Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сохранение и размножение в культуре in vitro генотипов редких видов лилий азиатской части России

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Сохранение и размножение в культуре in vitro генотипов редких видов лилий азиатской части России"

На правах рукописи

НАБИЕВА Александра Юрьевна

СОХРАНЕНИЕ И РАЗМНОЖЕНИЕ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ГЕНОТИПОВ РЕДКИХ ВИДОВ ЛИЛИЙ АЗИАТСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ

03.00.05 - «Ботаника» с

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 5 ДЕК 2008

Новосибирск - 2008

003454269

Работа выполнена в Центральном сибирском ботаническом саду СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель — доктор биологических наук, с.н.с.

Дорогина Ольга Викторовна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, проф.

Высочина Галина Ивановна; доктор биологических наук, с.н.с. Мочалова Ольга Владимировна.

Ведущая организация — Главный ботанический сад РАН, г. Москва.

Защита состоится 23 декабря 2008 г. в Ю00 ч на заседании совета Д 003.058.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Центральном сибирском ботаническом саде СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, ул. Золотодолинская, 101. Факс:(383)3301-986.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центрального сибирского ботанического сада СО РАН.

Автореферат разослан 14 ноября 2008 г.

Ученый секретарь совета доктор биологических наук

Ершова Э.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В связи с ускоряющимися в последнее время темпами исчезновения многих видов растений появляется необходимость разработки методов их размножения и сохранения. Особенно это касается редких декоративных и лекарственных растений, для которых реинтродукция и репатриация являются одним из возможных способов восстановления. К таким видам относятся редкие виды лилий Сибири и Дальнего Востока - Lilium pilosiusculum (Treyn) Misez., L. pumilum Dehle, L distichum Nakai и L. cernuum Кош.

В условиях интродукции, особенно в климатической зоне средней полосы, возобновление этих видов традиционными способами часто отсутствует (Растения..., 2005). В связи с этим, необходимым стал поиск ускоренного метода размножения лилий, позволяющего в то же время сохранить генотипы растений. При выборе стратегии сохранения биоразнообразия редких, исчезающих видов растений многими исследователями показана эффективность методов биотехнологии в сравнении с традиционными способами их размножения (Камелин, 1997; Benson, 1999; Молканова, Горбунов, 2003), в том числе и представителей порядка Líbales (Pelkonen, 2005; Pejman, Morteza, 2007).

В то же время, существует необходимость построения прогнозируемой модели морфогенеза регенерантов, исключающей возникновение сомаклональной изменчивости. Важным преимуществом разрабатываемой технологии размножения редких генотипов в культуре in vitro должно явиться массовое воспроизводство генетически стабильных регенерантов, не отличающихся по ряду морфологических, биохимических и гено-типических признаков от исходных растений. Выявление возможной изменчивости обеспечивается применением наиболее воспроизводимых и доступных методов экспресс-анализа.

Цель и задачи исследований. Цель исследования - выявить пути реализации морфогенетического потенциала различных типов эксплантов 4 видов лилий: Lilium pilosiusculum, L pumilum, L. distichum и L cernuum и разработать методы, позволяющие сохранять генетическую стабильность регенерантов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфогенетические особенности развития различных типов эксплантов -семян, соматических тканей репродуктивных органов, тканей луковичных чешуй в культуре in vitro и сравнить их регенерационную способность.

2. Определить типы морфогенеза и особенности регенерации в зависимости от возраста материнского растения и соотношения экзогенных гормонов в питательной среде.

3. Провести анализ регенерантов, полученных из различных типов эксплантов при помощи гистологического, цитологического методов и изучения электрофоретических спектров изоферментов.

4. Показать возможность получения регенерантов из соматических тканей и органов цветка у различных сортов рода Lilium (пор. Liliales) и у сортов pp. Hosta Tratt. и Hemerocalhs L. (nop Amaryllidales).

Защищаемые положения:

1. Для изученных видов лилий выделен тип эксплантов, характеризующийся наибольшей регенерационной способностью - тычиночные нити с пыльником и фрагментом цветоложа. Полученные из них регенеранты развивались только по пути прямого органогенеза.

2. Реализация программы гемморизогенеза или соматического эмбриоидо-генеза у регенерантов изученных видов лилий, полученных из соматических тканей и органов цветка, позволяет сохранять их генотипы неизменными.

Научная новизна. Впервые проведен комплексный анализ регенерантов четырех видов лилий, полученных в культуре тканей луковичных чешуй и соматических тканей и органов цветка при использовании гистологического, цитологического методов и изучения электрофоретических спектров изоферментов. Приведенные результаты гистологического анализа тканей регенерантов двух видов лилий - L pumilum и L сегпиит, полученных из тканей и органов цветка, позволяют заключить, что появление мелких клеток с хорошо различимыми ядрами, образовывавших шаровидные структуры с васку-лярными элементами, обозначенные ранее O.A. Чуриковой как полиады (2005), предваряют появление как побеговых конусов, так и соматических эмбриоидов.

Показано, что регенерация жизнеспособных растений проходит у изученных нами видов и сортов лилий по таким путям морфогенеза in vitro, как гемморизогенез и соматический эмбриоидогенез (терминология дана по Т.Б. Батыгиной, 1997). Отсутствие каллусогенеза при интенсивной регенерации микролуковичек у тычиночных нитей, выделенных вместе с пыльником и фрагментом цветоложа, говорит о высокой степени ин-тактности эксплантов, исключающей образование каллуса.

Впервые при анализе электрофоретических спектров у двух видов лилий и полученных регенерантов были выделены, как наиболее видоспецифичные, изоферментные спектры изоцитратдегидрогеназы (IDH) и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-FGD). Получены сопоставимые результаты при проведении анализа данных изоферментов в нескольких повторностях, если исследовали материал, полученный от растений, выращиваемых в одинаковых условиях и находящихся на одной стадии онтогенеза.

При проращивании неспелых семян L pilosiusculum на модифицированной среде П-2т, дополненной 0,2 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л БАП, отмечено формирование соматических эмбриоидов в основании семядоли проростков путем прямой регенерации без образования каллуса Показано, что у регенерантов, полученных путем соматического эм-бриоидогенеза, по сравнению с сеянцами в культуре in vivo образуется большее количество метамеров в луковице за одинаковый промежуток времени.

Практическая значимость работы. Разработана оригинальная методика получения регенерантов из соматических тканей и органов цветков лилий, которая позволяет сохранять исходный генотип неизменным. Создание подобной воспроизводимой модели регенерации дополняет существующие методы микроклонирования. Введение в культуру in vitro редкого вида L сегпиит из соматических тканей и органов цветка способствует сохранению материнских растений и созданию клонированных генотипов для репатриации данного вида в природу.

Привлечение в качестве эксплантов неспелых семян Lilium pilosiusculum приводит к ускорению онтогенетического развития сеянцев данного вида, что особенно важно для его интродукции.

Подобраны оптимальные условия культивирования in vitro для получения в короткие сроки идентичных сорту редких генотипов высоко востребованных в интродукции культиваров из родов Hosta и Hemerocallis.

Личный вклад автора состоит в получении и анализе экспериментального материала, описании результатов исследования, формировании выводов. Гистологические и цитологические исследования проведены в лаборатории декоративных растений совместно с к.б.н. Бугловой J1.B., фотографии сделаны в Центре коллективного пользования ЦСБС СО РАН; анализ спектров изоферментов и их интерпретация проведены совместно с сотрудниками ИЦиГ к.б.н. Левитес Е.В. и к.б.н. Кирикович С.С.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на юбилейной конференции «Садоводство и цветоводство на современном этапе» (Новосибирск, 2005), Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Международной научной конференции «Цветоводство без границ» (Харьков, 2006), I (IX) Международной конференции молодых ботаников (С.-Петербург, 2006), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2006), Международной конференции «Современные проблемы фитодизайна» (Белгород, 2007), VI Международной научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы, списка сокращений; содержит 35 рисунков и 18 таблиц. Список литературы включает 270 источников, в том числе 110 - на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава посвящена обзору литературы и состоит из 5 подглав, в которых дан подробный анализ работ как отечественных, так и зарубежных авторов, в областях, касающихся сохранения редких видов методами ex situ, теоретических основ процессов морфогенеза изолированных тканей и органов растений в культуре in vitro. Критически изучены разные точки зрения на возможные пути морфогенеза и модели регенерации в культуре соматических тканей. Определены основные возможные причины сомаклональной изменчивости в культуре in vitro, а также обозначены пути ее преодоления. Выделены основные направления биотехнологических исследований в роде Lilium, освещены проблемы, связанные с созданием надежных биотехнологических методов сохранения редких и исчезающих генотипов в культуре in vitro. Представлен обзор методов маркирования генотипов регенерантов, полученных в культуре in vitro, для их идентификации и сравнения с генотипами материнских растений.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты. Объектами для введения в культуру m vitro выбраны 4 вида p. Lilium: L. pilosiusculum (Freyn) Misez., L distichum Nakai, L pumilum Dehle, L cernuum Kom ; также были введены в культуру сорта лилий из разных гибридных секций (всего 42 различных сорта): Азиатские гибриды (13 сортов), Восточные гибриды (7), Трубчатые гибриды (2), ЛА-гибриды (17) и ЛО-гибриды (3), и представители порядка Amarylhdales: 3 сорта p. Hosta Tràtt. (сем. Hostaceae Mathew) и 1 сорт p. Hemerocallis L. (сем. Нетего-callidaceae R. Br.).

Все лилии, изученные в данной работе, относятся к категории видов, сокращающих свою численность - Lilium pilosiusculum, L distichum, L. pumilum (Красные книги Хабаровского края (2000), Еврейской автономной области (2006) и Иркутской области (2001), либо к видам редким и исчезающим - как L cernuum, который внесен в Красную книгу РСФСР (Красная..., 1988). Два вида - L cernuum и L distichum, выращены в Иркутском ботаническом саду, куда ранее были завезены луковицы из природных популяций Дальнего Востока (нами получены в 2004 г.). L pilosiusculum собран из окрестностей г. Новосибирска, L pumilum - вблизи села Б. Голоустное (западное побережье оз. Байкал). Приведена ботаническая характеристика исследованных видов лилий. Куль-тивары из различных гибридных секций p. Lilium, а также из родов Hosta и Hemerocallis получены из частных коллекций.

Названия видовых таксонов приведены согласно справочнику С.К. Черепанова (1995), деление лилий на гибридные секции дано по монографии М.В. Барановой (1990), терминология, касающаяся семенного размножения, дана согласно P.E. Левиной (1981).

Методы. Исследования по микроразмножению данных объектов проведены на базе лаборатории биотехнологии Центрального сибирского ботанического сада (г. Новосибирск). Экспериментальные работы с использованием метода культуры тканей проводили по общепринятым методикам (Бутенко, 1964; Калинин и др, 1980). Эксплантами служили различные органы растений - семена, фрагменты проростков, оси соцветий, части околоцветника, пыльники, тычиночные нити, фрагменты цветоложа и луковичных чешуй, а также объединенный тип эксплантов: пыльник и тычиночная нить с частью цветоложа Для культивирования эксплантов использовали питательные среды различного состава: MS (Murashige, Skoog, 1962), N6 (Chu, 1982), a также среды MSm, N6m и П-2т (Chuang, Quyang, 1978), модифицированные нами. Во всех используемых средах содержание микросолей и органических компонентов (кроме сахарозы) было одинаково и соответствовало среде MS.

В качестве источника углерода была использована сахароза в концентрации 20-40 г/л. Для получения полутвердой питательной среды применяли агар-агар марки «Bacto agar» в концентрации 4-7 г/л. Основываясь на работах предыдущих исследователей по культивированию изолированных тканей лилий (Stimart, Asher, 1978; Румынии, Слюсаренко, 1989), в качестве оптимального для всех сред, используемых в работе, установили значение pH = 5,7-5,8. Продолжительность одного пассажа составляла 3-4 недели.

Растения выращивались, в лабораторных условиях - а) при искусственном освещении (2000-4000 лк) в условиях фотопериода: 16/8 ч свет/темнота и температуре 20-25 °С; б) в условиях термостата в темноте при температуре 24-26°С; в) в световом термостате фирмы Rumed (Германия) при + 7°С.

Цитологический анализ микроспор, пыльцы L pilosiusculum, а также числа хромосом у растений-регенерантов выполняли по общепринятым методикам (Паушева, 1980), по модифицированным (Тюкавин и др., 1999; Красников, 2004) и по собственной методике подсчета хромосом у регенерантов L. distichum и L сегпиит, описанной в данной работе (гл. 3.4.2.).

Гистологическое изучение тканей регенерантов было выполнено на постоянных препаратах (Прозина, 1960), для дифференцированной окраски на ДНК-РНК ткани окрашивали метиловым зеленым и пиронином. Окраску микроспороцитов проводили ацетокармином или гематоксилином по Гендейгайну (Барыкина и др., 2004). Готовые препараты и образцы тканей просматривали на микроскопе "Axiolab" фирмы "Zeiss" в центре коллективного пользования ЦСБС.

В качестве биохимических маркеров использовали изоферменты. Исследование изоферментов проведено с помощью метода электрофоретического разделения экстрактов белков в 14 %-м горизонтальном крахмальном геле (Левитес, 1986). Сканирование электрофореграмм проводили при помощи прибора Biodoc.

Морфологическое изучение микролуковиц регенерантов состояло в подсчете числа метамеров в луковицах и измерении диаметра луковиц.

Для введения семян в культуру ткани были собраны нераскрытые коробочки L pilosiusculum по 2-3 шт. с 20 растений в 2 срока: 1-й срок (1-2 августа) и 2-й срок (5 сентября) в 2006-2007 гг. Исходным материалом для введения в культуру L. pilosiusculum, L. сегпиит, L pumilum являлись луковичные чешуи из внешнего ряда (по 5 с каждой луковицы), которые отбирали в 2004-2005 гг.

Для введения в культуру тканей проводили отбор эксплантов из цветков-L. pilosiusculum - в первую и третью декаду июня 2005 г., всего 30 бутонов по 15 в каждый срок, примерно с 20 растений.

L. сегпиит - начало июля 2004 г., всего 4 бутона (по 2 с двух разных растений); L, distichum ~ начало июля 2004 г., всего 4 бутона (по 2 с двух разных растений); L pumilum - начало июля 2004 г., всего 10 бутонов (по 2 с пяти разных растений).

Из неокрашенных бутонов четырех видов лилий были выделены следующие типы эксплантов:

A. Поперечные срезы оси соцветия, толщиной 1,5-2,0 мм; Б. Фрагменты цветоложа такой же толщины;

B. Тычиночные нити с пыльниками;

Г. Тычиночные нити с пыльниками, имевшие в основании небольшой сегмент цветоложа.

Условия культивирования. 1. Семена были высажены как на безгормонапьные среды MS, N6, так и на среды MSm, N6m, П-2т, отличавшиеся разным содержанием макроэлементов, но с одинаковыми концентрациями регуляторов роста, витаминов и микроэлементов; содержание сахарозы составляло 20 г/л. На начальном этапе культивирования семена проращивали в темноте при температуре 22-24° С. Через 1-1,5 месяца,

все проросшие семена, а также семена, образовавшие эмбриогенный каллус и соматические эмбриоиды, переносили в условия фотопериода 16/8 часов.

2. Фрагменты луковичных чешуй L. pilosiusculum, L cernuum, L. pumilum помещали на безгормональную среду MSm, либо содержащую регуляторы роста. Содержание сахарозы в среде составляло 30 г/л. Первоначально объекты находились в темноте в термостате при t = 26-28° С.

3. Для инициации изолированные экспланты, выделенные из цветков, помещали на питательные среды MSm и N6m, к которым добавляли одинаковый набор микросолей по прописи MS, сахарозу в количестве 30-40 г/л и регуляторы роста: ауксин - 2,4-Д (либо НУК) и цитокинин - БАП. В контроле использовали среды этого же состава, но без регуляторов роста.

Первоначально все объекты помещали в темноту в термостат при t = 26-28° С. Через 2 месяца определяли морфогенетическую реакцию эксплантов и интенсивность регенерации в зависимости от минеральной основы среды (MSm или N6m), концентрации вносимых регуляторов роста и возраста исходных растений. Затем все пролифери-рующие культуры переносили на среду MSm для дифференциации, содержавшую только цитокинин БАП - (0,2 мг/л) и культивировали в дальнейшем под люминесцентными лампами с фотопериодом 16 ч при температуре 20-25° С.

Для лучшего укоренения микролуковички, полученные при использовании любого типа эксплантов, со среды для дифференциации переносили на среду для укоренения, представлявшую собой безгормональную среду MSm. Количество сахарозы в данной среде не превышало 20 г/л, а количество агара составляло 4-5 г/л. В дальнейшем, укорененные растения in vitro помещали в световой термостат фирмы Rumed (Германия) при + Т С для того, чтобы регенеранты в течение 6-8 недель прошли период покоя для их лучшей адаптации к условиям in vivo. Спустя год после введения в культуру in vitro, луковицы регенерантов достигали в диаметре 1,0-1,5 см. Для перевода ex vitro для них проводили двухступенчатую адаптацию: сначала высаживали в теплицу на различные смеси субстратов, а затем - в открытый грунт. Для высадки лилий использовали смесь сфагнума, песка, торфа, дерновой земли в соотношении 1:1:1:1. В течение первых 2-3 недель после высадки соблюдали режим умеренного полива регенерантов, понижая уровень транспирации их листьев при помощи опрыскивания или накрывая растения пленкой.

Все эксперименты в культуре ткани проводились в 2-3 повторностях. При математической обработке экспериментальных данных использовались основные статистические методы, применяемые в биологических исследованиях (Вольф, 1966; Максимов, 1980). Обработку экспериментальных данных проводили с использованием статистических пакетов Microsoft Excel 2003 и STATISTICA 6.0.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Введение в культуру ш vitro Lilium pilosiusculum с помощью семян

Нами была поставлена задача - провести сравнительный анализ всхожести спелых и неспелых семян в культуре in vitro; определить возможные пути ускорения онтогенеза проростков и получения наибольшего количества дочерних микролуковичек от одного семени.

Обнаружено, что всхожесть неспелых семян уменьшалась как при увеличении

времени их стерилизации, так и при воздействии высоких концентраций Н§СЬ (рис. 1).

Варианты 1-6: 1 - контроль: посев in vivo-, 2 - 0,2 %-я сулема (IIgCI2) - 10 мин; 3 - 0,5 %-я сулема -10 мин; 4-70 %-й этанол - 1 мин + 0,2 %-я сулема - 7 мин; 5-70 %-й этанол - 1 мин + 0,2 %-я сулема - 10 мин; 6 - 70%-й этанол - 1 мин + 0,2 %-я сулема - 17 мин.

На основании данных, представленных на рис. 1, нами предложен следующий способ стерилизации неспелых семян данного вида лилии: предварительная стерилизация коробочек 70 %-м этанолом в течение ) мин., затем стерилизация 0,2 %-м водным раствором HgCl2 в течение 7 мин. В условиях данного эксперимента, скорость прорастания семян зависела от состава среды и сроков посадки, варьируя от 1 до 12 недель. Отмечено, что период прорастания спелых семян L. pilosiusculum после хранения более продолжителен, чем у свежесобранных спелых и неспелых семян, а их всхожесть ниже (табл. 1).

Таблица 1

Всхожесть семян L. pilosiusculum при 20° С на среде MS в зависимости от сроков посева, п=100

Вид растения Число, месяц и год посева Число дней на каждом этапе % прорастаниясемян

до прорастания прорастания

L. martagón subsp. pilosiusculum 05.09.06 (спелые) 18.0±0.7 45.0±1.0 87.0±0.8

22.03.07 (спелые после хранения) 29.9±0.9 61.8±1.1 76.0±0.9

02.08.06 (неспелые) 7.0±0.3 16.0±0.6 98.0±0.6

F = 3 55 1 теор. ~> ~> HCPQ.05 F фак-г. =310.03 НСРо.о5 = 2.10 F факт. = 748.65 НСРо.о5 = 2.51 F факт. = 173. 77 НСРо.о5 = 2.48

В процессе исследования было установлено, что всхожесть семян данного подвида в культуре in vitro зависит от их спелости и от сроков посева.

При проращивании неспелых семян лилии данного подвида на среде П-2т, дополненной 0,2 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л БАП, отмечено формирование соматических эмбриои-дов (рис. 2) в основании семядоли проростков.

Рис. 2. Образование соматических эмбриоидов (СЭ) в основании семядоли проростков Ь. рИомшсиЫт на среде П-2ш с регуляторами роста

Характерно, что их образование происходило путем прямой регенерации без образования каллуса, что позволило получить от одного семени в среднем до 3,02 регенеран-тов, тогда как в контроле - всего 1,29 регенеранта на одно семя (табл. 2).

Таблица 2

Интенсивность регенерации микролуковичек и преобладающий тип морфогенеза у проростков неспелых семян £. рИо$1и$си1ит в зависимости от минеральной основы питательной среды

и регуляторов роста, п=100

Вариант Преобладающий тип морфогенеза Интенсивность регенерации микролуковичек, шт.

1. МБ (контроль) эмбриогенез 1.29 ±0.68

2. МЭ + 0.2 мг/л 2,4Д + 0.1 мг/л БАП каллусогенез, непрямой органогенез 2.86 ±0.72

3. N6 + 0.2 мг/л 2.4Д + 0.1 мг/л БАП каллусогенез; непрямой органогенез 3.31 ±0.86

4. П-2т + 0.2 мг/л 2,4Д + 0.1 мг/л БАП эмбриоидогенез 3.02 ±0.68

Таким образом, наибольшее число микролуковичек было образовано путем непрямого органогенеза у семян, эмбриональные ткани которых образовывали каллус на средах М8 и N6 с регуляторами роста. Несмотря на то, что количество образовавшихся в результате соматического эмбриоидогенеза микролуковичек на среде П-2ш с добавлением 0,2 мг/л 2,4Д + 0,1 мг/л БАП было меньше, этот путь морфогенеза более предпочтителен, так как ведет к получению растений генетически идентичных исходным (Батыгина, 1997). На остальных средах - М8 и N6, с такими же добавками, происходило формирование каллусной ткани в основании семядоли, тогда как в контроле на среде М8 без гормонов дочерние луковицы практически не образовывались.

Также отмечено, что число метамеров, слагающих луковицу сеянца, на среде П-2т, дополненной 0.2 мг/л БАП, было достоверно выше, чем на средах МБ и N6. Таким образом, число метамеров у микролуковичек, полученных из неспелых семян Ь. рИохшьсиЬт, зависит от состава питательной среды и от содержания в среде регулятора роста БАП в количестве 0,2 мг/л (табл. 3).

Известно, что в определенной степени число метамеров является количественным выражением физиологического состояния и показателем онтогенетического развития (Баранова, 1999).

Таблица 3

Влияние минеральной основы питательной среды и 0.2 мг/л БАП на формирование метамеров в проростках неспелых семян ¿. рИоьииси/ит через 6 месяцев культивирования, п=10

№/№ Среды для культивирования проросших семян* Среднее количество метамеров

1. МЭ 3.7 ±0.4

2. МЭ + 0.2 мг/л БАП 5.8 ±0.8

3. N6 3.5 ± 0.2

4. N6 + 0.2 мг/л БАП 6.3 ±1.3

5. П-2ш + 0.2 мг/л БАП 8.5 ±0.8

НСРо.05 (1) = 4.5; НСРо.05 (2) = 4.14; HCPo.os (1.2) = 3.29

Примечание: фактор 1 - присутствие (отсутствие) 0.2 мг/л БАП в среде; фактор 2 - вариант питательной среды; фактор 1.2 - взаимодействие между первым и вторым факторами

Отмечено, что в условиях in vivo у видов лилий секции Martagón ювенильная стадия продолжается 3-4 года (Баранова, 1990; Семенова, 2007), и луковицы трехлетнего возраста состоят из 5-7 чешуй или метамеров (рис. 3, А). В то время как луковицы 1-2-летних сеянцев L. pilosiusculum, которые выращивались in vivo, состояли не более чем из 5-6 метамеров (рис. 3, А), у микролуковиц 10-месячных сеянцев L. pilosiusculum, культивировавшихся на питательной среде П-2т, нами отмечено образование, в среднем, до 9 метамеров (рис. 3, Б).

Рис. 3. Сравнение числа метамеров у луковиц L. pilosiusculum: А. У сеянцев in vivo (а-г соответствуют 1-4 годам культивирования; по Г.П. Семеновой, 2007); Б. У микролуковицы, полученной в культуре ткани из семян на среде П-2м с регуляторами роста (через 10 мес. культивирования)

Таким образом, неспелые семена L. pilosiusculum, способные к прорастанию и не имеющие морфофизиологического покоя, прорастали в культуре in vitro более дружно и за более короткие сроки, чем семена, собранные с тех же растений на месяц позже. На

среде П-2т с добавлением 0,2 мг/л 2,4Д +0,1 мг/л БАП развитие сеянцев проходило быстрее, чем на средах MS и N6. Образование микролуковичек на данной среде происходило путем вторичного соматического эмбриоидогенеза, что позволило увеличить коэффициент микроразмножения L pilosiusculum в 2-3 раза.

3.2. Введение в культуру in vitro L. pilosiusculum, L. cernuum, L. pumilum из эксплантов луковичных чешуй

При введении в культуру любого из трех видов изученных нами лилий с помощью эксплантов луковичных чешуй, мы неизбежно сталкивались с проблемой их высокой инфицированности При увеличении времени экспозиции в стерилизующем растворе 0,2 % сулемы, выход жизнеспособных эксплантов резко сокращался, а после 2 месяцев культивирования число жизнеспособных эксплантов луковичных чешуй, у которых наблюдалось образование микролуковичек, составляло не более 20 % у L. cernuum, 13,3 % -у L. pumilum и всего 10 % - у L. pilosiusculum

Коэффициент размножения у всех трех видов во 2-3-м пассажах на среде MS был приблизительно одинаков, он составлял всего 1-2 луковички на эксплант.

3.3. Введение в культуру in vitro L. pilosiusculum, L. cernuum, L. disticltum, L. pumilum из эксплантов тканей и органов цветков

При изучении процессов регенерации у эксплантов тканей и органов цветков четырех видов лилий стояла задача подобрать такие их типы, которые бы представляли собой индивидуальные органы, выделенные с частью побега, имеющие наибольшую способность к регенерации и наименьшую - к образованию каллуса. Экспланты, взятые из цветков Lilium pilosiusculum, высаживали на одну из 12 сред, отличавшихся как составом макросолей, так и содержанием регуляторов роста (мг/л):

MSm: А) без регуляторов роста N6m: Б) без регуляторов роста

Отмечено, что наибольшая регенерационная способность наблюдалась у тычиночных нитей, которые имели в основании небольшой фрагмент цветоложа и не были изолированы от пыльников. Для развития данного типа эксплантов было характерно отсутствие каллусообразования.

Кроме того, перед нами стояла задача - соотнести интенсивность образования микролуковичек с возрастом материнского растения. В связи с этим, было проведено цитологическое исследование фаз микроспорогенеза у Ь рйо$1шси1ит, и определена высота бутонов, соответствующая той или иной фазе микроспорогенеза. Из всех изученных типов эксплантов Ь рйо51шси1ит, выделенных из тканей и органов цветка, для дальнейшего опыта был выбран только один тип - тычиночные нити с пыльником, имеющие в основании фрагмент цветоложа. Определено суммарное число регенерантов

1. 2,4 Д (0.8)

6. 2,4 Д (0.8)

2. 2,4 Д (0.8) + БАП (0.2)

3. НУК (0.4) + БАП (0.4)

4. НУК (0.2) + БАП (0.2)

5. БАП (0.4)

7. 2,4 Д (0.8) + БАП (0.2)

8. НУК (0.4) + БАП (0.4)

9. НУК (0.2) + БАП (0.2)

10. БАП (0.4)

в опыте как среднее по двум повторностям. Показана зависимость данного показателя от онтогенетического состояния материнского растения (высоты бутонов), минеральной основы сред (варианты сред 1-10) и внесения ауксинов 2,4Д, НУК и цитокинина БАП (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость регенерационной способности тычиночных нитей L. p¡-losiusculum с пыльником и фрагментом цветоложа от онтогенетического состояния материнского растения (высоты бутонов), минеральной основы питательных сред и добавления регуляторов роста, п=10

Варианты сред МБт А и N6111 Б, не содержащие регуляторов роста, в эксперименте не использовались.

Таким образом, можно сделать следующие выводы: 1) у Ь. рИоБшзсиЫт микролуковички способны образовываться с разной степенью интенсивности у всех эксплантов, представляющих собой ткани и органы цветка как на среде М5ш, так и на N6111, в которые были внесены ауксины и цитокинины; 2) наиболее активно регенерация микролуковичек происходила при повышенном содержании в средах ауксина 2,4 Д (0,8) по сравнению с цитокинином БАП (0,2) (вар. 2, 7, рис. 4). Наибольшей способностью к регенерации обладали тычиночные нити с пыльником, имеющие в основании фрагмент цветоложа. При использовании данного типа эксплантов, выделенных из неокрашенных бутонов высотой 17-25 мм, было получено наибольшее суммарное число регенерантов. Основываясь на цитологическом анализе микроспорогенеза, результаты которого изложены в гл. З.5.1., преобладающей стадией микроспоргенеза для бутонов такого размера, следует указать поздние одноядерные микроспоры.

Рис. 5. Образование соматических эмбриоидов на разросшейся ткани фрагмента цветоложа /.. рНо$ш$си!ит (среда N601 + 0, 2 мг/л 2,4 Д + 0,2 мг/л БАП); ЗК - зародышевый корень; ЗГ1 -зародышевая почечка; х10

У остальных трех видов лилий наибольшей морфогенной активностью также обладали тычиночные нити с пыльником и фрагментом цветоложа. Регенерация проходила активно как на среде MSm, дополненной 0,8 мг/л 2,4 Д и 0,2 мг/л БАП, так и на среде N6m с добавлением 0,2 мг/л 2,4 Д и 0,2 мг/л БАП. Образование микролуковичек происходило либо по пути адвентивного побегообразования (гемморизогенеза) на среде MSm, либо соматического эмбриоидогенеза на среде N6m. У эмбриоидов, образовавшихся из ткани цветоложа L. cernuum, L. pumilum отмечено одновременное появление как зародышевого корня, так и зародышевой почечки (рис. 5). При обобщении результатов, полученных при культивировании тканей и органов цветка у четырех видов лилий, получены следующие выводы: 1) для морфогенеза в культуре изолированных тканей и органов цветков всех четырех рассмотренных видов лилий наиболее характерен гемморизо-генез; 2) наибольшее количество регенерантов у L. pilosiusculum образовывали тычиночные нити с фрагментом цветоложа и пыльником, в котором большинство микроспор были одноядерные (высота бутонов 17-25 мм); 3) у двух видов лилий - L. cernuum и L. pumilum - отмечено образование соматических эмбриоидов на среде N6m + 0,2 мг/л 2,4 Д + 0,2 мг/л БАП; 4) только у одного типа эксплантов, а именно, у тычиночных нитей с пыльником и фрагментом цветоложа, процесс адвентивного побегообразования и соматического эмбриоидогенеза не включал стадию каллусообразования при низких концентрациях регуляторов роста в питательных средах.

3.4.1. Гистологический анализ регенерантов

При изучении морфогенеза у L. pumilum и L. cernuum in vitro мы анализировали развитие меристематических структур в эксплантах, выделенных из луковичных чешуй и из тканей и органов цветков. В тканях эксплантов как луковичных чешуй, так и соматических тканей и органов цветков изученных видов, отмечено (рис. 6) появление мелких клеток с хорошо различимыми ядрами, образовывавших шаровидные структуры с васкулярными элементами, обозначенные ранее O.A. Чуриковой как полиады (2005).

Рис. 6. Образование полиад (П) в паренхиме цветоложа, изолированного из цветка L. pumilum в стадии бутонизации, х 250

Обнаружено, что при добавлении к среде N6 ауксина 2,4 Д в сочетании с цитоки-нином БАП в равных концентрациях (0,2 мг/л) в эксплантах, представлявших собой тычиночные нити, объединенные с тканью цветоложа и с пыльником, наряду с адвентив-

ными почками, могли закладываться биполярные образования, имевшие как зародышевую почечку, так и зародышевый корень и идентифицированные нами как соматические эмбриоиды (рис. 7).

—чеад

ЗК

Рис. 7. Образование соматического эмбрионда через 40 дней культивирования тычиночной нити с пыльником и тканью цветоложа ¿. сегпишп на среде N6 + 0,2 мг/л 2,4 Д + 0,2 мг/л БАП; П - почечка; ¡К - зародышевый корень, х250

По-видимому, инициальными клетками для их образования выступали те же поли-ады, отдельные клетки которых при внесении в среду 2,4 Д могли развиваться не только по пути адвентивного побегообразования, но и соматического эмбриоидогенеза.

3.4.2. Цитологический анализ

Цитологический метод использовали для решения следующих задач: 1) для изучения стадий микроспорогенеза у ЫНит рИоз1шси1ит\ 2) для определения числа хромосом у регенерантов двух видов лилий: ЫНит сегпиит и Ь. сНзНЫгит.

В пыльниках Ь. рИойгшсиШт, выделенных из разных по высоте неокрашенных бутонов, были выявлены несколько стадий микроспорогенеза, для каждого препарата установлены модальные классы микроспорогенеза (рис. 8). Бутоны были ранжированы по высоте в соответствии с преобладающей стадией микроспорогенеза.

Рис. 8. Модальные и минорные классы микроспорогенеза в бутонах /.. рИомиясЫит, ранжированных по высоте по 3 группам

Таблица 4

Взаимосвязь между морфологическими показателями генеративных органов и стадией микроспоро- и гаметогенеза в пыльниках цветков ЫИитрИоь'шзсиЫт

Преобладающая стадия (модальный класс) микроспоро- и гаметогенеза Абсолютные значения Показатели регрессионного анализа Статистические критерии

Высота бутона (мм)

Распад тетрад, ранние микроспоры 8-16 гху = 0,972 F = 280,53 Р = 0,0001

Поздние микроспоры 17-25

Двуклеточная пыльца >26

В результате исследований были установлены биологические закономерности развития микроспорогенеза в пыльниках L pilosiusculum. Выявлена зависимость между стадиями микроспорогенеза (табл 4) в пыльниках данного вида лилии и высотой бутона

Предложено усовершенствовать методику подсчета хромосом путем выдерживания корешков лилий в холодной воде в холодильнике при +4 °С в течение 12-16 ч для синхронизации стадий митоза. При изучении кариотипов у регенерантов L. сегпиит и L. distichum, полученных в культуре соматических тканей и органов цветков, не было отмечено изменений в числе хромосом, несмотря на то, что изучение регенерантов проводилось после их продолжительного культивирования в течение 2,5 лет.

3.4.3. Анализ изоферментов

Данный анализ применялся для изучения возможной изменчивости среди регенерантов Lilium сегпиит и L. distichum, полученных в результате культивирования in vitro из разных эксплантов (луковичных чешуй, тканей и органов цветка), а также для сравнения исходных генотипов лилий с полученными регенератами. В качестве видоспе-цифичных маркеров были выбраны изоферментные спектры: изоцитратдегидрогеназы (ЮН) и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-FGD). Для сравнения использовались: А. Микролуковички L. сегпиит и L distichum, полученные в культуре in vitro из тканей и органов цветка; Б. Микролуковички L. сегпиит, полученные в культуре in vitro из луковичных чешуй; В. Листья исходного растения L сегпиит, выращиваемого в теплице.

Анализ изоферментов у регенерантов проводили спустя 1,5 года после введения объектов в культуру, причем все сравниваемые между собой регенераты находились в ювенильном возрастном состоянии, активно вегетировали и имели по 2-3 ассимилирующих листа. Исходное растение-донор L сегпиит, из которого были получены регенераты, содержалось в условиях теплицы и находилось в репродуктивном возрастном периоде. Для анализа изоферментов с исходного растения были взяты 3-4 листа с нижней части генеративного побега, а у регенерантов - 2-3 чешуи микролуковиц с небольшой частью основания ассимилирующей листовой пластинки. Для анализа электрофоре-тических спектров регенерантов, полученных из луковичных чешуй и частей цветка L. сегпиит, использовали две ферментные системы ЮН и 6-PGD.

У всех исследованных регенерантов были выявлены спектры IDH, состоящие из двух компонентов (рис. 9).

t.

Г.

^^ Рис. 9. Спектры изоферментов IDII у регенерантов, полученных —— из частей цветков L. сегпишп (1-3)

3 4 5 6 и луковичных чешуй in vitro (4-6)

Б

(одно растение). А - электрофоре-тические спектры; Б-схема

При изучении изоферментных спектров б-РвО у регенерантов, полученных из частей цветков одного и того же растения сИзйсИит, была выявлена сомаклональная изменчивость: у одной пары регенерантов данного вида были выявлены двухкомпонентные спектры б-РвО с разной электрофоретической подвижностью компонентов, а у другой пары регенерантов был отмечен хорошо выраженный трехкомпонентный спектр 6-РОЭ (рис. 10). Возможными причинами возникших изменений в генотипе регенерантов Ь. сИьИсИит могут быть, по нашему мнению, два фактора: повышенные концентрации регуляторов роста в некоторых вариантах сред для культивирования, а также продолжительное культивирование, в течение которого регенеранты могли находиться на разных стадиях роста и покоя.

+

Рис. 10. Спектры изоферментов б-Рвй у регенерантов, полученных из частей цветков одного и того же растения Л. ЛЧ-ИсИит. А - электрофоретические спектры; Б - схема

Вследствие отсутствия изменчивости у регенерантов L. сегпиит, полученных из разных типов эксплантов, можно заключить, что выбранный нами метод культуры in vitro помогает сохранять генотип такого редкого вида, как L. сегпиит. С помощью используемых ферментов IDH и 6-PGD нами показана возможность идентификации полученных регенерантов у двух изученных видов лилий.

ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ КУЛЬТУРЫ IN VITRO ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ СОРТОВЫХ ЛИЛИЙ, ХОСТ И ЛИЛЕЙНИКА

Отмечено, что у модельного сорта лилий восточного гибрида «Сибирь» через 3 месяца культивирования на среде N6 с регуляторами роста наибольшей регенерацион-ной способностью обладали тычиночные нити с пыльником и небольшим фрагментом цветоложа (15 регенерантов на эксплант). Определены следующие особенности морфогенеза у лилейников в культуре in vitro: наиболее активно закладываются адвентивные

почки в основании цветоложа и на поперечных срезах осей соцветий; необходимым фактором органогенеза являлось включение в состав инициирующей среды как ауксина 2,4-Д (0,5-0,6 мг/л), так и цитокинина БАП. При изучении процессов морфогенеза у сортов хосты в культуре in vitro на гистологических срезах нами отмечено, что побегообразование у хосты in vitro происходило на возникающих у основания завязей адвентивных корнях, закладывающихся из субэпидермальных тканей стебля.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в культуре тканей и органов цветков видов Lilium pilosiusculum, L distichum, L pumilum, L cernuum возможна реализация процессов как адвентивного органогенеза, соматического эмбриоидогенеза, так и каллусогенеза.

2. Определен тип эксплантов, представляющий собой сопряженную систему: пыльник -тычиночная нить - ткань цветоложа, с помощью которой получены регенераты путем прямого органогенеза и соматического эмбриоидогенеза без фазы каплусообразо-вания.

3. Наибольшая регенерационная способность к образованию микролуковичек у вида L. pilosiusculum была отмечена у тычиночных нитей с пыльником и фрагментом цветоложа, культивировавшихся на среде N6m + 0,8 мг/л 2,4 Д с добавлением БАП в концентрации 0,2-0,4 мг/л. Данные экспланты были выделены из бутонов, в которых преобладающей стадией микроспорогенеза были одноядерные микроспоры.

4. Разработана схема получения соматических эмбриоидов с использованием культуры неспелых семян у вида L pilosiusculum. В результате культивирования проростков данного вида на среде П-2ш с добавлением 2,4-Д (0,2 мг/л) и БАП (0,1 мг/л) происходит ускорение развития, выражающееся в образовании большего числа метамеров в луковице, при увеличении коэффициента микроразмножения в 2-3 раза.

5. Установлено, что для начальных этапов морфогенеза эксплантов, выделенных из луковичных чешуй, а также тканей и органов цветка L. pumilum и L. cernuum в культуре in vitro характерно образование меристематических зон и элементов проводящей системы, входящих в состав полиад.

6. У регенерантов L. cernuum и L. distichum не отмечено изменений в числе хромосом (2п=24), по сравнению с исходными диплоидными видами.

7. В результате анализа электрофоретических спектров изоферментов IDH и 6-PGD не выявлено значимых генотипических изменений у регенерантов L. cernuum, по сравнению с исходным видом; обнаруженная сомаклональная изменчивость у регенерантов L. distichum, по-видимому, является следствием эпигенетических изменений, обусловленных разной нормой реакции регенерантов на продолжительное культивирование.

8. Разработан протокол массового размножения и длительного культивирования in vitro четырех видов лилий: L. cernuum, L. pilosiusculum, L. pumilum, L. distichum при сохранении стабильности генотипа L. cernuum, по крайней мере, в течение трех лет.

9. Эффективность применения данной методики подтверждена при получении регенерантов путем прямого органогенеза в культуре тканей и органов цветков у других представителей порядков Liliales и Amaryllidales.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Набиева А Ю. Преимущества использования методов культуры ткани для размножения ювых сортов лилий // Тез. докл. юбилейной конф. «Садоводство и цветоводство на совре-

енном этапе». РАСХН. Сиб отд-ние. НЗПЯОС им. И.В Мичурина. Новосибирск, 2005. . 203-207.

2. Набиева А.Ю , Буглова JI В., Вяткин А.И., Кайгородова E.H. Особенности микрокло-¡ального размножения видов и сортов рода Hosta Tratt. в культуре завязей in vitro // Мате-иалы III Междунар. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М, 005, Ч. 1. С. 282-284.

3. Набиева А.Ю , Гордиенко Н.Я. Изучение факторов, определяющих пути развития экс-лантов репродуктивных органов лилий соматического происхождения в культуре т vitro //

атериалы V Междунар. науч. конференции «Цветоводство без границ». Харьков, 2006.

4. Nabieva A.Y. The peculiarities of micropropagalion of some rare Lily species of the Asiatic part of Rusia by the culture of floral buds // Биологический Весгник Харьковского университета. Харьков, 2006. .10. Вып. 1.С. 68-70.

5. Набиева А.Ю., Буглова Л.В., Кайгородова Е.Н. Особенности морфогенеза представители pp. Hosta и Lilium в культуре цветочных почек in vitro // Материалы I (IX) Междунар. онф. молодых ботаников. С.-Петербург, 2006. С. 176.

6. Набиева А.Ю , Буглова Л.В., Астанкович Л.И., Красников А.А. Изучение развития со-атических тканей цветка некоторых представителей pp. Lilium L. и Hyacinthus L. в культуре

п vitro //Материалы I Всероссийской научно-практ. конф. «Биотехнология как инструмент охранения биоразнообразия растительного мира». Волгоград, 2006. С. 80-85.

7. Nabieva A.Y., Buglova L.V. Peculiarities of micropropagation of some representatives of the genus osta Tratt by the culture of ovaries // Biotechnology, Agriculture and the Food Industry. New York, 006. P. 27-33.

8. Набиева А.Ю., Полубоярова T.B. Биотехнологические подходы в размножении декора-ивных видов природной флоры из pp. Allium и Lilium для озеленения городов //Материалы еждунар. конф. «Современные проблемы фитодизайна». Белгород, 2007. С. 244-249.

9. Набиева А.Ю. Факторы, влияющие на сохранение генотипов лилий неизменными при х культивировании in vitro // Материалы VI междунар. научно-практ. конф. «Проблемы отаники Южной Сибири и Монголии». Барнаул, 2007. С. 319-320.

10. Набиева А.Ю., Дорогина О.В., Красников А.А. Размножение и сохранение в культуре п vitro двух редких видов лилий - Lilium distichum Nakai и L. cernuum Кот. // Раст. ресурсы. 008. Т. 44, вып. 2. С. 23-29. (Реценз.)

11. Набиева А.Ю, Дорогина О.В , Сорокопудова О.А., Кирикович С.С., Левитес Е.В. Соз-ание отдаленных гибридов лилий и их идентификация на ранних этапах онтогенеза // Докл.

Российской сельхоз. академии. 2008. № 3. С. 26-28. (Реценз.)

12. Набиева А.Ю., Дорогина О.В. Введение в культуру in vitro Lilium martagon L. subsp. ilosiusculum (Freyn) Iljin ex B. Fedtsch с помощью спелых и неспелых семян // Вестник

Алтайского гос аграр. ун-та. 2008. № 8 (46). С. 12-15. (Реценз.)

. 113-115.

Подписано в печать 11 1108 Формат 60x84'/i6 Объем 1,0 п л Тираж 100 экз Заказ № 18

Центральный сибирский ботанический сад СО РАН 630090 Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Набиева, Александра Юрьевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Использование методов биотехнологии для сохранения биологического разнообразия растений

1.2. Факторы, определяющие процессы морфогенеза в культуре изолированных тканей и органов растений

1.3. Модели регенерации растений в культуре in vitro

1.4. Сомаклональная изменчивость; методы ее идентификации у регенерантов

1.5. Получение регенерантов лилий в культуре in vitro

Глава 2. Объекты, методы и условия проведения исследований

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Введение в культуру in vitro Lilium pilosiusculum (Freyn) Misez, с помощью семян

3.2. Введение в культуру in vitro Lilium pilosiusculum,

L. cernuum Komv L. pumilum Delile из луковичных чешуй

3.3. Введение в культуру in viti'o Lilium pilosiusculum, L. distichum Nakai, L. cernuum, L. pumilum из эксплантов тканей и органов цветка

3.4. Анализ регенерантов лилий 96 3.4.1. Гистологический анализ 96 3.4. 2. Цитологический анализ 103 3.4. 3. Анализ изоферментов

Глава 4. Практическое применение методов культуры in vitro для получения регенерантов сортовых лилий, хост и лилейника

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сохранение и размножение в культуре in vitro генотипов редких видов лилий азиатской части России"

Актуальность темы. В связи с ускоряющимися в последнее время темпами исчезновения многих видов растений появляется необходимость разработки методов их размножения и сохранения. Особенно это касается редких декоративных и лекарственных растений, для которых реинтродукция и репатриация являются одним из возможных способов восстановления. К таким видам относятся редкие виды лилий Сибири и Дальнего Востока - Lïl-ium pilosiuscuhim (Freyn) Misez., L. pumilum Delile, L. distichum Nakai и L. cer-nuum Kom.

В условиях интродукции, особенно в климатической зоне средней полосы, возобновление этих видов традиционными способами часто отсутствует (Растения., 2005). В связи с этим, необходимым стал поиск ускоренного метода размножения лилий, позволяющего в то же время сохранить генотипы растений. При выборе стратегии сохранения биоразнообразия редких, исчезающих видов растений многими исследователями показана эффективность методов биотехнологии в сравнении с традиционными способами их размножения (Камелин, 1997; Benson, 1999; Молканова, Горбунов, 2003;) в том числе и представителей порядка Liliales (Pelkonen, 2005; Pejman, Morteza, 2007).

В то же время, существует необходимость построения прогнозируемой модели морфогенеза регенерантов, исключающей возникновение сомакло-нальной изменчивости. Важным преимуществом разрабатываемой технологии размножения редких генотипов в культуре in vitro должно явиться массовое воспроизводство генетически стабильных регенерантов, не отличающихся по ряду морфологических, биохимических и генотипических признаков от исходных растений. Выявление возможной изменчивости обеспечивается применением наиболее воспроизводимых и доступных методов экспресс-анализа.

Цель и задачи исследований. Цель исследования - выявить пути реализации морфогенетического потенциала различных типов эксплантов 4-х видов рода Lilium L. и разработать методы, позволяющие сохранять генетическую стабильность регенерантов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфогенетические особенности развития различных типов эксплантов - семян, соматических тканей репродуктивных органов, тканей луковичных чешуй в культуре in vitro и сравнить их регенерационную способность.

2. Определить типы морфогенеза и особенности регенерации в зависимости от возраста материнского растения и соотношения экзогенных гормонов в питательной среде.

3. Провести анализ регенерантов, полученных из различных типов эксплантов при помощи гистологического, цитологического методов и изучения электрофоретических спектров изоферментов.

4. Показать возможность получения регенерантов из соматических тканей и органов цветка у различных сортов рода Lilium (пор. Liliales) и у сортов родов Hosta Tratt. и Hemerocallis L. (пор. Amaiyllidales).

Защищаемые положения.

1) Для изученных видов лилий выделен тип эксплантов, характеризующийся наибольшей регенерационной способностью - тычиночные нити с пыльником и фрагментом цветоложа. Полученные из них регенеранты развивались только по пути прямого органогенеза.

2) Реализация программы гемморизогенеза или соматического эм-бриоидогенеза у регенерантов изученных видов лилий, полученных из соматических тканей и органов цветка позволяет сохранять их генотипы неизменными.

Научная новизна. Впервые проведен комплексный анализ регенерантов четырех видов лилий, полученных в культуре тканей луковичных чешуй и соматических тканей и органов цветка при использовании гистологического, цитологического методов и изучения электрофоретических спектров изо-ферментов. Приведенные результаты гистологического анализа тканей реге-нерантов двух видов лилий - L. pumilum и L. сегпиит позволяют заключить, что появление мелких клеток с хорошо различимыми ядрами, образовывавших шаровидные структуры с васкулярными элементами, обозначенные ранее O.A. Чуриковой как полиады (2005), предваряют появление как побего-вых конусов, так и соматических эмбриоидов.

Показано, что регенерация жизнеспособных растений проходит у изученных нами видов и сортов лилий по таким путям морфогенеза in vitro, как гемморизогенез и соматический эмбриоидогенез (терминология дана по Т.Б.Батыгиной (1997). Отсутствие каллусогенеза при интенсивной регенерации микролуковичек у тычиночных нитей, выделенных вместе с пыльником и фрагментом цветоложа, говорит о высокой степени интактности эксплан-тов, исключающем образование каллуса.

Впервые при анализе электрофоретических спектров у двух видов лилий и полученных регенерантов были выделены как наиболее видоспеци-фичные изоферментные спектры изоцитратдегидрогеназы (IDH) и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-FGD). При проведении анализа данных изо-ферментов в нескольких повторностях были получены сопоставимые результаты в тех случаях, когда исследовали материал, полученный от растений, выращиваемых в одинаковых условиях и находящихся на одной стадии онтогенеза.

При проращивании неспелых семян L. pilosiusculum на среде П-2, дополненной 0,2 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л БАП, отмечено формирование соматических эмбриоидов в основании семядоли проростков путем прямой регенерации без образования каллуса. Показано, что у регенерантов, полученных путем соматического эмбриоидогенеза по сравнению с сеянцами в культуре in vivo образуется большее количество метамеров в луковице за одинаковый промежуток времени.

Практическая значимость работы. Разработана оригинальная методика получения регенерантов из соматических тканей и органов цветков лилий, которая позволяет сохранять исходный генотип неизменным. Создание подобной воспроизводимой модели регенерации дополняет существующие методы микроклонирования. Введение в культуру in vitro редкого вида L. сетиит из соматических тканей и органов цветка способствует сохранению материнских растений и созданию клонированных генотипов для репатриации данного вида в природу.

Привлечение в качестве эксплантов неспелых семян Lilium pilosiuscu-lum приводит к ускорению онтогенетического развития сеянцев данного вида, что особенно важно для его интродукции.

Подобраны оптимальные условия культивирования in vitro для получения в короткие сроки идентичных сорту редких генотипов высоко востребованных в интродукции культиваров из родов Hosta и Hemerocallis.

Личный вклад автора состоит в получении и анализе экспериментального материала, описании результатов исследования, формировании выводов. Гистологические и цитологические исследования проведены в лаборатории декоративных растений совместно с Бугловой JI.B., а также в Центре коллективного пользования; анализ спектров изоферментов и их интерпретация проведены совместно с сотрудниками ИЦиГ Левитес Е.В.и Кирикович С.С.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на юбилейной конференции «Садоводство и цветоводство на современном этапе» (Новосибирск, 2005), Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), Международной научной конференции «Цветоводство без границ» (Харьков, 2006), I (IX) Международной конференции молодых ботаников (С-Петербург, 2006), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2006), Международной конференции «Современные проблемы фитодизайна» (Белгород, 2007), VI Междунар. научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы; списка сокращений; содержит 35 рисунков и 18 таблиц. Список литературы включает 270 работ, в том числе 110 работ на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Набиева, Александра Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в культуре тканей и органов цветков видов Lil-ium pilosiusculum, L. distichum, L. pumilum, L. cernuum возможна реализация процессов как адвентивного органогенеза, соматического эмбриоидогенеза, так и каллусогенеза.

2. Определен тип эксплантов, представляющий собой сопряженную систему: пыльник - тычиночная нить - ткань цветоложа, с помощью которой получены регенеранты путем прямого органогенеза и соматического эмбриоидогенеза без фазы каллусообразования.

3. Наибольшая регенерационная способность к образованию микролуковичек у вида L. pilosiusculum отмечена у тычиночных нитей с пыльником и фрагментом цветоложа, культивировавшихся на среде N6 + 0,8 мг/л 2,4 Д с добавлением БАП в концентрации 0,2 - 0,4 мг/л. Данные экспланты были выделены из бутонов, в которых преобладающей стадией микроспорогенеза были одноядерные микроспоры.

4. Разработана схема получения соматических эмбриоидов с использованием культуры неспелых семян у вида L. pilosiusculum. В результате культивирования проростков данного вида на среде П-2 с добавлением 2,4 Д (0,2 мг/л) и БАП (0,1 мг/л) происходит ускорение развития, выражающееся в образовании большего числа метамеров в луковице, при увеличении коэффициента микроразмножения в 2-3 раза.

5. Установлено, что для начальных этапов морфогенеза эксплантов, выделенных из луковичных чешуй, а также тканей и органов цветка L. pumilum и L. сетиит в культуре in vitro характерно образование меристема-тических зон и элементов проводящей системы, входящих в состав полиад.

6. У регенерантов L. cernuum и L. distichum не отмечено изменений в числе хромосом (2гг=24), по сравнению с исходными диплоидными видами.

7. В результате анализа электрофоретических спектров изофермен-тов IDH и 6-PGD не выявлено значимых генотипических изменений у регенерантов L. cernuum, по сравнению с исходным видом; обнаруженная сома-клональная изменчивость у регенерантов L. distichum, по-видимому, является следствием эпигенетических изменений, обусловленных разной нормой реакции регенерантов на продолжительное культивирование.

8. Разработан протокол массового размножения и длительного культивирования in vitro четырех видов лилий: L. cernuum, L. pilosiusculum, L. pumilum, L. distichum при сохранении стабильности генотипа L. cernuum, по крайней мере, в течение трех лет.

9. Эффективность применения данной методики подтверждена при получении регенерантов путем прямого органогенеза в культуре тканей и органов цветков у других представителей порядков Liliales и Amaryllidales.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Набиева, Александра Юрьевна, Новосибирск

1. Атанасов A.A. Биотехнология в растениеводстве. — Новосибирск: Наука, 1993.-242 с.

2. Байбурина Р.К., Мухаметвафина A.A., Миронова JI.H. Опыт культви-рования некоторых видов Lilium L. in vitro II Раст. ресурсы. — 2004. — 40, № 1 С. 82-89.

3. Байбурина Р.К., Мухаметвафина A.A., Миронова Л.Н. Особенности регенерации гибридов азиатских лилий из фрагментов соцветий в культуре in vitro II Сельскохозяйственная биология. — 2006 1. - 80-85.

4. Баранова М.В. Типы прорастания семян и развитие сеянцев у видов Lilium L. // Бот. журн. 1974. - Т. 59, № 7. - С. 1045-1055.

5. Баранова М.В. Луковичные растения семейства лилейных (география, биоморфологический анализ, выращивание). СПб.: Наука, 1999 .— 229с.

6. Баранова М.В. Лилии. — Л.: Агропромиздат, 1990. — 384 с.

7. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина Г.М., Чубатова Н.В. Справочник по ботанической микротехнике. М.: Моск. ун-т., 2004.-312 с.

8. Барыкина Р.П. Чурикова O.A. Развитие, структура и функции гидро-цитной системы у растений // Вестник МГУ. Сер. Биология. 2004. — №2. -С. 23-31.

9. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Л.: Наука, 1987. - 103 с.

10. Батыгина Т.Б. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 1. Генеративные органы цветка. СПб.: Мир и семья, 1994. -504 с.

11. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 2. Семя. СПб.: Мир и семья, 1997. - С. 624648.

12. Батыгина Т.Б. Системы репродукции // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 3. СПб.: Мир и семья, 2000. - С. 628634.

13. Батыгина Т.Б. Эмбриогенез и морфогенез половых и соматических зародышей // Физиол. раст. 1999. - 6, № 6. - С. 884-898.

14. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro (эмбриоидогенез у покрытосеменных) // Ботан. журн. — 1978.-63, № 1.-С. 87-111.

15. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений — СПб.: Изд-во Санкт-Петербургск. Ун-та, 2002. — 232 с.

16. Батыгина Т.Б., Рудский И.В. Роль стволовых клеток в морфогенезе растений // Докл. РАН. 2006.- Т. 410, № 5. - С. 1-3.

17. Белокурова В.Б., Листван Е.В., Майстров П.Д., Сикура Й.Й., Глеба Ю.Ю., Кучук Н.В. Использование методов биотехнологии растений для сохранения и изучения биоразнообразия мировой флоры // Цитология и генетика.-2005.-39, № 1.-С.-41-51.

18. Биологические особенности растений Сибири, нуждающихся в охране. -Новосибирск: Наука, 1986. 255 с.

19. Богданова Е.Д. Эпигенетическая изменчивость, индуцируемая никотиновой кислотой // Генетика. 2003. - Т.39, №9. - С. 1221-1227.

20. Бойков Т.Г. Редкие растения и фитоценозы Забайкалья: Биология, эколого-географические аспекты и охрана. Новосибирск: Наука, Сиб. из-дат. фирма, 1999. —265 с.

21. Болтенков Е.В., Зарембо Е.В. Регенерация и каллусогенез в культуре in vitro тканей органов цветка видов рода Iris L.(Iridaceae) // Известия РАН. Сер. Биологическая. 2005- №2. - С.174-179.

22. Боронникова С.В. Семенная продуктивность Lilium martagon subsp. pilosiusculum (Freyn) Iljin ex B. Fedtsch. и Paeonia anomala L. (Пермская обл.) // Растительные ресурсы. 2002. - Т.38, № 3. - С. 50-54.

23. Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений // Физиология растений. 1999. -Т.46, №6. - С.930-944.

24. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения / Культура клеток растений.- М.: Наука, 1986. С. 3-20.

25. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.- 160 с.

26. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений М.: Наука, 1971 - 342 с.

27. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений М.: Наука, 1975 — 51с.

28. Бутенко Р.Г. Изолированные протопласты растений объект и модель для физиологических исследований / Культура клеток растений. — М.: Наука, 1981.- С. 69-84.

29. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. — М.: Наука, 1964. 272 с.

30. Бутенко Р.Г. Клеточные и молекулярные аспекты морфогенеза растений in vitro III Чайлахян. чтения. Пущино: Пущинский НЦ, 1994. — С. 7-26.

31. Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений / Гормональная регуляция онтогенеза растений. — М., 1984 С. 42-54.

32. Бутенко Р.Г. Гормональная регуляция онтогенеза растений М., 1984.- С.42.

33. Валиханова Г.Ж., Рахимбаев И.Р. Культура клеток и биотехнология растений: Учебное пособие. Алма-Ата: изд. КазГУ, 1989. - 80 с.

34. Верещагин В.И., Соболевская К.А., Якубова А.И. Полезные растения Западной Сибири. М.; Л. - 1959. -430 с.

35. Вечернина H.A., Таварткиладзе O.K., Жаркова C.B. Каллусоге-нез и регенерационная способность тканей и органов Allium сера L. in vitro И Известия АГУ. Барнаул: Изд-во АГУ, 2000.- №3 - С.47-50.

36. Вечернина H.A., Таварткиладзе O.K., Жаркова СВ. Размножение in vitro ЦМС-линии лука репчатого: Тез. междунар. конф. «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI в.»- М.: Изд-во НИИСОК, 2000. С.56-57.

37. Вечернина H.A., Таварткиладзе O.K., Клементьева JI.A., Долганова З.В. Особенности регенерации и размножения растений рода Iris L. in vitro 11 Растительные ресурсы. 2004. - вып.4 - С. 56-65.

38. Вечернина H.A. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений. Барнаул.: Изд-во Алтайского ун-та, 2004 -205 с.

39. Вольф В.Г. Статистическая обработка опытных данных. — М.: Изд-во "Колос". 253 с.

40. Врищ Д.Л. Лилии Дальнего Востока и Сибири. Владивосток: Даль-невосточн. кн. изд.-во, 1972. — 110 с.

41. Высоцкая О.Н. Длительное сохранение in vitro коллекции растений земляники // Физиология растений. 1994. - 41, № 6- С. 935-941.

42. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений / Культураiклеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. - С. 91-102.

43. Высоцкий В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных растений: Автореф. дис. . докт. с.-х. наук. М., 1998. - 44 с.

44. Глазко В. И, Дубин А. В., Календарь Р. Н.,Глазко Г.В.,Шерепитко В. И., Созинов А. А. Генетические взаимоотношения между сортами сои, оцененные с использованием ISSR маркеров // Цитология и генетика.— 1999. — Т. 33, №5.-С. 47-51.

45. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н, Потапова H.H. Эмбриоидогенез в культуре пыльников пшеницы: цитолого-гистологические аспекты. — 4.1. Уфа: БНЦ УрО РАН. -1992. 64 с.

46. Горбунова В.Ю. Генетические предпосылки спорофитного пути развития микроспор злаков в условиях in vitro. — Уфа: УНЦ РАН, 1993. 104 с.

47. Горбунова В.Ю., Круглова H.H. Влияние генетической детерминации уровня эндогенных фитогормонов на выход андрогенных новообразовании у пшеницы // Генетика. 1994. - Т. 30, прилож. - С. 34.

48. Гриф В.Г. Действие низких температур на митоз и хромосомы растений // Цитология. 1963. - 5, № 4,- С. 404-413.

49. Дерфлинг К. Гормоны растений. М.: Мир, 1985 - 304 с.

50. Дмитриева H.H. Проблема регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей растений / Культура клеток растений. — М.: Наука, 1981.- С.113-123.

51. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. -М.: Наука, 1983.-180 с.

52. Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Реунова Г.Д., Илюшко М.М. ДНК-типирование дальневосточных видов рода Iris L. с помощью метода RAPD-PCR// Генетика.- 1998.-Т. 34.-С. 368-372.

53. Земляченко Я.В., Каравайко H.H., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н. Новый подход к изучению зависимости между структурой и функцией цитокининов // Докл. РАН. 1997.- Т. 353, № 2. С. 261-263.

54. Иванов В.Б. Особенности организации пролиферации клеток в растениях в связи с проблемой стволовых клеток // Цитология .— 1986. — Т. 28. С. 295-302.

55. Иванов В.Б. Проблема стволовых клеток у растений // Онтогенез -2003. 34, №4.- С. 253-261.

56. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры ткани в физиологии и биохимии растений. — Киев: Наукова думка, 1980. — 488 с.

57. Камелин Р.Б. Биологическое размножение и интродукция растений // Раст. ресурсы. 1997.-33, Вып.З. - С.1-11.

58. Карабаев М. Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы: физиологические и биотехнологические аспекты: Автореф. дисс. . докт. биол. наук. -М., 1994.-49 с.

59. Карначук P.A., Гвоздева Е.С. Влияние света на баланс фитогормонов и морфогенез в культуре ткани зародышей пшеницы // Физиология растений. 1998. - 45, № 2. - С. 289-295.

60. Катаева Н.В., Аветисов В.А. Клональное размножение в культуре ткани / Культура клеток растений. М.: Наука, 1981— С. 137-149.

61. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. — М.: Наука, 1983.-96 с.

62. Коваленко О.В. Генетические аспекты морфогенеза растений // Успехи соврем, биологии. 1993,- Т. 113, №3. - С. 269-285.

63. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Лауве Л.С. Генетическая изменчивость каллусных линий женьшеня Panax ginseng // Биотехнология. 2001. — № 1. - С. 19-26.

64. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Болтенков Е.В., Лауве Л.С. Сома-клональная изменчивость Iris pseudacorus по данным RAPD- и цитологического анализов // Биотехнология. — 2004 №. 2. - С. 13-23.

65. Конарев А. В. Биохимические и молекулярно-биологические подходы к изучению генетических ресурсов растений // Аграрная Россия, № 6, 2006. — 60 с.

66. Конарев В. Г. Молекулярно-биологические исследования генофонда культурных растений в ВИРе (1967-2007 гг.) / Сост.: Сидорова В. В., Конарев А. В. 2-е изд. доп. - СПб.: ВИР, - 2007. - 134 с.

67. Конвенция о биологическом разнообразии: Текст и прил. NEP/CBD/COP/8/12, 2006. 38 с.

68. Константинова Т.Н., Аксенова Н.П., Сергеева Л.И., Чайлахян М.Х. Взаимное влияние света и гормонов на регуляцию морфогенетических процессов в культуре in vitro II Физиология растений. 1998 - Т. 34, № 4 — С. 795 - 802.

69. Корочкин Л.И., Серов О.Л., Манченко Г. П. Понятие об изоферментах / Генетика изоферментов. М.: Наука, 1976. - С. 5-17.

70. Красная книга. Дикорастущие виды флоры СССР, нуждающиеся в охране. — Л.: Наука, Ленингр. отд-ние, 1975.- 204 с.

71. Красная книга Еврейской автономной области. Новосибирск: Изд-во «Арта», 2006 247 с.

72. Красная книга Иркутской области: Сосудистые растения.- Иркутск: Облмашинформ. 2001.- 200 с.

73. Красная книга РСФСР: Растения. М.: Росагропромиздат. — 1988 —590 с.

74. Красная книга Республики Саха (Якутия). Т.1.: редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды растений и грибов.- Якутск: НИПК «Саха-полиграфиздат», 2000. 256 с.

75. Красная книга Хабаровского края. Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды растений и животных. — Хабаровск: Изд-во «Риотип», 2000,- 244 с.

76. Красников A.A. Методика приготовления временных давленых препаратов для подсчета хромосом растений // Проблемы кариологии, кариоси-стематики и молекулярной систематики растений. — Вып. III. Новосибирск, 2004.- 10 с.

77. Круглова H.H., Горбунова В.Ю., Куксо П.А. Морфогенез в культуре in vitro: роль фитогормонов // Успехи соврем, биологии. 1999 - Т. 119, Вып. 6. -С. 567-577.

78. Кубалакова М, Гавел П. Использование культуры тканей в процессеселекции у Lilium L. / Вопросы биотехнологии.— Уфа, 1995. — С. 206-209.

79. Кудряшова Г.Л. Карио-систематическое исследование кавказских лилий: Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Л., 1971. — 25 с.

80. Кунах В.А. Генетическая изменчивость соматических клеток растений. 2. Изменчивость в природе // Биополимеры и клетка. -1995. -Т.11, № 6. -С. 5-40.

81. Кунах В.А. Генетическая изменчивость соматических клеток растений. 3. Каллусообразование in vitro Н Биополимеры и клетка. -1997. Т. 13, №5.-С. 362-366.

82. Кунах В.А. Закон гомологических рядов Н.И. Вавилова в сомакло-нальной изменчивости растений: Материалы 3-го съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». (Москва 6-12 июня 2004 г.) - М. - 2004 . - Т. 1. - С. 73.

83. Куперман Ф.М. Морфофизиология растений. — М.: Высшая школа, 1973.-254 с.

84. Кузеванов В.Я., Седых C.B. Ресурсы Ботанического сада Иркутского государственного университета: научные, образовательные и социально-экологические аспекты. Справочно-методическое пособие. — Иркутск: Иркутский государственный университет, 2005. — 243 с.

85. Кузьмина H.A., Потапова O.A. Культивирование различных сортов роз in vitro II Естественные науки: Биология. — 2000. №5. - С. 38-39.

86. Крогулевич Р. Е., Ростовцева Т.С. Хромосомные числа цветковых растений Сибири и Дальнего Востока. — Новосибирск: Наука, 1984. 286 с.

87. Круглова H.H., Горбунова В.Ю., Куксо П.А. Морфогенез в культуре in vitro: роль фитогормонов // Успехи соврем, биологии. — 1999 — Т. 119, вып. 6. -С. 567-577.

88. Лавров С.А., Мавродиев Е.В. Эпигенетическое наследование признаков и его возможная роль в микроэволюции растений // Журн. общей биологии. 2003. - Т.64, № 5. С. 403- 420.

89. Левина P.E. Репродуктивная биология семенных растений. — М.: Наука. 96 с.

90. Левитес Е. В. Генетика изоферментов растений. — Новосибирск: Наука, Сиб. отделение, 1986. 144 с.

91. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки. Под ред. Баева A.A. — М.: Мир, 1974. 956 с.

92. Максимов H.H. Многофакторный эксперимент в биологии. М.: Изд-во МГУ, 1980. - 280 с.

93. Малецкий С.И. Наследственность и изменчивость у растений / Эпи-генетика растений: Сб. науч. тр. — Новосибирск: Институт цитологии и генетики СО РАН, 2005. С. 7-53.

94. Малецкий С.И., Колодяжная Я.С. Генетическая изменчивость в популяциях соматических клеток и ее влияние на репродуктивные признаки у покрытосеменных растений // Успехи соврем, биологии. 1999. - Т. 119, №2-С. 128-143.

95. Малышев Л.И., Пешкова Г.А. Нуждаются в охране редкие и исчезающие растения Центральной Сибири. — Новосибирск: Наука, 1979. —172 с.

96. Мамаева С.Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток / Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. — С. 78-98.

97. Машкина О.С., Табацкая Т.М., Стародубцева Л.М. Длительное микрочеренкование для массового клонального размножения карельской березы и тополя // Физиология растений. — 1999. — 46, №6. С. 950-952.

98. Международная программа ботанических садов по охране растений. М.: Междунар. совет ботан. садов по охране растений Botanic Gardens Con-serv. Intern. — 2000. — 57 с.

99. Мехтизаде Э.Р., Акпаров З.И., Мамедова С.А. Прогноз генетической долговечности семян // www.rae.ru. Научный журнал "Современные проблемы науки и образования"- 2007. №3.

100. Миляева Э.Л., Азизбекова Н.Ш., Комарова Э.Н., Ахундова Д.Д. Формирование клубнелуковиц-регенерантов шафрана посевного (Crocus sativus L.) в культуре in vitro II Физиология растений. 1995 - Т. 42, № 1. - С. 127134.

101. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1991. - 430 с.

102. Миронова О.Ю. Разработка и совершенствование технологий клональногомикроразмножения декоративно-цветочных культур: Автореф. дисканд. биол.наук. М.: Моск. с.-х. акад. им. К. А. Тимирязева. - 2004. — 22 с.

103. Молканова О.И., Горбунов Ю.Н. Сохранение редких и исчезающих растении в банке меристем ГБС РАН // Биологическое разнообразие. Интродукция растений: Тез. докл. 3-ей Межд. науч. конф. СПб., 2003- С. 42.

104. Моисеева H.A. Молекулярные и клеточные механизмы морфогенеза в культуре клеток растений /Биология культивируемых клеток и биотехнология растений / Под ред. Р.Г. Бутенко. М.: Наука, 1991. - С. 166 -186.

105. Нгуен Хонг Минь, Смирнов В.А., Балашова H.H. Генетические различия по потребности к фитогормонам // Изв. АН Республики Молдова. Биол. и хим. науки. 1991.-№5-С.13 -20.

106. Николаева М.Г. Покой семян / Физиология семян. — М.: Наука, 1982 — С. 125-183.

107. Номенклатура ферментов // Сер. Биологическая химия / Под ред. B.JI. Кретович. М. 1966. - 252 с.

108. Осипова Е.С., Ковеза О.В., Троицкий A.B., Долгих Ю.И. Выявление специфических RAPD- и JSSR-фрагментов у сомаклонов кукурузы и создание на их основе SCAR-маркеров // Генетика. — 2003. — № 12 С. 76-82.

109. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. 3-е изд. — М.: Колос, 1980.-304 с.

110. Першина JI.A. Основные методы культивирования in vitro в биотехнологии растений: Учеб. пособие, 2-е изд. Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т, 2005. - 142 с.

111. Пешкова Г.А. Флорогенетический анализ степной флоры гор Южной Сибири. Новосибирск: Наука, 2001. — 192 с.

112. Полевой В.В. Фитогормоны. — Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. — 248с.

113. Попов A.C. Криоконсервация клеток растений / Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. - С. 70 - 77.

114. Прозина М.Н. Ботаническая микротехника. М., 1960. - 199 с.

115. Размахнин Е.П. Закономерности гаплопродукции в культуре пыльников пырея сизого Agropyron glaucum Desf.: Автореф. . дис. канд. биол. наук. -Новосибирск, 2003. 145 с.

116. Растения Красной книги России в коллекциях ботанических садов и дендрариев / Отв. ред. A.C. Демидов. М.: ГБС, 2005.- 144 с.

117. Редкие виды растений Советского Дальнего Востока и их охрана. Т.2. -М.: Наука, 1981.-234 с.

118. Редкие и исчезающие виды природной флоры СССР, культивируемые в ботанических садах и других интродукционных центрах страны / Отв. ред. П.И. Лапин. М., 1983.- 142 с.

119. Рожанская О. А. Количественная изменчивость в популяциях сома-клонов и мутантов люцерны // Доклады РАСХН, 2006. №1. - С. 18-20.

120. Руководство по цитологической технике / Сост.: Абрамова Л.И. и др. / Под редакцией И.Д. Романова. Л., 1971.-24 с.

121. Румынии В.А., Слюсаренко А.Г. Масс-клональное размножение лилий // Бюл. ГБС РАН. М, 1989, 153. - С. 62-69.

122. Румынии В.А. Массовое размножение in vitro луковичных и клубне-луковичных растений: Тез. докл. V Междунар. конф. «Биология культивируемых клеток и биотехнология» Новосибирск - 1988 - С. 368.

123. Сайб Л.Р., Карабаев М.К. Фитогормональная регуляция регенерации растений: качественная модель // Изв. АН Каз. ССР. Серия биол. 1991. №3. -С. 15-22.

124. Семенова Г.П. Эколого-морфологические критерии оптимальных условий прорастания семян дикорастущих растений // Сиб. экол. журн. 2004. -51, №6. -С.156-176.

125. Семенова Г.П. Редкие и исчезающие виды флоры Сибири.- Новосибирск: Академ, изд-во "Гео", 2007. 408 с.

126. Серов О. JL Механизмы образования гибридных изоферментов как модель для изучения взаимодействия генов / Генетика изоферментов. — М.: Наука, 1977.-С. 187-197.

127. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев: Наукова думка, 1990. - 280 с.

128. Соколовская А.П. Географическое распространение полиплоидных видов растений. Исследование флоры Приморского края // Вест. Ленингр. унта. Сер. Биология. 1966.- 1, №3. - С. 92-106.

129. Сорокопудова O.A. Величина луковиц видов и сортов Lilium в лесостепной зоне Западной Сибири / Бюллетень Главного ботан. Сада.- 2004. Вып. 188.- С. 155-160.

130. Сорокопудова O.A. Эколого-адаптационные закономерности интродукции видов и сортов рода Lilium L. в Сибири: Автореф. дис. . докт. биол. наук. Саратов, 2005. - 35 с.

131. Сосудистые растения советского Дальнего Востока. Т. 2 / Отв. ред. С.С. Харкевич. Л.: Наука, 1987 - 446 с.

132. Стратегия Ботанических садов России по сохранению биологического разнообразия растений М.: Красная Звезда, 2003. - 33 с.

133. Таварткиладзе O.K., Вечернина H.A. Сохранение генофонда растений в коллекции культур in vitro II Изв. АГУ, Спецвыпуск 1999 - С. 13-15.

134. Тахтаджян А.Л. Система Магнолиофитов. Л.: Наука, 1987 — 439 с.

135. Телятьев В.В. Полезные растения Центральной Сибири. Иркутск: Вост.- Сиб. кн. изд-во, 1985. — 384 с.

136. Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений // Биотехнология растений: культура клеток. М.:ВО «Агропромиздат», 1989. -С.97-127.

137. Тихомиров В.Н. Культивирование редких и исчезающих видов растений в ботанических садах как один из методов охраны генофонда флоры /

138. Особенности развития редких растений при культивировании в центре Европейской части СССР. М.: Наука, 1986. - С. 4-7.

139. Тюкавин Г.Б. Биотехнологические основы селекционной технологииморкови (Daucus carota L.): Автореф. дис.докт. биол. наук. М., 2007. 50с.

140. Хайдав Ц., Алтанчимэг Б., Варламова Т.С. Лекарственные растения в монгольской медицине. Улан-Батор: Госиздательство, 1985 - 391 с.

141. Харкевич С.С., Качура H.H. Редкие виды растений советского Дальнего Востока и их охрана. М.: Наука, 1981. - 234 с.

142. Чайлахян М.Х. Гормональная теория развития растений. М.: Изд-во АН СССР, 1937.-С. 96.

143. Чайлахян М.Х. Гормональная регуляция роста и развития высших растений // Успехи соврем, биологии. — 1982. — Т. 95, №1. — С. 23-34.

144. Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в^пределах бывшего СССР). СПб.: "Мир и семья", 1995. - 991 с.

145. Чуб В.В., Т.А. Власова, Р.Г. Бутенко. Каллусогенез и морфогенез в культуре генеративных органов весеннецветущих видов Crocus L. // Физиология растений. 2004. - 50, №6. - С. 815-820.

146. Чурикова O.A., Румынии В.А., Барыкина Р.П. Морфогенетические процессы в луковичных чешуях некоторых видов лилий в условиях масс-клонального размножения in vitro II Бюл. ГБС РАН. —1994. — 169. — С. 105111.

147. Чурикова O.A., Барыкина Р.П. Регенерационная способность некоторых луковичных и клубнелуковичных однодольных in vitro. Морфогенетиче-ский аспект // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 1995. — №2 — С. 58-66.

148. Чурикова O.A. Изучение закономерностей функционирования верхушечной меристемы побега и особенностей морфогенетических процессов в культурах in vitro растений разных таксономических групп // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 2005. - № 3- С. 52-64.

149. Чурикова O.A. Некоторые особенности морфогенеза лилий и гиацинтов при микроклональном размножении in vitro: Тез. докл. Всероссийск. со-вещ. «Морфофизиология специализированных побегов многолетних травянистых растений».- Сыктывкар, 2000. — С. 171-172.

150. Флора Сибири. Т.4. Araceae Orchidaceae / Сост. Власова Н.В., До-ронькин В.М. и др. - Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ление, 1987. - 246 с.

151. Французенок В.В. Совершенствование микроклонального размножения лилий.: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук. Горки, 1997. - 20 стр.

152. Шамина 3. Б. Генетическая изменчивость растительных клеток in vitro. Киев, 1978. - 248 с.

153. Швецов С. Г., Гамбург К.З. Поглощение и метаболизм 2,4Д в суспензионной культуре клеток кукурузы и сои // Физиология растений. — 1980. — 27, №4. С. 746-755.

154. Шевелуха B.C. Сельскохозяйственная биотехнология. — М.: Высшая школа, 2003 340 с.

155. Шретер А. И. Лекарственная флора советского Дальнего Востока. — М.: Медицина, 1975. 328 с.

156. Эсау К. Анатомия растений. — М.: Мир, 1969. — 658 с.

157. Anderson W.C. Tissue culture propagation of red raspberries / Proc. Conf. on nursery production of fruit plants through tissue culture-application and feasibility. Beltsville Md. 1980. - P. 7-34.

158. Arzate-Fernândez A-M., Nakazaki T., Okumoto Y., Tanisaka T. Efficient callus induction and plant regeneration from filaments with anther in lily (Lilium longiflorum Thunb.) // Plant Cell Rep. 1997. - 16. - P. 836-840.

159. Aguettaz P., Paffen A., Delvallee T., Linde P., Geert J. The development of dormancy in bulblets of Lilium speciosum generated in vitro. 1. The effect of culture condition // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1990. - 22. - P. 167-172.

160. Avigud G. Sucrose and other disaccharides. / In: Locwns F.A., Tanner W. (Eds.), Encyclopedia of Plant Physiology, New Series 13 A. N.Y.: Springer. -1982.-P. 217-347.

161. Bacchetta L., Remotti P. C., Bernardini C., Saccardo F. Adventitious shoot regeneration from leaf expiants and stem nodes of Lilium // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2003. -74, № 1. - P. 37-44.

162. Bach A., Cecot A. Micropropagation of Hyacinthus orientalis cv. Carnegie in a double-phase culture medium. Effect of cytokinins on growth and development // J. Acta Hort. 1988. - 226. - P. 607- 610.

163. Bahr L. R., Compton M. E. Competence for in vitro bulblet regeneration among eight Lilium genotypes // Hort. Science. 2004. - 39, №1. - P. 127-129.

164. Benson E.E. Plant Conservation Biotechnology. London: Taylor and Francis. - 1999. -309 p.

165. Bigot C. Comparaison des aptitudes pour le bourgeonnemant de tissus superficiels et de tissus profonds cultives in vitro. CR Acad. Sci. Serie D. — 1974. -278.-P. 1027-1030.

166. Bonnier F.J.M., Van Tuyl J.M. Long term in vitro storage of lily: effects of temperature and concentration of nutrients and sucrose // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1997. - V. 49, № 2. - P. 81-87.

167. Bonnier F.J.M., Hoekstra F.A., Rie De Vos C.H., Van Tuyl J.M. Viability loss and oxidative stress in lily bulbs during long-term cold storage // Plant Sci. -1997. — V.122, № 2. — P. 133-140.

168. Booy G., Wouters T. C. A. E., Kleyn-Noordijk Y. Identification of lily cultivars using isoelectric focusing of proteins from bulb scales and tissue culture bulblets // Plant Breeding 1998. - 117 - № 1. - P. 57-62.

169. Brown P. T. H., Gobel E., Lorz H. RFLP analysis of Zea mays L. callus cultures and their regenerated plants // Theor. Appl. Genet. 1991. — 81. P. 227232.

170. Chang Chen, Chang-Tesrn Chen, Yu-Ching Tsai, Wei-Chin Chang. A tissue culture protocol for propagation of a rare plant, Lilium speciosum Thunb. var. gloriosoides Baker.// Bot. Bull. Acad. Sin. 2000. -V. 41.- 139-142.

171. Chirta V.D.S., Padmaja G. Clonal propagation of mulberry (Morus indica L. cultivar M-5) through in vitro culture of nodal explants // Sci. hort. (Neth.). — 1999. 80, №3-4. - P. 289-298.

172. Chu Chin-Ching, Wang Ching Chu et al. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources//Sci. sin. 1975. - 18, №5.-P. 659-668.

173. Chuang Ch.-Ch., Quyang T.-W. A set of potato media for wheat anther culture: Proc. sympos. on Plant Tissue Culture. Peking: Sci. Press 1978. - P. 5156.

174. De Rocher E. J., Harkins K. R. Galbraith D.W. Developmentally regulated systemic endopolyploidy in succulents with small genomes // Science. — 1990. V. 250. P. 75 -77.

175. Debergh P.C., Maene L.J. A scheme for commercial propagation of ornamental plants by tissue culture // Sci. Hort. -1981.-14, №4. P. 17-19.

176. Debergh P.C. Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium // Physiol, plant 1983. - 59, №2. - P. 270-276.

177. Endo Т., Morishima H. Шее / Isozymes in plant genetics and breeding. -Part B. Amsterdam: Elsevier, 1983. P. 129-146.

178. Evans D.A., Sharp W.R. Somaclonal variation and its application in plant breeding //Newsl. Int. Assoc. Plant Tissue Culture. 1988. - 54. - P. 2-10.

179. Fakhrai F., Evans P. Morphogenic potential of cultured explants of Crocus chrysanthus Herbert, cv. E.P.Bowles // J. Exp. Bot. V.40, № 216. - P. 47-51.

180. Fay M. Conservation of rare and endangered plants using in vitro methods И In vitro Plant Cell Dev. Biol. 1992. - 28. - P. 1-4.

181. Freeling M., Schwartz D. Genetic relationships between the multiple alcohol dehydrogenases of maize // Biochem. Genet. -1973. 8, № 1. — P. 27-36.

182. George E.F. Plant propagation by tissue culture. 1993. - P. I. — Eding-ton: Exegenics Ltd. - 574 p.

183. Gerrits M.M., De Klerk G.J. Dry-matter partitioning between bulb and leaves in plantlets of Lilium speciosum regenerated in vitro // Acta Bot. Neerl. -V.41.-P. 461-468.

184. Godo Т., Matsui K., Kida Т., Mii T. Effect of sugar type on the efficiency of plant regeneration from protoplasts isolated from shoot tip-derived meristematic nodular cell clumps of Lilium formolongi hort. // Plant Cell Reports. 1996. - 15. -P. 401-404.

185. Godt M. J. W., Hamrick J. L. Allozyme diversity in the endangered shrub Lindera meJissifolia (Lauraceae) and its Widespread congener Lindera benzoin. II Can. J. For. Res. 1996. - 26. - P. 2080-2087.

186. Goodman M.M., Stuber C.W. Maize / Isozymes in plant genetics and breeding. Part B. - Amsterdam: Elsevier, 1983. - P. 1-33.

187. Goodman M.M., Stuber C.W. Genetic identification of lines and crosses using isoenzyme electrophoresis: Proc. Ann. Corn Sorghum Res. Conf. 1980. V. 35.-P. 10-31.

188. Heuser C.W., Apps D.A. In vitro plantlet formation from flower petal explants of Hemerocallis cv. Chipper Cherry // Can. J. Bot. — 1976. V. 54. - P. 616-618.

189. Hodgkin T., Roviglioni R., De Vicente M.C., Dudnik N. Molecular methods in the conservation and use of plant genetic resources // Acta Hort. (ISHS). — 2001.-V. 546.-P. 625-628.

190. Hunter R.L., Markert C.L. Histochemical demonstration of enzymes separated by zone electrophoresis in starch gels // Science. 1957. - 28, 125(3261). -P. 1294-1295.

191. Jeong J.H., Kwon S.T. Variations of morphological characteristics of Lilium hansonii related with protein and isozyme bands. Acta Hort. (ISHS) 1996. -414. - P. 145-150 - http://www.actahort.org/books/414/41416.htm

192. Karabaev M., Shegebaev O. Cultivated cells of wheat and maize: biotechnology and breeding: Abstracts 5th International Wheat Conference (June 10-14, Turkey, Ankara). 1996. - P. 366.

193. Karp A. Somaclonal variation as a tool for crop improvement // Euphytica. -1995.-85.-P. 295-302.

194. Karp A., Kresovich S., Bhat K. V., Hodgkin T. Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies // IPGRI technical bulletin.- 1997.-2.-47 p.

195. Kedra M., Bach A. Morphogenesis of Lilium martagon L. explants in callus culture // Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 2005. — 47/1. - P. 65-73.

196. W., Enomoto K., Fukunaga Y., Kuo C. Regeneration of tepals, stamens and ovules in explants from perianth of Hyacinthus orientalis L. importance of explant age and exogenous hormones // J. Planta- 1988. -175, №4. P. 478-484.

197. W.-L. Control of in vitro regeneration of individual plant organs // Acta Botanica Sinica 2003.- 45, №12. - P. 1453-1464.

198. Marasek A., Hasterok R., Wiejacha K., Orlikowska T. Determination by GISH and FISH of hybrid status in Lilium II Hereditas. 2004. - 140, № 1. - P. 17.

199. Mateu-Andres I., Segarra-Moragues J. G. Patterns of genetic diversity in related taxa of Antirrhinum L. assessed using allozymes // Ann. Bot. 2003. - 92. -P. 647-655.

200. Matsuo E. Studies on growth and development of bulb in eastern lily (Lilium longiflorum Thunb.) // J. Japan Soc. Hortic. Sci. 1975. - 44, № 3. - P. 281.

201. May B. Starch electrophoresis of allozymes / Molecular genetic analysis of population: A practical approach. Ed. A.R. Hoelzel. N. Y.: Oxford University Press. - 1994. - P. 1-28 and 371-378.

202. Meyer M. M. In vitro propagation of Hosta sieboldiana II J. Hort. Science.- 1980. 15, №6. - P. 737-738.

203. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // J. Physiol. Plant. 1962. -15. - P. 473-497.

204. Murashige T., Nakano R. 1966. Tissue culture as a potential tool in obtaining polyploid plants // Journal of Heredity 1966. - V. 57. - P. 114-118.

205. Molecular genetic techniques for plant genetic resources: Reports of an IPGRI Workshop (9-11 October 1995 Rome, Italy), eds. Ayard W.G., Hodgkin T., Jaradat A., Rao V.R. IPGRI, 1997. - P. 137.

206. Montezuma-de-Carvalho J., Guimaraes M.L.L. Production of buds and plantlets from the stamen's filament of Lilium regale cultivated in vitro II Biologia Plantarum. 1974. - 16, № 6. - P. 472-473.

207. Niimi Y. Application of leaf-segment cultures to in vitro bulblet production of six Lilium species // Acta Bot. Neerl. 1986. - 35, №3- P. 189-194.

208. Niimi Y. In vitro propagation and post-in-vitro establishment of bulblets of Lilium japonicum Thunb.// J. Jpn. Soc. Hortic. Sci.- 1995 63, №4. - P.843-852.

209. Nitsch J.P. Growth and development in vitro of excised ovaries // Amer. J. Bot. 1951. - 38, № 7. - P. 566-577.

210. Nliut D.T. Micropropagation of lily (Lilium longiflorum) via in viti-o stem node and pseudobulblet culture // Plant Cell Rep. 1998. - 17. - 913-916.

211. Nhut D. T., Le B.Van, Tanaka M. Shoot induction and plant regeneration from receptacle tissues of Lilium longiflorum II Scientia Horticulturae. 2001. -87.-P. 131-138.

212. Nhut D.T., Bui V.L., Minh N.T., Teixeira da Silva J.A., Fukai S., Tanaka M., Tran Thanh Van K. Somatic embryogenesis through pseudobulblet transverse thin cell layers of Lilium longiflorum II Plant growth Reg. — 2002. 37. — P. 193198.

213. Okubo H. Dormancy in bulbous plants // Acta Hort. (ISHS). -1992. 325. -P. 35-42.

214. Paek K.Y., Ma S.H. In vitro propagation of hosta using cultured shoot tips and somaclonal variability of regenerants // Acta Hort. 1996. - 440. - P. 576581.

215. Parker P. G., Snow A. A., Schug M. D., Booton G. C., Fuerst P. A. What molecules can tell us about populations: choosing and using a molecular marker // Ecology. 1998 - 79, №2. - P. 361-382.

216. Pelkonen V.- P. Tissue culture as means in the production of hardy lilies // Acta Hort. 1997. - 447. - P. 665-667.

217. Pelkonen V.- P. Kauppi A. The effect of light and auxins on the regeneration of Lily {Lilium regale Wil.) cells by somatic embryogenesis and organogenesis // International Journal of Plant Sciences. 1999. -160, № 3. - P. 483-490.

218. Pelkonen V.-P. Biotechnological approaches in lily {Lilium) production. -Oulu.: Oulu University press 2005. - P. 185.

219. Pell E.J., Schlagnhaufer C.D., Arteca R.N. Ozone-induced oxidative stress: mechanism of action and reaction // Physiol. Plant. 1997. - 100. - P. 264-273.

220. Pence V.C. The application of biotechnology for the conservation of endangered plants / Plant Conservation Biotechnology, ed. Benson E.E. — Chapter 15. Taylor and Francis, London. 1999. - P. 227-241.

221. Pierik R.L.M., Steegmans H.H.M. Vegetative propagation of Freesia through the isolation of shoots in vitro // Neth. J. Agr. Sci. 1976. - 24, № 4. — P. 274 - 277.

222. Rastogi R., Sawhney V. K. In vitro development of angiosperm floral buds and organs // Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1989. - 16, №3. - P. 145-174.

223. Reisch B. 1983. Genetic variability in regenerated plants/ Handbook of Plant Cell Culture. / Eds. D.A. Evans, W.R. Sharp, P.V. Ammirato, Y. Yamada. -V. 1- N.Y.: Macmillan Co., 1983.-P. 748-769.

224. Robb S. The culture of excised tissue from bulb scales of Lilium speciosum Thunb. // J. Exp. Bot. 1957. - 8. - P. 348-352.

225. Rybczynski, J.J., Gomolinska, H. 6-benzyladenine control of the initial bulblets formation of wild lily Lilium martagon L. II Acta Hort. (ISHS). —1989. -251.-P. 183-190.

226. Siljak-Yakovlev S., Peccenini S., Muratovic E., Zoldos V., Robin O., Valle J. Chromosomal differentiation and genome size in three European mountain Lilium species // Plant Syst. Evol. 2003. - 236. - P. 165-173.

227. Simmonds J.A, Cumming B.G. Propagation of Lilium hybrids. I. Dependence of bulblet production on time of scale removal and growth substances // Sci. Hort.-1976.- 5.-P. 77-83.

228. Shin K.S., Chakrabarty D., Paek K.Y. Sprouting rate, change of carbohydrate contents and related enzymes during cold treatment of lily bulblets regenerated in vitro II Sci. Hort.- 2002. 96. - P. 195-204

229. Smities O. Zone electrophoresis in starch gels // J. Biochem. — 1955. — 61. -P. 618-629.

230. Scandalios J.G., Felder M.R. Developmental expression of alcohol dehydrogenase in maize // Develop. Biol. 1971. - V. 25, №4. - P. 641-654.

231. Schwartz D., Cardy B.J., Stuber C.W., Goodman M.M. Techniques for starch gel electrophoresis of enzymes from maize (Zea mays L.) // N. C. State Univ. Dep. Stat, mimeo. Ser. 1980. №13. - P. 17- 31.

232. Skoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro U Sympos. Soc. Exp. Biol. — 1957. — 11, №2. P. 118-131.

233. Skoog F. Aspects of growth factor interaction in morphogenesis of tobacco tissue cultures / Les cultures de tissus de plantes. Paris, 1971. -115 p.

234. Stanilova M.I., Ilcheva V.P., Zagorska N.A. Morphogenetic potential and in vitro micropropagation of endangered plant species Leucojum aestivum L. and Lilium rhodopaeum Delip. // Plant Cell Rep. 1994. - 13. - P. 451-453.

235. Stimart D.P., Ascher P.D., Wilkins H.F. Overcomming dormancy in Lilium longiflorum bulblets produced in tissue culture // J. Am. Soc. Hort. Sci. — 1982. -107.-P. 1004-1007.

236. Stimart D.P., Ascher P.D. Tissue culture of bulb-scale sections for asexual propagation of Lilium longiflorum Thunb. // J. Am. Soc. Hort. Sci. 1978. — 103. -P. 182-184.

237. Takayama S., Misawa M. A scheme for mass propagation of Lilium in vitro II Sci. Hort. 1983. - 18. - P. 353-362.

238. Tikhonova V.L., Yashina S.G. Long-Term Storage of Protected Wild Plant Seeds // Sol. Sci. Rev. Physiol Gen. Biol. 1996. - 12, P. 1-33.

239. Tran Thanh Van K.M. Control of morphogenesis in vitro cultures // Annu. Rev. Plant Physiol. 1981. - 33. - P. 291-311.

240. Tribulato A., Remotti P.C, Loffler H.J.M, van Tuyl J.M. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Lilium longiflorum Thunb. // Plant Cell Rep. -1997.- 17.-P. 113-118.

241. Valente P., Tao W., Verbelen P. Auxins and cytokinins control DNA en-doreduplication and deduplication in single cells of tobacco // Plant Sci. -1998-134.-P. 207-215.

242. Van Tuyl J. M., Boon E. Variation in DNA content in the genus Lilium II Acta Hort. 1997. - 430. - P. 829-835.

243. Van Harmelen M.J., Loffler H.J.M.,van Tuyl J.M. Somaclonal variation in lily after in vitro cultivation // Acta Hort. (ISHS) 1997. - 430. - P. 347-350 -http://www.actahoit.org/books/430/43053.htm

244. Van Aartrijk J., Blom-Barnhoorn G.J. Growth regulator requirements for adventitious regeneration from Lilium bulb-scale in vitro, in relation to duration of bulb storage and cultivar I I Sci. Hortic. 1981. - 14. - P. 261-268.

245. Varshney A., Lakshmikumaran M., Srivastava P.S., Dhawan V. Establishment of genetic fidelity of in v/7ro-raised Lilium bulblets through RAPD markers I I

246. Vitro Cellular and Development Biology-Plant. 2001. - 37, № 2. - P. 227231.

247. Verron P., Le Nard M., Cohat J. In vitro organogenic competence of different organs and tissue of Lily of the valley 'Grandiflora of Nantes' // Plant Cell Tiss. Organ. Cult. 1995. - 40 - P. 237-242.

248. Wang H., Ng T.B. Isolation of lilin, a novel arginine and glutamate-rich protein with potent antifungal and mitogenic activities from lily bulbs // Life Sci. — 2002. 70, № 9. - P. 1075-84.

249. Wawrosch C., Malla P.R. Kopp B. Clonal propagation of Lilium nepalense D. Don, a threatened medicinal plant of Nepal // Plant Cell Reports. 2001. - 20, №4.-P. 285-288.

250. Wendel J.F., Stuber C.W., Goodman M.M. Twelve new isozyme loci in maize: Progress report on chromosomal locations, the subunit composition and subcellular localization of their products // Maize Genet. Coop. News Letter. -1985.-V. 59.-P. 87-88.

251. White P. R. The cultivation of animal and plant cells. — 2nd ed. N.Y. : Ronald Press, 1963.-387 p.

252. Yahraus T., Chandra S., Legendre L., Low P.S. Evidence for a mechanically induced oxidative burst // Plant Physiol. 1995 - 109. - P. 1259-1266.

253. Yamagishi M. Effect of culture temperature on the enlargement, sugar uptake, starch accumulation, and respiration of in vitro bulblets of Lilium japonicum Thunb. // Scientia Horticulturae. 1998. - 73, № 4. - P. 239-247.