Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние селена на рост и развитие микромицетов-продуцентов биологически активных веществ

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ильин, Дмитрий Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Микроэлементы как составляющая часть минерального питания микромицетов

1.2. Роль и место селена в объектах биосферы.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

III. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ СОЕДИНЕНИЙ СЕЛЕНА НА РОСТ И РАЗВИТИЕ НЕКОТОРЫХ

МИКРОМИЦЕТОВ.

3.1. Культурально - морфологические признаки культур продуцентов биологически активных веществ

3.2. Влияние соединений селена на культурально -морфологические особенности мицелиальных культур

3.3. Влияние соединений селена на морфологию мицелия продуцентов антибиотиков

3.4. Влияние различных концентраций соединений селена на скорость и динамику роста мицелиальных культур на агаризованных питательных средах

3.5. Влияние соединений селена на степень накопления биомассы в глубинной культуре

3.6. Влияние соединений селена на интенсивность и динамику споруляции микромицетов

IV-ВОЗДЕЙСТВИЕ НЕКОТОРЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ СОЕДИНЕНИЙ СЕЛЕНА НА БИОСИНТЕТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРОМИЦЕТОВ-ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ.

4.1. Воздействие различных концентраций соединений селена на степень биосинтеза вторичных метаболитов у микроми-цетов - продуцентов антибиотиков

4.2. Аспекты влияния соединения селена на уровень биосинтеза культуры Acremonium chrysogenum при различных способах внесения вещества

4.3. Влияние соединения селена на уровень биосинтеза культуры Fusidium coccineum при различных способах внесения вещества

4.4. Влияние соединения селена на уровень биосинтеза культуры Penicillium chrysogenum при различных способах внесения вещества

4.5. Влияние соединения селена на уровень биосинтеза культуры Penicillium nigricans при различных способах внесения вещества.

IV. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ВОЗДЕЙСТВИЯ СОЕДИНЕНИЯ СЕЛЕНА НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРОМИЦЕТОВИ АКТИНОМИЦЕТОВ

5.1. Культурально - морфологические свойства культур актиномицетов - объектов исследований

5.2. Анализ влияния соединения селена на культурально -морфологические и физиологические признаки актиномицетов

5.3. Сравнительный анализ влияния соединения селена на биосинтетическую активность микромицетов и актиномицетов

VI. ВОЗМОЖНОСТИ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СЕЛЕНАТА НАТРИЯ В ПРОЦЕССАХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА.

6.1. Возможность использования селеновых добавок с целью увеличения выхода биомассы мицелия на примере культуры Trichoderma viride

6.2. Возможность использования селеновых добавок с целью увеличения выхода целевого продукта различными способами на примере культуры Penicillium nigricans

6.3. Возможность использования селеновых добавок в процессе микробиологического синтеза с целью упрощения выделения целевого продукта на примере Streptomyces flavochromogenes

6.4. Возможность применения селеновых добавок с целью нивелирования последствий воздействия некоторых стрессовых факторов в процессе микробиологического синтеза

6.4.1. Возможность использования селената натрия в целях расширения диапазона температур культивирования мицелия микромицетов

6.4.2. Использование селена при длительном хранении культур продуцентов антибиотиков на агаризованных питательных средах

6.4.3. Применение селеновых добавок как адаптогенов при культивировании продуцентов на средах с компонентами, не соответствующими требованиям на примере Acremonium chrysogenum и Fusidium coccineum.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние селена на рост и развитие микромицетов-продуцентов биологически активных веществ"

Проблема роли микроэлементов в жизнедеятельности живых организмов в широком смысле, и, в частности микро- и макромицетов занимает на современном этапе одно из центральных мест в прикладной экологии. Содержание микроэлементов в питательных средах и их количественные пропорции во многом определяют темпы развития и характер метаболизма микроорганизмов. В связи с неблагополучным состоянием окружающей среды, вызванным разного рода факторами (повышенная техногенная нагрузка, химизация сельского хозяйства, нерациональное использование природных ресурсов и др.) нередко имеет место дисбаланс или дефицит некоторых микроэлементов. Так, сложившийся в последнее время дефицит селена на разных уровнях экосистем объясняется разрушением гумусового слоя почв, а также их прогрессирующим закислением. Имеется достаточно сведений о роли большинства необходимых элементов в процессах жизнедеятельности микроорганизмов, однако в плане изучения роли селена информация ограничена. Давно установлен факт активной биоабсорбции селена из почв макромицетами (Ермаков, Ковальский, 1974). Имеются сообщения относительно роли селена в обменных процессах высших базидиальных грибов (Денисова, Иванов и др., 1999). Есть сведения о способности дрожжей и некоторых других микромицетов к накоплению селена в значительной степени в зависимости от состава среды, на которой они культивируются. Биологический смысл явления биоабсорбции может заключаться в необходимости защиты клеточных мембран от продуктов ПОЛ (перекисного окисления липидов). Селен как признанный ангиоксидант может обеспечивать некоторую степень необходимой защиты. Потребность микромицетов в такой защите объясняется высокой скоростью роста и выраженной интенсивностью обменных процессов. Особый интерес представляют возможности использования соединений селена в низких концентрациях в процессах культивирования микромицетов - продуцентов биологически активных веществ. Согласно нашим предположениям обеспечение оптимальными концентрациями этого элемента культивируемых культур продуцентов позволит замедлить процесс старения культуры, нивелировать воздействие стресс - факторов по ходу культивирования и ферментации благодаря антиоксидантным свойствам биомолекулы, содержащей селен. В связи с этим особое значение приобретают эксперименты, посвященные изучению влияния соединений селена на рост и развитие мицелиальных культур грибов — продуцентов антибиотиков, а актуальность такого рода исследований не вызывает сомнений.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния соединений селена на параметры роста и обменные процессы грибов-микромицетов, в том числе - продуцентов антибиотиков в условиях лабораторного культивирования.

В ходе исследований были поставлены следующие задачи:

- выявить концентрации соединений селена, оптимальные для роста и интенсификации обменных процессов культур продуцентов;

- изучить морфологические и физиологические характеристики исследуемых культур и проследить воздействие на эти аспекты соединений селена в динамике культивирования;

- определить степень воздействия изучаемого вещества на накопление биомассы, сроки ферментации антибиотика и ее интенсивность;

- рассмотреть возможность применения ультранизких концентраций селенсодержащих веществ в условиях промышленного культивирования продуцентов как стабилизаторов процессов ферментации (с учетом состава питательной среды). 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1Л. Микроэлементы как составляющая часть минерального питания микромицетов

Учение о микроэлементах, внесшее переворот в наши представления о питании живых организмов, имеет довольно сложную и интересную историю. Родоначальником исследований по микроэлементам следует считать французского ученого Ролена, обнаружившего исключительно большой эффект от внесения ничтожных концентраций цинковых солей в питательную среду Aspergillus niger (Raulin, 1870). Им же было обнаружено положительное влияние марганца на рост плесневых грибов. Ролен предполагал, что цинк и другие элементы являются не просто стимуляторами роста, но и являются необходимым его условием. Вслед за исследованиями Ролена опубликована работа К.А. Тимирязева (1872), где автор показал значение цинка для развития растений.

Бертрану и Жавилье (Bertrand, Javillier, 1911) удалось получить, применив очень чистые, свободные от марганца питательные растворы, доказательства необходимости марганца для развития Aspergillus niger. В такой среде гриб не давал конидий.

В 1914 году появилась книга Брэнчли под названием «Растительные яды и стимуляторы», в которой были подведены итоги работ, посвященных воздействию марганца, меди, цинка и мышьяка на растительные организмы. Брэнчли разделил микроэлементы на две группы: яды, которые при высоких разведениях становятся индифферентными, и яды, которые при достаточно малых количествах вызывают малое, но вполне явственное усиление роста.

Появившиеся чуть позже работы В.И.Вернадского (1919,1922) доказали, что между средой и организмами постоянно происходит обмен веществом. Эти идеи укрепили представления о микроэлементах как необходимых элементах питания. 7

Более глубокие исследования в отношении физиологии и биохимии микромицетов начались в 1940-1950-е годы, когда было открыто, что некоторые плесени обладают антибиотическими свойствами, а другие могут служить источником ряда органических соединений. Пик сообщений о физиологии питания грибов, и в частности о пропорциях минеральных веществ в питании пришелся на середину нашего века.

Известно, что к важнейшим факторам, определяющим активность гетеротрофных организмов, относят создание оптимальных условий температуры, влажности, света и, прежде всего, наличие в среде всех элементов питания. Для полноценного питания грибов нужны, прежде всего, углеродсодержащие соединения, так как они являются поставщиками клеточного строительного материала - углерода и «топливным материалом», высвобождая при окислении необходимую энергию. Для микроскопических грибов органические углеродсодержащие соединения являются единственным источником энергии, поэтому их количество в питательной среде является потенциалопределяющим для роста этих организмов (Курсанов,1940; Шиврина, 1965). Не менее важными для грибов являются азотсодержащие соединения, так как они служат для них единственным поставщиком азота - строительного материала белков, играющих важнейшую роль в обменных процессах (Горленко,1983). Грибы не в состоянии связывать атмосферный азот, а могут принимать его только в форме неорганических солей или органических азотных соединений (Morton, Мс Millan, 1954). Кроме источников углерода и азота, все аспекты значимости которых в питании грибов широко и всесторонне освещены в многочисленных литературных источниках (Гарибова, 1963; Маслова,1969; Бухало, 1972), грибам необходимы многочисленные минеральные элементы.

По сведениям З.Э.Беккер, для основного обмена микромицетам необходимы приблизительно 17 - 18 элементов, в число которых входят кроме азота, углерода, кислорода, водорода также сера, фосфор, калий, 8 железо, медь, цинк, марганец, молибден, кальций. Возможно, требуются кобальт, галлий, бор, скандий, ванадий (Беккер, 1936; Беккер, 1988).

Методы изучения потребностей грибов в минеральных компонентах специально разработаны рядом авторов (Steinberg, 1939; Lilly, 1965). Классический метод, разработанный Р. Стейнбергом (Steinberg, 1939), состоит в испытании на синтетической среде, очищенной от следов минеральных компонентов с точной их дозировкой. Учет потребности в них производится в основном по интенсивности роста организма. Функциональный метод состоит в определении элементов, необходимых для функционирования определенных энзимов. Исследуется способность этих элементов образовывать комплексы с энзиматическими белками. Например, при использовании метода парамагнитной электронно-резонансной спектроскопии (Nicolas et al., 1962) изучалось образование белковых комплексов у микроорганизмов с железом, марганцем, молибденом и медью.

В работах с минеральными компонентами рекомендуется учитывать два момента (Беккер, 1988). Во-первых, возможность биологического замещения одного компонента другим. В отличие от полного, частичное замещение отмечается довольно часто. По причине такого явления можно не выявить потребность в элементе, если в среде содержится его заместитель. В качестве примера в литературе приводятся случаи замены цинка при синтезе аминокислот кадмием и калия натрием у Aspergillus niger (Bertran, De Wolf, 1960). Bo - вторых, возможность антагонизма ионов. Концентрация необходимого иона может зависеть от концентрации другого иона.

По требуемым количествам элементы питания делят на макроэлементы и микроэлементы. После азота, углерода, водорода и кислорода наиболее важные макроэлементы - фосфор и сера. Они участвуют почти во всех биохимических реакциях в живых организмах, как энергодающие системы или акцепторы в процессах биосинтеза (при конденсации, циклизации, окислении, восстановлении и других процессах, являясь компонентами 9 коферментов). Велико значение и ряда других элементов: калия, магния и т.д. Минеральные вещества усваиваются грибами в виде солей (Stoller,1954).

Сера, как составная часть аминокислот и витаминов - тиамина и биотина, а также кофермента А необходима для грибов. Она усваивается в виде неогранических сульфатов. Соединения серы стимулируют протеолитическую активность. Сера является составной частью белков в виде серосодержащих аминокислот - цистеина и метионина. Она обеспечивает конформацию или пространственную конфигурацию ферментных белков, связывая части полипептидных цепей -S-S- мостиками. Есть сведения, что сера обладает активным стимулирующим действием на рост и споруляцию грибов (Негруцкий,1990). В микроскопических грибах сера содержится в подавляющем большинстве случаев в восстановленной форме как производное сероводорода, но источником ее могут служить только окисленные соединения, далее восстанавливаемые грибами. Сульфиды металлов, как правило, непригодны для питания микромицетов. По Волконскому (ФостерД950) те немногие микромицеты, которые способны к усвоению сульфидов (Ceratostomella multiannulata, сапролегнии), относятся к паратиотрофам, а усваивающие сульфаты - к эутиотрофам. Потребность грибов в сере измеряется в сотых или тысячных долях процента, ее количество в клетках меняется в зависимости от ее концентрации в среде и от концентрации азота (так как она входит в состав белков) и может колебаться от 0,1 до 0,5 % от массы сухого мицелия.

Фосфор принимает участие в углеводном обмене, а именно в процессах фосфорилирования при дыхании и брожении (Беккер,1988; Дворнина,1980). Усвоение фосфатов необходимо для процессов синтеза витаминов: тиамина, рибофлавина и никотиновой кислоты. Недостаток фосфора может вызвать нарушения в процессах обмена и, в первую очередь, утилизации глюкозы. В организме грибов фосфор может переходить в так называемые макроэнергетические соединения, являющиеся источниками большого

10 количества потенциальной энергии. В виде ортофосфорной кислоты фосфор входит в нуклеопротеиды, функцией которых является передача наследственных свойств и синтез белков (Мюллер, Лефлер, 1994). Накопление нуклеотидов в мицелии микромицетов соответствует преобладающему у данного вида или в данной фазе развития обмену. Например, в молодом мицелии Penicillium chrysogenum обильно содержатся молекулы АТФ (Белозерский, Кулаев,1964). Фосфат также является обязательной составной частью большинства кофакторов окислительных, восстановительных, гидролитических и декарбоксилирующих коферментов, например, НАД и НАДФ. Содержание фосфора в грибах меняется в зависимости от возраста: в спорах и молодом мицелии его всегда больше, чем в старом. Например, у Aspergillus niger на третий день культивирования его содержится 12,7 мкг на 1мг массы сухого мицелия, а на девятый день -2,4 мкг/кг (Lilly, 1965).

Роль калия менее выяснена. Установлено, что дефицит калия вызывает торможение углеводного обмена. При недостатке калия у Aspergillus niger образуется много щавелевой кислоты, то есть происходит неполное окисление и мицелий интенсивно выделяет аммиак вследствие угнетения синтеза белков (Лилли, Барнет,1953). Калий частично может быть заменен натрием и бериллием. Количество калия, необходимого для грибов, колеблется от 40 до 150 мг/л питательной среды. Калий непосредственно не участвует (Rothstein,1965) в реакциях метаболизма, его роль состоит в конструировании механизма обмена с внешней средой и в поддержании нормальных для обмена физико-химических условий гН, рН, баланса ионов в клетке.

Магний представляет собой элемент, крайне необходимый для процессов окисления. Потребность в нем для микромицетов близка к потребности в сере, что является обоснованием для применения его в питательных средах в виде MgS04. Aspergillus niger требуется для

11 оптимального роста 20 мг/л магния (Беккер,1988). Стойких органических соединений в мицелии грибов этот элемент не образует. Оптимальная концентрация магния для роста грибов связана с оптимальными концентрациями фосфора следующим образом: на каждый ион магния необходимы 36 ионов фосфора. Вероятно, это связано с ролью магния в активизации некоторых ферментов, участвующих в процессах брожения и дыхания. Магний способен нейтрализовать действие ряда ядов, например, сулемы и борной кислоты, образующихся вследствие антагонизма ионов (Лилли, Барнет,1953).

Кальций содержится в золе микромицетов в большом количестве. В отсутствие его урожай мицелия микроскопических грибов резко снижается. Оптимальная для роста доза кальция находится в пределах от 50 до 500 мкМ на 1 г сухого мицелия (Беккер,1988).

Микроэлементы или следовые элементы необходимы грибам для обмена в очень незначительных количествах: от 0,3 до 0,02 и менее мг/л. К ним относятся железо, цинк, медь, марганец, молибден, кобальт, бор и некоторые другие (галлий, скандий, ванадий) (Беккер,1988). Они либо входят в состав ферментов, либо способны модулировать их деятельность. Факты наличия стимуляции образования и роста мицелия при определенных концентрациях цинка, железа, марганца, меди известны давно (Lindenberg,1944; Perliman,1949). Для изучения потребности в микроэлементах у микроскопических грибов большую роль сыграли работы Р.Стайнберга, исследовавшего ее на модели Aspergillus niger (Steinberg, 193 9). Б. Столлер, исходя из роли различных микроэлементов в физиологии грибов предложил вводить в состав синтетических питательных сред следующие девять элементов: марганец, железо, алюминий, хром, цинк, бор, бром, йод (Столлер, 1956). Он провел опыты по выявлению токсичности каждого элемента при двух крайних концентрациях, однако существенного влияния на рост грибов не обнаружил.

12

В частности, железо - микроэлемент, требующийся грибам в наибольшем количестве (0,001%), его рекомендовано добавлять в среду Чапека. Грибами железо усваивается в форме растворов неорганических солей и входит в состав ряда важных окислительных ферментов со структурой порфиринов, особенно участвующих в дыхательной цепи и цикле Кребса (Диксон, Уэбб, 1982). В качестве кофактора железо входит в ферменты каталазу, пероксидазу и др. Механизм участия железа в окислительных реакциях представляется "сбросом" электрона с двухвалентного железа, который сопровождается выделением энергии. До 80% железа содержится в клетках в форме неорганических комплексов с фосфорной кислотой (Кулаев,1975). Обнаружено, что физиологическое действие металлов часто резко возрастает при их сочетании. Эффект действия на грибы железа сильно увеличивается в присутствии цинка. Возможно, это связано с последовательным участием обоих элементов в ферментах дыхательной цепи. Необходимость цинка показана для многих видов грибов, основная его роль - функция кофактора дегидрогеназ. Еще в 1869 году Ролен доказал необходимость цинка для Aspergillus niger (Raulin, 1870). При недостатке цинка окисление субстрата идет не полностью и в среде появляется много побочных продуктов обмена, например, органических кислот. В присутствии цинка их образование подавляется (Диксон, Уэбб, 1982). В опытах Стейнберга сухой вес A. niger (Steinberg, 1939) в отсутствие цинка уменьшался почти в 2000 раз. Бертран и Вольф показали, что цинк необходим для деятельности глюкозо - 6 -фосфатдегидрогеназы и 6 - фосфоглюконатдегидрогеназы Aspergillus niger (Bertran, De Wolf, 1960). Некоторые исследователи предполагают участие цинка в синтезе нуклеотидов. На это указывает увеличение свободных нуклеотидов в культуре Rhizopus nigricans. Цинк влияет на образование некоторых токсинов, например токсина уровской болезни и других соединений стероидной структуры (Беккер,1963). Этот микроэлемент

13 способствует также образованию многих пигментов, например, меланина у Macrosporium и хризогенина у Penici Ilium chrysogenum.

Медь имеет более ограниченное значение, чем железо и цинк, однако и она принадлежит к числу необходимых для грибов: потребность в меди доказана для Rhizopus nigricans, Aspergillus niger, A. flay is, Fusarium oxysporium и многих других микромицетов. Этот микроэлемент влияет на спорообразование и пигментацию спор. По этому признаку можно обнаружить концентрации меди в среде порядка 0,05 мкг/50 мл.

Марганец нужен грибам в очень ограниченном количестве. Марганец является кофактором главным образом ферментов, участвующих в трансформировании органических кислот цикла Кребса. Некоторую роль играет марганец и в азотном обмене, активируя аргиназу дрожжей и входя в состав гидроксиламинредуктазы у плесневых грибов (Диксон, Уэбб, 1982).

Хлор требуется грибам в основном для синтеза хлорсодержащих антибиотиков: гризеофульвина (Penicilhmi nigricans), геодина (Aspergillus terreus), хлорсодержащего метаболита калдариомицина (Caldariomyces fumago), нидулина (A. nidulans), налгиолаксина (Penicillium nalgiovensis) (Миллер, 1961).

Выраженная потребность грибов в кобальте пока недостаточно подтверждена, в связи с тем, что очистить среду до уровня, выявляющего его дефицит, пока не удавалось. Предполагается, что малые количества кобальта нужны микромицетам для синтеза ДНК ядер, имеющих у грибов очень малые размеры (Беккер,1988). Геохимически кобальт тесно связан с никелем. Никель оказывает существенное неспецифическое воздействие на целый ряд металло-ферментных комплексов. Выявлено, что он активизирует аргиназу, а также способен только в ограниченной степени заменять кобальт и марганец в этом ферменте.

Молибден требуется грибам в наименьшем количестве. Обнаружено, что молибден участвует в восстановлении нитрата в нитрит. Дефицит

14 молибдена у грибов наблюдается редко, однако он возможен в условиях избытка конкурирующей с этим элементом меди.

В определенных условиях у грибов возникает потребность еще в нескольких элементах. Так, в количестве 0,02 мг/л галлий способен стимулировать рост Aspergillus niger. При росте на глицериновой среде для грибов этого вида также оказывается необходимым скандий (Беккер, 1988). Бор, по некоторым сведениям, также способен активизировать рост и развитие грибов (Steinberg, 1939). Бертран (Bertrand, 1941) показал важность ванадия для Aspergillus niger. Спорообразование у Penicillium протекает даже более эффективно при частичной замене кальция стронцием (Basu,1956).

В отношении селена многочисленные литературные данные свидетельствуют о непосредственном активном участии самого микроэлемента в биохимических и физиологических процессах (Решетникова, 1997). В ряде источников на соединения селена - селенаты указывают как на антиметаболиты (Birkett,Rowlands,1981). Однако известно, что одним из компонентов белка микроорганизмов является селенометионин (Tuve,Williams,1961). Из дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans были выделены селеноаминокислоты: селенометионин и селеноцистин. Микроскопическими грибами синтезируются селенорганические соединения. Так Aspergillus niger и Scopulariopsis brevicaulis, росшие в присутствии селенита, синтезировали диметил - селенид, в опытах Ковальского (1965) бактерии, грибы и актиномицеты при культивировании в жидкой среде Чапека с добавлением селенита натрия синтезировали селеноэфиры и диалкилселениды. Отмечается влияние селена на синтез серусодержащих биомолекул, которые, в свою очередь, стимулирующе действуют на рост и споруляцию грибов (Негруцкий,1990). Есть сведения, что селен служит для почвенных гифомицетов активатором ферментных систем (Мехтиева, Рабкрин, 1981).

15

Существуют микроэлементы, которые сами по себе не являются необходимыми для микромицетов, но влияют на усвоение других и могут частично заменять их или изменять направление обмена, а также нарушать баланс обменных процессов. На фоне избытка необходимых микроэлементов они не влияют на рост, развитие и обмен, но при недостаточном микроэлементном питании могут влиять очень сильно. Такие процессы наблюдаются как в случае естественного их недостатка в природе, так и при дефиците, создаваемом действием многих химических факторов.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Ильин, Дмитрий Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Селен, как ультрамикроэлемент, оказывает сильное воздействие на процессы жизнедеятельности микромицетов - продуцентов антибиотиков и биологически активных веществ. Высокие (10° - 10"1 г/л) концентрации селена в питательной среде ингибируют рост мицелиальных культур, а

4 7 ультранизкие концентрации (10" - 10" г/л) оказывают стимулирующее воздействие.

2. Микроструктура мицелия практически всех изученных видов микромицетов, культивируемых на питательных средах при концентрации селена в 10"5 - 10"6 г/л, отличается от контрольных образцов на поздних сроках роста плотной сетью гиф с ярко выраженной базофилией протоплазмы. В ряде случаев вакуолизация и образование зерен волютина запаздывают по сравнению с контролем. Это в совокупности указывает на задержку старения культуры.

3. Выявлено стимулирующее воздействие низких концентраций селената натрия на скорость роста мицелия всех изученных видов микромицетов, причем наибольший стимулирующий эффект для большинства из них достигается при содержании вещества 10"4 г/л питательной среды. Исключение составляет P. nigricans, скорость роста мицелия которого наиболее значительно возрастает при концентрации селената натрия 10"6 г/л среды.

4. При внесении селената натрия в питательную среду отмечаются более ранние сроки прорастания мицелия всех изученных видов микромицетов (на 1-2 сутки роста) и интенсивный рост мицелиальных культур на протяжении всего процесса культивирования (до 12 и более суток роста).

106

5. Высокие концентрации селената натрия негативно влияют на накопление биомассы у всех изученных видов микромицетов. Однако раствор селената натрия в низких концентрациях порядка 10 "4 -10 "6 г/л стимулирует накопление биомассы микромицетов.

6. Соединение селена оказывает заметное влияние на характер спороношения всех изученных видов микромицетов. Высокие концентрации селена в питательной среде (lO'V/л) ведут к угнетению спорогенеза,

2 3 концентрации на уровне 10" -10" г/л приводят к усилению спороношения, а концентрации 10"4 - 10"6г/л влекут ослабление этого процесса в сравнении с контрольными вариантами.

7. Добавление в среду для ферментации высоких концентраций селената натрия (10"1" 10"3г/л) заметно сокращает, а низких (10"4 -10"7 г/л) -повышает выход метаболических продуктов.

8. Внесение селена в среду на ранних стадиях культивирования (в период роста моноспоровой культуры) негативно влияет на последующий процесс биосинтеза. Это подтверждает предположения о перестройке в результате внесения селена физиологии продуцентов в сторону продления вегетативной фазы и о возникновении сдвига сроков перехода к вторичному метаболизму с возможными изменениями его параметров.

9. Диапазон концентраций, обусловивших позитивную отзывчивость на селен прокариотических организмов, оказался более широким. Мицелиальные культуры актиномицетов позитивно реагируют на внесение

Q / селеновых добавок в диапазоне концентраций от 10" г/л до 10' г/л (что выразилось в стимуляции развития культуры и усилении биосинтетической активности). У актиномицетов позитивную роль для процесса ферментации играет внесение вещества на любом из этапов культивирования. Концентрация вещества 1 г/л питательной среды или 10° г/л губительно влияет на рост и развитие мицелия актиномицетов.

107

10. Внесение соединения селена в концентрации 1 «Ю"6 г/л помимо общего позитивного воздействия на физиологические процессы продуцента гелиомицина Streptomyces flavochromogenes обуславливает явление активной агрегации кристаллов.

12. Селенат натрия в целом нивелирует ряд стрессовых факторов в ходе культивирования. В связи с этим, следует рекомендовать введение неорганических соединений селена в низких концентрациях (10"5 - 10 "6 г/л) в рецептуру питательных сред.

108

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью настоящей работы явилось изучение аспектов воздействия микроэлемента селена на некоторые процессы жизнедеятельности микромицетов. Опираясь на данные, полученные в отношении макромицетов (Иванов, Денисова и др., 1998; Денисова, 1999), мы предположили обнаружение позитивного воздействия селена на рост и развитие микроскопических грибов, используемых в микробиологическом синтезе в качестве продуцентов биологически активных веществ, в том числе антибиотиков. Интерес представляли последствия воздействия соединений селена как на морфологические структуры микромицетов, так и на их физиологические процессы.

Полученные результаты, в целом, свидетельствуют о том, что микроэлемент селен активно включается в обменные процессы продуцентов. На это указывают заметные изменения в морфологии, в процессах роста и развития, в ходе ферментации вторичных метаболитов при внесении вещества в питательные субстраты. Прежде всего, следует отметить, что селен, являясь токсичным элементом, при содержании в сравнительно высоких концентрациях в питательной среде, делает ее полностью непригодной для культивирования микроорганизмов. Такими являются концентрации на уровне от 10"1 г/л и выше. Селен, относимый к разряду «ультрамикроэлементов», позитивно влияет на организмы в пределах концентраций 10"4 - 10"7 г/л питательной среды. Мы доказали это на примере микромицетов - продуцентов антибиотиков (Penicillium chrysogenum, P. nigricans, Fusidium coccineum, Acremonium chrysogenum) и биологически активных веществ (Trichoderma viride). Такие концентрации обусловили достоверное увеличение средних скоростей роста мицелия на агаризованной питательной среде (на 30 - 121%). Увеличение интенсивности роста, вероятно, объясняется тем, что внесение вещества активизировало

101 селенсодержащие антиоксидантные ферменты, которые предотвращают нарастание ПОЛ и отравление организма продуктами собственного метаболизма, интенсивно накапливающимися в процессе роста и развития. Будучи быстрорастущими организмами, грибы теоретически должны страдать от негативного воздействия свободных радикалов, накапливающихся вследствие интенсивного обмена веществ. Однако этого не происходит, возможно, благодаря именно селенсодержащим ферментам, обладающим выраженными антиоксидантными свойствами. Исходя из этого, можно предположить, что ультрамалые концентрации соединения селена в среде обеспечивают более комфортные условия для мицелия, нивелируя торможение роста продуктами обмена. В динамике роста мицелиальных культур под воздействием соединения селена также отмечаются некоторые изменения. Прежде всего, сроки прорастания инокулята, которые составляют для изученных видов микромицетов 3-5 сутки с момента посева, смещаются на более ранние (1-2 сутки). Селенсодержащие ферменты могут косвенно стимулировать энзимы группы протеаз, обеспечивающих прободение оболочек спор.

Интересные данные получены при изучении аспектов влияния соединения селена на микроморфологию мицелия. Известно, что мицелиальные культуры, культивируемые на лимитированной питательной среде, проходят ряд возрастных стадий. Первоначально микропрепарат мицелия представляет собой сеть гиф, обладающих хорошей базофилией. На более поздних стадиях по мере старения мицелия отмечается снижение базофилии, разрывы гиф, появление включений (зерна метахроматина и т.д.), вакуолизация и автолиз. Отмечаемые в опытах с оптимальными концентрациями селена изменения свидетельствуют в пользу сделанного нами предположения о роли этого элемента в физиологии грибов. Так, мицелий опытных вариантов даже на поздних стадиях роста на посевной питательной среде сохраняет ряд признаков молодого мицелия, взятого для

102 изучения в ранние сроки культивирования. Это выражается в сохранении хорошей базофилии протоплазмы, снижении вакуолизации, задержке автолитических процессов. В дальнейшем переход к последующим возрастным стадиям происходит у такого мицелия более синхронно. Эти явления, вероятно, есть результат воздействия селена - одного из факторов, способных путем включения в состав пероксидазных ферментов замедлять процессы старения культуры.

Выясненное позитивное воздействие селена на процессы накопления биомассы мицелия культур также логично объясняется с подобных позиций. Кроме того, может иметь место предположенное нами антистрессорное воздействие селенсодержащих биофакторов, которые сокращают адаптационную лаг-фазу и, тем самым, ослабляют последствия стресса мицелия, вызванного сменой среды. Вследствие этого, активное накопление биомассы может начинаться в более ранние сроки, происходить более активно благодаря оптимальным дозам селенсодержащего вещества в среде, что приводит, в конечном итоге, к увеличению выхода вегетативной массы.

При изучении воздействия селена на процессы спорогенеза микромицетов обнаружен ряд представляющих определенный интерес особенностей. Как выяснено, селенат натрия заметно влияет на процессы спороношения изученных видов, причем характер воздействия изменяется в зависимости от концентрации вещества в питательной среде. Концентрации в диапазоне порядка 10"3 г/л стимулируют, а 10"6 г/л - задерживают наступление спороношения. Спорогенез начинается на определенной стадии развития, после определенного периода культивирования, когда питательные вещества субстрата в основном исчерпаны. Лимитирование среды - один из факторов, определяющих спороношение, которое можно рассматривать, как стремление организма перейти к финальной части своего цикла развития. Мы предполагаем, что в силу своих свойств, возможно через активацию ферментных комплексов, селен делает элементы

103 лимитированной среды более доступными для мицелия. С этих позиций усиление и сокращение сроков начала споруляции на средах, содержащих более высокие концентрации солей селена, является ответом мицелиальных культур на создание неблагоприятных для них условий культивирования.

Внесение соли селена (10-4-10'6 г/л) в ферментационную среду позитивно сказалось на процессах биосинтеза всех изученных продуцентов. Однако добавление вещества в низких концентрациях на ранних стадиях культивирования, обусловившее стимуляцию роста на том этапе, в большинстве случаев негативно повлияло на последующий процесс ферментации. Видимо, имеет место перестройка физиологии продуцентов в сторону продления вегетативной фазы и сдвиг сроков перехода к вторичному метаболизму с некоторыми изменениями его параметров.

Прокариотические организмы - актиномицеты более позитивно (в среднем в два раза), чем микромицеты, реагируют на внесение соединения селена в питательный субстрат. Выяснилось, что для актиномицетов позитивную роль в процессе ферментации играет внесение вещества на любом этапе культивирования. Вероятно, объяснением этого эффекта является то, что у прокариот защита от перикисного окисления липидов практически целиком зависит от селенсодержащих белков, тогда как в эукариотических клетках микромицетов имеются дублирующие антиоксидантные системы (селен для них - важный, но не единственный фактор защиты).

Следует отметить также обусловленный внесением селена стереоселективный эффект, обеспечивающий синтез молекул продукта с одинаковой пространственной изомерией, и, как следствие этого, образование крупных кристаллов метаболита. Это может быть полезно в плане технологической обработки целевого продукта (сокращаются потери при фильтрации).

104

Наиболее важным в теоретическом и практическом плане, на наш взгляд, является адаптогенное или антистрессорное воздействие селена на организмы микромицетов. В прикладном аспекте это свойство находит применение в процессах хранения и культивирования мицелия: нивелирует последствия отравления собственными метаболитами, является протекторной защитой от ряда негативных стрессовых факторов (от спонтанной температурной флуктуации или наличия в средах переокисленных жиров). Активные формы кислорода (О2", Н20, ОН, 0*2), а также пероксиды и гидропероксиды биомолекул, накапливающиеся в организме в результате стресса любой природы, являются инициаторами деструктивных процессов перекисного окисления липидов, образующих основу клеточных мембран и мембран внутриклеточных органелл. Селенозависимые белки, например, глутатионпероксидаза участвуют в регулировании ПОЛ. Возможно, внесение селена в питательные среды обеспечивает некоторое легирование защитной системы и снижает значительную часть негативных последствий окислительной деструкции.

105

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ильин, Дмитрий Юрьевич, Москва

1. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микроэлементозы человека. М.: Медицина, 1991. - 496 с.

2. Бартошевич Ю.Э., Дмитриева С.В., Заславская П.Л. Спорогенез, биосинтез антибиотиков и систематическое положение Fusidium coccineum//Антибиотики. -1983.- № 7.- С. 483-485.

3. Бахарев В.Д., Бухарова М.А., Шостак В.И. О влиянии селена на световую чувствительность глаза // Физиологический журнал СССР.- 1975.- Т.61.-№1.-С. 150-152.

4. Беккер З.Э. Влияние внешних воздействий на плодоношение грибов // Успехи современной биологии. 1963. - № 3. - С. 491 - 508.

5. Беккер З.И. Физиология и биохимия грибов-М: Изд-во МГУ, 1988.-227с.

6. Белозерский А.Н., Кулаев И.С., Афанасьева Т.П. Изучение полифосфат -фосфогидролазы / /Физиология растений.- 1964, №5- С. 35-42.

7. Беляева Т.В. Оптимизация биосинтеза антибиотика фузидина с помощью комплекса генетических и физиологических методов: Дис. . канд. биол. наук.-М.,1984.- 169 с.

8. Блинохватов А.Ф. О селене, которого нам не хватает // Химия и жизнь. -1995,-Т. 23.-№3.- С. 40-45.

9. Блинохватов А.Ф., Иванов А.И., Вихрева В.А., Денисова Г.В., Ильин Д.Ю., Хрянин В.Н. Значение селена для объектов биосферы // Эколого -экономическое развитие России (анализ и перспективы). Альманах, поев. 10-летию РАЕН-М., 2000,-С. 145-152.

10. Ю.Бобко Е.В., Шенуренкова Н.П. О влиянии селенистой и селеновой кислот на развитие растений. // ДАН СССР.- 1945. Т. 46,-Вып. З.-С. 122-124.

11. Бухало А.С. Влияние различных источников углерода и азота в синтетических средах на рост базидиомицетов // Микология и фитопатология. 1972. - Т. 6.- Вып. 3. - С. 241 - 244:109

12. Вернадский В.И. Записка о необходимости организации химического изучения организма. В кн. Протоколы заседания физико-матем. отд. Укр. АН, Киев.-1918,-43 с.

13. Вернадский В.И. Химический состав живого вещества в связи с химией земной коры.-М., 1922,- 31 с.

14. Вернадский В.И. Химическое строение биосферы Земли и ее окружения. -М.: Наука, 1965.-374 с.

15. Виноградов А.П. Геохимия редких и рассеянных элементов в почвах. М.: Наука, 1957.-218 с.

16. Вощенко А.В., Иванов В.Н., Бондарев Г.И. Содержание селена в продуктах питания, рационах и сыворотке крови жителей эндемичного по болезни Кешана района.//Вопросы питания. 1989,- №1.-С. 65-66.

17. Гарибова JI.B. Физиология питания культурного шампиньона (Agaricus bisporus Lange) 1. Углеродное питание// Науч. докл. высшей школы Биолог, науки. 1963. - № 4. - С. 137 - 140.

18. Голубкина Н.А. Исследование роли лекарственных растений в формировании селенового статуса населения России Автореф. Дисс. . доктора с/х наук.-М., 1999.- 48 с.

19. Горленко Н.В. Грибы как источник пищевых белков //Микология и фитопатология.-1983.-17.-№3.- С. 177-181.

20. Дворнина А.А. Субстраты, технология их подготовки в промышленном шампиньоноводстве (обзорная информация) Кишинев, 1980.-101 с.

21. Денисова Г.В. Влияние неорганических соединений селена на рост и развитие базидиальных макромицетов: Дис. . канд. биол. наук.- М., 1999,- 130 с.

22. Денисова Г.В, Иванов А.И., Блинохватов А.Ф. Влияние неорганического соединения селена на рост и плодоношение грибов //Сб. науч. Конф. Спец. Сельского хоз ва - Пенза, 1997. - С. 84-85.110

23. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982.- 960 с.

24. Дорожкина А.Ф. Содержание селена в кормах Иссык -Кульской котловины // Роль микроэлементов и витаминов в кормлении животных.-Сб. Микроэлементы в животноводстве и растениеводстве.-Фрунзе: ИЛИМ.,1978.- Вып. 17.-С. 70 75.

25. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: "Агропромиздат", 1985. -351с.

26. Ермаков В.В. Субрегионы и биогеохимические првинции СССР с различным содержанием селена // Тр. биогеохимической лаборатории, 1978.-Т. 15.-С. 54-57.

27. Ермаков В.В. Биогеохимическая провинция Тувы.- Автореф. Канд дисс., Москва, 1967.- 33 с.

28. Ермаков В.В., Ковальский В.В. Биологическое значение селена.-М.:Наука, 1974.-298 с.

29. Живецкий А.В., Сучков Б.П. Содержание селена в крови здоровых лиц и больных со злокачественными новообразованиями по материалам в Черновицкой области // Микроэлементы в медицине: Респ. межвед. сб,-Киев, 1973.- Вып.4.- С. 69 73.

30. Инструкция № 20-19 по определению активности фузидина биологическим методом в культуральной жидкости, разработанная в АО "Биосинтез" Пенза, 1983 - 6 с.

31. Инструкция №3 НГ 111, по определению активности гризеофульвина в культуральной жидкости, разработанная в АО "Биосинтез" - Пенза, 1975.11 с.

32. Исмайлов Х.А., Агаева З.М., Бекташи Т.К. Перспективы применения селена в иммунитете растений // Селен в биологии. Мат-лы науч. конф. Баку: Изд во Элм,1976,- С.88 - 96.

33. Карелина JI.B. Содержание селена в некоторых растениях. В сб.: Микроэлементы регуляторы жизнедеятельности и продуктивности растений.- Рига, 1971 - 209 с.

34. Ковальский В.В. Регионы биосферы основа биогеохимического районирования. Докл. ВАСХНИЛ, 8:2, М.,1969.

35. Ковальский В.В., Раецкая Ю.И., Грачева Т.И. Микроэлементы в растениях и кормах М., 1971.- 64 с.

36. Конова Н.И. К вопросу о биогеохимии селена в различных геохимических условиях//Микроэлементы.-1993.-Вып.33. -С. 43-48.

37. Конова Н.И., Ермаков В.В., Савкина Т.В. Дискретность рассеивания селена в биогеохимических пищевых цепях//Микроэлементы в биологии и их применение в сельском хозяйстве и медицине: Тез. науч.конф. Самарканд : СамГУ, 1990. С.46 - 47.

38. Кудрин А.Н. Научные основы применения неорганических и органических соединений селена в медицинской практике // Витамины.-1975.-Вып 8.-С. 128 134.112

39. Кулаев И.С. Биохимия высокомолекулярных полифосфатов.-М., 1975. -225 с.

40. Курсанов Л.И. Микология. М, 1940. - 270 с.

41. Лилли В., Барнетт Г. Физиология грибов.-М.: Мир, 1953.-553 с.

42. Маслова Р. А. Влияние различных источников азота на рост дереворазрушающих грибов в культуре //Микология и фитопатология. -1969. Т.З, - № 5. - С. 452 - 457.

43. Методика приготовления ферментативной среды для продуцентов пенициллина шт. 19, разработанная в АО "Биосинтез" Пенза, 1995. -2 с.

44. Методика определения активности феноксиметилпенициллина йодометрическим методом, разработанная в АО "Биосинтез" Пенза, 1990. -8 с.

45. Методика приготовления ферментативной среды для продуцента гризеофульвина, разработанная в АО "Биосинтез" Пенза, 1995 - 5 с.

46. Методика количественного определения гризеофульвина в культуральной жидкости по спектро-фотомегрическому методу, разработанная в АО "Биосинтез" Пенза, 1983 - 7 с.

47. Методика приготовления ферментационной среды для биосинтеза фузидина в лабораторных условиях, разработанная в АО "Биосинтез" -Пенза, 1995 -5 с.

48. Мехтиева Н.А., Рабкрин Н.А. Значение явления серно селенового антагонизма в развитии почвенных гифомицетов и накопление ими селена // Селен в биологии.- Баку: Элм.-1981.- С. 252-255.

49. Мюллер Э., Лёффлер В. Микология М.: "Мир", 1995, - 343 с. Пер. с нем.

50. Негруцкий С.Ф. Физиология и биохимия низших растений.-Киев: Выща школа, 1990,-200 с.

51. Обухова Т.И. Значение определения селена в диагностике болезни Кешана// Микроэлементы в биологии и их применение в сельском113хозяйстве и медицине: Тез. науч.конф. Самарканд : СамГУ, 1990. С.479 -480.

52. Петрухина Т.Ю. Цитологическое изучение продуцента фузидина в связи с его антибиотической активностью. Автореф. Дисс. . канд. биол. наук, М.-1975.-212 с.

53. Плетникова И.П. Биологическое действие и уровень безопасности селена при поступлении в организм с питьевой водой //Гигиена и санитария.-1970.-№2.-С. 14- 19.

54. Постников А.В., Илларионова Э.С. Новое в использовании селена в земледелии. -М.: ВНИИТЭСХ, 1991.- 43 с.

55. Промышленный регламент на производство бензилпенициллина № 640206-27 -93 от 15.09.1993. 520 с. (для служебного пользования).

56. Промышленный регламент на производство гризеофульвина № 64-020629 -95 от 8.04.1995. 468 с. (для служебного пользования).

57. Промышленный регламент на производство фузидина натрия №64-020631-93, от 24.06.1993. - 499 с. (для служебного пользования).

58. Промышленный регламент на получение натриевой соли цефалоспорина С, ОПР 64-0263-34/1 -94 от 3.07. 1994.- Пензенский филиал ВНИИА (ГНЦА) 389 с. (для служебного пользования).

59. Промышленный регламент № 64 0206 - 34 - 94 на производство гелиомицина, 1994 г. - 483 с. (для служебного пользования).

60. Промышленный регламент № 64 0206 - 36 - 94 на производство леворина, 1994 г.- 530 с. (для служебного пользования).

61. Промышленный регламент № 64 0206 - 39 - 95 на производство нистатина, 1995 г. - 386 с. (для служебного пользования).

62. Решетникова И. А. Накопление селена и фракционирование его изотопов микроорганизмами. Деструкция лигнина ксилотрофными макромицетами.-М., 1997.-197 с.114

63. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышэйша школа, 1967.-326 с.

64. Сучков Б.П. Содержание подвижных форм селена и фтора в почвах Черновицкой области и некоторых минеральных удобрений// Селен в биологии. Мат-лы науч. конф. Баку: Изд во Элм,1981.- С. 13 - 14.

65. Тимирязев К.А. О вероятном значении цинка в экономии растений. Труды общ. Естествоиспыт. Сп.Б,1872. С - 3.

66. Торшин С.П., Ягодин Б.А., Удельнова Т.М., Голубкина Н.А., Дудецкий А.А. Влияние микроэлементов Se,Zn,Mo при разной обаспеченности почвы микроэлементами и серой на содержание селена в растениях яровой пшеницы и рапса // Агрохимия.-1996.-№5.-С.54-64.

67. Торшин С.П. Удельнова Т.М. Ягодин Б.А. Биогеохимия и агрохимия селена и методы устранения селендефицита в пищевых продуктах и кормах//Агрохимия.- 1996,- №8-9.- С. 127 144.

68. Шакури Б.К. Влияние солей селена на рост и развитие озимого ячменя на горно каштановых почвах и на интенсивность микробиологических процессов // Селен в биологии. Мат-лы науч. конф. Баку: Изд - во Элм, 1976.-С. 100-105.

69. Школьник М.Я. Микроэлементы в жизни растений.- Д., Наука -1974.-С. 324.

70. Basu S.N. Significance of calcium in the fruitine of Chaetomium species, particularly Chaetonium globosum. J. Gen. Microbiol., №5.- 1964. P. 231.

71. Birkett J.A., Rowlands R.T. Chlorate resistance and nitrate assimilation in industrial strains of Penicillium chuysogenum. . J. Gen. Microbiol., №123.-1981.-P. 281-285.

72. Bollard E.G. Involment of unusual elements in plant growth and nutrition// Inorganic plant nutrition / Encyclopedia of plant physiology.- Berlin: Springer Yerlag, 1983.-V.15 B.-P. 695 744.115

73. Cooke S. The availability of selenium to herbare crops as influ ensed by soil type//J. Scien. Food.Agric.-l985.-V.36.-M7.-P. 543-544.

74. Coppock R. Selenium, human health and irrigated agriculture.- California: Univ., Agric. Issues Center, 1987.-9 p.

75. Gams W. Cephalosporium artige Schimmelpilze (Hyphomycetes), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart.- 1971.- 84 p.

76. Grossman A., Wendel A. Non reactivi of the selenoenzim glutatione peroxidase with enzimatically hydroperoxidized phosholipid.- Fur J. Biochem.-1983.-P. 549-552.

77. Hoekstra W.G., Hafeman O., Oh S.H., Cunder R.A., Ganter H.E. Effect of dietary selenium on liver and erytrocyte glutathione peroxidase in the rat // Fed. prog, -1973.-32. P. 885.

78. K0hrle J., Schutzler C., Dreher I. Selenium and Thyroid Hormone System // Prog. 3 rd Inter. Cong, on Vitamins and Related Biofactors.-1998.-P. 33.

79. Levander O.A. Selenium. Trace elements in humat and animal nutrition.- 5 ed. // Ed.W.Mertz. Orlando, San Diego, N.Y. Austin, Monreal, Sydney, Tokyo, Toronto: Acad. Press, 1986.-V.2.-P. 209-266.

80. Lilly V.G. Chemical constituent of the fungall cell // The Fungi /Ed by G.C. Ainswort and A.S. Sussman.- New York London, 1965.-163 p.

81. Lindenberg G. Uber die physiologie inginabbaimder Bodenhynenomycetes // Symb.Bot. Upps.-1944.-P. 140 -144.

82. Marit M.E. van Bakel, Ulrich N.W. Effect of limited oxidative stress on glutathione metabolism in selenium deficient erythrocytes from patients with phenylketonuria // Prog. 3 rd Inter. Cong, on Vitamins and Related Biofactors.-1998.-P. 70.

83. Morton A.G., Mc Millan A. The assimilation of nitrogen from ammonium salt and nitrate by fungi // J. Exp. Bot.-1954.-V.5.-№ 14.- P. 232-238.116

84. Perliman D. Studies on the growth and metabolism of Polyporus anceps in submerger culture//Amer. J. Bot.- 1949.-36.-№2.-P. -180-184.

85. Riely J.F. Mast cells, со carcinogenesis and anti - carcinogenesis in the scin of mice // Experientia (Basel) - 1968.- 24,- P. 1237 - 1238.

86. Rosenfeld J., Beach O.A. Selenium Geobotany, Biochemistry and nutrition // Acad. Press.- New York London, 1964.-P. 835.

87. Rotruck J.L., Ganther H., Swanson A., Hafeman D. Federal. Program., 1973.-31.-P. 691.

88. Salzman J., Salzman E., Salzman I., Lincoff G. A Search for Soma in Russia Kamchatka Peninsula //Mushroom the Journal.-1996.-P. 18-23.

89. Scroeder H.A., Frost D.V., Balassa J.J. Essential trace metals in man ; selenium. J. chon. Dis.,1970.-23.-p. 227 243.

90. Scroeder H.A., Mitchener M. Selenium and tellurium in mice.Effect on growth survival and tumors // Arch, environ. Health.-1972.- 24.- P. 66 71.

91. Schwarz P.A., Foltz C.M. Selenium as an integral part of Factor 3 aganist dietary necrotic liver degeneration//! Amer. Chem. Sci.-1957.-V.79.-P. 3292.

92. Shamberger R.G. , Baughman F.F., Kalchert S.L., Willis C.E. , Hofftnan G.C. Carcinogen induced chromosomal breakage decreased by antioxidants// Prog. Natl. Acad Sci. (USA).- 1973.-70.-P. 1461 - 1463.

93. Shrift A. Metabolism of selenium by plant and microorganisms // Selenium compounds in nature and medicine.-New York: Cornell University, 1961.- 816 P117

94. Stoller B.B. Principles and practice of mushroom culture // Economic Botany.-1956.-V.8.-№ l.-P. 91-96.

95. Steinberg R. A. Relation of accessery substanse and amine requirments to the carbon nutrition of Aspergillus niger // Prog. Third. Int. Congr. Microbiol.-1939.-P.491.

96. Taylor W. Slowing down with selenium // Chemistry Industry.- 1994- P.664.

97. Thompson H.J. Selenium as an anticarcinogen !! J. agric. food. Chem., -1984.-32.-P. 422-425.

98. Ulrich J.M., Shrift A. Selenium Absorbtion by excised Astragalus roots // Plant Physiol, 1968.-№43. -P. 14-20.

99. Yolgarev M.N.,Tscherkes L.A. Further studies in tissue changes associeted with sodium selenate. In : Muth O.H., Oldfield J.E., Weswing P.H. Selenium in biomedicine.- Westport, Connecticut, The AVI Publishing Co., Inc.- 1967.- P. 179- 184.

100. Watkinson J.H. Analytical Chemistry. New-York, 1966.-192 p.

101. Zeive R., Peterson P.J. Selenium content of plants: soil and atmosphere integration //J. Sci. Food. Agric.-1985.-V.36.-№7.- P. 534 535.18