Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм селена

Егорова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм селена
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм селена"

На правах рукописи

ЕГОРОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА НОВЫХ ПИЩЕВЫХ ИСТОЧНИКОВ ОРГАНИЧЕСКИХ ФОРМ СЕЛЕНА

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2006

Работа выполнена в ГУ Научно - исследовательский институт питания Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

Мазо Владимир Кимович

Голубев Михаил Аркадьевич

Козлов Леонид Васильевич

Ведущая организация: ГУ Научно - исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

Защита состоится «19» июня 2006 г. в 14.00 на заседании Диссертационного Совета Д 001.002.01. в ГУ НИИ питания Российской академии медицинских наук по адресу: 109240, Москва, Устьинский проезд, д.2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ питания РАМН Автореферат разослан « » мая 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук,

профессор В.М. Коденцова

aCQGfi ЦЗЬб

Актуальность темы

Концепция оптимального питания предполагает необходимость полного и адекватного обеспечения организма человека как макро, так и микронутриентами, а также минорными компонентами пищи.

Известно, что у современного человека имеет место недостаточное поступление с пищей микронутриентов и минорных компонентов вследствие снижения энерготрат и, соответственно, уменьшения общего количества потребляемой пищи. Таким образом, представляются актуальными поиск и разработка технологии получения новых пищевых источников эссенциальных микроэлементов, в частности селена, являющегося одним из важнейших антиоксидантов пищи.

Согласно современным представлениям биологическая роль селена в первую очередь определяется его антиоксидантным и иммуномодулирующим действием [Тутельян В.А и др.,2002, Beckett G.J., Arthur J.R., 2005]. Селен входит в активные центры ферментов антиоксидантной системы глутатиона -глутатионпероксидаз [Evenson J.K. et al., 2004]. Селеноэнзимом, ответственным за обмен тиреоидных гормонов, является 5-йодтиронин дейодиназа I [ Engman L., et al., 1997]. Главная биологическая функция селензависимой тиоредоксин-редуктазы, состоит в катализе окисления/восстановления тиоредоксина - белка, ответственного за поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза в клетке [ Gromer S. et а1.,2003]. Что касается иммуномодулирующего действия селена, то оно затрагивает как гуморальное, так и клеточное звено иммунной системы. В частности, дефицит селена в организме снижает продукцию антител, нарушает дифференцировку тимоцитов [ McKenzu R.C. et al., 1998; Ryan-Harshman M., Aldoori W., 2005; Patrick L, 2004].

тактически

пищевых продуктах животного и растительного происхождения, практич

рос. нацйойаЛьная БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

ОЭ Ш(ккН80

весь селен представлен в органической форме. При этом в продуктах животного происхождения преобладает селеноцистеин, а в продуктах растительного происхождения - селенометионин [ Тутельян В.А. и др.,2002; Cases J.et al., 2002].Однако в достаточно большом количестве биологически активных добавок к пище (БАД) отечественного и зарубежного производства в качестве пищевого источника селена используются его неорганические соединения, в основном в виде селенитов и селенатов. Как органические, так и неорганические соединения селена достаточно эффективно всасываются в желудочно - кишечном тракте. При этом селенит и селенат анионы восстанавливаются ферментативным путем до селеноводорода. Возможности утилизации последнего в организме ограничены в количественном отношении, и при поступлении в организм избыточных количеств неорганического селена он может накапливаться в тканях в форме свободного высоко токсичного гидроселенид аниона. В то же время селенометионин и селеноцистеин наряду с метаболизацией до селеноводорода утилизируются по иному пути, включаясь в состав селенометионина и селеноцистеина тканевых белков, что существенно повышает значение предельно допустимой концентрации (ПДК) селена и, соответственно, уменьшает риск неблагоприяного воздействия на организм в случае его передозировки селена в этой форме по сравнению с его неорганическими соединениями.

В целом по России, согласно данным эпидемиологических исследований, проведенных сотрудниками Института питания РАМН, не менее чем у 80% населения обеспеченность селеном ниже оптимальной. [Тутельян В.А. и др.,2002].

Таким образом, разработка методов биотехнологического получения новых пищевых источников органического селена, их детальное исследование и характеристика представляются весьма актуальными. В связи с этим большой интерес представляют так называемые биологические «матрицы», при «встраивании» в которые происходит биотрансформация селена, и он

переходит из неорганической формы в органическую (селенсодержащие аминокислоты - селенометионин и селеноцистеин).

Настоящая работа посвящена разработке способов получения, а также экспериментальной оценке биомассы селенсодержащего штамма Lactobacillus plantarum 8RA - 3 и препаратов селенсодержащего фикоцианина (с различной степенью очистки)- пигмента, выделенного из обогащенной селеном сине-зеленой микроводоросли спирулины (Arthrospira platensis).

Цель работы

Получение и характеристика в опытах in vitro и in vivo новых пищевых источников селена: биомассы селенсодержащих лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) и препарата селенсодержащего фикоцианина, выделенного из биомассы селенсодержащей Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas).

Основные задачи исследования

1. Вырастить в лабораторных условиях биомассу селенсодержащих лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) с высоким содержанием этого микроэлемента.

2. Получить высокоочищенные препараты фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина, используя в качестве исходного сырья биомассу Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) и биомассу селенсодержащей Spirulina platensis, соответственно.

3. В опытах in vivo провести сравнительную оценку всасывания и депонирования селена из исследуемых пищевых источников и селенита натрия в печени и семенниках крыс.

4. Охарактеризовать в опытах in vivo иммуномодулирующее действие препаратов фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина при их внутрибрюшинном введении.

5. Исследовать влияние перорального введения водорастворимого экстракта, выделенного из биомассы селенсодержащей Spirulina platensis на гуморальный иммунный ответ у сенсибилизированных животных.

Научная новизна работы

Оптимизированы условия культивирования биомассы селенсодержащих лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) и в опытах in vivo охарактеризована биодоступность селена в составе выращенной биомассы.

Впервые при использовании в качестве исходного сырья биомассы селенсодержащей Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) выделен и очищен препарат селенсодержащего фикоцианина. Сравнительными исследованиями in vivo установлена высокая биодоступность селена в составе препарата селенсодержащего фикоцианина.

Впервые получены результаты, свидетельствующие о стимулирующем влиянии препаратов селенсодержащего фикоцианина различной степени очистки на клеточное и гуморальное звенья иммунитета у лабораторных животных (мыши линии DBA и крысы линии Вистар). При относительно продолжительном пероральном введении препарата селенсодержащего фикоцианина (степень очистки - 2,1 раза; содержание фикоцианина 113 мг/мл) у животных, сенсибилизированных модельным антигеном - куриным овальбумином, усиливался ответ антител класса G, специфичных к этому белку.

Показано, что при внутрибрюшинном введении высокоочищенного препарата селенсодержащего фикоцианина имеет место активация лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов перитонеальной полости и повышение фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата.

Практическая значимость работы

Экспериментально отработанные оптимальные условия выращивания селенсодержащей биомассы лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) с высоким содержанием селена могут быть использованы при масштабировании процесса для промышленного биотехнологического получения нового пищевого источника этого эссенциального микроэлемента.

Высокоочищенный препарат фикоцианина, выделенный из биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas), может быть использован для получения моноклональных антител к этому белковому пигменту и разработки иммуноферментного метода идентификации Spirulina platensis в составе БАД к пище и специализированных продуктов питания.

Установленное в опытах in vivo иммуностимулирующее действие водорастворимого экстракта из биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Tppas) при пероральном способе введения свидетельствует о перспективности его использования в составе нового поколения продуктов профилактического питания, повышающих иммунитет и неспецифическую резистентность организма. Высокая биодоступность селена в составе селенсодержащего фикоцианина определяет перспективность его использования для профилактики селеновой недостаточности.

Апробация работы Материалы диссертационной работы были доложены на Третьем московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва,2005), на XI (Гурзуф, 2003), XTI (Гурзуф, 2004) и XIII (Гурзуф, 2005) международных конференциях "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии".

Публикации

По результатам работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах и 7 публикаций в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, заключение, выводы. Указатель литературы содержит 47 отечественных и 132 зарубежных источников. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, включает 14 таблиц и 19 рисунков.

Положения выносимые на защиту

• Экспериментально определены оптимальные условия выращивания селенсодержащей биомассы лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) и получен препарат, в котором содержание селена составило 1493 ± 7 мкг/г сухой биомассы, что достаточно для его использования в качестве пищевого источника.

• С использованием в качестве исходного сырья биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) и биомассы селенсодержащей Spirulina platensis выделены и очищены, соответственно, высокоочищенные препараты фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина (содержание селена 92±2 мкг/г препарата).

• Охарактеризованы всасывание и депонирование селена при его пероральном введении лабораторным животным (крысам линии Вистар) в составе полученных препаратов, а также селенита натрия и селенсодержащей Spirulina platensis. Установлено, что из органических форм селена наибольшей биодоступностью обладает селен в составе препарата с относительно высоким содержанием селенсодержащего фикоцианина.

• Установлена способность препарата селенфикоцианина повышать неспецифическую резистентность у лабораторных животных (мышей линии DBA). Выявлено стимулирующее влияние препаратов, содержащих селенфикоцанин, на гуморальный иммунный ответ мышей, иммунизированных эритроцитами барана, и крыс линии Вистар, многократно сенсибилизированных овальбумином.

Материалы и методы исследования

Биомасса селенсодержащих лактобацилл была получена путем культивирования штамма Lactobacillus plantarum 8RA-3 в жидкой питательной среде на основе гидролизата казеина с различными концентрациями селенита натрия. Пробы инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 12

ч. Биомассу отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин., далее ее промывали физиологическим раствором (0,9 % NaCl) и повторно центрифугировали при тех же условиях. Осадок ресуспендировали в минимальном количестве дистиллированной воды и лиофильно высушивали. Биомасса селенсодержащих лактобацилл была получена под руководством доктора медицинских наук, профессора Б.А.Шендерова (ГУ МННИИЭМ им. Г.Н.Габричевского). Определение селена в сухой биомассе лактобацилл и других материалах проводили микрофлуориметрическим методом с реактивом-2,3-диаминонафталином согласно [Голубкина Н.А., 2005].

Сухая биомасса селенсодержащей спирулины получена биотехнологическим методом культивирования штамма Spirulina platensis (штамм. Nordst. Geitl. Ippas.(per. № В - 437) в присутствии в ростовой среде селенита натрия в регулируемых условиях теплиц открытого типа. Содержание селена в сухой биомассе составило 512±9мкг/г.

Для получения фикоцианина из спирулины и селенфикоцианина из селенсодержащей спирулины нами был модифицирован метод, описанный в работе [Teale F.W., 1970].

Выделение включало стадии водной экстракции, сульфатноаммонийных фракционирований и хроматографии. Ионообменную градиентную хроматографию проводили на колонке 2,5x40 см с ДЭАЭ-сефацелем, уравновешенной 0,05 М Ыа-ацетатным буфером рН 5,2 с 0,05 М NaCl.

Содержание фикоцианина во фракциях на различных стадиях выделения и очистки определяли по отношению оптических плотностей измеряемых спектрофотометрически (спектрофотометр СФ-26, Россия) [Minkova К.М. et al., 2003].

Спектры поглощения растворов высокоочищенных препаратов фикоцианина из спирулины и селенсодержащей спирулины в 0,01 М Na-фосфатном буфере рН 7,3 регистрировали на спектрофотометре с диодной матрицей Agilent 8454 (США). Спектры флуоресценции растворов

высокоочищенных препаратов фикоцианина из спирулины и селенсодержащей спирулины регистрировали в том же буфере, используя спектрофлуориметр «Hitachi», (Япония) и определяя максимумы возбуждения и эмиссии методом автоматического сканирования спектров. Молекулярную массу субъединиц фикоцианина и селенфикоцианина определяли по методу диск-электрофореза в 15% геле акриламида в присутствии анионного ПАВ - додецилсульфата натрия [Laemli U.K., 1970], используя прибор «Модель-69» («Reanal», Венгрия). Выделение и физико-химическая характеристика препаратов проведена при участии ведущего научного сотрудника НИИ питания РАМН И.В.Гмошинского.

При проведении исследований всасывания и депонирования селена в опытах in vivo были использованы крысы самцы линии Вистар. В ходе эксперимента все крысы, за исключением животных контрольной группы, получали селенит натрия, биомассу селенсодержащей спирулины (содержание селена 539 ± 15 мкг/г), белковый препарат с повышенной концентрацией селена, полученный водной экстракцией из биомассы селенсодержащей спирулины и дополнительно очищенный двухкратным сульфатноамонийным осаждением (содержание селена -3,6 мкг/мл), и сухую биомасса лактобацилл с содержанием селена 1493 ± 7 мкг/г в виде добавок к стандартному рациону в течение 14 или 21 дня. Доза селена во всех группах составила 5 мкг на 1 животное в день. Затем животных забивали, брали кровь для получения сыворотки, печень и семенники.

При исследовании влияния высокоочищенных препаратов фикоцианина с содержанием пигмента 90% и селена 1,20±0,02 мкг/г и селенсодержащего фикоцианина со степенью чистоты 85% и содержанием селена 92±2 мкг/г на клеточное звено иммунитета in vivo были использованы мыши линии DBA. Мышам за пять дней до опыта были введены внутрибрюшинно растворы высокоочищенных препаратов в дозах от 0,1 до 5 мкг на 1 г массы тела мыши, затем животных забивали и получали перитонеальный экссудат. Далее экссудат подвергали гипотоническому шоку. Для определения фагоцитарной активности

клеток перитонеального экссудата его инкубировали в полной среде с дрожжами Saccharomyces cerevisiae дикого типа и GPI-мутантами. Светорассеяние определяли методом проточной цитометрии на каналах FSC-H/SSC-H на проточном питометре FACSCalibur (Becton Dickinson)(ClIIA).

При исследовании влияния препаратов фикоцианина и селенфикоцианина на гуморальный иммунитет в опытах in vivo были использованы мыши линии DBA и крысы линии Вистар. Мышам, предварительно иммунизированным эритроцитами барана в дозе 1 * 108 на животное вводились внутрибрюшинно высокоочищенные препараты фикоцианина и селенфикоцианина в дозах от 0,1 до 5 мкг на г массы тела мыши. На 5 день иммунизации животных забивали и проводили определение количества антителообразующих клеток (АОК) селезенки (реакция Ерне) согласно [Jerne N.K.,Nordin A.A. 1963]. Исследование клеточного состава и фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата мышей и определение количества антителобразующих клеток селезенки проведено при участии старшего научного сотрудника НИИ питания РАМН Е.А.Мартыновой.

Крыс сенсибилизировали куриным овальбумином (ОВА) по схеме, используемой для моделировании системной анафилаксии у этих животных [ Stokes C.R. et al., 1987]. Крысы опытных групп получали в качестве добавки к обычному рациону препарат, выделенный из селенсодержащей спирулины и содержащий в своем составе селен и фикоцианин (в количествах 4 мкг/мл и 113 мг/мл, соответственно) в течение 29 дней. Затем оценивали интенсивность гуморального иммунного ответа по концентрации циркулирующих специфических IgG антител (суммы фракций IgGj и lgG4) с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста (стандартного ELISA) на полистироле. При этом были использованы кроличьи антитела к IgG|+4Kpbicbi, конъюгированные с пероксидазой ( НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалея РАМН).

Все эксперименты проводились как минимум в пяти параллельных исследованиях, полученные данные представлены как М ± ш. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакетов

программ ExcelXP и SPSS 9.0. Достоверность различий значений средних уровней исследуемых показателей определяли с использованием двустороннего t-теста Стьюдента. Дополнительно проверяли гипотезу о различии распределений указанных показателей с помощью непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Во всех случаях различия признавались достоверными (нуль-гипотеза отвергалась) на уровне значимости Р<0,05.

Результаты собственных исследований и их обсуждение 1. Получение и физико-химическая характеристика фикоцианина и

селенфикоцианина Биомасса селенсодержащих лактобацилл была получена путем культивирования штамма Lactobacillus plantarum 8RA-3 в жидкой питательной среде с содержанием селена 5 мкг/мл в форме селенита натрия. Эта концентрация была выбрана как наиболее подходящая после проведения серии экспериментов, так как она обеспечивала оптимальное насыщение биомассы лактобацилл данным микроэлементом, его трансформацию в органическую форму и не подавляла роста биомассы. Содержание селена в сухой биомассе лактобацилл было стабильным, воспроизводимым и составило 1493 ± 7 мкг/г.

Другим объектом исследования была биомасса сине - зеленой микроводоросли спирулины платенсис (Arthrospira platensis). Фикоцианин был выделен из необогащенной селеном спирулины со степенью очистки в 31 раз с выходом 19,6%. При этом содержание селена в нем составило 1,20±0,02мкг/г. Из биомассы селенсодержащей спирулины было выделено два препарата селенсодержащего фикоцианина: его водный раствор со степенью очистки в 2,1 раз и выходом 28 % и высокоочищенный препарат (степень очистки в 27 раз с выходом 4 %). Содержание селена составило в первом случае 4 мкг/мл, во втором - 92±2 мкг/г.

Основные стадии выделения и спектральные характеристики препаратов фикоцианина и селенфикоцианина представлены в табл. 1 и 2, соответственно.

Таблица 1

Основные стадии выделения и очистки селенфикоцианина

№п Стадия выделения

/п Об2(Д)258 Выход % * Кратность очистки

1 Водная экстракция 0,19 100 1

2 Сульфатноаммонийное фракционирование 0,40 28 2,1

3 Хроматография на ДЭАЭ-сефацеле 4,7 14 24,7

4 Хроматография на «Суперозе 12» 5,20 4 27,4

*Выход селенфикоцианина на всех стадиях выделения рассчитывали

по количеству оптических единиц, определяемых при длине волны 620 нм.

Таблица 2

Спектральные характеристики препаратов фикоцианина 90 % чистоты и селенфикоцианина 85% чистоты

Фикоцианин Селенфикоцианин

Максимумы поглощения препаратов в УФ и видимой области 204 нм, 278 нм и 620 нм 204 нм, 278 нм и 620 нм

Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции 621 нм и 646 нм 621 нм и 646 нм

Коэффициенты экстинкции О62о'см 1% 57 60

В ходе хроматографического фракционирования по молекулярным массам на «Суперозе 12» препарата, полученного после очистки сульфатноаммонийной фракции селенспирулины на ДЭАЭ-сефацеле (препарат фикоцианина с кратностью очистки в 24,7 раз) было обнаружено, что собранные фракции соответствуют молекулярным массам 70 - 110 кД, что совпадает с литературными данными о молекулярной массе фикоцианина [Minkova K.M. et al., 2003]. Содержание селена в собранных фракциях данного препарата на сухую массу составило 100 мкг/г, что близко к полученному ранее результату для селенфикоцианина. Эти данные свидетельствуют о том, что селен по всей вероятности включается в состав фикоцианина в виде селенсодержащих аминокислот.

2. Сравнительная оценка всасывания и депонирования селена из селенсодержащих препаратов.

Для обоснования заключения о перспективности использования исследуемых в нашей работе новых источников селена представлялось необходимым провести сравнительную оценку их всасывания и ретенции в опытах in vivo. В ходе эксперимента крысы линии Вистар за исключением животных контрольной группы получали вышеперечисленные источники селена в виде добавки к стандартному рациону в течение 14 и/или 21 дня. Доза селена во всех опытных группах составила 5 мкг в день.

На основании данных по содержанию селена в сыворотке крови и органах крыс, получавших этот микроэлемент в составе исследуемых пищевых источников и селенита натрия, оценивали его всасывание. Среднее содержание селена в сыворотке крови животных, получавших селенсодержащую спирулину в течение 14 дней, практически не отличалось от данного показателя контрольной группы (см табл. 3). Животные групп, получавших белковый препарат селенсодержащего фикоцианина (со степенью очистки в 2,1 раза) и биомассу селенсодержащих лактобацилл, характеризовались достоверно повышенным в сравнении с контролем уровнем селена в сыворотке крови.

Содержание селена в печени крыс всех опытных групп было достоверно выше, чем в контрольной группе и достоверно ниже, чем в группе крыс, получавших селенит натрия. Самое же низкое значение депонированного печенью селена имело место для биомассы селенсодержащих лактобацилл. Средние уровни селена в семенниках животных, как в контрольной, так и во всех опытных группах были близки по величине и достоверно не различались между собой (Р>0,1 во всех случаях) (табл.3).

Величина безразмерного отношения концентрации селена в ткани печени к концентрации селена в сыворотке крови крыс в группах, получавших исследуемые пищевые источники селена в течение 14 дней, может рассматриваться как качественный критерий эффективности процессов тканевого депонирования селена, поскольку уровень селена сыворотки крови, как указывается в работах [Patrick L., 2004; Sunde R.A., 1990], коррелирует с его содержанием в лабильном пуле специфических селенопротеинов плазмы (в основном, глутатионпероксидазы типа III и селенопротеина Р), тогда как уровень селена печени может рассматриваться как показатель его консервативного тканевого депо.

При сравнительном анализе указанного показателя было обнаружено, что он наиболее высок у группы, получавшей селенсодержащую спирулину, и составляет 1,6. У группы крыс, получавших селенсодержащий белковый препарат фикоцианина, рассматриваемый показатель был равен 1,4, а получавшей селенит натрия -1,5. Все три этих величины достоверно не различались между собой, указывая на близкую эффективность тканевого депонирования селена из этих пищевых источников. Однако у крыс, получавших биомассу селенсодержащих лактобацилл, рассматриваемое отношение не отличалось от величины показателя контрольной группы (0,97 и 0,99, соответственно).

Во второй серии экспериментов животные получали селен в составе биомассы селенсодержащей спирулины, белкового препарата фикоцианина и селенита натрия в течение 21 дня (см. табл.4).

Содержание селена в сыворотке крови и органах крыс, получавших селенсодержащие препараты в течение 14 дней

(М±ш)

№ п/п Группы животных Бе в сыворотке мкг/л 8е в печени м кг/кг Бе в печени мкг/орган Бе в семеннике мкг/кг Бе в семеннике мкг/орган Суммарное содержание Бе в сыворотке, печени, семенниках, мкг

1 Контроль 326±10 321±28 3,5±0,2 763±21 1,03±0,05 7,87±0,27

2 Селенспирулина 336±64* 536±29" 5,4±0,4'* 806±19 1,16±0,05 9,99±0,79*

3 Селенсодержащий фикоцианин 400±14** 568±31** 5,8±0,6" 750±44 1,10±0,08 10,84±0,9б"

4 Селенсодержащие лактобациллы 480±41* 463±48'* 4,7±0,7** 798 ±16 1,21±0,06 10,7±0,9"

5 Селенит натрия 503±16" 749±29* 7,6±0,7* 816±32 1,1 ±0,08 13,8±0,8"

*- достоверность различий групп (Р<0,05) между контролем и опытными группами (№№ 2,3,4,5);

• -достоверность различий между группой, получавшей селенит натрия (№ 5) и другими опытными группами (№№ 2,3,4), во всех остальных случаях различия не достоверны

Содержание селена в сыворотке крови и органах крыс, получавших селенсодержащие препараты в течение 21 дня

(М±ш)

№ п/п Группы животных Se в сыворотке мкг/л Se в печени мкг/кг Se в печени мкг/орган Se в семеннике мкг/кг Se в семеннике мкг/орган Суммарное содержание Se в сыворотке, печени, семенниках, мкг

1 Контроль 329±7 262±20 2,9±0,4 683±70 0,99± 0,11 7,31±0,50

2 Селенспирулина 508±38* 589±59* 6,1±1,4* 752±18 1,04±0,04 11,91±2,03

3 Селенфикоцианин 463±20" 502±75* 5,7±0,6* 719±29 1,04±0,04 10,27±1,18

4 Селенит натрия 462±18" 610±40* 6,7±0,7" 665±34 1,02 ±0,11 12,03±0,81*

*- достоверность различий групп (Р<0,05) между контролем и опытными группами (№№ 2,3,4), во всех остальных случаях различия не достоверны

Средние концентрации селена в сыворотке крови крыс всех опытных групп были достоверно выше контроля (Р<0,05), но не различались между собой (Р>0,1). Среднее содержание селена в печени животных, принимавших селенсодержащую спирулину, как при расчете на орган, так и на кг ткани печени было достоверно выше контроля (Р<0,05).

У животных, получавших белковый препарат селенсодержащего фикоцианина и селенит натрия, средние концентрации селена в печени достоверно отличались от контроля (Р<0,05), но не различались между собой (Р>0,1).

При определении селена в семенниках подопытных животных была обнаружена та же картина, что и у крыс, получавших исследуемые пищевые источники в течение 14 дней.

3. Исследование иммуномодулирующего действия препаратов фикоцианина и селенфикоцианина

В экспериментах in vivo при введении внутрибрюшинно мышам линии DBA различных доз высокоочищенного (содержание фикоцианина 90%) препарата пигмента, выделенного из биомассы спирулины, было охарактеризовано его иммуностимулирующее действие. Фикоцианин повышал относительное число перитонеальных макрофагов в 1,8 раза (максимально эффективная доза 0,5мкг/г массы тела), оказывая, однако при этом некоторое ингибирующее влияние на нейтрофилы перитонеального экссудата.

В следующей серии экспериментов животным также внутрибрюшинно вводились различные дозы высокоочищенного препарата селенсодержащего фикоцианина, выделенного из биомассы селенсодержащей спирулины. Как и для препарата фикоцианина, оценивалось влияние препарата селенсодержащего фикоцианина на лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы перитонеальной полости. Максимально эффективная доза, то есть та, при которой введение мышам селенсодержащего фикоцианина максимально увеличивало число лимфоцитов перитонеальной полости, была равна 1,0мкг/г массы тела. Это значение существенно ниже соответствующей величины, определенной при введении фикоцианина, как такового. Повышение вводимой дозы селенсодержащего фикоцианина до 5мкг/г массы тела не приводило к дальнейшему возрастанию числа перитонеальных лимфоцитов, а напротив имело место снижение их числа до контрольных значений. Эффект активирующего воздействия селенсодержащего фикоцианина на макрофаги имел место, хотя и был менее выражен по сравнению с собственно фикоцианином: число перитонеальных макрофагов повысилось в 1,2 раза. Максимально эффективная доза была такой же, как и для фикоцианина - 0,5 мкг/г массы тела.

Однако влияние препарата селенсодержащего фикоцианина на перитонеальные нейтрофилы отличалось от воздействия препарата фикоцианина на эти клетки, представляющие важное звено в системе

неспецифической резистентности организма. Если фикоцианин снижал относительное число нейтрофилов перитонеального экссудата, то сочетание селена и фикоцианина в препарате селенсодержащего фикоцианина оказывало стимулирующее дозозависимое влияние на эти клетки и повышало их число, начиная с дозы 0,5 мкг/г массы тела, пропорционально величине вводимой дозы (см. рис. 1).

фикоцианин

60 50 40

30 20 10

ают

_li

селенфиюцианин

0,1 0,5 5 0,1 0,5 1

дозы препаратов, мкг/г массы тела

Рис. 1. Влияние препаратов фикоцианина и селенфикоцианина на относительное число нейтрофилов в перитонеальном экссудате мышей

Увеличение в перитонеальной полости животных количества как макрофагов, так и нейтрофилов при введении им селенсодержащего препарата фикоцианина, увеличивало фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата, что было продемонстрировано в опытах in vitro с использованием в качестве фагоцитируемого материала двух типов дрожжей с различным липидным составом цитоплазматической мембраны (Saccharomyces cerevisiae

АУТ и ЗассЬаготусся cerevisiac ОРТ - мутантов). Несмотря на то, что различия в липидном составе мембран фагоцитируемых объектов влияют на их распознавание перитонеальными клетками, селенфикоцианин повышал фагоцитирующую активность клеток перитонеального экссудата независимо от вида дрожжей. Дозозависимое пропорциональное повышение активности наблюдалось, начиная с дозы 0,25мкг/г массы тела (см. рис. 2).

массы тела

■ Saccharomyces cerevisiae штамм WT

□ Saccharomyces cerevisiae GPI - мутант

■ контроль

Рис. 2. Влияние введения препарата ссленфикоцианина на фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата мышей in vitro.

Таким образом, результаты, полученные в вышеперечисленных исследованиях, свидетельствуют об активирующем влиянии как фикоцианина,

так и селенфикоцианина на лимфоциты и макрофаги перитонеальной полости при внутрибрюшинном введении высокоочищенных препаратов. На преимущества в плане возможного использования селенсодержащего фикоцианина как иммуностимулятора, по сравнению с фикоцианином как таковым, указывают данные сравнительного исследования влияния этих препаратов на нейтрофилы. Выраженное стимулирующее действие селенсодержащего фикоцианина на нейтрофилы при наличии некоторого ингибирующего воздействия собственно фикоцианина, позволяет предположить, что стимулирующий нейтрофилы эффект является следствием появления в составе препарата органической формы селена, хотя это предположение нуждается в дополнительной проверке.

Стимулирующее влияние высокоочищенного селенфикацианина на гуморальное звено иммунитета установлено в опытах по определению дозозависимого действия препарата на число антителообразующих клеток (АОК) селезенки мышей, которых иммунизировали эритроцитами барана.

Из рис.3 видно, что у мышей, которым вводили препарат фикоцианина в интервале доз 0,25 - 1,0 мкг/г массы тела, число АОК селезенки соответствовало контрольному уровню. При дальнейшем повышении дозы наблюдалось даже некоторое снижение рассматриваемого показателя. В то же время введение препарата селенфикоцианина, дозозависимо и значительно повышало число АОК селезенки подопытных животных. Их число при максимально эффективной дозе (1 мкг/ г массы тела) составило 95 на 1 млн. клеток селезенки, что в 3 раза больше соответствующего показателя для фикоцианина. Полученный результат свидетельствует о выраженном стимулирующем влиянии селенфикоцианина на гуморальный иммунитет.

Иммуностимулирующее действие препарата, выделенного из селенсодержащей спирулины и содержащего в своем составе селен и фикоцианин (в количествах 4 мкг/мл и 113 мг/мл, соответственно) также было исследовано в опытах in vivo при его длительном пероральном введении

крысам линии Вистар, сенсибилизированным модельным антигеном - куриным овальбумином (см. табл. 5).

у 100

X X 8

О 80 ф

" 70 о

| 60 V

| 50 х

- 40

£ 30 о

о 20

1 I 1

- .и н -г! 1 1 1 1

,11 1 1

I 1 II 1 ■ 1 1 1 11

□ фикоцианин ■ селенфикоциа

НИИ

025 03 1

0 1 0 25 0 5

дозы препаратов мкг/г веса мыши

Рис.3 Влияние препаратов фикоцианина и селенфикоцианина на число антителообразующих клеток селезенки мышей, иммунизированных эритроцитами барана (реакция Ерне).

Таблица 5

Влияние селенфикоцианина на уровень специфических антител к овальбумину у крыс

Группа Число животных Показатели (М±т)

Уровень АТ мг/мл уровня АТ

8е -фикоцианин 24 7,1±0,7 0,78810,051

Стандартный рацион вивария 24 4,6±0,4 0,61110,047

1-тест Стьюдента Р 0,011 0,024

Как видно из таблицы, уровень антител к куриному овальбумину был достоверно и значительно выше в сыворотке крыс, сенсибилизированных этим антигеном, по сравнению с контрольной группой сенсибилизированных животных, получавших стандартный рацион вивария. Полученный результат указывает на иммуностимулирующее влияние перорального приема данного препарата на гуморальный иммунный ответ.

ВЫВОДЫ

1. Культивированием в средах с различным содержанием селенита натрия экспериментально определены оптимальные условия выращивания селенсодержащей биомассы лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) и получен препарат, в котором содержание селена составило 1493 ± 7 мкг/г сухой биомассы.

2. С использованием в качестве исходного сырья биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) и биомассы селенсодержащей Spirulina platensis выделены и очищены соответственно препараты фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина. Высокоочищенный препарат фикоцианина содержит 90% пигмента. Содержание пигмента в высокоочищенном препарате селенсодержащего фикоцианина составляет 85%, а содержание селена - 92±2 мкг/г препарата.

3. Охарактеризованы всасывание и депонирование селена при его пероральном введении в течение 14 дней крысам линии Вистар в дозе 5 мкг на одно животное в составе биомассы селенсодержащей Spirulina platensis, препарата селенсодержащего фикоцианина, биомассы селенсодержащих Lactobacillus plantarum и селенита натрия. Наиболее высокое содержание селена в сыворотке крови определено для селенита натрия, самое низкое содержание селена установлено в печени для биомассы селенсодержащих Lactobacillus plantarum.

4. При пероральном введении в течение 21 дня крысам линии Вистар биомассы селенсодержащей Spirulina platensis и препарата селенсодержащего фикоцианина, концентрации селена в сыворотке крови были выше, чем при введении этих источников селена в течение 14 дней, достигнув тех же значений, что и для селенита натрия при этом сроке введения. Депонирование селена печенью значимо не различалось для всех трех его источников.

5. При внутрибрюшинном введении мышам линии DBA высокоочищенный препарат селенфикоцианина повышал их неспецифическую резистентность, активируя лимфоциты и макрофаги перитонеальной полости и, в отличие от фикоцианина, дозозависимо повышал относительное число нейтрофилов. Селенфикоцианин также повышал фагоцитарную активность клеток перитонеальной полости относительно двух типов дрожжей Saccharomyces cerevisiae WT и Saccharomyces cerevisiae GPI - мутантов.

6. Установлено стимулирующее влияние препаратов, содержащих селенфикоцанин, на гуморальный иммунный ответ мышей линии DBA, иммунизированных эритроцитами барана, и крыс линии Вистар, многократно сенсибилизированных овальбумином.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Ширина ЛИ., Егорова Е.А., Мазо В.К. Новые пищевые источники селена// Сборник трудов XI международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии". Украина - Гурзуф, 2003. - С. 236 - 237

2. Мазо В К., Егорова Е А Эссенциальные микроэлемены в питании: нормы потребления и новые пищевые источники// Материалы 17 сессии Академической школы-семинара им. A.M. Уголева "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения" - Пущино на Оке, 2003г. - T.XIV, № 4. - Приложение №20. - С. 94 - 97

3. Егорова ЕА Новые пищевые источники селена// Сборник трудов XII международной конференции" Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" - Украина - Гурзуф, 2004.-С. 108-110

4. Мазо В.К., Гмошинский КВ., Егорова Е А., Ширина Л.И. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов// Клиническая диетология. -2004.-Т. 1., №3 - С. 3 - 14

5. Егорова Е.А., Шендеров Б.А., Данилина Л Л и др. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Сообщение 4: Обогащенные селеном бактерии Lactobacillus plantarum//Bonpocbi детской диетологии. -2004.-Т. 2,№6. -С. 62-65

6. Мазо В К, Егорова Е.А , Гмошинский И.В., Мартынова Е.А. Получение и свойства селеносодержащего фикоцианина из цианобактерии Spirulina platensis// Материалы третьего московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - Москва - 2005. -часть 2. - С. 112

7. Мартынова Е.А., Егорова Е.А., Гмошинский ИВ, Мазо В.К., Влияние препаратов фикоцианина и селен-фикоцианина на иммунную систему и апоптоз в модельной системе на мышах линий DBA и Asnl// Сборник трудов XIII международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии". - Украина - Гурзуф. - 2005. - С. 172 - 173

8. Егорова Е.А. Выделение и характеристика фикоцианина из обогащенной селеном цианобактерии Spirulina platensis// Материалы всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье". - Суздаль. - 2005. - С. 341

9. Егорова ЕА Получение новых пищевых источников селена//Материалы VIII Всероссийского конгресса "Оптимальное питание - здоровье нации". -Москва.-2005.-С. 90

10.Гмошинский ИВ, Мазо В К, Егорова Е.А , Фатеева НН Выделение и сравнительная характеристика фикоцианинов, полученных из спирулины и селенсодержащей спирулины// Биотехнология. - 2006. - №2 - С.40 - 43

11. Мартынова Е. А., Егорова ЕА., Гмошинский ИВ., Мазо В.К. Влияние фикоцианина, выделенного из 8рниНпа рЫегшв, на активацию, экспрессию рецепторов и апоптоз лимфоцитов тимуса мышей// Биотехнология. - 2006. - №2 - С. 73 - 77

12. Егорова Е.А., Гмошинский И.В., Зорин С.Н., Мазо В.К.

Изучение иммуномодулирующих свойств селенсодержащего фикоцианина//Вопросы питания. - 2006. - №2 - С. 19 - 21

Для заметок

Заказ № 47/05/06 Подписано в печать 05.05.2006 Тираж 130 экз. Усл. пл. 1,34

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 Л www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

¿OOCj\

!M 1 9 8 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Егорова, Екатерина Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ. ф 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Селен - эссенциальный микроэлемент в питании человека.

2.2 Новые пищевые источники селена - объекты современной биотехнологии.

2.2.1. Spirulina platensis (Arthrospira platensis).

2.2.2. Селенсодержащая Spirulina platensis.

2.2.3. Дрожжи пищевые.

2.2.4. Селенсодержащие пищевые дрожжи.

2.2.5. Лактобациллы. у, 2.2.5. Селенсодержащие лактобациллы.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Материалы и методы исследований.

3.1.1.Объекты исследования.

3.1.1.1.Штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3.

3.1.1.2. Селенсодержащий штамм

Lactobacillus plantarum 8RA - 3.

3.1.1.3. Spirulina platensis (Arthrospira platensis). w 3.1.1.4. Селенсодержащая Spirulina platensis.

3.1.1.5.Фикоциани н.

3.1.1.6. Селенсодержащий фикоцианин.

3.1.1.7. Лабораторные животные.

3.1.2.Методы исследований.

3.1.2.1. Биохимические и иммунологические методы.

3.1.2.1.1. Метод оценки биодоступности селена в составе исследуемых препаратов.

3.1.2.1.2.Метод определения клеточного состава перитонеального экссудата мышей.

3.1.2.1.3. Метод определения фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата мышей.

3.1.2.1.4. Метод определения количества антителообразующих клеток (АОК) селезенки мышей.

3.1.2.1.5. Метод оценки вторичного иммунного ответа к куриному овальбумину у крыс.

3.1.2.2.Физико - химические методы анализа.

3.1.2.2.1. Метод определения селена.

3.1.2.2.2. Электрофоретический метод определения молекулярной массы фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина.

3.1.2.2.3. Методы спектрофотометрии и флуоресценции, использованные для определения содержания и спектральных характеристик фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина.

3.1.2.3. Статистическая обработка результатов исследований.

3.2. Результаты исследований и их обсуждение.

3.2.1. Получение селенсодержащего штамма Lactobacillus plantarum 8RA-3.

3.2.2. Выделение и характеристика фикоцианина из Spirulina platensis (Arthrospira platensis).

3.2.3. Выделение и характеристика селенфикоцианина из селенсодержащей Spirulina platensis (Arthrospira platensis).

3.2.4. Оценка биодоступности селена в составе исследуемых препаратов.

3.2.5. Влияние фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина на клеточный состав перитонеального экссудата мышей.

3.2.6.Влияние селенсодержащего фикоцианина на фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата мышей.

Ф 3.2.7. Влияние фикоцианина и селенфикоцианина на количество антителообразующих клеток (АОК) селезенки мышей.

I» 3.2.7. Оценка влияния препарата селенфикоцианина на вторичный иммунный ответ к куриному овальбумину у крыс.

4.3АКЛЮЧЕНИЕ.

5.ВЫВОД Ы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм селена"

Так же, как и в других научных дисциплинах, результаты исследований, накопленные в различные периоды развития науки о питании (нутрициологии) получали своё теоретическое выражение в виде определенных концепций. В настоящее время в стадии становления находится концепция оптимального питания - система современных представлений науки о питании, основанная на последних достижениях фундаментальных физиолого-биохимических и эпидемиологических исследований и новых научных дисциплин: нутригеномики, протеомики и метаболомики. Продолжая и одновременно развивая основные положения теории рационального питания А.А. Покровского [32] и теории адекватного питания A.M. Уголева [42], концепция оптимального питания предполагает необходимость адекватного обеспечения организма человека как макро, так и микронутриентами и минорными компонентами пищи [40]. В настоящее время существенно расширились представления об эссенциальности для организма человека многих микронутриентов и минорных компонентов пищи, не рассматривавшихся ранее в качестве факторов, необходимых для обеспечения его нормальной жизнедеятельности. Получены убедительные свидетельства их участия в метаболизме, и с позиций доказательной медицины, соответственно, установлено, что при дефиците (недостаточности) этих биологически активных веществ в рационе человека имеет место снижение резистентности к неблагоприятным факторам окружающей среды (феномен маладаптации), формирование иммунодефицитных состояний, нарушение функций систем антиоксидантной защиты, хронизация болезней, повышение риска развития распространенных заболеваний, снижение качества жизни и эффективности лечебных мероприятий [39].

Чрезвычайно важным в плане значения концепции оптимального питания для практического обеспечения здоровья населения является положение о том, что у современного человека имеет место недостаточное поступление с пищей микронутриентов и минорных компонентов пищи вследствие снижения энерготрат и, соответственно, уменьшения общего количества потребляемой пищи. Негативное влияние на обеспеченность населения микронутриентами и минорными компонентами пищи оказывают также новые технологии, используемые в сельском хозяйстве (как в земледелии, так и животноводстве) и современные способы переработки пищевой продукции.

Положение о регулярном потреблении пищевых продуктов, обогащенных микронутриентами, как важнейшем факторе оптимизации питания и здоровья человека является научным обоснованием, во-первых, для обогащения ими продуктов массового потребления для всех групп детского и взрослого населения и регулярно используемых в повседневном питании и, во-вторых, для широкого производства биологически активных добавок к пище (БАД) и специализированных продуктов, используемых преимущественно в профилактическом питании. Недопустимость бесконтрольного обогащения БАД, специализированных продуктов и тем более продуктов массового потребления микронутриентами, вследствие опасности возможных передозировок последних и соответствующего неблагоприятного воздействия их на организм человека, предполагает физиологическое обоснование адекватного и верхнего допустимого уровней их потребления. Это положение концепции оптимального питания реализовано Методическими рекомендациями МР.2.3.1.1915-04 «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ» (утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и введены в действие 02.07.2004 г.). Важно представлять, что все перечисленные в документе природные вещества и соединения характерны для традиционных пищевых продуктов животного и растительного происхождения, однако, их содержание в последних недостаточно высоко. Это обстоятельство в свою очередь определяет необходимость получения новых пищевых источников микронутриентов и других минорных биологически активных компонентов пищи, оценки их безопасности и эффективности. Концепция оптимального питания предъявляет жесткие требования к форме, в которой искомое биологически активное соединение находится в составе нового пищевого источника. Правила соответствия химического состава пищи ферментным взаимоотношениям организма на всех уровнях её ассимиляции относятся и к определенным микронутриентам, в первую очередь эссенциальным микроэлементам (ЭМ). Констатируется целесообразность использования в составе БАД и для обогащения пищевых продуктов органических форм ЭМ, так как на протяжении эволюции человека как вида и в его современной жизни преимущественно органические соединения этих микронутриетов потреблялись и потребляются им в составе растительной и животной пищи [22]. Особенно убедительно, на наш взгляд, этот тезис иллюстрируется на примере селена - микроэлемента, токсичность которого была известна уже очень давно, а представления об эссенциальности берут начало с 1957 года в связи с открытием селенсодержащего фермента антиоксидантной защиты -глутатионпероксидазы [7].

Селен относится к микроэлементам, для которых интервал между адекватным и максимально допустимым уровнем потребления сравнительно узок и во многом зависит от того, в какой форме селен поступает в организм. В пищевых продуктах животного и растительного происхождения, практически весь селен представлен в органической форме. При этом, в продуктах животного происхождения преобладает селеноцистеин, а в продуктах растительного происхождения - селенометионин [44]. Однако в достаточно большом количестве БАД отечественного и зарубежного производства в качестве пищевого источника селена используются его неорганические соединения, в основном в виде селенитов и селенатов. Как органические, так и неорганические соединения селена достаточно эффективно всасываются в желудочно - кишечном тракте. При этом селенит и селенат анионы восстанавливаются ферментативным путем до селеноводорода. Возможности утилизации последнего в организме ограничены в количественном отношении, и при поступлении в организм избыточных количеств неорганического селена он может накапливаться в тканях в форме свободного высоко токсичного гидроселенид аниона. В то же время селенометионин и селеноцистеин, наряду с метаболизацией до селеноводорода, утилизируются по иному пути, включаясь в состав селенометионина и селеноцистеина тканевых белков, что существенно повышает значение предельно допустимой концентрации (ПДК) и, соответственно, уменьшает риск неблагоприяного воздействия на организм в случае передозировки селена в этой форме по сравнению с его неорганическими соединениями. Исходя из вышеизложенного, проблема поиска новых пищевых источников органических форм селена и оценки их биологического действия весьма актуальна. Перспективен биотехнологический путь получения пищевых источников этого несомненно эссенциального для организма человека микроэлемента, в частности, использование в качестве «объектов для биотехнологического встраивания» бактерий рода Lactobacillus и микроводоросли Spirulina platensis. В нашей работе предпринята попытка провести исследования, позволяющие оценить возможности использования вышеназванных биоматриц для встраивания селена с целью получения новых пищевых источников этого ЭМ.

Научная новизна

При относительно продолжительном пероральном введении препарата селенсодержащего фикоцианина невысокой степени очистки у животных, сенсибилизированных модельным антигеном - куриным овальбумином, усиливался ответ антител класса G, специфичных к этому белку. Показано, что при внутрибрюшинном введении высокоочищенного препарата селенсодержащего фикоцианина имеет место активация лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов перитонеальной полости и повышение фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата.

Практическая значимость

Высокоочищенный препарат фикоцианина, выделенный из биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas), может быть использован для получения моноклональных антител к этому белковому пигменту и разработки иммуноферментного метода идентификации Spirulina platensis в составе биологически активных добавок к пище и специализированных продуктов питания.

Установленное в опытах in vivo иммуностимулирующее действие водорастворимого экстракта из биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) при пероральном способе введения свидетельствует о перспективности его использования в составе нового поколения продуктов профилактического питания, повышающих иммунную защиту неспецифическую резистентность организма. Высокая биодоступность селена в составе селенсодержащего фикоцианина определяет перспективность его использования для профилактики селеновой недостаточности.

Цель работы

Основные задачи исследования

1 .Вырастить в лабораторных условиях биомассу селенсодержащих лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) с высоким содержанием этого микроэлемента.

3. В опытах in vivo провести сравнительную оценку всасывания и депонирования источников органического селена и селенита натрия в печени и семенниках крыс.

4.Охарактеризовать в опытах in vivo иммуномодулирующее действие препаратов фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина при их внутрибрюшинном введении.

5. Исследовать влияние перорального введения водорастворимого экстракта, выделенного из селенсодержащей биомассы Spirulina platensis на гуморальный иммунный ответ у сенсибилизированных животных.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены на Третьем московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва,2005), на XI (Гурзуф, 2003), XII (Гурзуф, 2004) и XIII (Гурзуф, 2005) международных конференциях "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии".

Публикации

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, заключение, выводы. Указатель литературы содержит 47 отечественных и 131 зарубежный источник. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, включает 14 таблиц и 19 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Егорова, Екатерина Александровна

5. ВЫВОДЫ

Культивированием в средах с различным содержанием селенита натрия экспериментально определены оптимальные условия выращивания селенсодержащей биомассы лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) и получен препарат, в котором содержание селена составило 1493 ± 7 мкг/г сухой биомассы.

С использованием в качестве исходного сырья биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) и биомассы селенсодержащей Spirulina platensis выделены и очищены соответственно препараты фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина. Высокоочищенный препарат фикоцианина содержит 90% пигмента. Содержание пигмента в высокоочищенном препарате селенсодержащего фикоцианина 85%, содержание селена - 92±2 мкг/г препарата.

Охарактеризованы всасывание и депонирование селена при его пероральном введении в течение 14 дней крысам линии Вистар в дозе 5 мкг на одно животное в составе биомассы селенсодержащей Spirulina platensis, препарата селенсодержащего фикоцианина, биомассы селенсодержащих Lactobacillus plantarum и селенита натрия. Самое высокое содержание селена в сыворотке крови определено для селенита натрия, самое низкое содержание селена в печени установлено для биомассы селенсодержащих Lactobacillus plantarum.

При пероральном введении в течение 21 дня крысам линии Вистар биомассы селенсодержащей Spirulina platensis и препарата селенсодержащего фикоцианина, концентрации селена в сыворотке крови были выше, чем при введении этих источников селена в течение 14 дней, достигнув тех же значений, что и для селенита натрия при этом сроке введения. Депонирование селена печенью значимо не различалось для всех трех его источников.

При внутрибрюшинном введении мышам линии DBA высокоочищенный препарат селенфикоцианина повышал их неспецифическую резистентность, активируя лимфоциты и макрофаги перитонеальной полости и, в отличие от фикоцианина, дозозависимо повышал относительное число нейтрофилов. Селенфикоцианин также повышал фагоцитарнюо активность клеток перитонеальной полости относительно двух типов дрожжей Saccharomyces cerevisiae WT и Saccharomyces cerevisiae GPI - мутантов.

Установлено стимулирующее влияние препаратов, содержащих селенфикоцанин, на гуморальный иммунный ответ мышей линии DBA, иммунизированных эритроцитами барана, и крыс линии Вистар, многократно сенсибилизированных овальбумином.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основная цель проведенного исследования состояла в оптимизации методов получения в лабораторных условиях новых пищевых источников органических форм селена (перспективных для дальнейшего промышленного масштабирования) и их экспериментальной оценке in vivo и in vitro. Что касается вопроса о том, в составе какого соединения (органического или неорганического) находится селен, то есть определенные основания отдавать предпочтение органическим формам данного микроэлемента, так как в подавляющем большинстве именно эти формы встречаются в продуктах растительного и животного происхождения. Использование неорганических соединений селена (селенитов и селенатов) представляется оправданным в лекарственных формах при наличии риска развития клинических проявлений дефицита этого микроэлемента и необходимости быстрого купирования состояния дефицита. По сравнению с неорганическими солями или окислами органические соединения селена обладают меньшим неблагоприятным побочным действием при возможных передозировках. Следовательно, разработка методов биотехнологического получения новых пищевых источников органического селена, их детальное исследование и характеристика представляются весьма актуальными. В связи с этим большой интерес представляют так называемые биологические «матрицы», при «встраивании» в которые происходит биотрансформация селена, и он переходит из неорганической формы в органическую (селенсодержащие аминокислоты -селенометионин и селеноцистеин).

Настоящая работа была посвящена разработке способов получения, а также экспериментальной оценке и сравнительной характеристике биомассы селенсодержащего штамма Lactobacillus plantarum 8RA-3 и препаратов селенсодержащего фикоцианина (с различной степенью очистки) - пигмента, выделенного из обогащенной селеном сине-зеленой микроводоросли спирулины (Arthrospira platensis).

Биомасса селенсодержащих лактобацилл была получена путем культивирования штамма Lactobacillus plantarum 8RA - 3 в жидкой питательной среде с содержанием селена 5 мкг/мл в форме селенита натрия. Эта концентрация была выбрана как наиболее подходящая после проведения серии экспериментов, так как она обеспечивала оптимальное насыщение биомассы лактобацилл данным микроэлементом, его трансформацию в органическую форму и не подавляла роста биомассы. Содержание селена в сухой биомассе лактобацилл было стабильным, воспроизводимым и составило 1493 ± 7 мкг/г, что потенциально более чем достаточно для ее использования в качестве пищевого источника.

Одним из исследованных в данной работе новых пищевых источников селена была биомасса сине - зеленой микроводоросли спирулины платенсис (Arthrospira platensis).

Спирулина относится к царству цианобактерий и имеет современное систематическое родовое наименование Arthrospira sp. [19]. Спирулина способна расти при высоких концентрациях селена, которые, безусловно, летальны для подавляющего числа других прокариотических и эукариотических организмов, и накапливать селен в составе биомассы в высоких концентрациях [33, 34].

Важной особенностью спирулины является также высокая пищевая ценность ее биомассы. Содержание белка в высушенной биомассе спирулины может достигать, в зависимости от вида, штамма и условий культивации, от 50 до 75% [64]. Биомасса спирулины может быть также нутритивно значимым источником каротиноидов, фикоцианинов, витаминов группы В [103 - 105]. Усвояемость перечисленных нутриентов из спирулины достаточно высока ввиду того, что этот микроорганизм, в отличие от эукариотических микроводорослей (в частности, хлореллы), пищевых дрожжей и лактобацилл, лишен плотных неперевариваемых клеточных оболочек [19, 58].

Использованная в данной работе сухая биомасса селенсодержащей спирулины, получена биотехнологическим методом культивирования штамма Spirulina platensis (штамм. Nordst. Geitl. Ippas.(per. № В - 437) в присутствии в ростовой среде селенита натрия в регулируемых условиях теплиц открытого типа. Содержание селена в сухой биомассе составило 512±9мкг/г. Согласно [66,67] биодоступность селена в составе селенсодержащей спирулины может быть существенно увеличена путем водной экстракции. Поэтому представлялось целесообразным разработать метод получения водорастворимого селенсодержащего препарата из биомассы обогащенной селеном спирулины платенсис, содержащего, помимо селена, фикоцианин -пигмент, обладающий по данным литературы выраженным иммуномодулирующим действием.

Для этих целей вначале был модифицирован метод получения фикоцианина из спирулины, впервые примененный для выделения этого фотосинтетического пигмента из цианобактерии Schizotrix sp.[157].

Выделение включало стадии водной экстракции, сульфатноаммонийных фракционирований, хроматографии на колонках с ДЭАЭ-сефацелем и суперозой-12. В результате был выделен фикоцианин необогащенной селеном спирулины со степенью очистки в 31 раз с выходом 19,6%. При этом содержание селена в нем составило 1,20±0,02мкг/г.

Этот метод выделения был сравнительно успешно использован для получения из биомассы селенсодержащей спирулины двух препаратов селенсодержащего фикоцианина: его водного раствора со степенью очистки в 2,1 раз и выходом 28 % и высокоочищенного препарата (степень очистки в 27 раз с выходом 4 %. Содержание селена составило в первом случае 4 мкг/мл, во втором - 92±2 мкг/г.

Поскольку фикоцианин не принадлежит к специфическим селенопротеинам, и в его гене отсутствует кодирующий включение селенсодержащей аминокислоты кодон ТГА, включение селена в состав этого белка по ко-трансляционному механизму не представляется возможным. Тем не менее, значительная степень обогащения ФЦ селеном указывает на возможность встраивания селенсодержащих аминокислот в этот полипептид, возможно, путём замещения соответствующих серусодержащих аминокислот. В ходе хроматографического фракционирования по молекулярным массам на «Суперозе 12» препарата, полученного после очистки сульфатноаммонийной фракции селенспирулины на ДЭАЭ-сефацеле (препарат фикоцианина с кратностью очистки в 24,7 раз) было обнаружено, что собранные фракции соответствуют молекулярным массам 70 - 110 кД, что совпадает с литературными данными о молекулярной массе фикоцианина. Содержание селена в собранных фракциях в пересчете на сухую массу составило 100 мкг/г, что близко к полученному ранее результату для селенфикоцианина. Эти данные свидетельствуют о том, что селен по всей вероятности включается в состав фикоцианина в виде селенсодержащих аминокислот.

В ходе эксперимента крысы линии Вистар за исключением животных контрольной группы получали вышеперечисленные источники селена в виде добавки к стандартному рациону в течение 14 или 21 дня. Доза селена во всех группах составила 5 мкг на 1 животное в день. Содержание белка и общая калорийность всех селенсодержащих добавок были пренебрежимо малы (<1%) в сравнении с суточной калорийностью и белком стандартного рациона.

В ходе всего периода кормления животные всех групп нормально росли и их средняя масса, а также массы исследованных органов как при 14-, так и при 21-дневной продолжительности эксперимента достоверно не различались, что свидетельствует о нутритивной адекватности рациона.

На основании данных по содержанию селена в сыворотке крови и органах крыс, получавших этот микроэлемент в составе исследуемых пищевых источников и селенита натрия, оценивали его всасывание. Среднее содержание селена в сыворотке крови животных, получавших селенсодержащую спирулину в течение 14 дней, практически не отличалось от данного показателя контрольной группы. Животные групп, получавших белковый препарат селенсодержащего фикоцианина (со степенью очистки в 2,1 раз), характеризовались достоверно повышенным в сравнении с контролем уровнем селена в сыворотке крови, однако этот показатель у них был достоверно ниже, чем у группы, получавшей селенит натрия.

Содержание селена в печени у крыс, получавших биомассу селенсодержащей спирулины, было достоверно выше, чем в контрольной группе, и не отличалось от данного показателя у животных, получавших селенит натрия. Близкое значение среднего уровня селена обнаружено и в печени животных, получавших белковый препарат селенсодержащего фикоцианина. Самое же низкое значение депонированного печенью селена имело место для биомассы селенсодержащих лактобацилл.

Средние уровни селена в семенниках подопытных животных, как в контрольной, так и во всех опытных группах были близки по величине и достоверно не различались между собой (Р>0,1 во всех случаях).

После 21 дня приема животными тех же пищевых источников селена его средние концентрации в сыворотке крови крыс всех опытных групп были достоверно выше контроля (Р<0,05), но не различались между собой (Р>0,1) во всех случаях. Среднее содержание селена в печени животных, принимавших селенсодержащую спирулину, при расчете на орган достоверно не отличалось от контроля (Р>0,1), однако при расчете на кг ткани печени показатель опытной группы был достоверно выше контрольного (Р<0,05). У животных, получавших белковый препарат селенсодержащего фикоцианина и селенит натрия, средние концентрации селена в печени достоверно отличались от контроля (Р<0,05), но не различались между собой (Р>0,1). При определении селена в семенниках подопытных животных была обнаружена та же картина, что и у крыс, получавших испытуемые пищевые источники в течение 14 дней.

Концентрации селена в этих органах, как крыс контрольной группы, так и всех опытных групп были близки по значениям и достоверно не различались между собой (Р>0,1 во всех случаях).

Таким образом, очевидно, что наиболее сбалансированное воздействие на тканевые депо селена оказывает белковый препарат селенсодержащего фикоцианина. У крыс, получавших данный пищевой источник селена, его относительное содержание в сыворотке крови близко к таковому в печени и семенниках. У группы животных, получавших биомассу селенсодержащей спирулины, процентное содержание селена в сыворотке крови меньше, чем у других опытных групп и близко к данному показателю контрольной группы, однако содержание селена в печени довольно высоко, что также свидетельствует о способности данной органической формы селена к тканевому депонированию.

У группы животных, получавших селенсодержащие лактобациллы, относительное содержание селена в сыворотке крови оказалось близко к данному показателю у крыс, получавших селенсодержащий белковый препарат фикоцианина. Однако содержание селена в печени оказалось на уровне контроля.

Величина безразмерного отношения концентраций общего селена в ткани печени и сыворотке крови крыс групп, получавших исследуемые пищевые источники селена в течение 14 дней, может рассматриваться как качественный критерий эффективности процессов тканевого депонирования селена, поскольку уровень селена сыворотки крови, как известно из литературы [39,154,159], коррелирует с его содержанием в лабильном пуле специфических селенопротеинов плазмы (в основном, глутатионпероксидазы типа III и селенопротеина Р), тогда как уровень селена печени может рассматриваться как показатель его консервативного тканевого депо [39,154].

При сравнительном анализе указанного показателя было обнаружено, что он наиболее высок у группы, получавшей селенсодержащую спирулину, и составляет 1,6.У группы крыс, получавших селенсодержащий белковый препарат фикоцианина, рассматриваемый показатель был равен 1,4, а получавшей селенит натрия -1,5. Все три этих величины достоверно не различались между собой, указывая на приблизительно одинаковую эффективность тканевого депонирования селена из этих трех источников. Однако у крыс, получавших биомассу селенсодержащих лактобацилл, рассматриваемое отношение не отличалось от величины для контрольной группы (0,97 и 0,99 соответственно).

Представленные данные свидетельствуют о том, что показатели ассимиляции селена пищи существенно различаются в зависимости от источника этого микроэлемента. Во всех случаях биодоступность селена в составе неорганической соли оказывается максимальной, что, однако, не может рассматриваться как аргумент в пользу использования этой добавки в продуктах питания и в составе БАД ввиду ее высокой потенциальной токсичности. Среди органических форм селена наибольшей биодоступностью и наибольшей сбалансированностью в распределении по органам и тканям обладает селен в составе селенсодержащего препарата фикоцианина. Его преимущество над цельной биомассой селенсодержащей спирулины проявляется в наибольшей степени при относительно коротком (14 дней) курсе приема. При более длительном приеме (21 день) показатели биодоступности селена из спирулины и селенсодержащего препарата фикоцианина практически выравниваются. Биодоступность селена из образца биомассы селенсодержащих лактобацилл, судя по показателю его уровня в печени, оказывается существенно ниже, чем у других источников органического селена. Ввиду этого возможности использования селенсодержащих лактобацилл в составе специализированных продуктов и БАД (в том числе пробиотического действия) не вполне ясны и требуют дополнительного изучения. Одновременно полученные данные указывают на хорошие перспективы внедрения в пищевую промышленность процессов глубокой технологической переработки обогащенной микроэлементами спирулины с получением из нее обогащенных фикоцианином фракций. Что же касается использования добавки неорганического селена, то такое использование, как уже отмечалось, может быть, на наш взгляд, оправдано только в лекарственных формах при клинических проявлениях дефицита этого микронутриента.

Можно ожидать эффективного использования в качестве нового пищевого источника микронутриента (особенно для целей профилактического и возможно лечебного питания) полученного в нашем исследовании водорастворимого препарата с высоким содержанием этого микроэлемента и фикоцианина, выделенного из биомассы селенсодержащей спирулины, исходя из достаточно многочисленных научных публикаций о широком спектре биологической активности каждого из вышеназванных соединений [39,136139,141,143,144]. Фикоцианину, как отмечалось нами ранее в обзоре литературы, свойственно выраженное иммуномодулирующее действие. В наших экспериментах in vivo при введении внутрибрюшинно мышам линии DBA различных доз высокоочищенного (содержание фикоцианина 90%) препарата пигмента, выделенного из биомассы спирулины, было охарактеризовано его иммуностимулирующее действие на животных. Фикоцианин повышал относительное число перитонеальных макрофагов в 1,8 раза (максимально эффективная доза 0,5мкг/г массы тела), оказывая, однако при этом некоторое ингибирующее влияние на нейтрофилы перитонеального экссудата.

В следующей серии экспериментов животным также внутрибрюшинно вводились различные дозы высокоочищенного препарата селенсодержащего фикоцианина, выделенного из биомассы селенсодержащей спирулины. Как и для препарата фикоцианина оценивалось влияние препарата селенсодержащего фикоцианина на лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы перитонеальной полости. Максимально эффективная доза, то есть та, при которой введение мышам селенсодержащего фикоцианина максимально увеличивала число лимфоцитов перитонеальной полости, была равна 1,0мкг/г массы тела. Это значение существенно ниже соответствующей величины, определенной при введении фикоцианина, как такового. Повышение вводимой дозы селенсодержащего фикоцианина до 5мкг/г массы тела не приводило к дальнейшему возрастанию числа перитонеальных лимфоцитов, а напротив имело место снижение их числа до контрольных значений. Эффект активирующего воздействие селенсодержащего фикоцианина на макрофаги имел место, хотя и был менее выражен по сравнению с собственно фикоцианином: число перитонеальных макрофагов повысилось всего в 1,2 раза. Максимально эффективная доза была такой же, как и для фикоцианина - 0,5 мкг/г массы тела.

Однако влияние препарата селенсодержащего фикоцианина на I перитонеальные нейтрофилы отличалось от влияния препарата фикоцианина на эти клетки, представляющие важное звено в системе неспецифической резистентности организма. Если фикоцианин снижал относительное число нейтрофилов перитонеального экссудата, то сочетание селена и фикоцианина в препарате селенсодержащего фикоцианина оказывало стимулирующее дозозависимое влияние на эти клетки и повышало их число, начиная с дозы 0,5 мкг/г массы тела, пропорционально величине вводимой дозы. Увеличение в перитонеальной полости животных количества как макрофагов, так и нейтрофилов при введении им селенсодержащего препарата фикоцианина, увеличивало фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата, что было продемонстрировано в опытах in vitro с использованием в качестве фагоцитируемого материала двух типов дрожжей с различным липидным составом цитоплазматической мембраны (Saccharomyces cerevisiae WT и Saccharomyces cerevisiae GPI). Несмотря на то, что различия в липидном составе мембран фагоцитируемых объектов влияют на их распознавание перитонеальными клетками, селенфикоцианин повышал фагоцитирующую активность клеток перитонеального экссудата независимо от вида дрожжей. Дозозависимое пропорциональное повышение активности наблюдалось, начиная с дозы 0,25мкг/г массы тела.

Таким образом, результаты, полученные в вышеперечисленных исследованиях, свидетельствуют об активирующем влиянии как фикоцианина, так и селенфикоцианина на лимфоциты и макрофаги перитонеальной полости при внутрибрюшинном введении высокоочищенных препаратов. На преимущества в плане возможного использования селенсодержащего фикоцианина как иммуностимулятора, по сравнению с фикоцианином как таковым, указывают данные сравнительного исследования влияния этих препаратов на нейтрофилы. Выраженное стимулирующее действие селенсодержащего фикоцианина на нейтрофилы при наличии некоторого ингибирующего воздействия собственно фикоцианина, позволяет предположить, что стимулирующий нейтрофилы эффект является следствием появления в составе препарата органической формы селена, хотя это предположение нуждается в дополнительной проверке. Стимулирующее влияние высокоочищенного селенфикацианина на гуморальное звено иммунитета установлено в опытах по определению дозозависимого действия препарата на число антителообразующих клеток селезенки мышей, которых иммунизировали эритроцитами барана. Иммуностимулирующее действие препарата, выделенного из селенсодержащей спирулины и содержащего в своем составе селен и фикоцианин (в количествах 4 мкг/мл и 113 мг/мл, соответственно) также было исследовано в опытах in vivo при его длительном пероральном введении крысам линии Вистар, сенсибилизированным модельным антигеном - куриным овальбумином. Уровень антител к куриному овальбумину также был достоверно и значительно выше в сыворотке крыс, сенсибилизированных этим антигеном, по сравнению с контрольной группой сенсибилизированных животных, получавших стандартный рацион вивария. Полученный результат указывает на иммуностимулирующее влияние перорального приема данного препарата на гуморальный иммунный ответ.

Подводя итоги проведенных исследований и анализируя полученные результаты, можно сделать следующее заключение. Оптимизация условий культивирования биомассы лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) в среде, обогащенной селенитом натрия позволила получить препарат

Lactobacillus plantarum, в котором содержание селена составило 1500 мкг/г сухой биомассы.

С использованием в качестве исходного сырья биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) и биомассы селенсодержащей Spirulina platensis были выделены и очищены препараты фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина. Охарактеризованы всасывание и депонирование селена печенью и семенниками при его пероральном введении в течение двух сроков (14 или 21 дня) крысам линии Вистар в дозе 5 мкг на одно животное в составе биомассы селенсодержащей Spirulina platensis, водорастворимого экстракта, выделенного из селенсодержащей биомассы Spirulina platensis, биомассы селенсодержащих Lactobacillus plantarum и селенита натрия. Самое низкое значение содержания селена в сыворотке крови после 14 дней перорального введения определено для биомассы селенсодержащей Spirulina platensis. Самое низкое содержание селена в печени при этом же сроке установлено для биомассы селенсодержащих Lactobacillus plantarum.

При пероральном введении в течение 21 дня селена в составе биомассы селенсодержащей Spirulina platensis и водорастворимого экстракта, выделенного из селенсодержащей биомассы Spirulina platensis, его содержание в сыворотке крови было выше по сравнению с 14 днями и достигло тех же значений, что и для селенита натрия. Депонирование селена печенью значимо не различалось для всех трех его источников. В семенниках селен не накапливался независимо от того, в составе какого препарата он находился. Установлено иммуностимулирующее действие высокоочищенных препаратов фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина при их внутрибрюшинном введении мышам линии DBA, однако в отличие от фикоцианина, оказывающего некоторое ингибирующее влияние на перитонеальные нейтрофилы, селенсодержащий фикоцианин оказывал стимулирующее воздействие на эти клетки.

Выявлено стимулирующее влияние на гуморальный иммунный ответ животных (крыс линии Вистар) водорастворимого экстракта, выделенного из селенсодержащей биомассы Spirulina platensis.

101

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Егорова, Екатерина Александровна, Москва

1. Авцин А.П., Жаворонков А. А., Риш М.А., Строчкова JI.C. Микроэлементозы человека: этиология, классификация, органопатология. М.: Медицина, 1991. - 496 с.

2. Алешко-Ожевский Ю. П., Зилова И. С., Мазо В. К. и др. Spirulina platensis перспективный пищевой источник эссенциальных микроэлементов// Вестн. новых мед. технологий. - 2002. - Т. 9. - № 1.- С. 3-10.

3. Берри Д. Биология дрожжей: Пер. с англ. М.: Мир, 1985. - 95 с.

4. Бланко Ф. Ф., Дерябин В. В., Пименов А. А., Бовина Е. В. Выделение структуры и биологическое действие дрожжевых маннанов// Антибиотики и медицинская биотехнология. -1987.- Т. 32. № 12.- С. 925-937.

5. Блохина Н.И., Леванова Г.Ф., Бондаренко В.М., Лихачева А.Ю. Традиционная классификация и геносистематика бактерий рода Lactobacillus// Журн. Микробиол. 1995.-№ 4- С. 19-23.

6. Глушанова НА. Лактобациллы в исследовании и коррекции резидентной микрофлоры человека: Автореф. дис.канд. мед. наук.-Новокузнецк, 1999.- 23 с.

7. Гмошинский И.В., Мазо В.К., Тутельян В.А., Хотимченко С.А. Микроэлемент селен: роль в процессах жизнедеятельности// Экология моря. -2000. -№54.-С. 5-19.

8. Голубкина Н. А., Гмошинский И. В., Зорин С. Н. и др. Влияние биологически активной добавки автолизата обогащенных селеном пекарских дрожжей на состояние кишечного барьера у крыс при анафилаксии// Вопр. питания. 1998.-№ 3.-С. 18-22.

9. Голубкина Н. А., Соколов Я. А., Хотимченко С. Н. и др. Селенообогащенные дрожжи Saccharomices cerevisiae// Биотехнология. 1996.-№5.-С. 52-56.

10. Голубкина Н.А. Флуориметрический метод определения селена// Журнал аналитической химии.- 1995.-Т.50.-С. 492-497.

11. Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов.-Л.:Наука,1978.-С.84-86

12. Жаворонков В. А., Казенин Д. А., Глущук JT. П. Устройства для перемешивания интактных культур в биотехнологии// Труды IX межд. конф. «Новые информационные технологии в медицине и экологии». Ялта, 2001. -С.123-125.

13. Зарецкая Е. С., Гмошинский И. В., Зорин С. Н. и др. Количественная оценка содержания органической формы микроэлемента селена в составе биомассы одноклеточной сине-зеленой водоросли Spirulina platensis// Биотехнология. 2003.- № 4. - С. 75-82.

14. Зарецкая Е. С., Гмошинский И. В., Мазо В. К. Новые пищевые источники микроэлементов: контроль качества// Рос. журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2002. - № 5. - С. 163.

15. Золотов П. А., Тутельян В. А., Княжев В. А. Способ получения хлебопекарных дрожжей. 1998. Патент РФ № 2103352.

16. Кудряшова А. А. Секреты хорошего здоровья и активного долголетия. М.: Пищепромиздат, 2000. - 320 с

17. Кукес В. Г., Асланян Н. В., Голубкина Н. А. и др. Динамика содержания селена в плазме крови при применении различных препаратов селена// Микроэлементы в медицине. 2002. - Т. 3.- № 4. - С. 13-16.

18. Мазо В. К., Гмошинский И. В., Зилова И. С. Микроводоросль спирулина в питании человека// Вопр. питания. 2004,- № 1. - С. 45-53.

19. Мазо В. К., Чистяков А. В., Данилина JI. JI. и др. Биологическая добавка к пище на основе пищевых дрожжей. 2000. Патент РФ № 2146874.

20. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Егорова Е.А., Ширина Л.И. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов// Клиническая диетология. 2004. - Т. 1. - №3. - С. 3 - 14

21. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Тамбиев А.Х., Кирикова Н.Н., Голубкина Н.А. Влияние биологически активной добавки к пище, содержащей биодоступный селен, на протекание реакции системной анафилаксии у крыс//Биотехнология. 1997. - № 9-10. - С. 23-28

22. Макарова С. Г., Гмошинский И. В., Мазо В. К. и др. Применение биологически активной добавки, содержащей витамин Е и селен, в комплексном лечении детей с аллергическими заболеваниями// Педиатрия. -2002.-№3.-С. 66-71.

23. Методические рекомендации (MP 2.3.1. 1915 04). "Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ". - М. - 2004.21 с.

24. Некрасов Б.В. Основы общей химии М.: Химия, 1973.- Т. 1.-351 с.

25. Нечаева С. В., Мазо В. К., Зорин С. Н., Жданова Е. Ю. Спирулина платенсис новый пищевой источник органических форм меди и марганца// Труды IX Межд. Конф. "Новые информационные технологии в медицине и экологии". - Ялта.- 2001.-С.114-115.

26. Определитель бактерий Берджи (9-е изд. в 2-х томах) Т. 2: Пер. с англ./Под. ред. Дж. Хоулта, Н.Крига, П.Смита и др. -М.: Мир, 1997.- С.570, 574, 576.

27. Оспанова М.Ш., Попова Г.М. Изучение протеолитической активности местных и производственных штаммов молочнокислых бактерий// Труды института микробиологии и вирусологии АН Казахстанской ССР.-1988.-Т.ЗЗ.-С. 176-179.

28. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Т.1. Электрофорез и ультрацентрифугирование.-М.:Наука, 1981.-С.56-72.

29. Покровский А.А. Пища как носитель и предшественник биологически активных веществ//Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева. 1978. - Т.23. - №4. - С. 34-47

30. Попова В. В. Влияние селена и цинка на рост Spirulina platensis и оптимизация внутриклеточного накопления этих элементов: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Москва. - 2003. - 18 с.

31. Пронина Н.А., Ковшова Ю.И., Попова В.В. и др. Влияние селенит-ионов на рост и накопление селена у Spirulina platensis// Физиология растений. 2002.- Т.49. - № 2. - С. 121 - 127.

32. Рожкова И.Ю. Селекция варианта штамма-продуцента лактобактерина Lactobacillus fermentum 90-ТЗ-4 для использования в гинекологической практике: Автореф. дис.канд. мед. наук. Москва. - 1999. -23 с.

33. Соколова К.Я. Усовершенствование метода изучения микробиоценозов/ Новое в практике лабораторных исследований. — Под ред. д.м.н, Г.К. Дегтевой. -Н. Новгород, 1991. С. 37-45.

34. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочнокислых продуктов. М.: Изд-во Сергиев Посад ООО "Все для Вас-Подмосковье.",1999.- 412 с.

35. Тутельян В.А., Княжев В.А., Хотимченко С.А. и др. Селен в организме человека. М.: Изд-во РАМН, 2002. - 224 с.

36. Тюрин М.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл: Автореф. дис. канд. мед наук. -Москва. 1990. - 24 с.

37. Уголев A.M. Теория адекватного питания// Природа. 1987. - №3. -С. 73 -77.

38. Химический состав пищевых продуктов. Т.1.-М.: Пищевая промышленность, 1976 234 с.

39. Шаховская А. К., Гмошинский И. В., Васильев А. В. и др. О применении органической формы селена в питании гастроэнтерологических больных// Экология моря: Сб. научных трудов. 2000.- Вып. 54. - С. 83-86.

40. Шевелева С. А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса// Вопросы питания. 1999.- Т.68-№2. -С. 32-40.

41. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том 3: Пробиотики и функциональное питание,- М.:"Грант", 2001.288 с.

42. Якушин С. С., Мазо В. К., Сазонова Н. С. и др. Влияние селеносодержащей биологически активной добавки к пище на обеспеченность селеном больных ишемической болезнью сердца// Вестн. новых мед. технологий. 2003. -Т. 10.- № 3.- С. 84.

43. Aguilar-Uscanga В., Francois J.M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation// Lett. Appl. Microbiol.- 2003.- Vol.37. №3.- P.268-274.

44. Amrane A. Seed culture and its effect on the growth and lactic acid production of Lactobacillus helveticus//J. Gen. Appl. Microbiol. 2003. - Vol. 49 -P.21-27.

45. Appadiirai S. Lactic acid production by immobilized Lactobacillus casei in recycle batch reactor: a step towards optimization// Journal of Biotechnology. -1999.-Vol. 73-P. 61-70.

46. Arora A.S., Gores G.J. The role of metals in ischemia/reperfusion injury of the liver. //Semin. Liver.Dis.- 1996. Vol.16. - №1.-P.31 -38.

47. Bansal M.P., Kaur T. Growth characteristics and selenium status changes of yeast cells with inorganic and organic selenium supplementation: selenium, a chemopreventive agent//J. Med. Food. 2002. - Vol.5. - №2. -P. 85-90.

48. Bates J. M., Spate V. L., Morris J. S. et al. Effects of selenium deficiency on tissue selenium content, deiodinase activity, and thyroid hormone economy in the rat during development// Endocrinology. 2000.- Vol. 141- №7. - P. 2490-2500

49. Batist G., Katki A.G., Klecker R., Myers C.E. Selenium induced cytotoxicity of human leukemia cells: interction with reduced glutathione// Cancer Res. 1986.- Vol. 46. - №11. - P. 5482-5285.

50. Beckett G.J., Arthur J.R. Selenium and endocrine systems// J. Endocrinol. 2005. - Vol. 184. - №3. p. 455-465.

51. Behne D., Weiss-Nowak C., Kalcklosch M. et al. Studies on distribution and characteristics of new mammalian selenium-containing proteins// Analyst. -1995.-Vol.120.-P. 823-825.

52. Beilstein M.A., Whanger P.D. Deposition of dietary organic and inorganic selenium in rat erythrocyte proteins// J. Nutr. 1986. - Vol. 116. - №9. — P. 1701 -1710.

53. Belay A. Current knowledge on potential health benefits of Spirulina//J. Appl.Phycol. 1993. - Vol.5. - P.423-430.

54. Belo I., Pinheiro R., Mota M. Fed-batch cultivation of Saccharomyces cerevisiae in a hyperbaric bioreactor//Biotechnol. Prog. 2003.- Vol.19. - №2. - P. 665-671.

55. Bjornstedt M., Kumar S., Bjorkhem L. et al. Selenium and the thioredoxin and glutaredoxin systems// Biomed. Environ. Sci. 1997. - Vol. 10. - №2-3. - P. 271-279.

56. Boussiba S., Richmond A. C-phycocyanin as a storage protein in the blue-green alga Spirulina platensis//Arch. Microbiol. 1980. - Vol. 125. - №2. - P. 234 -238.

57. Calomme M., Hu J.,Vanden Branden K., Vanden Berghe D.A. Seleno-lactobacillus. An organic selenium source// Biol, trace Elem. Res. 1995. -Vol.47. -P. 379-383.

58. Campanella L., Russo M.V., Avino P. Free and total amino acid composition in blue-green algae// Ann. Chim. 2002. - Vol. 92. - P.343-52.

59. Cannell R.J. Algal biotechnology// Appl. Biochem. Biotechnol. 1990. -Vol.26.-№1.-P.85-105.

60. Cases J., Vacchina V., Napolitano A. et al. Selenium from selenium-rich Spirulina is less bioavailable than selenium from sodium selenite and selenomethionine in selenium deficient rats // J. Nutr. 2001. - Vol. 131. - № 8. - P. 2343-2350.

61. Cases J., Wysocka J.A., Caporiccio B. et al. Assessment of selenium bioavailability from highselenium spirulina subfractions in selenium deficient rats//J. Food. Chem. 2002. - Vol.50. - №13.- P.3867-3873.

62. Cha J.Y., Park J.C., Jeon B.S. et al. Optimal fermentation conditions for enhanced glutathione production by Saccharomyces cerevisiae FF-8// J. Microbiol. -2004.- Vol. 421. -№ P. 51-55.

63. Chassaigne H., Chery C.C., Bordin G., Rodriguez A.R. Development of new analytical methods for selenium speciation in selenium-enriched yeast material// J. Chromatogr. A. 2002.- Vol.976. - №1-2.- P.409-22.

64. Clement G. Production and characteristic constituents of the algae Spirulina platensis and maxima// Annales de la Nutrition et de l'Alimentation. -1975.-Vol.29. №6.-P. 477-488.

65. Cohen Z., Vonshak A., Richmond A. Fatty acid composition of Spirulina strains grown under various environmental conditions// Phytochemistry. Vol. 26. -№ 8. - P.457-463.

66. De Angelis M., Corsetti A., Tosti N. et al. Characterization of non-starter lactic acid bacteria from Italian cheeses based on phenotypic, genotypic and cell wallprotein analyses// Appl. and Envirom. Microbiol. 2001. - Vol. 67. - №5. - P. 20112020.

67. De Moreno de LeBlanc A., Matar C., LeBlanc N. et al. Effects of milk fermented by Lactobacillus helveticus R389 on a murine breast cancer model//Breast Cancer Res. 2005. - Vol.7 - P. 477-486.

68. Delcour J., Ferain Т., Deghorain M. et al. The biosynthesis and functionality of the cell-wall of lactic acid bacteria//Antonie van Leeuwenhock.1999.- Vol.76. -P.159-184.

69. Dobrogosz Walter J., Jeffrey Scott R. Variability of Lactobacillus plantarum in response to growth on lactose//Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1987.- Washington D.C.-1987. P. 229.

70. Dodds K.L., Collms-Thompson D.L. Nitrite tolerance and nitrite reduction in lactic acid bacteria associated with cured meat products// Int. J. Food Microbiol.-1984.-Vol. 1.- №3. p. 163-170.

71. Elli M., Zink R., Rytz A., et al. Iron requirement of Lactobacillus spp. in completely chemically defined growth media// Journal of Applied Microbiology.2000.- Vol. 88. № 4. - Р.695-703.

72. Engman L. Contgreave I., Angulo M. et al. Diaryl chalcogenides as selective inhibitors of thioredoxin reductase and potential antitumor agents// Anticancer Res. 1997. - Vol.17. -№6D.- P. 4599-4605.

73. Evenson J.K., Wheeler A.D., Blake S.M. Selenoprotein mRNA is expressed in blood at levels comparable to major tissues in rats// J. Nutr. 2004. -Vol. 134. - №10. - P. 2640-2645.

74. Fenster K.M., Parkin K.L., Steele J.L. Intracellular esterase from Lactobacillus casei LILA: nucleotide sequencing, purification, and characterization// J. Dairy Sci. -2003.- Vol. 86. -№4. P. 1118-1129.

75. Fujii M., Saijoh K., Sumino K. Regulation of selenoprotein P mRNA expression in comparison with metallothionein and osteonectin mRNAs followingcadmium and dexamethasone administration// Kobe. J. Med. Sci. 1997. - Vol.43. -№1. - P. 13-23.

76. Gamier F., Dubacq J.P., Thomas J.C. Evidence for a transient association of new proteins with the Spirulina maxima phicobilisome in relation to light intensity// Plant. Physiol.- 1994. Vol. 106. - №2. - P. 747 - 754.

77. Gharieb M.M., Gadd G.M. The kinetics of 75Se.-selenite uptake by Saccharomyces cerevisiae and the vacuolization response to high concentrations//Mycol. Res. 2004.- Vol. 108 (Pt. 12) - P. 1415-1422.

78. Gireesh Т., Nair P.P., Sudhakaran P.R. Studies on the bioavailability of the provitamin A carotenoid, beta-carotene, using human exfoliated colonic epithelial cells//Br. J Nutr. 2004. - Vol. 92. - №2. - P. 241-245.

79. Gladyshev V.N., Hatfield D.L. Selenocystein containing proteins in mammalians// J. Biomed. Sci. - 1999. - Vol.6. - №3. - P. 151 - 160.

80. Godva N.K., Ramana J.V., Prasad C.S., Singh K. Micronutrient content of certain tropical conventional and unconventional feed sources in Southern Africa// Trop.Anim. Helth Prod. 2004. - Vol. 36. - №1. - P. 77 - 94.

81. Gromer S., Johansson L., Bauer H. et al. Active sites of thioredoxin reductases: why selenoproteins? //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003.-Vol. 100. -№22.- P. 12618-12623.

82. Hao Z., Chen S., Wilson D.B. Cloning, expression and characterization of Cadmium and Manganese uptake genes from Lactobacillus plantarum// Appl. and Envirom. Microbiol. 1999. - Vol. 65 -№11. -P. 4746-4752.

83. Hao Z., Reiske H.R., Wilson D.B. Characterization, of Cadmium uptake in Lactobacillus plantarum and isolation of Cadmium and Manganese uptake mutants// Appl. And Envirom. Microbiol. 1999. - Vol. 65 - №11. -P. 4741-4745.

84. Herrera A., Boussiba S., Napoleone V., Hohlberg A. Recovery of c-phycocyanin from the cyanobacrerium Spirulina maxima//J.Appl.Phycol. 1989. -Vol.1. - №4.-P. 327-331.

85. Hill K.E., Zhou J., McMahan W.J. et al. Neurological dysfunction occurs in mice with targeted deletion of the selenoprotein P gene//J. Nutr. 2004. - Vol.134. - №1.- P.157-61.

86. Huang S.A., Dorfman D.M., Genest D.R. Type 3 iodothyronine deiodinase is highly expressed in the human uteroplacental unit and in fetal epithelium// J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003. - Vol. 88. - №3.- P. 1384-8.

87. Huang Z., Zheng W.J., Guo B.J. Optimization of cultivation conditions in Se-enriched Spirulina platensis//Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. -2002. Vol.18. -№3. - P. 373-376.

88. J. Xu, W. Verstraete. Evaluation of nitric oxide production by lactobacilli//Appl.Microbiol. Biotechnol. 2001. - Vol. 56. - № 3-4. - P.504-507.

89. Jaffe W.G. Effect of selenium intake in humans and in rats//Proceedings of the Symposium on Selenium-Tellurium in the environment. Pittsburgh: Industrial Health Foundation.-1976.-P. 188-193.

90. Jerne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody-producing cells//Science. 1963. - Vol.26. P.140 - 405.

91. K. Rabe L. and S. L. Hillier Optimization of Media for Detection of Hydrogen Peroxide Production by Lactobacillus Species// Journal of Clinical Microbiology. 2003. -Vol. 41. - № 7. - P. 3260-3264.

92. Као О.Н., Edwards M.R., Berns D.S. Physical -chemical properties of С- phycocianin isolated from acido thermophilic eukaryote, Cyanidium caldarium// Biochem. J.- 1975.- Vol. 147. - № 1. - P. 63 - 70.

93. Kapoor R., Metha U. Supplementary effect of Spirulina on hematological status of rats during pregnancy and lactation// Food Hum. Nutr.- 1998. Vol.52. -№4.-P. 315-324.

94. Kapoor R., Metha U. Iron bioavailability from Spirulina platensis, whole egg and whole wheat//Indian J.Exp.Biol. 1992. - Vol.30. - №10. - P.904 - 907.

95. Kapoor R., Metha U. Iron status and growth of rats fed different dietary iron sources//Plants Food Hum. Nutr. 1993.- Vol.44.- № 1. - P. 29-34.

96. Karen E. S., Noren C. J. The efficiency of Escherichia coli selenocysteine insertion is influenced by immediate downstream nucleotide.//Nucleic acids research.- 2000. Vol. 28. - №3. - P. 755-761.

97. Kask S., Laht T.M., Pall T. et al. A study on characteristics and nutrient consumption of Lactobacillus plantarum in A-start culture// Antonie van Leeuwenhock. 1999.- Vol. 75. - P. 309-320.

98. Kleerebezem M., Boekhorst J., van Kranenburg R. et al. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1// PNAS.-2003.- Vol. 100. №4. -P. 1990-1995.

99. Kuhad R.C., Singh A., Tripathi K.K. et al. Microorganisms as an alternative source of protein.//Nutr. Rev. 1997. - Vol.55. - №3. - P.65-75.

100. Laemli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature. 1970.- Vol.227. - P. 680 -685.

101. Li Z.Y., Guo S.Y., Li L. Bioeffects of selenite on the growth of Spirulina platensis and its biotransformation//Bioresour. Technol. -2003. Vol.89. - № 2. -P.171-176.

102. Martinova E.A., Merrill A.H. Jr. Fumonisin B1 alters sphingolipid metabolism and immune function in BALB/c mice: immunological responses to fumonisin Bl// Mycopathologia. 1995.- Vol. 130- №3. - P.163-70.

103. Mazo G. N., Savvin S. N., Pronina N. A. et al. Chemical speciation of Zn, Cu and Cr in Spirulina platensis microalgae// ICP Information Newsletter. 2002. -Vol. 27. - Special edition. - P. 138.

104. McKenzu R.C., Rafferty T.S., Beckett G.J. Selenium: an essential element for immune function// Trends immunology today.-1998.-Vol. 19. № 8.-P.342-345.

105. Minkova K.M., Tchernov A. A., Tchorbadjieva M.I. et al. Purification of С- phycocyanin from Spirulina (Arthospira) fusiformis//J. Biotechnol. 2003. -Vol.102.-№1.- P.55-59.

106. Naveena B.J., Altaf M., Bhadriah K., Reddy G. Selection of medium components by Plackett-Burman design for production of L(+) lactic acid by Lactobacillus amylophilus GV6 in SSF using wheat bran//Bioresour. Technol. 2005.- Vol. 96. №4. - P.485-490.

107. Pagmantidis V., Bermano G., Villette S. et al. Effects of Se-depletion on glutathione peroxidase and selenoprotein W gene expression in the colon//FEBS Lett. 2005. - Vol. 579. - №3. -P. 792-796.

108. Patrick L. Selenium biochemistry and cancer: a review of the literature// Altern. Med. Rev. 2004. - Vol.9. - №3. - P. 239 - 258.

109. Pickering I. J., Prince R. C., Salt D. E. et al. Quantitative chemically imaging of selenium transformation in plants// Proc. Natl. Acad. Soc. 2000. Vol. 97.-№20.-P. 10717-10722.

110. Pinero Estrada J.E., Bermeo Bescoc P., Villar del Fresno A.M. Antioxidant activity of different fractions of Spirulina platensis protein extract// Farmaco. -2001. Vol.56. - № 5-7. - P.497-500.

111. Pinson В., Sagot I., Daignan-Fornier B. Identification of genes affecting selenite toxicity and resistance in Saccharomyces cerevisiae.// Mol. Microbiol. -2000. Vol. 36. - №3. - P.679-87.

112. Ponce de Leon C.A., Bayon M.M., Paquin C., Caruso J.A. Selenium incorporation into Saccharomyces cerevisiae cells: a study of different incorporation methods.// J. Appl. Microbiol. -2002. Vol. 92. - №4.- P.602-610.

113. Probiotics a critical review/ edited by Gerald W. Tannock. —1999. -Wymondham UK. Horizont Scientific Press - 383 p.

114. Pulz O., Gross W. Valuable products from biotechnology of microalgae//Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2004. Vol.65. - №6. - P.635-648.

115. Quillet M. Carbohydrates synthesized by the spirulines// Annales de la Nutrition et de l'Alimentation. 1975. - Vol. 29. - № 6. -P. 553-561.

116. Range 1-Yagui Cde O., Danesi E.D., de Carvalho J.C., Sato S., Chlorophyll production from Spirulina platensis: cultivation with urea addition by fed-batch process//Bioresour. Technol. 2004.- Vol. 92. - №2.- P. 133-41.

117. Rayman M.P. The use of high-selenium yeast to raise selenium status: how does it measure up? //Br. J. Nutr.- 2004.- Vol. 92. №4,- P.557-73.

118. Reddy M.C., Subhashini J., Mahipal S.V. et al. С Phycocyanin, a selective cyclooxygenase - 2, induces apoptosis in lipopolysaccharide - stimulated RAW 264.1 macrophages// Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2003. - Vol. 304. -№ 2. - P. 385.

119. Remirez D, Fernandez V, Tapia G, et al. Influence of C-phycocyanin on hepatocellular parametres related to liver oxidative stress and Kupffer cell functioning//Inflamm. Res. -2002. Vol.51. - № 7. - P. 351-356.

120. Remirez D, Gonzalez R., Merino N. Et al. Inhibitory effects of Spirulina in zymosan indused arthritis in mice//Mediators Inflamm. 2002. - Vol.11. - № 2. -P. 75 -7 9.

121. Remirez D, Ledon N, Gonzalez R. Role of histamine in the inhibitory effects of phycocyanin in experimental models of allergic inflammatory response/Mediators Inflamm. 2002. - Vol.l 1. - № 2. -P. 81-85.

122. Ringquist S., Schneider D., Gibson T. et al. Recognition of the mRNA selenocysteine insertion sequence by the specialized translational elongation factor SELB// 7 Genes Dev. 1994.- Vol. 18. - №3. - P. 376-385.

123. Ml.Romay Ch., Gonzalez R., Ledon N. C-phycocyanin a biliprotein with antioxidant, anti-inflammatory, neuroprotective effects//Curr. Protein Pept. Sci. -2003. Vol. 4. - №3. - P. 207-216.

124. Rozes N., Peres C. Effects of phenolic compounds on the growth and fatty acid composition of Lactobacillus plantarum//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. -Vol.49.-P. 108-111.

125. Ryan-Harshman M., Aldoori W. The relevance of selenium to immunity, cancer, and infectious/inflammatory diseases//Can. J. Diet. Pract. Res. -2005. -Vol.66. №2.-P.98-102.

126. Savaskan N.E., Brauer A.U., Kuhbacher M. Selenium deficiency increases susceptibility to glutamate-induced excitotoxicity// FASEB J. 2003. - Vol. 17. -№1. - P. 112-114.

127. Shahbazi A., Mims M.R., Li Y. et al. Lactic acid production from cheese whey by immobilized bacteria//Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. -Vol. 121. - №5. - P.529-540.

128. Shih S.R., Tsai K.N., Li Y.S., et al. Inhibition of enterovirus 71 induced apoptosis by allophycocyanin isolated from a blue - green alga Spirulina platensis//J. Med. Virol. -2003. - Vol.70. - № 1. - P. 119-125.

129. Silva Lopes Mde F., Leitao A.L., Marques J.J. et al. Processing of extracellular lipase of Lactobacillus plantarum: involvement of a metalloprotease// FEMS Microbiology Letters. 1999. - Vol. 176. - №2. -P.483-487.

130. Smith M.J., Westfall B.B. Further field studies on the selenium problem in relation to public health// US Public Health Rep. Vol. 52. - P. 1375-1384.

131. Squire В., Stubbe J. Cloning, sequencing and expression of the adenosylcobalamin- dependent ribonucleotide reductase from Lactobacillus leichmannii//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993.-Vol. 90. № 18. - P. 8352-8356.

132. Stabnikova O., Wang J.Y., Ding H.B., Tay J.H. Biotransformation of vegetable and fruit processing wastes into yeast biomass enriched with selenium// Bioresour. Technol. -2005.- Vol. 96. №6. - P. 747-751.

133. Stokes C.R., Miller B.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity I I Food allergy and intolerance .-London e.a.-l987.-P.286-300

134. Subhashini J., Mahipal S.V., Reddy M.C. et al. Molecular mechanisms in С Phycocyanin induced apoptosis in human chronic myeloid leukemia cell line -K562//Biochem Pharmacol. - 2004. - Vol. 68. - №3. - P. 453-62.

135. Suhajda A., Hegoczki J., Janzso B. et al. Preparation of selenium yeasts I. Preparation of selenium-enriched Saccharomyces cerevisiae//J. Trace Elem. Med. Biol. 2000.-Vol.14. - №l.-P.43-47.

136. Sunde R.A. Molecular biology of selenoproteins //Annu.Rev.Nutr.-1990.-Vol.10.-P.451-474.

137. Swanson C.A., Patterson B.H., Levander O.A. et al. Human 74Se.selenomethionine metabolism: a kinetic model// Amer.J. Clin. Nutr. 1991. -Vol. 54. -№5.-P. 917-926.

138. Szulc В., Ryszka F., Dolinska B. The kinetic study of the selenium yeast stability//Boll. Chim. Farm. 2003.- Vol.142. - №2.- P.66-68.

139. Teale F.W., Dale R.E. Isolation and characterization of phycobiliproteins// Biochem.J.-1970.-Vol.l 16. № 2. - P.161-169.

140. Vanden Berghe D.A., 2002.Trace element rich additive, method for preparing same, preparation in which the additive is included and use thereof. US Patent №6.479.050

141. Waschulewski I.H., Sunde R.A. Effect of dietary methionine on tissue selenium and glutathione peroxidase (EC 1.11.1.9) activity in rats given selenomethionine// Brit.J.Nutr.-1988.- Vol.60.- № 1.- P.57-68

142. Watanabe F., Katsura H., Takenaka S. et. al. Pseudovitamin B(12) is the predominant cobamide of an algal health food, spirulina tablets // J. Agric. Food Chem.- 1999.- Vol.47. №11.-P.4736-4741.

143. Watanabe Y., Hall D.O. Photosynthetic production of the filamentous cyanobacterium Spirulina platensis in a cone-shaped helical tubularphotobioreactor//J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - Vol. 44. - № 6. - P. 458463

144. Weigle W., Cochrane G., Dixon F. Anaphylactogenic properties of soluble antigen-antibody complexes in the guinea pig and rabbit// J.Immunol.-1960.-V.86.-P.469-475.

145. Weinberg E.D. The Lactobacillus anomaly: total iron abstinence// Perspectives in biology and medicine. 1997. - Vol.40. - №4. - P.578-583.

146. William C. Bowman and Edvard De Moll Biosynthesis of biotin from dethiobiotin by the biotin auxotroph Lactobacillus plantarum// Journal of Bacteriology.- 1993. -Vol. 175. -P. 7702-7704.

147. Yang G., Zbu L., Liu S. Human selenium requirements in China.// Selenium in biology and medicine./ Eds. G.F. Combs Jr. et al. Part B. Westport: AVI, 1987. P. 589-607.

148. Yang G., Zhou R., Yin S. et al. Studies of safe maximal daily selenium intake in a seleniferous area in China. Part I// J. Trace Elem. Electrolytes Health Dis. -1989.-Vol.3.- P.77-87.

149. Yoneda S., Suzuki K.T. Equimolar Hg-Se complex binds to selenoprotein P.//Biochem. Biophys.Res.Commun. 1997. - Vol. 231. - №1. - P. 7-11.

150. Yoshida M., Sugihara S., Suenaga T. et al. Digestibility and chemical species of selenium contained in high-selenium yeast// J. Nutr. Sci. Vitaminol (Tokyo). 2002.-Vol.48. - №5.- P.401-404.

151. Zagrodzki P., Nicol F., McCoy M.A. et al. Iodine deficiency in cattle: compensatory changes in thyroidal selenoenzymes// Res. Vet. Sci. 1998. - Vol. 64. - №3.-P. 209-211.

152. Zhang J., Reddy J., Buckland В., Greasham R. Toward consistent and productive complex media for industrial fermentations: studies on yeast extract for a recombinant yeast fermentation process// Biotechnol. Bioeng. 2003.- Vol. 82. - №6.-P.640-652.

153. Zimmermann M.B., Kohrle J. The impact of iron and selenium deficiencies on iodine and thyroid metabolism: biochemistry and relevance to public health// Thyroid. 2002. - Vol.12. - №10. - P. 867-878.

154. Zinoni F., Birkmann A., Leinfelder W., Bock A. Cotranslational insertion of selenocysteine into formate dehydrogenase from Escherichia coli directed by a LIGA codon// VProc. Natl. Acad.Sci. USA.- 1987.-Vol.84. № 10. - P.3156-3160.

Информация о работе

Егорова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм селена - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы