Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биодоступности и влияния органических форм селена и цинка на состояние слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение биодоступности и влияния органических форм селена и цинка на состояние слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс"

На правах рукописи 005051543

ПЕНЕВА ВЕРА ВИТАЛЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ БИОДОСТУПНОСТИ И ВЛИЯНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ФОРМ СЕЛЕНА И ЦИНКА НА СОСТОЯНИЕ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОНКОЙ КИШКИ РАСТУЩИХ КРЫС

03.01.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

4 АПР 2013

Москва - 2013

005051543

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт питания" Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Мазо Владимир Кимович

Официальные оппоненты: Соколов Николай Николаевич,

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук, заведующий лабораторией медицинской

биотехнологии

Плетень Анатолий Петрович,

доктор биологических наук, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический

университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, старший преподаватель кафедры биохимии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится «_»_2013 г. в 14-00 на заседании

Диссертационного Совета Д 001.002.01 в ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу: 119240, Москва, Устьинский проезд 2/14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ питания» РАМН Автореферат разослан «_»_2013 г.

Учёный секретарь

Диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор

Коденцова В.М.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность проблемы

Важнейшим в теоретическом и практическом отношении в концепции оптимального (здорового) питания является положение о необходимости адекватного снабжения организма макро- и микроиутриентами, в том числе эссенциальными микроэлементами [Тутельян В.А., 2005; Погожева A.B., 2010]. Глобальная проблема недостаточной микронутриентной обеспеченности населения различных регионов определяет необходимость научного обоснования, разработки и комплексной медико-биологической оценки безопасности и эффективности использования в питании новых пищевых источников эссенциальных микроэлементов, получаемых с помощью инновационных биотехнологических подходов. С общебиологических позиций, учитывающих эволюционный фактор, очевидна целесообразность использования в питании человека органических форм микроэлементов [Мазо В.К. и др., 2009; Serfass R.E., 2003]. Пищевые источники этих микроэлементов, жизненно необходимых организму человека, должны отвечать требованиям безопасного использования в питании и высокой эффективности для восполнения микроэлементной недостаточности. Это положение относится, в частности, к цинку и селену - эссенциальным микроэлементам, обладающим выраженным антиоксидантным и иммуномодулирующим действием и широко используемым в составе специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавках (БАД) [Коденцова В.М. и др., 2011; Багрянцева О.В. и др., 2012; Patrick L., 2004; Prasad AS., 2008]. Специалистами разработано и осуществлено биотехнологическое получение новых пищевых органических форм селена и цинка, проведена в эксперименте оценка их острой токсичности [Зорин С.Н. и др., 2007; Vegarud G.E., 2000; Vanden Berghe D.A., 2002; Costa J.A.V., 2004]. Однако крайне недостаточно исследовано влияние этих пищевых источников селена и цинка на состояние барьера желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), обеспечивающего защиту внутренней среды организма от потенциально возможного избыточного проникновения чужеродных антигенов, токсинов микрофлоры, вирусов и микроорганизмов [Ногаллер А. М. и др., 2008; Finamore А, 2008; Tran CD, 2009; Zhong W, 2010]. Барьерная функция ЖКТ, как известно, реализуется за счет совокупного действия составляющих её компонентов: пищеварительно-транспортного конвейера (желудочно-кишечной моторики, секреции пищеварительных соков, полостного и пристеночного пищеварения), активности ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани и, самым существенным образом, эпителиального слоя слизистых оболочек [Daniel R Clayburgh, 2004]. Повышенное поступление белковых макромолекул во внутреннюю среду организма свидетельствует о нарушенной целостности

барьера ЖКТ, в первую очередь, эпителия тонкой кишки как зоны преимущественного всасывания нутриентов.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «НИИ питания» РАМН по темам №069 «Экспериментально-клиническая оценка биодоступности новых источников органических соединений некоторых эссенциальных микроэлементов (цинк, селен, йод, медь, марганец)» и №080 «Разработка системы лабораторных тестов для выявления дифференциальной диагностики пищевой аллергии».

Цель работы - экспериментальная оценка биодоступности органических форм селена и цинка и их влияния на состояние слизистой оболочки тонкой кишки лабораторных животных (крыс).

1.2. Основные задачи исследования

1. Провести сравнительную физиолого-биохимическую оценку биодоступности органической (ферментолизат селенсодержащих пищевых дрожжей) и неорганической (селенит натрия) форм селена в эксперименте на растущих крысах-самцах линии Вистар.

2. Количественно охарактеризовать всасывание модельного белкового антигена -куриного овальбумина в ЖКТ растущих крыс-самцов линии Вистар, получавших рацион с адекватным и десятикратно повышенным содержанием селена в составе ферментолизата селенсодержащих дрожжей.

3. Охарактеризовать состояние слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс-самцов линии Вистар в условиях различной обеспеченности селеном с использованием морфологических методов исследования.

4. Оценить сенсибилизирующее действие ферментолизата селенсодержащих дрожжей с использованием модели системной анафилаксии у взрослых крыс-самцов линии Вистар.

5. Оценить биодоступность комплекса цинка с ферментолизатом белка мяса мидий в эксперименте на растущих крысах-самцах линии Вистар.

6. Количественно охарактеризовать всасывание модельного белкового антигена -куриного овальбумина в ЖКТ растущих крыс-самцов линии Вистар в условиях различной обеспеченности этих животных цинком.

7. Охарактеризовать состояние слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс-самцов линии Вистар в условиях различной обеспеченности цинком с использованием морфологических методов исследования.

1.3. Научная новизна

Впервые установлено, что проницаемость барьера ЖКТ лабораторных животных (растущих крыс) относительно модельного антигена - овальбумина не нарушается (не возрастает) при десятикратном превышении в корме адекватного содержания селена в органической форме - ферментолизате селенсодержащих пищевых дрожжей. С использованием морфологических методов исследования показано, что как адекватное, так и десятикратно повышенное поступление с рационом селена в органической форме препятствует развитию неблагоприятных изменений в слизистой оболочке тонкой кишки, отмечаемым у крыс, потреблявших селендефицитный рацион.

Впервые установлено, что потребление крысами цинка в форме комплекса с ферментолизатом мяса мидий снижает у этих животных проницаемость защитного барьера ЖКТ, характеризуемую всасыванием модельного антигена - овальбумина.

Показано, что включение комплекса цинка с ферментолизатом белка коровьего молока в рацион крыс, предварительно находившихся в течение 14 суток на цинкдефицитном полусинтетическом рационе, способствует восстановлению у этих животных ряда морфометрических показателей, характеризующих состояние эпителиального слоя слизистой оболочки тонкой кишки.

1.4. Практическая значимость работы

Установленная экспериментально в опытах in vivo высокая биодоступность и безопасность органических форм селена и цинка определяют перспективность их дальнейшей клинической апробации для использования в широком спектре продуктов оздоровительного действия, в том числе БАД к пище и специализированных пищевых продуктов, предназначенных для восполнения микроэлементной недостаточности. Экспериментально доказанное для ферментолизата селенсодержащих пищевых дрожжей отсутствие неблагоприятного воздействия на состояние защитного барьера ЖКТ, а также сенсибилизацию и тяжесть анафилактических проявлений у лабораторных животных является дополнительным обоснованием безопасности его использования в составе БАД к пище и специализированных пищевых продуктов. Предложена комплексная экспериментальная оценка эффективности и безопасности использования в питании органических форм пищевых источников селена и цинка, включающая не только характеристику биодоступности, восполнения микроэлементной недостаточности, но и влияния на состояние защитного барьера ЖКТ и на анафилактическую чувствительность, которая может быть использована для аналогичной комплексной оценки новых пищевых источников других эссенциальных микроэлементов.

1.5. Внедрение результатов в практику

Материалы диссертации, использованы в специализированном курсе лекций «Биохимия эссенциальных микроэлементов» ФГБУ «НИИ питания» РАМН.

1.6. Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены на X Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питания и здоровье», Москва, 1-3 декабря 2008 г., на III съезде общероссийского союза общественных объединений «Российское общество медицинской элементологии», Москва, 11-13 мая 2012 г.

1.7. Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемом научном журнале, рекомендованном Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ, и 1 публикация в сборнике Материалов X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питания и здоровье».

1.8. Личный вклад соискателя

Все изложенные в диссертации результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач интерпретация полученных результатов осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.

1.9. Объём и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (195 ссылок). Объем работы составляет 122 страницы, содержит 5 рисунков, 2 фотографии, 1 схему и 21 таблицу.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Химические реактивы и оборудование

В работе использованы химические реактивы квалификации ОСЧ, ХЧ или ЧДА, а также коммерческие специализированные наборы для биохимических и иммунологических исследований. При проведении исследований использовано отечественное и импортное оборудование: спектрофотометр однолучевой СФ-46 («ЛОМО», СССР); анализатор иммуноферментный колориметрический «Эфос 9305» (Московский завод «Сапфир», Россия); спектрофотометр атомно-абсорбционный («Hitachi 180-80», Япония) с Зеемановской поляризацией; печь муфельная ПЛ-5 (ООО «Накал», Россия); деионизатор воды «Водолей» (НПП «Химпромэлектроника», Россия), ультрафильтрационная установка «МИНИТАН» («Миллипор, США) с набором мембран от 100 до 10 кД, нанофильтрационная установка

(«Владисарт», Россия), измельчитель тканей лабораторный («Waring commercial blender 800S», США, 22000 об/мин), санный микротом («Рейхерт», Австрия).

2.2. Лабораторные животные Опыты in vivo проведены на лабораторных крысах-самцах линии Вистар, полученных из питомника «Столбовая», с исходной массой тела от 80 до 200 г. Всего в работе проведено 5 экспериментов, использовано 167 крыс. До начала экспериментов животные находились на стандартном общевиварном рационе (ОВР), используемом в ФГБУ «НИИ питания» РАМН. В зависимости от схемы проведения конкретного эксперимента животные получали сбалансированный ОВР ФГБУ «НИИ питания» РАМН, специально приготовленные селенобогащенный и цинкобогащенный рационы, а также коммерческий селендефицитный («Low Selenium Diet, Rat Modified», MP Biomedicals LLC, Франция) и цинкдефицитный («Zinc Deficient Diet, Egg White Base», MP Biomedicals LLC, Франция) рационы.

2.3. Пищевые источники органических форм селена и цинка В качестве источника селена в органической форме использовали водорастворимую фракцию ферментолизата селенсодержащей биомассы пекарских" дрожжей (ФСПД) «Se-Витасил» (ООО «Эней-ВИТА», Россия).

Ферментолизат мяса мидий (ФММ), его комплекс с цинком (Zn-ФММ) и комплекс цинка с ферментативным гидролизатом белка коровьего молока (Zn-ФГБКМ), полученные по методике [Зорин С.Н. и др., 2008] с использованием сырого мороженого мяса зеленой мидии Mytilus Perna viridus и цельного белка коровьего молока, предоставлены старшим научным сотрудником ФГБУ «НИИ питания» РАМН, к.б.н. Зориным С.Н.

2.4. Физико-химические методы исследования. Элементный анализ Содержание цинка в комплексах Zn-ФММ и Zn-ФГБКМ определяли с использованием метода атомно-абсорбционной спектрофотометрии [Скурихин И.М. и Тутельян В.А., 1998] совместно со старшим научным сотрудником ФГБУ «НИИ питания» РАМН, к.б.н. Шевяковой Л.В.

Содержание селена в исследуемых материалах определяли микрофлуориметрическим методом с реактивом 2,3-диаминонафталином [Голубкина H.A., 1995]. В качестве стандартов использованы раствор селенита натрия с содержанием селена 50 нг в пробе, навески аттестованного стандарта селенсодержащих дрожжей с содержанием селена 450 мкг/г и стандарта сыворотки крови с известным содержанием селена.

2.5. Биохимические методы исследования in vitro Общую активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови крыс определяли с помощью набора производства фирмы «Ольвекс» (Россия) унифицированным методом «по конечной точке».

В крови определяли активность глутатионпероксидазы (ГПО) по методике [Мальцев Г.Ю., Тышко Н.В., 2002]. Исследование проведено с использованием гемолизатов эритроцитов, полученных из гепаризированной крови. Исходные гемолизаты готовили разведением осажденной при 1500 g в течение 10 мин эритроцитарной массы дистиллированной водой в соотношении 1:1 с последующим однократным перезамораживанием гемолизата при -15 -18°С.

Суммарная антиоксидантная активность (АОА) сыворотки крови (в относительных единицах) определена по методу [Ивахненко В.И. и др., 2007], совместно с врачом ФГБУ «НИИ питания» РАМН, к.б.н. Ивахненко В.И. Метод основан на оценке способности сыворотки крови к подавлению Ре2+-зависимого перекисного окисления липидов в желточных липопротеинах in vitro.

Концентрацию в сыворотке крови специфических IgG антител (суммы фракций IgGl и IgG4) к белку куриного яйца - овальбумину (ОВА) и концентрацию ОВА [Голубкина H.A., Гмошинский И.В. и др., 1998] определяли с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста (стандартного ELISA) на полистироле согласно [Stuart С.А., Twistelton R., 1984] с незначительными модификациями.

Иммуноферментные определения проведены совместно с ведущим научным сотрудником ФГБУ «НИИ питания» РАМН, доктором биологических наук Гмошинским И.В.

2.6. Морфометрические методы

По окончании экспериментов животных подвергали патологоанатомическому вскрытию и брали кусочки дистального отдела тонкой кишки для гистологического исследования. Гистологический материал фиксировали в жидкости Карнуа и заливали в парафин, окрашивали гематоксилином и эозином, а также Шифф-реактивом по методу Шабадаша и окраски муцикармином для выявления секрета (муцина) бокаловидных клеток. При изучении полученных препаратов использовали морфометрические методы: измеряли высоту ворсинок и глубину крипт, высоту эпителиального слоя на срезах ворсинок, в слое эпителия проводили подсчет эпителиальных и бокаловидных клеток, количество лимфоцитов и митотически делящихся клеток.

Морфологические исследования проведены совместно с научным сотрудником ФГБУ «НИИ питания» РАМН, к.б.н. Гаджиевой З.М.

2.7. Экспериментальные методы исследования in vivo

Всасывание исследуемых пищевых источников органического селена и цинка, их сенсибилизирующее действие, влияние на иммунологическую реактивность лабораторных

животных, барьерную функцию ЖКТ, характеризуемую всасыванием ОВА, и состояние слизистой оболочки кишки исследовано в опытах in vivo.

2.7.1. Оценка всасывания органической и неорганической форм селена, их влияния на ростовые показатели и селеновый статус лабораторных животных проведена в эксперименте №1 на 39 растущих крысах-самцах линии Вистар с начальной массой 92,2±1,9 г. Животные были разделены на 4 группы. Первая группа животных получала селендефицитный рацион (содержание селена 0,02 мг/кг). Животные второй группы получали тот же селендефицитный рацион, но с добавлением водного раствора селенита натрия до конечного содержания селена в диете 0,22 мг/кг. Селендефицитный рацион животных третьей и четвертой групп обогащался селеном в органической форме (ФСПД) до конечной концентрации селена 0,22 мг/кг и 2,02 мг/кг корма, соответственно. Продолжительность эксперимента составила 28 дней. Каждую неделю животных всех групп взвешивали. В последний день эксперимента у животных второй, третьей и четвертой группы определяли всасывание ОВА (раздел 2.7.2). После выведения из эксперимента у животных всех групп отбирали кровь и внутренние органы (печень, почки, селезенку, семенники). В крови определяли активность ЩФ, ГПО, АОА. Все органы взвешивали, а содержание селена определяли в сыворотке крови и печени.

2.7.2. Для определения влияния неорганической и органической формы селена на всасывание ОВА в ЖКТ растущих крыс в эксперименте №1 тестировали всасывание в кровь модельного пищевого антигена - ОВА у животных трех групп: второй, третьей и четвертой. Содержание ОВА в сыворотке крови крыс определено (через 3 ч после его внутрижелудочного введения в дозе 2,0 г/кг массы животного) с использованием иммуноферментного метода определения.

2.7.3. Экспериментальная оценка влияния ФСПД на сенсибилизацию и протекание реакции анафилаксии проведена в эксперименте №5 на взрослых крысах-самцах линии Вистар с исходной средней массой тела 170±10 г. После недели адаптации крысы первой (опытной) группы (25 животных) получали в течение 28 дней ad libitum ОВР с добавлением органического источника селена (ФСПД), крысы второй (контрольной) группы (26 животных) получали только ОВР также ad libitum. Расчетное количество ФСПД составило 4 мг на одну крысу в день, что соответствовало дополнительному количеству 5 мкг селена на одно животное в день. Модель системной анафилаксии воспроизводили согласно [Stokes C.R., Miller B.G., 1987] с незначительными модификациями [Мазо В.К. и др., 2004]. По окончании эксперимента у животных опытной и контрольной групп отбирали кровь из хвостовой вены для определения ответа антител к ОВА, вводили внутривенно разрешающую дозу ОВА и наблюдали развитие симптомов активного анафилактического шока. Степень

сенсибилизации животных оценивали, определяя концентрацию в сыворотке крови специфических антител к ОВА.

2.7.4. Оценка в опытах на лабораторных животных влияния обеспеченности цинком на ростовые показатели и активность ЩФ проведена в эксперименте №3 с использованием растущих крыс-самцов линии Вистар с исходной средней массой тела 131±3 г (24 животных). Крысы были разделены на три группы (по 8 крыс в группе). На протяжении всего эксперимента, продолжавшегося в течение трёх недель, животные первой (контрольной) группы получали ОВР, адекватно обеспечивающий животных макро- и микронутриентами, животные второй группы получали полусинтетический цинкдефицитный корм, животные третьей группы получали полусинтетический цинкдефицитный корм, обогащенный цинком в составе 2п-ФММ (содержание цинка составило 13 мг/кг корма). На протяжении всего эксперимента через каждые двое суток животных всех групп взвешивали. По окончании эксперимента у животных отбирали кровь и внутренние органы (печень, почки, селезенку, семенники). В сыворотке крови определяли активность щелочной фосфатазы, внутренние органы взвешивали.

2.7.5. В рамках эксперимента №3 (раздел 2.7.4.) также проводили оценку влияния органической формы цинка на всасывание ОВА в ЖКТ растущих крыс второй (получающих цинкдефицитный корм) и третьей групп (получающих корм, обогащенный цинком в форме комплекса с ФММ). Барьерная функция ЖКТ этих животных охарактеризована путем определения содержания в крови внутрижелудочно введенного модельного белкового антигена - ОВА.

2.7.6. Морфологическое (морфометрическое и гистологическое) исследование влияния селена и цинка на состояние слизистой оболочки тонкой кишки крыс проведено в эксперименте №2 и №4, соответственно. В эксперименте №4 животные (29 крыс-самцов линии Вистар) были разделены на три группы: первая группа (9 крыс) получала полусинтетический цинкдефицитный корм, обогащенный сульфатом цинка до конечного содержания 13,3 мг/кг; вторая группа (10 крыс) получала полусинтетический цинкдефицитный рацион (содержание цинка 1,3 мг/кг), третья группа (10 крыс) на протяжении первых 14 дней получала цинкдефицитный корм, а последующие 14 дней -полусинтетический цинкдефицитный корм, дополнительно обогащенный цинком в форме 2п-ФГБКМ до конечного содержания 13,3 мг/кг («восстанавливающее кормление»). Эксперимент №2 проводили на 24 крысах-самцах линии Вистар с начальной массой 92,2±1,9 г. Животных разделили на 4 группы по 6 животных в каждой. Животные первой (контрольной) группы в течение всего эксперимента получали ОВР. Остальные три группы получали селендефицитный корм. Корм животных групп №3 и №4 обогащали селеном в

органической форме (ФСПД) до конечной концентрации селена 0,22 мг/кг корма (адекватно обогащенный) и 2,02 мг/кг корма (десятикратно обогащенный). При выведении животных из экспериментов у них отбирали кусочки дистального отдела тонкой кишки для гистологического исследования.

2.8. Статистическая обработка результатов исследований Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакетов программ MS Excel ХР и SPSS 11.5 для Windows. Математическая обработка данных эксперимента включала расчет средних значений со стандартными ошибками и представленных как М±т. Достоверность различий значений средних уровней исследуемых показателей определяли с использованием двухстороннего t-теста Стьюдента. Различия принимали за достоверные при вероятности принятия нуль-гипотезы (уровне значимости) р<0,05. Дополнительно проверяли гипотезу о различии распределений рассматриваемых показателей с помощью непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Различия признавались за достоверные на уровне значимости р<0,05.

3. Результаты и их обсуждение 3.1. Сравнительная оценка биодостуииости органической и неорганической форм селена в эксперименте на растущих крысах-самцах линии Вистар

Данные об относительном приросте массы тела растущих крыс, потреблявших селенодефицитный рацион или рационы с добавлением селенита натрия или ФСПД (раздел 2.7.1., эксперимент №1), приведены в таблице 3.1.1.

Таблица 3.1.1. Относительный прирост массы тела животных (% к исходной массе).

№ групп Содержание селена в рационе Количест во крыс в группе 8 сутки 15 сутки 22 сутки 28 сутки

1 Селен-дефицитный 0,02 мг/кг 10 9,6 ±2,7 37,6 ±4,8 67,5 ±6,1 89,8 ±5,7

2 Селенит натрия 0,22 мг/кг 9 13,7 ±4,3 38,9 ±5,4 71,9 ±6,2 86,2 ±6,6

3 ФСПД, 0,22 мг/кг 10 18,1±2,9* 43,4 ±3,5 73,5 ±3,9 91,8 ±4,4

4 ФСПД, 2,02 мг/кг 10 19,7±5,1* 43,9 ±7,9 75,5±11,4 95,4 ±11,8

Примечание: * Различие с группой №1 достоверно, Р<0,05; непараметрический критерий Мана-Уитни

За первую неделю нахождения на еелендефицитном рационе животные (группа №1) статистически значимо отстали по массе тела, по приросту массы тела в сравнении с животными, получавшими корм, обогащенный органической формой селена (группы №3, №4). Однако в дальнейшем для больших сроков наблюдения это различие было недостоверным, что может свидетельствовать об определенной адаптации животных к недостаточной селеновой обеспеченности в условиях данного эксперимента.

Относительные массы тимуса, почек, печени, селезёнки, сердца достоверно не различались у животных всех групп.

Уровень селена в сыворотке крови и печени животных статистически достоверно нарастал с увеличением его содержания в корме (таблица 3.1.2.). При этом достоверно выше концентрация селена была (как в сыворотке крови, так и печени) у животных, потреблявших ФСПД по сравнению с животными, потреблявшими такое же количество селена в виде селенита натрия. Для этих же групп животных, средние значения активности ГПО в крови были практически одинаковыми. По-видимому, большее всасывание органической формы селена вело к депонированию этого микроэлемента в отличие от селенита натрия, используемого организмом животных в основном для синтеза селенспецифических протеинов [Schrauzer G.N., 2001]. Полученные значения были минимальными при потреблении крысами селендефицитного корма (группа №1) и статистически достоверное повышение (р<0,05, критерий Мана-Уитни) активности ГПО было установлено лишь у животных, получавших корм, содержание селена в котором составляло 2,02 мг/кг (группа №4).

Таблица 3.1.2. Содержание селена в сыворотке крови, печени, активность ГПО и АОА крови крыс.

№ групп Содержание селена в рационе АОА, отн. Ед. Селен в сыворотке, нг/мл Селен в печени, нг/г ГПО, мкмоль/мин/мг (на белок)

1 Селен-дефицитный 1,13 ±0,07 31,0±2,2* 110,4±6,6* 1,06±0,22°

2 Селенит натрия 0,22 мг/кг 1,30 ±0,12 150,1±5,3* 561,6±13,7* 1,61 ±0,31

3 ФСПД, 0,22 мг/кг 1,36±0,09° 169,7±4,5* 662,8±17,7* 1,53±0,12

4 ФСПД, 2,02 мг/кг 1,19 ±0,06 303,2±12,4* 2274,0±108,1* 2,71± 0,52

Примечание: * Различие между всеми группами достоверно (р<0,05); 0 Различие с группами 1 и 4 достоверно (р<0,05); непараметрический критерий Мана-Уитни

По сравнению с группой №3 достоверно (р<0,05) наименьшее значение АОА было определено в крови животных групп №1 и №4, получавших селендефицитный корм и корм с аномально высоким содержанием селена, соответственно. Таким образом, и низкая, и избыточная селеновая обеспеченность животных однонаправлено неблагоприятно сказывались на АОА крови.

Полученные результаты свидетельствуют о более высокой усвояемости и, следовательно, более предпочтительном использовании органической формы селена по сравнению с его неорганической формой.

3.2. Количественная характеристика всасывания макромолекулярного зонда-куриного овальбумина в желудочно-кишечном тракте растущих крыс в условиях различной обеспеченности селеном В таблице 3.2.1. представлены результаты определения всасывания в кровь макромолекулярного зонда - ОВА из ЖКТ растущих крыс, получавших селенит натрия и ФСПД (раздел 2.7.2., эксперимент№1).

Таблица 3.2.1. Содержание ОВА в сыворотке крови экспериментальных животных (через 3 ч после внутрижелудочного введения ОВА).

№ групп Содержание селена в рационе Количество крыс в группе Куриный ОВА, нг/мл

2 Селенит натрия 0,22 мг/кг 9 59,4 ± 30,7

3 ФСПД, 0,22 мг/кг 10 18,0 ±5,3

4 ФСПД, 2,02 мг/кг 10 15,7 ±2,5

Во всех случаях различия между группами недостоверны, р>0,05, критерий Мана-Уитни

Имеет место тенденция к увеличению проницаемости барьера ЖКТ для ОВА у растущих крыс, получавших селен в неорганической форме - селените натрия (у двух крыс наблюдалась аномально высокое всасывание ОВА в сыворотке крови: 162 нг/мл и 267 нг/мл), причем у этих же животных оказалась самой большой относительная масса селезенки (0,9% и 1% от массы тела). Использование органической формы селена в этой же дозировке не приводило к аномально высоким значениям всасывания ОВА ни у одного из животных. В условиях опыта не выявлено сколько-нибудь существенного различия всасывания ОВА у крыс групп №3 и №4. Таким образом, даже десятикратное увеличение содержания органической формы селена в корме по сравнению с физиологической дозировкой приводит к его депонированию печенью, не вызывая при этом нарушения проницаемости барьера ЖКТ для макромолекул ОВА, характеризуемой всасыванием этого белка в кровь.

3.3. Морфологическая характеристика состояния слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс в условиях различной обеспеченности селеном

В эксперименте №2 (раздел 2.7.6.) с использованием метода морфометрии количественно и качественно охарактеризовано состояние структуры слизистой оболочки дистального отдела тонкой кишки растущих крыс линии Вистар. ОВР был принят в качестве некоего «физиологического эталона», в сравнении с которым использование полусинтетического рациона менее благоприятно влияет на состояние эпителия тонкой кишки. Действительно, такой показатель, как высота эпителия в криптах достоверно отличался от контрольного значения у всех трех групп животных, получавших полусинтетические рационы. Также у животных трёх опытных групп в эпителии ворсинок по сравнению с контролем было достоверно увеличено количество лимфоцитов, что может указывать на усиление функций местной защиты слизистой оболочки. Не выявлено достоверных различий в количественных показателях состояния эпителиального пласта для животных, адекватно обеспеченных органической формой селена, и животных, получавших десятикратно избыточную дозу этого микроэлемента также в органической форме.

Наиболее выражены неблагоприятные изменения в слизистой оболочке тонкой кишки крыс, получавших селендефицитный полусинтетический рацион (таблица 3.3.1). У животных этой группы уменьшена высота клеток эпителия на ворсинках и криптах, снижено количество муцинпродуцирующих клеток и клеток эпителия на продольном срезе ворсинок.

У животных получавших корм с добавлением адекватной их потребностям дозировки органической формы селена (0,22 мг/кг корма), изменения в структуре слизистой оболочки были менее выражены, чем у крыс, получавших селендефицитный корм.

У крыс, получавших с кормом десятикратно увеличенное количество селена в составе ФСПД (2,02 мг/кг корма), по ряду морфометрических показателей слизистая оболочка кишки была близка к таковой у животных, получавших ОВР: высота ворсинок, глубина крипт, высота клеток эпителия на ворсинках, количество клеток эпителия на продольном срезе ворсинок и крипт не различались достоверно (р>0,05).

Таблица 3.3.1. Морфометрические показатели состояния слизистой оболочки кишки крыс с различной обеспеченностью селеном (условные единицы).

\Содержание селена в \рашюне/группа Морфо- N. метрические показатели ОВР, группа №1 Селен дефицитный, группа №2 0,22 мг/кг органический селен, группа №3 2,02 мг/кг органический селен, группа №4

Высота ворсинок 30,8±1,88 28,9±1,43 31,6±1,07 29,26±1,68

Глубина крипт 30,0±0,79 26,9±1,34 28,2±1,22 27,9± 1,68

Высота клеток эпителия на ворсинках 5,16±0,27 4,1±0,18* 4,5±0,26* 4,67±0,18°

Высота клеток эпителия в криптах 4,48±0,34 3,7±0,15* 3,6±0,35* 3,6±0,21*

Количество клеток эпителия на продол, срезе ворсин 109,6±2,58 101,8±1,84* 109,0±2,42 109,1±2,59°

Количество клеток эпителия на продол, срезе крипт 83,3±3,03 75,5±2,64 79,0±2,81 78,3±2,47

Количество бокаловидных клеток в эпителии ворсинок 17,96±0,62 14,58±0,68* 15,9±0,69* 14,7±0,61*

Количество бокаловидных клеток в эпителии крипт 21,7±1,01 18,07±0,55* 20,9± 1,8 8 18,8±0,56*

Примечание: между группами №3 и №4 достоверных различий не выявлено (р>0,05); * Различие с группой №1 достоверно (р<0,05); ° Различия с группой №2 достоверны (р<0,05) согласно 1-критерия Стъюдента

Таким образом, гистологическая оценка влияния обеспеченности селеном показала, что наиболее выражены были неблагоприятные изменения в слизистой оболочке кишечника крыс, получавших селендефицитный корм, а наименее - у животных, получавших корм, максимально обогащенный органической формой селена (2,02 мг/кг корма).

3.4. Влияние органической формы селена на сенсибилизацию и тяжесть проявлений анафилактического шока у взрослых крыс

При использовании такой органической формы селена как ФСПД нельзя исключать априори проявления им сенсибилизирующих свойств [Зорин С.Н., Гмошинский И.В., 2006; Гмошинский И.В., Зорин С.Н., 2007]. Вопрос о возможности проявления у нового пищевого источника иммуномодулирующих свойств, влияющих на чувствительность организма к другим антигенам (аллергенам), был изучен в эксперименте №5 с использованием модели пищевой анафилаксии у лабораторных животных (раздел 2.7.З.).

В таблице 3.4.2. представлены данные (не достигающие уровня достоверной значимости, р>0,05), свидетельствующие о снижении тяжести реакции анафилаксии (анафилактический индекс, летальность) в группе животных, получающих дополнительно ФСПД.

Таблица 3.4.2. Результаты оценки тяжести активного анафилактического шока у крыс с различной обеспеченностью селеном и уровня специфических антител к ОВА в сыворотке крови этих животных.

№ группы Содержание селена в рационе Уровень антител, мг/мл Анафилактический Индекс Летальность, %

1 ОВР+ФСПД 1,3±0,3 1,36 8,0

2 Контроль (ОВР) 1,9+0,3 1,88 19,2

Во всех случаях различия между группами недостоверны, р>0,05, критерий Мана-Уитни

Уровень антител к ОВА, характеризующий степень сенсибилизации животных, оказался также ниже (не достиг уровня достоверной значимости, р>0,05) для группы животных, получавших вместе с ОВР добавку ФСПД, в сравнении с животными, получавшими только ОВР.

Таким образом, установлено, что введение в рацион крыс ФСПД не приводит к усилению у них тяжести реакции системной анафилаксии и степени сенсибилизации.

3.5. Влияние обеспеченности растущих крыс органической формой цинка на их ростовые показатели и цинковый статус

Результаты количественной оценки влияния органической формы цинка (2п-ФММ) на ростовые показатели и активность ЩФ (раздел 2.7.4., эксперимент №3) представлены в таблице 3.5.1. и на рисунке 1.

Прирост массы тела, %

90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Дни эксперимента

■ 2п-дефицит; • 2п-мидии а ОВР

*

* У г' .к

( Г I / г

/ / к / (

/ * /

у • / / X

/ / ,___ 1-1 1— -ш

у -9Г

У 1

Рисунок 1. Относительный прирост массы тела растущих крыс на протяжении всего эксперимента №3.

По окончании эксперимента животные, получавшие ОВР и имевшие исходно меньшую массу тела, по сравнению с животными, получавшими цинкдефицитный рацион, обогнали их не только по относительному приросту, но и по абсолютному значению массы тела.

Масса тела животных, получавших гп-ФММ увеличивалась на протяжении всего эксперимента и по его окончании относительный прирост массы тела был даже достоверно (р<0,05) выше, чем таковой у животных контрольной группы, потреблявших ОВР.

О недостаточной обеспеченности цинком животных, получавших цинк дефицитный корм, то есть о снижении их цинкового статуса, свидетельствуют сравнительные данные по активности ЩФ. Активность ЩФ сыворотки крови крыс, получавших цинкдефицитный корм, была высоко достоверно (р<0,001) в 2,38 раза ниже соответствующего показателя для крыс, корм которых был обогащен органической формой цинка.

Таблица 3.5.1. Прирост массы тела (% от исходной массы) и активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови экспериментальных животных.

№ группы Содержание цинка рационе Масса тела первый день эксперимента Масса тела заключ. день эксперимента Прирост массы, % ЩФ, нм/с/л

1 ОВР 118,1±7,9 208,3±15,0 77±6,7*

2 Zn-дефицит (1,3 мг/кг) 141,8±2,1 176,1±3,6 24,3±2,8* 944±139*

3 Zn-ФММ (13 мг/кг) 134,1±5,1 247,4±7,1 85,5±5,9 2247±139

Достоверности различия (Р), критерий Манна-Уитни

Различия между группами №1-№3 <0,05 -

Различия между группами №2-№3 <0,01 <0,001

Результаты, полученные на этом этапе исследований, свидетельствуют о высокой биодоступности нового пищевого источника органической формы цинка, эффективно обеспечивающей прирост массы тела у растущих лабораторных животных. Пептидные фракции различной молекулярной массы в составе ферментолизата мяса мидий, обладая собственной биологической активностью и образуя комплексы с цинком, способствуют, по-видимому, повышенному усвоению в организме этого микроэлемента.

3.6. Влияние органической формы цинка на всасывание куриного овальбумина в желудочно-кишечном тракте растущих крыс

Определение всасывания антигенной формы ОВА проведено в эксперименте №3 (раздел 2.7.5.) для двух групп растущих крыс: животных, получавших на протяжении всего эксперимента полусинтетический цинкдефицитный рацион (группа №2), и животных, получавших тот же рацион, но обогащенный Zn-ФММ (группа №3). Средние значения концентрации ОВА в сыворотке крови крыс составили для групп №2 и №3, соответственно, 43,2±11,0 нг/мл и 26,0± 13,3 нг/мл.

Несмотря на относительно небольшие количества животных в сравниваемых группах и значительный разброс экспериментальных данных для индивидуальных животных, всегда имеющий место при тестировании этого показателя, выявлено достоверное (р<0,05, согласно критерия Манна-Уитни) снижение проницаемости барьера ЖКТ при нормальной обеспеченности крыс органической формой цинка по сравнению с дефицитом

этого эссенциального микроэлемента. Таким образом, использование в качестве пищевого источника цинка комплекса этого микроэлемента с ФММ препятствует повышенному всасыванию макромолекул пищи.

3.7. Морфологическая характеристика состояния слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс в условиях различной обеспеченности цинком

Результаты морфометрической оценки состояния слизистой оболочки дистального отдела тонкой кишки у трех групп животных различно обеспеченных цинком (раздел 2.7.6, эксперимент №4) представлены в таблице 3.7.1. У животных второй группы, получавших цинкдефицитный корм в течение всего эксперимента, достоверно увеличена глубина крипт (р<0,05) и достоверно уменьшена высота клеток эпителиального слоя на ворсинках (р<0,05), отмечены гораздо большая частота отслойки эпителия от собственной пластины, образование микрополипозных выростов в виде складок эпителиального слоя, появление участков низких клеток с пикнозом ядер. Более чем в 2 раза снижалось число клеток в криптах, находящихся в состоянии митотического деления (р<0,05).

У крыс третьей группы, получавших в течение двух недель цинкдефицитный корм, а затем в течение двух недель рацион, обогащенный гп-ФГБКМ, глубина крипт и высота клеток эпителия на ворсинках восстанавливались до значений, не отличающихся достоверно (р>0,1) от этого показателя для животных первой группы, но отличались достоверно (р<0,05) в сравнении с группой №2. У крыс, получавших восстанавливающий корм, как и у крыс цинкдефицитной группы, в слое эпителия вершин ворсинок имелись очаги десквамации клеток. Количество таких животных составляло 70% и 40% соответственно в группах, потреблявших цинкдефицитный и восстанавливающий корм. При этом в группе животных, потреблявших цинкдефицитный полусинтетический рацион наблюдалась более тяжелая картина, со случаями нарушения непрерывности эпителиального слоя в зонах десквамации. Таким образом, дополнительное введение цинка в форме комплекса 2п-ФГБКМ в полусинтетический корм восстановило глубину криптальных отделов, высоту эпителиального слоя в слизистой оболочке дистального отдела тонкой кишки крыс, получавших ранее цинкдефицитный корм, до показателей, характерных для крыс, потреблявших достаточно обеспеченный цинком корм.

Было отмечено, что у крыс получавших «восстанавливающее питание», также как и у животных, нормально обеспеченных цинком в течение всех 28 дней, не обнаружено очагов нарушения непрерывности эпителиального пласта в тонкой кишке.

Таблица 3.7.1. Морфометрические показатели состояния слизистой оболочки кишки у крыс с различной обеспеченностью цинком (условные единицы).

^\Содержапие цинка в рационе, № группы Морфо-метрические показатели ^^^ Сульфат цинка, 13,3 мг/кг, группа №1 дефицитный, 1,3 мг/кг, группа №2 «Восстанавлива ющий», группа №3

Высота ворсинок 52,8±2,3 51,5±1,6 52,8±1,7

Глубина крипт 51,6±4,0* 63,7±1,2 55,8±3,1**

Количество бокаловидных клеток в эпителии ворсинок, % 16,5±1,5 14,3±0,7 15,5±1,2

Количество бокаловидных клеток в эпителии крипт, % 21,3±1,8 21,1±1,0 22,1±1,7

Высота клеток эпителия на ворсинках 5,4±0,3* 4,5±0,3 5,2±0,2**

Высота клеток эпителия в криптах 4,0±0,4 3,2±0,2 3,6±0,2

Количество митозов в эпителии крипт 2,8±1,0* 1,2±0,1 1,5±0,2

Примечание: * Различия между группами 1 и 2 достоверны; ** Различия между группами 2 и 3 достоверны; непараметрический ранговый критерий Мана-Уитни.

Полученные данные, как и результаты предыдущих разделов, свидетельствуют о безопасности и эффективности использования органических форм цинка в питании лабораторных животных с целью коррекции недостаточной обеспеченности этим микроэлементом.

4. Выводы

1. Всасывание в кровь и депонирование селена в печени у животных, потреблявших его органическую форму (ферментолизат селеносодержащих дрожжей), было достоверно выше (169,7±4,5 нг/мл сыворотки крови и 662,8±17,7 нг/г печени, соответственно), чем у животных, получавших такое же количество селена в форме неорганического соединения (150,1±5,3 нг/мл сыворотки крови и 561,6±13 нг/г печени, соответственно).

2. Десятикратное превышение оптимальной дозы селена в органической форме не оказывало неблагоприятного воздействия на барьерную функцию ЖКТ растущих крыс: отсутствовали достоверные различия всасывания биомаркера макромолекулярной проницаемости овальбумина у крыс, получавших в течение 28 суток корм с адекватным и десятикратно повышенным содержанием ферментолизата селеносодержащих пищевых дрожжей (18,0±5,3 нг/мл и 15,7±2,5 нг/мл, соответственно).

3. У крыс, получавших на протяжении 28 суток полусинтетический корм с адекватным или десятикратно превышенным содержанием селена, морфометрические показатели, характеризующие состояние слизистой оболочки тонкой кишки (высота клеток эпителия на ворсинках, количество клеток на продольном срезе ворсинок), были увеличены по сравнению с таковыми у крыс, получавших в течение этого же времени селенодефицитный рацион.

4. Обогащение общевиварного рациона ферментолизатом селеносодержащих дрожжей не повышало у взрослых крыс степени сенсибилизации к модельному анафилактогену и тяжести проявлений у этих животных системной анафилаксии.

5. Потребление растущими крысами в течение 21 суток цинка в органической форме (комплекс цинк-ферментолизат белка мяса мидий) в составе полусинтетического рациона свидетельствовало о высокой биодоступности этого микроэлемента. Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови и прирост массы тела относительно исходной у этих животных (2247±139 нм/с/л и 85,5±5,9%, соответственно) были значительно и достоверно выше, чем у животных, потреблявших цинкдефицитный корм (944±139 нм/с/л и 24,3±2,8%, соответственно).

6. У растущих крыс, получавших в течение 21 суток в составе полусинтетического рациона комплекс цинка с ферментолизатом мяса мидий, всасывание в кровь модельного антигена -овальбумина достоверно ниже (26,0±13,3 нг/мл), чем у животных, получавших в течение этого же времени полусинтетический цинкдефицитный рацион (43,2±11,0 нг/мл).

7. Потребление крысами полусинтетического цинкдефицитного рациона в течение 28 суток приводило к неблагоприятным морфологическим изменениям слизистой оболочки тонкой кишки. Включение в течение двух недель комплекса цинка с ферментолизатом белка коровьего молока в полусинтетический рацион животных, предварительно получавших две недели цинкдефицитный рацион, способствовало частичному восстановлению морфологических показателей: высоты клеток эпителия на ворсинках, глубины криптальных отделов.

Список опубликованных работ по теме диссертации Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки России:

1. Зорин С.Н., Пенена В.В., Бучанова A.B., Гмошинский И.В., Ивахненко В.И., Мазо В.К.. Оценка биодостпности органической и неорганической форм селена в опытах на растущих крысах.//Вопросы питания.-2008.-Т. 77, № 6,- С. 72-74.

2. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Саблина В.В. (Пенева В.В.), Зорин С.Н. Проницаемость стенки тонкой кишки для белковых антигенов у человека и лабораторных животных.//Вопросы питания. — 2008. — Т. 77, N 2. — С. 10-22.

3. Зорин С.Н., Бучанова A.B., Матяш А.И., Пенева В.В., Гмошинский И.В., Мазо В.К. Влияние комплекса органического цинка с ферментативным гидролизатом мяса мидий на всасываемость в желудочно-кишечном тракте потенциально аллергенных пищевых белков.//Вопросы питания,- 2010.-1.19, № 2.-С.73-77.

4. Гаджиева З.М., Пенева В.В., Зорин С.Н., Мазо В.К. Морфометрическая характеристика состояния слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс в условиях различной обеспеченности их селеном.// Вопросы питания. - 2012 - Т.81, №1.- С. 86-89.

Материалы научных конференций

5. Зорин С.Н., Бучанова A.B., Пенева В.В., Гмошинский И.В. Влияние различных источников селена на некоторые физиологические и биохимические показатели лабораторных животных.// Материалы X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питания и здоровье»,- М., 2008.- С.37.

Список сокращений

Zn-ФГБКМ-комплекс цинка с ферментативным гидролизатом белка коровьего молока

Zn-ФММ - комплекс цинка с ферментативным гидролизатом мяса мидий

АОА - антиоксидантная активность

БАД - биологически активная добавка

ГПО - глутатионпероксидаза

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ОВА - овальбумин

ОВР - общевиварный рацион

ФММ - ферментативный гидролизат мяса мидий

ФСПД - ферментативный гидролизат селенсодержащих пищевых дрожжей ЩФ - щелочная фосфатаза

Заказ № 34-П/03/2013 Подписано в печать 15.03.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пенева, Вера Витальевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт питания" Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

04201355923

ПЕНЕВА ВЕРА ВИТАЛЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ БИОДОСТУПНОСТИ И ВЛИЯНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ФОРМ СЕЛЕНА И ЦИНКА НА СОСТОЯНИЕ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОНКОЙ КИШКИ РАСТУЩИХ КРЫС

03.01.04. - Биохимия

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -Доктор биологических наук, профессор Мазо Владимир Кимович

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................................1

1.1. Краткая характеристика биологического действия цинка и селена............^

1.1.1. Селен................................................................................................................................................................^ ^

1.1.2. Цинк.................................................................................

1.2. Биотехнологические пищевые источники органических форм селена

и цинка..........................................................................................................................................................................у!

1.2.1. Дрожжи - продуценты органических форм пищевого селена......................л „

1 о

1.2.2. Комплексы цинка с пептидами и аминокислотами ферментативных гидролизатов пищевых белков................................................................................................................2q

1.3. Влияние цинка и селена на состояние защитного барьера желудочно-кишечного тракта..........................................................

1.3.1. Влияние неорганических соединений цинка................................

1.3.2. Влияние неорганических соединений селена..............................................................^

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................................................зу

2.1. Химические реактивы и оборудование..........................................

2.2. Лабораторные животные...........................................................

2.3. Ферментолизат мяса мидий............................................................................................................^

2.4. Гидролизат пищевых дрожжей......................................................................................................^

2.5. Физико-химические методы исследований. Элементный анализ..................^

2.5.1.Определение содержания цинка методом атомно-абсорбционной

спектрофотометрии............................................................................................................................................^

2.5.2. Микрофлуориметрический метод определения селена....................................^

2.6. Биохимические методы исследования in vitro................................................................^

2.6.1 .Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови... ^

2.6.2.Определение активности глутатионпероксидазы......................................................^

2.6.3.Определение антиоксидантной активности сыворотки крови......................^

2.6.4. Определение восстановленных тиолов в печени лабораторных животных (крыс)........................................................................ ^

2.6.5. Иммуноферметные методы.................................................... ^

2.6.5.1. Определение концентрации в сыворотке крови специфических IgG антител (суммы фракций IgGl и IgG4) к OB А с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста (стандартного ELISA)........... ^

2.6.5.2. Определение всасывания OB А в сыворотке крови лабораторных животных (крыс)........................................................................ ^

2.7. Морфометрические методы...................................................... ^

2.8. Экспериментальные методы исследования in vivo..........................

2.8.1. Оценка в опытах на лабораторных животных (крысах) всасывания органической и неорганической форм селена, их влияния на ростовые показатели и селеновй статус......................................................... 49

2.8.2. Определение влияния неорганической и органической формы селена на всасывание куриного ОВА в желудочно-кишечном тракте растущих крыс............................................................................ 50

2.8.3. Морфологическое исследование влияния селена на состояние слизистой оболочки кишки крыс..................................................... 50

2.8.4. Экспериментальная оценка влияния ферментолизата селенсодержащих дрожжей (водорастворимой фракции) на степень сенсибилизации и протекание реакции анафилаксии у лабораторных 51 животных (крыс).........................................................................

2.8.5. Оценка в опытах на лабораторных животных (крысах) влияния обеспеченности цинком на ростовые показатели и активность щелочной фосфатазы................................................................................. 52

2.8.6. Экспериментальная оценка влияния органической формы цинка на всасывание куриного ОВА в желудочно-кишечном тракте растущих 53 крыс.........................................................................................

2.9. Статистическая обработка результатов исследований..................... 54

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................. 55

3.1. Влияние неорганической и органической формы селена на некоторые физиолого-биохимические показатели и селеновую обеспеченность растущих крыс...................................................... 55

3.2. Влияние неорганической и органической формы селена на всасывание макромолекулярного зонда - куриного ОВА в желудочно-кишечном тракте растущих крыс.................................................... 62

3.3. Морфологическая характеристика состояния слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс в условиях различной обеспеченности селеном..................................................................................... 66

3.4. Влияние органической формы селена на тяжесть проявлений анафилактического шока и гуморальный иммунный ответ у крыс............ 74

3.5. Влияние обеспеченности крыс органической формой цинка на их ростовые показатели и цинковый статус............................................ 79

3.6. Влияние органической формы цинка на всасывание куриного ОВА в желудочно-кишечном тракте растущих крыс...................................... 86

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................... 89

5. ВЫВОДЫ............................................................................... 100

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................... 102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

GSH - восстановленные тиолы

IFN-gamma - гамма-интерферон

IgG- иммуноглобулины класса G

MLCK - легкие цепи киназы миозина

PBS - фосфатно-солевой буфер

TNBS - тринитробензолсульфоновая кислота

TNF - фактор некроза опухоли

Zn-ФГБКМ - комплекс цинка с ферментативным гидролизатом белка коровьего молока

Zn-ФММ - комплекс цинка с ферментативным гидролизатом мяса мидий

АИ - анафилактический индекс

АОА - антиоксидантная активность

БАД - биологически активная добавка к пище

ГПО - глутатионпероксидаза

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный

НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстаовленный

ОВА - овальбумин

ОВР - общевиварный рацион

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПЭГ-4000 - полиэтиленгликоль 4000

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФГБКМ - ферментативный гидролизат белка коровьего молока ФГПБ - ферментативный гидролизат пищевых белков ФММ - ферментативный гидролизат мяса мидий

ФСГТД - ферментативный гидролизат селенсодержащих пищевых дрожжей

ЩФ - щелочная фосфатаза

ЭМ - эссенциальные микроэлементы

ВВЕДЕНИЕ

Важнейшим в теоретическом и практическом отношении является положение концепции оптимального (здорового) питания о необходимости адекватного снабжения организма макро- и микронутриентами, в том числе ЭМ [69]. Глобальная проблема недостаточной микронутриентной обеспеченности населения различных регионов определяет необходимость научного обоснования, разработки и комплексной медико-биологической оценки безопасности и эффективности использования в питании новых пищевых источников ЭМ, в первую очередь, получаемых с помощью инновационных биотехнологических подходов. С общебиологических позиций, учитывающих эволюционный фактор, очевидна целесообразность использования в питании человека органических форм микроэлементов [43]. Пищевые источники этих микроэлементов, жизненно необходимых организму человека, должны отвечать требованиям безопасного использования в питании и высокой эффективности для восполнения микроэлементной недостаточности. Это положение относится в частности к цинку и селену - ЭМ, обладающим выраженным антиоксидантным и иммуномодулирующим действием [14,18,120,156,195]. Селен используется в составе БАД, специализированных пищевых продуктах диетического (лечебного и профилактического) питания и продуктах для питания детей раннего возраста [165]. Сфера применения органических и неорганических форм цинка в оздоровительном питании еще шире: этот микроэлемент может быть использован при обогащении продуктов массового потребления [36,58]. Специалистами разработано и осуществлено биотехнологическое получение новых пищевых органических форм селена и цинка, проведена в эксперименте оценка их острой токсичности [10,30,45]. Однако, крайне недостаточно исследовано влияние этих новых пищевых источников селена и цинка на состояние барьера ЖКТ, обеспечивающего защиту внутренней среды организма от потенциально возможного избыточного проникновения чужеродных антигенов, токсинов микрофлоры, вирусов и

микроорганизмов [16,41,42]. Барьерная функция, как известно, реализуется за счет совокупного действия составляющих её компонентов: пищеварительно-транспортного конвейера ЖКТ (желудочно-кишечной моторики, секреции пищеварительных соков, полостного и пристеночного пищеварения), активности ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани и, самым существенным образом, эпителиального слоя слизистых оболочек [50]. Повышенное поступление белковых макромолекул во внутреннюю среду организма свидетельствует о нарушенной целостности барьера ЖКТ, в первую очередь, эпителия тонкой кишки как зоны преимущественного всасывания нутриентов.

Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилась экспериментальная оценка биодоступности органических форм селена и цинка и их влияния на состояние слизистой оболочки тонкой кишки лабораторных животных (крыс).

Научная новизна

Впервые установлено, что проницаемость барьера ЖКТ лабораторных животных (растущих крыс) относительно модельного антигена - овальбумина не нарушается (не возрастает) при десятикратном превышении в корме адекватного содержания селена в органической форме - ферментолизате селенсодержащих пищевых дрожжей.

С использованием морфологических методов исследования показано, что как адекватное, так и десятикратно повышенное поступление с рационом селена в органической форме (ферментолизат селенсодержащих пищевых дрожжей) препятствует развитию неблагоприятных изменений в слизистой оболочке тонкой кишки, отмечаемых у крыс, потреблявших селендефицитный рацион.

Показано, что обогащение общевиварного рациона крыс ферментолизатом селенсодержащих пищевых дрожжей (дополнительно 5 мкг

селена на крысу в сутки) не приводит к усилению тяжести реакции системной анафилаксии и степени сенсибилизации.

Впервые установлено, что потребление крысами цинка в форме комплекса с ферментолизатом мяса мидий снижает у этих животных проницаемость защитного барьера ЖКТ, характеризуемую всасыванием модельного антигена - овальбумина.

Практическая значимость работы

Установленная экспериментально в опытах in vivo высокая биодоступность и безопасность органических форм селена и цинка определяют перспективность их дальнейшей клинической апробации для использования в широком спектре продуктов оздоровительного действия, в том числе БАД к пище и специализированных пищевых продуктов, предназначенных для восполнения микроэлементной недостаточности. Экспериментально доказанное для ферментолизата селенсодержащих пищевых дрожжей отсутствие неблагоприятного воздействия на состояние защитного барьера ЖКТ, а также сенсибилизацию и тяжесть анафилактических проявлений у лабораторных животных является дополнительным обоснованием безопасности его использования в составе БАД к пище и специализированных пищевых продуктов. Предложена комплексная экспериментальная оценка эффективности и безопасности использования в питании органических форм пищевых источников селена, включающая не только характеристику биодоступности, восполнения микроэлементной недостаточности, но и влияния на состояние защитного барьера ЖКТ и на анафилактическую чувствительность, которая может быть использована для аналогичной комплексной оценки новых пищевых источников других эссенциальных микроэлементов.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы были представлены и обсуждены на X Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 1-3 декабря 2008 г., на III съезде общероссийского союза общественных объединений «Российское общество медицинской элементологии», Москва, 11-13 мая 2012 г.

Внедрение результатов в практику

Материалы данной диссертации использованы в специализированном курсе лекций «Биохимия эссенциальных микроэлементов» ФГБУ «НИИ питания» РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ, и 1 публикация в сборнике Материалов X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 1-3 декабря 2008 г.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов. Указатель литературы содержит 71 российский и 124 зарубежных источника. Объем работы составляет 121 страницу машинописного текста, содержит 5 рисунков, 2 фотографии, 1 схему и 17 таблиц.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «НИИ питания» РАМН по темам №069 «Экспериментально-клиническая оценка биодоступности новых источников органических соединений некоторых эссенциальных микроэлементов (цинк, селен, йод, медь, марганец)» и №080 «Разработка системы лабораторных тестов для выявления дифференциальной диагностики пищевой аллергии».

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Питание является одним из важнейших факторов, опосредующих связь человека с внешней средой и оказывающих решающее влияние на здоровье, работоспособность и устойчивость организма к воздействию неблагоприятных факторов производства и среды обитания. Оптимальное питание человека - это система питания, обеспечивающая здорового человека необходимым количеством энергии и набором пищевых веществ как в виде натуральных продуктов питания, так и обогащенных продуктов и биологически активных минорных веществ с учетом возраста, пола и образа жизни. Адекватная обеспеченность микро- и макронутриентами является важнейшим фактором, обеспечивающим здоровье человека. Концепция оптимального питания констатирует, что, к сожалению, у современного человека имеет место недостаточное поступление с пищей микронутриентов и минорных компонентов пищи вследствие снижения энерготрат и, соответственно, уменьшения общего количества потребляемой пищи [68]. Анализ фактического питания населения Российской Федерации и соответствующие зарубежные исследования свидетельствуют о том, что недостаточная микронутриентная, в том числе микроэлементная, обеспеченность населения представляет проблему глобального масштаба [106-108,158]. Реалии современной жизни таковы, что в традиционных пищевых продуктах как растительного, так и животного происхождения содержание микронутриентов (витаминов и минеральных веществ), а также минорных биологически активных компонентов пищи, имеет тенденцию к снижению вследствие использования новых интенсивных технологий в сельском хозяйстве и современных способов переработки пищевой продукции [1,68,78]. Такое положение определяет актуальность широкого обогащения пищевых продуктов массового потребления и специализированных продуктов микронутриентами. Представляется перспективным использование биотехнологического подхода для получения в широких масштабах новых пищевых источников органических форм ЭМ,

оценке эффективности и безопасности которых в питании должно быть уделено особое внимание. Соответственно, исследование влияния новых пищевых источников микроэлементов на состояние кишечного барьера, характеризуемое состоянием эпителия тонкой кишки и всасыванием макромолекул в ЖКТ лабораторных животных, является дополнительной оценкой безопасности использования их в питании.

Ниже представлен краткий обзор научных публикаций, связанных с оценкой биологических свойств селена, цинка и новыми пищевыми источниками органических форм этих ЭМ. Заключительный раздел обзора посвящен анализу экспериментальных исследований влияния селена и цинка на барьерную функцию ЖКТ, обеспечивающую защиту внутренней среды организма от чужеродных антигенов.

1.1. Краткая характеристика биологического действия цинка и селена 1.1.1. Селен

Селен относится к группе ЭМ антиоксидантного действия, в которую также входят цинк, медь и мар�