Влияние экзогенных факторов на рост и развитие регенераторов в процессе формирования дигаплоидных форм сахарной свеклы

Таратонов, Николай Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Влияние экзогенных факторов на рост и развитие регенераторов в процессе формирования дигаплоидных форм сахарной свеклы
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Влияние экзогенных факторов на рост и развитие регенераторов в процессе формирования дигаплоидных форм сахарной свеклы"

от м На правах рукописи

- / РР 1Ш УДК 633.63:581.14:631.52

РГБ ОД

2 О

ТАРАТОНОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ РЕГЕНЕРАНТОВ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ ДИГАПЛОПДНЫХ ФОРМ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

06.01.05 — Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Рамонь, 1999

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском науч исследовательском институте сахарной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова в 19 1999 годах

Научные руководители — доктор сельскохозяйственных наук, профессор,

чл. - корр. РАСХН, академик РЭА и МАИ, заслуженный деятель науки РФ

A.B. Корниенко.

доктор сельскохозяйственных наук,

B.В. Знаменская

Официальные оппоненты — доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Н.Т. Па и люк-

кандидат сельскохозяйственных наук Н.С. Агафонов

Ведущая организация — Воронежский государственный университет

Защита состоится « в_часов на заседан

диссертационного совета Д. 120. 75. 01'во Всероссийском НИИ сахарной свекль сахара им. А.Л. Мазлумова по адресу: 396030, Воронежская обл., Рамонь, ВНИИС

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского НИИ сахг ной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова.

Автореферат разослан « 1999 г

Ученый секретарь /¡71 [/

диссертационного совета, кандидат сельскохозяйственных наук В.А. Бычкова

nUr.S-m^o

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Более чем за два века свекла из огородного растения [ревратилась в важнейшую техническую культуру, ее урожайность и сахаристость ¡озросли более чем в 3 раза. На смену сростноплодным (многосемянным) сортам [ришли раздельноплодные (односемянные), на ряду с фертильной стала возделы-аться свекла стерильная по пыльце, в практику вошли диплоидные, триплоидные и етраплоидные формы культуры. Появление новых форм повлекло за собой изме-[ение принципов, направлений и методов селекции. На смену традиционной селек-;ии сортов - популяций пришла гетерозисная селекция. Современный селекцион-ый процесс стал базироваться на раздельноплодной форме сахарной свеклы, по-иплоидии и на разнообразии материалов с использованием ЦМС (Корниенко, Ор-ов, 1996). Проблема получения нового исходного материала для селекции стано-ится актуальной. Методы используемые в гетерозисной селекции, базирующиеся а комбинациях, рекомбинациях и отборе, ведут как правило к сужению генетиче-кой изменчивости и уменьшению многообразия исходного генетического материа-а (Кузьмин и др., 1995 ). Поэтому необходимо разрабатывать новые методы, кото-ые позволят обогащать генофонд растений для создания высокопродуктивных ортов и гибридов. Методам биотехнологии в решении этих вопросов отводится начителыюе место.

Одним из перспективных путей получения новых исходных форм сахарной веклы является метод гиногенеза. Источником для расширения генетической базы данном случае являются гаплоидные структуры, получаемые из неоплодотворен-ых семяпочек. Получение гаплоидов в культуре in vitro, начиная с введения неоп-одотворенных семяпочек и заканчивая переводом удвоенных гаплоидов в грунт, вляется сложным, не до конца изученным процессом, зависящим от ряда факторов: гнотипа исходного растения, состава питательной среды, условий культивирования других.

Это препятствует внедрению в селекционный процесс новых нетрадиционных етодов создания генетически ценного селекционного материала, основанных на заимодействии экзогенных факторов среды и системы размножения растений.

В связи с этим необходимость дальнейшего изучения факторов внешней и «утренней среды, лимитирующих процесс получения гаплоидов и формирование а их основе дигаплоидных линий в культуре in vitro является актуальной и крайне

1ЖНОЙ.

Цель и задача исследований. Основная цель исследований заключалась в изу-гнии морфогенетической активности женского гаметофита сахарной свеклы в ус-эвиях in vitro и оптимизации режимов получения дигаплоидных линий.

Задачи исследований.

1. Изучить воздействие физических и химических факторов на регенерацион-ую способность неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в культуре in itro.

2. Оптимизировать систему гормонального воздействия на гаплоидные реге-гранты в период стабилизации.

3. Разработать оптимальные условия перевода гаплоидов на диплоидный уровень.

4. Изучить влияние некоторых физиологически активных веществ на репродукцию дигаплоидных клеток.

5. Оптимизировать состав питательной среды для активизации роста удвоенных гаплоидов.

6. Оценить корнеобразующую способность эксплантов сахарной свеклы под воздействием новых химических соединений и выявить наилучший срок для индукции ризогенеза в культуре in vitro.

7. Получить дигаплоидные формы сахарной свеклы.

Научная новизна. Впервые для сахарной свеклы показано стимулирующее действие рентгеновского облучения и обработки пониженной температурой на формирование гаплоидных форм из неоплодотворенных семяпочек женского гаме-тофита.

Оптимизирован состав питательной среды для повышения регенерационной способности неоплодотворенных семяпочек через вторичную регенерацию из кал-лусных структур.

Модифицированы питательные среды для этапа стабилизации гаплоидных ре-генерантов и перевода их на диплоидный уровень, что позволило ускорить получение дигаплоидных форм за счет уменьшения количества пассажей.

Впервые для индукции ризогенеза привлечены химические соединения широкого спектра действия, что способствовало увеличению корнеобразования до 100%.

Практическая ценность и реализация результатов исследований. Полученный экспериментальный материал позволил усовершенствовать метод получения дигаплоидных линий сахарной свеклы из неоплодотворенных семяпочек в культуре in vitro.

Увеличен выход гаплоидов с 4,5 % до 10,3 % путем-воздействия на женский гаметофит сахарной свеклы экзогенными факторами.

Сокращено время получения одной дигаплоидной линии на 2-2,5 месяца за счет нового режима стабилизации гаплоидов.

Оптимизированы условия перевода гаплоидов на диплоидный уровень, позволяющие получать до 90 % дигаплоидов, исключая возможность возврата их на гаплоидный уровень.

Выявлен оптимальный срок для укоренения дигаплоидов в культуре in vitro.

Получены и переданы селекционерам ВНИИСС для селекционно-генетического изучения и использования дигаплоидные формы сахарной свеклы на основе исходного материала: Рф 11120 и № 11424.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Индуцирующая способность неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в культуре in vitro может быть стимулирована путем экзогенного воздействия на женский гаметофит физическими и химическими факторами.

2. Стабилизация гаплоидных регенерантов определяется не только гормональным составом питательных сред, но и их чередованием.

3. Активность роста колхицинированных растений регулируется гормональном составом среды.

4. Корнеобразующая способность дигаплоидов зависит от сроков культивиро-¡ания и состава питательной среды.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и >бсуждены на Международной научно-практической конференции молодых ученых i специалистов «Повышение эффективности агропромышленного производства в •словиях. современных форм хозяйствования» (Воронеж, 1995); Межрегиональной гаучно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Обеспечение табилизации АПК в условиях рыночных форм хозяйствования» (Воронеж, 1997); аседаниях Ученого совета ВНИИСС (Рамонь, 1997-1999).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора итературы, четырех глав практической работы, выводов, практических рекоменда-;ий, списка литературы и приложений. Текст (без приложений) изложен на 102 траницах, содержит Птаблиц, 22 рисунка. Список литературы состоит из 200 на-менований, из них 85 на иностранных языках. В приложения вынесены данные амонской метеостанции; температурный режим в СТК ВНИИСС; справка о полу-еиии дигаплоидных форм сахарной свеклы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в 1996-1999 годах во Всероссийском научно-сследовательском институте сахарной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова (п. Ра-онь, Воронежской области).

Материном для исследований служили многосемянные фертильные линии и эмера рамонской селекции (Рф 34, Рф 13, Рф 11120, №№ 5427, 11402, 11424, 4308, 14177), MC-формы фирмы KWS (Германия) (Перла, Гала, КВС 5418), а так-е сорта-популяции - Рамонская односемянная 9, Уладовская односемянная 35.

Для эксплантации неоплодотворенных семяпочек отбирали бутоны, располо-енные на соцветиях верхнего, нижнего ярусов, побегов первого порядка и цен-)алыюго побега. Семяпочки изолировали в начале цветения растений сахарной ¡еклы из 1-30 бутонов от первого цветка.

Обработку бутонов повышенной температурой (+37,5°С) проводили в течение 3 суток в термостате, пониженной (+4-6°С) с той же экспозицией — в бытовом хо->дильнике. Рентгеновское облучение проводили установкой «Ренс- И-Светлана». эзы облучения 1000-5000 рентген.

При введении в культуру использовали технику стерилизации и приготовле-1Я питательных сред по Р.Г. Бутенко (1975). В качестве стерилизующего агента :пользовали хлорную воду в концентрации 0,05% при экспозиции 2 ч с последую-ей четырехкратной промывкой материала дистиллированной автоклавированной |дой. Семяпочки вычленяли в стерильных условиях ламинарного бокса под бино-глярным микроскопом МБС-9 (кратность увеличения 12) с помощью остро зато-:нной иглы.

Для культивирования семяпочек использовали питательную среду Гамборга (Bs) (Gamborg, Eveling, 1968).

В состав питательной среды входили витамины по Уайту (White, 1963), а также 100 мг/л мезоинозита, 40 г/л сахарозы. рН рабочей среды поддерживался на уровне 5,8-6,0. Индукция гаплоидных регенерантов достигалась дополнительным включением ростовых веществ: 6-БАП, гиббереллин, кинетин в различных концентрациях и сочетаниях. Концентрация ростовых веществ варьировала от 0,5 до 2 мг/л - гиббереллин; от 0,1 до 0,3 мг/л - кинетин и 6-БАП. В качестве контроля служила безгормональная питательная среда.

Культивирование неоплодотворенных семяпочек проводили в течение 3-х месяцев при температуре 23-26°С, 16-часовом фотопериоде, освещенности 5 тыс. люкс и влажности воздуха около 70%. Эмбриогенную способность определяли через каждые 15 дней.

Стабилизацию полученных гаплоидов проводили в течение двух пассажей на питательной среде с содержанием гормонов роста: гиббереллин, кинетин, 6-БАП в концентрации 0,05-0,2 мг/л. В качестве контроля служила безгормональная питательная среда.

Измерение высоты растений, количество листьев, выживаемости проводили еженедельно. В конце каждого пассажа при черенковании подсчитывали коэффициент размножения для каждого растения.

Диплоидизацию гаплоидов проводили методом колхицинирования в питательной среде с концентрацией колхицина 0,0025-0,01% и экспозицией 2 и 3 суток. Активация роста удвоенных гаплоидов стимулировалась добавлением в питательную среду гормонов роста: гиббереллин , 6-БАП от 0,05 до 0,2 мг/л, кинетин - от 0,2 до 1,0 мг/л. В качестве контроля служила безгормональная питательная среда.

Косвенный анализ плоидности проводили через 4 недели культивирования по числу хлоропластов в замыкающих клетках устьиц листа по методике Э.П. Пауше-вой (1980). Хромосомный анализ проводили через 90 дней после колхицинирования. Число хромосом подсчитывали по методике, разработанной в ВИРе (1986) на точках роста.

Просматривали препараты на микроскопах МБС-2, МБС-9, МБИ-3 с использованием люминесцентного осветителя ОИ-18. Фотографирование - на микроскопе МБИ-15, окуляр - х 10, объектив - х 8.

Измерение количества листьев, высоты растений, выживаемости проводили еженедельно, коэффициент размножения и анализ плоидности - при завершении опыта.

В качестве стимуляторов ризогенеза использовали новые синтетические регуляторы роста, синтезированные в Инновационном центре ТАХИАТ при институте физиологически активных веществ РАН (п. Черноголовка, Московская обл.) профессором Р.Г. Гафуровым и на кафедре химии ВГАУ (г. Воронеж) кандидатом химических наук В.В. Фроловой. Синтезированные вещества пока не имеют официального названия и все сведения о химическом строении, свойствах и т.д., представляют ноу-хау. Условные названия веществ, синтезированных Гафуровым Р.Г. -«№344» и «№456», Фроловой В.В. - «Нф» и «Мф». По данным авторов вышеука-

заниые соединения обладают широким спектром физиологической активности. Вещества «№344» и «№456» использовались в концентрации 5; 0,5; 0,05 мг/л, «Нф» и «Мф» - в концентрации 1,5; 1; 0,5 мг/л. В качестве контроля использовалась питательная среда содержащая НУК (1 мг/л).

Укоренение растений проводили на питательной среде Гамборга (Bs) с добавлением витаминов по Уайту, мезоинозита (100 мг/л), сахарозы (20-50 мг/л). Условия культивирования аналогичны другим экспериментам.

Укоренение дигаплоидов проводили в разные сроки: с февраля по июнь. В конце пассажа (через 4 недели культивирования) подсчитывали количество укоренившихся растений и выживаемость.

Математическую обработку всех экспериментальных данных проводили с помощью критерия достоверности %2 (Зайцев, 1973).

Повторность каждого опыта 2-х - 3-х кратная.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Стимулирование регенерационной способности неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в культуре in vitro.

Индукция гаплоидных регенерантов в культуре неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы является сложным, не до конца изученным процессом. На него оказывают влияние целый ряд лимитирующих факторов: генотип исходного растения, стадия развития женского гаметофита, физиологическое состояние до-норного материала, состав питательной среды, условия культивирования (Фаркаш, Лопас, 1989; Госька, 1989; Семан, Фараго, 1989; Подвигина и др., 1994; По двигана, Знаменская, 1996).

Гормональный состав питательной среды играет одну из ключевых ролей в процессе индукции эмбриогенеза половых и соматических клеток (Славова, Рафаи-лова, 1988; Лобанова, Еналеева, 1988; Ережепов и др., 1988; Семан, Фараго, 1989; Подвигина, Знаменская, 1996). В наших экспериментах присутствие в питательной среде ростовых веществ приводило к значительной стимуляции эмбриогенеза неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы (табл.1).

Таблица 1

Влияние ФАВ на регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы (1997-1998 гг)

№ питательной среды Регуляторы роста, мг/л Культивировано семяпочек, шт. % регенерации

ГК Кн 6-БАП

1 2 - - 175 1,71

2 1,5 - - 160 1,88

3 1,0 - - 150 6,0

4 0,5 - 165 8,48

X2 / у} табличное W=0,05 10,12/7,82

5 1,5 0,1 - 165 3,03

6 1.0 0,2 - 155 1,94

7 0,5 0,3 - 175 2,29

X2! X1 табличное \V=0,05 0,64/5,99

8 1,5 - 0,1 175 5,14

9 1,0 - 0,2 150 4,67

10 0,5 - 0,3 155 10,32

X2 / X1 табличное W=0,05 13,49/5,99

Контроль (б/г) 0 0 0 160 1,88

Количество полученных регенерантов варьировало от 1,71 до 10,32 % от числа культивированных семяпочек в зависимости от используемых ФАВ и их концентрации. Наибольшее влияние на эмбриогенез оказали гиббереллин и гиббереллин в сочетании с 6-БАП. Максимальное количество регенерантов - 10,32 % было получено на среде № 10 с гиббереллином - 0,5 мг/л и 6-БАП - 0,3 мг/л. Совместное присутствие в питательной среде 6-БАП в более низких концентрациях и гиббереллина в более высоких, стимулировало индукцию регенерантов несколько слабее, чем среда № 10, количество образовавшихся структур составило 4,67 и 5,14 % (среда № 9 и № 8). Положительный эффект на регенерацию оказал гиббереллин. На питательной среде в пониженных концентрациях гиббереллина 0,5 и 1,0 мг/л выход макроструктур составил 8,48 и 6,0 % соответственно (среда №4 и №3). Увеличение концентрации гиббереллина до 2 мг/л стимулирующего эффекта не оказало, процент регенерации был на уровне контроля (1,88 %). Питательная среда с кинетином и гиббереллином так же не стимулировала эмбриогенез семяпочек. Количество полученных эмбриоидов было незначительным - от 1,94 до 3,03 % (среды № 5, 6, 7).

По данным некоторых исследователей развитие семяпочек в культуре in vitro зависит от гормонального состава питательной среды (Знаменская, 1999; Славова, Рафаилова, 1991). При этом происходит либо прямое возникновение регенерации из семяпочек, либо образуется каллус. В наших экспериментах в зависимости от приметаемых регуляторов роста морфогенез неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы протекал в следующих направлениях:

1. Прямая регенерация

2. Каллусогенез (образование неморфогенного каллуса)

3. Каллусогенез (образование каллуса с последующей регенерацией из него побегов)

4. Образование уродливых структур, не способных к дальнейшему развитию.

Морфогенез неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в культуре in vitro обуславливался не только наличием физиологически активных веществ в питательной среде, но и их концентрацией (табл. 2).

Таблица 2

Влияние регуляторов роста на морфогенез неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в культуре in vitro (1997,1998гг)

Состав Пути морфогенеза

пита- Прямая Каллусогенез, % Уродливые

тель- регенерация, % неморфогенный морфогенный структуры, %

ной каллус каллус

среды, от всех ОТ от всех от от всех ОТ от всех ОТ

мг/л регене- числа регене- числа регене- числа регене- числа

рантов семяпочек рантов семяпочек рантов семяпочек ратов семяпочек

ГК2 66,7 1,1 0 0 0 0 33,3 0,6

ГК 1,5 66,7 1,3 0 0 0 0 33,3 0,6

ПС1,0 77,8 4,7 0 0 0 0 22,2 1,3

ГКО,5 92,9 7,9 0 0 0 0 7,1 0,6

X2/ х2 табл.

W=0,05 10,85/7,82 0,33/7,82

ГК 1,5 80 2,4 0 0 0 0 20 0,6

Кн0,1

ГК1 100 1,9 0 0 0 0 0 0

Кн0,2

ГКО,5 100 2,3 0 0 0 0 0 0

Кн0,3

х2/ х2 табл.

W=0,05 1,53/5,99 1,0/5,99

ГК1,5 55,6 2,9 0 0 22,2 1,1 22,2 1,1

БАПОД

ГК1 57,1 2,7 0 0 42,9 2,0 0 0

БАП0,2

ГКО,5 50 1,9 16,7 0,7 33,3 7,7 0 0

БАП0,3

X2/ х2табл.

W=0,05 2,16/5,99 1,0/5,99 17,0/5,99 2,0/5,99

Кон- 66,7 1,25 0 0 0 0 33,3 0,63

троль (б/г)

Так, присутствие гиббереллина в питательной среде в значительной степени влияло на ход прямой регенерации. Добавление гиббереллина в концентрации 1,0 и 0,5 мг/л позволило получить от 4,7 до 7,9 % жизнеспособных регенерантов, что составило 77,8 и 92,9 % от всех новообразований. Наличие в питательной среде 6-БАП в сочетании с гиббереллином стимулировало каллусогенез. Наибольшая частота каллусообразования характерна для неоплодотворенных семяпочек, культивированных на питательной среде, содержащей 0,3 мг/л 6-БАП и 0,5мг/л - гиббереллина. При этом индуцировался как морфогенный, так и неморфогенный каллус. Благодаря вторичной регенерации эксплантов из каллуса на данной питательной среде удалось получить до 7,7 % регенерантов, что составило третью часть от всей регенерации. Достоверного влияния кинетина совместно с гиббереллином на морфогенез неоплодотворенных семяпочек не обнаружено, что подтверждается результатами математической обработки.

Было установлено, что гормональный состав питательной среды оказывал влияние не только на стимуляцию эмбриогенеза и направленность морфогенеза семяпочек в культуре in vitro, но и обуславливает характер дальнейшего развития индуцированных гаплоидов. Такая обусловленность связана прежде всего различной физиологической активностью ростовых веществ.

Согласно литературным данным, стимуляция индукции эмбриогенеза может быть достигнута путем предобработки генеративных органов пониженной температурой (+3-5°С) (Шамина, 1981; Бугара, Русина, 1988; Вутева, Загорска, 1991), СВЧ -излучением, ионизирующим излучением, воздействием электрического поля (Вутева, Загорска, 1991; Перфильева и др., 1992; Асфандиярова, Зиякаева, 1988).

В наших экспериментах индуцирующая способность неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в культуре in vitro, подвергнутых рентгеновскому облучению, зависела от дозы облучения (табл.3).

Таблица 3

Влияние рентгеновского облучения на индукцию гаплоидии у сахарной свеклы (1996, 1998 гг)

Доза облучения, Культивировано Получено регенерантов

рентген семяпочек, шт. шт. %

1000 200 7 3,5

2000 185 7 3,8

3000 190 10 5,3

4000 120 1 0,8

5000 125 2 1,6

Контроль 165 2 1,2

X2 / X2 табличное W=0,05 11,22/9,49

Стимуляция эмбриогенеза наблюдалась при облучении семяпочек дозами 1000; 2000 и 3000 рентген. При этом было получено 3,5; 3,8 и 5,3% регенерации соответственно. Максимальной регенерационной способностью отличались семяпочки, облученные дозой 3000 рентген. Увеличение дозы облучения до 5000 рентген стимулирующего эффекта не оказало.

Наряду с рентгеновским облучением стимулирующее действие на регенерацию оказала термическая обработка генеративных органов. Однако стимулирующий эффект зависел от температуры обработки. Воздействие температурой +37,5 °С в течение 1-3 суток угнетало развитие семяпочек и приводило к их дегенерации. Эмбриогенная способность неоплодотворенных семяпочек, подвергнутых обработке пониженной температурой +4-6 °С, зависела от времени обработки и сроков введения эксплантов в культуру (табл.4).

Таблица 4

Влияние холодовой обработки и сроков введения в культуру неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы на индукцию гаплоидии (1996-1998 гг)

Экспози- Сроки введения

ция,

сутки Весна Лето

Культивирова- % регене- Культивиро- % регене- х2

но семяпочек, рации вано семяпо- рации

шт. чек, шт.

1 230 2,61 95 1,05 3,57

2 265 3,4 95 4,21 1,92

3 195 6,15 110 1,82 7,14

Контроль 175 1,71 85 1,18 1

13,63

Х2табл.\¥=0,01 11,345

Максимальной регенерационной способностью отличались семяпочки, изолированные с маточных растений, выращенных в теплице. При этом наибольшее количество регенерантов (6,15%) было получено при холодовой обработке в течение 3-х суток, а максимальный процент регенерации у семяпочек, введенных летом (4,21%), при холодовой обработке в течение 2-х суток. Такая разница объясняется с помощью показателя среднесуточной температуры в начале цветения маточных растений сахарной свеклы. Среднесуточная температура во время цветения маточников в теплице (12,5 °С) ниже среднесуточной температуры во время цветения маточников в поле (21,8 °С). Таким образом, в теплице маточные растения подвержены естественному воздействию холодом. В связи с этим адаптированным к перепадам температур маточным растениям теплицы требуется большая экспозиция об-

работка холодом для стимуляции эмбриогенеза, чем маточникам, выращенным в поле.

Полученные положительные результаты по использованию химических и физических факторов для стимуляции регенерационной способности неоплодотворен-ных семяпочек сахарной свеклы послужили предпосылкой для изучения их совместного влияния на регенерацию.

Было выявлено, что максимальной регенерационной способностью (6,36 %) характеризовались семяпочки, культивированные на питательной среде с гибберел-лином в концентрации 2 мг/л и прошедшие предобработку холодом в течение 3-х суток.

Таким образом, эксперименты по воздействию физическими и химическими факторами на систему генеративного размножения сахарной свеклы показали, что они способны оказывать положительный эффект на индукцию гаплоидии. Значительно повысить выход гаплоидов можно путем предобработки генеративных органов маточных растений сахарной свеклы пониженной температурой и рентгеновским облучением, а также культивированием неоплодотворенных семяпочек на питательной среде с различным содержанием регуляторов роста растений. Предобработка пониженной температурой (+ 4-6 °С) в течение 2-3 суток, в зависимости от сроков введения и использования питательной среды, содержащей гиббереллин 0,5 мг/л в сочетании с 6 -БАП 0,3 мг/л на наш взгляд могут быть рекомендованы для повышения частоты образования гаплоидных структур.

Стабилизация гаплоидных регенератов сахарной свеклы

Стабилизация гаплоидных регенерантов является важным этапом культивирования гаплоидных растений, индуцированных в культуре in vitro. В этот период необходимо обеспечить максимальную сохранность всех растений, так как каждый регенерант может стать родоначальником гаплоидной линии.

Сущность процесса стабилизации заключается в активизации ростовых процессов у индуцированных гаплоидов, отборе наиболее жизнеспособных, активно растущих и хорошо размножающихся гаплоидных растений.

В зависимости от генотипа гаплоиды по-разному реагируют на изменяющиеся факторы внешней и внутренней среды. Процесс адоптации может длиться несколько месяцев. В этот период у большинства растений происходит активизация вегетативного роста и размножения. У некоторых регенерантов развитие, наоборот, затормаживается, и нередко растения гибнут. В основном это определяется генетическими факторами и условиями культивирования (Славова, Рафаилова, 1991; Подви-гина, 1994).

Рост и развитие гаплоидных регенерантов можно в определенной степени поддерживать с помощью физиологически активных веществ в питательной среде, а также чередованием питательных сред различного гормонального состава.

Было установлено, что перевод гаплоидных регенерантов со среды индукции на ростовую (гиббереллин, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л) значительно стимулировал

рост количества листьев и вегетативное размножение гаплоидов по сравнению с культивированием на безгормональной питательной среде (табл. 5).

Таблица 5

Влияние гормонального состава питательной среды на рост и развитие индуцированных гаплоидов (I пассаж) (1998-1999гг)

Показатели Гормональный состав среды, мг/л х2

Ростовая ГК(0,2)Кн(0,2)БАП(0,2) без гормональная

Средняя высота растения, мм. 30,0 32,6 0,251

Среднее количество листьев в растении, шт. 12,8 4,2 8,73

Коэффициент размножения 3,0 1,2 4,702

Выживаемость, % 90,5 90,6 0,011

X табличное при уровне значимости 0,05 - 3,841

Снижение концентрации гормонов в питательной среде в последующем (втором) пассаже до 0,05 мг/л оказывало наибольшее благоприятное воздействие на прирост растений в высоту (рис. 1), прирост количества листьев (рис. 2), обеспечивало хороший коэффициент размножения (рис. 3) и наибольшую выживаемость гаплоидов (рис. 4).

Прирост растений в высоту (II пассаж)

18-

16-

2 14-

>ч

1- 17-

.а 10-

□ Вн

о 6-

<3.

X 4-

а.

20-

16,6

14,6

9,8

12,9

9,1

12,3

12,8

¿cm

?=7

ГК0,2КмО,25АПО,2 ГК0,1КнО,1БАП0.1 ГКО,05КмО,05БАП0.05 Б/Г

Гормональный состав среды, мг/л □ пассаж после ростовой среды □ пассаж после безгормональной среды

Рис. I.

Прирост численности листьев (II пассаж)

л о

а о

I-о а т х с; о х н о о а.

а С

10-, 987654 3 21-

7,5

Л7

ТА

ГКО,2КиО,2БАПО,2

ГК0,1Кн0,1БАП0,1 ГК0,05Кн0,05БАП0,05

Гормональный состав среды, мг/л □ пассаж после ростовой среды □ пассаж после оезгормональной среды

Рис. 2.

Коэффициент размножения гаплоидов в конце 2-го пассажа.

г * %

0 х

<Ч 1.5-1

Я П

а.

1 н

Л §

1.9

2,2

• 111:

1,5

1,2

-г

ГК0,2Кн0,2БАП0.2 ГКО,1КнО,1БАПО,1 ГКО,05Кн!),05БАПО,05

Гормональный состав среды, мг/л Ш Пассаж после ростовой среды □ Пассаж после безгормонаьной среды

Рис. 3.

Выживаемость гаплоидов в конце 2-го пассажа.

-Л • 94-о^

13 ^ о

о sots ш

m 854

93,1

96,3

88,9

92,6

,37,5

ГКО,2КнО,2БАПО,2 ГК0.1КнО,1БАПО,1 ГКО,05КнО,05БАПО,05 БЛ

Гормональный состав среды, мг/л

□ Пассаж после ростовой среды □ Пассаж после безгормональной среды

Рис. 4.

Результаты проведенных экспериментов позволили определить оптимальную систему гормонального воздействия на гаплоидные регенеранты в период стабилизации. Предлагается процесс стабилизации проводить в течение 2-х пассажей с чередованием питательных сред: ростовая (гиббереллин, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л) - ростовая с пониженным содержанием гормонов (гиббереллин, кинетин, 6-БАП по 0,05 мг/л). Такое чередование обеспечивает высокую выживаемость, активный рост и вегетативное размножение гаплоидов.

Днплоидизация гаплоидных регенерантов в культуре in vitro

О непосредственном использовании гаплоидов в производстве известны лишь единичные случаи. В качестве таковых могут быть названы сорт пеларгонии Кляй-нер Либлинг (2п = 9), форма gracilis туи складчатой и один из сортов риса (Munzcr, 1979). Гаплоидные растения не могут давать потомство, так как мейоз у них нарушен в связи с отсутствием гомологичных хромосом, что в результате приводит к формированию нежизнеспособных гамет (Атанасов, 1993; Бурмакина, 1994). Удвоение числа хромосом гаплоидных растений полностью решает проблему размножения и открывает новые перспективы для использования гаплоидов в селекции (Лаптев, 1984).

Наиболее эффективным методом диплоидизации является способ удвоения числа хромосом с помощью колхицина. Для свеклы известны различные методы колхицинирования, применяемые как на первом году жизни: обработка сухих и прорастающих семян (Бормотов, Турбин, 1972; Knapp, 1956; Savitsky, 1968), обработка молодых сеянцев в семядольном состоянии (Мосина, 1967; Демчинская, 1968), так и на втором году жизни: обработка головок маточных корнеплодов (Юсубов, Мосина, 1970; Rosenthal, 1958), обработка верхушек цветоносных побегов (Лутков и др., 1963; Ernould, 1946). На сахарной свекле в результате обработки гаплоидных регенерантов в фазе 6-8 листьев 0,1% раствором колхицина было получено 8,4% диплоидов, 41,3% остались в гаплоидном состоянии, 3,4% тетраплоидов, 1,1% октоплоидови 33,0% миксоплоидов (D'Halluin, Keimer, 1986). При этом отмечалась очень высокая чувсвительность к обработкам клонов свеклы (Ярмолюк, 1986; Ragot, Steen, 1992).

Наиболее эффективным, по данным A.M. Юсубова и Н.Р. Мосиной (1970), оказался метод обработки всходов водным раствором колхицина и концентрации 0,1-0,2% в течение 10-20 дней, что позволяло получать до 60% тетраплоидов в Ci.

В наших экспериментах диплоидизацию гаплоидов мы проводили методом колхицинирования в питательной среде.

Выход удвоенных гаплоидов зависел от концентрации колхицина и экспозиции. Оптимальной оказалась концентрация колхицина 0,01% при воздействии в течение 2-х суток (таблица 6). Количество диплоидных клеток в данном случае было максимальным 86,5%.

Таблица 6

Результаты обработки колхицином гаплоидных растений в культуре in vitro (1998-1999гг)

Кон- Время

цент- обра- %

рация ботки, Выживаемость регенерантов, % устьичпых клеток с числом

колхи- сут. хлоропластов

ци-

на,%

на 7-й на 14-й на 21-й на 28-й < 12 12-14 >14

день день день день

0,01 2 100 95 85 65 5,9 86,5 7,7

0,01 3 100 95 80 60 1,6 63,2 35,2

0,0075 2 100 90 90 75 36,1 56,8 7,1

0,0075 3 100 90 85 60 6,0 76,7 17,3

0,005 2 100 95 85 75 71,8 27,1 1,1

0,005 3 100 90 85 65 30,9 63,3 5,8

0,0025 2 100 100 95 85 91,2 8,8 0

0,0025 3 100 95 85 70 83,2 16,0 0,8

Контроль — 100 100 100 100 100 0 0

X2 0 2,09 8,96 48,49 335,31 398,4 75,0

"/^табличное при уровне значимости 0,01 - 18,475.

Увеличение времени обработки до 3-х суток не привело к дальнейшему возрастанию доли диплоидных клеток как это наблюдалось в остальных вариантах, более того при данной экспозиции наблюдалось резкое снижение количества; диплоидных клеток за счет увеличения доли полиплоидных. Гибель колхицинированных эксплантов отмечалась уже после двух недель культивирования и продолжалась до конца пассажа (28-й день). В зависимости от концентрации колхицина и времени обработки выживаемость регенерантов через 4 недели составляла от 60 до 80%. С возрастанием концентрации колхицина и экспозиции выживаемость растений снижалась. Причина гибели эксплантов заключается в сильном мутагенном и токсичном действии колхицина (Давоян, Тырнов, 1974).

На наш взгляд при колхицинировании гаплоидных регенерантов сахарной свеклы оптимальный срок инкубирования на среде с колхицином составил 2 суток. Наиболее эффективной оказалась концентрация колхицина 0,01%. При уровне выживаемости 65% данная концентрация обеспечивала получение до 86,5% диплои-дов.

Основным препятствием для удвоения числа хромосом у гаплоидов является не трудность получения большого числа диплоидных клеток в тканях гаплоидов, а быстро наступающий процесс уменьшения их числа после прекращения действия колхицина, то есть процесс дедиплоидизации миксогогоидной ткани (Давоян,Тырнов, 1974).

Процесс уменьшения числа диплоидных клеток может быть вызван тем, что клетки меристем, вследствие асинхронного их деления, обладают разной чувствительностью к колхицину. Менее чувствительные клетки, находящиеся в период обработки в интерфазе, сохраняют прежний уровень плоидности и делятся быстрее блокированных колхицином (Дубинин, Панин, 1967; Macleod, Davidson, 1968 ). Более чувствительные клетки (в профазе и метафазе) под действием алкалоида поли-плоидизируются, но одновременно с этим, вследствие мутационного действия колхицина, в них возникает и значительное число хромосомных нарушений, которые впоследствии приводят к элиминации таких клеток (Давоян,Тырнов, 1974 ). Кроме того, данные по митотическому циклу в полиплоидном ряду кукурузы показывают, что цикл деления гаплоидных клеток примерно в 1,4 раза короче, чем диплоидных (Давоян, Тырнов, Суханов, 1972 ). Вполне понятно, что в процессе внутриклеточного отбора будет способствовать более быстрому увеличению доли гаплоидных клеток в миксоплоидной ткани. Другой причиной уменьшения числа диплоидных клеток является их переход в дифференцированное состояние.

Таким образом, все перечисленные факты приводят к тому, что даже при высокой степени диплодизации меристем оставшаяся часть гаплоидных клеток способна восстановить прежний уровень плоидности растений. Диплоидная популяция

клеток в миксоплоидной ткани гаплоидов значительно менее конкурентоспособна, чем гаплоидная.

Для блокирования в миксоплоидной ткани деления гаплоидных клеток можно использовать по существу любой (физический, химический и т.д.) супрессирующий фактор, обладающий, однако, дифференциальным действием на клетки разной пло-идности (Давоян,Тырнов, 1974 ). Из физических агентов можно использовать достаточно успешно ионизирующее облучение (ренгеновские и гамма лучи) (Lewis, 1951; Siddig, Swaminathan, 1967). Из химических, блокирующих деление агентов, обладающих дифференциальным действием на гетерогенную клеточную популяцию, следует выделить физиологически активные вещества (ФАВ) - ауксины и особенно цитокинины. Важнейшим представителем последних является кинетин.

Результаты проведенных нами экспериментов подтверждают факт дифференцированного воздействия некоторых физиологически активных веществ на диплоидные клетки в миксоплоидной ткани. Культивируемые колхицированные эксплан-ты на питательной среде с различным содержанием ФАВ в конечном итоге в значительной степени отличались по соотношению клеток различной плоидности (табл.7).

Таблица 7

Влияние гормонального состава питательной среды на воспроизводство клеток различной плоидности (1999г).

% Количество

№ Гормональный устьичных клеток ди гаплоидов,%

варианта состав среды, мг/л с числом (хромосомный

хлоропластов анализ на 90-й

(на 30-й день) день)

< 12 12-14 > 14

1 ГК0,2Кн0,2БАП0,2 0,6 93,2 6,2 90

2 ГКО, 1 КнО, 1Б АПО, 1 0,9 92,6 6,5 90

3 ГК0,05КнО,05БАШ,05 2,2 87,6 10,2 80

4 Кн1 0 27,4 72,6 35

5 КнО,75 0 49,3 50,7 60

6 КнО,5 0 73,9 26,1 80

7 КнО,25 0,1 96,4 3,5 100

8 Контроль (б/г) 9,5 85,4 5,1 20

X2 57,2 41,7 112,2 238,513

X2 табличное при уровне значимости 0,01 - 16,812

Присутствие в питательной среде цитокининов и гиббереллина снижало долю гаплоидных клеток и в зависимости от концентрации, стимулировало размножение диплоидной или полиплоидной популяции клеток в миксоплоидной ткани.

С увеличением концентрации гиббереллина, кинетина и 6-БАП в питательной среде от 0,05 до 0,2 мг/л число диплоидных клеток возрастало, а гаплоидных и полиплоидных снижалось.

Относительной выровненностью клеточной популяции по плоидности характеризовались растения культивированные на среде с кинетином в концентрации 0,25мг/л.

В данном случае кинетин стимулировал деление диплоидных с одновременным торможением роста гаплоидных и полиплоидных клеток. Увеличение концентрации кинетина от 0,25 до 1мг/л активировало деление полиплоидных клеток (вариант 6; 5; 4).

Хромосомный анализ плоидности, проведенный через 3 месяца культивирования подтвердил результаты косвенного анализа плоидности (по количеству хло-ропластов в устьичных клетках) на всех вариантах сред с гормонами роста. Процент диплоидов в течение 3-х месяцев на данных вариантах сред практически не изменился, однако произошло резкое снижение числа диплоидов в варианте с безгормональной средой с 85,4 до 20%. Такое снижение является результатом процесса де-диплоидизации. За 3 месяца за счет возврата на гаплоидный уровень количество диплоидов уменьшилось более чем в 4 раза.

На основании проведенных исследований можно сказать, что на воспроизводство диплоидных клеток сахарной свеклы в культуре in vitro оказывает влияние гормональный состав питательной среды. Цитокинины и гиббереллин тормозят рост гаплоидной ткани. Кинетин в концентрации 0,25 мг/л максимально стимулирует деление диплоидных клеток сахарной свеклы с одновременным торможением деления гаплоидных и полиплоидных клеток в культуре in vitro.

Наряду с высокой эффективностью колхицина, как полиплоидизирующего агента, это вещество обладает высокой токсичностью и мутагенным эффектом. Отрицательное последействие колхицина заключается в угнетении ростовых процессов и даже гибели растений.

Имеется ряд работ, свидетельствующих о том, что стимуляторы роста значительно снижают угнетающее действие и усиливают полиплоидизирующий эффект колхицина (Глотов, 1939; Duhamel, 1939; Рунков, Жебрак. 1969).

В наших экспериментах последствие колхицина в различной степени проявлялось на растениях культивированных на питательной среде с разным содержанием ФАВ. После 3-х недель культивирования выживаемость дигаплоидов варьировала от 60 до 100% в зависимости от концентрации ФАВ в питательной среде (рис. 5).

Наибольшую жизнеспособность проявляли экспланты культивируемые на питательной среде с кинетином. Выживаемость всех растений обеспечивала концентрация кинетина 0,25 и 0,5 мг/л. Увеличение концентрации кинетина до 1 мг/л привело к снижению выживаемости до 93,3%. На питательной среде дополненной гиб-береллином и 6-БАП выживаемость находилась в прямой зависимости от их концентрации.

Влияние экзогенных регуляторов роста на выживаемость дигаплоидов через 21 день после обработки колхицином

о о 2 о га о

X 3 ш

100 100

93,3 93,3

86,7

81,3

Кн0,25 Кн0,5 Кн0,75 Кн1

ГКО,2 ГК0.1 ГКО,05 Б/Г Кн0,2 Кн0.1 Кн0,05 БАП0,2 БАП0.1 БАП0,05

Питательная среда

100

90-

80-

70-

60-

50-

40-

Рис. 5.

Наименьшую гибель растений в данном случае обеспечивала концентрация гиббереллина, кинетина и 6-БАП - 0,2 мг/л. Снижение концентрации этих веществ привело к падению выживаемости до 70%. Наиболее наглядно угнетающее последействие колхицина можно проследить в варианте с безгормональной питательной средой. Отсутствие экзогенных регуляторов роста в питательной среде привело к значительной гибели культивируемых растений (выживаемость не превышала 60%). Несмотря на низкую выживаемость на безгормональной среде дигаплоиды характеризовались наибольшим приростом в высоту (рис. 6).

Растения, культивируемые на ростовой среде, были значительно меньших размеров. На наш взгляд причиной тому могут быть два обстоятельства. Во-первых, растения подвергшиеся воздействию колхицина, в период первого пассажа испытывают токсичный стресс и любые высокоактивные вещества могут отрицательно влиять на рост растений.

Прирост растений в высоту

Продолжительность культивирования, недели 1-ГК0,2Кн0,2БАП0,2 — - 2- ГК0,1Кн0,1БАП0,1

3- ГКО,05КнО,05БАГ10,05 - - 4-Кн1

-5- Кн0,75 ---6- Ки0,5

--7-КнО,25 ' 8- контроль(б/г)

Рис. 6.

Даже незначительные концентрации ФАВ тормозили рост растений в высоту (график 3). Во-вторых, цитокннины: кинетин и 6-БАП ингибируют апикальное доминирование (СЬуо]ка ег а1., 1962) и индуцируют развитие боковых побегов (Муромцев и др., 1987).

По нашим данным образование почек идет значительно быстрее на питательной среде содержащей цитокинины в комплексе с гиббереллином (рис. 7).

В литературе имеются подтверждения данному факту. Целый ряд ученых ука-¡ывает, что цитокинины и гиббереллины часто являются синергистами при индукции стебле- и побегообразования в культуре изолированных тканей (Винклер, Диба, 1972; Атацосов, Кикиндонов, 1977; Полевая и др., 1988).

На среде с кинетином 1 мг/л (график 4) культивируемые растения также про-1Вляли высокую склонность к побегообразованию, однако, данная концентрация отнетина привела к значительной витрификации побегов. Низкое содержание, так ке как и полное отсутствие ФАВ в питательной среде после 2-х недель культивиро-шгая останавливало рост численности листьев (график 3 и 8).

Прирост количества листьев

Продолжительность культивирования, недели

- - - 1- ГК0,2Кн0,2БАП0,2 — - 2-ГКО,1КнО,1БАПО,1 -3- ГК0,05Кн0,05БАГТО,05 - - 4-Кн1

-5- Кн0,75 ---6- Кн0,5

— —7- Кн0,25 8- контроль (б/г)

Рис. 7.

Растения с активным ростом боковых почек в конечном итоге давали большее количество побегов на один эксплант, чем растения культивированные на безгормональной питательной среде. Однако разброс концентраций и различное сочетание ФАВ в питательной среде существенного влияния на коэффициент размножения не оказали. Количество побегов на один эксплант варьировало от 2,0 до 2,3 штук (рис. 8).

На основании проведенных исследований можно заключить, что на активизацию ростовых процессов колхицинированных растений сахарной свеклы влияет гормональный состав питательной среды. Выживаемость растений и характер роста зависит как от ФАВ, так и от его концентрации. Кинетин (0,25-0,75 мг/л) ингиби-ровал рост растений в высоту и стимулировал процессы почкования, одновременно обеспечивая максимальную выживаемость растений в ходе культивирования. Увеличение концентрации кинетина до 1 мг/л вызывало витрификацию побегов.

Коэффициент размножения удвоенных гаплоидов после 3-х недель культивирования

Кн0,2 Кн0,1 Кн0,05 БАП0,2 БАП0.1 БАП0.05

Питательная среда

Рис. S.

Минимальное отрицательное последействие колхицина испытывали растения, культивируемые на питательной среде: гиббереллин, кинетнн, 6-БАП в концентрации 0,2 мг/л каждого вещества. Растения нормально развивались, проявляли активный рост, имели хорошую облиственность. Уменьшение концентрации ФАВ в питательной среде снижало выживаемость, рост численности листьев. На безгормональной среде, несмотря на активный рост в высоту, дигаплоиды имели слабую облиственность, не формировали боковых побегов, часть их гибла в процессе культивирования.

По результатам наших исследований оптимальным режимом диплоидизации гаплоидов является колхицинирование их в течение 2-х суток на среде с колхицином в концентрации 0,01% и последующий пассаж на ростовую питательную среду с ФАВ: гиббереллин, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л. Данная схема позволяет получить до 90% дигаплоидов, исключает возврат их на гаплоидный уровень, обеспечивает высокую выживаемость (86,7%) и создает необходимые условия для активного роста и размножения удвоенных гаплоидов.

Индуцирование ризогенеза у сахарной свеклы в культуре in vitro

Одним из этапов микроклонального размножения растении в культуре in vitro является укоренение размноженных побегов.

Исследования, проведенные на сахарной свекле, показывают, что на индукцию ризогенеза в большей степени оказывает влияние гормональный состав питательной среды. Для укоренения пробирочных растений рекомендуется пассировать их на питательную среду с ауксинами: ИМК (1-2мг/л) или НУК (1мг/л). При этом

частота корнеобразования в зависимости от генотипа может колебаться в пределах 48-100% (Ильенко, 1983; Знаменская, Жужжалова, 1995).

Ведущая роль в регуляции ризогенеза принадлежит соединениям ауксиновой природы, однако, эффективность последних зачастую оказывается очень низкой в силу остаточного последействия цитокининов, используемых при микроклональном размножении, которые ингибируют ауксины. В связи с этим возникла необходимость в поиске новых веществ для индукции ризогенеза у сахарной свеклы.

В 1999 году в отделе биотехнологии ВНИИСС (п. Рамонь, Воронежская обл.) проходил испытание ряд новых синтетических регуляторов роста, обладающих широким спектром физиологической активности.

В наших экспериментах данные фиторегуляторы проходили испытания в качестве стимуляторов корнеобразования. Результаты испытаний приведены в таблице 8. Следует отметить, что испытуемые вещества в методике культивирования in vitro использовались впервые.

Таблица 8

Влияние различных химических соединений на индукцию ризогенеза у дигаплоидов сахарной свеклы в культуре in vitro (1999г)

Вещество Концентрация, % Выживаемость,

мг/л укоренения %

5 95 100

№344 0,5 90 100

0,05 100 95

X2 169,873 0,256

5 100 90

№456 0,5 90 100

0,05 89,5 95

х2 164,844 0,263

1,5 0 85

Нф 1 5,6 90

0,5 5,6 90

х2 25,523 1,556

1,5 0 90

Мф 1 27,8 90

0,5 10,5 95

х2 20,171 0,270

НУК 1 15,8 95

(контроль)

безгормональная - 0 100

X2 табличное при уровне значимости 0,01- 9,210

Анализ экспериментальных данных свидетельствует о наличии способности у исследуемых веществ индуцировать ризогенез. В зависимости от вида фиторегуля-тора и его концентрации частота корнеобразования колебалась от 0 до 100%. Наиболее эффективными стимуляторами корнеобразования явились фиторегуляторы « № 344 » и « № 456 ». Максимальное количество укорененных регенерантов (100%) удалось получить на питательной среде с « № 344 » и « № 456 » в концентрации 0,05 и 5 мг/л соответственно, причем разброс концентраций от 0,05 до 5 мг/л в каждом из вариантов существенно на процесс укоренения не повлиял. Такая «эластичность» данных веществ в плане концентрации может иметь важное практическое значение, так как значительно сокращает опасность передозировки веществ.

При культивировании дигаплоидов на питательных средах с « Нф » и « Мф » количество укоренившихся растений зависело от концентрации этих веществ в питательной среде. Стимулирующее действие на ризогенез эти вещества оказали в интервале концентраций от 0,5 до 1 мг/л. Повышение концентрации до 1,5 мг/л полностью ингибировало ризогенез.

К сожалению, предложенный интервал концентраций не позволил нам в полной мере оценить потенциальные возможности этих веществ. Объективную оценку данным веществам можно будет дзть после проведения дополнительных исследований и корректировке концентрации.

Исходя из полученных результатов, можно сказать, что фиторегулятор «Нф» является слабым стимулятором ризогенеза. Число укоренившихся растений на питательной среде с « Нф » не превышало 5,6%,что почти в 3 раза меньше, чем на контроле (15,8%). Более эффективным оказалось вещество « Мф ». Повышение концентрации с 0,5 до 1 мг/л привело к увеличению корнеобразования с 10,5 до 27,8%.

На выживаемость дигаплоидных растений исследуемые вещества в приведенных концентрациях никакого влияния не оказали, о чем свидетельствуют результаты математической обработки.

Проведенные исследования являются основанием для заключения, что из всего ряда исследованных веществ наибольшей ризогенетической активностью обладают фиторегуляторы « № 344 » и « № 456 ». Максимальное корнеобразование на питательной среде с этими веществами достигало 100%. Причем изменение концентрации с 0,05 до 5 мг/л незначительно влияло на количество укоренившихся дигаплоидных растений. Полученные результаты позволяют рекомендовать эти вещества для индуцирования ризогенеза растений в культуре in vitro.

Стимулировать ризогенез можно путем уменьшения концентрации сахарозы в питательной среде (Атанасов, 1993). Однако, повышенные концентрации сахарозы (8-9%) способствуют развитию более мощной корневой системы, а также благоприятно сказываются на росте надземных органов (Амерханова, Рахимбаев, 1986).

Исследуя действие сахарозы на развитие растений сахарной свеклы нами было установлено, что наибольший процент укоренения (92,5%) отмечен при концентрации сахарозы в питательной среде 4% (рис. 9).

Влияние сахарозы на укоренение побегов сахарной свеклы

О (контроль) 2 3 4 5

Концентрация сахарозы, %

Рис. 9

На данном варианте питательной среды побеги имели мощную мочковатую корневую систему и отличались хорошим развитием. Изменение концентрации сахарозы в сторону увеличения и уменьшения не способствовало повышению укоре-няемости растений, а полное исключение сахарозы из питательной среды (контроль) резко снижало ризогенетическую способность растений до 54,3%.

При проведении экспериментов по микроклональному размножению дигаплоидных растений сахарной свеклы в культуре in vitro был выявлен еще один фактор оказывающий влияние на корнеобразование. Дигаплоиды, пассированные на корневую среду в разные периоды времени, проявляли неадекватную склонность к укоренению (рис. 10).

Влияние сроков культивирования на ризогенез дигаплоидных растений сахарной свеклы в культуре in vitro

Рис. 10.

Максимальное корнеобразование наблюдалось в феврале - 62,7%. Весной отмечено снижение корнеобразующей активности растений. Пик снижения пришелся на май месяц. Число укоренившихся растений не превышало 24,7%. Далее наметилась активизация ризогенеза до 26,2%. Однако для подтверждения данного тезиса необходимо проведение дополнительных исследований.

Повышенная склонность к образованию корней а предвесенний период связана с активизацией ростовых процессов у сахарной свеклы в этот период, так как в феврале, да III этапе органогенеза у сахарной свеклы происходит переход от стадии яровизации к световой (Биологический контроль в сельском хозяйстве, 1962). Это значит, что у корнеплодов сахарной свеклы заканчивается период глубокого покоя и при благоприятных условиях (тепло, влажность, свет) растение способно возобновить рост (Полевой, 1989).

По всей видимости, растениям сахарной свеклы в культуре in vitro, несмотря на постоянство внешних и внутренних условий также как интактным растениям сахарной свеклы характерна периодичность роста, обусловленная периодом физиологического покоя, окончание которого создает предпосылки для активного роста побегов и корней.

Таким образом, проведенные исследования позволили нам выявить еще один фактор, способный оказывать влияние на ризогенез сахарной свеклы в культуре in vitro - сроки культивирования на корневой среде.

Оптимальным временем, в течение которого укореняется максимальное количество дигаплоидов является февраль. По нашим данным, корнеобразование в этот период может достигать 62,7%. Укоренение в последующие месяцы: март, апрель, май приводит к снижению числа растений, формирующих корневую систему.

Выводы

1. Выявлено, что морфогенетическая активность женского гаметофита стимулируется воздействием физико-химических факторов (рентгеновским облучением, холодовой обработкой, составом питательной среды) из которых наиболее эффективными являются регуляторы роста. Присутствие в питательной среде гибберел-лина (0,5 мг/л) и 6-БАП (0,3 мг/л) позволило в среднем увеличить выход гаплоидных регенерантов до 10,3%.

2. Показано, что в период стабилизации культивирование гаплоидов на ростовой среде (ГК, Кн, 6-БАП по 0,2 мг/л) с последующей пересадкой на питательную среду с пониженной концентрацией гормонов (ГК, Кн, БАП по 0,05 мг/л) обеспечивает высокую выживаемость гаплоидов (96,3%), активный рост и способность к вегетативному размножению.

3. Установлено, что колхицинирование гаплоидов в течение 2-х суток на без-гормоналыюй среде с колхицином в концентрации 0,01% и последующий пассаж на ростовую питательную среду с ФАВ: гиббереллин, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л является наиболее оптимальным режимом перевода гаплоидов на диплоидный уровень. Данная схема позволяет получить до 90% дигаплоидов, исключает возврат их

на гаплоидный уровень, обеспечивает высокую выживаемость (86,7%) и создает необходимые условия для активного роста и размножения удвоенных гаплоидов.

4. Выявлено, что на корнеобразующую способность дигаплоидов в культуре in vitro оказывают влияние сроки культивирования на корневой среде. Оптимальным сроком укоренения дигаплоидов является февраль.

5. Исследованы новые химические соединения, обладающие ризогенетической активностью. Фиторегуляторы « № 344 » и « № 456 » в концентрации 0,05 и 5 мг/л соответственно позволили получить до 100% укорененных растений.

Рекомендовать усовершенствованную методику получения дигаплоидных линий сахарной свеклы для внедрения в селекционный процесс с целью создания нового исходного материала сахарной свеклы.

Полученные дигаплоидные формы сахарной свеклы, переданные для изучения в селекцентр ВНИИСС, рекомендуются для включения в перспективные селекционные схемы.

Новые синтетические регуляторы роста « № 344 » и « № 456 » рекомендуются в качестве стимуляторов ризогенеза в культуре in vitro.

1. Диплоидизация гаплоидных регенерантов сахарной свеклы // Повышение эффективности агропромышленного производства в условиях современных форм хозяйствования: Тез. докл. Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Воронеж, 1995. - Ч. 2. - С. 28-29. (Соавт. Ващенко

2. Использование физических факторов для увеличения индукции гаплоидов у сахарной свеклы // Обеспечение стабилизации АПК в условиях рыночных форм хозяйствования: Тез. докл. Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Воронеж, 1997.-С. 189-190.

3. Влияние физических воздействий на регенерационную способность неоп-лодотворенных семяпочек сахарной свеклы // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и создание генофонда: Тез. докл. VII Международной конференции. -Москва, 1997. - С. 97. (Соавт. Знаменская В.В., Подвигина O.A.).

4. Влияние физических факторов на регенерационную способность в культуре семяпочек сахарной свеклы Н Сахарная свекла (в печати) (Соавт. Знаменская В.В., Подвигина O.A.).

Рекомендации производству

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Т.Г.).

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Таратонов, Николай Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы создания гомозиготных линий.

1.2. Возникновение гаплоидов и методы их получения.

1.3. Диплоидизация гаплоидов.

2. МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ.

2.1. Исходный материал.

2.2. Условия и методика проведения опытов.

2.2.1. Индукция гаплоидов.

2.2.2. Стабилизация полученных гаплоидных регенерантов.

2.2.3. Колхицинирование гаплоидов.

2.2.4. Укоренение дигаплоидов.

3. СТИМУЛИРОВАНИЕ РЕГЕНЕРАЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ НЕОПЛОДОТВОРЕННЫХ СЕМЯПОЧЕК САХАРНОЙ СВЕКЛЫ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO.

3.1. Воздействие химическими факторами.

3.2. Воздействие физическими факторами.

4. СТАБИЛИЗАЦИЯ ГАПЛОИДНЫХ РЕГ ЕНЕРАНТОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ.

4.1. Влияние чередования питательных сред различного гормонального состава на рост и развитие индуцированных гаплоидов. vitro.

5.2. Влияние физиологически активных веществ на воспроизводство дигаплоидных клеток.

5.3. Активизация ростовых процессов у колхицинированных растений физиологически активными веществами в культуре in vitro.

6. ИНДУЦИРОВАНИЕ РИЗОГЕНЕЗА У САХАРНОЙ СВЕКЛЫ В

КУЛЬТУРЕ IN VITRO.

6.1. Влияние состава питательной среды и сроков культивирования на корнеобразование у дигаплоидов.

ВЫВОДЫ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Влияние экзогенных факторов на рост и развитие регенераторов в процессе формирования дигаплоидных форм сахарной свеклы"

Актуальность проблемы.

Более чем за два века свекла из огородного растения превратилась в важнейшую техническую культуру, ее урожайность и сахаристость возросли более чем в 3 раза. На смену сростноплодным (многосемянным) сортам пришли раз-дельноплодные (односемянные), на ряду с фертильной стала возделываться свекла стерильная по пыльце, в практику вошли диплоидные, триплоидные и тетраплоидные формы культуры. Появление новых форм повлекло за собой изменение принципов, направлений и методов селекции. На смену традиционной селекции сортов - популяций пришла гетерозисная селекция. Современный селекционный процесс стал базироваться на раздельноплодной форме сахарной свеклы, полиплоидии и на разнообразии материалов с использованием ЦМС (Корниенко, Орлов, 1996). Проблема получения нового исходного материала для селекции становится актуальной. Методы используемые в гетерозисной селекции, базирующиеся на комбинациях, рекомбинациях и отборе, ведут как правило к сужению генетической изменчивости и уменьшению многообразия исходного генетического материала (Кузьмин и др., 1995 ). Поэтому необходимо разрабатывать новые методы, которые позволят обогащать генофонд растений для создания высокопродуктивных сортов и гибридов. Методам биотехнологии в решении этих вопросов отводится значительное место.

Одним из перспективных путей получения новых исходных форм сахарной свеклы является метод гиногенеза. Источником для расширения генетической базы в данном случае являются гаплоидные структуры, получаемые из не-оплодотворенных семяпочек. Получение гаплоидов в культуре in vitro, начиная с введения неоплодотворенных семяпочек и заканчивая переводом удвоенных гаплоидов в грунт, является сложным, не до конца изученным процессом, зависящим от ряда факторов: генотипа исходного растения, состава питательной среды, условий культивирования и других.

Это препятствует внедрению в селекционный процесс новых нетрадиционных методов создания генетически ценного исходного материала, основанных на взаимодействии экзогенных факторов среды и системы размножения растений.

В связи с этим необходимость дальнейшего изучения факторов внешней и внутренней среды, лимитирующих процесс получения гаплоидов и формирование на их основе дигаплоидных линий в культуре in vitro является актуальной и крайне важной.

Цели и задачи исследований.

Основная цель исследований заключалась в изучении морфогенетической активности женского гаметофита сахарной свеклы в условиях in vitro и оптимизации режимов получения дигаплоидных линий.

Задачи исследований:

1. Изучить воздействие физических и химических факторов на регенера-ционную способность неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в культуре in vitro.

2. Оптимизировать систему гормонального воздействия на гаплоидные регенеранты в период стабилизации.

3. Разработать оптимальные условия перевода гаплоидов на диплоидный уровень.

4. Изучить влияние некоторых физиологически активных веществ на репродукцию дигаплоидных клеток.

5. Оптимизировать состав питательной среды для активизации роста удвоенных гаплоидов.

7. Получить дигаплоидные формы сахарной свеклы.

Научная новизна.

Впервые для сахарной свеклы показано стимулирующее действие рентгеновского облучения и обработки пониженной температурой на формирование гаплоидных форм из неоплодотворенных семяпочек женского гаметофита.

Оптимизирован состав питательной среды для повышения регенераци-онной способности неоплодотворенных семяпочек через вторичную регенерацию из каллусных структур.

Модифицированы питательные среды для этапа стабилизации гаплоидных регенерантов и перевода их на диплоидный уровень, что позволило ускорить получение дигаплоидных форм за счет уменьшения количества пассажей.

Практическая ценность и реализация результатов исследований.

Полученный экспериментальный материал позволил нам усовершенствовать метод получения дигаплоидных линий сахарной свеклы из неоплодотворенных семяпочек в культуре in vitro.

Увеличен выход гаплоидов с 4,5 % до 10,3 % путем воздействия на женский гаметофит сахарной свеклы экзогенными факторами.

Выявлен оптимальный срок для укоренения дигаплоидов в культуре in vitro.

На защиту выносятся следующие положения:

3. Активность роста колхицинированных растений регулируется гормональным составом среды.

4. Корнеобразующая способность дигаплоидов зависит от сроков культивирования и состава питательной среды.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Таратонов, Николай Алексеевич

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что морфогенетическая активность женского гаметофита стимулируется воздействием физико-химических факторов (рентгеновским облучением, холодовой обработкой, составом питательной среды) из которых наиболее эффективными являются регуляторы роста. Присутствие в питательной среде гиббереллина (0,5 мг/л) и 6-БАП (0,3 мг/л) позволило в среднем увеличить выход гаплоидных регенерантов до 10,3%.

2. Показано, что в период стабилизации культивирование гаплоидов на ростовой среде (ГК, Кн, БАП по 0,2 мг/л) с последующей пересадкой на питательную среду с пониженной концентрацией гормонов (ГК, Кн, БАП по 0,05 мг/л) обеспечивает высокую выживаемость гаплоидов (96,3%), активный рост и способность к вегетативному размножению.

3. Установлено, что колхицинирование гаплоидов в течение 2-х суток на безгормональной среде с колхицином в концентрации 0,01% и последующий пассаж на ростовую питательную среду с ФАВ : гиббереллин, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л является наиболее оптимальным режимом перевода гаплоидов на диплоидный уровень. Данная схема позволяет получить до 90% дигаплоидов, исключает возврат их на гаплоидный уровень, обеспечивает высокую выживаемость (86,7%) и создает необходимые условия для активного роста и размножения удвоенных гаплоидов.

5. Исследованы новые химические соединения, обладающие ризогенети-ческой активностью. Фиторегуляторы « № 344 » и « № 456 » в концентрации 0,05 и 5 мг/л соответственно позволили получить до 100% укорененных растений.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

Рекомендовать усовершенствованную методику получения дигаплоид-ных линий сахарной свеклы для внедрения в селеклионный процесс с целью создания нового исходного материала сахарной свеклы.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Таратонов, Николай Алексеевич, Рамонь

1. Амерханова М.Б., Рахимбаев И.В. Вегетативное размножение сахарной свеклы в культуре тканей // Вестник АН КазССР. 1986. - №3. - С. 49-54.

2. Аренкова Д.Н. Получение тетраплоидов у дыни воздействием аценаф-тена // Докл. АН ССС. 1940. - т.27. - С. 1028-1029.

3. Асфандиярова P.P., Зиякаева K.P. Каллусогенез в культуре пыльников и незрелых зародышей гороха посевного // Биология культивируемых клеток и биотехнология.: Тез. докл. Международной конференции. Новосибирск, 1988.-С. 220.

4. Атанасов А. Биотехнология в растеневодстве. Новосибирск, 1993. -С. 241.

5. Атанасов А.И., Бутенко Р.Г. Культура изолированных пыльников сахарной свеклы // Физиология и биохимия культурных растений. 1980. - т. 12. - № 1. - С. 49-56.

6. Атанасов А., Кикиндонов Т. Вегетативно размножаване на захарно цвекло in vitro // Растениевъдни науки (НРБ). 1977. - XIV.- № 1. - С. 59-66.

7. Баласанян Д.С. Роль кинетина в стимуляции деления клеток Allium сера L. // Биол. ж. Армении. 1973. - 26.- № 5. - С. 70-75.

8. Биологический контроль в сельском хозяйстве / Под ред. Ф.М. Купер-мана. -М. 1962.-276 с.

9. Болсунов И.И. Экспериментально полученный гаплоид у Nicotiana rustica // Журнал шстггута боташки АН УРСР. 1939. - № 21-22. - С. 197-199.

10. Бормотов В.Е., Турбин Н.В. Экспериментальная полиплоидия и гетерозис у сахарной свеклы. Минск: Наука и техника, 1972. - 230с.

11. Бреславец Л.П. Полиплоидия в природе и опыте. М. АН СССР. -1963.-364 с.

12. Бугаенко Л.А., Давыдова O.A., Родов B.C., Гладун С.М. Получение полиплоидных растений мяты с использованием культуры in vitro // Биология культивируемых клеток и биотехнология.: Тез. докл. Международной конференции. -Новосибирск, 1988. С. 91.

13. Бугара A.M., Русина Л.В. Гаплоидный каллусогенез в культуре неоп-лодотворенных семяпочек шалфея мускатного // Физиология и биохимия культурных растений. 1989. - т. 21- № 6. - С. 554-560.

14. Бугара A.M., Русина Л.В. Культура неоплодотворенных завязей семяпочек in vitro как способ получения гаплоидных растений // Физиологоия и биохимия культурных растений. 1988. - т. 20. - № 5. - С. 419-430.

15. Бугара A.M., Русина Л.В., Резникова С.А. Эмбриоидогенез в культуре пыльников шалфея мускатного // Физиология и биохимия культурных растений. 1986. - т. 18.-№4.-С. 381-386.

16. Буйдин В.В. Индуцирование полиплоидии некоторыми производными аценафтена // Цитология и генетика. 1975. - т. 9. - С. 315-318.

17. Бурмакина Н.В. Исследование мейоза у гаплоидов озимой пшеницы// Генетика: Приложение. 1994. - т. 30. - С. 20.

18. Бурханова Э.А., Селеванкина С.Ю., Романко Е.Г., Куроедов В.А., Кулаева О.Н. Влияние цитокининов на матричную активность хроматина в проростках ржи // Докл. АН СССР. 1975. - т. 222. - № 3. - С. 733-735.

19. Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений // Гормональная регуляция онтогенеза растений. М.: Наука, 1984. - С. 42-54.

20. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. - 272 с.

21. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М.: Наука, 1975. - 120 с.

22. Бычкова Г.С., Бутенко Р.Г. Действие ауксина и кинетина на митотиче-ский цикл частично синхронизированной популяции клеток женьшеня настоящего in vitro // Докл. АН СССР. 1974. - 217,- № 2. - С. 452-489.

23. Верзилов В.Ф., Михтелева A.A. Действие гиббереллина на генеративную сферу земляники // Фитогормоны в процессе роста и развития растений.-М.: Наука, 1974. С. 36-41.

24. Винклер Г.Н., Диба А. Сранительная оценка питательных сред и стимулирующих веществ при культивировании меристемы картофеля // Известия ТСХА. 1972. - №5. - С. 35 - 37.

25. Вутева С., Загорска Н. Влияние гамма- лучей и низких температур на индуцированный андрогенез D. Innoxia Mill // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - С. 162-165.

26. Габаев С.Г. Опыты по воздействию колхицином и аценафтеном на огурцы с целью получения полиплоидов // Докл. АН СССР. т. 28. - 1940. - С. 163-166.

27. Герасимова E.H. Гаплоидное растение Crépis tecturum L., полученное экспериментально // Биол. Журнал. 1936. - т. 5. - С. 895-899.

28. Гирько B.C., Василенко С.И. О воздействии колхицина на морфогенез у гибридов тритикале и ячменя in vitro // Селекция и семеноводство. 1996. -№ 1-2.-С. 20-22.

29. Госька М. Результаты исследований по использованию культур in vitro в селекции сахарной свеклы // Использование биотехнологических методов в селекции сахарной свеклы. Киев, 1989. - С. 32-36.

30. Гришина Е.В., Зайцева М.И. Получение гаплоидов у кукурузы при воздействии химическими мутагенами и физиологически активными веществами // Апомиксис и цитоэмбриология растений. Саратов, 1968. - С. 65-68.

31. Гудков И.Н. Действие фитогормонов на продолжительность митоти-ческого цикла в клетках меристем // Регуляция клеточного цикла растений. -Киев: Наук, думка, 1985. С. 6-25.

32. Давоян H.H. Получение гаплоидов у риса методом культивирования неоплодотворенных завязей в условиях in vitro // Доклады ВАСХНИЛ. 1985. -№ 3. - С. 15-16.

33. Давоян Н.И., Тырнов B.C. Проблема диплоидизации гаплоидов // Гап-лоидия у покрытосеменных растений. Саратов, 1974. - 180 с.

34. Давоян Н.И., Тырнов B.C., Суханов В.М. Продолжительность митоти-ческого цикла у гаплоидов, дигаплоидов и тетраплоидов кукурузы // III Всесоюзное совещание по полиплоидии. Минск, 1970. - С. 79.

35. Демчинская E.H. К методике получения тетраплоидных форм сахарной свеклы // Основные выводы научно-исследовательских работ по сахарной свекле за 1966 год.-Киев, 1968.-т. 1.-С. 124-126.

36. Дерфлинг К. Гормоны растений. М: Мир, 1985. - С. 303.

37. Добрецова Т.Б., Лутков А.Н., Манжос A.M. О возможности получения полиплоидных и гаплоидных форм сахарной свеклы из близнецовых растений // Полиплоидия и селекция. М. - Л.: Наука, 1965. - С. 232-238.

38. Добросотсков В.В. Изменчивость самонесовместимости // Сахарная свекла. 1982. -№ 3. - С 31-33.

39. Дубинин Н.П., Панин В.А. Новые методы селекции растений. М.: Колос, 1967.-360 с.

40. Дьячук Т.И., Дьячук П.А. Культура пыльников пшеницы и ее использование в селекции // Биология культивируемых клеток и биотехнология.: Тез. докл. Международной конференции. Новосибирск, 1988. - С. 207.

41. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. Свойства и функции в организме. М.: Наука, 1983. - 176 с.

42. Ережепов А.Е., Омирбекова Н.Ж., Колумбаева С.Ж. Индуцированный морфогенез в культуре изолированных неоплодотворенных завязей пшеницы // Биология культивируемых клеток и биотехнология.: Тез. докл. Международной конференции. Новосибирск, 1988. - С. 203.

43. Зайцев Г.Н. Методика биометрических расчетов. М.: Наука, 1973.257 с.

44. Знаменская В.В. Жужжалова Т.П. Микроклональное размножение сахарной свеклы (методические рекомендации). Воронеж, 1995. - 23 с.

45. Знаменская В.В. Принципы и методы создания и поддержания исходного материала на современном этапе селекции сахарной свеклы: Автореф. дис. д.с-х.н. Рамонь, 1999. - 40с.

46. Иванова И.А. Фитогормоны и регуляция метаболизма в онтогенезе растений // Гормональная регуляция онтогенеза растений. М.:Наука, 1984. -С. 127-141.

47. Ивановская Е.В. Гаплоидия растений Solanum tuberosum L. // Докл. АН СССР. 1939.-Т.24.-С. 488-491.

48. Ильенко И.И. Микроклональное размножение и сохранение селекционного материала сахарной свеклы в культуре in vitro // Физиология и биохимия культурных растений. 1983. - Т. 15. -№ 4. - С. 351-355.

49. Калинин Ф.Л., Лобов В.П., Ястрембович Н.И., Мережинский Ю.Г., Сарлацкая В.В., Мельнечук Ю.П. Регуляция метаболизма растительной клет-ки.-Киев.: Наук, думка, 1973. -224с.

50. Карпеченко Т.Д. Тетраплоидные ячмени, полученные действием высокой температуры. Биол. журнал, 1938. - № 7. - С. 287-294.

51. Карпеченко Г.Д. Экспериментальная полиплоидия и гаплоидия // Теоретические основы селекции растений. М. - Л.: Сельхозиздат, 1935. — т.1. -С. 397-434.

52. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. -М.: Наука, 1983.-95 с.

53. Кашин A.C., Куприянов П.Г. Апомиксис в эволюции цветковых растений : онто- и филогенетические аспекты проблемы. Саратов, 1993. - 196с.

54. Кихара X. Цитоплазматическая мужская стерильность и селекция пшеницы // Сельскохозяйственная биология. 1967. - т.2. - С. 214-225.

55. Конарев В.Г., Елсакова Т.Н. Влияние некоторых физиологически активных веществ на нуклеиновые кислоты и клеточные структуры растений // Регуляторы роста растений и нуклеиновый обмен. М.: Наука, 1965. - 50с.

56. Корниенко A.B., Орлов С.Д. Методы селекции сахарной свеклы на гетерозис. М.: Родник, 1996. - 236 с.

57. Костов Д. Частота полиэмбрионии у ржи // Докл. АН СССР 1939. -т. 24.-С. 468-471.

58. Краевой С .Я., Гареев М.Э. Индуцированное получение гаплоидов у томата: Тез. докл. IV всесоюз. совещания по полиплоидии. Киев.:Наук. думка, 1975.-С. 62-63.

59. Кузьмин H.A., Шевченко В.Е., Павлюк Н.Т. Селекция и семеноводство полевых культур. Воронеж: Издательство ВГАУ, 1995. - 352 с.

60. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. М.: Наука , 1982. - 82 с.

61. Кулаева О.Н. О восстановлении белково-нуклеинового обмена срезанных листьев в процессе их изменения под действием кинетина // Докл. АН СССР. 1963. - 153.- С. 1475.

62. Кулаева О.Н. Цитокинины и их физиологическое действие // Усп. совр. биол. 1967. - № 28. - С. 63.

63. Кулаева О.Н. Цитокинины их структура и функция. М.: Наука,1973.-284 с.

64. Кулаева О.Н., Чайлахян М.Х. Достижения и перспективы в использовании фитогормонов // По материалам XI Международной конф. по ростовым веществам // Агрохимия . 1984. - №1. - С. 106-128.

65. Кунах В.А. Полиплоидия в культуре клеток in vitro и ее возможные причины // Экспериментальная полиплоидия у культурных растений. Киев,1974.-39 с.

66. Кунах В.А., Сидоренко П.Г., Зосимович В.П. Влияние кинетина на репродукцию клеток различной плоидности // Успехи полиплоидии. Киев, 1977.-С. 205-215.

67. Кунах В.А. Цитологическая характеристика культуры ткани гапло-паппуса // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М, 1970,- 155с.

68. Лаптев Ю.П. Гаплоидия в селекции растений. М.: Колос, 1984,248с.

69. Левенко Б.А. Получение гаплоидов из пыльников растений // Экспериментальная полиплоидия у культурных растений. Киев, 1974. - 25 с.

70. Лобанова Л.П., Еналеева Н.Х. Влияние состава питательной среды наразвитие макрогаметофита в культуре изолированных завязей табака // Биология культивируемых клеток и биотехнология.: Тез. докл. Международной конференции. Новосибирск, 1988. - С. 202.

71. Лутков А.Н. Гаплоидное растение льна полученное действием высокой температуры // Экспериментальные полиплоиды в селекции растений. -Новосибирск: Наука, 1966. С. 321-325.

72. Лутков А.Н., Панин В.А., Панина Е.Б., Карташова З.П., Щипачева Э.Н. Методика получения полиплоидных гибридов сахарной свеклы // Селекция и семеноводство. 1963. -№ 4. - С. 58-61.

73. Лутков А.Н. Тетраплоидия у льна, вызванная действием высокой температуры на зиготу // Докл. АН СССР. 1938. - т. 19. - С. 177-181.

74. Марьяхина И. Я., Полумордвинова И.В., Шевченко Н П. Возможность использования метода полиплоидизации in vitro в селекции лука //С.-х. биология. 1994. - № 5. - С. 32-37.

75. Мосина Н.Р. Получение тетраплоидных форм сахарной свеклы воздействием колхицина // Наука производству. - Воронеж, 1967. - С. 17-20.

76. Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агрохимиздат, 1987.-385 с.

77. Мюнцинг А. Генетические иследования. М.: Изд. иностранной литературы, 1963. - 488 с.

78. Нежевенко Г.И., Шумный B.K. Близнецовый метод получения гаплоидных растений // Генетика. 1970. - т. 6. - С. 173-180.

79. Новак Ф.Й. Индукция гаплоидов в культуре тканей и их значение в селекции растений // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986.-С. 159-167.

80. Определение числа хромосом и описание их морфологии в меристеме и пыльцевых зернах культурных растений: Методические указания ВИР. -Л, 1986.-62 с.

81. Павлова М.К. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек: возможности и перспективы // Сельскохозяйственная биология. 1987. - № 1. -С. 27-33.

82. Паушева Э.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1980. - 304 с.

83. Подвигина O.A., Знаменская В.В. Индуцирование гаплоидов у сахарной свеклы // Пути повышения эффективности свеклосахарного производства России в условиях рыночной экономики. Рамонь, 1996. - С. 57-58.

84. Подвигина O.A. Индуцирование гаплоидии у сахарной свеклы: Ав-тореф. дис. канд. с-х. н. Рамонь, 1994. - 22 с.

85. Поддубная Арнольди В.А. Общая эмбриология покрытосеменных растений. - М.: Наука, 1964. - 482 с.

86. Полевая B.C., Яшина С.Г., Олейникова Т.А. Размножение in vitro ре-генерантов томата из изолированных меристем // Физиология растений. 1988. -т. 35, вып. 3,-С. 612-617.

87. Полевой В.В. Физиология растений. М.: Высшая школа, 1989.464с.

88. Раджабли Е.П., Рудь В.Д., Тарасенко В.Д., Хвостова В.В. Методы экспериментального получения полиплоидных и мутантных форм растений.-Новосибирск, 1972.-215с.

89. Романко Е.Г., Селеванкина С.Ю., Куроедов В.В. Влияние цитокини-на на синтез РЕЕК и на синтез связанной с хроматином РНК-полимеразы в срезанных листьях ячменя // Физиология растений. 1978. - т. 25. Вып.6. - С. 1199-1205.

90. Рыбин В.А. Искуственное вызывание полиплоидии у цветковых растений // Цитологический метод в селекции плодовых. М.: Колос, 1967. - С. 3 -216.

91. Сатарова Т.Н. Культивирование пыльников кукурузы // Биология культивируемых клеток и биотехнология.: Тез. докл. Международной конференции. Новосибирск, 1988. - С. 217.

92. Сельскохозяйственная биотехнология / B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, C.B. Дегтярев, Е.З. Кочиева, М.И. Прокофьев, H.H. Новиков, В.М. Ковалев, Д.В. Калашников; Под редакцией B.C. Шевелухи. М.: Высшая школа, 1998.-416с.

93. Семан И., Фараго Ю. Результаты научного исследования биотехнологии сахарной свеклы // Использование биотехнологических методов в селекции сахарной свеклы. Киев, 1989. - С. 58-63.

94. Терновский М.Ф. Полиплоидия в селекции табака // III Всесоюзн. Совещание по полиплоидии.: Тез. докл. Минск, 1970. - С. 4-5.

95. Тодуа В.А., Тавдумадзе Е.Г., Терновский М.Ф., Сарычев Ю.Ф. Индуцированный партеногенез у Nicotiana tabacum L. // Докл. АН СССР. 1967. -т. 177.-С. 449-459.

96. Турков В.Д., Дубров А.П. Сравнительная эффективность гамма- и ультрофиолетового облучения в получении гаплоидных семян у томатов Li-copersicon esculentum // Докл. АН СССР. 1968. - т. 181. - С. 486-487.

97. Турков В.Д. Экспериментальный партеногенез у томатов // II совещание по проблемам апомиксиса у растений и животных.: Тез. докл. -Новосибирск.: Наука, 1967. С. 63.

98. Тырнов B.C. Эмбриологические механизмы возникновения гаплоидов // Гаплоидия и селекция. М.: Наука, 1976. - С. 66-76.

99. Фаркаш Ф., Ловас А. Использование биотехнологии в селекции сахарной свеклы // Использование биотехнологических методов в селекции сахарной свеклы. Киев, 1989. - С. 64-69.

100. Хвилковская Б., Зенктелер М. Действие некоторых фитогормонов на ткани культивируемых in vitro семяпочек Solanum tuberosum // Цитология и генетика, 1983.-т. 17.-№3.-С. 12-19.

101. Хохлов С.С., Тырнов B.C., Гришина Е.В. Гаплоидия и селекция.1. М.: Наука, 1976.-221с.

102. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. - С. 124136.

103. Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. -М.: Наука, 1992.-599 с.

104. Щербаков В.К. Полиплоидия и редукция наборов хромосом у растений под влиянием различных факторов и роль ядра и цитоплазмы в этих процессах // Успехи современной биологии. 1962. - 54, вып. 2. - С. 146-182.

105. Эллиот Ф. Селекция растений и цитогенетика М.: ИЛ, 1961.-127с.

106. Юсубов A.M., Мосина Н.Р. Создание полиплоидных форм сахарной свеклы // Полиплоидия в селекции сахарной свеклы. М.: Наука, 1970. - С. 120 -133.

107. Ahmim Mamar, Vieth Joachim. Production de plantes haploides de Gerbera jamesonii par culture in vitro d'ovules // Can. J. Bot. 1986. - 64. - № 10. -P. 2355-2357.

108. Amrhein N. Growth//Progr. Bot. 1983. - 45. - P. 136-165.

109. Ao G.M., Zhao S.X., Li G.H. Induction of Haploid plantlets from unpollinated maize ovaries in vitro // Acta Genetica Sinica. 1982. - 9,4. - P. 281 -283.

110. Beaville M.A. Obtention d'haploides in vitro á partir d'ovaries non fécondes de Riz, Oriza sativa L. // С. r. Acad. sei. 1980. - 290, № 6. - P. 489-492.

111. Belling J., Blakeslee A.F. The assortiment of chromosome in triploid Datura amer // Nature. 1922. - v. 56. - P. 337-346.

112. Bender K. Uber die Erzeugung und Entstehung digaploider Pflanzen bei Solanum tuberosum. Z. Pflanzenzucht. - 1963 - Bd.50. - P. 141-166.

113. Blakeslee A., Belling J., Farnham M., Berger A. A haploid mutant in Datura stramonium // Sciene. 1922. - 55. - P. 646-647.

114. Blakeslee A., Morrison G., Avery A. Mutations in a haploid Datura // J. Hered. // 1927. 18. - P. 193-199.

115. Blakeslee A., Avery A. Methods of inducing doubling of ehromosomes in plants. J. Heredity. 1937.- v.28. - P. 393-411.

116. Bossoutrot D., Hosemans D. Gynogenesis in Beta vulgaris L.: From in vitro culture of unpollinated ovules to the production of doubled haploid plants in soil // Plant Cell Repts. 1985. - 4. - № 6. - P. 300-303.

117. Bourgin J.P., Nitshc J.P. Ann. Physiol. Vegetale. Paris. - 1967. - P. 377-382.

118. Campion B., Alloni C. Induction of haploid plants in onion (Allum cepa L.) by in vitro culture of unpollinated ovules // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. -1990.-20,-№ l.-P. 1-6.

119. Chase S.S. Monoploids and monoploid derivatives of maize // Bot. Rev. 35.- 1969.-P. 117-167.

120. Deanon J.R. Treatment of sweet corn silks with mallic hydrade and col-hicine as means of increasing the frequency of monoploids // Philipp. Agr. 1957. -41.-P. 364-377.

121. Devreux M., Saceardo F., Brunoria A. Caryologia // Firenze. 1971. - P. 141-148.

122. D'Halluin Katelijn, Keimer Birgit. Production of haploid sugar beets (Beta vulgaris L.) by ovule culture // Gen. Manipulai. Plant Breed: Proc. Int. Symp.-Berlin: New York, 1986. P. 307-309.

123. Duhamel L. Action de la colchicine sur la croissence de meristemies ra-dicularis de Lupinus albus // Cont. rend. Soc. biol. 1939. - 131. - P. 121-137.

124. Ernould L. L'Autopolyploidie experimentale chez la betterave // La Cellule. 1946.-P. 50-54.

125. Fisher H.E. Untersuchungen an Zwillingen von Beta vulgaris Zuchter, 1956.-Bd. 26.-P. 136-152.

126. Gamborg O.L., Eveling D. Culture method and detection of gluconate in suspension cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. 1968. - 46. - P. 417421.

127. Gmitter F.G., Xubai Ling. Embryogenesis in vitro and nonchimeric tetraploid plant recovery from undeveloped citrus ovules treated with colchicine // Soc. Hort. Sei. 1991. - 116, № 2. - P. 317 - 321.

128. Goodwin P.B. Phytohormones and growth and development of organs of the vegetative plants // Phitohormones and related compounds. Amsterdam-Oxford-New York: Biomedical press, 1978.-v. 11.-P. 131-174.

129. Goska Maria. Histological observations of sugar-beet ovules in in vitro cultures // Bull. Pol. Acad. Sei. Biol. Sei. 1985. - 36. - № 7-9. - P. 171-175.

130. Guha S., Maheshwari S.C. In vitro production of embrios from anthers of Datura // Nature. 1964. - Vol. 204. - P. 497-501.

131. Gupta N., Carlson P.S. Preferential growth of haploid plant cells in vitro // Nature. 1972. - 86. - P. 72-83.

132. Hansen A.L., Plever C., Pedersen H.C., Keimer B., Andersen S.B. Efficient in vitro chromosome doubling during Beta vulgaris ovule culture // Plant Breed. 1994. - 112. - № 2. - P. 89-95.

133. Hansson B. Sver. utsadesforen. tidkr. 1978. - 88. - P. 141-148.

134. Hoseman D., Bossoutrot D. Induction of haploid plants from in vitro culture of unpollinated beet (Beta vulgaris L.) // Pflanzenzucht. 1983. - 91, 1. - P. 74-77.

135. Hsu C.L., Stewart J. McD. Callus induction by (2 chloroethyl) phosphonic acids on cultured cotton ovules // Physiol, plant. - 1976. - 36,2. - P. 150 - 153.

136. Huang Q.T., Yang H.Y., Zhou C. Embryological observations on ovary culture of unpollinated young Howers in Hordeum vulgare L. // Acta bot. sinica. -1982. 24. - № 3. p. 295-300.

137. Jentzsch K. Regulation des Wachtums und der Zellvermehrung // Wissen stand und Problems. Berlin, 1983. - 143p.

138. Jones R.L. Gibberellin control of cell ebongation // Plant growth substances. London, 1982.-P. 120-130.

139. Jorgensen C.A. The experimentae formation of heteroploid plants in the genus Solanum // J. Genetics. 1928. - v.19. - P.133-211.

140. Kameya T., Hinata K. J. Breed. Tokyo, - 1970. - P. 82-87.

141. Katayama J. Haploid formation by x-reys in Triticum monococcum. Cytologia. 1934. - v.5. - P. 235-237.

142. Keller J. Culture of unpollinated ovules, ovaries and flover buds in some species of the genus Allium and haploid induction via gynogenesis in onion (Allium cepa L.) // Euphyfica. 1990. - 47. - № 3. - P. 241-247.

143. Kihara H., Tsunewaki K. Use of alien cytoplasms a new metod of pra-ducing haploids // J. Genet. - 1962. - v. 37.-P. 310-313.

144. Knapp E. The significance of polyploidy in sugar beet breeding // Proc. Int. Genetics Symposia. Tokyo, 1956. - P. 371-379.

145. Kruse A. The potential use of heterosis in Beta vulgaris // 1980 arsskrift. Yeabook Jahrbuch Annuaire. Kobenhavn, 1980. P. 117-137.

146. Kuckuck H. Aztkzeuzungen bei Gerste. Zuchtez. - 1934. - P. 270-273.

147. Lewis D. Production of polihaploids by colchicine and x-reys // Nature. 1951.-№167.-P. 891.

148. Lux H., Herrmann L., Wetzel Claudia. Production of haploid sugar beet (Beta vulgaris L.) by culturing unpollinated ovules // Plant Breed. 1990. - 104. - № 3.-P. 177-183.

149. Macleod R.D., Davidson D. Changes in mitotic indexes in roots of vicia faba // Exptl. Cell Res. № 2-3. - P. 541-554.

150. Magoon M.L., Shambuligappa K.G. A polihaploid plant of Sorghum album Parodi // Genet, pol. 1962. - v. 3. - P. 301-306.

151. Maheshwari P., Sachar R.C. Polyembryony. Recent advances in the embryology of angiosperms // Delhi. 1963. - P. 265-296.

152. Mazoti L.B., Muhlenberg C.E. Haploides naturales en maiz // Rev. Agr. 1958.-v.25.-P. 171-178.

153. Meyer J. L'induction du development mitotique ches, les protoplastes de mesophylle de Tabac cultives in vitro: contrele hormonae // Bull. Soc. bot. Fr. Actual, bot. 1985,-№ l.-P. 87-102.

154. Muntzing A. Hote on a haploid rye plant // Hereditas. 1937. - v.23. -P. 401-404.

155. Munrez W. Möglichkeiten und Stand der Haploid Zuchtungbei landwirtschaftlichen Kulturplanzen. // Mogl. U. Stand. Haploidie bei landw. Kulturfl. -1979.-P. 179-198.

156. Nacamura S. Somt haploid plant in rice // Jour. Genet. Jap. 1933. - № 8.-P. 223-227.

157. Nagl W., Rucker W. Shift of DNA replication from diploid to poliploid cells in citocinin controlled differentiation // Cytobios. 1974. - v.10. - 137 p.

158. Narasimhan B., Mukherjec S.K. Use of kinetin in recovery of tetraploids from grape shoots treated with colhicine // Sei. and Cult. 1969. - v. 35. - 266p.

159. Nebel B.R. Mechanism of polyploids though colchicine // Nature. -1937.-v. 140. P. 1101.

160. Nitsch J. Culture in vitro de tissum de fruits. 3. Mesocarpe et endocarpe de peche// Bull. Soc. bot. France. 1967. - 112. - № 1/2. - P. 22 - 25.

161. Nitcsch J. Congr. nat. Soc. Savantes. Tours, 1968. - P. 423-437.

162. Nitsch J., Amer J. Bot. Baltimore, 1951.-P. 566-576.

163. Nitsch J., Noreel B. C.R. Acad. Sci.D. 1973. - 246. - P.303-306.

164. Nogent S., Dubois F., Lenee P. Gynogenesis in sugarbeet, Beta vulgaris: Colloq. Impact, biotechnol. dans secteur veg. agro-aliment // Bull. Soc. bot: Fr. Actual, bot, 1990. 137. - № 3-4. - P. 133.

165. Nordenskiold H. Studies of a haploid rye plant // Hereditas. 1939. - v. 25.-P. 204-210.

166. Nygren A. Poliploids in Melandricum produced by nitrous oxide // Hereditas. 1955. - v.41. - P. 287-290.

167. Ostergen G. Polyploids and aneuploids of Crepis capillaris produced by tretment with nitrous oxide // Genetica. 1954. - v. 27. - P. 54-64.

168. Ostergen G. Production of polyploids and aneuploides of Phalaris by means of nitrous oxide // Hereditas 1957. - v. 43. - P. 512-516.

169. Pallares P. Premiers résultats de la culture «in vitro» d'ovules non fécondés de cotonnier (Gossypium hirsutum L.) // Coton et fibres trop. 1984. - 39, 4.-P. 145-152.

170. Prakash S. Haploidy in Brassca nigra Koch // Euphytica. 1973. - 22. -P. 613-614.

171. Ragot M., Steen P. Genetic and environmental effects on chromosome doubling of sugarbeet (Beta vulgaris L.) haploids // Euphytica. 1992. - 63. - № 3. -P. 233-237.

172. Randolph L.F. Some effects of high temperature on polyploidy and other variations in maize // Nat. Acad. Sei. 1932. - v. 18. - P. 222-229.

173. Sachar R.C., Kapoor M. In vitro culture of ovules of Zephyranthes // Phytomorfology. 1959. -9. -№ 21. - P. 147-156.

174. San Noeum L.H. Haploids d'Hordeum Vulgare L. par culture in vitro non fécondés // Annual Amelior. Plantes. 1976. - 26. - P. 751-754.

175. Seman Ivan, Farago Juraj. Research biotechnological methods in sugar beet breeding in the research and breeding institute at Bucany // Potsdam. Forsh. B. -1988. -№ 57. -C. 51-56.

176. Siddig E.A., Swaminathan M.S. Superior radioresistance of polyploids -a tool for the preferential elimination of diploid cells in a cjlchicine- induced mixo-ploid tissue // Current Sci. 1967. - № 2. - P. 307-308.

177. Sitbon M. Production of haploid Gerbera jamesonii plants by in vitro culture unfertilized ovules // Agronomie. 1981. - 1. - № 9. - P. 807 - 812.

178. Savitsky H. Effect of low colchicine concentration on inducing tetraploidy in sugar beets // J. Amer. Soc. Sugar Beet Technol. 1968. - 15. - P. 2-7.

179. Speckmann C.J.Jr., Van Geyt J.P.C., Jacobs M. The induction of haploids of sugar beet (Beta vulgaris L.) using anther and free pollen culture or ovule and ovary culture // Gen. Manipulat. Plant Breed. Berlin: New York, 1986. - P. 351 - 353.

180. Srivastava L.M., Sawney V.K., Taylor I.P. Gibberellic acidinduced cell elongation in lettuce hypocotyls // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1975. - v.72. - P. 1107-1111.

181. Sunderland N. New Sci. London, 1970. - P. 142-144.

182. Thakur S. Indian J. exper. Biol. New Delhi, 1975. - P. 517-520.

183. Torrey J.G. Kinetin as trigger for mitosis in nature endomitotic plant cells // Exp. Cell Res. 1961. - 23. - P. 281.

184. Trewavas A.I. Plant growth substances metabolic fliwheels for ces metabolic fliwheels for plant development // Cell. Biol. Int. Repts. 1983. - 7. - № 8. - P. 569-575.

185. Truong Andre I., Demarly V. Obtaining plants by in vitro culture of unfertilized maize ovaries (Zea mays L.) and preliminary studies on the Progeny of gynogenetic plant // Pflanzenzucht. - 1984. - 92. - № 4. - P. 309-320.102

186. Van Geyt J., D'Halluin K., Jacobs M. Induction of nuclear and sell divisions in microspores of sugar beet (Beta vulgaris L.) // Pflanzenzucht. 1985. -95,-№4. -P. 325-335.

187. Walker C.W.R., Dietrich J. Kinetin induced meioticprophese acceleration and stasis in Tradescantia Cultured on media deficient in sugar // Nature. 1961.- 192.-889 p.

188. Webber J.M. Cytologicae featres of Nicotiana glutinosa haploids // Jour. Agr. Res. 47. - P. 845-867.

189. Wu B.J., Chen K.C. Cytological and embriological studies of haploid plant production from cultured unpollinated ovaries of Nicotiana tabacum L.// Acta. Bot. sinica. 1982. - 24. - № 2. - P. 125 - 129.

190. Zhou C., Yang H. Y. Embryogenesis in unfertilized embrio sac of rice. ActaBotanica Sinica, 1981. - 23. - 3. - P. 176-180.

191. Zhu Z.C., Wu H.S., An Q.K. Induction of haploid plantlets from unpollinated wheat ovaries cultured in vitro // Acta Genetica Sinica. 1981.-8.-4.- P. 386-390.

Информация о работе

Таратонов, Николай Алексеевич
кандидата сельскохозяйственных наук
Рамонь, 1999
ВАК 06.01.05

Диссертация

Влияние экзогенных факторов на рост и развитие регенераторов в процессе формирования дигаплоидных форм сахарной свеклы - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы