Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рост дрожжей на селенсодержащих средах и накопление селена в биомассе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Рост дрожжей на селенсодержащих средах и накопление селена в биомассе"

ргв оа

1 3 МАЙ 1996

На правах рукописи

ЖИЛЬЦОВА ТАТЬЯНА СЕРГЕЕВНА

РОСТ ДР0ЖЖЕЙ1А"¥ПЕНВ1ЩЕРЖАЩИХ СРЕДАХ

И НАКОПЛЕНИЕ СЕЛЕНА В БИОМАССЕ

Специальность 03.00.23. — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1995

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д. И. Менделеева па кафедре промышленной биотехнологии, в Госу^ дарственном научно-исследовательском институте биосинтеза белковых веществ и в Институте питания РАМН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, чл.-корр.

Технологической Академии РФ Градова Нина Борисовна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Летунова Светлана Владимировна; •— кандидат биологических наук, ; Сатрутдинов Айдар Дамирович.

Ведущая организация: Институт пищевых веществ

Российской Академии Наук (г. Москва).

Защита состоится « 77 » Ш^^ЩГ 1995 г. в /О- часов на заседании диссертационного совета Д 053.34.13. в Российском химико-технологическом университете им. Д. И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская площадь, д. 9.

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре Российского химико-технологического унинерентета им. Д. И. Менделеева.

Автореферат разослан « 1995 г

Ученый секретарь диссертационного совета

И. И. ГУСЕВА

-л-

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. _

Актуальность проблемы. . В последнее десятилетг^ показана важная роль в обмене веществ человека, животных и микроорганизмов селена, который замещает серу в серосодержащих аминокислотах. И в то же время наблюдаете? снижение количества селена в трофических цепях вследствие увеличения содержания в природных средах техногенной серы, конкурирующей в природе с селеном [Ермаков В.В., 1974]. Следствием этого является повышенная потребность содержания селена в кормах и продуктах питания (Мишанин Ю.Ф., 1992]. •

Экспериментальными 'исследованиями показано, что эффективность физиологического воздействия минеральных компонентов, и в частности селена, в значительной степени повышается, если последние поступают в ■ организм гявотних \П человека з органической форие (СогаЬэ Й.Е., 1Э86].

Физиолого-биохимические свойства дрожжей, а таете опыт их производства и 'принрнешш определяют дрожо. как наиболее перспективный объект для получения на их основе препаратов, обогащенных селеном. Рядом зарубежных фирм и отечественны!® исследователями показана возможность получения селенобогащенных препаратов на основе пищевых пекарских и пивных дрсизей [препарата "0лигогал-£3е", "Селена", Реиетникова й- ., 1Э74; Даиберг Б.Э. и др., .1990]. В напей стране имеется большой про!апменный опыт производства биомассы дроетей на ряде промышленных видов-сырья: этаноле, н-парафинах, мелассе и др.

Целью настоящей' работы явилась разработка' научных основ для получения селенобогащенных продуктов специального назначения на основе лр07£зевого производства.

Цель работы определила следующие основные задачи исследований:- изучение влияния селена на рост дробей; -определение уровня и фср>.а накопления селена в биомасса в зависимости от условий культиЕирояения; - т'.зучепие особенностей метаболизма селена в дрежгах; - . разработка способов культивирования дрогаей, как основы для разработки технологии получения дрожяевнх продуктов, обогащенных органическим селеном. Научная новизна. Установлен характер воздействия широкого

диапазона концентраций селена на рост дрожжей рода Candida Выявлены две физиологические группы дрояяей во степени селенорезистентности: резистентные (%0= 20-60 дг5е02/л) и нерезистентные (G50=0,I-20 игБеС^/л). Показано влияние источника углерода и условий культивирования на селенорезистентность дрояжей разных физиологических групп: повышение селенорезистентности при увеличении концентрации растворенного кислорода, концентрации в среде фосфора и меда, снижение при повышении концентрации молибдена и температуры культивирования и отсутствие влияния различных концентраций серы и соотношения серы и селена. Впервые показана связь между селенорезистентность» дрояяей и активностью" ферментов глутатионредуктазы к селензависиыой глутатионпероксидазы-Оольшая ферментативная активность отмечена у. селенонерезистентных штаммов. Изучены закономерности накопления селена в клетках дрояяей: установлен больший уровень накопления селена в селенонерезистентных штаммах, а также скизение уровня накопления селена при повышении концентрации фосфора и молибдена в среде культивирования'. Впервые исследована коыпартыенталмзашя селен* в обогащенных селеном дрожаах: определена большая часть селена (72£) в белках и аминокислотах, иекьшая в липидах (IS) н в виде неорганического селена (21%), содержание которого зависит от штамма дрояяей. Содержание свобода« селеноашнокислот увеличивается при повышении ковдентращш селена в среде. Впервые в дрожках найден связываадсй кобальт селеноцкстеннсодергагзй белок ыеталлотионеин.

Практическая значимость. Отобраны перспективные . стякш этаиолокисляжщых, углеводородокисдяюздх дрсвпей рода Candida, а также рода Saccharomyces для получения ка их осноЕе селенобогэщйнних препаратов специального назначения. Разработаны исходные данные .для лабораторных регламентов получения дрогжей с разшы уровней содеряашя селена: кормовой добавки с содержание« ' селена около 2,0 ыг/кг, ветеринарного препарата с содерганиеи. селена около 20, иг/кг; пищйвсй добавки с содержанием селена около 20,0 «г/кг; ветеринарного и лечебного препаратов с содержанием селена до 800 ыг/кг. Результата использована для •

-з-

эзработки опытно-промшленного регламента получения паприна, Зогащенного селеном до 2,0 мг/кг, на основании которого эрзботана на Новополоцком заводе опытная партия продукта 5ъеыом 500 кг.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из зедения, обзора литературы, материалов и яетодов исследования, :ссперииентальной часта, выводов, списка литература. Работа злояена на 223 страницах кашнописного текста, содержит 17 тсунков и 17 таблиц. Список литература вклвчает 323 знненовашя, из них 284 - иностранные работы. *

■ ЗКШЕШЖНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. Объекты и метода Есследозапгя. в работе использованы прокыаленные этааодассиияяаруг^'е п арафтюкислягщяе птз^и дрогкеЯ рода Candida, ' а тахга дро эда Saccharo:ir/ces из коллекции ГосНКйсйнтезбелох. , Дрозян вырастали на минеральной среде "И", кодифицированной зависимости от це.л эксперимента. Периодический процесс рльгавкрования осуществляли в колбах, инкубированных на качзлке ри 220 об/кин, а такта в ферментерах "?,!2рублЕК" и "Фермус" прг 3 среда 5,5-5,7 и температуре оптимально:! для варащиззекых ran.toB. Непрерывное культивирование проводили з фр^шетерп:: Внотек" и "Елоетат". 3 качестве .единственного источника глерода использовала синтетический этанол, н-пзрафпни, мелассу глюкозу в ззвисикости от палей эксперимента. ' Рост культур тоеделлли турбидагатрическим п несоЕьа кзтодаш. В качества сочника селена использовал! Se02 или HgSeOg, 'кечеш же я эмеченнке изотопом 75So з виде 0,1 и 1,0% растворов.

Определенна селена проводила флуоринетряческку методом з -ЯГ У.Я lAlfthan А., 1984], либо методом радаоакишнаг япдякатсров Рачянсккй., 1978] в биомассе, шделешгой центрифугированием и лергенной лисфилыю пли в распылительной суш.з.

Активность ферментов салензаписицой глуаатиоппероксидазы и гсутатиоиредуктазы определяли согласно ¡¿етодаше [Iisura Li., 388]. ,

Субклеточные " фракции дрсетей выделяли кетодси

-к-

дифференциалъного центрифугирования гомогената клеток, разрушенных в дезинтеграторе MSK ("Erawn Melsungen", ФРГ) [Егорьева, Белов, 1984]. Неорганический селен удаляли диализом [Podgorska. В., 1985]. Липиды отделяли экстракцией смесью хлороформа и метанола, низкомолекулярные соединения- двойной экстракцией ТХУ, аминокислоты осаждали на колонке со смолой Dawex 50x8 и элюировали раствором HCl [Дайн М. и др., 1979). Специфический селенсодержащий белок извлекали при фракционировании растворимой фракции белка на колонке ("Pharmcia", Швеция) с сефзкрилом S-ID0 [Белов А., 1984].

При ыатеыатичей<ой обработке данных использовали следу»rote метода: регрессионного анализа, итераций, МНК и корреляционный анализ 1Лакин Г.Ф,, 1990).

3, Результаты исселедований и их обсуждение.

• 3.1. Влияние селена на рост дрожжей и накопление селена в биомассе.

При изучении влияния различной концентрации селена в "среде культивирования на рост изученных дрожжей рода Candida и рода Saccharomyces показано, что увеличение концентрации селена в среде культивирования от 0,5 до 120,0 мгБеО^/л приводит к уменьшению удельной скорости роста и концентрации биомассы и. не оказывает влияние на продолжительность лаг-фазы роста (табл. 3.1.I). '

На кривой зависимости роста всех изученных штаимов дрожжей от концентрации селена выделяются три участка (рис. 3.1 Л). Первый характеризует стимуляцию роста дрошзеЯ, что является прежде всего изменением активности фермента . глугатионпероксидазы,. содержащего селеноцистеин tGennity J.M., 1985). Второй участок-ингибирование роста дрожжей и резкое снижение активности роста при определенной для каждого штамма концентрации селена. Это fca основании литературных данных может быть связано с образованием селенорганических соединений в таких концентрациях, которые снижают активность ферментов основных путей метаболизма [Ермаков В.В., 1971). Третий участок- отсутствие влияния' дальнейшего повышения концентрации селена на низкий уровень активности роста

Таблица 3.1.I.

Характеристики роста дрожжей С.иг1115 ВСБ-651 при различной концентрации селена в среде и способе культивирования.

Стелет. Концетрация Удельная скорость Прирост биомассы

аэрации селена Бе02. роста ■ !

г 02/л час мг/л час г/л

контроль 0,142 3,26

0,4 0,5 0,150 3.26

5,0 0,061 0,41

контроль 0,240 4,00

2,0 0,270 5,40

10,0 0,200 4,40

4,0 20,0 разов 0,130 0,70

20,0 дроби 0.1Э0 5,10

50,0 разов 0,072 0,20

50,0 дроби 0,120 3,20

Таблица 3.1.2.

Влияние концентрации селена на рост дрс~:.ей.

¡ШШЗ !Селенорезмстент! Концентрация селена, ~прл

црожжей !ность ! водящая к. 50« сннгекнэ

! ! роста (<т50), Ш5е02/л

IC.ethanolica ВСБ-651 ! 2С.Kruse1 ВСБ-896 1 3S.cerevi-siae ВСБ-834 ! 4S.cerevisiae ВСБ-835 I 5S.cerevisiae BCB-J-503 6С.maltosa ВСБ-744 ! 7S.cerevisiae ВСБ-irpoii! ac.maltosa ВСБ-8Э9 . ! SS.cerevislae БСБ-327.7 IOC.utilis ВСБ-651 ! IlC.utilis ВСБ-726 . !

%е+ 1 63,0

l ' 42,9

1 23,4

RSe- 1 13,9

RSe+. ! 24,9

%е- • t 1910

RSe- ; 14,9

RSe- t 10,7

RSe- - f 5,9

RSe- t 3,3

j 3,6

дрояхей, что отражает процесс адаптации культур к соединен! селена, как . отыечзлось рядок авторов [Gennity J.M., I98i Ковальский В.В., Г965]. На основании анализа этих зависшею' построена математическая ыодель для второго участка в bi уравнения прядай:

у = ах+- Ъ, где у- рост дрожгей при различной концентра: селена в среде; х- концентрация селана в среде культнькроагнш Коэффициенты уравнения представлены на рис. 3.1.1.■

Анализ полученных даннкх позволяет разделить дрожки отновашп к уровню концентрации селена на две физлолопгческ группы: селенорезистентные (%е+) и селенонерезистентные (RSe (табл. 3.1.2),' что не является бидовыы признаком штаыу Величина концентрация селена, приводящая к 50г сшшенив рос дротаей (Gg0), достигала величины 63,0 игБеС^/л и приближается даншп, получеш&щ для P,ge-l культуры Candida albicans ШЛ 8 Illikerson V'i.J., 1963]. ' •• •

Исследование накопления селена в биомассе (табл. 3.1. показало, что с увеличение« концентрации сажена в ере, пот"*ыается содержание селена б биомассе и снижается степень е: потребления из среды как следствие уменызекил 'хонцеятрац; биоаэсси в культуральной яздкостя. При зтоу выявлено, что R5j культура накапливают вдвое больше селена в биопассе, чеы при одинаковая условия;! культивирования. Степень потреблен; селена из среды ' при низшие его концентрация! выше д,' к5е_культур, при высоких- для rgef культур, что о'суьясняйт-с

различньш содержанием, Оиоыассы в. культуральноГ* кмдкоста zj культур различней селе коре экс 7 енткости (тгОд. 3.1.3).

Исследование показало, что .селенорезпстектность зависит с используемого источника углерода (рис. 3.1 Л). Все исследовании итзиш дроясей. характеризуются RSe_ прк культивировании и глюкозе. Накопление селена в биомассе при росте дрозкей в глюкозе подчиняется теи ге закономерностей, что к при росте к промышленных субстратах (табл. 3.1.3). Как было установлено %е- культура практически не изменяют своя резистентност (величина Gg0 не изменяется для культур C.mltosa ВСБ-744 ; ВСБ-89Э или несколько увеличивается для C.utilis ВСЕ-651 ;

А

Конпентрация ЗеО,, иг/л

Рве .3.1.1. Рост дробей на среде с различный источником углерода

и разной концентрацией селена. А-:1-С.1гШ15 ВСБ-651,этанол; Ь=Э6,1;а=-12,0 при х= 0,5-7,0

4-С.е-Шапо1:1са ВСБ-814,глжкоза;Ъ=Э5,4;а=-13,2 при х=0,5-7,0 Б-:3-С.^Шб ВСБ-651 .глюкоза; Ь=81,5; а=-2,3 при х= 5,0-30,0

5-C.ethanoli.ca ВСВ-814,этакол;Ь=258;а=-3,3 при х=50,0-70,0

Таблица 3.1.3.

Накопление селена в биомассе дрежяей при различной концентрацЕЯ серы и селена в среде.

Культура !Содержание в среде Концентрац! Содарканпе! Степень

дрожжей ¡селена серн ? биомассы { селена в г потребл.

!5е02 Б в среде ? бис:.;ассе » селена

1 ; ! 1гз среда

!ыг/л кг/л , г/л ! ¡¿Г/КГ » ОТ /3

! 0,5 6,8 3,58 ! 83,2' ' 1 83,3

ВСВ-651 ! 5,0 6,8 1,41 ! 405,1 ! 15,4

! 2,0 6,8 1,61 ! 217,3 » 23,1

! 1,3 100,0 2,68 ! 9,8 » 3,3

О.е'Шапо ! 0,5 6,8 3,57 I 52,4 " 5 61,1

Пса ВСВ- ! 5,0 6,3 3.24 1 227,5 1 20,7 ■

814 » 1 5 >

-e-

ВСБ-726 до 8,0-14,0 uSeC^A), в то.врет как для Rge+ культур эта величина резко уменьшается (для С. ethanolica Ь-Б-814 С50=3,4 '«¿гЗеО^/л, для C.taTisei ECB-BSS Gso= 17,8 ш^еС^/л).

При исследовании влияния температуры культивггроваккя на селекорезистентность тер^оголерактшх RSe+ штатов C.ethanolica BCB-8I4 u C.krusei ВСБ-8Э6 было установлено, что при повысакки температура с 32 до 40°С дакнае птастановятся К5&(вгличша G5£) на этаноле снижается до 4,5 urSeO^/л), что видико объясняется теапературозависиши характерен образования некоторой селенорганичесюа соединений CChau Y.К., 1978].

исследования показали, что изменение содержания серы в среде культивирования для изученных пташов дрохаей в пределах от 6,8 до 885,2 ыг/л не влияло на селенорезистентность дрожей. Однако наксилеше селена в биомассе, а таете степень его потребления уценьазэтся с увеличением содержания серы в среде (табл. 3.1.3). Показзно, что селен не uosot полностью заменять серу для хзучетшх птациов, так как при постоянной концентрации в среде культивирования cyisai сери и седепа 100 иг/л по мере увеличения конц^нтращЕИ селена характер роста дробей аналогичен росту прл постоянное содер^агсш серы а среде (рис. 3.1 Л). Рассьгогракше кали значения S/Se (100,142,160) не оказывали суцествешю.го влияния ка саленореэистентпостъ дробей".

При изучанзи влияния ряда шшеральнцх когдюнектоз ст>аха культквировзшш было показано существенное влияние ряда из inix на селаиорезистентность нзучэшпгх Еггашов дробей. Тай увеличение концентрации фосфора в срадо повизает

селонотзезистентность _птаиаа C.utilis БСБ-651 на БОЙ и не

оказывает влияния ка Rge+ иаш C.ethanolica ЕСБ-814, тогда как добавление «икроэлеыентов (цолибден, Сор, код) сшкает, хотя в в разной. степени, селенорезистешность обоих стаииов соответственно на 90 и 40?. ^ При проведении Ш'Э 2'' для ставка C.utilis ВСБ-651 получено-уравкеш"1 рзпзессн;:: у= 3,0Э-г 0,7ISj+ 0,37я->- 0,77s,- 0,223-,^+

где у-рост дроззеГг при определеннее концентрата: селена в срсдэ 2,0 К£г5в02/л, зт-фэсфохпТ-,05), ^т-цодъ(Cu59^ «Н20), г3~калыщЗ (СгС12»Н20), х4-шлкбден (йа,И00д»й20).

Лостоверяо показано, что селенорэ знстентность увеличивается при увеличении концентрации фосфора в среде (Р205 с 452 до 5650 ur/л), ко уменьшается накопление селена а биомассе с 247 до IOS аг/пг, что в соответствии с IFalcone С., 1963] ио-ет быть связано с конкуренцией кевду фосфатоы -и селенитом за уасто адссрбшпь При добавлении солей молибдена (Па^ИоО^«&>0 до 2,0 иг/л) кг;: селекорезжтенткость, так и накоплений селена в биомасса такгэ сшетзэтся (с 247 до 160 ioVkt) в результате неконкурентного Енгибнрования ; «олгбденсу транспорта селекггтэ [Еготлг Т.А., 1900]. '

Изучение влиякля степей; ээ-рашгя на селепсрэзпстентнссть rraraa . C.utllis ЕСБ-651 покззалэ, что при пультпЕЗсим^! зс~сй в колбе на качалке (сулг^гглоз г:::с::о 0,4 гО-,/л чг>с) гзллчпна C-cQ составляет 3,8 игБеС^/л, тогда щ-л

сулы.гЕГфсвзиз! в фзр-'сштерз с е:;сс::сй степенью зэрают [сульфитное число 4,0 гО,/л час) велгаша '>5q равна 15,0 ггБеО^/л. Енявлекшв закономернее?:! В-ишпш солен а :тз гост tporneñ сохраняются и пря высокой степени азрзщга (табл. 3.1.1). 'ак, пш увелзчешп концентрация селзна в средэ не из?гекяетек родотатольность лаг-фазы и сшпается скорость роста, одергггеге селена . в 'баонассе определяется прэ' "з есзго сяцеятрацкей. селена в среде, тэа' пах прп цсицантрзщп 5,0 гБсС^/л ri ргзшх условиях аэрегрз эта зе-гулгиа сссггяхгм'г 16—1С5 ж/тс. . Поскольку nci взссш.! crsrein - горз'.г;: элэксрекютегггЕОЬть дрелей зозснстсст, то ото hcsso:-sl~'; zczzi iipcipcc при 50,0 нгБсОул и привода? здзргглзм сол-зтз з Сислассэ до 5S3 it/ег.

!!сслздозалз5ь вогггегзгсеть езлече:: гсистешсзта

зрллей при длительном пассггоовгктл - па сраст с асЕста:пхе.чся ппгентрацией селена. Так, при посЯ2Довзтп;.ьнси сзссфоаашы (13 iccareñ) ira среде с поЕКзаасеЯся; кожж'л:з1:;-Л со.теия от I.J да 2 jjrSeOnAi показана возможность адаптация R Se_ втанма maltosa ВСБ-744 к повышенный ютщенграппяк селена, но при otc.v явлено снижение резистентности RSe+ птгииа C.ethanoilca. Б-814. -

-ю-

3.2. Исследование особенностей метаболизма селена в дрожжах.

Анализ полученных результатов дает основание предполагать что физиологические различия К£е+и KSe_ дрожжей рода Candida, ; также уровень накопления селена в биомассе могут быть связань как с различиями в адсорбционной емкости клеток к селену так и с активностью ферментов, участвующих в метаболизме селена.

Исследования степени адсорбции селена не выявило существенны* различий между исследованными штаммами. При сравнительное оценке, проведенной совместно с ИП РАМН, выявлена обратная зависимость между селенорезиствнтностью дрожжей и активность» ферментов. Так, при концентрации 5,0 ыгЗеС^/л активность глутатиокредуктазы составила для RSe+ культуры C.ethanoliça БСБ-814 1,7" отк.едишц, в то время как для К&е_ культуры C.utilis ВСБ-651- 35,7 отн.единиц; активность селензаЕисимой глутатионпероксидазы при Аналогичных условиях культивирования является соответственно 1,2' и 2,1 отн.единицы. Эти данные дают основание делать вывод о "fou, что в восстановлении селенита в кУ^ь^Уре пригашает участие глутатион и глутатионредуктаза, что подтверждается литерат^ыми данными [Dilworth G.L., 1977]. В то se время- RSe+ культура C.ethanollca ВСБ-814 видимо имеет другой иеханнзи восстаг.Ъвления селенита. Так, несмотря на различную активность глутатиокредуктазы у исследованных Rgê+ и Rge_ шташгоз при одинаковой концентрации селена в среде 5,0 ¿jrSeCg/Jï, активность глутатионпероксидазы, содержащей селеноцистеин, является величиной одного порядка, iî при этом содержание селенг в биомассе RSe+ втамна составляет 228 мг/кг, а в биомассе Rg^ ¿ггаша 485 иг/кг (табл. 3.Î.2).

Изучение распределения селена в клетках селенобогащекных дродгей по:.аззло, что основное его количество содержится в мембранам, аминокислотах и растворишх белках протошшзин-78-84% и дшль I6-22K в клеточной стенке. Основное количество селена в клетке RSe_ icyльтури C.utilis ВСБ-651 определено во фрикции белков и аминокислот- 72Х, и незначительное количество в лишдах- до 1% и в виде неорганического селена- 278. При Ф?а;;шюкировании клеток дробей ■ показано, что количество

высокомолекулярных соединений селена в клетках мало зависит от селенорезистентности дрожжей (90,5-90,6%) и уменьшается с ■ увеличением содержания селена в биомассе дщ RSe+ культуры C.ethanolica ВСБ-814 с 90,6Ж при содержании "селена в биомассе ГЭГ мг/кг до 85,2%-при 421 цг/кг. Содержание селеноаыинокислот в низкомолекулярных соединениях зависит от селенорезистентности 1 штамма и составляет 7,4% для RSe+ культуры и 5,9% для RSe_ культуры, а также от концентрации селена в биомассе, повышаясь для RSp+ культуры с. 7,4 до 13% при повышении содержания селена в биомассе от 121 до 421 ыг/кг. Содержание неорганического селенг в биомассе возрастает при повышении общего содержания селена с величины 14% при содержании селена в биомассе 9,8 мг/кг до

величины 28% при 302,8 иг/кг для RSe_штамма C.utilis ВСБ-651.

Количество неорганического селена зависит также от штамма дрожжей. Так, при концентрации селена в биомассе 9,8 мг/кг для ■ RSe+ 111731013 эта величина составляет 14%, в то время как для RSe_ птаыма 3235 при содержании селена в биомассе 5,1 иг/кг. Как свободные селенозминокислоты, так и селенос^инокислоты белковых гадролизатов представлены, "в основной, селеноыетиокинсл - 47-52% и селеноцистеинои -18-413.

При изучении растворимой белковой фракции дрозгей .

C.raltosa ВСБ-744, выраженных с различными концентрация!® селена л кобальта, был обнаружен специфический белок петаялотлоненк, связываний кобальт а содержащий селеноцисте1Ш.

3.3. Разработка способов получения селенс-бога'щенпнх дро^евых продуктов специального назначения.

Получешазе результаты при изучении селенорезистентности . дробей и накоплетьч селена в блсыэс'се ■ обосновывает выбор ¡гтаииов дрожгей для . получения селенобогащешси дрожжевых продуктов разного назначения.

Так для получения кормовых дрожжей, 'обогащенных селенсы. содержание которого не должно превышать 2,0 «г/кг, что связано с

когаоЯ :zz ввода в корковые рационы, как белковой добавки, воэ^огно использовать лзОые из исследованных птзыисв дробей на этаноле п ц-парзЯзшах (C.utilis BC5-65I,. С.mal tosa ВСБ-&9Э,

С.е1Ьало11са. БСВ-814).

ветертарно-профидактаческие кормовые добавки с содержанием селена не более 2^,0 иг/кг (на основании добавки в корца) возможно получать тага® при использовании лжбых из исследованных стаинов, но более предоочтктелышш .является стажа

С.и-Шэ ВСБ-651, С.тглПоБа ВСБ-744, ВСБ-899.

Для получения профилактических пищевых добавок с содержанием селена не более 20,0 мг/кг иоглю рекомендовать использовать пекарские вырациваеыые на иэлассе, желательно

Еггаг^га £.сегеу1з1ае ВСБ-про^. и ВСБ-835. ' 0

Получение ветеринарных и медицинских препаратов с высокий содержанием селена возыоано при ■ использовании К3е_ штатов, в частности этанолокисляквдзго С.и^ИБ ВСБ-651 и 5.сегеу1Б1ае БСБ-прои., культивируемого на иелассе.

При исследовании роста и накопления селена в биомасса при разных способах культивирования, проведенные совместно с ГосШГЛсшггезбелок, показано, что биомассу с содержание» салена не более 2,0 и не более 20.0 иг/кг возиогно получить как пр;: непрерывное, так п периодической процесса при содержании селенг в среде до 2,0 ыг5е0о/л и содержании сери о? 56 до 193 иг/л. Пр»; этой степень потребления салона из среды увеличивается при стпгиши концентрации сера до 6,8 иг/л. Условия хранении к репами постферглентащюнксй обработки бкс-массн когут не отличаться от принятых в прощалешэсти. Тате» образом, для получения продуктов с дашша содзркагоеи седанз иож> яспользовать ргзрЕЗотагаае ранее тсхколсгпчесг^а процесси получения кориоЕах дробей опркца и палрЕйа, о таггге пекарских дрогг.ей на излассе. •

Анализ результатов ггзучгкгл зжжвш концентрации седана в среде культивирования на рост и накоплена салена в биомассе показывает, что биомасса деш&ей с высоки;.; содержанием селена ■ксдат быть получена только при культивировании шгаьиа при высокой концентрации селена в среде. При это:.: активность роста ктамка снижается на 50% и более и. набладается низкая степень потребления селена из среда. Подученные данные яеились основой ля разработки способов культивирования дроззей для получения

Тгблица 3.3.1.

Плргтатри прсггессоз культивдрсзаний дрспей С.^Шг БСЕ-651 при разных условиях культивирования. '

Содерз.!Способ Шснцептр.Юодерзан.!Степэнь ¡Продуктов-»Величинг селепа 'внесен, '.биоуассы !селена !тотребл.!ность про-! К., а срэда!селена ! !в бяоыас-!селена !цессэ по

БеО, !в среду! !се ' ! «селену ' ^^Хде,

иг/л ! ! г/а ! иг/кг ! 5 !аг5е/л час!

Г 5,0 !разов. !

2 10,0 !рззов. !

3 20,0 1рззоз. !

4 20,0 !дроби. !

5 50,0 !рззов. ! 3 50,0 !дробн. !

6,99 ! 416,2 ! 82,0 г 0,32 { 1,03

4,57 1 555,2 I Г 39,0 » 0,23 ; 0,63

го ! 997,6 ? 10,0 ! 0,16 ; 0,29

6,22 ! 790,0 ! 35,0 ! 0,55 ? 0.60

0*65 I 899,7 ! 2,0 } 0,05 ! 0,05

4,65 ! 420,0 ' ! 5,0 '! 0,21 ! 0.07

№сиасся с высотам уровнен содержания селена *

При культивировали п?2!иэ зтаколокясляггсы

1.^1115 ВСБ-651 было йсследоваяо шшшяе различных коицэктрзт* елена от 5,0 до 50,0 пгБеО^/л в условиях высокой степега зрапяя прл скорости растворенного пгслорсдз 4,0 гС^/л чзс '7. ::?;:с-< уровне содэрхапзм серн 5,8 ххг/л (табл. 3.1.1). окззэио, что увеличешго концентр?ппп селена а среде до 50,0 г£е&,/л приводи? к нз:ссллегегэ селена з Опслассе до 1СОО мг/пг р газкоЗ степени _ вотреблепяя еелэнэ аз 'срад* до 2..". Пр:; тсСясу 2н^сенпл еусоют концантрацпЗ селена, кзх л чс~ю Сил5 йдподагзть, увеличивается азтгоность роста отгад» к степень >треблекяя салена из среда культивирования,- сдиако скг.гаетс;; •дер^апие салена в бясгзссе до 790 кг/кг (табл. 3.3.1). Для технологической оценк» разных резаков культивирования пользовалось ряд показателей: уровень содерг-кня селена г; сУассе, степень потребления селена из среда эдукгяБность -процесса по накопления' селена з Сяамссе с

:азатсль й1, ргыгаЛ схногзпав произведения ссдархаг-гля сзлснз " зиассе я степени его лотозблешя кз среда пса сп^гдэлелг.с::

концентрации селена Ygg'Xgp на произведение содержания селена в биомассе и степени его потребления из среда при концентрации селена 5,0 urSeC^/x• (табл. 3.3.1). Лучшими технологическими показателями по' YSe характеризуются режимы при разовой подаче селена в среду культивирования в концентрации 5,0 и 10,0 MTSeOg/n и режим с дробной подачей, селена в концентрации 20,0 urSeOg/fl. Более высокими показателями' К^ характеризуются режш с разовой подачей селена в концентрации 5,0 мг5е02/л и дробной добавкой селена в концентрации 20,0 мгЭе02/л. Данные пежины культивирования могут быть рекомендованы для получения биомассы с высоким содержанием селена. В целях предотвращения возкохности восстановления селена в биомассе показана необходимость быстрого термического инактивирования биомассы перед сушкой продукта. Высокая остаточная концентрация селена в культуральной жидкости при режиме культивирования с дробной подачей селена в концентрации 20,0 игБеО-^/л не является лимитирующим показателем при его практическом использовании. Необходимый объем производства такого продукта специального назначения с высоким содержанием селена возможно будет значительно ниже объемов производства основных продуктов кормовых или хлебопекарных дрожжей, следовательно и объем культуральной жидкости с высоким содержанием селена будет разбавляться культуральной жидкость» основного производства и не окакет влияние на состояние активного клз.

Выводы.

.1. Установлен характер влияния различных концентраций селена .от 0,5 до 120,0 мгБе02/л на рост дрожжей рода Candida и Saccharoroyces cere^isiae: стимулирующее действие или отсутствие влияния низких концентраций, резкое снижение -активности роста при определенной для каждого ETa!£,ia концентрации и отсутствие влияния дальнейшего повышения концентрации селена на низкий уровень активности роста дрожжей.

2. По величине концентрации селена, приводящей к резкому ■ снижению активности роста, изученные- штаммы дрожжей могут быть разделены на две физиологические группы: селенорезистентные (С50= 20-60 мгБеС^/л) и селенонерезистентные 0,1-20

игБеОр/л).

3. Выявлено, что условия культивирования оказывает разл:гшое влияние ' на степень селенорезистентности - дрозней обеих физиологических групп. Степень селенорезистентности значительно повышается (С50 с 3,8 до 15,0 мгЗе02.'л) при увеличении концентрации растворенного кислорода (с.0,4 до 4,0 ыгО^/л час), в меньшей степени- при повышении концентрации фосфора в среде культивирования п добавлении -уеда, снижается при. добавлекж нолибдена и. поЕыпешет темперзтуры культиввдования.- На степень селенорезистентности не оказывают влияние изменение кощентрат'И серы п добавление альбумина н аскорбиновой кислоты. Характер З.ШЕМ источника углерода зависит от тата дрозлей.

4. Установлено, что уровень накопления селена в бисчассе дроггей зависит от втпима и условий культивирования: - в селенонерезистенткых ■ пташгах накапливается селена в 2 разз, больше, чаи з селенорезистентных Егтаь'лах; - уровень накопления

уровень накопления селена в дровах разных физиологических групп повышается при увеличении в среде культивирования концентрации селена (с 0,5 до 50,0 итБеС^/л) я снижается в 10-20 раз-при увеличения в среде культивирования серы (с 6,8 до 100,0 уг/л), фосфора (Р2О5 от 492 до 5650 ж/л) и молибдена (до 1,0 иг/л). ' ■

5. Выявлена зависимость медду селенорезистенткостьэ дрогшей. рода Сапй1(3а . я активностью ферментов глутзтиеяредуктзгы к сёлензависгагаЗ гдутатаонпероксадазн. Большая .фериентатлЕкая даптвкость характерна, для селенокерезистеитних культур. .

6. исследовании ксяшартиекталазацяв селена в клетях дрозпей показано, что Сольная часть селена -(52-73%) содержится в цитоплазме во фрагами ашнокаслот ч растворила белков, меньшая в мембранах (323) и клеточной стенке (165).

7. При изучения распределения селена по Фракциям клеточки ко'шонезгтев селенобогацевшх дрогхей определено, что большая часть селена до 725 содержится в белках и аминокислотах, иеяыпее в липидзх ' 1,055), в виде неоргагагческого селена содерет-ся 14-28%, что зависит от шта'шз дрезехэй. Содержание езебодшх селеноаиикокислот, представленных селеиекетионином ' к

селеноцистеиноы (соответственно ■ 52 и 42%), зависит от селенорезистентности штамма и составляет 7,4% для селенорезистентнш .культур и 5,9 для селенонерезистентных, а также от концентрации селена в биомассе, повышаясь с 7.4 до 13" при повышении содержания селена в биомассе от 121 до 421 мг/кг.

8. В растворимой фракции белков С.maltosa ВСБ-744 найден иеталлотионеин, специфически 'кобальт-евязывающий белок, содержащий селеновдстеин.

9. На основании скрининга шташов дрожжей рода Candida и рода Saccharomyces отобраны шташы для получения селеяоОолщеннкх продуктов разного назначения: - кормовых дрожкей паприна и эприна, обогащенных селеном до 2,0 ас/кг и показана возможность использования любых промышленных штаммов; - ветеринарно-профилактическт кормовых добавок с содержанием селена до 20,0 иг/кг и шташов этанолассишлируквдх дрожжей C.utilis BCB-65I, углеводородокислящих дробей C.maltosa БСБ-744 и ВСБ-899;

- профилактических" пищевых добавок с содержанием селена до 20,0 «г/кг и штаммов S.cerevisiae ВСЕ-пром. и ВСБ-835;

- медицинских. и ветеринарных препаратов с содержанием селена до BOO мг/кг и иташов C.utilis ВСБ-651 и S.cere"visiae ВСБ-проы.

10. Разработаны способы -культивирования отобранных шташов дротаей рода Candida и сахаромицетов соответственно на этаноле и иелассе, обеспечивающие получение биомассы с различным уровней содержания селена, как основы для разработки лабораторного регламента получения селенобогащеншх продуктов равного назначения: - непрерывный реши культивирования для получения кормовых дрожвй на основе технологии, получения зприна и паприна; - непрерывный процесс культивирования для получения профилактячеких кормовых добавок' на основе технологии получения », эприна и паприна; - периодический процесс . культивирования для получения профилактических пищевых добавок на основе производства пекарских дрогшей; - периодический процесс культивирования для получения медицинских и ветеринарных лечебных препаратов с дробной подачей селена в среду . культивирования.

Опубликованные работы по теме диссертации.

1. Кильцова Т.е., Исакова Е.П., Шерова Т.Л.,* Градова Н.Б. Влияние селена на рост дрожжей p. Candida.//- Биотехнология.-

1993.- №5.- С.13-16.- Ъ

2. Хильцова Т.С., Градова Н.Б., Исакова Е.П., Белов А.П. Разработка технологии получения дрожжей обогащенных селеном. //Всероссийская конференция "Химия и технология лекарственных веществ".- Санкт-Петербург.- 1994.- 28-30 нюня.- С.II.

3. Кильцова Т.С., Градова Н.Б. Влияние состава среды культивирования на устойчивость дрожжей рода Candida к селену. '/ Биотехнология.- 1994.- ÍÍTI-I2.- с.12-15.

4. Исакова Е.П., Градова Н.Б., Ерошкн В.К., Белов А.П., 1ерова Т.Л., Жильцова Т.е., Горпенко Л.В. Способ получения 'иоыассы, обогащенной селеном. Заявка й 93056533/13 от 21 ;екабря 1993 г. '

5. Жильцова Т.е., ШаговаМ.В., Градова Н.Б., Голубкина H.A. сследование резистентности дрожжей ро.^а Candida. // риклэдная биохимия и микробиология. - 1995. - в печати.

6. Зильцова Т.е., Белов А.П., Градова Н.Б. Накопление и аспределение- селена в клетках обогащенных селеном дрожжей рода andida. //Прикладная биохимия и микробиология - 1995.- в печати;