Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетический контроль апомиксиса у кукурузно-трипсакумных гибридов

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетический контроль апомиксиса у кукурузно-трипсакумных гибридов"

На правах рукописи

Белова Ирина Васильевна

Цитогенетический контроль апомиксиса у кукурузно-трипсакумных гибридов

03.02.07 - генетика

1 7 НОЯ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2011

005002536

Работа выполнена в лаборатории цитологии и аиомиксиса растений Учрежден! Российской академии наук Института цитологии и генетики и Институ химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Соколов Виктор Андреевич Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Коновалов Александр Алексеевич Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор сельскохозяйственных наук, професс Осипова Галина Михайловна

ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт кормов Россельхозакадемии, п. Краснообск

Ведущее учреждение: Саратовский государственный

университет им. Н.Г. Чернышевского, г. Саратов

Защита диссертации состоится » HOj'bpA 2011 г. на утреннем заседай диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание учен степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зс института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10, т. (383)363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии генетики СО РАН.

Автореферат разослан « X ^» ОКТл'ЪР ?. 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность.

Апомиксис или бесполосеменное размножение является генетически нтролируемым репродуктивным процессом, в результате которого развитие одышей происходит из диплоидных материнских клеток без оплодотворения, ким образом, получаемое потомство является абсолютной копией теринского организма. За последние два десятилетия интерес к этому явлению мире, судя по числу научных коллективов занимающихся им, вырос огократно. Апомиксис привлекателен тем, что с его помощью можно реплять ценные количественные признаки и поддерживать их теоретически конечно долго. Это позволит ускорить создание сортов, устойчивых к езням и вовлечь в гибридную селекцию все культурные растения без аничения [Koltunow et al., 1995; Vielle-Calzada et al., 1996; Kindiger, Sokolov, 97; Grossnikiaus et al., 1998; Bicknell, Koltunow, 2004; Savidan, 2000, 2007]. репление гетерозиса через семенное размножение при использовании миксиса позволит упростить коммерческое гибридное семеноводство и изить затраты как у семенных, так и вегетативно размножающихся культур арпеченко, 1935; Петров, 1957, 1964; Hanna, Bashaw, 1987; Berthaud, 2001]. В лаборатории цитологии и апомиксиса растений Биологического института АН СССР впервые в мире апомиксис был передан межвидовому гибриду при ещивании кукурузы с ее диким сородичем Tripsacum dactyloides L. г=Ах=12). Настоящая диссертация представляет часть многосторонней следовательской работы, проводимой в. лаборатории цитологии и апомиксиса тений Института химической биологии и фундаментальной медицины СО Н, и излагает результаты изучения цитогенетического контроля апомиксиса и которые закономерности цитологического и эмбриологического поведения курузно-трипсакумных гибридов с различным соотношением родительских юмов. Цель исследования:

Настоящая работа посвящена изучению цитогенетического контроля и рактера экспрессии генов апомиксиса у гибридов Zea mays х Т. dactyloides L. Задачи исследования:

1. Провести цитологический анализ коллекции кукурузно-трипсакумных бридов, имевшейся в лаборатории к 1993 г.

2. Изучить у них тип эмбриологического развития зародышевых мешков.

3. Оценить число генов, контролирующих бесполосеменное размножение.

4. Выявить минимальное число и определить роль отдельных хромосом ипсакума в цитогенетическом контроле апомиксиса у его гибридов с курузой.

5. Изучить особенности Вш и В1Ггибридизации и ее роль в поддержан генетического разнообразия у апомиктов на примере полученных гибридов.

6. Проанализировать причины неполной женской фертильности кукуруз1 трипсакумных гибридов, включая изучение гаметофитной совместимости и р импринтинга.

Научная новизна.

1. Впервые получены и изучены гибриды с 30 хромосомами кукурузы I хромосомами трипсакума, что является несомненным достижением, сужая к поиска генов апомиксиса до 9 хромосом. Ранее считалось, что для коптр( апомиксиса у гибридов кукурузы с трипсакумом необходим полный ген дикого родителя (18 хромосом).

2. Установлено, что 39-хромосомные кукурузно-трипсакумные гибри размножаются посредством псевдогамной диплоспории с мегагаметогенез ЛШеппапа-типа, как и тетраплоидный Т. с1ас1уЫс1е5.

3. Впервые показан независимый контроль двух составляющих апомиксис апомейоза и партеногенеза у трипсакума.

4. Продемонстрировано подавление импринтинга у кукурузно-трипсакумн гибридов и различная его экспрессивность при формировании эндосперм зависимости от плоидности и качества опылителя.

Практическая значимость работы.

Разработки лаборатории могут использоваться для выяснения генетичес механизмов передачи отдельных элементов апомиксиса и особенно интрогрессии генов при отдаленной гибридизации. Кроме того, они мо служить экспериментальной моделью передачи апомиксиса у других куль Материалы работы используются при чтении спецкурса «Экологичес генетика» в Сургутском государственном университете для демонстра перестроек хромосом.

Коллекция, созданная в лаборатории [Петров и др., 1974] и дополнен] нами с 1993 года новыми формами, является уникальной моделью интрогрес апомиксиса от дикого сородича культурному растению, и эта идея бь использована при получении гибридов жемчужного проса [Ощ'агсИп, Нап 1989].

Частота завязываемости семян у наиболее перспективных апомиктичн гибридов с 30 хромосомами кукурузы и 9 хромосомами трипсакума состав1 около 40%, что делает возможным практическое использование таких форм.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Апомиктическое размножение является комплексным признаком проявляется у гибридов кукурузы с трипсакумом в присутствии не менее дев определенных хромосом дикого родителя.

2. Апомейоз и партеногенез у диплоспорических кукурузно-трипсакумных бри дои наследуется независимо.

3. Подавление импринтинга у псевдогамных апомиктичных гибридов яется определяющим фактором для развития жизнеспособных зерновок. Личный вклад автора. В основу диссертации положены исследования

тора в лаборатории цитологии и апомиксиса Института цитологии и генетики О РАН, переведенной в апреле 2009 г. в Институт химической биологии и ндаментальной медицины СО РАН (экспериментальная работа по получению юмиктичных линий, тесты по потомству, цитогенетический анализ). Анализы одуктов ПЦР и изозимов выполнены в соавторстве с д.б.н. В.А. Соколовым в мках международного проекта с Министерством земледелия США. мбриологический анализ осуществлялся автором при поддержке фонда NWO, идерланды, при сотрудничестве с д.б.н. Т.Н. Наумовой (БИН РАН, Санкт-етербург).

Апробация результатов диссертации и публикации. Материалы диссерта-т обсуждались на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН 1998, 2001 и 2004 гг., и были доложены на международных конференциях -VIII International Conference on maize and sorghum genetics and breeding at the d of the 20th Century (Belgrade, Yugoslavia, 2000); 2nd International Apomixis nference AP02001 (Como, Italy, 2001), Третьей Международной Конференции отдаленной гибридизации, Главный Ботанический Сад им. Н.В. Цицина РАН осква, 2003), XI Plant and Animal Genome Conference (San-Diego, USA, 2003), ternational workshop NARO (Nishinasuno, Japan, 2003), конференции «Приори-тные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений XXI веке» (Москва, 2003), III съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: современ-е состояние и перспективы развития» (Москва, 2004) и международной конфе-нции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009).

По материалам диссертации опубликовано 24 научные работы, из них девять атей в рецензируемых отечественных (6) и международных (3) журналах, комеидованных ВАК, и восемь тезисов на конференциях.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 193 страницах и стоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы из 362 точников, в том числе 300 иностранных, и приложения. Иллюстративный териал содержит 18 таблиц (одна в приложении) и 45 рисунков.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному ководителю д.б.н. В.А. Соколову, оказавшему неоценимую помощь в работе; .н. Н.И. Белоусовой и к.б.н. Е.С. Фокиной за предоставленный коллекционный териал; д.б.н. Т.Н. Наумовой за помощь в проведении эмбриологического ализа и интерпретацию результатов исследований; моим ближайшим коллегам

по работе с гибридами к.б.н. Т.К. Таракановой и к.с.-х.н. | А.Ю. Кравченко! з участие, постоянную поддержку и обсуждение работы; А.П. Михайловой, Т.Е Космаковой, Э.А. Абдырахмановой и О.И. Лисициной за техническую помощь выращивании растений и обработке материала.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходные формы. Коллекция гибридов кукурузы (Zea mays - Zm) с трип сакумом (Tripsacum dactyloides - Td), исследованных в данной работе, была соз дана в лаборатории цитологии и апомиксиса растений Биологического институт СО АН СССР [Петров и др., 1974; Белоусова, 1982]. Гибриды F¡ с 46 хромосома ми (10Zm+36Td) были получены гибридизацией диплоидной кукурузы с тетрап лоидным трипсакумом в 1994 г. В.А. Соколовым на Станции Южных равнин США. Последующие поколения этих гибридов изучались нами в Новосибирске.

В осенне-зимний и весенний период растения выращивали в условиях гид ропонной теплицы Института цитологии и генетики СО РАН на искусстпепнок грунте из керамзита с подачей стандартного раствора Кнопа. В весенне-летни период материал выращивали рассадным способом в теплице Селекционно генетического комплекса ИЦиГ СО РАН, Новосибирск, и далее высаживали парники. В полевых условиях растения размножали и тестировали на Станцш Южных равнин, Вудвард, США и станции ВИР в Краснодарском крае.

Цитогенетический анализ. Подсчет соматических чисел хромосом выпол нен по общепринятой методике с окрашиванием по Фельгену [Паушева, 1970] 2% ацетоорсеином [Kindiger, 1993]. Цитологическая идентификация линий про ведена на основе анализа хромосом в меристематических клетках кончиков ко решков молодых проростков на 5-15 метафазных пластинках для каждого расте ния при увеличении 15x90.

В работе было использовано оборудование Центра коллективного пользова ния микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН.

Анализ изозимов и продуктов ПЦР. Образцы из каждой семьи был проанализированы для выявления полиморфизма, связанного с возможной половой репродукцией, по изозимам: алкогольдегидрогеназа (АДГ), кислая фосфатаза (КФ), малатдегидрогеназа (МДГ), фосфоглюкоизомераза (ФГИ), фосфоглюкомутаза (ФГМ), 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (6-ФГД) методом, описанным Стубером с коллегами [Stuber et al., 1988].

Для этой же цели провели анализ продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР, RAPD) на образцах ДНК, полученных из свежего лиофилизированного листового материала, как было описано ранее [Соколов и др., 1998].

Эмбриологическое изучение. Изучение эмбриологического материала проводили на фазово-контрастном и конфокальном микроскопах (Nomarsky

tics) и с использованием метил бензоата для приготовления просветленных епаратов [Naumova et al., 1999]. Для анализа роста пыльцевых трубок ыленные кукурузной пыльцой початки помещали в фиксатор FAA на 2-й день еле опыления и окрашивали раствором анилинового синего. Методики исапы в статьях [Khatypova et al., 2002; Белова и др., 2011].

Статистическая обработка данных. При сравнении средних значений личественных признаков достоверность различий оценивалась с помощью t-итерия Стьюдента. При обработке данных применяли пакет программ Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Цитогенетика кукурузно-трипсакумных гибридов

. Для подтверждения бесполосеменного способа размножения 38-хромосом-ie (20Zm+18Td) линии, полученные сотрудниками лаборатории д.б.н. Д.Ф. етрова, были исследованы нами с помощью хромосомного, изозимного и по 1ектрам полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализов. Редукция одного нома дикого родителя с сохранением апомиктического способа размножения етров и др., 1968, 1976, 1985] являлась значительным достижением, так как лученные американскими исследователями гибриды с таким геномным ставом полностью теряли хромосомы трипсакума к 8 поколению [Harlan, de et, 1977]. Для определения генетического родства и способа происхождения от щего материнского предка, установленного нами в результате сопоставления дословных, было изучено 25 растений из 3 семей. Растения имели 38 омосом, и кариотип их состоял из 20 хромосом кукурузы и 18 хромосом ипсакума, за исключением Вш-гибрида 145-6 (40Zm+18Td). Кариотип здобного растения показан на рисунках I и 2.

Анализ продуктов ПЦР, проведенный с использованием 40 различных эаймеров, также показал внутрисемейную идентичность апомиктичных курузно-трипсакумных гибридов. При использовании затравок ОРЕ-11, ОРЕ-и ОРЕ-20 было обнаружено, что растение 117-2 имеет RAPD-ектрофореграмму, отличающуюся от таковой его сибов. По всей видимости, ю является продуктом неполного мейоза (частичной конъюгации и оссинговера) [Koltunow, 1993]. При исследовании других RAPD-ектрофореграмм не удалось идентифицировать какого-либо варьирования жду оцениваемыми семьями. Изозимный анализ АДГ, КФ, МДГ, ФГИ, ФГМ и ФГД показал отсутствие какой-либо вариабельности внутри и между следованными линиями, включая и растение 145-6. Отсутствие характерной я перекрестников цитогенетической, изозимной и молекулярной риабельности четко указывает на то, что гены, контролирующие

апомиктическое развитие, привнесенные от Т. dactyloides, стабильп проявляются у гибридов на протяжении более чем 20 генераций.

!ШШ( т mum

' * ' • '

luí un die im im

i I i \ i i i

& i I till

• * * »

Рис. 1. Метафазная пластиика 58- Рис. 2. Кариотип 58-хромосомного гиб-1

хромосомного кукурузно- рида152-5Ь.

трипсакумного нередуцированного гибрида 152-5Ь.Ув. 15x100.

С целью выявления растений с числом хромосом трипсакума менее 18 бы предпринят скрининг коллекции линий, имевшихся в нашей лаборатории к 199 году. Хромосомный анализ, выполненный на 518 растениях из 95 линш полученных от четырех исходных 38-хромосомных родителей размножавшихся от 5 до 18 генераций апомиктически, показал, что 29 лини! (100 растений) сохранили первоначальное число хромосом (2n=38; 20Zm+18Tdj В то же время нами были обнаружены образцы с 39 и, реже, 40 хромосомам! составляющие большинство популяции в результате цитогенетичеси неконтролируемого отбора на продуктивность. Анализ родословных цитологические исследования митоза позволили разделить 39-хромосомнь гибриды на два класса в соответствии с происхождением и геномным составом.

К первому классу гибридов с 39- и 40-хромосомными кариотипами был1 отнесены 174 растения из 36 линий. Как показал анализ, кариотипы эти растений имеют 20 хромосом кукурузы, 18 трипсакума и одну или дг дополнительные хромосомы. Из проанализированной популяции были выделен 15 линий (65 растений), у которых к 38 хромосомам добавлена изохромосома, 2 растений из 5 линий кроме изохромосомы имели одну дополнительну! хромосому, и у 16 линий (80 растений) наблюдали по одной дополнительно хромосоме. При этом у 4 линий добавочная хромосома была телоцентрическо! Цитологический анализ показал, что дополнительными в этом материале чаи

¡сего являются хромосомы кукурузы. Нам удалось идентифицировать лишь одну ромосому сексуального родителя в кариотипе двух родственных линий, ¡езультаты кариологических исследований гибридов показали, что линии 57 и 8, являющиеся потомками одного растения, предположительно несут ¡ополнительную хромосому 5 кукурузы.

Наибольший интерес представляет второй класс 39-хромосомных растений, ¡ыделенных нами в семьях Г278 и Г32. На основании сравнительной длины [ромосом, соотношения плеч, положения спутников был сделан вывод, что ¡ариотип этих линий состоит из 30 хромосом кукурузы и 9 хромосом [рипсакума. Дополнительные хромосомы, чаще всего телоцентрические, были Обнаружены у некоторых растений из 6 линий. Анализ родословных показывает, то 39-хромосомные гибриды были получены в четырех разных семьях в <езультате редукции гаплоидного генома трипсакума (п=х=\8) после накопления укурузных геномов путем Вш-гибридизации или, возможно, непосредственно от 8-хромосомного растения. Результаты хромосомного анализа, проведенного у 6 линий в 1994 г. и 13 линий в 1995 г. показали, что кариотипы линий 141, 144 и 62 идентичны (рис. 3, 4).

V *

Ъ НО л

V/

182 III «XI 1X1 Ш Ш ш ш ш »»•

» « I

Рис. 4. Кариотип апомикта 162-1 с 30 хромосомами кукурузы и 9 хромосомами трипсакума.

'ис. 3. Метафазная пластинка растения 41-3. Стрелками обозначены хромо-;омы 6 кукурузы.

При идентификации трех геномов кукурузы у 39-хромосомных гибридов >ыли обнаружены метафазные пластинки с тремя спутничными хромосомами 6 "укурузы (рис. 3). Сравнивая кариотипы потомков 3 8-хромосомного растения 202т+18Тё) и кариотипы линий 141, 144 и 162 (302ш+9Тс1), можно заключить, 1то гены, контролирующие апомиктическое размножение, локализованы в руппе из малых хромосом генома трипсакума. Благодаря разнице в размерах и

!

соотношениях плеч эти 9 хромосом трипсакума морфологически хорош1 отличимы от кукурузных. По физическим размерам можно предположить, чт1 самая большая из них - хромосома 7, следующие две занимают место с 8 по 11 хромосомы 12, 13, 14, спутничная 16, и самые маленькие - 17 и 18. Аналк изозимов и продуктов ПЦР не выявили разнообразия ни внутри апомиктичны1 линий 144 и 162, ни между ними. Это показало, что у 39-хромосомных гибриде^ не происходит рекомбинационных событий, которые несомненно проявились б: в изозимной вариабельности, связанной с утратой хромосом кукурузы ил трипсакума [Kindiger, Vierling, 1994].

Цитологический анализ хромосомного набора трипсакума и сравнение cm пифических для трипсакума бэндов на ПЦР-электрофореграммах у разных ль ний, указывают на то, что они несут одинаковые 9 хромосом трипсакума (рис. 5]

Рис. 5. Результаты электрофореза продуктов ПЦР:

I - маркеры молекулярного веса; 2 4 трипсакум; 3 - апомиктичный 56-хромосомный гибрид Fi (20Zm+36Td); 4 - 38-хромосомный апомиктичный гибрид (20Zm+l 8Td)-5, 6, 7, 8 - 39-хромосомные апомик-тичные гибриды (30Zm+9Td); 9,10,

II - половое потомство Вп; 12, 13 -материнская тетраплоидная кукуруза. Обозначенный стрелкой фрагмен-1 (~ 1200 п.н.) косегрегирует с апомик сисом.

Хромосомные перестройки, такие как появление транслоцированных хроме сом, дополнительных ядрышкообразующих районов (NOR), изохромосом и т® лоцентриков, наряду с присутствием целых дополнительных хромосом кукуруз! отмечены у ряда растений и сохраняются в их потомстве благодаря апомиксисз У гибридных линий V63 и VI7 нами обнаружена хромосома 6 кукурузы с двум! ядрышкообразующими районами, а в их потомстве - добавочный сателлит на кс ротком плече, увеличивший общее число NOR до трех (рис. 6, 7).

Экспериментальные результаты показали, что растения с 30 хромосомам кукурузы и 9 хромосомами трипсакума имеют факультативный тип апомиксис и их потомство состоит из апомиктов, гибридов Вш (оплодотворение нередуци рованной яйцеклетки) и Вп-типов (оплодотворение редуцированной яйцеклетки)

Наличие Вш-гибридов, которые в зависимости от плоидности опылителя яе ляются 49- или 59-хромосомными растениями, свидетельствует о функпионирс

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

;ании трипсакумных генов апомиксиса в присутствии геномов кукурузы в её ци-оплазме. В последовательных апомиктических поколениях 39-хромосомомных |иний 4х-6 (30гш+9Тс1) и 1067 (21гт+18Тс1) количество Вш-гибридов колебалось незначительно - от 6,2 до 8,6% и от 3,8 до 7,0%, соответственно. Хотя в потомстве отдельных растений доля таких гибридов в разные годы составляла от 0 ¡о 23,6%, в результате исследований не выявлено ни одного облигатного апо-[икга. Усиление Вщ-гибридизации наблюдалось у 49-хромосомных (402ш+9Тс1) ибридов. Частота Вц-гибридов у всех линий составляла 0-1,6 %.

Сравнение динамики морфометрических признаков у 39-, 49-, 59- и 69-ромосомных растений, имеющих 9 хромосом трипсакума, однозначно выявляет силение морфотипа кукурузы по мере увеличения числа ее геномов у гибридов, 'акой характер экспрессивности количественных признаков кукурузы хорошо эгласуется с возрастанием доли половых потомков.

, N «В*./»

> С

9 .*«> -

ч "" ^ * '

V >'

» V -V'

Л.»* И»

ч\ -

Ж Щ ■*«,

ис. 6. Метафаза митоза 40-ромосомного растения У63-2, хромо-Ьма со спутниками на обоих плечах и ормальные спутничные хромосомы Укурузы указаны стрелками.

I

Эмбриологическое изучение кукурузно-трипсакумных гибридов

| Эмбриологически были изучены более 120 семяпочек у 12 растений двух иний разного происхождения с 30 хромосомами кукурузы и 9 хромосомами оипсакума - 4х-6 (потомство Г32) и \У39 (потомство Г278). Мегаспорогенез и 1ормирование зародышевого мешка у обеих линий протекали одинаково. Одна ,'бэпидермальная нуцеллярная клетка вблизи внешней доли семяпочки начинала Увеличиваться в размерах. В итоге она становилась археспориальной клеткой,

,мела более крупное и уплотненное ядро и позже дифференцировалась в

|

|

Рис. 7. Метафазная пластинка растения 17-7: 98 с трехсателлитной хромосомой 6 кукурузы.

материнскую клетку мегаспоры (МКМ) (рис. 8а). Вместо вступления в мейо: характерного для сексуального способа размножения, МКМ начина^ удлиняться, при этом в ядре не происходило видимых изменений. В конце это! стадии халазальный конец клетки становился узким, и она принимала форм]; которую у апомиктичного Т. йас1уЫс1е5 Б. Бёрсон с сотрудниками [Вигвоп е1 а( 1990] назвали "формой слезы".

Рис. 8. (а) Семяпочка с археспориальной клеткой. (Ь) Семяпочка с больши мегаспороцитом (МКМ), видна вакуолизация и тенденция к диплоспории ("фо} ма слезы"), (с) Семяпочка с происходящим непосредственно из МКМ диплоспс рическим одноядерным зародышевым мешком АШеппапа-типа без видимых о! татков деградирующих мегаспор, (ф Двухядерный зародышевый мешок, (е) Ч тырехядерный зародышевый мешок. (Г) Восьмиядерный зародышевый мешс перед дифференциацией клеток, (g) Восьмиядерный зародышевый мешок поа: дифференциации клеток. Обозначен яйцевой аппарат, видны центральная клеи с двумя неслившимися полярными ядрами и три антиподальные клетки. (И) Та я! семяпочка в следующем последовательном фокусе, видны две синергиды, яйц]

етка и два полярных ядра, (i) Яйцеклетка в стадии метафазы и четырехклеточ-ш эндосперм. Шкала для a, i - 50 цт; с - 20 цш; b, d, е, f, g, h -100 цш.

линенная материнская клетка мегаспоры увеличивалась и вакуолизировалась. олщение клеточной стенки МКМ сопровождалось дегенерацией окружающих нуцеллярных клеток. В то время как материнская клетка мегаспоры линялась, интегументы разрастались, окружая микропилярную часть мяпочки (рис. 8Ь). После такой изоляции МКМ делилась митотически (рис. 8с), одуцируя двухядерный мегагаметофит с большой центральной вакуолью (рис. ). Второе митотическое деление формировало 4-ядерный зародышевый мешок ис. 8е), а третье - 8-ядерный зародышевый мешок (рис. 8f). При дальнейшей 1фференциации (формировании клеточных стенок) образовывались две шергиды, яйцеклетка, два полярных ядра и три антиподальных клетки, которые сто в дальнейшем делились с образованием при этом пяти или шести антипод ис. 8g,h). Случаев развития зародыша или эндосперма без опыления у ученных нами кукурузно-трипсакумных гибридов не наблюдалось. Более того, 13 день после опыления эндосперм чаще всего несколько опережал яйцеклетку скорости деления (рис. 8i).

Полное отсутствие мейоза и линейной тетрады мегаспор указывает на то, что -хромосомные кукурузно-трипсакумные гибриды размножаются митотической плоспорией. Как у Т. dactyloides, мегагаметогенез здесь Antennaria-типа, так к Ixeris или Taraxacum-тшы включают мейотическое реституционное ядро и адию диады мегаспор [Nogler, 1984; Bashaw, Hanna, 1990]. В изученном териале не обнаружено случаев мейотического поведения, развития зародыша и эндосперма без оплодотворения и аномалий дифференциации при развитии родышевых мешков.

При изучении роста пыльцевых трубок кукурузы в столбиках 38- и 39-омосомных кукурузно-трипсакумных гибридов было обнаружено, что средний оцент столбиков с пыльцевыми трубками, доросшими до семяпочки, составил и опылении Попкорном 41,1%, Тетраплоидом Шумного В.К. - 47,7% и стером пурпуровым - 31,5%. У кукурузы трубки дорастали в 100% следованных столбиков. Достоверных различий по этому показателю между шлителямн и кукурузно-трипсакумными гибридами в опытах 1999 и 2000 гг. выявлено, но отмечено влияние погодных условий. Число пыльцевых трубок, росших до семяпочки, также было значительно ниже у гибридов по сравнению кукурузой (1-2 трубки на столбик у гибридов и 7-9 - у кукурузы). Таким разом, гаметофитная несовместимость в тканях столбика является одной из твных причин неполной озерненности у кукурузно-трипсакумных гибридов.

Генетический контроль апомейоза и партеногенеза у гибридов

В таблице 1 приведены результаты расщепления в потомствах кукурузн трипсакумных гибридов по пеиетрантности двух составляющих апомиксиса апомейоза (нередукции) и партеногенеза. Из представленных данных очевидн что число сексуальных потомков (табл. 1, столбец Вц и Вщ) увеличивается, ког соотношение кукурузных геномов (половой родитель) к трипсакумным генома (апомиктичный родитель) у гибрида равно или превышает 5 : 0,5. Необходим отметить также, что партеногенез подавляется в большей степени, чем апомейо при возрастании кукурузной доли геномов, т. е. партеногенез не реализовался 35% потомства, тогда как апомейоз - только у 4,5% (табл. 1, последние две стр( ки). При снижении соотношения геномов кукурузы к трипсакуму партеноген не проявился от 2% до 9% (табл. 1, потомство Вш, строки от 1 до 4). Для знач! тельного увеличения числа оплодотворенных яйцеклеток (от 6% до 35%) и яйц< клеток с редуцированным набором хромосом (от 0% до 4,5%) требуется десяп кратная разница в соотношении родительских геномов в пользу кукурузы.

Таблица 1

Расщепление по апомейозу (А) и партеногенезу (П) у потомков кукурузно-трипсакумных гибридов различной плоидности и соотношения геномов

Тип потомства

Гибриды Всего Апомикты Вгибриды Вц .гибриды

__(А и П) (только А) (нет А и П)

-----------------%-------------------

Fi 2n=56 (20Zm+ 36Td) 105 93 7 0

ВС 2n=38 (20Zm + 18Td) 181 98 2 0

ВС 2n=39 (30Zm + 9Td) 145 91 9 0

ВС 2n=40 (30Zm+9Td+l)* 111 95 5 0

среднее 94 6 0

ВС 2n=59 (50Zm + 9Td) 36 58 36 6

ВС 2n=60(50Zm+9Td+1 )* * 161 63 34 3

среднее 60,5 35 4,5

* Линия с телоцентрической хромосомой и хромосомой б кукурузы, несущ дополнительный NOR на длинном плече вдобавок к регулярному NOR коротком.

** Вщ-гибрид, полученный при опылении 40-хромосомной линии тетраплоидно кукурузой.

Необходимо отметить, что возрастание соотношения геномов снижал партеногенез примерно в 9 раз сильнее в сравнении с апомейозом. G результаты говорят о независимой экспрессии этих элементов апомиксиса i возможно, о разнице в числе контролирующих их генов. Апомейотическ составляющая запрограммирована достаточно жестко и встречается с высоко частотой даже при многократной разнице в числе геномов сексуального родите

бл. 1). В то же время партеногенез проявляет неполную пенетрантность уже у ^идовР: с соотношением геномов 2:2, и снижается примерно на 40% порционально возрастанию доли геномов кукурузы.

При сравнительном изучении потомства двух спонтанно удвоенных гибридов = 2x39 (30гт+9Тс1) =78 и 2п= 2x38 (20гт+18Т<1) =76) было показано, что уд-нное состояние 9 хромосом трипсакума у 78-хромосомных растений приво-к нормальному прохождению мейоза и формированию редуцированного за-ышевого мешка у 15 потомков. У 14 растений за этим следовали партеногенез ормирование дигаплоидов и одно растение оказалось Вц-гибридом.

Таблица 2

Расщепление среди потомков кукурузно-трипсакумных гибридов с

удвоенными геномами

Тип потомства

бриды Всего Апомикты Дигаплоиды Вц-гибриды

2п=78; 2 (30гт+9Тс1) 15 0 14 1

2п=76; 2 (202ш+18Тс1) 7 7 0 0

является несомненным подтверждением независимости механизмов прессии апомейоза и партеногенеза друг от друга. Только в одном случае (Вп-рид) партеногенез не экспрессировался. Примечательно, что партеногенез у растений встречался после нормального мейоза и формирования одышевого мешка, а не после апомейоза. Второе растение (76-хромосомное) извело только 7 апомиктичных потомков [Лукина, Юдин, 1983]. Данные, представленные в таблице 3, обобщают результаты изучения кроссов от опыления 23 семей 46-хромосомных гибридов (107ш+36Тс1) 1Лоидной кукурузой. Большинство семей ВС) (15 из 23 изученных) оказались мшегами, т. е. они были морфологически однородны и имели 46 хромосом, и материнское растение. Другая группа из 7 семей ВС) состояла главным азом из апомиетичных потомков, но имела также от 1 до 3 Вш-гибридов. В м случае, как и в рассмотренных ранее, партеногенез не имел 100% етрантности, хотя соотношение геномов 1 : 2 было в пользу апомиктичного ителя. И, наконец, одна семья ВС[ была представлена только Вш-гибридами, . у нее партеногенез полностью отсутствовал.

Наблюдение Вш и варьирование их числа при беккроссировании в исимости от соотношения кукурузных и трипсакумных геномов говорит о игенном контроле данного признака. Возможно, что одними из участников го процесса являются скорость роста пыльцевой трубки и продолжительность оя апомейотической яйцеклетки до начала дробления и ее способность к одотворению в это время. Только в случае благоприятного стеченш

вышеназванных событий и дальнейшего успешного развития зерновки м можем наблюдать нередуцированные гибриды. Таким образом, выявлен способности к выщеплению Вщ-гибридов в группе, где основная масса растен апомикты, говорит лишь о полиморфизме по времени покоя яйцеклеток скорости роста пыльцевых трубок. Поэтому следующее поколение беккроссов увеличенным числом геномов кукурузы (Вш) снова дает в основн апомиктичное потомство (табл. 3).

Таблица

Расщепление по апомейозу и партеногенезу среди 23 семей, полученных опылением кукурузно-трипсакумных гибридов Р\ (2п=46; Югт+ЗбТё) кукурузой

Растения ВС, _Растения ВС,

№ семьи .. Всего Апомик- Вш- № семьи Всего Апомик-

растений ты гибриды растении ты гибри;

57 13 13 0 45 16 15 1

92 11 11 0 46 18 17 1

112 12 12 0 77 13 12 1

188 8 8 0 79 15 12 3

190 11 11 0 175 10 9 1

236 И 11 0 302 12 11 1

251 9 9 0 383 13 12 1

289 9 9 0 1 Всего: 7 97 88 9

300 13 13 0 363 15 0 15

334 14 14 0 1 Всего: 1 15 0 15

355 14 14 0

365 13 13 0

392 8 8 0

415 15 15 0

484 8 8 0

1 Всего: 15 169 169 0

Предложенная Г.Л. Стеббинсом гипотеза о дигенном контроле апомикси [Stebbins, 1950] нашла продолжение в ряде исследований. Тем не мене накоплено достаточно много свидетельств полигенного контро бесполосеменного размножения [Carman, 1997; Noyes, Rieseberg, 2000; Blakey al., 2001; Matzk et al., 2005; Leblanc et al., 2009; Vijverberg et al., 2010]. Наш результаты также свидетельствуют в пользу его полигенной природы.

Проблемы озерненности и массы зерновки у апомистичных кукурузно трипсакумных гибридов

Преодоление эффекта геномного импрннтинга, являющегося неизбежны следствием аномального соотношения родительских геномов в эндосперм апомиктов при псевдогамии, считается элементом апомикгическог

азмножения. Как следует из представленных в таблице 4 результатов, арьирование соотношений кукурузных геномов материнского и отцовского роисхождения в широких пределах как при опылении тетраплоидом (от 4т : 2р о 14т : 2р), так и при опылении диплоидом (от 4т : 1р до 12т : 1р) не приводит полному проявлению импринтинга - и эндосперм, и зародыш развиваются ормалыю, давая различные по размеру жизнеспособные семена. Развитие нормального" эндосперма, несомненно, наблюдается по причине наличия у бридов полного генома трипсакума или его доли из 9 хромосом. В случае рисутствия трех хромосом трипсакума у Вш-гибрида (2и=63), а затем и у его едуцированных потомков (Вц-гибриды 2и=53 и 2я=51) формируются аномально алые "субнормальные" эндоспермы (по определению Lin, 1984).

Таблица 4

лияние соотношения материнских (ш) и отцовских (р) геномов кукурузы на азмер семян у ее гибридов с трипсакумом

Генотипы Соотношение геномов в эндосперме, опыленном Размер семян

тетраплоидом диплоидом нормальны! субнормальный

20Zm + 18Td 4т : 2р 4т : 1р +

30Zm + 18Td 6т : 2р 6т : 1р +

40Zm + 18Td 8т : 2р 8т : 1р +

30Zm + 9Td 6т : 2р 6т : 1р +

40Zm + 9Td 8т : 2р 8т : 1р +

50Zm + 9Td Ют : 2р ? +

70Zm + 9Td 14т : 2р ? +

60Zm + 2 (9Td) 12т : 2р ? +

60Zm + 2 (18Td)* - - - -

60Zm + 3Td** 8т : 2р ? +

50Zm + 3Td 6т : 2р ? +

50Zm + lTd 6т : 2р ? +

Карликовое растение, не выбрасывало рылец, не завязало семена * Нередукция без партеногенеза

кспрессивность импринтинга в большинстве случаев зависит от плоидности пылителя. Соотношение материнских и отцовских геномов кукурузы в ндосперме 4 : 1, 6 : 1 и 8 : 1 при опылении диплоидом по сравнению с 4 : 2, 6 : 2 8 : 2 при использовании тетраплоидного опылителя приводит к увеличению елкозерной, но жизнеспособной фракции. Различия по средней массе зерновок ри опылении диплоидной и тетраплоидной кукурузой достоверны у всех линий различных условиях выращивания. Исключение составляет диплоидный ибрид Fi Wilson, который как опылитель не уступает тетраплоидной кукурузе, олученные результаты позволяют заключить, что подавление импринтинга

характерно для псевдогамных диплоспорических апомиктов, равно как

величина эндосперма для всех типов бесполосеменного размножения зависит

опылителя.

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований созданы 39-хромосомнь апомиктичные гибриды Zea mays х Tripsacum dactyloides, несущие 3 хромосом кукурузы и 9 трипсакума. Добавочные 9 хромосом дико родителя являются минимально необходимым набором для поддержания них бесполосеменного размножения.

2. Апомиктический способ размножения у 38- (20Zm+18Td) и 3 хромосомных (30Zm+9Td) линий разного происхождения подтвержде цитогенетически, а также с помощью анализа изозимов и продуктов ПЦР.

3. С использованием метода просветленных эмбриологических препарат показано, что основной способ размножения у 39-хромосомных гибридов псевдогамная митотическая диплоспория Antennaria-типа, ч соответствует ранее показанному типу апомиксиса у трипсакума.

4. Впервые показано, что апомейоз и партеногенез у апомиктов Т. dactyloid наследуются независимо. Результаты гибридологического анализа де возможность с большой вероятностью заключить, что диплоспор контролируется одним доминантным геном или группой сцепленных ген и имеет высокую пенетрантность. Партеногенез, напротив, находится по контролем многих генов и его проявление зависит от генетических внешних факторов.

5. Продемонстрирована различная степень подавления импринтинга кукурузы в присутствии геномов трипсакума и его отдельных xpoMocoN Средняя масса зерновок проявляет зависимость от соотношения мужских женских геномов кукурузы в эндосперме, а также генотипа опылител Высокая генетическая вариабельность этого признака показывает, что о может быть увеличен генетическими методами.

6. Женская фертильность кукурузно-трипсакумных гибридов определяете гаметофитной совместимостью и экологическими условиями.

7. Апомиктичные 39-хромосомные гибриды сохраняют характерную дл трипсакума долю полового потомства (4,9-8,1%). Экспрессивно апомейоза и партеногенеза у отдельных растений в разные годы варьирует более широких пределах, чем в последовательных апомиктически

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соколов В.А., Киндигир Б., Дивальд Ч., Хатыпова (Белова) И.В. Сравнительный анализ апомиктического размножения кукурузно-трипеакумных гибридов и трипсакума ежевидного // ДАН. 1996. Т. 346, № 6. С. 845-847.

2. Соколов В .А., Лукина Л.А., Хатыпова И.В. О пути получения апомиктичной кукурузы//ДАН. 1996. Т. 347, № 5. С. 714-717.

3. Kindiger В., Sokolov V., Khatypova I.V. Evaluation of apomictic reproduction in a set of 39 chromosome maize - Tripsacum backcross hybrids // Crop Sci. 1996. V. 36, №5. P. 1108-1113.

4. Соколов B.A., Киндигир Б., Хатыпова И.В. Изучение апомиктичных кукурузно-трипсакумных гибридов // Генетика. 1998. Т. 34, № 4. С. 492498.

5. Соколов В.А., Киндигир Б., Хатыпова И.В. Апомиктически размножающиеся 39-хромосомные кукурузно-трипсакумные гибриды // Генетика. 1998. Т. 34, № 4. С. 499-506.

6. Sokolov V.A., Khatypova I.V. The development of apomictic maize: update, problems and perspective // GENETIKA-BELGRADE. 2000. V. 32. № 3. P. 331-353.

7. Sokolov V.A., Kravtchenko A.Y., Nakagawa H., Khatypova I.V. Apomictic maize - Tripsacum hybrids: genetics and breeding perspectives // Grassland Science, Additional Issue. 2002. V. 48. P. 342-343.

8. Белова И.В., Тараканова Т.К., Абдырахманова Э.А., Соколов В.А., Панихин П.А. Хромосомный контроль апомиксиса у гибридов кукурузы с гамаграссом // Генетика. 2010. Т. 46, № 9. С. 1188-1191.

9. Белова И.В., [Кравченко А.Ю.|, Наумова Т.Н., Соколов В.А.

Эмбриологическое изучение способа размножения апомиктичных кукурузно-трипсакумных гибридов // Вестник НГАУ. 2011. № 1 (17). С. 23-28.

Подписано к печати 10.10.2011 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 Заказ №59

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белова, Ирина Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Определение апомиксиса, его распространение и адаптивное значение.

1.2. Типы апомиксиса в природе.

1.3. Основные особенности апомиксиса.

1.3.1. Связь полиплоидии и апомиксиса.

1.3.2. Факультативность апомиксиса.

1.3.3. Десинхронизация процессов развития у апомиктов.

1.3.4. Преодоление апомиктами эффектов импринтинга при формировании семян

1.4. Генетический контроль апомиксиса

1.4.1. Картирование генов апомиксиса у злаков

1.4.2. Идентификация генов апомиксиса у двудольных растений

1.5. Работы лаборатории Д.Ф. Петрова по передаче апомиксиса кукурузе.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Исходные формы

2.2. Контроль способа размножения у гибридов.

2.2.1. Цитогенетический анализ

2.2.2. Анализ изозимов и продуктов ПЦР

2.2.3. Эмбриологическое изучение.

2.3. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. ЦИТОГЕНЕТИКА АПОМИКТИЧНЫХ КУКУРУЗНО

ТРИПСАКУМНЫХ ГИБРИДОВ.

3.1. Подтверждение бесполосеменного способа размножения у 38-хромосомных гибридов.

3.2. Дополнительные хромосомы в кариотипе 38-хромосомных гибридов.

3.3. Гибриды с 30 хромосомами кукурузы и 9 хромосомами трипсакума.

3.4. Гибридное потомство 39-хромосомных апомиктов.

ГЛАВА 4. ЭМБРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КУКУРУЗНО

ТРИПСАКУМНЫХ ГИБРИДОВ.

4.1. Диплоспория у 39-хромосомных гибридных линий.

4.2. Рост кукурузных пыльцевых трубок в столбиках кукурузно-трипсакумных гибридов

ГЛАВА 5. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ АПОМЕЙОЗА И

ПАРТЕНОГЕНЕЗА У ГИБРИДОВ.

ГЛАВА 6. ПРОБЛЕМЫ ОЗЕРНЕННОСТИ И МАССЫ ЗЕРНОВКИ У АПОМИКТИЧНЫХКУКУРУЗНО-ТРИПСАКУМНЫХ

ГИБРИДОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Цитогенетический контроль апомиксиса у кукурузно-трипсакумных гибридов"

Актуальность проблемы.

Апомиксис или бесполосеменное размножение является генетически контролируемым репродуктивным процессом, в результате которого развитие зародышей происходит из диплоидных материнских клеток без оплодотворения. Таким образом, получаемое потомство является абсолютной копией материнского организма. За последние два десятилетия интерес к этому явлению в мире, судя по числу научных коллективов занимающихся, им, вырос многократно. Его изучают как ботаникш- эволюционисты, так и генетики. Первым апомиксис интересен-как пример необычно высокой, пластичности растительных видов и освоение ими экстремальных ареалов обитания, несмотря на пониженную комбинативную изменчивость в сравнении с половыми формами. Генетикам он привлекателен тем, что с его помощью можно будет закреплять ценные количественные признаки и поддерживать уникальные комбинации генов в потомствах теоретически бесконечно долго. Это позволит вовлечь в гибридную селекцию и использовать эффект гетерозиса без ограничения у всех культурных растений. В настоящее время производство гибридных семян рентабельно только у культур, где от единичного опыления получают не менее 500 семян [Koltunow et al., 1995а; Vielle-Calzada et al., 1996; Kindiger, Sokolov, 1997; Grossnikiaus et al., 1998; Bicknell, Koltunow, 2004]. Закрепление гетерозиса через семенное размножение при использовании апомиксиса позволит упростить коммерческое гибридное семеноводство с последующим понижением, затрат как у семенных, так и вегетативно размножающихся культур [Карпеченко, 1935; Петров, 1957, 1964; Hanna, Bashaw, 1987; Berthaud, 2001]. Потенциальный экономический эффект апомиктических технологий, оцениваемый для производства гибридного риса, превышает 2,5 миллиарда, долларов в год [McMeniman, Lubulwa, 1997]. Перспективы использования контролируемого апомиксиса в сельском хозяйстве открывают новые возможности для селекционеров и позволяют ускорить селекционные программы создания сортов, устойчивых к болезням и адаптированных к условиям среды [Hanna, 1995; Jefferson, Bicknell, 1995; Koltunow et al., 1995a; Savidan, 2000a, 2007].

Создание апомиктичной кукурузы позволило бы в огромной степени снизить расходы на производство гибридных семян этой культуры и существенно продвинуть решение проблемы ее использования в развивающихся странах. Попытки найти генетически контролируемый апомиксис у диплоидной и тетраплоидной кукурузы не имели успеха. По этой причине в лаборатории цитологии и апомиксиса растений Биологического института СО РАН пошли путем передачи требуемого признака от обладающего им дикого сородича -тетраплоидного трипсакума ежевидного (Tripsacum dactyloides L. 2я=4х=72). Это явилось первой в мире удачной ¡попыткой интрогрессии апомиксиса в межвидовой гибрид культурного растения с диким сородичем. Тем^не менее, для передачи »этого признака кукурузе и успешного изучения его молекулярно-генетическими методами необходимо выявление минимального числа хромосом трипсакума, достаточного-для сохранения бесполосеменного способа размножения.

Настоящая диссертация представляет часть многосторонней, многолетней исследовательской работы, проводимой в лаборатории цитологии и апомиксиса растений ИХБФМ СО РАН, и описывает результаты по изучению генетического контроля апомиксиса и некоторые закономерности цитологического и эмбриологического поведения кукурузно-трипсакумных гибридов с различными композициями родительских геномов.

Цель и задачи исследования.

Основная цель настоящей! работы - изучить цитогенетический контроль и характер экспрессии генов апомиксиса у гибридов Zea mays х Т. dactyloides L. В связи с этим были поставлены задачи:

1. Провести цитологический анализ коллекции кукурузно-трипсакумных гибридов, имевшейся в лаборатории к 1993 г.

2. Изучить у них тип эмбриологического развития зародышевых мешков.

3. Оценить число генов, контролирующих бесполосеменное размножение.

4. Выявить минимальное число и определить роль отдельных хромосом трипсакума в цитогенетическом контроле апомиксиса у его гибридов с кукурузой.

5. Изучить особенности Вш и В1Ггибридизации и ее роль в поддержании генетического разнообразия у апомиктов на примере полученных гибридов.

6. Проанализировать причины неполной женской фертильности кукурузно-трипсакумных гибридов, включая изучение гаметофитной совместимости и роль импринтинга.

Научная новизна:

1. Впервые получены и изучены гибриды' с 30 хромосомами кукурузы и 9 хромосомами трипсакума, что является несомненным достижением;; сужая круг поиска генов апомиксиса до 9 ; хромосом:! Ранее считалось, что для контроля апомиксиса у гибридов кукурузы с трипсакумом необходим полный геном ¿дикого родителя (18 хромосом).

2. Установлено, что 39-хромосомные 1сукурузно-трипсакумные гибриды размножаются посредством псевдогампой диплоспории с мегагаметогенезом ЛШеппапа-ттУд., как и тсгранлоидныйУ. dactyloid.es Ь.

3; Впервые показан независимый контроль двух составляющих апомиксиса -апомейоза и партеногенеза у трипсакума:

4. Продемонстрировано подавление импринтинга у кукурузно-трипсакумных гибридов и различная его экспрессивность при' формировании; эндосперма; в зависимости от плоидности й качества опылителя. ' ' '

Практическая значимость работы.

Разработки лаборатории могут использоваться для выяснения генетических механизмов передачи отдельных элементов апомиксиса и особенностей; интрогрессии генов при отдаленной гибридизации. Кроме того, они могут служить экспериментальной моделью передачи апомиксиса у других культур. Материалы работы используются при чтении, спецкурса' «Экологическая генетика» в Сургутском государственном университете для демонстрации перестроек хромосом:

Коллекция кукурузно-трипсакумных гибридов, созданная в лаборатории [Петров и др., 1974] и дополненная нами с 1993 года новыми формами, является уникальной моделью интрогрессии апомиксиса от дикого сородича культурному растению, и эта идея была использована при получении гибридов жемчужного проса [Dujardin, Hanna, 1989].

Частота завязываемости семян у наиболее перспективных апомиктичных гибридов с 30 хромосомами кукурузы и 9 хромосомами трипсакума составила около 40%, что делает возможным практическое использование таких форм.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Апомиктическое размножение является комплексным признаком и проявляется у гибридов кукурузы с трипсакумом в присутствии не менее девяти определенных хромосом дикого родителя.

2. Апомейоз и партеногенез у диплоспорических кукурузно-трипсакумных гибридов наследуется независимо.

3. Подавление импринтинга у псевдогамных апомиктичных гибридов, является определяющим фактор о мдля развития жизнеспособных зерновок.

Личный» вклад автора. В основу диссертации положены исследования автора в лаборатории цитологии и апомиксиса Института цитологии и генетики СО РАН, переведенной в апреле 2009 г. в Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (экспериментальная работа по получению апомиктичных линий, тесты по потомству, цитогенетический анализ). Анализы продуктов- ПЦР и изозимов выполнены в соавторстве с д.б.н. В.А. Соколовым в рамках международного проекта с Министерством земледелия США. Эмбриологический анализ осуществлялся автором при поддержке фонда NWO, Нидерланды, при сотрудничестве с д.б.н. Т.Н. Наумовой (БИН РАН, Санкт-Петербург).

Апробация результатов диссертации и публикации. Материалы диссертации обсуждались на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в 1998, 2001 и 2004 гг., и были доложены на международных конференциях - XVIII International Conference on maize and sorghum genetics and breeding at the end of the

20th Century (Belgrade, Yugoslavia, 2000); 2nd International Apomixis Conference AP02001 (Como, Italy, 2001), Третьей Международной Конференции по отдаленной гибридизации, Главный Ботанический Сад им. Н.В. Цицина РАН (Москва, 2003), XI Plant and Animal Genome Conference (San-Diego, USA, 2003), International workshop NARO (Nishinasuno, Japan, 2003), конференции «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке» (Москва, 2003), III съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004) и международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009).

По материалам диссертации опубликовано 24 научные работы, из них девять статей в рецензируемых отечественных (б) и международных (3) журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, и восемь тезисов на конференциях.

Структура и объем диссертации.

Работа изложена на 193 страницах и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы из 362 источников, в том числе 300 иностранных, и приложения. Иллюстративный материал содержит 18 таблиц (одна в приложении) и 45 рисунков.

Благодарности.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. В.А. Соколову, оказавшему неоценимую помощь в работе; к.б.н. Н.И. Белоусовой и к.б.н. Е.С. Фокиной за- предоставленный коллекционный' материал; д.б.н. Т.Н. Наумовой за помощь в проведении эмбриологического анализа и интерпретацию результатов исследований; моим ближайшим коллегам по работе с гибридами к.б.н.

Т.К. Таракановой и к.с.-.х.н.| А.Ю. Кравченко! за участие, постоянную поддержку и* обсуждение работы, А.П. Михайловой, Т.Е. Космаковой, Э.А. Абдырахмановой и О.И. Лисициной- за техническую помощь в выращивании растений и обработке материала.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Белова, Ирина Васильевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Д.Ф. Петровым с сотрудниками впервые была продемонстрирована возможность передачи бесполосеменного способа размножения при гибридизации кукурузы с апомиктом Tripsacum dactyloides. Выделение 38-хромосомных (20Zm+18Td) растений с одним полным геномом трипсакума, которого было достаточно для экспрессии апомиксиса более 20 поколений, является уникальным результатом; который не был повторен вплоть» до начала 90-х гг. французскими1 учеными [Leblanc et al., 1996; Grimanelli et al., 1998b].

Редукция хромосом в* результате факультативности апомиксиса! и спонтанного получения* как гаплоидных апомиктов (я+0), так и полового потомства-(Вп, п+п) позволили' вести дальнейшее сокращение числа хромосом дикого* родителя, которые наряду с апомиксисом, несут нежелательные для селекции признаки. С целью выявления таких растений был предпринят скрининг коллекции кукурузно-трипсакумных гибридов лаборатории цитологии и апомиксиса растенийг ИХБФМ СО РАН. Наиболее важным« результатом цитогенетического изучения было выявление 39-хромосомных апомиктов, которые имели 30 хромосом кукурузы и 9 хромосом трипсакума. Девять хромосом дикого родителя на сегодняшний день является наименьшим числом, обеспечивающим передачу апомиксиса кукурузно-трипсакумным гибридам, но- для устойчивой экспрессии этого признака необходимы еще три генома кукурузы.

Асексуальное размножение у 38- (20Zm+18Td) и 39-хромосомных (30Zm+9Td) гибридов было подтверждено тестами по потомству, цитологически и с помощью анализов изозимов и продуктов ПЦР. Более того, эмбриологическое изучение двух линий с 9 хромосомами трипсакума показало, что они имеют Antennaria-тип мегагаметогенеза- и партеногенетическое развитие зародыша, которое начинается после оплодотворения, центральной клетки зародышевого мешка. Таким образом, эмбриологически была подтверждена митотическая диплоспория, которая характерна для T. dactyloides. Несомненный интерес представляет тот факт, что у гибридов не было обнаружено опережающего развития зародыша, которое неоднократно отмечено у трипсакума.

Способность к гибридизации с накоплением геномов (Вш, 2п+п) является характерным признаком апомикгов. Такие гибриды были обнаружены в последовательных поколениях 39- и 49-хромосомных линий, что позволило провести их сравнительный анализ по морфометрическим признакам. Различия между ВцГгибридами и исходной линией были достоверны.по ряду показателей, и с накоплением геномов кукурузы ее признаки усиливались. Гибриды с 30 кукурузными- и 9 трипсакумными хромосомами, как и 38-хромосомные, имели промежуточное наследование между родительскими, видами по количеству стеблей, ширине листа; длине междоузлия, числу рядков в початке, массе зерновки.

Полученные в результате Вш-гибридизации линии с различными» i соотношениями» материнских и отцовских геномов-кукурузы были использованы для- анализа по признаку выполненности семян. Была выявлена различная экспрессивность импринтинга у кукурузно-трипсакумных гибридов« при? отклонении балансового числа эндосперма от 2 : 1, которое очень критично для кукурузы. При. соотношениях материнских и- отцовских геномов кукурузы в эндосперме 6 : 2, 6 : Г, 8 : Т и, 8' : 1 гибриды, как и трипсакум, завязывали выполненные зерновки, что говорит об отсутствии экспрессии импринтинга при'их формировании. Таким образом, импринтинг у кукурузы активно подавляется в присутствии геномов трипсакума и, как оказалось, даже отдельных его хромосом.

Изучая« причины неполной женской фертильности гибридов кукурузы с трипсакумом, мы показали, что завязываемость семян у них определяется гаметофитной совместимостью при росте пыльцевой'трубки, кукурузы в столбике гибридов, экологическими условиями и генотипом материнского растения. Линии разного происхождения с 40-хромосомамшкукурузы и 9 хромосомами трипсакума отличались по завязываемости, что, видимо, связано с вариабельностью по кукурузной составляющей. Размера семяш у гибридов кукурузы с трипсакумом проявляет зависимость от соотношения у них мужских и. женских- геномов кукурузы, а также генотипа материнского растения и опылителя. Различия по средней массе зерновок при опылении диплоидной и тетраплоидной кукурузой достоверны у всех линий в различных условиях выращивания. Исключение составляет диплоидный гибрид F\ Wilson, который как опылитель не уступает тетраплоидной. кукурузе. В результате проведенных экспериментов можно заключить, что признак массы зерновки у кукурузно-трипсакумных гибридов имеет высокую генетическую вариабельность и может быть увеличен генетическими и селекционными приемами. Так, последние исследования нашей лаборатории показали увеличение средней массы зерновок при обработке растений 5-азацитидином - ингибитором метилирования ДНК [Соколов и др., 2010]

Генетический, контроль апомиксиса активно изучается у различных видов растений, и демонстрирует различия между ними, связанные с биологическими особенностями и типом асексуального размножениям И если при.1 апоспории, за исключением имеющего 5-локусный контроль Роа pratensis, имеются? доказательства контроля апомиксиса кластером сцепленных генов, то* у диплоспорических видов обнаруживается все больше свидетельств полигенного контроля не сцепленными локусами. Обобщая экспериментальные данные, которые были накоплены при изучении- апомиктичных гибридов- кукурузы« с трипсакумом, мы впервые экспериментально показали, что апомейоз и партеногенез у Т. dactyloides наследуются независимо. Результаты, гибридологического анализа дают возможность с большой вероятностью заключить, что апомейоз (диплоспория) контролируется одним доминантным геном или группой^ сцепленных генов и имеет высокую пенетрантность. Партеногенез, напротив, находится, под! контролем многих генов и его проявление зависит от генетических и внешних факторов.

Коллекция- апомиктичных линий, полученных в лаборатории цитологии и апомиксиса ИХБФМ СО РАН, представляет необходимый материал для изучения генетической природы митотической' диплоспории, знание которой необходимо для дальнейшего использования апомиксиса в' целях закрепления гетерозиса и хозяйственно-полезных признаков у культурных растений. Несомненный селекционный интерес представляют адаптивные качества кукурузно-трипсакумных гибридов^ переданные диким видом, такие как засухо- и солеустойчивость, наличие аэренхимы, позволяющей выживать на затопляемых почвах, и холодостойкость. Гибриды с 30' кукурузными и 9 трипсакумными хромосомами значительно превосходят кукурузу по урожаю зеленой массы, содержанию протеина и переваримых компонентов, а также содержанию полиненасыщенных жирных кислот в семенах [Тараканова и др., 2008]. Полевые испытания подтвердили высокий потенциал гибридов как кормовой культуры в засушливых условиях п. Ботаника Краснодарского края, когда они оставались единственными зелеными кормовыми растениями в августе и сентябре (Тараканова, личное сообщение). Все это делает гибриды кукурузы с трипсакумом перспективной культурой, преодоление мужской стерильности которой может поставить ее в ряд ценных кормовых растений, полученных методами традиционной селекции.

159

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белова, Ирина Васильевна, Новосибирск

1. Батыгина Т.Б. Апомиксис // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции: Т. 3.: Системы репродукции / Под ред. Т.Б. Батыгиной. СПб.: Мир и семья, 2000а. - С. 143-145.

2. Белова И:В;, Кравченко А.Ю.1, Наумова Т.П., Соколов В.А. Эмбриологическое изучение способа; размножения- апомиктичных кукурузно-трипсакумных гибридов // Вестник НГАУ. 2011. -№ 1 (17). - С. 23-28.

3. Белоусова> II.И. 46-хромосомиые гибриды от скрещивания диплоидной кукурузы с те-фаплоидным. трипсакум // Цитология и генетика культурных растений / Под^ед:.Д.Ф^^Петрова:,- Новосибирск:^^Наука; 1972^ С. 36-48;

4. Белоусова Н.И. О наследовании элементов апомиксиса в потомстве 46-хромосомных гибридов кукурузы с трипсакум // Апомиксис у растений и животных / Под ред. Д.Ф; Петрова. Новосибирск: Наука^ 1978. - С. 78-87.

5. Белоусова Р1.И., Фокина Е.С. Полиэмбриония в потомстве кукурузо-•фипсакумиых гибридов // Генетические основы селекции / Под ред. Д.Ф. Петрова. Новосибирск: Наука; 1982. - С. 33-39:

6. Белоусова Н.И. Изучение новых гибридов от скрещивания кукурузы с трипсакум // Генетические основы апомиксиса и селекции растений / Под ред. Д.Ф. Петрова. Новосибирск: Наука, 1984. - С. 31-35.

7. Белоусова Н.И., Довженко Л.И: О получении межродовых гибридов Zea mays х Tripsacum dactyloides II Цитология и генетика культурных растений / Под ред. Д.Ф. Петрова. Новосибирск: Наука, 1967. - С. 55-65.

8. Белоусова- Н1И., Лайкова Л.И. Изучение потомства 46-хромосомных гибридов ZEA MAYS х TRIPSACUM DACTYLOIDES L. // Апомиктическое размножение и гетерозис / Под ред. Д.'Ф. Петрова. Новосибирск: Наука, 1974.-С. 48-58.

9. Белоусова Н.И., Лайкова Л.И: Изучение потомства 46-хромосомных гибридов .Zeamays х Tripsacum dactyloides L. II Апомиксис и его значение в-эволюции и селекции / Под ред. Д.Ф. Петрова. Новосибирск: Наука, 1976. -С. 73-76.

10. Г4'. Боровский М.И., Коварский А.Е. Межродовая гибридизация- кукурузы с трипсакум (Tripsacum dactyloides L.)7/ Изв. АН Молдавской ССР. 1967. -№14.-С. 25-35.

11. Камелина О.П. Апогаметия // Эмбриология цветковых растений. Терминология и- концепции. Т. 3. Системы репродукции / Под ред. Т.Б. Батыгиной. СПб.: Мир и семья, 2000: - С. 165-169:

12. Карпеченко Г.Д. Экспериментальная полиплоидия и гаплоидия // Теоретические основы селекции растений. Т. 1'. Общая селекция. М.-Л., 1935.-С. 397-435.

13. Кашин A.C. Гаметофитный-апомиксис как неустойчивая система семенного размножения у цветковых. Саратов: Научная книга,12006. - 310 с.

14. Лайкова Л.И: Эмбриологическое изучение трипсакум и гибридов.кукурузы х трипсакум- // Апомиктическое размножение и гетерозис / Под ред. Д.Ф.* Петрова. Новосибирск: Наука, 1974. - С. 65-73.

15. Лайкова Л.И. Цитоэмбриологическое изучение гибридов кукурузы, с трипсакум // Апомиксис и его значение для эволюции и селекции / Под ред. Д.Ф. Петрова. Новосибирск: Наука, 1976. - С. 77-84.

16. Лукина Л.А., Юдин Б.Ф. Нередуцированный апомиксис у 76-xpoiviocoMHbix гибридов кукурузы с трипсакум // ДАН. 1983. - Т. 273. - № 5. — С. 12461248.

17. Лукина Л.А., Юдин Б.Ф. Ступенчатый радиационный мутагенез при регулярном апомиктическом размножении // Проблемы апомзаксиса и отдаленной гибридизации / Под ред. Д.Ф. Петрова. Новосибирск:: Наука; 1987.-С. 71-78.

18. Наумова, Т.Н. Диплоспория // Эмбриология цветковых ^растений. Терминология и концепции. Т. 3. Системы репродукции / Под ред. Т.Б. Батыгиной. СПб.: Мир и семья, 2000. - С. 151-157.

19. Петров Д.Ф. Значение апомиксиса для закрепления гетерозиса ГУ ДАН. -1957. Т. 112. - № 5. - С. 954-957.

20. Петров Д.Ф. Генетически регулируемый апомиксис. Новосибирске, 1964. -187 с.

21. Петров Д.Ф. Генетические основы апомиксиса. Новосибирск: На^гка, 1979. - 278 с.

22. Петров Д.Ф., Белоусова Н.И., Юрчиков Ю.Н. Цитогенетическое изучение гибридов между тетраплоидными' формами кукурузы и тригжсакум // Генетика. 1968. - Т. IV. - № 3. - С. 58-71.

23. Петров Д.Ф., Белоусова Н.И., Фокина Е.С. и др. Цитологическое изучение гибридов кукурузы с трипсакум и наследование элементов апомикс^иса у них // Апомиктическое размножение и гетерозис / Под ред. Д.Ф. П<=^ггрова. -Новосибирск: Наука, 1974. С. 11-47.

24. Петров Д.Ф., Фокина Е.С., Белоуеова Н:И. О характере наследственной изменчивости при регулярном апомиктическом размножении // Апомиксис и его значение для эволюции и селекции / Под ред. Д.Ф. Петрова. -Новосибирск: Наука, 1976b.-С, 85-95:

25. Петров; Д.Ф:, Белоуеова НМ:,' Фокина E.G. Наследование апомиксиса и. его ■ элементов.у= гибридов?кукурузы с трипсакум 7/ Генетика: 1979: - Тл XV.

26. Петров; Д1Ф:, , Белоусовш; Н:Щ Фокина Е.С. Основные особенности; наследования элементов апомиксиса у некоторых; гибридов кукурузы с трипсакум5 // Генетические основы; селекции. / Под ред:. Д.Ф. Петрова. -Новосибирск: Наука, 1982а. • С. 4-32. л

27. Петров; Д.Ф.,. Белоуеова; Н.И:, .Фокинач Е.С.: Передача^ апомиксиса от трипсакум к. кукурузоподобным • гибридам // Отдаленная гибридизация иапомиксис / Под ред: Д;Ф:< Петрова: Новосибирск: Наука, 1982b. - С. 32-52.

28. Негров . Д.Ф., Белоуеова;Н:И:, Фокина E.G. Передача? способности* к . регулярному апомиктическому размножению от трипсакум к кукурузе // , Теоретические основы селекции / Под ред. Д.Ф. Петрова. Новосибирск:1. Паука, 1985.-С. 21-47.

29. Поддубная-Арнольди; В:А. Цитоэмбриология; покрытосеменных растений; Основы и перспективы. -Mí: Наука; 1976.,- 508 с.38:. Рандольф Л.Ф: Цитогенетические данные о происхождении и эволюции кукурузы // Кукуруза и ее улучшение. М.: ИЛ, 1957. - С. 19-54.

30. Соколов В.А. Независимое наследование и экспрессия апомейоза и партеногенеза у гибридов кукурузы с трипсакумом // ДАН. 2000. - Т. 374. -№ 2.-С. 280-282.

31. Соколов В.А. Импринтинг у растений // Генетика. 2006. - Т. 42. - № 9. - С. 1250-1260;

32. Соколов- В;А., Киндигир Б:, Хатыпова. И;В. Изучение .'апомиктичныхг кукурузно-трипсакумных гибридов // Генетика.,- 1998а. Т. 34. - № 4. - С. 492-498;

33. Соколов; В.А., "Киндигир Б., Хатыпова И.В; Апомиктически размножающиеся; 39-хромосомные; кукурузно-трипсакумные гибриды // Генетика. 1998b. - Т. 34. - № 4. - С. 499-506.

34. Соколов В;А., Ианихин П.А., Тараканова-Т.К. Существуют ли гаметофитный апомиксис у диплоидных цветковых растений? // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. - Т. 15; -№:!. -С. 80-10Г.

35. Соколов В.А., Тараканова Т.К., Абдырахманова Э.А. Способ получения крупнозерных форм у апомиктичных гибридов кукурузы. Патент Российской; Федерации Лг2 2379882, бюл. № 3, 2010.

36. Тараканова Т.К., Соколов В: А., Абдырахманова Э;А., Блэюг С.А. Отдаленные скрещивания как источник увеличения селекционного разнообразия:зерновых // Вестник ВОГиС. 2008. - Том 12. - № 4. - С. 672679. г . . . '

37. Фокина; E.G. Частота нолиэмбрионии в- потомстве кукурузо-трипсакумных апомиктов // Апомиксис у растений и животных / Под ред. Д.Ф. Петрова. — Новосибирск: Наука, 1978.-С. 87-92.

38. Фокина Е.С. О некоторых особенностях эмбриологии 38-хромосомных' апомиктических гибридов кукурузы с трипсакум // Индуцированный

39. Юдин Б.Ф., Хватова М.Н. К использованию колхицина в изучении межродовых гибридов кукурузы с трипсакум // Отдаленная гибридизация и апомиксис / Под ред. Д.Ф. Петрова. Новосибирск: Наука, 1982. - С. 10-18.

40. Юдин Б.Ф., Лукина Л.А. Соматически расщепляющийся клон у апомиктического гибрида кукурузы с трипсакум // Генетика. Т. XXIV. - № 5. - 1988:-С. 878-884. .

41. Юдин Б.Ф., Соколов В.А. Об отсутствии апомиксиса у линии кукурузы 8313 // ДАН: 1989: - Т. 309. - С. 219-222.

42. Akiyama. Y., Hanna W.W., Ozias-Akins P: High-resolution- physicals mapping? reveals that the apospory-specific genomic region,(ASGR) inGenchrus ciliaris is locatedona.heterochromatic and hemizygous region,;ofasingle: chromosome //

43. Theor. Appl. Genet. 2005. - V. 111. - P. 1042-1051.

44. Albertini E., Barcaccia- G., Porceddu A., Sorbolini S., Falcinelli" M. Mode of: reproduction is detected by Parthl and Sexl SCAR markers; in a wide range of facultative apomictic Kentucky bluegrass varieties // Mol. Breed: 2001a. - V. 7. -P. 293-300.

45. Albertini E., Porceddu A.,. Ferrantii E., Reale L., Barcaccia- G., Romano В., Falcinelli Mi Apospory^and? parthenogenesis may be:imcou%ledAwFoa~prdtensisi: . A cytological investigation // Sex. Plant Reprod. 2001b: - V. 14.- P. 213-217.

46. Alves E.R, Cameiro V.T.C., Araujo A.C.G. Direct evidence of pseudogamy in an apomictic Вrachiaria brizanthci (Poaceae) // Sex. Plant Reprod. 2001. - V. 14.1. P. 207-212. ,

47. Anand S;C., Eeng-E:R Comix; Tr/pjacwm hybrids // Maize Genet. Coop: Newsh -1963. -V. 37-P.41.

48. AnandS:C., Leng E.R. Differential crossability of maize strains with Tripsacum II Cytologia. 1964. - V. 29. - P. 324-329.

49. Anderson E. Cytological?observations on Tripsacum dactyloides // Ann. Mo. Bot. Gard-,- 1944^- V. 31>-РГ 317-3231

50. Araujo A.C.G., Mukhambetzhanov S., Pozzobon M.T., Santana E.F., Carneiro V.T.C. Female gametophyte development in apomictic and sexual Brachiaria brizantha (Poaceae) // Rev. Cytol. Biol. Veg. Bot. 2000. - T. XXIII. - P. 13-28.

51. Asker S. Gametophytic apomixis: elements and genetic regulation // Hereditas. -1980.-V. 93.-P. 277-293.

52. Asker S.E., Jerling L. Apomixis in plants. Boca Raton, FL: CRC Press, 1992. -298 p.

53. Bantin J., Matzk F., Dresselhaus T. Tripsacum dactyloides (Poaceae): a natural model system to study-parthenogenesis // Sex. Plant Reprod. 2001. - V. 14. - P." 219-226.

54. Bashaw E.C., Hanna W.W. Apomictic reproduction // Reproductive versatility in the grasses / ed. G.P. Chapman. Cambridge: Cambridge University Press, 1990. -P. 100-130.

55. Bashaw E.C., Hussey M.A., Hignight K.W. Hybridization (n+n and 2n+n) of facultative apomictic species in the Pennisetum agamic complex // Int. J. Plant Sci. 1992. - V. 153. - № 3; - P. 466-470.

56. Battaglia E. Apomixis // Recent advances in the embryology of angiosperms / ed. P. Maheshwari. New Delhi: Indian Society of Plant Morphologists, 1963. - P. 221-264.

57. Berger F., Grini P.E., Schnittger A. Endosperm an integrator of seed growth and development // Curr. Opin. Plant. Biol. 2006. - V. 9. - P. 664-670.

58. Berger F., Hamamura Y., Ingouff M., Higashiyama T. Double fertilization1 -caught in the act // Trends Plant Sci. 2008. - V. 13. - P: 437-443.

59. Bergman B. Meiosis in two different clones of the apomicitic Chondrilla juncea // Hereditas. 1950. - V. 36. - P. 297-320.

60. Bergquist R.R. Transfer from Tripsacum dactyloides to corn of a major gene locus conditioning resistance to Puccinia sorghi // Phytopathology. -1981. -V. 71.-№. 5.-P. 518-520.83