Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культура завязей кукурузы в связи с апомиксисом

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Культура завязей кукурузы в связи с апомиксисом"

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИЯСКСЛ ФЕДЕРАЦИЙ БОТАНИЧЕСКИЙ ИНСТИТЗТ ИМ. В.Л. КОМАРОВА

На правах рукописи

АЛАТОРЦЕВА Татьяна Алексеевна

КУЛЬТУРА ЗАВЯЗЕЙ КУКУРЗЗН В СВЯЗИ С АПОМИКСИСОМ

03.00.05 - ботаника

Автореферат диссертации на соискание дчёной степени кандидата биологических надк

Санкт-Петербдрг 1394

$

Работа выполнена в Отделе генетики и цитологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Черныиевского

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Тнрнов B.C. доктор биологических наук, профессор Терёхин Э.С. доктор Фармацевтических наук Николаева Л.А. Всероссийский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова

Защита диссертации состоится "23" ноября 1994г. в "14 " часов на заседании специализированного совета К 002.46.01 по защите диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук при Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН по адресу : 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова. 2 (зал Учёного совета).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН.

Автореферат разослан " ДX)" октября 1994г.

Ячённй секретарь специализированного совета

О.С. Едина

- 3 -

ОБШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТИ

Актуальность темы.Среди различных способов размножения особое внимание многих биологов и селекционеров привлекает апоииксис. Это объясняется с тем, что проблема тесно переплетается с многими другими обчебиологическими проблемами, такими как эволпция полового размножения. рекомбиногенез, иейоз. Апомиксис тесно связан с гаплоидией, полиплоидией, андрогенезои, полизмбрионией, сеыигами-ей.Важнейней является проблема покоя гаиет и перехода их к морфогенезу. Следовательно, исследование апомиксиса способствует реве-нив многих важнейзих вопросов.

Считается перспективным использование апомиксиса в селекции. При этом возможно закрепление гетерозиса и других уникальных свойств гибридов.создание линий с цитоплазматической мужской сте-рильностьп, размножение семенами сложных гибридов, полиплоидов. Однако, проблема апомиксиса далека е^З до своего полного понимания и реиения.

Бплыгинство возделываемых основных культур (пяеница, роаь, рис, кукуруза, картофель, томаты и др.) размножается половым путём (Петров, 1988; Хохлов,1970), поэтому актуальным остаётся вопрос о создании коллекции разных видов с апоииктичныа способом размножения или хотя бн с наличием его элементов.

Среди разных подходов к получении апомиктичных форм заслуживает внимания культура тканей и клеток In vitro, особенно культура неоплодотворёшшх завязей и семяпочек. Имевтся основания предполагать, что у апомиктичных форм регенерация может осуцест-вляться легче, чем у половых форм. Зта идея заслуживает экспериментальной проверки. Кроме того in vitro можно сохранять и размножать полученные ценные генотипы.

Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы заклЕчалась в изучении специфики поведения неопылённых завязей кукурузы в культуре in vitro в связи с проблемой апомиксиса.

В задачи работы входило:

1. Провести сравнительнуп оценку развития семяпочек in vitro апомиктичных к амфимиктичных линий:

а) изучить пути реализации партеногенетического развития in vitro;

б) изучить цитологические особенности эмбриональных процессов я морфогенеза in vitro и in vivo.

2. Выявить ведудие факторы, влиящие на эмбриональные процессы в изолированных завязях.

3. Изучить пути и особенности получения регенерантов апомиктичных линий.

4. Оценить перспективы использования культуры неоплодотворён-ных завязей для выявления апокиксиса.

Научная новизна работы. Впервые проведена сравнительная оценка культивируемых in vitro завязей кукурузы амфк-апокиктичных линий. Остановлено:

- для возникновения прозмбрио у партеногенетических форм необходим минимум компонентов экзогенного питания; это может быть использовано для диагностики способов размножения и отбора апо-миктов;

- определён состав селективных сред, пригодных для возникновения, обнаружения и дорамивания апомиктичных зародыией и одновременно ведумих к гибели завязей амфимиктов.

Впервые проведено цитоэмбриологическое исследование завязей апомиктичной линии кукурузы in vitro. Зстановлено:

- основной способ формирования жизнеспособного зародыва -партеногенез;

- обнаружены случаи параллельного н альтернативного делений яйцеклеток, синергид, центральной клеток (партеногенез, апогаме-тня, эндоспермогенез, полиэмбриония):

- выявлены два пути получения in vitro апомиктичного потомства: прямой эмбриогенез и регенерация из эмбриоидов, возник-вих от ткани материнского зародыша (последний перспективен для массовой репродукции гаплоидных апомиктичных растений):

- выявлена негативная роль развивавдегося эндосперма на жизнеспособность зародыжей in vitro.

Впервые проведено сравнение процессов в женских гаиетофитах in vivo и in vitro, выявлено их сходство и различие.

Наячно-поактическое значение работы. Показана возможность (впервые для кукурузы) выявления и отбора апомиктичных форм с использованием культуры неопылённых завязей.

Выявлены условия получения многочисленного апомиктичного потомства путём клонирования эмбриоидов.

Полученная информация может быть использована исследователями, работавшими в области репродуктивной биологии , апомиксиса, селекция.

На зациту выносятся следудцие основные поло!ения.

1. Возможность реализации наследственно обусловленных предпосылок к апоииксису в кдльтуре неоплодотворённых завязей.

2. Использование техники in vitro для разннозеиня апониктич-ных гаплоидных растений.

3. Возможность культуры In vitro для диагностики апокиксиса.

Апробация работы. Основные положения диссертации были

представлены на Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988); II Неадднародной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алиа-Ата, 1989): II Всесопзноя совецанни "Генетика развития" (Тапкент. 1990); IU Всесонзной научной конференции "Экологическая генетика (Киаинёв, 1991); XIII йеядународнои конгрессе EUCARPIA (Франция, 1992); XI Мегдународном сиипознуие "Эмбриология и сеиенное размноаение" (Ленинград, 1990); Меадународноы сиы-позиуие "Апомикис у растений" (Саратов, 1994).

Публикации. По иатериалаи диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заклвчения, выводов и списка литературы. Работа изло!°на на 133 страницах маяинописного текста н вклнчает 8 таблиц, 10 таблиц иллистраций и 9 таблиц микрофотографий. Список литературы содержит 228 наименований на русском и иностранном языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРШИЕ РЙБОТН Материал н нетоды исследования

В качестве объектов исследования были выбраны линии кукурузы, размножавшиеся половин путём и с эленентаыи аполикснса.

АТ-1 - линия полдчена в лаборатории генетики и цитологии СГЗ. Встречаекость д неё гаплоидного партеногенеза иоает достигать 100Z и автоноаного эндоспермогенеза - не кенее 50Z (Тнрнов, Ена-леева, 1983).

Амсиыкктячнне форнн: ТИ - Тестер Йангельсдорфа, линия, наркн-рованная по десяти хроиосоыан; ГПЛ-1, ГПЛ-14. ГПЛ-52, ГПЛ-63. ГПЛ-76 - линии гаплоидного происхождения; 33, 3MIg. ЗМС. KM, KMC - инбредные линии, генетические маркёра. АТ-1*ТМ, АТ-1ХГШ1-52, АТ-1ХКМС - иежлинейнае гибриды F1.

Растенкя-донорн выращивали в поле. Початки до появления рылец (пестичных нитей) закрывали пергаментными изоляторами. В определённое время после появления рылец, от 1 до 17 суток (возраст завязи), в зависимости от требований опыта, початки срезали. Соцветие стерилизовали (без листьев обёртки и пестичных нитей) в течение 10 секунд в растворе 70Z этилового спирта и 7 кинут в растворе натриевой соли зтилмеркуртиосалициловой кислоты (50 ur/л). В асептических условиях завязи срезали со стергня початка и поиеца-ли в стеклянные пробирки с 3 мл питательной среды по три в каадуп пробирку срезом вниз. Пробирки закрывали ватно-марлевыаи пробкани и содервали в темноте при температуре 25°С .

Питательная среда вкличала макро- и микроэлементы по Нурасмге и Скугу, вкташшн Blt ВРР. С, иезоинозит, а такие агар-агар, сахарозу . До автоклавирования рН составлял 5.8-6,1.

Анализ завязей проводили с использованием кнкроскопа М5С-2. Новообразования, обнаруженные в полости завязи, пересаживали на среду, содераащув фитогорноны, соответствующие целям пересадки (состав среди, периодичность фиксации. возраст зкепланта представлена в соответствуодем разделе).

Перед посадкой часть завязей фиксировали в ацеталкоголе (1:3) для уточнения стадии развития зародьшевого кевка.

В процессе культивирования проводили темпоральную фиксация эксплантированных завязей со средн. Для анализа применялся иетод Ферментативной мацерации и выделения зародыаевых меиков (Куприянов, 1982), а такве метод приготовления постоянных иикротоиных препаратов (Паувева. 1970). Анализ препаратов и их фотографирование проводилось на иикроскопе "Zetopan" при увеличении объектива 10Х: 40Х. Рисунки зароднвевых мевков сделаны с поаоцьв рисовального аппарата РА-4. Математическуи обработку материала производили с известными рекомендациями (Рокицкий, 1973: Зайцев, 1930).

Определение роли некоторых факторов в развитии неопылённых завязей in vitro

Влияние состава питательной среди на эмбриогенез. Для эксплантации использовали пятисуточные завязи линий АТ-1. ГПЛ-1, ГПД-14. ГПД-63, ГПЛ-76, ТМ: ЗУ 1g.

При подборе ингредиентов среды был учтён опыт работы пред-вественннков (Truong-Andre. Desarly, 1984), но испытаны близкие к

другие варианты. Использовано девять пропорцйй сахарозы и 2,4-Д. пять различных концентраций этого ауксина, при постоянном количестве сахарозы и семи концентраций сахарозы прй постоянной количестве 2.4-Д, всего 16 сочетаний (табл.1).

Таблица 1

Изменение частоты эмбриогенеза в зависимости от состава питательной среды в завязях линии йТ-1

Концентрация 2.4-Д.иг/л 0 0.2 2.0

сахарозы.Z 1 5 9 1 5 9 1 5 9

0 9.2 7.8 3.6 12,2 7.6 3,1 9.0 14.9

Концентрация 2,4-Д, нг/л (сахароза 9Z)

0.25

0.5

1.0

2.0

U) 3.2 4,7 3.2 4.4 3.7

Концентрация сахарозы. X. (при 2,0аг/л 2,4-Д)

0 1.0 3.0 5.0 7.0 9.0 11.0

U) 0 2,4 2,4 4,2 2.8 S.7 3.7

0

(«) - частота эмбриогенеза, Z

Внимание было сосредоточено на двух компонентах средн. сахарозе а 2.4-Д по следуЕцна причинам.

2,4-Д - наиболее употребляеаый ауксин, используемый В культуре In vitro для неопылбнных завязей и молодых знготических зародышей разных видов растений, в том числе и для кукурузы.

Сахароза - ваанейвий транспортируемый углевод. Ее концентрация в клетках сказывается на скорости метаболических процессов.

- 8 -

играет сусественнув роль в морфогенезе.

Известно,что в индуцирувцей среде уровень сахарозы требуется несколько выве, чем в последущих пассажах, но имевтся н исклвче-ния. Для неопылённых завязей кукурузы описаны оба случая (Truong-Andre, Detarly. 1984: Huang et al., 1991). При дорачива-ник зиготических зародыжей применяется питательная среда, содержащая 2.4-Д - 2,0 кг/л и сахарозу - 1.0-3,t)Z. Поэтому дополнительно к испытании 16 вариантов питательной среды, вклвчаввих разные соотножения ауксина и углевода проведено изучение эффективности снижения концентрации сахарозы в процессе культивирования.

Оценка итогов культивирования при разных концентрациях сахарозы (табл.1) показала, что несмотря на высокую частоту эмбриогенеза при 0,2 нг/я 2.4-Д и 9Z сахарозы, максимальный результат бнл получен на варианте среды с 9.02 сахарозы и 2,0 мг/л 2,4-Д. Неходя из этого в следувцек опыте экспланты выдергивали на исходной среде, содервавей 9.0Z сахарозн и 2,0 мг/л 2,4-Д в течение ?,14,21,28.35,45,55. 65 суток. Затем их переносили на свежую среду, с количеством сахарозы, уыеньвенным до 2,02 (табл.2).

Таблица 2

Частота эмбриогенеза в зависимости от длительности выдерживания завязей линии АТ-1 на исходной среде (2мг/л 2,4-Д н 9Z сахарозн)

Длительность культивирования на исходной среде, сутки

? 14 21 28 35 45 55 65

U) 0 4,8 2,1 2,5 6.1 3.9 5.1 2.6

(*) - частота эмбриогенеза, Z

Частота эмбриогенеза оценивалась после вскрытия завязей спустя 2,5 месяца от начала культивирования по количеству завязей с новообразованиями, которые представляли сэбой комплексы эмбри-оидов (клоны) или отдельные зародыии.

Остановлено, что поведение завязей ano- и амфимиктичных доноров резко отличается друг от друга. Экспланты половых ©opa

(ГП/1-1, ГПЛ-14, ГПЛ-63, ГПЛ-76, ТМ и 3Hig), культивируеаых в тех ве количествах, стабильно некротизировали на всех испытанных вариантах среды, в тон числе при снижении концентрации сахароза.

Для завязей апоннктичной линии АТ-1 при тех ае условиях было характерно константное проявление эмбриогенеза. Выход эябрнокдннх клонов, способных к регенерации, полученных от завязей, первоначально культивируемых в течение 14,35,65 суток на среде с высокой концентрацией сахарозы (9,02), составлял 1,9: 1,0: 1,32, соответственно. при этой названные результаты не ииели нехзщ собой значимых различий. Негативный эффект углеводного голодания сказывался на развитии эксплантов только на Оезгорноналынзй среде при концентрации сахароз« 1.0Х иди при резкой снивении количества этого углевода в 4,5 раза ( с 9.02 до 2.0Z) спустя ? суток от ао-аента инокуляции (табл.2). В этих случаях недостаток сахароза приводил к полной дегенерации завязей. Присутствие сахароза о ан-ниаально достаточное количестве особенно ваано на первнх этапах культивирования, в период адаптации завязей к условиям in vitro. Соблпдение этого требования обеспечивает успех культивирования завязей даве на безгориональной среде.

Установлено, что горнононезависмиое проявление партеногенеза in vitro характерно исклвчнтельно для завязей допоров с наследственной предрасположенностьп к апоаиксйсу.

Предпочтительное количественное соотновение ауксина и сахарозы зависит от задач опыта. Нааи определены:

а) минимально достаточные концентрации этих веществ, обеспечивавшие удовлетворительное состояние зародыяа in vitro ti,ÜZ сахарозы и 0.2 мг/л 2,4-Д);

б) наиболее благоприятные для развития апоииктичного зародйза и получения гаплоидных регенерантов даге в исходном ¡тассаае С5,0 и 9.0Z сахарозы и 0.2 и 2.0 мг/Л 2.4-Д» соответственна):

в) количество сахароза (5,0-^,0%), при котором развявааъяйсз зародив не теряет жизнеспособности и в отсутствии горйонов.

Такиа образом, в связи с наличнен у донорных растений линий АТ-1 наследственной тенденции к автоноиноиу развития, роль питательной среды в данной случае сводится не к индукции партеногенеза. а к поддерваниа нораадьной зизнедеятельности гаплоидного про-эмбрио.

Возоаст завязей. Известна высказывания, что к ноаенту эксплантации зародывевый меяок долаен быть в достаточной степени

зрелым, дифференцированным. Это касается и кукурузы ( fio et al.. 1982; Truong-Andre, Deiarly: 1984; Huang et al.. 1991). Гибридные зародыви этого вида, способны к доразвитию и дифференциации in vitro только в определённые сроки после опыления (lían Ьаваегеп. 1988; Kunert. Kimert. 1989).

Были исследованы завязи разных возрастов, начиная с одних суток и далее через два дня: 1,3,5,7,9.11,13.15,1? суток. Эксперимент проводили на питательной среде, дополненной сахарозой C9.0Z) и 2,4-Д (2,0 мг/л). Завязи анализировали при вскрытии их спустя 2,5 месяца культивирования.

Установлено, что завязи линий, не склонных к апониксису (ГПЛ-1, ГШ1-14, ГПЛ-63. ГПЛ-76, ТМ. 3Mig), дегенерировали не дав новообразований.

9 линии АТ-1 получены иные результаты. Сравнительный анализ трёх лет исследования (рис. 1) позволил выявить значительные колебания уровня частоты завязей, имевших эмбриональные структуры.

И год 1988

III год 1990

I 3 S7 9 15 возраст, ct/mnu

1 3 $ 7 911 1315 П

Рис.1.Изменение частоты эмбриогенеза in vitro в завязях разного возраста линии АТ-1.

9 одновозрастных завязей варьировали год от года величины максимальных и минимальных частот эмбриогенеза. В течении трёх сезонов наблвдалось смешение этих величин в сторону то более молодых, то более зрелых завязей. Однако, отм<;чена ежегодная стабильная тенденция к увеличенив количества завязей с апоыиктичньшн зародывами при увеличении возраста до определенного предела в момент инокуляции и затем последующее снижение их числа при культи-

вировании старепаих завязей.

При увеличении вариантов с разннмя возрастает завязей кривая зависимости на графике из й-образной превратилась в 3-образнуа. Удалось определить благоприятные сроки для эксплантация завязей н критические, неблагоприятные, находязиеся иа»ду двумя дзуая ааксинумаии. Критический неблагоприятный возраст возет быть объяснён несннхронностьн развития завязей на початке. К определёнпо-ау сроку число перезреваих завязей превыаает количество завязей, досткгвкх возраста адаптации, что вызывает иизкув частоту появления зародывей. Позднее при изменении соотновения старых и зрелых {адаптирующихся) в пользу последних, количество завязей, способных продуцировать зародызи, аизнеспосабные in vitro, возрастает.

Наиболее благоприятным является возраст, близкий к семи суткам. Однако, для выбора сроков эксплантации следует соблздать поправку в 1-2 суток, с учётом погодных условий, ускоряваих или заиедлясцих темпы развития генеративной сферы.

Роль способа разнновения доноров. Бали испытаны линии АТ-1. три её гибрида F1 с аыфнаиктичными линиями: АТ-1ХГП/1-52, ЙТ-1ХТЙ. АТ-1ХКМС и три контрольные линии: ГПЗ-52. Т8. KUC. Завязи отбирала спуся 3 а 10 суток после появления рылец. Нспольздемая питательная срсда для культиварованиа била дополнена 9.0Z сахарозы и 2.0 »г/л 2.4-Д.

При рассечения завязей спустя 1,5-2 аесаца выявлено различие в поведении эксплантоз. взятых от доноров с разным способом раэи-нозекиз (табл.3).

Таблица 3

Реакция завязей разных фора кукурдзы при культивировании in vitro

Генотнпнческае АТ- -IX АТ- -IX АТ- -IX

Оорын АТ- -1 ТИ ГПЛ-52 КЙС тм ГПЛ-52 кас

Возраст 3 10 3 10 3 10 3 10 3 10 3 10 3 10

завязей, сутка

Эмбриогенез + + + - + + +

(+) наличие, (-) отсутствие данного признака.

Завязи контрольных амфнмиктичних линий дегенерировали спустя 3-7 суток культивирования. В то же время в завязях партеногенети-ческой линии AT-1 н её гибридов с амфимиктичными линиями (ñT-lx ГПЯ-52: AT-1*ТИ: АТхКМС), было отмечено наличие зибриогенеза. Установлено, что признак автономного партеногенетического развития зародыва наследуется в гибридном потомстве и проявляется в условиях In vitro (хотя н с более низкой частотой, чем у чистой линии йТ-1).

Различие в реакции неопылённых завязей кукурузы от форм с разным способом размножения показало, что именно способ размножения доноров, их генотипические особенности определяет морфогенез в культуре завязей in vitro.

Цитозмбриологическая характеристика завязей In vivo и in vitro

Завязи линии АТ-1 и линий ГГМ-1. ГПЛ-14. ГПЙ-52, ГПЛ-63, ГПЛ-7В» ЗН. 3HÍS. ЗИС. К*. KMC спустя 3. ?. 14. 21 сутки с момента поведения на искусственнуи питательную среду извлекали из пробирок и фиксировали в ацеталкоголе (1:3). Были исследованы завязи различных возрастов - от комента появления рылец до 15 суток.

Отмечено полное отсутствие признаков деления в клетках макро-гаиетофита амфимиктичных линий. Используемая питательная среда фактически не только не способствовала продление жизни завязей без опыления, а скорее наоборот, ингибировала их развитие. В течение первых 7 суток культивирования зародышевые мевки дегенерировали.

Эмбриогенез и состояние яйцевого аппарата линии ЙТ-1. 9ста-новлено. что процессы их возникновения in situ и In vitro идут на ранних стадиях аналогично. Начало автономного деления яйцеклетки без опыления приходится на 8-10 суток от момента появления пестичных нитей на материнском растении, вкличая время нахождения завязей на питательной среде in vitro.

Яйцеклетка делится поперечной перегородкой к оси зародыаевого мевка, давая две дочерние клетки. Затем одна или обе (чаде апикальная) клетки делятся продольно с образованием 3-4-клеточного зародыва. Последующие деления проходят в разных плоскостях. При продольном заложении ыеаклеточной перегородки при первом делении яйцеклетки две дочерние клетки могут функционировать как самосто-

ятельные инициал« зароднней. Подобные картины характерны для данной линии в естественных условиях (Тырнов, Еналеева, 1983). Яйцевой аппарат зароданевых мевков линии flT-l нояет вклнчатъ иногда дазе две-три яйцеклетки. В некоторых завязях обнаруаены пролнфе-рационные процессы и в синергидах. которые приводят к образованна не глобулярных зародывевых структур, а образованиям каллусного типа. Способностью к дальнейаему развитии In vH.ro обладапт только зародывн из яйцеклеток, это касается и полнэнбрнонни.

Зндоспермогенез tn vivo и in vitro. Исследованы зародыаевые незки 1-17-суточннх завязей. Замечено, что в момент появления рылец из початка и в течение ецё 3-5 суток в условиях in vivo и in vitro зароднзевые меаки сохраняпт нормальное строение. Центральная клетка при этом имеет два полярных ядра, не проявляя признаков деления. Б отдельных аномальных случаях число полярных ядер иояет быть больае двух, иногда дазе 3-5.что не является признаков эндоспериогенеза.

Слияние двух полярных ядер и деление центральной клетки отмечено in situ в 7-суточных завязях. Аналогичные процессы in vitro происходят в возрасте завязей 8-15 суток. Но в 17-18-суточных завязях эндосперм моает быть аногоядерным. In vivo и in vitro аехк-леточные перегородки не закладывался, хота в отдельных завязях отмечены фрагменты как ядерного, так и клеточного эндосперма.

Число ядер эндосперма редко равняется числу клеток прозабрио, К моменту слияния полярных ядер зародыа асает иметь 20-80 клеток. При двухъядерноы эндосперме - 8 - 100 клеток. Соотноаение процессов забрио- и эндоспериогенеза не соответствует таковым у кукурузы при половом размнозении (Зверванская и др.,1975).

В условиях культуры in vitro затормоаенное образование эндосперма, безусловно связанное с его анональностьп, не проходит бесследно и для развивавшегося апомнктичного проэабрио.

Взаимодействие эндосперма и зародына. Эндосперм, при визуальном рассмотрении представляшзий собой велеподйбнай полупрозрачный сгусток (размером 2.0-2,5мм). аоано было обнаруаить в полости завязи вместе с зародывем или без него. Частота встречаемости завязей с эндоспермогенезоа варьирует в зависимости от початиа от 1.3 до 25,32 .в той числе завязей с эндоспермом без зародыаа - от 0 до 18.22 и одновременно с эндоспермом н зародывем - от 0,7 до 8.8%.

Замечено, что аномальный эндосперм при этом находится сбоку

от зародывевого образованна или слегка обволакивает его. Такой зародив далее глобулярной стадии или стадии формирования змбри-оидных бугорков не развивается. Пересадка на свевув среду не способствует росту. Вызвать прорастание зародывей или репродукции эмбриоидов не удаётся. Развитие апомиктичных зародывей происходило только при отсутствии в зародывевои невке эндоспермогенеза. Не было отмечено ни одного случая завервения эмбриогенеза или образования эмбриоидов при наличии в завязях эндосперма.

Основная причина аномальности эндосперма связана с его диплоидной. либо, в случае отсутствия слияния полярных ядер гаплоидной природой, поскольку для многих видов, включая кукурузу, показано, что полноценное развитие эндосперма возможно липь при плоидности кратной трём (Еналеева, Тырнов, 1994; Lin, 1977).

Остановлено, что наличие дефектного эндосперма в неопилённых завязях кукурузы не является положительным фактором для формирования апомиктичного прозмбрио и регенерации в условиях культуры in vitro.

Особенности развития партеногенетического зародыва in vitro. Показано, что при отсутствии эндосперма процесс эмбриогенеза in vitro может идти по одному из двух направлений: путём непосредственного прорастания зародыва, начинавшимся с появления зародывевого коревка и колеоптиле и приводящее к образованна растеньиц гаплоидного происхождения или путём регенерации из эмбриоидов, образующихся при почковании от ткани материнского зародыва.

Морфогенез в первом случае заметно заторможен. Появлением корейка и колеоптиля морфогенез нередко заканчивался, хотя иногда можно было наблвдать регенерации целых растений. При этом была заметна редукция этапов дифференциации зародыва. в чём проявлялось его некоторое сходство с развитием растений-паразитов без эндосперма.

Возможно, присутствие в среде ауксина 2.4-Д провоцирует активное образование эмбриоидов и блокирует формирование растений путём прямого эмбриогенеза.

Процесс возникновения эмбриоидов проходит подобно соматическому эмбриоидогенезу. характерному для культуры зиготических зародывей многих злаков, таких как кукуруза, овёс, ячмень, роеь. пненица. просо, сорго (Lupotto. Lusardi. 1988: Dan Laaseren, 1988: Schutze, 1988: Зльконнн, Тырнов. 1990: Eolubev, Ishln.

1990: Ilchukov et aL. 1990: Ryschka et al., 1991: Ha, Liang. 1985; Rengel, 198?) и обнаруяеннын y Peonía anoaala на интактннх растениях In situ (Зковлев, Иоффе, 195?; Батыгнна,Бутенко,1981).

На полагаем, что инициалами глухат отдельные клетки субзпи-дераального слоя зародыза, делящиеся периклннально, затен в разных плоскостях. Образоваваиеся клеточиие каипяексн видедяятся на поверхности в виде бугорка и далее в виде хороао занетной округлой или овальной структуры. Синхронное деление больного числа иницналей приводит к появления кчозества знбркоидов, покрывавших вез поверхность аатерннского зародква. При этоа зибриоидн либо прорастаят. либо отпочковнвавт новые поколения зыбриоидов . то есть дапт начало клонаи эибриоидов. Установлено, что от иоиента появления пестичных нитей in vivo до репродукции молодых эибриоидов долзно'пройти приблизительно три - четыре недели.

Периодическая, по мере необходимости пересадка эибриоидоген-ннх коиплексов ОГК) на свезуп пктательнуп среду MS. содерзащуя 2.07. сахарозы и 2,0 нг/л 2.4-Д, позволает поддераивать длительное вреня культуру регенерационноспособнах забриондогеннах ятаымов. Интенсивное прорастание эибриоидов к укоренение регенерантов происходит. ча среде, содергадей внесто 2,4-Д - ЙУК и кинетин в равных количествах ( по 1 иг/л).

й наяих опытах больяинство регенерантов были хлорофилльныии, альбиносы встречались редко (около 6Z).

Цитологический анализ показал, что у зелёных растений-регене-рантов больяинство клеток в апикальной зоне корней являотся гап-лоидньши, хотя наряду с ними встречались отдельные клетки с диплоидным набором хромосон.Наличие отдельных диплоидных клеток свидетельствовало о спонтанной диплоидизации на однон нз этапов онтогенеза растений-регенерантов.

Заклпчение

Апоцнкснс и культура тканей - два крупных самостоятельных направления в биологии. Как известно, очень часто ныенно на стыке, разных дисциплин аоано получить новуп иноораацип.

Назн'данные показали, что культура in vitro в связи с проблемой апониксиса аоает использоваться в разных направлениях:

1) как аодель репродуктивных явлений и процессов;

2) для сохранения уникальных генотипов с злеыентани ano-

киксиса, путем создания «таммов от первичных зародымей или от тканей регенерантов;

3) для клонирования апомкктов, путём почкования эмбриоидов. что ведёт к единовременному получении многочисленного потомства и тем самым увеличивает вероятность сохранения выявленных единичных экземпляров;

4) для диплоидизации, если исходными апомиктами являются пар-теногенетические гаплоидн: поскольку апомиксис чаче встречается среди полиплоидных видов, не исключено, что культуру in vitro будет целесообразно использовать и для перевода диплоидов на более высокий уровень плоидности;

5) как метод диагностики и отбора апомиктичных форм.

Литературные данные, прямо (хотя и в немногочисленных случаях) или косвенно подтверждавт правомочность такого заклвчения.

3 специалистов, работавших в области культуры тканей, часто дискуссионным был вопрос 'генотип-среда", что важнее из них для получения регенерантов in vitro, является ли отрицательные результаты только ливь следствием неудачного подбора нужных компонентов в питательной среде. В конечном итоге чаче признается роль обоих факторов. Вместе с тем, если роль среды достаточно ясна, то конкретные явления, механизмы, факторы, стоячие за понятием "генотип", в данном случае, не наполнены ни каким содержанием.

Навн данные показывает, что по крайней мере одним из механизмов "генотипически обусловленной регенерации" мо&ет быть апомиксис. Точнее следует говорить о корреляционных связях апо-миксиса и регенерации, так как генетически детерминирован апомиксис, и для гамет, переключенных на программу морфогенеза, среда играет в значительной мере лнаь инкубирувщув роль.

С другой стороны такая корреляция позволяет среди регенерантов, полученных в культуре неоплодотворенная завязей, отбирать апомикты. особенно на обеднённых средах, не способствуем морфогенезу -у обычных половых форм.

Ны надеемся . что такой подход окажется плодотворным для выявления апомиктов те только для кукурузы , но и для многих других видов.

Выводы

1. При изучении неопылённых завязей кукурузы in vitro выявлены значительные различия в реакции ano- и амфимиктичных линий. У первых наблюдался автономный эмбрио- и зндоспермогенез, у вторых - дегенерация макрогаметофита. Генотип доноров (наличие предпосылок к апомиксису) является ведущим фактором, определявшим появление пролиферационных процессов в клетках зародыяевого менка изолированных завазей.

2. Испытанные варианты питательной среды не оказывают индуци-рувцего воздействия на макрогаыетофит амфимиктичных линий кукурузы. Роль среды дла апомиктичных форм сводится к обеспечению элементами питания автономно развивающийся гаплоидный зародыа.

3. Цитоэыбриологически обнаружены случаи партеногенеза, апо-гаметии, полизмбрионии. автономного зндосперыогенеза. Однако, основной путь формирования жизнеспособных зародыяей - партеногенез.

4. Вчявлены два пути получения апоыикгичного потомства: прямой эмбриогенез и регенерация из змбриоидов, возникяих от материнского зародыяа (последний перспективен для массовой репродукции апомиктичных растений).

5. Сравнение процессов в женском гаметофите партеногенети-ческих фора in vivo и in vitro показало следувцсе:

а) развитие зародыяей в обоих случаях идёт до глобулярной стадии:

б) далее in vivo наступает дегенерация, in vitro - прорастание зародыяей или почкование змбриоидов ( в трёх-четырёхнедельных завязях, включая время культивирования).

6. Регенерация растений осуществляется в отсутствии эндосперма. При наличии последнего ингибируется процесс дифференциации зародыаа и воспроизводство змбриоидов. Следовательно, присутствие эндосперма в неопылённых завязях не является положительным фактором.

7. Возникновение in vitro зародыяей и регенерантов у партено-генетических форм при одновременной гибели завязей у амфимиктов может быть использовано для диагностики и отбора апомиктов.

- 18 -

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Алаторцева Т.ft., Тырнов B.C. Морфогенез и регенерация растений в культуре неплодотворённых завязей кукурузы // Биология культивируемых клеток и биотехнология": Тез. докл. Междунар. конф.- Новосибирск. 1988. - 4.2. - С. 201.

2. Алаторцева Т.ft., Тырнов B.C. Использование техники In vitro для дорацивания прозмбрио при редуцированном партеногенезе У кукурузы //Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тр. II Междунар. конф.- Алма-Ата. 1989. - С.139.

3.Тыонов B.C.. Алаторцева Т.Д. Культура завязей кукурузы in vitro как модельная система для изучения партеногенеза // Генетика развития: Тез. докл. II Всесовзн. совек. - Тавкент, 1990. -Т.1, 4.2. - С.164-166.

4. Алаторцева Т.А. Проявление гаплоидного партеногенеза в культуре неопылённых завязей кукурузы // Экологическая генетика растений, животных, человека: Тез. докл. IV Всесовзн. научн. конф. - Кижинёв: Мтиинца, 1991. - С.356.

5. Alatortseva Т.Д.. Tyrnov U.S. , Sukhanov U.M. Peculiarities of developaent in vitro of unfertilized ovaries of ■aize apoiictic line // Eabryology and seed reproduction:Proc. XI Int. Syep., Leningrad. USSR,1990. - St. Peterburg: Hauka. 1992 -P.29-30.

6. Alatortseva Т.Д., Tyrnov U.S. In vitro culture of ovaries of partknogenetic Baize line // Reproductive biology and plant breeding: XIII EUCARPIA Congr. - 1992. - P. 329-330.

?. Alatortseva T.A.. Makarov U.U., Tyrnov U.S. The effect of pre-treataent of apoiictic laize line ears by aapicillin thrihydrate on eibryogenesis in vitro // Trends in Plant Biotechnology: II Syip. - Puschino. 1993.- P.341.

8. Alatortseva Т.Д., Tyrnov U.S. The use of culture in vitro for identification apoafctic fore // Trends in Plant Biotechnology: II Syep. - Puschino,1993.- P.342.

9. Алаторцева Т.Д., Тырнов B.C. Сравнительное изучение развития неопылённых завязей апо- и амфимиктичных линий кукурузы in vitro // Апомиксис у растений: состояние проблемы и перспективы исследований: Тр. Междунар. симп. - Саратов. 1994. - С.8-9.