Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфогенез различных видов рода CROCUS L. в культуре IN VITRO

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Морфогенез различных видов рода CROCUS L. в культуре IN VITRO"

РГб од

- 8 МАП .1995

На правах рукописи

ЧУБ Владимир Викторович

МОРФОГЕНЕЗ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ РОДА CROCUS L. В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

(Специальность 03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова, на Биологическом факультете, каф. физиологии растений.

Научный руководитель - чл. -корр. Российской Академии Наук, академик РАСХН. профессор Р.Г.Бутенко.

Официальные оппоненты:

Д. б. н., профессор А.П.Меликян,

к. б. н. К-В.Катаева.

Ведущее учреждение - Московская сельскохозяйственная академия им. К. А.Тимирязева.

Защита диссертации состоится "18" Ж&& 1995 г. в "/55$ часов- на заседании специализированного совета К. 053.05.14 в Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова.

Адрес: 119899, г.Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться ознакомиться в Научной библиотеке им. А.М.Горького Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан л^^лЛ 1995г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

0.Г.Полесская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Интерес к объекту нашего исследования - видам рода Crocus L. - обусловлен тремя обстоятельствами.

1. Крокусы являются красиво цветущими эфемероидами, которые находят все более широкое применение как декоративные растения.

2. Многие виды находятся под угрозой уничтожения.

3. Один из представителей рода - шафран посевной (С. sa-tivus L.)- является продуцентом ценных веществ: кроцина (безвредный пищевой краситель, обладающий сильными окрашивающими свойствами), пикрокроцина (гликозида, придающего шафрану специфический вкус) и сафраналя (основного компонента эфирного масла), что обуславливает его широкое применение в пищевой промышленности. Высушенным рыльцам шафрана приписывают ле-. карственные свойства [Тихомиров В.А., 1888]. Стоимость шафрана на международном рынке постоянно растет [Sigma, 1988-1994].

При плантационном выращивании крокусов возникают различные проблемы. Одна из них - низкие коэффициенты вегетативного размножения многих видов Crocus. Это обстоятельство не позволяет широко внедрять в культуру исчезающие и редкие виды Crocus.

Вторая проблема - стерильность многих видов и сортов (особенно - С. sativus L.).

При выращивании шафрана посевного урожай оказывается низким, нестабильным и сильно зависит от погодных условий. К тому же, на территории России нет пригодных для культуры шафрана посевного территорий. Поэтому перспективными для возделывания могут оказаться другие представители рода Crocus L.

Все эти проблемы невозможно разрешить без использования биотехнологии. Можно наметить три основных направления работ в этой области: 1) клонапьное микроразмножение крокусов in vitro с целью увеличить коэффициенты вегетативного размножения; 2) получение рылец шафрана или подобных им структур для извлечения ценных веществ; 3) отбор каллусных и суспензионных культур-суперпродуцентов этих веществ.

В последнее время интерес к культивированию крокусов in

vitro заметно возрос [Ding Bao-га et al., 3981; Нурмуханбето-ва, 1983; Himeno and Sano, 1987; Fakhrai and Evans, 1989; Миля-ева, Ахундова, 1993].

Для .разработки технологии получения рылец шафрана in vitro необходимо комплексное и всестороннее изучение закономерностей морфогенеза у ряда представителей рода Crocus L.

Цель работы. Поиск новых видов рода Crocus L., пригодных для получения in vitro ценных веществ, содержащихся в шафране.

Для этого необходимо бьшо решить следующие задачи.

1.Ввести в культуру in vitro различные виды рода Crocus L., дать их сравнительную характеристику на первых этапах роста. Выбрать наиболее перспективные для дальнейшей работы

ВИДЫ,;'

2. Изучить характер роста культур, полученных из различных по происхождению эксплантов, в зависимости от сезона года.

3. Получить устойчивые каллусные культуры , различащие-, ся генотипически и эпигенетически. Исследовать особенности их

роста.

4. Провести сравнительный анатомо-морфологический анализ органов исходного растения и структур, возникающих в культуре in vitro.

Научная новизна. Впервые были введены в культуру in vitro C.angustifolius Weston, С. sieberi Gay и C.speciosus Bieb. Установлена зависимость характера роста в культуре от сезона года. Впервые доказана возможность образования рыльцеобразных структур не только из тканей стенки завязи, но и из тычиночной нити и связника. На основе проведенного исследования предложена модель дедифференцировки Crocus в культуре in vitro.

Практическая значимость работы. Полученные результаты позволят разработать методы для биотехнологического получения каллусов и рыльцеобразных'структур, содержащих ценные компоненты шафрана.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на ежегодных планово-отчетных конференциях' по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино, 1992; Москва, !994; Москва, 1995), III съезде Всероссийского общества физиологов рас-

тений ( Санкт-Петербург, 1993), II Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Алматы, 1993), на заседаниях кафедры физиологии растений Биологического факультета ИГУ

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, список которых приводится.

Финансирование. В течение ряда лет работа финансировалась • в рамках Государственной научно-технической программы России "Новейшие методы биоинженерии" по проекту "Получение клеточных линий-продуцентов пищевых красителей и добавок".

Объем и структура диссертации. Работа изложена на /33 страницах машинописного текста, содержит H рисунков.

"Ь таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов работы и обсуждения, общего заключения. В списке литературы наименований, из них на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Растительный материал. Род Crocus L. " из сем. Iridaceae содержит более 80 видов, которые можно по срокам зацветания разделить на две экологические группы: весеннецветущие С11-V) и осеннецветущие (IX-XII). В качестве объектов мы выбрали С.angustifolius Weston, весеннецветущий вид, занесенный в Красную Книгу СССР, С.vernus (L. )Hill. С. chrysanthus (Нег-bert)Herbert C.sieberi Gay - высокодекоративные весеннецветущие виды, послужившие основой для создания многочисленных сортов, C.speciosus Bieb. и С. zonatus Gay - осеннецветущие виды, которые могут служить заменителями шафрана посевного. С.angustifolins был собран на склоне г. Аю-Даг и любезно предоставлен нам 0.В. Митрофановой (Никитский бот. сад, Ялта). Остальные виды были взяты из коллекций и предоставлены: С.spe-ciosus и С. zonatus - Е.Н. Клюйковым (МГУ, Москва) и Д. Л. Матюхи-ным (ТСХА, Москва) , С.vernus и С.chrysanthus cv. "Remembrance" Н.А.Петренко (ВИР, Санкт-Петербург). Клубнелуковицы С. chrysanthus cv."Cream Beauty" и C.sieberi cv."Violet Queen" были приобретены на одном из местных рынков.

Введение эксплантов в культуру In vitro проводили ежемесячно с октября по февраль (если имелся массовый материал)

или только в октябре-ноябре (при ограниченном количестве клубнелуковиц).

Для введения в культуру in vitro весеннецсетущих видов использовали почки, содержащие зачатки генеративных органов, не распустившиеся цветки или оплодотворенные завязи. Материал поверхностно стерилизовали в течение 7 минут 10%-ным раствором перекиси водорода, промывали стерильной водой и разделяли на отдельные органы (экспланты): столбики с рыльцами, тычинки, листочки околоцветника, завязи, листья, замещающие клубнелуковицы. Иногда в среду после автоклавирования добавляли цефотаксим до конечной концентрации 500 мг/л и постепенно снижали при субкультивированиях.

Условия культивирования. Экспланты высаживали на основную среду Мурасиге и Скуга, содержащую 2.5%-ную сахарозу с различным содержанием регуляторов роста (см. табл. 1). Культуры содержали на свету при 25 С. Для большинства экспериментов мы использовали 16-часовой световой день (люминесцентная лампа дневного света). Каждые 15-20 дней экспланты переносили на свежую среду того же состава или модифицированную.

Измерения прироста сырой биомассы. Для количественной оценки прироста биомассы асептически взвешивали кусочки каллуса перед пересадкой и при последующем субкультивировании.

При пересадках оценивали количество некротизированных фрагментов каллуса. Для каждого варианта сред измерения проводили в 15 биологических повторностях.

Световая и электронная микроскопия. Наиболее интересные образцы тканей или образовавшиеся при морфогенезе структуры изучали на светооптических срезах и с помощью сканирующего микроскопа. Материал подготавливали для исследования стандартными методами: фиксировали в 2. 5% глутаральдегиде, обезвоживали в серии растворов этанола, переводили в ксилол и заключали в парафин, после нарезки окрашивали срезы гематоксилином (для световой микроскопии) или фиксировали и обезвоживали аналогично, переводили в ацетон, лиофильно высушивали,

- 7 -

ТАБЛИЦА 1. Схема варьирования сред

при культивировании тканей С.angustí folius Weston.

HS, Юмг/лНУК, 1МГ/ЛБАП MS,Юмг/лНУК,1МГ/ЛБАП MS.Юмг/лНУК,lnr/лБАП

0.2мг/л ГК 0.4мг/л ГК

Кагшусогенез, морфогенез

Удлинение структур с последующим некрозом

----— - ____,____ ____г-_- ---1

MS. Юыг/лНУК, licr/лБАП MS, 1ыг/л2.4-D, MS,5мг/л2.4-D, №3,5мг/л2.4Ч)

(tí,контроль) 1мг/лБАП(е) 1-5мг/лБАШ. ô) (е)

Рост^рухлого каллуса, слабый морфогенез

Слабый полуор-ганизов. рост

Быстрый полуор-ганизов. рост

Некроз

ZL

1/2 MS, Юмг/лНУК. 1 MS, Юмг/лНУК, 2 MS. Юмг/лНУК,

lMT/лБАП 1иг/лБАП 1ЫГ/ЛБАП

Измерение прироста биомассы

1/2 MS, Юмг/лНУК, lMT/лБАП

монтировали и напыляли палладием (для сканирующей микроскопии) .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.ИНДУКЦИЯ КАЛЛУСОГЕНЕЗА И МОРФОГЕНЕЗА IN VITRO.

- ' 1. Пйдбор условий культивирования проводили на С. Chrysanthe cv.'Cream Beauty'.-В качестве эксплантов использовали фрагменты завязи. Варьировали условия освещения (16 часовой день или полная темнота) и гормональный состав среды (10мг/л НУК и 1мг/л БАП или 10 мг/л БАШ. Гормональный состав выбирали исходя из.данных литературы [Fakhrai and Evans. 1989; Sar-ша et al.. 1991].

На"среде, содержащей только БАП,, экспланты погибали довольно быстро: в течение 3-4 недель на свету и 4 - 6 недель в темноте. Иногда на эксплантах успевал развиться первичный каллус, однако быстро происходила его некротизация.

В темноте на среде с добавлением НУК и БАП без пересадки экспланты уже через две недели формировали каллус. Выращенный в темноте каллус имел кремовую окраску. На одних участках каллуса на 10 - 12 неделе мы наблюдали морфогенез, а на других -некроз через 12-18 недель.

Световой вариант мало отличался по скорости роста от тем-нового. Однако в отличие от темнового варианта, в световом варианте экспланты образовали несколько типов каллуса, варьировавших по окраске и плотности (белый плотный, зеленоватый и кремовый рыхлый). На свету тоже удалось получить морфогенез. В некоторых случаях мы также наблюдали некротизацию каллуса.

Таким образом, наилучшим оказался световой вариант, среда Мурасиге и Скуга с добавлением 10 мг/л НУК и 1 мг/л БАП. В этих условиях мы и изучали морфогенетический потенциал других видов шафрана.

2. Способность к введению в культуру in vitro различных видов рода Crocus. По данным литературы [Нурмуханбетова, 1983] клубнелуковицы С. alatavicus и C.korolkovi в мае обладают низкой, а начиная с августа - высокой способностью к кал-лусогенезу и морфогенезу. Поэтому для своих экспериментов мы брали материал в течении осени и зимы.

2.1 Изученные нами весеннецветущие вида Crocus различались по способности образовывать каллус . или способности к

морфогенезу. Минимальную способность к каллусогенезу и морфогенезу показал С. sieberi. Уже через 3-4 недели наблюдали изменение цвета эксплантов и их гибель. Каллусогенеза или морфогенеза у этого вида в наших условиях не наблюдалось. Вероятно, это связано с размерами зачатков органов цветка, которые у С. sieberi меньше, чем у других исследованных нами видов.

У С. vernus наблюдали лишь первичный каллусогенез, экс-планты и каллус гибли после 5-8 недель культивирования.

Высокий морфогенетический потенциал проявил С. chrysanthus. На его эксплантах уже после 2 недель культивирования образовывался каллус, а зачатки рыльцеобразных структур были заметны через 4 недели. Способность к морфогенезу и каллусогенезу варьировала в зависимости от типа экспланта и от фазы развития, на которой находилось растение при введении в культуру.

Наиболее эффективным при введении в культуру in vitro оказался С. angustí folius. Он так же легко, как и С. chrysanthus, давал каллус и морфогенез различного типа. Кроме того, нам удалось отобрать быстрорастущий каллус С. angustifolius, который можно длительно культивировать на твердой среде.

На наш взгляд, различия в эффективности каллусогенеза и морфогенеза можно целиком объяснить за счет различий в величине эксплантов. При уменьшении величины экспланта более вероятна его гибель. Это может быть связано с недостаточным кондиционированием среды, высокой удельной поверхностью повреждения и/или недостаточными запасами веществ в тканях экспланта.

Однако, нежелательно использование более крупных эксплантов. При первичном эксплантировании важно, чтобы органы были отделены друг от друга. Наши эксперименты по совместному эксплантированию органов у С.chrysanthus показали, что между органами возможна конкуренция. Например, если не отделять завязь от молодой клубнелуковицы, то уже через 4 недели культивирования происходит гибель завязи при интенсивном разрастании тканей клубнелуковицы. Погибают также и листочки околоцветника, не отделенные от Завязи.

2.2. Нами были использованы два осеннецветущих вида -

С. spesiosus и G.zonatus. Материал С. zonatus мы получили после цветения. Из генеративных эксплантов удалось выделить только стенку завязи и развивающиеся семена.

Через 3 недели культивирования на среде с 10мг/л НУК и 1мг/л БАП семязачатки С. zonatus давали первичный каллус, суб-культивировать который нам не удалось. Морфогенеза не было отмечено.

.С. speciosus отличался быстрым и обильным образованием каллуса на той же среде. Образование первичного каллуса происходило уже через 2 недели. На 3 неделе на эксплантах были видны новообразованные структуры различного типа.

Ткани С.speciosus мы поддерживали в культуре in vitro без изменения условий около года и смогли наблюдать второй пик морфогенеза с начала сентября по конец октября месяца. Сроки совпадают со временем цветения in vivo.При эксплантиро-вании в фазе цветения С. speciosus показал высокую способность к введению в культуру, каллусогенезу и морфогенезу.

Таким образом, в наших экспериментах наилучших результатов мы добились при введении в культуру С. angustifolius, С. chrysanthus (весеннецветущие) и С. speciosus (осеннецветущий вид). Наши дальнейшие исследования касались именно этих видов.

3. Способность к каллусогенезу и морфогенезу различных типов эксплантов. Эксперименты проводили в осенние месяцы на С. chrysanthus, С. angustifolius и С.speciosus, которые показали хорошие потенции к морфогенезу. У всех видов исследовали экспланты из генеративных органов: столбик с рыльцем, тычинки, листочки околоцветника и завязь. У С.angustifolius, кроме того, брали брактеи, фотосинтезирувдие листья, катафиллы и j ткани замещающей клубнелуковицы.

3.1. Экспланты из столбиков с рыльцами погибали наиболее часто, что, вероятно, связано с небольшими размерами этих структур. Однако, в двух случаях был получен зеленоватый и желтоватый каллус, субкультивировать который не удалось.

3.2. Культивируемые тычинки оставались живыми дольше, чем столбики с рыльцами. Ткани пыльника быстро бурели и погибали. Тычинки С. chrysanthus не были способны к каллусогенезу при выбранных условиях культивирования. Из тканей связника и

тычиночной нити, на которые были нанесены повреждения, развивались рыльцеобразные структуры. Применение техники небольших повреждений связника позволило нам доказать, что ткани тычинок способны к генеративному морфогенезу. Этот результат получен впервые в наших работах. Тычинки С. angustifolius были способны образовывать не только рыльцеобразные структуры, но и каллус.

3.3. Размеры листочков околоцветника по мере культивирования возрастали, на месте среза образовывался не морфогенный первичный каллус. Большая часть эксплантов листочков околоцветника погибала.

3.4. Наибольшую способность к каллусогенезу и морфогенезу проявили экспланты завязи, что соответствует данным других авторов [Fakhrai, Evans, 1989; Fakhrai, Evans, 1990; Sarma et al.,1990]. Морфогенный каллус, который можно было субкульти-вировать, образовывали стенки завязи, но не семязачатки . У неоплодотворенных семязачатков происходило изменение окраски и увеличение размеров. Микроскопический анализ нашего материала показал, что ткани наружного интегумента изредка переходят к неорганизованным клеточным делениям. Гораздо лучше образуют каллус оплодотворенные семязачатки у С. zonatus.

У эксплантов стенки завязи С. angustifolius и С.specio-. sus кроме каллусогенеза и морфогенеза по рыльцевому типу отмечен морфогенез по стеблевому типу. Этот тип морфогенеза наблюдали в базальных, но не в апикальных частях эксплантов. По-видимому, существует градиент морфогенетического потенциала: апекс завязи генерирует рыльцеобразные структуры, тогда как базальная часть - вегетативные побеги.

На образовавшихся рыльцеобразных структурах С. angustifolius отмечали наличие групп фиолетовых клеток. Эта окраска характерна для околоцветника этого вида (окрашены клетки, окружающие жилки на листочках околоцветника). Таким образом, несмотря на воспроизведение формы столбика и рыльца, в рыльцеобразных структурах имеются участки из клеток, по своей биохимической специализации более близкие к листочкам околоц-. ветника.

Рыльцеобразные структуры у С.angustifolius, C.chrysant-hus и С.speciosus при субкультивировании были способны пере-

ходить к каллусогенезу в тех же условиях культивирования. У С.angustifolius в трех случаях наблюдали образование новых рыльцеобразных структур из этого каллуса меньшего размера (по сравнению с исходными).

3.5. Первичные экспланты вегетативных органов С.angustifolius высаживали только на среду, содержащую 10 мг/л НУК и 1мг/л БАП при освещении. В этих условиях у фотосинтезирующих листьев наблюдается рост и появление зеленой окраски. В местах повреждений иногда возникают очаги роста, в которых формируются глобулярные структуры. По сравнению с эксплантами стенки завязи переход к неорганизованному росту начинается сравнительно поздно ( при 18-20 субкультивировании).

3.6. Катафиллы и брактеи не отличаются от фотосинтезирующих листьев по морфогенетическому потенциалу, однако они менее жизнеспособны.

3.7. Замещающие клубнелуковицы увеличиваются в размерах, дают многочисленные очаги роста в субэпидермальных слоях и неорганизованный рост в местах повреждений. Морфогенеза побе-гового или корневого типа de novo мы не зарегистрировали. Возможно лишь развитие уже заложившихся на клубнелуковице почек.

4. Влияние изменений состава регуляторов роста в среде на культивируемые ткани Crocus.

4.1. После первичного эксплантирования и закладки рыльцеобразных структур и побегов у С.angustifolius мы предпринимали попытку усилить рост растяжением этих структур с помощью гиббереллина (GA-3). Мы использовали добавки 0.2 и 0.4 мг/л GA-3 на фоне основной среды: 10мг/л НУК и ímt/л БАП (табл.1).

Уже через неделю мы наблюдали удлинение как столбикооб- | разных структур, так и фотосинтезирующих листьев. Заметных отличий в поведении тканей на среде с 0.2 и 0.4мг/л GA-3 мы не зарегистрировали.

4.2. После 9-ого субкультивирования на среде с 10мг/лНУК и 1мг/л БАП мы заменили НУК на 2.4-D. Целью этой замены было вызвать ризогенез. Эксперименты проводили с тканями, происходящими из листа, клубнелуковицы и стенки завязи С.angustifolius.

Использовали 5 вариантов сред: (d) 10мг/л НУК, 1мг/л БАП

- контроль; (р 1мг/л 2.4-D, 1мг/л БАП; Ш 5мг/л 2.4-D, 1мг/л БАП; (б) 5мг/л 2.4-D, 5мг/л БАП; (е) 5мг/л 2. 4-D.

В контроле культура продолжала расти гетерогенно: наряду с очагами роста, глобулярными структурами, гладкой, покрытой эпидермисом, поверхностью можно было встретить очаги рыхлого каллуса. Глобулярные структуры размером не более 3-5мм в диаметре.

Характер роста на новых средах по сравнению с контролем заметно изменился. Полное исключение БАП из среды (с) приводило к быстрым некрозам. На среде с 2.4-D и БАП очаги роста давали все более крупные глобулярные структуры, достигавшие 10-15мм. Преобладали плотные ткани с гладкой поверхностью, покрытой эпидермисом. Каллусы некротизировали. Гетерогенность понижалась. Это явление было характерно для тканей любого происхождения.

Эффект не зависел от дозы 2.4-D и БАП в использованных нами концентрациях. На среде (р) рост был, однако, замедленным по сравнению с (И) и (б). Поэтому среду с 1мг/л 2. 4-D и 1мг/л БАП мы не использовали в дальнейшей работе. На среде (б); 5мг/л 2. 4-D, 5мг/л БАЛ мы поддерживали полуорганизованный рост в течение года. "

Эффект от замены НУК на 2. 4-D связан не с дифференциров-кой каллусной массы, но с селективным действием на очаги структурированного роста.

5. Оптимизация состава среды для выращивания Crocus в культуре in vitro была необходимым этапом работы, поскольку в наших условиях биомасса тканей Crocus нарастала медленно, часто появлялись очаги некрозов, окрашенные в коричневый цвет.

Часто соотношение элементов минерального питания в среде Мурасиге и Скуга оказывается не оптимальным для различных видов растений. Чтобы проверить это предположение для тканей крокусов, мы провели эксперимент по изменению содержания макроэлементов в среде в следующих градациях: 1/2; 1 и 2 нормы (табл.1). Среда, содержащая двойную норму макроэлементов по Мурасиге и Скугу, неблагоприятна для роста. На ней ткани довольно быстро темнеют и погибают. Нам не удалось сохранить образцы дате для второго субкультивирования.

Наилучшей в этом эксперименте оказалась среда с половинным содержанием макроэлементов. При визуальной оценке степень потемнения каллусов на этой среде была наименьшей.

6. Сезонные изменения каллусогенеза, морфогенеза и роста в культуре, in vitro является Одной из хорошо выраженных особенностей культивирования тканей Crocus.

6.1. По мере хранения растительного материала весеннец-ветущих видов (С. chrysanthus и C.angustifolius) мы наблюдали изменения в морфогенетическом потенциале эксплантов. Наиболее ярким был контраст между осенними экспериментами (октябрь) и весенними (февраль).

Столбики с рыльцами и тычинки, изолированные из почек весной, полностью теряли способность к каллусогенезу и морфогенезу. Листочки околоцветника также лишь росли ( в длину и ширину, но не в толщину) и приобретали окраску, характерную для исследуемого вида и сорта, но каллусогенез отсутствовал.

• Стенки завязи примерно с одинаковой скоростью образовывали каллус и в октябре, и в феврале. Однако весной возникали каллусы меньших размеров по сравнению с осенними вариантами. Формирование рыльцеобразных структур из каллусов весной (на 14 день после посадки) происходило значительно быстрее, чем осенью (на 28 день). Доля эксплантов, образовавших новые структуры, весной (55%) также была заметно выше, чем осенью (12%). Вероятно, по мере хранения клубнелуковиц и развития в них органов цветка способность к дедифференцированному росту может снижаться или утрачивается полностью. У тканей околоцветника и рыльца способность к каллусогенезу уже в декабре полностью исчезает.

По мере снижения способности к росту каллусов увеличивалась способность к морфогенезу, что было обнаружено, например, в тканях стенки завязи.

С зацветанием растений происходило снижение морфогенети-ческого потенциала эксплантов генеративных органов, вероятно, связанное с необратимыми процессами клеточной специализации. Тычинки из раскрывшихся цветков С.chrysanthus и оплодотворенные завязи C.zonatus не дали каллусогенеза или морфогенеза.

Таким образом, развитие эксплантов стенки завязи идет по генеративному пути в соответствии с дифференцировкой этих ор-

ганов. Возможности для вегетативного морфогенеза также сохраняются. Внутри экспланта стенки завязи, по-видимому, имеется градиент морфогенетического потенциала (генеративный морфогенез идет в апикальной, а вегетативный - в базальной части эксплантов).

Примечательно, что сезонный ритм роста при дальнейшем культивировании in vitro сохраняется, несмотря на постоянные условия освещения и температуры. В летние месяцы рост каллуса замедляется, увеличивается количество некротизированных очагов в ткани. Осенью и зимой рост возобновляется. В феврале на C.angustifolius мы наблюдали еще один пик морфогенеза (как вегетативного, так и генеративного), коррелирующий со временем цветения in vivo.

6.2. У осеннецветущего вида С.speciosus такяе была отчетливо выражена сезонная динамика роста в культуре in vitro. На ранних этапах культивирования (осенью и зимой) происходил генеративный и вегетативный морфогенез, образование глобулярных структур, разрастание покрытых эпидермисом тканей.

В весенние месяцы на "среде с Юмг/л НУК и 1мг/л БАП происходило образование более рыхлого каллуса. Неорганизованный рост преобладал над организованным. В начале лета рост тканей замедлялся, появлялись некротические очаги:

В начале сентября у тканей, происходящих из стенки завязи без внешней индукции начинался морфогенез по рыльцевому и побеговому типам. Появлялись ярко окрашенные рыльцеобразные структуры, бесцветные катафиллы и фотосинтезирующие листья. В конце октября (конец цветения С. speciosus in vivo) рыльцеобразные структуры потеряли оранжевую окраску и стали давать вторичный морфогенез, который продолжался в ноябре и декабре.

Несмотря на определенные различия поведения в культуре у изученных видов, выявленные сезонные закономерности морфогенеза in vitro, по-видимому, универсальны для крокусов. Наиболее интенсивный морфогенез наблюдается в культуре in vitro одновременно с фазой наиболее интенсивных ростовых процессов in vivo.

II. РЕЗУЛЬТАТЫ МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ.

7. Особенности органогенеза в культуре генеративных органов Crocus. При изучении процессов морфогенеза в культуре

in vitro перед нами встала проблема адекватной идентификации возникающих структур. К сожалению, мы не могли пользоваться критериями взаимного расположения органов, наиболее часто применяемых в морфологических исследованиях. В культуре in vitro органы возникают в нехарактерных для них позициях. Поэтому нам было необходимо зарегистрировать процессы закладки органов и сравнить их анатомическую структуру со структурой нормальных органов растения.

Визуально наблюдаемые критерии отличия рыльцеобразных структур от листьев просуммированы в таблице 2.

7.1. Необходимо отметить ряд особенностей листьев, появляющихся в культуре in vitro. Дифференцировка листьев на брактеи, предлистья, фотосинтезирующие листья и катафиллы соблюдается не строго. По форме органа не всегда можно точно определить, является ли он фотосинтезирующим листом или ката-филлом. Образовавшиеся de novo листья часто постепенно сужены от основания к верхушке и имеют зеленые кончики. Листья с типичным резким переходом к суженной части нередко лишены зеленой окраски. Фотосинтезирующие листья могут формировать несколько спинных выростов, срастающихся на некотором протяжении. Не всегда, однако, этих выростов два, как у предлистьев. Мы наблюдали образование трижды разветвленных на верхушке фо-тосинтезирующих листьев (В отличие от рыльцеобразных структур, все три доли листа всегда лежат в.одной плоскости).

7.2. Закладка столбикообразных и рыльцеобразных структур всегда радиально-симметричная. Эти органы разветвляются на конце, тогда ветви их лежат в разных плоскостях. Часто число ветвей превышает три. Столбико- и рыльцеобразные структуры, как правило, окрашены в желтый или оранжевый тон. У C.angus-tifolius на структурах наблюдали фиолетовые пятна. Они, веро-

.ятно, связаны с синтезом антоцианов (см. разд. 3.4). Наиболее интенсивно окрашены в оранжевый цвет апикальные части рыльцеобразных структур, к основанию интенсивность окраски быстро ослабевает. Чаще всего при последующих субкультивированиях окраска исчезает.

В тканях завязи наблюдается градиент морфогенетического потенциала. В одних и тех же условиях базальные части завязей обрадуют побеги, в средних частях видны глобулярные структуры

ТАБЛИЦА 2. Критерии различия листовых и генеративных органов, возникших при морфогенезе in vitro.

Критерии Столбико- и рыльцеобразные органы Листья

1.Закладка радиально-симметричная, кольцевая билатерально-симметричная, кольцевая или дуговая

2.Сопутствующие органы отсутствуют • апикальная меристема с примордиями других листьев

3.Ветвление обычно на 3 и более долей обычно отсутствует, реже -.на 2 - 3 части

4.Положение лопастей лежат в разных плоскостях лежат в одной плоскости

5.Полость сообщается с внешней средой на апексе органа обычно отсутствует, если есть - то полностью замкнутая

6.Наличие и характер выростов апикальные выросты трехлопастные, завернутые на адаксиальную сторону, могут нести папиллы на абаксиапьной стороне часто есть крыловидные выросты по всей длине, завернуты абаксиально, папилл не бывает

7.Окраска могут содержать желтый или оранжевый пигмент обычно содержат хлорофилл

8.Характер роста не скручиваются часто скручиваются по мере роста

Э.Морфоге-нетический потенциал на боковой поверхности часто возникают аналогичные структуры второго порядка субэпидермапьно возникают очаги роста, разрастающиеся в глобулярные структуры

и слабо ветвящиеся столбикообразные структуры, в то время, как апикальные части дают сильно ветвящиеся столико - и рьшь-цеобразные структуры. Это явление отмечено у C.angustifolius и С.speciosus.

' После длительного культивирования этот градиент,, вероятно, нарушается. У С.speciosus при 15 субкультивировании (второй осенний пик морфогенеза) вегетативные и генеративные органы пролиферировали без видимого порядка на тканях, происходящих из стенки завязи.

8. Морфогенез в культуре вегетативных органов.

8.1. Ткани замещающей клубнелуковицы были способны только к морфогенезу побегового. типа, который мало отличался от вегетативного морфогенеза тканей стенки завязи.

8.2. Характерно поведение эксплантов листьев в культуре in vitro. Они образуют либо субэпидермально, либо на поврежденных поверхностях многочисленные очаги роста, развивающиеся в глобулярные структуры. (Этот тип морфогенеза встречается и у других эксплантов, но у листьев он особенно массовый и проявляется раньше, чем у стенок завязи или клубнелуковиц).

Глобулярные структуры не несут никаких органов, поэтому гомологизировать их с каким-либо из органов трудно. В центре глобулярных структур части можно наблюдать либо тяж прокамбия, либо зрелые проводящие элементы. В апексе иногда можно различить две зоны, образованные с помощью меристемы, откладывающей клетки в двух направлениях. Глобулярные структуры всегда формируют эпидермис. Субэпидермально в них могут закладываться глобулярные структуры второго и более высоких порядков.

Напрашивающаяся аналогия с корнем довольно поверхностна, поскольку корни у крокусов закладываются в более глубоких слоях тканей и. как правило, имеют гораздо меньший диаметр. Кроме того, было показано, что из глобулярных структур на С. alatavicus можно индуцировать развитие побегов СНурмуханбе-това, 1983]. Вероятно, лучше интерпретировать эти структуры как видоизмененный, лишенный листьев побег.

9. Анатомические особенности неорганизованного роста.

На первых этапах культивирования концистенция и цвет тканей заметно варьирует. Мы наблюдали образование плотных и

рыхлых тканей, части ткани были покрыты эпидермисом.

Анатомический анализ позволил сгруппировать эти типы неорганизованного роста в три основные группы.

9.1. Плотные ткани, покрытые эпидермисом очень похожи на запасающую паренхиму клубнелуковицы, покрытую эпидермисом. Иногда под эпидермисом закладываются прокамбиальные тяжи. Ближе к поверхности они идут параллельно эпидермису, в глубинных слоях их ориентация может меняться. Высокий уровень тканевой дифференцировки может сохраняться при дальнейшем культивировании, особенно на средах, содержащих 2.4-D (М,й).

9.2. Рыхлые тканн, покрытые эпидермисом отличаются сильно изрезанной фактурой поверхности. Эпидермис по-прежнему хорошо отличается от внутренней паренхимы. Вся ткань с глубокими инвагинациями, многочисленными полостями. Заполняющая паренхима рыхлая, богата межклетниками. Часто эпидермис отслаивается от паренхимы. Проводящих элементов обнаружить не удается. - — -

9. 3. Рыхлые ткани без эпидермиса состоят из паренхимати-ческих клеток разнообразной формы, которые лежат без определенной ориентации. Межклетники довольно большие. Иногда в толще ткани можно выделить очаги клеточных делений (тогда у каллуса большая способность к морфогенезу).

Деление на эти типы не строгое, поскольку можно наблюдать ткани промежуточного строения, а также обнаружить мозаичные участки.

10. Модель дедифференцировки у крокусов в культуре in | vitro. Вероятно, дедифференцировка в культуре in vitro у крокусов проходит параллельно сразу по нескольким направлениям.

10.1. Первое - нарушение межорганных связей в растении. Новые органы возникают в не характерных для них позициях (побеги - на листьях и стенках завязи, рыльца - на боковой поверхности завязи). При этом часто они имеют искаженную морфологию (переходы между катафиллами и фотосинтезирующими листьями, "безлистные" глобулярные побеги и т.п.).Рост оказывается организованным на органном, но не на организменном уровне (прокамбий и проводящие элементы занимают легитимные позиции в новообразованиях).

10.2. Вторая возможность перехода к неорганизованному росту - нарушение гистологической структуры органа. Ткани все еще дифференцированы (по крайней мере - на эпидермис и паренхиму), но уже не образуют органов.

10.3. Третий путь - дедифференцировка на тканевом уровне и нарушение неязслеточных взаимодействий.

По-видимому, все три возможности начинают реализовывать-ся одновременно. Однако скорость различных процессов дедиффе-ренцировки сильно зависит от сезона года и от экзогенных регуляторов роста. Добиться полностью гомогенного роста в культуре Crocus очень сложно, поскольку в ткани все время присутствуют участки разного уровня дедифференцированности.

В период цветения растение наиболее устойчиво к внешним гормональным воздействиям и стремится поддержать свою органную структуру. Рост каллуса на раневой поверхности отстает от роста новообразованных структур.

В дальнейшем новообразования могут переходить к следующей ступени неорганизованного роста, происходит процесс "разборки" органов на ткани, который на ранних этапах обратим.

В период вынужденного покоя преимущество получают второй и третий путь дедифференцировки. Но морфогенные очаги длительно сохраняются в"культуре, хотя их рост замедлен. Чем больше времени проходит между введением в культуру и периодом интенсивного морфогенеза, тем меньше размеры новообразуемых структур. Понижается и абсолютное число структур. Это отчетливо проявлялось при сравнении образцов С.angustí folius, у которых вторая волна морфогенеза зарегистрирована в марте 1994г. через 14 - 20 месяцев от введения в культуру.

i

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Как показало проведенное исследование, не все виды Crocus L. способны стать донорами культивируемых органов-продуцентов ценных веществ, содбржащихся в шафране. В наших исследованиях наиболее интенсивно окрашенные рыльцеобразные структуры были получены на C.speciosus Bieb. Другие виды из числа изученных, по-видимому, мало пригодны, поскольку их рыльца In vivo и in vitro оказываются гораздо менее окрашенными по сравнению с С. speciosus.

Разработка биотехнологии получения ценных веществ шафрана в культуре in vi tro наталкивается на определенные сложности, связанные с особенностями поведения представителей рода Crocus в культуре in vi tro.

Первая из них - хорошо выраженная сезонность морфогене-тических процессов. Это сильно ограничивает применение методов клонального микроразмножения и культивирования рыльцеоб-разных структур in vi tro. Решение этой проблемы тесно связано с изучением ритма развития растений in vivo, поиском корреляций между поведением объекта в природе и в искусственных условиях. Эндогенные факторы, регулирующие сезонное развитие у крокусов, изучены пока еще не достаточно хорошо. Поэтому до сих пор биотехнологические методы оказываются не намного эффективными, чем плантационное возделывание крокусов.

Вторая проблема - медленный рост каллуса в культуре in vi tro. С одной стороны, он обусловлен спецификой перехода к дедифференцированному росту видов рода Crocus L. Крокусы медленно адаптируются к условиям культуры, долго сохраняют тканевую специализацию. Получить однородную культуру удается только после 15 месяцев культивирования.

С другой стороны, полученные нами данные показывают, что модификация состава среды приводит к увеличению скорости роста культуры тканей Crocus. Эксперименты по оптимизации состава среды могут быть продолжены.

Третья проблема - сложность индуцировать процесс морфогенеза по генеративному пути. Наличие в растении градиентов морфогенетического потенциала было исследовано на Nicotiana tabacum L., Cichorium intybis L., Begonia spp. и др. растениях. Способность к генеративному морфогенезу возрастает по мере достижения цветочно-спелого состояния [Чайлахян, 1988] и повышается, если эксплантировать ткани все более приближенные к генеративных органам. Наши исследования подтвердили эту закономерность на новых объектах.

ВЫВОДЫ.

1. Были- исследованы новые виды крокусов, которые ранее не вводили в культуру invitro: С.angustifolius, С.speciosus, " С.sieberi, С.zonatus. Для первых двух видов, а также для

C.chrysanthus нами получены in vitro устойчивые культуры из различных эксплантов.

2. Усовершенствован минеральный состав среды для поддержания культур Crocus. Снижение содержания макроэлементов в срсде да половины нормы увеличивает прирост биомассы, снижает дано некротизированных тканей.

3. Изучено влияние экзогенных регуляторов роста на культуры тканей Crocus. Использование НУК в качестве синтетического аналога ауксинов приводит преимущественно к неорганизованному росту. Замена НУК на 2.4-D способствует пролиферации очагов организованного роста.

4. Установлена зависимость роста и морфогенеза от сезона года и от типа исходного экспланта. Зарегистрирован эндогенный сезонный ритм в культуре in vitro, совпадающий с сезонной динамикой соответствующих видов in vivo.

5. Доказана способность тканей связника тычинок к генеративному морфогенезу.

6. Анатомически изучены полученные в культуре in vitro ткани. На базе этого исследования предложена модель дедиффе-ренцировки у крокусов. Выделены три пути дифференцировки: за счет нарушения межорганных, межтканевых и межклеточных взаимодействий.

7. Наблюдаемые в культуре in vitro различия между видами являются количественными и объясняются, по видимому, физиологической неоднородностью материала и различной сезонной специализацией изученных видов, крокусов.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает признательность коллегам: сотрудникам каф. физиологии растений МГУ Т.А.Власовой, 0.В.Горяевой, Е.М.Морозовой, а также сотрудникам ИФР РАН А. Б.Бургутину и С. Э. Зоринянц за большую помощь в фотодокументировании работы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Чуб В. В., Власова Т. А., Огородникова У. Б., Бутенко Р.Г. Получение клеточных линий-продуцентов пищевых красителей и добавок.//III Всероссийская планово-отчетная конференция по

направлении "Генная и клеточная инженерия":Тез. докл./ Пущи-но, 1992. - С.83.

2. Власова Т. А., Чуб В.В., Бутенко Р.Г. Культивирование in vitro эксплантов генеративных органов шафрана.//Международная конференция по биотехнологии: Тез. докл./ Пущино, 1993. - С.120.

3. Чуб В.В., Власова Т. А., Бутенко Р.Г. Морфогенетичес-кий потенциал тканей Crocus: примеры различной детерминированности в культуре in vitro.// III съезд Всероссийского общества физиологов растений: Тез. докл./ Санкт-Петербург, 1993. - Часть 3. - С.229.

4. Горяева 0. В., Чуб В. В., Власова Т. А. Ультраструктура поверхности генеративных органов Crocus chrysanthus in vivo и при культивировании in vitro.//II Международная конференция "Биология культивируемых клеток и биотехнология": Тез. докл./ Алматы, 1993. - С. 51.

5. Чуб В. В., "Власова Т. А., Горяева 0. В., Морозова Е. М., Лукавая 0.Л., Бутенко Р.Т. Получение 'клеточных линий шафрана - продуцентов пищевых красителей и добавок.// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1994. - No 4. - С.23.

6. Чуб В.В., Власова Т. А., Бутенко Р.Г. Каллусогенез и морфогенез в культуре генеративных органов весеннецветущих видов рода Crocus L.// Физиология растений. - 1994. - Т.41, No 6. - С.815-820.