генотипа, так и от состава питательной среды.

Лучшими по интенсивности пролиферации каллусной массы являются сорта Урожайная ЦГЛ (4,2 балла), Фейерверк (3,9 балла) и Привлекательная (3,7 балла). Выделена наиболее продуктивная по этому показателю питательная среда, она включает кинетин - 2,0 мг/л и 2,4-Д- 1,0 мг/л.

Разработка приемов регенерации растеннй в культуре каллусной ткани Индукция побегов-регенерантов в каллусных тканях

Важным этапом в осуществлении андрогенеза in vitro является индукция процессов регенерации. Морфогенез при регенерации в культуре каллусной ткани может реализоваться через соматический, неполовой эмбриогенез или путем органогенеза. В экспериментах формирование эмбриогенного каллуса и образование растений-регенерантов через соматический эмбриогенез не установлено.

Один из ключевых факторов, который способствует реализации потенций каллусных тканей к регенерации - это гормональный баланс питательной среды. Для регенерации андрогенных побегов из каллусных тканей плодовых и ягодных культур используют различные сочетания и концентрации наиболее важных фитогормонов - цитокинины и ауксины.

Проведенные исследования показали, что у некоторых сортов земляники уже на инициальных питательных средах в образовавшихся каллусах могут быть получены побеги-регенеранты. Так у сорта Фейерверк регенерация была отмечена на среде 3) (6-БАГ1 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л) с частотой 12,7 % от числа полученных каллусов. Один регенерант отмечен также на среде З5 (зеатин 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л). У сорта Урожайная ЦГЛ на инициальных средах 3i и 35 получены регенеранты с частотой 7,2 % и 6,7 % соответственно. У сорта Золушка единичные побеги были отмечены на инициальной среде 3,

Для индукции андрогенных побегов из каллусной ткани использовались различные варианты питательных сред, которые были названы морфогенными

или регенерационными. Всего испытано десять вариантов питательных сред с различными соотношениями и концентрациями ауксинов и цитокининов. Однако не все они оказались благоприятными для индукции морфогенетических процессов. Так, было установлено, что введение в состав питательных сред 6-БАП в концентрациях 5,0 мг/л и 7,0 мг/л не способствовало заложению адвентивных почек и образованию побегов.

Выделены две наиболее продуктивные регенерационные среды для сорта Золушка: 37, которая включала 6-БАП 2,0 мг/л, зеатин 2,0 мг/л, НУК 1,0 мг/л и Р, в состав которой входили 6-БАП 2,0 мг/л, ИУК 1,0 мг/л. На этих средах в каллусах были получены корни и побеги-регенеранты.

На среде Р в каллусах получено наибольшее количество побегов (44,7 %), а так же отмечено образование корней (21,3 %). Частота образования побегов на среде З7 составила - 5,9 %, несколько выше, чем на среде Р получено корней - 29,4 % (табл. 5).

Таблица 5 - Морфогенная активность каллусов сорта Золушка

Регуляторы роста, мг/л Количество каллусов, шт. Каллусы, образовавшие

корни % побеги %

37 (6-БАП 2,0 + зеатин 2,0 + НУК 1,0) 51 29,4 5,9

Р (6-БАП 2,0 + ИУК 1,0) 47 21,3 44,7

В ходе исследований, было изучено действие инициальной среды на последующую морфогенную активность полученных каллусов. В результате проведенных исследований такое влияние отмечено (табл.6).

Таблица 6 - Морфогенная активность каллусов сорта Золушка, полученных на различных инициальных средах

Инициальная среда, мг/л Морфогенная среда, мг/л Количество каллусов, шт. Каллусы, образовавшие

корни % побеги %

3, (6-БАП 2,0 + НУК 0,5) 37 (6-БАП 2,0 + зеатин 2,0 + НУК 1,0) 24 37,5 0

Р (6-БАП 2,0 + ИУК 1,0) 26 15,4 46,2

Зз (кинетин 2,0 + НУК 0,5) Зт 27 22,2 11,1

Р 21 28,6 42,9

Каллусы, полученные на инициальной среде 3], и впоследствии культивируемые на среде 37 давали высокий выход корней (37,5 %), однако побеги при этом не образовывались. В то же время на среде Р получены как корни (15,4 %), так и большое количество побегов-регенерантов (46,2 %).

Высокая активность побего- и корнеобразования (42,9 % и 28,6 % соответственно) отмечена в каллусах, полученных на среде З3, а затем культивируемых на среде Р.

Таким образом, каллусы, индуцированные на инициальных средах 3i и Зз следует культивировать на среде Р, так как это позволяет получать в них с высокой частотой побеги и корни.

Размножение и укоренение андрогенных побегов на искусственных питательных средах

Полученные в результате регенерации в культуре пыльников in vitro земляники побеги, представляют интерес для селекционно-генетических исследований, так как могут быть различных уровней плоидности и отличаться от исходного генотипа качественными и количественными признаками. Поэтому для того, чтобы избежать потери и сохранить генотипы для дальнейшего исследования, проводили размножение побегов-регенерантов в системе in vitro.

Испытаны три концентрации 6-БАП (1,0; 2,0; 3,0 мг/л) в средах для размножения полученных побегов-регенерантов.

У всех сортов к концу третьего месяца размножения лучшие результаты по выходу побегов были получены при концентрации 6-БАП 1,0 мг/л. Немного уступила концентрация 2,0 мг/л, однако она дала более активное побегообразование на первом и втором месяцах культивирования. При концентрации 6-БАП 3,0 мг/л у испытанных генотипов на протяжении всех месяцев культивирования были отмечены самые низкие показатели коэффициента размножения (табл. 7).

Таблица 7 - Коэффициент размножения на среде, содержащей разные концентрации 6-БАП

Сорт Концентрация 6-БАП в питательной среде, мг/л

1,0 2,0 3,0

Фейерверк 8,9 10,3 6,4

14,3 15,1 8,2

19,2 15,5 13,3

Урожайная ЦГЛ 8,3 9,2 6,2

13,1 14,8 7,4

18,2 17,4 12,3

Золушка 7,6 8,8 4,5

11,8 13,7 6,5

16,6 15,3 10,3

Таким образом, если микроразмножение заканчивать на втором месяце, то лучше использовать концентрацию 6-БАП 2,0 мг/л, при более длительном культивировании побегов (до трех месяцев) - 6-БАП 1,0 мг/л.

Этап укоренения является основой успешной адаптации стерильных растений in vivo. Не всегда среда, применяемая для размножения, обеспечивает высокий процент корнеобразования. Здесь необходимо учитывать сортовые особенности укореняемого растения. В проведенных исследованиях у сорта Золушка на среде для размножения с 1,0 мг/л 6-БАП было отмечено образование единичных корней.

Изучено влияние ИМК в концентрациях 1,0; 2,0; 3,0 мг/л на укоренение побегов-регенерантов земляники. В имеющейся литературе большинство исследователей рекомендуют включать в состав среды для укоренения наряду с ауксинами и вещества, обладающие цитокининовой активностью. Но, так как перед укоренением побеги длительно культивировали на средах размножения, содержащих достаточное количество такого цитокинина как 6-БАП (1,0; 2,0; 3,0мг/л), то его отсутствие, на наш взгляд, не должно было отрицательно сказаться на состоянии растений, что и подтвердили исследования. Все испытанные микропобеги на средах для укоренения имели нормальное развитие.

Установлено, что увеличение концентраций ИМК в среде стимулирует ризогенез и рост корней. При концентрации 3,0 мг/л у изученных генотипов отмечены наиболее высокие показатели, как числа образовавшихся корней, так и их длины (рис. 4.).

■Среднеечисло корней передняя длина корней

1 I 2 | 3 Урожайная ЦГЛ

Концентрация ИМК, мг/л

Рис. 4. Влияние различных концентраций ИМК на ризогенез in vitro.

Морфологические и цитологические особенности андрогенных растений-регенерантов

Цитологический анализ плоидности андрогенных растений-регенерантов земляники является необходимым этапом исследований. Это обусловлено тем, что имели дело с непрямым андрогенезом, то есть растения-регенеранты индуцировались в каллусе, который мог образоваться не только из микроспоры, но и из стенок пыльника, связника, тычиночных нитей, клетки которых имеют диплоидный набор хромосом.

Проведено цитологическое изучение растений-регенерантов сорта Золушка, полученных in vitro из пыльников. Регенеранты через каждые 4-5 недель пересаживали на свежие питательные среды и при этом проводили фиксации точек роста молодых корешков и листочков для цитологических исследований.

Испытано три варианта фиксации материала, чтобы выяснить, в каком из них будет больше делений в клетках. Первый вариант - перед фиксацией пробирки с растениями помещали на ночь в холодильник при t +5 °С, а утром на 2-3 часа ставили под лампы дневного света с интенсивностью освещения 25003000 люкс. Второй вариант - пробирки помещали только под лампы дневного света (на 2-3 часа). Третий вариант - материал фиксировали сразу, без предварительной подготовки. Лучшие результаты по количеству делений в клетках получены в первом варианте опыта. Всего изучено пятнадцать растений-регенерантов. У девяти из них (60 %) клетки были с диплоидным набором хромосом (2п=56). Четыре растения (26,7 %) имели гаплоидный набор хромосом (п=28). У остальных регенерантов в соматических тканях встречались как гаплоидные, так и диплоидные клетки в соотношении 1:1.

Растения с гаплоидным набором хромосом отличались по морфологическим признакам. Так, они имели более удлиненную листовую пластинку, иную зазубренностью ее края, чем исходные растения, отличались медленным темпом роста и слабым образованием стеблей-усов.

Адаптация микрорастений к условиям открытого грунта

Адаптация укорененных in vitro клонов является наиболее сложным и критическим моментом в процессе выращивания растений-регенерантов. На этом этапе часто наблюдается большой процент гибели регенерантов, что снижает эффективность проведенной работы. Растения на этапе адаптации должны привыкнуть к жестким условиям внешней среды при дальнейшем пребывании в открытом грунте.

Для переноса в нестерильные условия отбирали крепкие растения высотой от 5 до 7 см. Эти растения высаживали в почвенный субстрат (перегной, песок, дерновая земля в соотношениях 1:1:1) в малогабаритную пленочную теплицу при схеме посадки 5*5 см. Теплица была оборудована установкой воздушно-капельного орошения. Регулярность поливов зависела от показателей влажности.

Испытаны два варианта адаптации пробирочных растений-регенерантов к условиям открытого грунта. В первом варианте андрогенные побеги без корней перед высадкой в грунт обрабатывали раствором (1,0 мг ИМК в 1,0 мл воды) в течение 5-7 секунд; во втором - использовали побеги с уже образовавшимися в условиях in vitro корнями без обработки стимулятором (табл. 8).

Таблица 8 - Результаты адаптации растений-регенерантов некоторых сортов земляники, высаженных в теплицу (2009 г.)

Сорт Вариант Высажено растений, шт. % адаптации

Урожайная ЦГЛ с корнями 39 92,3±4,27

без корней (обработка ИМК) 34 70,6±7,81

Фейерверк с корнями 38 89,5±4,80

без корней (обработка ИМК) 33 66,7±8,20

Золушка с корнями 35 88,6±5,37

без корней (обработка ИМК) 37 67,6±7,70

В результате проведенных исследований было установлено, что у всех испытанных генотипов адаптация выше в варианте, где используются растения, укорененные in vitro без обработки их стимулятором. Отмечено, что у сортов селекции ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина процесс адаптации проходил активнее, чем у сорта Золушка селекции ВСТИСП,Около половины адаптированных in vitro регенерантов в 2010 году цвели и плодоносили.

Экономическая эффективность выращивания посадочного материала андрогенных растений земляники с применением метода клонального микроразмножения

Полученные методом андрогенеза in vitro растения земляники различных уровней плоидности (от гаплоидных до полиплоидных) представляют большую ценность для генетики и селекции. Так, их включение в селекционную работу позволяет значительно, на несколько гибридных поколений ускорить процесс получения новых сортов и тем самым сэкономить затраты рабочей силы и материальных средств. Однако зачастую андрогенные растения индуцируются в небольших количествах, и для их передачи и внедрения в селекционно-генетическую практику возникает необходимость ускоренного размножения. Проведено сравнение экономической эффективности производства селекционного посадочного материала земляники через культуру in vitro и в условиях in vivo (табл. 9).

Процесс размножения в культуре in vitro позволяет более эффективно использовать производственные площади лаборатории. В результате с 1м2культу-ральной комнаты от 920 исходных микрочеренков (при среднем коэффициенте размножения 10) выход новых побегов за пассаж достигает значительных величин. С учетом потерь на этапах ризогенеза in vitro и адаптации in vivo выход растительного материала составляет 87,5 % и 90,0 % соответственно. В то же время, при стандартной схеме посадки 5x5 см, с единицы тепличной площади выход укорененных растений земляники составляет в среднем 78,0 %.

Таблица 9 - Экономическая эффективность выращивания посадочного материала андрогенных растений земляники сорта Золушка с применением метода клонального микроразмножения

Показатели Технология размножения растений-регенерантов

с применением метода in vitro в условиях in vivo

Исходное количество материала на 1 м2, шт. 920 400

Выход материала с 1 м2 теплицы или культурапьной комнаты за 1 пассаж, шт. 9200 312

Выход адаптированных стерильных растений после доращивания ш vivo, шт. 7245 -

Полные затраты, руб. 28565 1516

Себестоимость, руб. 3,9 4,9

Средняя цена реализации, руб./шт. 10 10

Стоимость валовой продукции, руб. 72450 3120

Прибыль, руб. 43885 1604

Уровень рентабельности, % 153,6 105,8

Результаты расчета и сравнения экономической эффективности производства селекционного посадочного материала земляники через культуру in vitro и в условиях in vivo показали, что технология микроразмножения требует больших капиталовложений на единицу площади, но высокий выход растительного материала на этапе размножения и успешная приживаемость микрорастений на этапе доращивания обеспечивает существенное снижение себестоимости саженца по сравнению со стандартной методикой и повышение рентабельности производства на 47,8 %.

Выводы

1. Наибольший андрогенетический потенциал выявлен у сортов земляники отечественной селекции, в первую очередь полученные во ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина (Урожайная ЦГЛ, Фейерверк, Привлекательная), а также сорт Золушка селекции ВСТИСП.

2. Разработана методика получения андрогенных растений-регенерантов у сортов Золушка, Урожайная ЦГЛ, Фейерверк, адаптированных к условиям открытого грунта.

3. Присутствие в инициальной среде 1,0 мг/л 2,4-Д позволяет получать каллусы из пыльников, хотя и с разной частотой, у всех изученных генотипов земляники. Для повышения частоты каллусообразования у сортов Урожайная ЦГЛ, Десертная, Кама лучше использовать в инициальных питательных средах в качестве цитокинина зеатин. У сортов Львовская ранняя, Фестивальная ромашка, Редгонтлит - 6-БАП. Для сортов Золушка и Привлекательная лучшие результаты даёт наличие в среде как 6-БАП, так и кинетина, а у сорта Фейерверк можно использовать все три цитокинина (6-БАП, кинетин и зеатин). Концентрация всех цитокининов при этом составляет - 2,0 мг/л.

4. Для индукции андрогенеза in vitro следует использовать пыльники с пыльцой на одноядерной стадии развития. Холодовая предобработка пыльников с экспозицией в 3 суток оказывает положительное влияние на выход андрогенных образований.

5. По морфологическому показателю выявлены два типа андрогенных каллусов: I - морфогенные, которые чаще всего встречаются у сортов Урожайная ЦГЛ, Фейерверк, Золушка; II - неморфогенные отмечены у сортов Фестивальная ромашка, Десертная, Привлекательная. Лучшими по интенсивности пролиферации каллусной массы являются сорта Урожайная ЦГЛ (4,2 балла), Фейерверк (3,9 балла) и Привлекательная (3,7 балла).

6. Отмечено, что на среде для каллусогенеза (6-БАП 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л) сорта земляники Фейерверк и Урожайная ЦГЛ способны образовывать побеги-регенеранты с частотой 12,7% и 7,2% соответственно. Сорт Золушка на данной среде образует рсгснеранты до 2%.

7. Выявлены две наиболее продуктивные регенерационные среды для сорта Золушка следующего состава (в мг/л): 6-БАП 2,0 + зеатин 2,0 + НУК 1,0 и 6-БАП 2,0 + ИУК 1,0. Отмечено влияние сред для каллусогенеза (6-БАП 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л и кинетин 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л), оказывающие благоприятное воздействие на последующую морфогенную активность андрогенных каллусов.

8. На этапе микроразмножения земляники наиболее эффективными являются концентрации в питательной среде 6-БАП 1,0 и 2,0 мг/л. При укоренении лучшие результаты дает присутствие в среде 3,0 мг/л ИМК. Среди полученных регенерантов сорта Золушка отмечено около 20 % гаплоидных.

9. При переносе пробирочных растений земляники в открытый грунт лучше использовать укорененные in vitro растения. Однако возможно использование побегов без корней, но обработанных раствором ИМК, так как в данном

случае преимуществом является отсутствие этапа укоренения в условиях in vitro.

10. Использование метода клонального микроразмножения при получении посадочного материала андрогенных растений земляники сорта Золушка обеспечивает увеличение рентабельности производства на 47,8 %.

Рекомендации для практического использования

Рекомендуем методы получения растений-регенерантов в культуре пыльников in vitro у сортов земляники Урожайная ЦГЛ, Фейерверк и Золушка. Они включают: сбор бутонов размером не более 4-5 мм, которые содержат пыльники с пыльцой на одноядерной стадии развития, холодовую предобработку пыльников продолжительностью 3 суток, их посев на питательные среды по MS следующего состава: 6-БАП 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л и зеатин 2,0 мг/л + НУК 0,5мг/л. Для сортов Урожайная ЦГЛ и Фейерверк эти среды являются также морфогенными. У сорта Золушка для индукции морфогенеза каллусы следует переносить на среды (в мг/л): 6-БАП 2,0 мг/л + зеатин 2,0 мг/л + НУК 1,0 мг/л и 6-БАП 2,0 мг/л + ИУК 1,0 мг/л.

Размножение полученных андрогенных побегов-регенерантов рекомендуем проводить на среде с 6-БАП 1,0 и 2,0 мг/л по MS. Для их укоренения следует использовать среду с ИМК в концентрации 3,0 мг/л. Адаптацию пробирочных растений необходимо осуществлять в пленочной теплице с воздушно-капельной установкой. Высаживать лучше укорененные в условиях in vitro растения, или использовать не укорененные побеги, обработав их концы раствором (1,0 мг ИМК в 1,0 мл воды) в течение 5-7 секунд. В целях повышения рентабельности производства селекционно-ценного посадочного материала земляники следует применять метод клонального микроразмножения.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Туровцева, Е. С. Влияние физиологически активных веществ на анд-рогенную активность пыльников земляники в условиях in vitro [Текст] / Е. С. Туровцева, О. Я. Олейникова Н Перспективы селекции яблони и других культур для промышленных насаждений : материалы Всерос. науч.-практич. конф., посвященные 130-летию со дня рождения С. Ф. Черненко, 21-23 ноября 2007 года. - Мичуринск-наукоград РФ, 2007. - С. 139-142.

2. Савельев, Н. И. Андрогенез in vitro малины и земляники [Текст] / Н. И. Савельев, О. Я. Олейникова, Н. С. Ильина, Е. С. Туровцева // Вестник Мич ГАУ. - Мичуринск-наукоград РФ, 2008.-№ 1.-С. 12-16.

3. Туровцева, Е.С. Влияние каллусоиндуцирующих сред на выход андрогенных каллусов земляники и их морфологию / Е.С. Туровцева // «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии»: 8-я молодежная научная конференция 2 апреля 2008 года. - Москва, 2008. - С. 38-40.

4. Туровцева, Е.С. Андрогенез in vitro земляники / Е.С. Туровцева, О.Я. Олейникова // Современное растениеводство России: Практика и научные достижения «Arpo XXI». - Москва, 2009. - С. 27-29.

5. Туровцева, Е.С. Влияние различных факторов на андрогенез in vitro земляники / Е.С. Туровцева // Современная школа в инновационном процессе: проблемы и перспективы: сб. материалов, посвященный 70-летию Мичуринского государственного педагогического института. - Мичуринск: МГПИ, 2009. -С. 102-104.

6. Туровцева, Е.С. Культура in vitro пыльников земляники I Е.С. Туровцева // Достижения науки и инновации в садоводстве : материалы Международной науч.-практ. конф., посвященной 75-летию со дня рождения лауреата государственной премии РФ, заслуженного деятеля науки, проф. В.А. Потапова 14-16окт.2009 г.-Мичуринск-наукоградРФ,2009.-С. 134-137.

7. Туровцева, Е.С. Особенности культивирования in vitro пыльников земляники / Е.С. Туровцева // Материалы 61-й научно-практической конференции студентов и аспирантов: сб. науч. тр. Всерос. науч.-практ. конф. 25-26 марта 2009 г. - Мичуринск-наукоград РФ, 2009. - С. 97-99.

8. Савельев, Н. И. Андрогенез in vitro плодовых и ягодных растений / Н. И. Савельев, О. Я. Олейникова, Н. С. Ильина, Е. С. Туровцева // Доклады РАСХН. - Москва, 2010. - №1. - С. 13-15.

9. Протасова, Е. С. Влияние холодовой предобработки и стадии развития пыльцы на выход каллусов земляники. / Е. С. Протасова II Университетское образование: традиции и инновации: материалы международного молодежного форума: 26 января 2010 г. Россия, г. Ульяновск, Часть II - Ульяновск, 2010. -С. 247-249.

Отпечатано в издательско-полиграфическом центре МичГАУ Подписано в печать 24.09.10г. Формат 60x84 '/16, Бумага офсетная № 1. Усл.печ.л. 1,3 Тираж 120 экз. Ризограф Заказ № 15087

Издательско-полиграфический центр Мичуринского государственного аграрного университета 393760, Тамбовская обл., г. Мичуринск, ул. Интернациональная, 101, тел. +7 (47545) 5-55-12

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Протасова, Екатерина Сергеевна

Введение.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы получения гаплоидов и их значение в 6 селекционно-генетических исследованиях.

1.2. Андрогенез растений в культуре in vitro.

1.2.1. Индукция каллусогенеза.

1.2.2. Морфогенез и регенерация растений.

1.2.3. Микроразмножение и укоренение регенерантов.

1.3. Методы адаптации пробирочных растений-регенерантов к нестерильным почвенным условиям.

1.4. Культура пыльников земляники.

ГЛАВА 2. ЦЕЛЬ, ЗАДАЧИ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА

ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Цель и задачи исследований.

2.2. Объекты и методика проведения исследований.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ПРОЦЕСС КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO ПЫЛЬНИКОВ ЗЕМЛЯНИКИ.

3.1. Генотип растений-доноров.

3.2. Минеральный и гормональный состав питательных сред.

3.3. Стадия развития пыльцы.

3.4. Холодовая предобработка пыльников растений-доноров.

3.5. Морфологические особенности андрогенных каллусов.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ПРИЕМОВ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ

В КУЛЬТУРЕ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ.

4.1. Индукция побегов-регенерантов в каллусных тканях.

4.2. Размножение и укоренение андрогенных побегов на искусственных питательных средах.

ГЛАВА 5. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АНДРОГЕННЫХ

РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ.

ГЛАВА 6. АДАПТАЦИЯ МИКРОРАСТЕНИЙ К УСЛОВИЯМ

ОТКРЫТОГО ГРУНТА.

ГЛАВА 7. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЫРАЩИВАНИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА АНДРОГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ.

Выводы.

Рекомендации для практического использования.

Список используемой литературы.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Совершенствование метода андрогенеза in vitro у земляники (Fragaria ananassa Duch.)"

Интенсификация современного сельскохозяйственного производства плодово-ягодной продукции требует разработки селекционно-генетических методов ускоренного создания новых, более высокопродуктивных и совершенных сортов ягодных растений, в частности земляники. Наряду с классическими методами, основанными на гибридизации, весьма актуальным является использование в решении данной проблемы современных биотехнологических методов, к которым, относится метод андрогенеза in vitro — культивирование на искусственных питательных средах пыльников и микроспор. Основной интерес к данному методу связан с тем, что это самый эффективный и быстрый способ получения гаплоидов, а на их основе — гомозиготных форм растений. Удвоение числа хромосом гаплоидов приводит всего за одну генерацию к достижению гомо-зиготности по всем локусам. Использование гомозиготных линий в гибридной селекции позволяет заранее предвидеть характер наследования признаков в потомстве, своевременно выбраковывать ненужный селекционный материал, быстро стабилизировать сорта и тем самым строго программировать селекционную работу, экономя время и материальные затраты. К настоящему времени этим способом удалось получить гаплоиды у многих однолетних и двулетних важнейших сельскохозяйственных культур.

Весьма актуально изучение проблемы получения гаплоидных и гомозиготных растений методом андрогенеза у земляники. Для этой ягодной культуры эффективные методы культивирования пыльников in vitro не разработаны. Это обусловлено, прежде всего, недостаточной изученностью механизмов каллусо-, эмбрио - и морфогенеза, влияния различных факторов на эти процессы и, как следствие этого, низким процентом образования каллусов или эмбриоидов. Большие трудности связаны с регенерацией растений и их плохой адаптацией к естественным почвенным условиям. Из отдельных, часто наиболее ценных генотипов, вообще не удается получить регенеранты при культивировании пыльников. Сложность решения этой проблемы связана с тем, что морфогенетиче-ский потенциал ягодных растений намного слабее по сравнению с однолетними культурами и поэтому труднее индуцировать регенеранты из изолированной ткани. Условия получения растений in vitro, разработанные для одних сортов и тем более видов, как правило, оказываются неэффективными для других и требуют существенных модификаций.

Положения, выносимые на защиту:

1. Приемы индукции каллусной ткани и регенерация растений в культуре пыльников земляники.

2. Условия размножения и укоренения полученных побегов-регенерантов.

3. Морфологическая и цитологическая оценка растений-регенерантов.

4. Способы адаптации растений-регенерантов к условиям открытого грунта.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Протасова, Екатерина Сергеевна

Выводы

3. Присутствие в инициальной среде 1,0 мг/л 2,4-Д позволяет получать каллусы из пыльников, хотя и с разной частотой, у всех изученных генотипов земляники. Для повышения частоты каллусообразования у сортов Урожайная ЦГЛ, Десертная, Кама лучше использовать в инициальных питательных средах в качестве цитокинина зеатин. У сортов Львовская ранняя, Фестивальная ромашка, Редгонтлит — 6-БАП. Для сортов Золушка и Привлекательная лучшие результаты даёт наличие в среде как 6-БАП, так и кинетина, а у сорта Фейерверк можно использовать все три цитокинина (6-БАП, кинетин и зеатин). Концентрация всех цитокининов при этом составляет — 2,0 мг/л.

5. По морфологическому показателю выявлены два типа андрогенных каллусов: I — морфогенные, которые чаще всего встречаются у сортов Урожайная ЦГЛ, Фейерверк, Золушка; II - неморфогенные отмечены у сортов Фестивальная ромашка, Десертная, Привлекательная. Лучшими по интенсивности пролиферации каллусной массы являются сорта Урожайная ЦГЛ (4,2 балла), Фейерверк (3,9 балла) и Привлекательная (3,7 балла).

Рекомендации для практического использования

Рекомендуем методы получения растений-регенерантов в культуре пыльников in vitro у сортов земляники Урожайная ЦГЛ, Фейерверк и Золушка. Они; включают: сбор бутонов размером не более 4—5 мм, которые содержат пыльники: с пыльцой на одноядерной стадии развития, холодовую предобработку пыльников продолжительностью 3 суток, их посев на питательные среды по MS еле— дующего состава: 6-БАП 2,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л и зеатин 2,0 мг/л + НУЬС; 0,5мг/л. Для сортов Урожайная ЦГЛ и Фейерверк эти среды являются такж<^ морфогенными. У сорта Золушка для индукции морфогенеза каллусы следует^ переносить на среды (в мг/л): 6-БАП 2,0 мг/л + зеатин 2,0 мг/л + НУК 1,0 мг/л 6-БАП 2,0 мг/л + ИУК 1,0 мг/л.

Размножение полученных андрогенных побегов-регенерантов рекомендуй ем проводить на среде с 6-БАП 1,0 и 2,0 мг/л по MS. Для их укоренения следу использовать среду с ИМК в концентрации 3,0 мг/л. Адаптацию пробирочные растений необходимо осуществлять в пленочной теплице с воздушно-капельно^ установкой. Высаживать лучше укорененные в условиях in vitro растения, hji^j использовать не укорененные побеги, обработав их концы раствором (1,0 ivxr ИМК в 1,0 мл воды) в течение 5-7 секунд. В целях повышения рентабельности производства селекционно-ценного посадочного материала земляники следу применять метод клонального микроразмножения.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Протасова, Екатерина Сергеевна, Мичуринск-наукоград РФ

1. Абрамов, С. Н. Статусы пыльника пшеницы при холодовом стрессе: Докл. Годичное собрание Всерос. общ-ва физиологов раст. (ВОФР) Уфа, 19-22 июня, 2001. / С. Н. Абрамов // Вестн. Башк. ун-та. 2001. - №2. - С. 100-102.

2. Азиходжаев, А. Влияние мезоинозита на морфогенез недоразвитых зародышей хлопчатника in vitro / А. Азиходжаев, 3. М. Умаров // Узбекский биологический журнал. 1985. - №5. - С. 49-50.

3. Анапиляев, Б. Б. Влияние генотипа на частоту регенерации растений в культуре микроспор ТгШсит аезйуит, Ь. / Б. Б. Анапиляев // Генетика. — 2000. Том 36, №4. - С. 505-509.

4. Атанасов, А. Биотехнология в растениеводстве / А. Атанасов. — Новосибирск : ИЦиГ СО РАН, 1993.-241 с.

5. Батыгина, Т. Б. Хлебное зерно / Т. Б. Батыгина. — Л. : Наука, 1987. — 103 с.

6. Батыгина, Т. Б. Культура изолированных пыльцевых злаков с позиции эмбриологии растений (Методологические разработки) / Т. Б. Батыгина, Н. Н. Круглова, В. Ю. Горбунова. Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. - 32 с.

7. Батыргожин, Б. А. Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды: Тез. сообщ. / Б. А. Батыргожин, Б. Б. Анапиляев, Н. Л. Богуслаев / Иркутск, 8-12 июля, 1991. Иркутск, 1991.-С. 86.

8. Бобков, С. В. Получение корнесобственных регенерантов в культуре пыльников проса / С. В. Бобков // Вестник РАСХН. 2000. - №5. - С. 41.

9. Бобков, С. В. Получение корнесобственных регенерантов растений проса в культуре незрелых соцветий и пыльников / С. В. Бобков // С.-х. биол. Сер. Биол. раст. 2002. - №5. - С. 65-68.

10. Бобков, С. В. Культуры изолированных пыльников и микроспор гороха Pisum sativum L./ С. В. Бобков // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тезисы X Междунар. конф. (Звенигород, 8-12 сент. 2008 г.). — М., 2008. С. 48.

11. Бондаренко, Е. Д. Особенности клонального размножения in vitro сортов земляники ананасной / Е. Д. Бондаренко, Н. И. Кисель // С.-х. биол. — 2002. № 1. - С. 81-84.

12. Бугара, А. М. Влияние холодовой предобработки на индукцию андрогенного развития в пыльниках кориандра / А. М. Бугара, Н. А. Егорова, С. А. Резников. // Физиология растений. — 1985. — Том 32, вып. 3. — С. 558-564.

13. Бугара, А. М. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек in vitro как способ получения гаплоидных растений / А. М. Бугара, Л. В. Русина // Физиология и биохимия культурных растений. — 1988. 20, №5. — С. 419-430.

14. Бургутин, А. Б. Микроклональное размножение винограда / А. Б. Бургу-тин // Биология культ, клеток и биотехнология растений. — М.: Наука, 1991. -С. 216-220.

15. Бутенко, Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р. Г. Бутенко. М.: Наука, 1964. — 272 с.

16. Бутенко, Р. Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений / Р. Г. Бутенко. — М.: Наука, 1975. 51 с.

17. Бутенко, Р. Г. Выращивание клеток высших растений в суспензионной культуре / Р. Г. Бутенко // Изв. АН ССР. Сер. Биол. 1977. - № 5. - С. 697-709.

18. Вершкова, Л. П. Получение регенерантов земляники в культуре пыльников и листовых эксплантов / Л. П. Вершкова // Молодые ученые — садоводству России: Тез. докл. Всерос. совещ. -М., 1995. С. 154-156.

19. Высоцкий, В. А. Регенерация плодовых и ягодных растений в культуре каллусной ткани пыльников, листовых и стеблевых эксплантов Текст. / В. А. Высоцкий, Л. В. Алексеенко // Садоводство и виноградарство. — 2008.-№2.-С. 17-20.

20. Высоцкий, В. А. Возможности регенерации растений земляники и малины из каллусов различного происхождения / В. А. Высоцкий, Ф.Н. Хамукова // Ягодоводство в Нечерноземье. М., 1993. - С. 19-24.

21. Гаврикова, Jl. И. Культура пыльников земляники / Л. И. Гаврикова,

22. B. Г. Трушечкин // Проблемы интенсификации садоводства в нечерноземной зоне РСФСР. М., 1985. - С. 73-77.

23. Гаврилова, А. И. Культура пыльников как метод размножения земляники / А. И. Гаврилова // Проблемы вегетативного размножения в садоводстве: Сб. науч. тр.-М., 1985.-С. 128-132.

24. Гамбург, К. 3. Биохимия ауксина и его действия на клетки растений. — Новосибирск, 1976. — 272 с.

25. Гамбург, К.З. Ауксины в культурах тканей и клеток растений / К. 3. Гамбург, Н. И. Рекославская, С. Г. Швецов. — Новосибирск: Наука, 1990.-243 с.

26. Геринг, X. Преодоление витрификации и улучшение акклиматизации растений при клональном микроразмножении / X. Геринг // Биология культ, клеток и биотехнология растений. — М.: Наука, 1991. С. 197-200.

27. Говорова, Г. Ф. Иммунологическое улучшение сортимента земляники в России / Г. Ф. Говорова, М. Д. Калиженкова, В. В. Мазин, Д. Н. Говоров // Сельскохозяйственная биотехнология. М: Воскресенье, 2000. — Т. 1. —1. C. 115-131.

28. Голованова, И. В. Генетические ресурсы и эффективные методы создания нового селекционного материала сельскохозяйственных растений: тез. докл. / И. В. Голованова, Е. Д. Никитина. Новосибирск, 1994. - С. 20-22.

29. Горбунова, В. Ю. Генетические предпосылки спорофитного пути развития микроспор злаков в условиях in vitro / В. Ю. Горбунова. — Уфа: УНЦ РАН, 1993.- 104 с.

30. Горбунова, В. Ю. Андрогенез in vitro яровой пшеницы: Автореф. дис. .докт. биол. наук / В. Ю. Горбунова. Уфа, 2000. - 48 с.

31. Горбунова, В. Ю. Новые методы биотехнологии растений / В. Ю. Горбунова, Н. Н. Круглова: Тез. докл. III Российск. симп. — Пугцино, 1995. С. 18.

32. Горбунова, В. Ю. Эмбриоидогенез в культуре пыльников пшеницы: цито-лого-гистологические аспекты / В. Ю. Горбунова, Н. Н. Круглова, Н. Н. Потапова. Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. - Ч. 1. - 63 с.

33. Гродзинский, А. М. Краткий справочник по физиологии растений /

34. A. М. Гродзинский, Д. М. Гродзинский. — Киев: Наукова думка. 1973. -590 с.

35. Гудвинг, Т. Введение в биохимию растений / Т. Гудвинг, Э. Мерсер. — М.: Мир, 1986.-С. 203-267.

36. Давыдова, Н. Н. Усовершенствование метода культуры пыльников для использования в селекционном процессе капусты (Brassica oleraceae L.): Автореф. дис. . канд. с.-х. наук/Н. Н. Давыдова. -М., 2008. — 25 с.

37. Данвелл, Дж. М. Культуры гаплоидных клеток / Дж. М. Данвелл // Биотехнология растений: культура клеток. М.: Агропромиздат, 1989. -С. 33-51.

38. Деменко, В. И. Микроклональное размножение плодовых и ягодных растений /

39. B. И. Деменко // Докл. ТСХА. 2000. - Вып. 271. - С. 77-79.

40. Дёрфлинг, К. Гормоны растений. Системный подход. / К. Дёрфлинг. М.: Мир, 1985.-304 с.

41. Домблидес, А. С. Разработка лабораторной технологии получения гино-генных растений моркови in vitro: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук / А. С. Домблидес. М., 2001. - 23 с.

42. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта : (С основами стат. обраб. результатов исслед.) / Б.А. Доспехов. М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.

43. Жуков, О. С. Методические рекомендации по получению растений-регенерантов плодовых пород в культуре пыльников /• О. С. Жуков,

44. Зайнутдинова, Э.М. Особенности регенерации растений из каллусной ткани пшеницы в присутствии абсцизовой кислоты / Э. М. Зайнутдинова,

45. Зайцев, Д. Ю. Потенциально морфогенные андроклинные каллусы как дополнительный источник дигаплоидов / Д. Ю. Зайцев // Материалы 4 съезда Общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова, Пущино, 6-7 дек. 2006 г. М., 2006. - С. 77-78.

46. Зубенко, В. Ф. Использование культуры изолированных неоплодотворен-ных семяпочек для получения гаплоидов сахарной свеклы / В. Ф. Зубенко,

47. B. Е. Белоус, Н. А. Олейник, А. Г. Бердышев, JI. П. Перфильева // Матер. Всесоюз. науч. конф. по с.-х. биотехнологии, Целиноград, 27-28 июля, 1991 г. Целиноград. 1991. - С. 73-74.

48. Искакова, К. М. Морфогенез в длительно поддерживаемой культуре анд-рогенных каллусов ячменя: Автореф. дис. . канд. биол. наук / К. М. Искакова. Алма-Ата: Казах, гос. ун-т, 1991. - 21 с.

49. Калинин, Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Киев: Наукова думка, 1980.-399 с.

50. Карпеченко, Г. Д. Полиплоидные гибриды Raphanus sativus L. X Brassica olercea L. / Г. Д. Карпеченко // Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции. -1927.-С. 17.

51. Касаева, К. А. Использование гаплоидии в селекции зерновых культур / К. А. Касаева // Агропромышленное производство: опыт, проблемы и тенденции развития. 1988. - № 2. - С. 23-30.

52. Кастрицкая, М. С. История культуры зародышей in vitro / М. С. Кастрицкая // Плодоводство: Науч. тр. / Институт Плод. HAH Беларуси. Самохваловичи, 2002.— Т. 14-С. 161-166.

53. Катаева, Н. В. Особенности микроразмножения трудноукореняемых сортов яблони / Н. В. Катаева // Сельскохозяйственная биология. — 1986. — №4. -С. 18-22.

54. Катаева, Н. В. Клональное размножение растений в культуре ткани / Н. В. Катаева, В. А. Аветисов // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981.-С. 137-149.

55. Катаева, Н. В. Клональное микроразмножение растений / Н. В. Катаева, Р. Г. Бутенко. М.: Наука, 1983. - 97 с.

56. Кефели, В.И. Рост растений / В. И. Кефели. М.: Колос, 1984. - 175 с.

57. Круглова, Н. Н. Каллусогенез как путь морфогенеза в культуре пыльников злаков / Н. Н. Круглова, В. Ю. Горбунова // Успехи современной биологии. 1997.-Т. 117, №1. -С. 83-94.

58. Круглова, Н. Н. Морфогенез в культуре изолированных пыльников: роль фитогормонов / Н. Н. Круглова, В.Ю. Горбунова, В.А. Куксо // Успехи современной биологии. -1999. Том 119, № 6. - С. 567-577.

59. Круглова, Н. Н. Культура изолированных пыльников злаков: точка зрения эмбриолога. 4 пути развития спорогенных клеток in vitro / Н. Н. Круглова, П. А. Куксо, Т. М. Золотова, О. А. Сельдимирова // Инф. Бюллетень / Ин-т цитол. РАН,-2001.-№ 16.-С. 17-19.

60. Круглова, Н. Н. Цитофизиологические особенности различных типов анд-роклинных каллусов пшеницы / Н. Н. Круглова, О. А. Сельдимирова,

61. Д. Ю. Зайцев // Физиология и биохимия культурных растений. -2007. — 39, № 1.-С. 42-50.

62. Куликов, И. М. Биотехнологические приемы в садоводстве: экономические аспекты / И. М. Куликов, В. А. Высоцкий, А. А. Шипунова // Садоводство и виноградарство. М., 2005. — №5. - С. 24-27.

63. Лаврова, Н.В. Технологические аспекты создания андрогенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы / Н. В. Лаврова. — М.: МСХА, 2006. 124 с.

64. Лозариду, Т. В. Влияние холодовой предобработки на культивируемые пыльники ячменя разных генотипов / Т. В. Лозариду, А. С. Литургидис, С. Т. Котцаманидис, Д. Г. Рупакиас // Физиология растений. 2005. — 52, №2.-С. 781-785.

65. Лукьянюк, С. Ф. Метод гаплоидии в селекции зерновых культур / С.Ф. Лукьянюк // С.-х. биология. 1983. -№ 5. - С. 8-18.

66. Лукьянюк, С. Ф. Получение гаплоидов ячменя с помощью гаплопродюсе-ров / С. Ф. Лукьянюк, С. А. Игнатова // Методические рекомендации. — Одесса. 1983.-21 с.

67. Матушкина, О. В. Адвентивный органогенез в культуре тканей / О. В. Матушкина // Повышение эффективности садоводства в современных условиях: Материалы Всерос. науч.-практ. конф. Мичуринск, 2003. -Т. I.-C. 155-159.

68. Мишуткина, Л. В. Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации растений сахарной свеклы {Beta vulgaris L.) in vitro / Л. В. Мишуткина, А. К. Гапоненко // Генетика. -2006. 42, № 2. - С. 210-218.

69. Мозафари, А. А. Особенности микроклонального размножения новых сортов земляники Текст. / А. А. Мозафари, Г. Ф. Говорова, М. Д. Калиженкова // Плодоводство / Ин-т плод. НАН Беларуси. — Самохваловичи, 2004. -Т. 16. С. 202-205.

70. Муравлев, А. А. Культура пыльников в селекции ярового рапса : автореф. дис. . канд. биол. наук / А. А. Муравлев. Саратов, 2007. - 24 с.

71. Муромцев, Г. С. Регуляторы роста растений / Г. С. Муромцев // Аграрная наука. 1993. -№3. - С. 21-24.

72. Муромцев, Г. С. Основы сельскохозяйственной биологии / Г. С. Муромцев, Р. Г. Бутенко, Т. И. Тихоненко, М. И. Прокофьев. — М.: Аг-ропромиздат, 1990. 384 с.

73. Навашин, М. С. Новая возможность в селекции (об использовании гаплоидов) / М. С. Навашин // Семеноводство. 1933. - № 2. - С. 11-16.

74. Никитина, Н. И. Культура неоплодотворенных семяпочек подсолнечника / Н. И. Никитина, Т. С. Федоренко, А. Ю. Боровков // Науч.-техн. бюл. / ВНИИС пасл. культур. 1989. - №3. - С. 14-16.

75. Осипова, Л. В. Микроклональное размножение земляники в искусственной культуре / Л. В. Осипова, С. Л. Расторгуев, В. М. Тюленев // Бюл. науч. информ. Центр. Генет. Лаб. 1986. - Вып. 43. - С. 27-31.

76. Павлова, М. К. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек: возможности и перспективы / М. К. Павлова // С.-х. биология. 1987. - №1. -С. 27-30.

77. Паушева, 3. П. Практикум по цитологии растений / 3. П. Паушева. М.: Колос.-1974.-С. 288.

78. Петров, Д. Ф. Генетика с основами селекции, изд. 2-е, доп. Учеб. Пособие для ун-тов. М.: «Высшая школа», 1976. - С. 111.

79. Полевой, В. В. Фитогормоны: Учебное пособие / В. В. Полевой. — Л.: Изд-во Ленингр. Ун-та, 1982. 248 с.

80. Пронина, И. Н. Влияние ИМК и ИУК на ризогенез плодовых и ягодных культур in vitro / И.Н. Пронина // Методы эффективного ведения садоводства: сб. науч. тр. Мичуринск, 1996. - С. 137-147.

81. Расторгуев, С. Л. Совершенствование селекционного процесса плодовых и ягодных растений на основе цитологических методов и культуры изолированных тканей: автореф. дис. . докт. с-х. наук / С. Л. Расторгуев — Мичуринск, 2008.-42 с.

82. Роньжина, Е.С 6-бензиламинопурин высокоэффективный экологически безопасный регулятор роста растений / Е. С. Роньжина // Вопросы сельского хозяйства: Междунар. сб. науч. тр. / Калинингр. Гос. тех. ун-т. — Калининград, 2003. - С. 119-127.

83. Сельдимирова, О. А. Развитие микроспориальных эмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы / О. А. Сельдимирова, С. Н. Абрамов, Н. Н. Круглова // Физиол. и биохимия культ, раст. 2004. - 36, №4. — С. 320-326.

84. Синнот, Э. Морфогенез растений / Э. Синнот.- М. 1963. — 603 с.

85. Соколов, В. А. Технология гаплоидов в генетике и селекции растений /

86. B. А. Соколов, В. К. Шумный // Вавиловское наследие в современной биологии. -М.: Наука, 1989. С. 247-269.

87. Сорока, А. И. Влияние состава среды каллусогенеза и регенерации в культуре пыльников льна / А. И. Сорока // Цит. и генетика. 2004. - Т. 38, №2. —1. C. 20-25.

88. Солдатов, И. В. Экспериментальная гаплоидия у сливы домашней / И. В. Солдатов // Генет. аспекты селекции в Киргизии. Фрунзе: Изд-во «Илим», 1982.-С. 100-102.

89. Солдатов, И. В. Гаплоиды косточковых плодовых растений и их использование в селекции / И. В. Солдатов // Генет. аспекты селекции в Киргизии. Генетика, селекция и семеноводство растений. 1986. - С. 102-106.

90. Спивак, В. А. Влияние физиологически активных веществ на морфогенез пыльников пшеницы в культуре in vitro / В. А. Спивак, О. Н. Головинская, Б. Г. Быховцев // Вопр. биохимии и физиол. раст. и микроорганизмов. — 1991. -№12. С. 66-73.

91. Тивари, Ш. Морфогенез в культуре пыльников и изолированных микроспор ячменя: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Ш. Тивари. М.: ТСХА, 1989.-25 с.

92. Тивари, Ш. Цитогенетическая гетерогенность андрогенных каллусов ячменя / Ш. Тивари, С. Колумбаева, И. Р. Рахимбаев // Цитология и генетика.- 1990.-С. 12-15.

93. Тивари, Ш. Регуляторы роста и развития растений / Ш. Тивари, И.Р. Рахимбаев : Тез. докл. II Всесоюз. конф. -Киев, 1989. С. 295.

94. Туровская, Н. И. Особенности микроклонального размножения земляники / Н. И. Туровская, О. В. Стрыгина, JI. Алыпевцева // Сб. науч. тр. / ВНИИ садов-ва им. И. В. Мичурина. Мичуринск, 1986. - Вып. 47. - С. 49-56.

95. Тюкавин, Г. Б. Основы метода андрогенеза моркови in vitro путем каллу-согенеза / Г. Б. Тюкавин. ГАВРИШ, 2006. - №4. - С. 28-32.

96. Хамукова, Ф. Н. Регенерация растений земляники и малины из эксплантов различного происхождения : автореф. дис. . канд. с.-х. наук / Ф. Н. Хаму-кова.-М., 1994.-22 с.

97. Хохлов, С. С. Гаплоидия и селекция / С. С. Хохлов, Е. В. Гришина и др. — М.: Наука, 1976.-221 с.

98. Шамина, 3. Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор / 3. Б. Шамина // Культура клеток растений. М., 1981 - С. 124-136.

99. Шевелуха, В. С. Современные проблемы гормональной регуляции живых систем и организмов / В. С. Шевелуха // Регуляторы роста и развития : Сб. тез. докл. III конф. М., 1997. - С. 3-4.

100. Шипунова, А. А. Влияние некоторых факторов культивирования на кло-нальное микроразмножение плодовых и ягодных растений / А. А. Шипунова, В. А. Высоцкий // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. работ / ВСТИСП. М., 2002. - Т. IX. - С. 193-200.

101. Шмыкова, Н. А. Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур : авто-реф. дис. . докт. с-х. наук. М., 2006. - 47 с.

102. Anderson, R. L. Rooting of tissue cultured rhododendrons / R. L. Anderson // The inter. Plant. Prop. Soc. 1978. -V. 28. - P. 135-139.

103. Arnison, P. G. Genotype specific response of cultured broccoli (Brasssica oleracea var. italica) anthers to cytokinins / P. G. Arnison, P. Donaldson, A.Jackson, C. Semple, W. A. Keller // Plant Cell Tiss, Org. Cult. - 1990. -V. 20.-P. 217-222.

104. Biesaga-Koscielniak, S. Effect of zearalenone treatment on the production of wheat haploids via the maize pollination system / S. Biesaga-Koscielniak, I. Marsinska, M. Wedzony, S. Koscielniak // Plant Cell Repts ЭИ. 2003. -21, №11.-P. 1035-1039.

105. Blakeslee, A. F. A haploid mutant in the Simson weed, Datura Stramonium / A. F. Blakeslee, I. Belling, M.E. Farnhame, A.D. Bregner // Science 1922. -V. 1,55.-P. 646-647.

106. Bryser, S. Wheat: production of haploids, performance of doubled haploids and trials / S. Bryser, Y. Henry // Crops B. 1986. - V. 1. - P. 73-88.

107. Button, J. Tissue in the citrus industry / J. Button, J. Kochba // Appl. and fun-dam. Aspects plant cell, tissue and organ cult. B. etc. // Spring. Verl., 1977. -P. 70-92.

108. Chase, S. S. Monoploids and monoploid-derivatives of maize (Zea mays L.) / S. S. Chase // Bot. Rev. 1969. - Vol. 35. - P. 117-167.

109. Chopra, R. W. In vitro culture of ovaries of Athaea rosea Cav. / R. W. Chopra // Proc. Seminar. Mof. Lev. Plant Phisiol / Ed. P. Maheshwari. Delhi., 1958. -P. 87-89.

110. Doina, Clapa. The use of zeatin as growth regukator for the micropropagation of some highbush blueberry (Vaccinium corymbosum) cultivars / Clapa Doina, Al. Fira // Bui. Univ. sti. Agr. Si med. Vet. Cluj-Napoca. Ser. Hort. 2006. - 63. -P. 320-325.

111. Fang Shu-Gui, Zeng Xiao-Ling, Zhu Chao-Hui, Lin Bi-Ying, Chen Wen- Hui, Liao Xiao-Zhen. Wuhan Zhiwuxue yanjiu // S. Wuhan Bot. Res. 2005. -23, №6.-P. 530-534.

112. Feng, X. R. Recovery of haploid plants from asparagus microspore culture / X. R. Feng, D. J. Wolyn // Can. J. Bot. 1994. - 72, №3. - P. 296-300.

113. Ferrie, A.M. Evalnation of Brassica rapa L., genotypes from for microspore culture response and identification of a highly embryogenic line / A.M. Ferrie, L. S. Epp, W. A. Keller // Plant Cell Repts. 1995. - 14, № 9. - P. 580-584.

114. Flehing-Haus, Roux T. Anther — culture ability in Secale cereals L. / Roux T. Flehing-Haus, S. Leimling, H. H. Veiger // Plant Breed. 1995. - 114, № 3. -P. 259-261.

115. Fowler, C. W. Callus formation from strawberry anthers / C. W. Fowler, H. G. Hughes, J. Janick // Hortic. Res. 1971. - V.2. - P. 116-117.

116. Garcia-Llamas, C. Effect of pollinator on haploid production in durum wheat crossed with maize and pearl millet / C. Garcia-Llamas, M. C. Ramirez, S. Ballesteros // Plant Breed. 2004. - 123, №2. - P. 201-203.

117. Guha, S. In vitro production of embryos from anthers of Datura. / S. Guha, S. C. Maheshwari // Nature. 1964. - V.204. - P. 497-498.

118. Guo Shu -qiao, Fang Hai- juan, Wang Zhou-fei, Zhang Hong-sheng. Nanjing non-gue daxue xuebao // S. Nanjing Agr. Uniw. 2006. - 29, №2. - P. 1 -5.

119. Ho, K. M. Genetic control of chromosome elimination during haploid formation in barley / K. M. Ho, K. J. Kasha // Genetics. 1975. - Vol. 81. - P. 263-275.

120. Johansson, L. Improvement of anther culture technique activated charcoal bound in agar medium in combination with liquid medium and elevated C02 concentration / L. Johansson, B. Anderson, T. Eriksson // Physiol Plant. 1982. — V. 54.-P. 24-30.

121. Jones, O. P. Propagation in vitro of five apple scion cultivars / O. P. Jones, C. H. Pontikis, M. E. Hopgood // J. Hort. Sci. 1979. - V. 54, № 2. - P.155-158.

122. Kasha, K. S. Utilization of haploidy in plant breeding and mutation / K. S. Kasha // Genetics. 1976. - Vol. 8, № 12. - P. 101-110.

123. Kasha, K. S. Achievements with haploids in barby research and breeding / K. S. Kasha, E. Reinbergs // The plant genome. Nowick, 1980. - P. 215-230.

124. Keller, W. A. Einige morphologische Aspekte bei der Kulture von Antheren / W. A. Keller, E. Klocke, H. B. Schmidt // Biol. Rundsch. 1986. - V. 24, № 6. -P. 367-381.

125. Kimbler, G. Haploid angiosperms / G. Kimbler, R. Riley // Bot. Rev. 1963. -V. 29.-P. 80-531.

126. Lane, W. D. Regeneration of apple plants from shoot meristem tips / W. D. Lane, //Plant Sci., left. - 1978. -V. 13. - P. 281-285.

127. Lei Chun, Chen Sin-feng. Qian Chun-tao, Zhang Yong-bing. Song Hui. Xibei zhiwu xuebao // Acta bot. boreali Occident, sin. - 2004. - 24, №9. - P. 1739-1743.

128. Lezin, F. The effects of genotype, ploidy level and cold pretreatment on barley anther culture responsiveness / F. Lezin, A. Sarrafi, G. Alibert // Cereal Res. Commun. 1996. - 24, № 1.-P. 7-13.

129. Li Wei-dong. Hebei nongye daxue xuebao / Li Wei-dong, Ge Hui-bo, Zhou Chun- jiang, Zhang Jie. // J. Agr. Univ. Hebei. 2004. - V. 27, № 2. - P. 59-63.

130. Lin Gang, He Yonggang, Liu Yong, He Guangyuan. Huazhong keji daxue xuebao. Ziran Kexue ban // J. Hualhong Univ Sci. and Techol. Natur. Sci. 2004. -32, №9. — P. 111-113.

131. Lopez-Perez, A. J. High embryogenic ability and plant regeneration of table grapevine cultivars (Vitis vinifera L.) induced by activated charcoal / A. J. Lopez-Perez, J. Carreno, A. Martinez-Cutillas, M. Dabauza // Vitis. 2005. - 44, № 2. - P. 79-85.

132. Maheshwari, S. C. Haploids from pollen grains retrospect and prospect / S. C. Maheshwari, A. Rashid, A. K. Jyagi // Amer. Y. Bot. - 1982. - 69, № 5. - P. 865-879.

133. Masoje, R. Responsiveness to anther culture in cultivars and F, cros ses of spring wheat / R. Masoje, O. M. Lukow, R. S. H. McKenzie, N. K. Howes // Can. S. Plant Sci. 1993. - 73, №3. - C. 777-783.

134. Melchers, G. Haploid higher plants for plant breeding / G. Melchers // Z. Pflan-zenzuchtg. 1972. -V. 67. - P. 21-32.

135. Moreira, M. F. Anatomical aspects of IBA-treated microcuttings of Gamphrena macrocephala St.-Hil / M. F. Moreira, B. Appezzato-Gloria, L. B. P. Zaidan // Braz. Arch.Biol. and Technol. 2000. - 43, № 2. P. 44-48.

136. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. 1962. - V. 15-13. -P. 473-497.

137. Niemirowicz-Sczytt, K. Micropropagation from the meristems and young leaves ofFragaria/K.Niemirowicz-Sczytt, S. Mulepszy//Bull. Pol. Acad. Sci. Biol. Sci — 1980.-V.28, № 5.-P. 335-340.

138. Niemirowicz-Sczytt, K. Characters of plants obtaned from Fragaria x ananassa in anther culture / K. Niemirowicz-Sczytt, Z. Zakrzewska, S. Malepszy, B. Kubicki // Ac-taHortic.-1983.-V. 131.-P. 231-238:

139. Nitsch, S. P. Haploid plant from pollen. / S. P. Nitsch // Z. Pflanzenzucht. -1972.-V. 67.-P. 3-18.

140. Nogler Gian Sondrea. Genetics of gametophytic apomixes historical sketch / Nogler Gian Sondrea // Pol. Bot. Stud.- 1994. - 8. - P. 5-11.

141. Oosawa, K. Studies on the anther culture of vegetable crops. 2. Multiplying virus-free strawberry plants by means of the anther culture method / K. Oosawa, M. Toda, S. Nishi // Bull. Veg. Ornament. Crops Res. Stat. A. 1974.-№ 1.- P. 41-57.

142. Petolino, I. F. Anther culture of elite genotypes of maize / I. F. Petolino, A. M. Jones // Crop Sci. 1986.-26, № 5. - P. 1072-1074.

143. Pierik, R. L. In vitro culture of higher plants / R. L. Pierik // Lordrecht: M. wij-hoffPubl.-1987.-344 p.

144. Prakash, S. Indaction and growth of androgenic haploids / S. Prakash, Z. Giles // Int. Rev. Cytol. 1987. - Vol. 107. - P. 273-292.

145. Pundir, N. S. Experimental embryology of Gossypium arboretum L. and G. hir-sutum L. and their reciprocal crosses . / N. S. Pundir // Bot. Gaz. 1972. -V. 133. -№1. -P. 7-26.

146. Quorin, M. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. / M. Quorin, P. Lepoivre // Acta hortic. 1977. - V. 78. - P. 437-442.

147. Reddy, V. Influence of genotype and culture medium on microspore callus -induction and green plant regeneration in anihersof Oryza sativa / V. Reddy, S. Leelevathi, S. Sen // Physiol, Plantazum. 1985. - 63, 3. - P. 308-314.

148. Roberts, L. W. Cytodifferentiation in plants / L. W. Roberts // Y. Canberra Univ. press, 1976.-P. 538-542.

149. Rosati, P. Anther culture of strawberry / P. Rosati, M. Devreux, U. Laneri // Hortscience. 1975. — V. 10.-P. 119-120.

150. Roulund, N. Effect of genotype, environment and carbohydrate on anther culture response in head cabbage (Brassica oleraceae L. Convar. capitata L.). Alef. / N. Roulund, L. Hansted, S. B. Andersen, B. Farestveit // Euphytica. 1990. -49, №3.-P. 237-242.

151. Rudolf, K. Microspore culture of white cabbage, Brassica oleraceae var. capitata L.: Genetic improvement of non-responsive cultivars and effect of genomedoubling agents / K. Rudolf, B. Bohanes, M. Hansen // Plant Breed. 1999. -118. №3. - P. 237-241.

152. Sachar, R. C. In vitro culture of ovaries of Zephyranthes / R. C. Sachar, M. Kapoor// Phytomorfology. 1959.-9, №21. - P. 147-156.

153. Sachar R. C. Influence of kinetin and gibberellic acid on the test-tube seeds of Cooperia pedunculata Herb / R. C. Sachar, M. Kapoor // Naturwissens chaften. — 1958.-45.-P. 552-553.

154. Salokhe, S. S. Micropropagation of sugar beet (Beta vulgaris L.) / S. S. Salokhe, Y. S. Nerkar // J. Maharashtra Agr. Univ. 2005. - 30, № 3. -P. 298-301.

155. Skoog, F. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro / F. Skoog, C.O. Miller// Sympos. Soc. Experiment. Biol. "The biological action of growth substances" Eds. Porter H.K. 1957. - V.l 1. -P.l 18-131.

156. Sharma, H. An assessment of doubled haploid production in soft red winter wheat by wheat x corn wide crosses / H. Sharma, Y. Yang, H. Ohm // Cereal Res. Commun. 2002. - 30, № 3-4. - P. 269-275.

157. Shi Xue-hui, Chen Hai-xia, Jiang Hui, Yang Can, He Ke-jia, Hong Ya-hui. Hunan nongye daxue xuebao // J. Hunan Agr. Univ. 2003. - 29, № 6. - P. 509-512.

158. Shimada Takiko, Otani Motogasu, Koba Takato. Anther culture of Japanese spring wheat «Haruhikari» and characterization of doubled haploid plants // Bull. Res. Inst. Resour. Ishikawa Agr. Coll. 1995. - №4. - P. 17-22.

159. Singh, S. Differential responsiveness of winter and spring wheat genotypes to maize-mediated production of haploids / S. Singh, G. S. Sethi, H. K. Chaudhary // Cereal Res. Commun. 2004. - 32, №2. - P. 201-207.

160. Stewart, J. In ovuloe embryo culture and seedling development of cotton (G. hirsutum L.). / J. Syewart, D. Mc, C.L. Hsu // Planta. 1977. - V. 137, №2. -P. 113-117.

161. Sunderland, N. Multicellular pollen formation in cultured barley an-ther.Independent division of the generative and vegetative cells / N. Sunderland,

162. M. Roberts, L. Y Evans, D. C. Wildon // S. Exp. Bot. 1979. - Vol. 30, w. 119. -P. 1133-1144.

163. Trejo -Tapia Gabriela, Amaya Uriel Maldonado, Morales Guadalupe Solcedo, Sancher Antonia De Jesus, Bonfil Blanca Martinez, Rodrigues Monroy Mario, Jimenez - Apariceo Antonio // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. - 2002. — 71, №1.- P. 41-46.

164. Tretyakova, SraidaN. Induction of androgenic cultures of Siberian larch (Larix sibirica Ledeb) / Sraida N. Tretyakova, Alonya S. Vyazovetskova, Anna S. Svanova // Eurasion S. Forest Res. 2006. - 9, №1. - P. 37-44.

165. Truong, A. In vitro haploid plants derived from pollination by irradiated pollen on cucumber. / A. Truong // Cucurbitaceal 88: Proc EUCARPIA Meet Cucurbut Genet, and Breed., Avignon Montfavet, May 31 - June 1-2, 1988. - Paris. -1988.-P. 143-144.

166. Tulecke, W. A tissue derived from the pollen of Yinkgo biloba / W. Tulecke. -Science. 1953. - 117, w 3048. - P. 599-600.

167. Vaithiyalingan, M. Effect of 2,4-D and casein — hydrolysate on callus induction and differentiation in Pigeon pea (Cajanus cajari) / M. Vaithiyalingan, N. Nadarajan // J. Ecobiol. 2004. - 16, №2. - P. 119-122.

168. Wang Tao Tao, Li Han - Xia, Zhang Si - Hong Lu Yong - En, Ye Zhi - Biao. Wuhan zhiwuxue yanjin // S. Wuhan Bot. Res. - 2004. - 22, №6. - P. 596-574.

169. Xie Miao, Qin Li ying, Pan Sun - song, He Huan - le, Wu Ai - zhong, Cai Run. Xibei zhiwu xuebao // Acta bot. boreali - Occident, sin. - 2005. - 25, № 6. -P. 1096-1100.

170. Xynias, I. N. Effect of cold pretreatment and incubatuin (Triticum aestivum) anther culture /1. N. Xynias, I. A. Zamani, E. Gouli Vavdinoudi, D. G. Roupakias // Cereal Res. Commun. - 2001. - 29, №3-4. - P. 331-338.

171. Zenkteler, M. Induction of androgenetic embryoids in the in vitro cultured anthers of several species / M. Zenkteler, E. Misiura, E. Ponitka // Experientia. 1975. - V.31. -P. 289-291.

172. Zhang Fuquan, Zheng Sixiang, Lin Xun, Q Shaowu. Hunan nonqye daxue xu-ebao // J. Hunana Agr. Univ. 1999. - 25, №4. - P. 275-278.

173. Zhao Sing, Sun Meng-Xiang. Wuhan Zhiwuxue yanjiu // J. Wuhan Bot. Res. -2005.-23, №6.-P. 519-523.

174. Zhou, C. Induced of haploid rice plantlets by ovary culture / C.Zhou, H. Y. Yang // Plant Sci. Let. 1981. - 20. - P. 231-237.

175. Zhu Hai-sheng, Pan Dong-ming, Lin Yi-zhang, Zhang Zhi-zhong, Wen Qing-fang. Xibei zhiwu xuebao // Acta bot. boreali oceident. sin. - 2007. - 27, № 5. -P. 919-925.

Информация о работе

Протасова, Екатерина Сергеевна
кандидата сельскохозяйственных наук
Мичуринск-наукоград РФ, 2010
ВАК 06.01.05

Диссертация

Совершенствование метода андрогенеза in vitro у земляники (Fragaria ananassa Duch.) - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы