Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль цитоскелета сердечных фибропластов в механизме генерации механоиндуцированных потенциалов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль цитоскелета сердечных фибропластов в механизме генерации механоиндуцированных потенциалов"

На правах рукописи УДК [ 612.822 + 612.172 ] - 014.42 : 547.964

ГГ,5 ().;

О ■' • ■ I ' - , I О

КАЗАНСКИЙ Виктор Евгеньевич

РОЛЬ ЦИТОСКЕЛЕТА СЕРДЕЧНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ В МЕХАНИЗМЕ ГЕНЕРАЦИИ МЕХАНОИНДУЦИРОВАННЫХ ПОТЕНЦИАЛОВ

( 03.00.13 - физиология человека и животных )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2000-

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии Российского государственного медицинского Университета (Россия, Москва).

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор А.Г.Камкин

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Н.А.Соколова

Доктор медицинских наук, профессор В.И.Савчук

Ведущая организация:

Российский Ордена Дружбы Народов Университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «_»_2000 года в

часов на заседании диссертационного Совета Д.084.14.06 при Российском государственном медицинском Университете по адресу: 117869, г.Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского Университета по адресу: 117869, г.Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан « »_ 2000 года

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук,

доцент Т.Е.Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние годы большое внимание уделяется изучению биоэлектрических свойств сердечных фибробластов и их роли в регуляции работы сердца с позиций механоэлектрической обратной связи в миокарде. Известно, что миокард содержит две группы клеток. Первая группа - кардиомиоциты, представляющие собой электровозбудимые сократительные клетки и вторая группа - не мышечные клетки, которые электроневозбудимы. Эта последняя группа состоит из различных клеточных типов, где доминируют фибробласты. Фибробласты достаточно широко представлены в сердце. В целом сердце млекопитающих количество фибробластов составляет приблизительно 5% - 10% от общего количества клеток. Их количество особенно велико в зоне синусного узла, где по данным разных авторов оно составляет от 45% до 75% общего количества клеток. Хотя в сердце представлены различные немышечные клетки, фибробласты среди них доминируют. Показано, что среди всех немышчных клеток сердца их более 90%. Несмотря на то, что наличие фибробластов в сердце известно давно, их роль в работе сердца и механизмы их функционирования начали изучать относительно недавно. До последнего времени значение фибробластов оценивалось исключительно с позиций создания ими опорных структур сердца. Однако, было предположено, что фибробласты играют роль не только структурного скелета, но выполняют и другие функции, например, синтезируют и выделяют различные биологически-активные вещества и, следовательно, принимают участие в регуляции работы сердца. Как показано в последние годы, эти клетки i

могут играть роль и в процессах электрогенеза сердца.

Впервые электрофизиологические характеристики фибробластов целого бьющегося сердца и их межклеточное взаимодействие были описаны A. Kamkin и I. Kiseleva в 1986 году как исследование "атипичных" не мышечных клеток сердца. В дальнейших исследованиях с одновременным применением микроэлектродной техники и гистологических методов этой рабочей группой было показано, что изучаемые "атипичные" клетки сердца являются фибробластами.

Показано, что фибробласты сердца являются электроневозбудимыми но механосенситивными клетками, то есть как фибробласты других типов, имеют ионные канальи реагирующие на сжатие или растяжение. Их рецепторами являются впервые описанные F.Sachs в 1985 году механорецепторы, связанные с ионными каналами, названными stretch-activated channels - механосенситивными ионными каналами (SAC). Мембраны подавляющего большинства возбудимых клеток содержат, как обнаружено в последние годы, не только потенциалзависимые и хемочувствительные, но и ионные каналы, функционирующие при механическом воздействии.

Ответ клетки на прямое механическое воздействие возникает как следствие взаимосвязанного функционирования ее структурных элементов и вторичных мессенжеров. Белки клеточной поверхности и экстрацеллюлярный матрикс, связанные посредством трансмембранных белков с цитоскелетом, активируют ионные каналы при механической деформации клетки. Преобразование механического сигнала на уровне клетки может выражаться как в ее электрофизиологических, так и в биохимических ответах. Изменение концентрации биологически активных лигандов на поверхности клетки также может быть непрямым механизмом преобразования механического сигнала. Для ряда электроневозбудимых клеток показано, что механизм преобразования механического сигнала представляет собой комбинацию между передачей силы растяжения или сжатия через цитоскелетные элементы на SAC и преобразование силы растяжения или сжатия в биохимические сигналы на механо-преобразующем участке клетки. Большинство авторов рассматривают в качестве принципиальной преобразующей системы F-актин микрофила-ментов, поскольку показано, что стимуляция аденилатциклазы и механосенситивный ответ клетки на деформацию ингибируется специфическим деполимеризующим актин микрофиламентов агентом. Микрофиламентная сетка поддерживает натяжение в клетке, которое совместно с микротубулярной жесткостью определяет клеточную форму.

Поскольку фибробласты сердца являются механосенситивными клетками, было предположено, что они являются механоэлектрическим преобразователем в сердце и служат базовыми элементами для реализации механизма обратной связи между возбуждением и сокращением. Хотя гистологически фибробласты сердца изучены достаточно хорошо их электрофизиологическое исследование проведено только в условиях культуры ткани неонатального сердца крыс и на целом сердце холоднокровных животных.

Эти исследования позволяют предположить, что сжатие или растяжение фибро-бласта в моменты сокращения или расслабления миокарда через цитоскелет вызывают изменение функционирования (активацию или инактивацию) stretch-activated channels и, как следствие, возникновение потенциалов, названных mechano-induced potentials (MIP). Проверке этой гипотезы посвящена настоящая работа.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение роли цитоскелета еердечных фибробластов в механизме генерации механоиндуцированных потенциалов.

Исследование включало решение следующих задач:

1) Идентификация механо-сенситивных фибробластов правого председия крысы и изучение их электрофизиологических характеристик;

2) Изучение роли деполимеризации F-актина и тубулина в механизме возникновения MIP.

3) Изучение роли полимеризации F-актина и тубулина в механизме возникновения

M IP.

4) Изучение эффекта стабилизаторов F-актина в условиях его деполимеризации.

5) Изучение эффекта стабилизаторов тубулина в условиях его деполимеризации.

Научная новизна работы

На сердечных фибробластах впервые изучены эффекты внутриклеточного введения Cytochalasin D и Colchicine, которые деполимеризуя F-актин и тубулин ингибируют MIP. Изучено влияние на MIP стабилизаторов F-актина и тубулина - ATP, GTP и Taxol. В работе получены данные о протективном эффекте стабилизаторов F-актина и тубулина на эффект Cytochalasin D и Colchicine. Работа демонстрирует, что передача механического сигнала на SAC у фибробластов сердца в значительной мере осуществляется при помощи F-актина микрофиламентов и тубулина микротубул.

Теоретическая и практическая значимость результатов

Изучение механизмов генерации MIP механосенситивными фибробластами сердца имеет большое теоретическое значение для понимания фундаментальных механизмов работы сердца и открывает новые представления о роли фибробластов как субстрата для реализации механоэлектрической обратной связи в сердце. Теоретическая и практическая ценность работы заключается в том, что определен механизм передачи механического сигнала на SAC, что позволит осуществлять регуляцию его передачи.

Практическое внедрение результатов работы заключается в том, что разработана система скрининга фармакологических препаратов, оказывающих влияние на механоэлектрическую обратную связь в сердце.

Апробация работы

По материалам диссертации сделан доклад на научной конференции Института Физиологии Университета Халле-Витгенберг (Germany, Halle/Saale, 28 января 2000 года).

Диссертация апробирована на заседании кафедры нормальной физиологии с курсом физиологии Медико-биологического факультета Российского государственного медицинского Университета (Россия, Москва, 27 апреля 2000 года).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов с их обсуждением, выводов и списка цитированной литературы.

Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста, включая 2 таблицы,30 рисунков и список литературы из 188 источников.

з

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследований

Работу выполняли на механосенситивных фибробластах, расположенных в правом предсердии изолированного сердца крыс (Wistar) различного пола. Из общего числа выполненных опытов 240 в обработку и анализ бьшо введено 151 экспериментов, которые полностью соответствовали планируемому протоколу.

Для экспериментов готовили препараты фрагмента предсердия с зоной синусного узла. Вырезали полоску длиной 7 мм и шириной 4 мм, содержащую пейсмейкерную зону.

Для обеспечения жизнедеятельности миокардиальной ткани изолированный синусный узел сердца крысы на протяжении экспериментов постоянно перфузиро-вали солевым раствором следующего состава [14] (тМ) : 118 NaCl, 2.7 КС1, 1.2 СаС12, 1.2 Mg2S04, 2.2 NaH2P04 , 25 NaHC03 , 5 Glucose. Через раствор постоянно проходили пузырьки карбогена (5% С02 и 95% 02 ). Осмолярность раствора была равна 290 ± 5

мосМ и рН был 7.4 ± 0.02 при температуре 37 ± 0.2 °С. Все реактивы были получены от фирмы Sigma.

Электрические воздействия

Для изучения биоэлектрических свойств клеток с генератора прямоугольных импульсов электрического тока через измерительную схему внутриклеточно периодически подавали поляризующие импульсы электрического тока силой 10"' А, прямоугольной формы, длительностью не менее 2 сек. Внутриклеточную поляризацию использовали только в экспериментах с фнбробластами сердца.

Химические воздействия

Для изучения возможности вовлечения микрофиламентов в rundown stretch-activated channels был использован CytichaJasin D, который гидролизу ет A TP актина и, тем самым, уменьшая стабильность полимера, приводит stretch-activated channels в состояние rundown. Cytochaiasin D вводили в клетку посредством пассивной диффузии из микроэлектрода, где он находился совместно с электролитом в концентрации 100 рМ или 200 цМ.

В качестве стабилизатора F-актина использовали АТР, вводимый внутриклеточно посредством пассивной диффузии из микроэлектрода, где он находился совместно с электролитом в концентрации 200 рМ или 2 тМ.

Для изучения протективного эффекта АТР на цитохалазиновую деполимеризацию F-актина, это соединение вводили внутриклеточно через микроэлектрод где оно бьшо в концентрации 2 тМ или 200 рМ совместно с Cytochalasin D в концентрации 200 jiM.

Для изучения роли микротубул в регуляции воротного механизма stretch-activated channels был использован Colchicine, специфически деполимеризующий тубулин. Colchicine

вводили в клетку также посредством пассивной диффузии из микроэлектрода, где он находился совместно с электролитом в концентрации 100 цМ или 200 jiM.

В качестве стабилизатора тубулина использовали GTP и Тахо!, вводимые внутриклеточно посредством пассивной диффузии из микроэлектрода. В микроэлектроде GTP был в концентрации 200 рМ или 2 тМ, а Taxol в концентрации 200 jiM. Все соединения находились в микроэлектродах совместно с электролитом.

Для изучения протективного эффекта GTP и Taxol на колхициновую деполимеризацию тубулина, соединения вводили посредством пассивной диффузии совместно с Colchicine в концентрации 200 рМ в микроэлектроде. Концентрация GTP в микроэлектроде была 2 тМ или 200 рМ, а концентрация Taxol 200 jjM.

Кроме того, осуществляли совместное введение Cytochalasin D и Colchicine, которые находились в микроэлектроде в концентрации по 100 рМ.

В процессе работы было выполнено 16 экспериментальных серий.

Для внутриклеточного введения соединений использовали микроэлекртоды, сопротивление которых было 8-9 МП.

В предварительных экспериментах нами было показано, что если сопротивление микроэлектрода было равно 10 МП или больше эффект не наступал. Мы также не получили эффекта при применении микроэлектродов, заполненных меньшей концентрацией соединений.

Все используемые соединения были получены от фирмы Sigma.

Механические раздражители

Для изучения механической чувствительности исследуемых клеток посредством электронного микрометра производили искусственное предрастяжение препаратов (preload) равное 1 mN.

Электрофизиологические исследования

Для выполнения поставленных экспериментальных задач была использована экспериментальная установка, работающая в режиме curent clamp, обеспечивающем регистрацию потенциалов клеток и искусственную внутриклеточную поляризацию их мембран с применением одного микроэлектрода. В качестве регистратора использовали Digital Type Recorder DTR-1802 фирмы Bio-Logic (Франция). Данные обрабатывали на PC IBM-AT при помощи программы "Sygnalis" (Германия) с использованием АЦП ВЕ 490 от Bakker Electronics (Германия).

Механические исследования

В экспериментах регистрировали resting force и active force изолированных фрагментов предсердий и осуществляли их механическое растяжение. Для этого применяли электронноизмерительную аппаратуру, включающую механоэлектричесхий преобразователь и мостовой усилитель Plugsys system 603 (Hugo Sachs Elektronik, Германия). Препарат

крепили между штырем механоэлектрического преобразователя и штырем микрометра которым задавали фиксированное предрастяжение ткани. Стандартное слабое предрастяжение препарата, равное 1 mN, вызывало стандартную active force в течение экспериментального протокола, равную 0.3 mN.

Характеристика регистрируемых параметров

Регистрировали active force и resting force препарата при разных степенях его растяжения. У фибробластов регистрировали величину мембранного потенциала; амплитуду MIP; величину механоиндуцированной гиперполяризации; амплитуду MIP, полученную при искусственном растяжении ткани; входное сопротивление клеток.

Методы обработки результатов экспериментов

Использовали стандартные методы математической статистики в виде стандартной коммерческой программы (SPSS statistical package, SPSS INC., USA). Вычисление всех статистических характеристик и оценок параметров функций проводили на PC.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ §1. Электрофизиологическое исследование фибробластов в правом предсердии крыс

В изолированном правом предсердии крысы мы регистрировали фибробласты (п=73), величина мембранного потенциала которых лежала в диапазоне от - 5 mV до - 70 mV (-22+2 mV). Наиболее часто встречались клетки с мембранным потенциалом в диапазоне от - 10 mV до - 25 mV. Величина входного сопротивления исследуемых клеток, по нашим данным, лежала в пределах от 510±10 MQ. В ритме спонтанных сокращений препарата у клеток регистрировали осцилляции мембранного потенциала, форма и электрофизиологические характеристики которых были аналогичны с ранее описаными mechanically induced potentials (MIP) у фибробластов, расположенных в предсердиях лягушки и крысы.

Амплитуда зарегистрированных MIP была либо соизмерима с величиной мембранного потенциала, либо значительно меньше его. Характерной особенностью, отличающей MIP от потенциалов действия, было и отсутствие оверщута. При расстоянии между кардиомиоцитом и фибробластом не более 50 цт MIP начинается позднее потенциала действия на 10 мсек. Длительность этого потенциала соответствует длительности механограммы препарата предсердия.

Основным тестом, при помощи которого мы идентифицировали фибробласты в предсердиях крыс, служила их специфическая реакция на искусственную внутриклеточную поляризацию и специфическая реакция на растяжение ткани.

У фибробластов спонтанно сокращающегося фрагмента правого предсердия искусственная гиперполяризация мембраны приводила к увеличению амплитуды MIP тем

большему, чем на большую величину смещался потенциал. Искусственная деполяризация мембраны приводила к уменьшению амплитуды MIP тем большему, чем большая поляризация имела место, вплоть до полного прекращения возникновения MIP при достижении потенциала реверсии.

Искусственное растяжение ткани спонтанно сокращающегося фрагмента правого предсердия приводило к гиперполяризации мембраны фибробласта и соответственно к увеличению амплитуды MIP тем большему, чем большую величину имело механосенситивная гиперполяризация ткани.

Регистрировали изменения MIP изучаемых клеток, вызванных спонтанными сокращениями ткани, поддерживая потенциал на уровне -50 mV, в течение 30 мин на фоне постоянной перфузии препарата физиологическим раствором (п=20).

На рис.1 представлены MIP на уровне -50 mV гиперполяризации, вызванные спонтанным сокращением фрагмента ткани сразу после введения в клетку микроэлектрода (кривая 1) и через 30 мин регистрации (кривая 2). Показано, что на протяжении времени регистрации амплитуда MIP (Vmip ) и его длительность Omip ) не менялись. Не менялись и величины resting force (ImN) и active force (0.29±0.018 mN) исследуемой ткани (см. также таблицу 1). В процессе регистрации величина мембранного потенциала и входное сопротивление клетки также оставались на постоянном уровне, что свидетельствует о устойчивой фиксации микроэлектрода мембраной клетки (смотри также таблицу 1).

Рис.1. Синхронная регистрация механограммы, вызванной спонтанным сокращением фрагмента ткани правого предсердия крысы (верхняя кривая) и MIP фибробласта (нижняя кривая) на уровне внутриклеточной гиперполяризации величиной -50 mV сразу после введения микроэлектрода в клетку (1) и через 30 мин перфузии препарата физиологическим раствором (2). RF - resting force, AF - active force, MIP - механоиндуцированный потенциал фибробласта, Em - величина мембранного потенциала клетки.

Влияние искусственной внутриклеточной поляризации исследуемых клеток на амплитуду MIP, вызванных спонтанным сокращением ткани сразу после введения микроэлектрода и через 30 мин перфузии препарата физиологическим раствором представлено на рис.2.

rf

0

Линейная (Р<0.0001) зависимость (рис.2-1) амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Еш ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.82; Р<0.0001) сразу после введения в клетку микроэлектрода совершенно не менялась в течение 30 мин регистрации (slope -0.80; PcO.OOOl) на фоне постоянных величин resting

-120 -100

Рис.2. Зависимость амплитуды MIP от величины смещения мембранного потенциала фибробласта сразу после введения микроэлектрода в клетку (1) и через 30 мин регистрации (2).

force и active force (рис.2-2). Так, на уровне -50 raV гиперполяризации амплитуда MIP через 30 мин была около 37 mV (по сравнению с 38 mV на первой минуте регистрации). А на уровне -100 тВ гиперполяризации амплитуда MIP была около 79 mV (по сравнению с 82 mV в контроле).

В целом, эти эксперименты показали, что на протяжении времени регистрации при стабильно поддерживаемом мембранном потенциале амплитуда MIP и его длительность не менялись. Это позволило поставить эксперименты, связанные с изучением влияния на исследуемые клетки некоторых фармакологических агентов, вводимых внутриклеточно. При этом, спонтанные сокращения ткани, не меняющиеся в течение 30 мин эксперимента рассматривали в качестве механического стимулятора клетки.

§2. Влияние внутриклкточной диффузии соединений, деполимеризующих н стабилизирующих цитоскелет на механоиндуцированные потенциалы фибробластов в правом предсердии крыс Данные о влиянии соединений, деполимеризующих и стабилизирующих цитоскелет, сведены в таблицу 1. Детальная информация о влиянии каждого из них представлена в следующих разделах настоящей работы.

2.1. Влияние Cyiochalasin D на биоэлектрическую активность фибробластов Если работа механосенситивных каналов и, следовательно, генерация MIP в ответ на механическое воздействие определяется микрофиламентами цитоскелета, то деполимеризация F-актина под действием Cyiochalasin D должна приводить к

Таблица 1

1 Control Drug effect 5 min

Compounds Concentration п AF (rnN) ^mlf (mV) slope Vmip/E„ (mV/mV) w (ms) AF (mN) (mV) slope V„,p«m (mV/raV) W (ms)

KC1 140 raM 20 0.29М.018 38±4 -0.82 85±7 0.29±0.018 38+4 -0.82 85±7

Cytochalasin D 100 цМ 14 0.29+0.018 38±3 -0.84 85±6 0.29±0.018 30±5 -0.74 81±5

Cytochalasin D 200 цМ 10 0.29±0.017 37±2 -0.79 85±5 0.29±0.017 18±3 -0.56 73±4

Colchicine 100 цМ 12 0.29+0.017 37±3 -0.82 84+5 0.29±0.017 32±4 -0.67 8216

Colchicine 200 цМ 10 0.29±0.017 38±3 -0.83 83±5 0.29+0.017 26±3 -0.54 74±5

Cytochalasin D Colchicine 100 цМ 100 цМ 6 0.29±0.017 37±3 -0.84 84±4 0.29±0.017 25±4 -0.58 82±6

Cytochalasin D Colchicine 200 цМ 200 tiM 5 0.29+0.017 37±3 -0.84 84±4 0.29+0.017 12±3 -0.30 72±5

ATP 200 цМ 7 0.29±0.017 38+3 -0.68 83±4 0.29Ю.017 42±3 -0.76 83+4

ATP 2 шМ 6 0.29i0.018 36±3 -0.69 84±4 0.29±0.018 47±4 -0.93 84+4

Cytochalasin D ATP 200 цМ 200 цМ 8 0.29±0.019 38±4 -0.91 85±5 0.29Ю.019 32±4 -0.81 85±5

Cytochalasin D ATP 200 цМ 2тМ 9 0.29±0.019 38±4 -0.85 85±7 0.29±0.019 31±3 -0.71 74±8

GTP 200 цМ 8 0.29±0.018 37±3 -0.70 86±3 0.29±0.018 48±1 -0.98 86+3

GTP 2 тМ 6 0.29±0.018 37±3 -0.76 85±7 0.29±0.018 43±3 -0.87 84±6

Taxol 200 цМ 8 0.29+0.018 37±4 -0.75 84±6 0.29±0.018 45+2 -0.86 83±6

Colchicine GTP 200 цМ 200 цМ 8 0.29±0.017 37±4 -0.84 85±5 0.29Ю.017 32+3 -0.71 85±5

Colchicine GTP 200 цМ 2 тМ 8 0.29±0.018 38±4 -0.86 85±7 0.29+Й.018 34±4 -0,75 85±6

Colchicine Taxol 200 цМ 200 цМ б 0.29±0.018 38±3 -0.89 86±6 0.29±0.018 33±4 -0.78 86±6

ингибированию амплитуды MIP, и при разных концентрациях соединения эффект ингибирования MIP должен протекать разное время.

Для проверки этой гипотезы в экспериментах Cytochalasin D вводили внутрь клетки путем пассивной диффузии из микроэлектродов, где соединение находилось в различных концентрациях, однако для анализа были использованы концентрации 100 рМ (п=14) и 200 jiM (п=10).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Cytochalasin D, находящегося в микроэлектроде в концентрации 100 рМ. Уже через 5 мин аппликации Cytochalasin D приводил к уменьшению Vmip до 80 % и tmip до 95 % от контрольных значений. Дальнейшее уменьшение Vmip и tmip шло до 15-ой минуты аппликации, после чего дальнейших заметных изменений не наблюдали. На 15-ой минуте Cytochalasin D в концентрации 100 рМ приводил к уменьшению Vmip до 45 % и Imip до 82 % от контрольных значений. Естественно, что эти изменения определяются действием соединения, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29±0.018 mN) исследуемой ткани не менялясь.

Линейная (PcO.OOOl) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.84; PcO.OOOl) под действием Cytochalasin D через 5 мин аппликации соединения сохраняется (Р<0.0001), однако кривая начинается с -10 mV (slope -0.74; Р<0.0002). Через 15 мин аппликации соединения кривая (PcO.OOOl) начиналась с -20 mV (slope -0.6; Рс0.002), а через 20 мин аппликации кривая (PcO.OOOl) практически не менялась, начинаясь с -20 mV (slope -0.57; РсО.ОООб). При этом, ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала значительно меньшее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, через 5 мин аппликации на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 30 mV (по сравнению с 38 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 65 mV (по сравнению с 83 мВ в контроле). В области от -5 mV до -10 mV MIP не возникал. Через 15 - 20 мин аппликации на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 19 mV (по сравнению с 38 mV в контроле). На уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 46 mV (по сравнению с 83 mV в контроле). В области от -5 mV до -20 mV MIP вообще не возникал.

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Cytochalasin D, находящегося в микроэлектроде в концентрации 200 рМ. Cytochalasin D приводил к уменьшению Vmip до 48 % и tmip до 86 % от контрольных значений. Эти изменения определяются действием соединения, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29±0.017 mN) исследуемой ткани не менялясь.

ю

Линейная (PcO.OOOl) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.79; Р<0.0001) под действием Cytochalasin D через 5 мин аппликации соединения (PcO.OOOl) начинается с -20 mV (slope -0.56; Р<0.0007). Ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала значительно меньшее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 18 mV (по сравнению с 37 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 46 mV (по сравнению с 76 mV в контроле). В области от -5 mV до -20 mV MIP вообще не возникал.

vmip(mv] 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

0 5 10 15 20 25

t [mm]

Рис.3. Зависимость величины амплитуды MIP от времени аппликации соединения в используемых концентрациях. 1 - в электроде только KCI, 2 - в электроде 100 jiM Cytochalasin D, 3 - в электроде 200 }iM Cytochalasin D.

В контрольных экспериментах в течение 20 минут перфузии препарата физиологическим раствором (рис.3-1) заметного падения амплитуды MIP не наблюдалось (slope 0.06; Р<0.0001). Внутриклеточная диффузия в течение 20 мин Cytochalasin D с концентрацией 100 jjM в микроэлектроде или 200 рМ в микроэлектроде ингибировала, но с разной скоростью, величину MIP до одинаковых значений на двадцатой минуте. При меньшей концентрации вещества (рис.3-2) амплитуда MIP медленно уменьшалась (slope 31.09; Р<0.0008) и кривая зависимости амплитуды MIP от времени диффузии веществ выходила на плато около 18 ± 2 mV (38 ± 4 mV в начале экспериментов) после 15-ой минуты аппликации, при большей концентрации вещества (рис.3-3) амплитуда MIP быстро уменьшалась (slope 20.75; Р<0.02) и кривая зависимости амплитуды MIP от времени диффузии веществ выходила на плато около 16 ± 4 mV (38 ± 3 mV в начале экспериментов) после 5-ой минуты аппликации.

Эти эксперименты свидетельствуют, что вне зависимости от концентрации Cytochalasin D (разумеется, в изученном диапазоне) ингибирование MIP идет до определенных значений (44% от исходных значений). Иначе говоря, в наших экспериментальных условиях деполимеризация F-актина идет до определенного уровня или, что более вероятно, F-актин, принимающий участие в передаче механического сигнала, деполимеризуется, а возникновение MIP связано с микротубулами или иными механизмами трансформации механического сигнала.

Таким образом, эксперименты с внутриклеточным введением Cytochalasin D подтверждают, что деполимеризация F-актина микрофиламентов приводит к ингибированию амплитуды MIP, и, следовательно, механическое воздействие может передаваться на механо-сенситивные каналы фибробластов сердца крысы через микрофиламенты.

2.2. Влияние Colchicine на биоэлектрическую активность фибробластов

Генерация MIP в ответ на механическое воздействие может определяться и микротубулами. В этом случае деполимеризация тубулина под действием Colchicine должна приводить к ингибированию амплитуды MIP, и при разных концентрациях соединения эффект ингибирования MIP должен протекать разное время.

Дтя проверки этой пшотизы в экспериментах Colchicine вводили внутрь клетки путем диффузии из микроэлектродов, где соединение находилось в концентрации 100 рМ (п=12) и 200 >iM (п=10).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Colchicine, находящегося в микроэлектроде в концентрации 100 jiM. Через 5 мин аппликации Colchicine приводил к уменьшению Vmip до 86 % и tMip до 97 % от контрольных значений. Дальнейшее уменьшение Vmip шло до 15-ой минуты аппликации, после чего дальнейших заметных изменений не наблюдали. На 15-ой минуте Colchicine в концентрации 100 рМ приводил к уменьшению Vmip до 59 % и tmip до 89 % от контрольных значений. Естественно, что эти изменения определяются действием соединения, т.к. величины resting force (IraN) и active force (0.29±0.017 mN) исследуемой ткани не менялясь.

Линейная (PcO.OOOl) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.82; Р<0.0001) под действием Colchicine через 5 мин аппликации соединения сохраняя линейный характер (Р<0.0001) меняет угол наклона (slope -0.67; Р<0.005). Через 15 мин аппликация соединения (PcO.OOOl) кривая еще больше уменьшает угол наклона (slope -0.54; Р<0.0004), а через 20 мин аппликации кривая (PcO.OOOl) практически не менялась (slope -0.51; Рс0.0004). При этом ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала значительно меньшее увеличение амплитуды MIP по

сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, через 5 мин аппликации на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 32 mV (по сравнению с 37 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 64 mV (по сравнению с 78 mV в контроле). А через 15-20 мин аппликации на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 24 mV (по сравнению с 37 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 50 mV (по сравнению с 79 mV в контроле).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Colchicine, находящегося в микроэлектроде в концентрации 200 рМ. Colchicine приводил к уменьшению Vmip до 68 % и tMip до 89 % от контрольных значений. Эти изменения определяются действием соединения, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29±0.017 mN) исследуемой ткани не менялясь.

Линейная (Р<0.0001) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.83; Р<0.0001) под действием Colchicine через 5 мин аппликации соединения сохраняя линейный характер (Р<0.0001) меняет угол наклона (slope -0.54; Р<0.05). Ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала значительно меньшее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 26 mV (по сравнению с 38 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 52 mV (по сравнению с 81 mV в контроле).

В контрольных экспериментах в течение 20 минут перфузии препарата физиологическим раствором заметного падения амплитуды MIP не наблюдалось (slope 0.06; Р<0.0001). Внутриклеточная диффузия в течение 20 мин Colchicine с концентрацией 100 рМ в микроэлектроде или 200 рМ в микроэлектроде ингибировала, но с разной скоростью, величину MIP до одинаковых значений на десятой минуте (Рис.4). При меньшей концентрации вещества амплитуда MIP медленно уменьшалась (slope 18.71; Р<0.05) и кривая зависимости амплитуды MIP от времени диффузии веществ выходила на плато около 22 + 5 mV (37 ± 3 mV в начале экспериментов) после 10-ой минуты аппликация, при большей концентрации вещества амплитуда MIP быстро уменьшалась (slope 17.64; Р<0.002) и кривая зависимости амплитуды MIP от времени диффузии веществ выходила на плато около 21 ± 4 mV (38 ± 3 mV в начале экспериментов) также после 10-ой минуты аппликации. Эти эксперименты свидетельствуют, что вне зависимости от концентрации Colchicine (разумеется, в изученном диапазоне) ингибирование MIP вдет до определенных значений (59% от исходного).

Иначе говоря, в наших экспериментальных условиях деполимеризация тубулина идет до определенного уровня или, что более вероятно, тубулин, принимающий участие в

передаче механического сигнала, деполимеризуется, а возникновение М1Р связано теперь уже с микрофиламентами или иными механизмами трансформации механического

сигнала.

VmipM

45

I I I 1 1

V4

V

1 1 " (3)

20 25 t Imin]

Рис 4 Зависимость величины амплитуды М1Р от времени аппликации соединения в используемых концентрациях. 1- в электроде только КС1, 2- в электроде 100 цМ Colchicine , 3- в электроде 200 дМ Colchicine .

Таким образом, эксперименты с внутриклеточным введением Colchicine подтверждают, что деполимеризация тубулина микротубул приводит к ингибированию амплитуды MIP, и, следовательно, механическое воздействие может передаваться на SAC фибробластов сердца крысы через микротубулы.

2.3. Влияние совместного введения Cytochalasin D и Colchicine на биоэлектрическую активность фибробластов Если механическое воздействие, вызывающее генерацию MIP, передается только микрофиламентами и микротубулами цитоскелета, то деполимеризация F-актина и тубулина одновременно под действием Cytochalasin D и Colchicine должна приводить практически к полному ингибированию амплитуды MIP, и при разных концентрациях соединений эффект ингибирования MIP должен протекать разное время. Если же MIP при одновременной аппликации соединений ингибируется не полностью, следовательно в его возникновении играют роль и другие механизмы, как, например, описанные осцилляции

внутриклеточного кальция.

Для проверки этой гипотизы в экспериментах Cytochalasin D и Colchicine одновременно вводили внутрь клетки путем диффузии из микроэлектродов, где оба соединения находилось в концентрациях по 100 рМ (п=6) и по 200 jiM (п=5).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Cytochalasin D и Colchicine, находящихся в микроэлектроде в концентрации по 100 рМ и по 200 рМ.

Cytochalasin D и Colchicine в концентрации 100 цМ приводили к уменьшению Vmip до 63% и (мгр до 96% от контрольных значений.

Cytochalasin D и Colchicine в концентрации 200 рМ приводили к уменьшению Vmip до 23 % и tMjp до 85 % от контрольных значений. Естественно, что эти изменения определяются действием соединения, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29±0.017 mN) исследуемой ткани не менялясь.

Линейная (Р<0.0001) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mB (slope -0.84; PcO.OOOl) под действием Cytochalasin D и Colchicine в концентрации по 100 jiM через 5 мин аппликации соединения сохраняя линейный характер (PcO.OOOl) начинается с -10 mV (slope -0.58; Рс0.05). При этом, ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала значительно меньшее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 25 mV (по сравнению с 37 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 53 mV (по сравнению с 82 mV в контроле). В области от -5 mV до -10 mV MIP вообще не возникал.

Под действием Cytochalasin D и Colchicine в концентрации по 200 JiM через 5 мин аппликации соединения сохраняется линейный характер (PcO.OOOl) зависимости амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Еш ), однако начинаются они с -20 mV (slope -0.30; Рс0.05). При этом! ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала значительно меньшее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 12 mV (по сравнению с 37 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 24 mV (по сравнению с 82 mV в контроле). В области от -5 mV до -20 mV MIP вообще не возникал.

В контрольных экспериментах в течение 20 минут перфузии препарата физиологическим раствором заметного падения амплитуды MIP не наблюдалось. Внутриклеточная диффузия в течение 20 мин Cytochalasin D и Colchicine с концентрацией по 200 jiM в микроэлектроде резко ингибировала величину MIP уже на 5-ой минуте и кривая зависимости амплитуды MIP от времени диффузии веществ выходила на плато около 12 ± 5 mV (37 ± 3 mV в начале экспериментов) после 5-ой минуты аппликации (Рис.5). Эти эксперименты свидетельствуют, что ингибирование MIP идет до определенных значений (23% от исходного).

Иначе говоря, в наших экспериментальных условиях F-актин и тубулин, принимающие участие в передаче механического сигнала, деполимеризуется, а

возникновение MIP, значительно уменьшенного по амплитуде и длительности связано с иными механизмами трансформации механического сигнала (например осцилляции внутриклеточного кальция).

vm1p imv)

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

О 5 10 15 20 25

I [min]

Рис.5. Зависимость величины амплитуды MIP от времени аппликации соединения в

используемых концентрациях. 1- в электроде только KCl, 2- в электроде 200 рМ Cyiochalasin D и Colchicine.

Таким образом, эксперименты с внутриклеточным введением Cyiochalasin D и Colchicine подтверждают гипотезу об участии микрофиламентов и микротрубочек в формировании биоэлектрической активности фибробластов сердца крысы и свидетельствуют о том, что даже при деполимеризации элементов цитоскелета возможно возникновение значительно редуцированного MIP. То есть, в механизме генерации MIP играют роль и другие факторы, например, внутриклеточные осцилляции кальция, как это было показано ранее.

2.4. Влияние АТР на биоэлектрическую активность фибробластов Если механическое воздействие, вызывающее MIP, определяется микрофиламентами цитоскелета, то стабилизация F-актина под действием АТР должна приводить к увеличению амплитуды MIP.

Для проверки этой гипотизы в экспериментах АТР вводили внутрь клетки путем диффузии из микроэлектродов, где соединение находилось в концентрации 200 piM (п=7) и 2 мМ (п=6).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии АТР, находящегося в микроэлектроде в концентрации 200 рМ. АТР приводил к увеличению VMip до 113 % а tMiP до 107% от контрольных значений. Эти изменения определяются действием соединения, т.к. величины resting force (ImN) и active force (0.29+0.018 mN) исследуемой ткани не менялясь.

Линейная (Р<0.0001) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mB (slope -0.68; Р<0.0001) под действием АТР не меняла характер (Р<0.0001), но уже через 5 мин аппликации соединения выраженно увеличивала угол наклона (slope -0.76; Р<0.0001). При этом, ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала большее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 42 mV (по сравнению с 37 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 76 mV (по сравнению с 68 mV в контроле).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии АТР, находящегося в микроэлектроде в концентрации 2 тМ. Показано, что АТР приводил к увеличению Vmip до 130 % от контрольных значений, но не менял tMip. Естественно, что эти изменения определяются действием соединения, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29±0.018 mN) исследуемой ткани не менялись.

Линейная (PcO.OOOl) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.69; Р<0.0001) под действием АТР не меняла характер (Р<0.0001), но уже через 5 мин аппликации соединения выраженно увеличивала угол наклона (slope -0.93; PcO.OOOl). При этом, ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала значительно большее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP бьиа около 47 mV (по сравнению с 36 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 93 mV (по сравнению с 69 mV в контроле).

Таким образом, эксперименты с внутриклеточным введением АТР подтверждают подтверждают, что стабилизация F-актина микрофиламентов приводит к увеличению амплитуды MIP, и, следовательно, микрофиламенты фибробластов сердца крысы моут быть передаточным звеном механического воздействия на SAC.

2.5. Влияние совместного введения Cytochalasin D и АТР на биоэлектрическую активность фибробластов

Если генерация MIP в ответ на механическое воздействие определяется микрофиламентами цитоскелета, а эффект действия Cytochalasin D у сердечных фибробластов специфически направлен на деполимеризацию F-актина, то предотвращение деполимеризации F-актина одновременной внутриклеточной аппликацией АТР должно приводить к протективному эффекту на Cytochalasin D, что должно выражаться в выраженном уменьшении ингибирования амплитуды MIP.

Для проверки этой гипотизы в этих экспериментах к Cytochalasin D, находящемуся в микроэлектроде в концентрации 200 рМ, была добавлена АТР в концентрации 200 рМ (п=8) или в концентрации 2 шМ (п=9), и эту смесь вводили внутрь клетки путем диффузии из микроэлектрода.

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Cytochalasin D, находящегося в микроэлектроде в концентрации 200 рМ, и АТР в концентрации 200 рМ. Введение в этих концентрациях Cytochalasin D совместно с АТР приводит к уменьшению Vmip только до 84 % от контрольных значений, a tmip вообще не метяется. Эти изменения определяются действием соединений, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29+0.019 mN) исследуемой ткани не менялясь.

Линейная (PcO.OOOl) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.91; Р<0.0001) под действием Cytochalasin D на фоне АТР через 5 мин сохраняла линейный (PcO.OOOl) характер с незначительным уменьшением угла наклона (slope -0.81; Рс0.0007). При этом ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала несколько меньшее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 32 mV (по сравнению с 38 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 77 mV (по сравнению с 87 mV в контроле).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Cytochalasin D, находящегося в микроэлектроде в концентрации 200 рМ, и АТР также в концентрации 2 тМ. Показано, что введение Cytochalasin D совместно с АТР приводит к уменьшению Vmip только до 82 % от контрольных значений, a ímip вообще не метяется. Естественно, что эти изменения определяются действием соединений, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29Ю.019 mN) исследуемой ткани не менялясь.

Линейная (PcO.OOOl) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Еш ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.85; PcO.OOOl) под действием Cytochalasin D на фоне АТР, начиная с -5 mV до -100 mV сохраняла линейный (PcO.OOOl) характер с незначительным уменьшением угла наклона (slope -0.71; Рс0.0007). При этом, ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала несколько меньшее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 31 mV (по сравнению с 38 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 68 mV (по сравнению с 83 mV в контроле).

Таким образом, эксперименты с внутриклеточным введением Cytochalasin D и АТР свидетельствуют о протективном эффекте АТР и подтверждают гипотезу об участии F-актина микрофиламентов в формировании биоэлектрической активности фибробластов сердца крысы.

2.6. Влияние GTP на биоэлектрическую активность фибробластов

Если механическое воздействие, вызывающее MIP, определяется микротубулами цитоскелета, то стабилизация тубулина под действием GTP должна приводить к увеличению амплитуды MIP.

Для проверки этой гипотезы в экспериментах GTP вводили внутрь клетки путем диффузии из микроэлектродов, где соединение находилось в концентрации 200 рМ (п=8) и 2 шМ (п=6).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии GTP, находящегося в микроэлектроде в концентрации 200 рМ. Показано, что GTP приводил к увеличению Vmip до 130 % от контрольных значений и не менял (mip- Естественно, что эти изменения определяются действием соединения, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29±0.018 mN) исследуемой ткани не менялись.

Линейная (Р<0.0001) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.70; PcO.OOOl) под действием GTP не меняла характер (PcO.OOOl), но уже через 5 мин аппликации соединения выражено увеличивала угол наклона (slope -0.98; PcO.OOOl). При этом, ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала значительно большее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 48 mV (по сравнению с 37 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 98 mV (по сравнению с 71 mV в контроле).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии GTP, находящегося в микроэлектроде в концентрации 2 шМ. GTP приводил к увеличению Vmip до 116 % от контрольных значений и не менял tMip. Эти изменения определяются действием соединения, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29+0.018 mN) исследуемой ткани не менялись.

Линейная (PcO.OOOl) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смешения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.76; PcO.OOOl) под действием GTP не меняла характер (PcO.OOOl), но уже через 5 мин аппликации соединения выраженно увеличивала угол наклона (slope -0.87; PcO.OOOl). Ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала большее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин

resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 43 mV (по сравнению с 37 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 85 mV (по сравнению с 75 mV в контроле).

Таким образом, эксперименты с внутриклеточным введением GTP подтверждают подтверждают, что стабилизация тубулина микротубул приводит к увеличению амплитуды MIP. Из этого следует, что микротубулы фибробластов сердца крысы могут быть передаточным звеном механического воздействия на SAC.

2.7. Влияние Taxol на биоэлектрическую активность фибробластов

В экспериментах Taxol вводили внутрь клетки путем пассивной диффузии из микроэлектродов, где соединение находилось в концентрации 200 jiM (п=8).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Taxol, находящегося в микроэлектроде в концентрации 200 рМ. Taxol приводил к увеличению Vmip до 122 % от контрольных значений и не менял tMip. Эти изменения определяются действием соединения, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29Ю.018 mN) исследуемой ткани не менялись.

Линейная (Р<0.0001) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.75; Р<0.0001) под действием Taxol не меняла характер (Р<0.0001), но уже через 5 мин аппликации соединения увеличивала угол наклона (slope -0.86; PcO.OOOl). Ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала большее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 45 mV (по сравнению с 37 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 85 mV (по сравнению с 72 mV в контроле).

Таким образом, эксперименты с внутриклеточным введением Taxol подтверждают гипотезу об участии тубулина микротубул в формировании биоэлектрической активности фибробластов сердца крысы.

2.8. Влияние совместного введения Colchicine и GTP на биоэлектрическую активность фибробластов

Если генерация MIP в ответ на механическое воздействие определяется микротубулами цитоскелета, а эффект действия Colchicine у сердечных фибробластов специфически направлен на деполимеризацию тубулина, то предотвращение деполимеризации тубулина одновременной внутриклеточной аппликацией GTP должно приводить к протективному эффекту на Colchicine, что должно выражаться в выраженном уменьшении ингибирования амплитуды MIP.

В этих экспериментах к Colchicine, находящемуся в микроэлектроде в концентрации 200 рМ, была добавлена GTP в концентрации 200 jjM (п=8) или в

концентрации 2 mM (п=8), и эту смесь вводили внутрь клетки путем диффузии из микроэлектрода.

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Colchicine, находящегося в микроэлектроде в концентрации 200 рМ, и GTP также в концентрации 200 рМ. Введение Colchicine совместно с GTP приводит к уменьшению Vmip только до 86 % от контрольных значений, и tMip уменьшается накже до 86%. Эти изменения определяются действием соединений, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29±0.017 mN) исследуемой ткани не менялись.

Линейная (PcO.OOOl) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.84; PcO.OOOl) под действием Colchicine на фоне GTP через 5 мин сохраняла линейный (PcO.OOOl) характер начиная с -5 mV до -100 mV с незначительным уменьшением угла наклона (slope -0.71; PcO.OOOl). Ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала несколько меньшее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 32 mV (по сравнению с 37 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 70 mV (по сравнению с 82 mV в контроле).

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Colchicine, находящего-ся в микроэлектроде в концентрации 200 рМ, и GTP в концентрации 2 mM. Введение Colchicine совместно с GTP приводит к уменьшению Vmip только до 89 % от контрольных значений, a tMip вообще не уменьшается. Эти изменения определяются действием соединений, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29+0,018 mN) исследуемой ткани не менялась.

Линейная (PcO.OOOl) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.86; PcO.OOOl) под действием Colchicine на фоне GTP через 5 мин, начиная с -5 raV до -100 mV сохраняла линейный (PcO.OOOl) характер с незначительным уменьшением угла наклона (slope -0.75; PcO.OOOl). Ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала несколько меньшее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 34 mV (по сравнению с 38 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 70 mV (по сравнению с 83 mV в контроле).

Таким образом, эксперименты с внутриклеточным введением Colchicine и GTP подтверждают гипотезу об участии тубулина микротубул в формировании биоэлектрической активности фибробластов сердца крысы.

2.9. Влияние совместного введения Colchicine и Taxol на биоэлектрическую активность фибробластов

Если генерация MIP в ответ на механическое воздействие определяется микротубулами цитоскелета, а эффект действия Colchicine у сердечных фибробластов специфически направлен на деполимеризацию тубулина, то предотвращение деполимеризации тубулина одновременной внутриклеточной аппликацией Taxol должно приводить к протективному эффекту на Colchicine, что должно выражаться в выраженном уменьшении ингибирования амплитуды MIP.

В этих экспериментах к Colchicine, находящемуся в микроэлектроде в концентрации 200 рМ, был добавлен Taxol в концентрации 200 рМ (п=6), и эту смесь вводили внутрь клетки путем пассивной диффузии из микроэлектрода.

Таблица 1 иллюстрирует эффект внутриклеточной диффузии Colchicine, находящегося в микроэлектроде в концентрации 200 рМ, и Taxol также в концентрации 200 рМ. Введение Colchicine совместно с Taxol приводит к уменьшению Vmip только до 86 % от контрольных значений, a Imip не меняется. Эти изменения определяются действием соединений, т.к. величины resting force (lmN) и active force (0.29Ю.019 mN) исследуемой ткани не менялись.

Линейная (PcO.OOOl) зависимость амплитуды MIP (Vmip) от величины смещения мембранного потенциала (Ет ) в области от -5 mV до -100 mV (slope -0.89; Р<0.0001) под действием Colchicine на фоне Taxol через 5 мин сохраняла линейный характер (PcO.OOOl) с незначительным уменьшением угла наклона (slope -0.78; PcO.OOOl). Ступенчатая искусственная внутриклеточная гиперполяризация индуцировала несколько меньшее увеличение амплитуды MIP по сравнению с контрольной регистрацией на фоне постоянных величин resting force и active force. Так, на уровне -50 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 33 mV (по сравнению с 38 mV в контроле). А на уровне -100 mV гиперполяризации амплитуда MIP была около 75 mV (по сравнению с 85 mV в контроле).

Таким образом, эксперименты с внутриклеточным введением Colchicine и Taxol подтверждают гипотезу об участии тубулина микротубул в формировании биоэлектрической активности фибробластов сердца крысы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что методами микроэлектродной техники на целом бьющемся препарате предсердия крысы нами была зарегистрирована биоэлектрическая активность фибробластов, которые не будучи электровозбудимыми, являются механосенситивными.

Одним из внутриклеточных кандидатов в посредники передачи механического сигнала на SAC является цитоскелет. Хотя роль цитоскелета достаточно хорошо изучена

для ряда клеток, многие вопросы передачи механического сигнала на SAC у сердечных фибробластов оставались открыты. Представленная работа демонстрирует, что передача механического сигнала на SAC у фибробластов сердца в значительной мере осуществляется при помоци F-актина микрофиламентов и тубулина микротубул. Однако, в процессе генерации MIP существует и еще одни механизм (вероятно, осцилляции внутриклеточного кальция).

ВЫВОДЫ

1. В зоне синусного узла сердца крысы выявлены электроневозбудимые, но механосенситивные фибробласты. Величина их мембранного потенциала равна -22+2 mV, а величина входного сопротивления мембраны 510± 10 МП. Гиперполяризация мембраны приводит к увеличению амплитуды MIP, вызванных спонтанными сокращениями ткани, а деполяризация приводит к их уменьшению вплоть до полного прекращения возникновения на уровне потенциала реверсии от -5 mV.

2. Внутриклеточное введение Cytochalasin D или Colchicin демонстрирует, что ингибирование MIP при стандартном мембранном потенциале длится разное время, определяемое концентрацией соединений, но идет только до определенных значений (44% и 59% от исходных уровня соответственно), что свидетельствует о полной деполимеризации F-актина или тубулина, принимающих участие в передаче механического сигнала. Действие Cytochalasin D на MIP более выражено чем Colchicin, т.е. микрофиламенты являются более важной структурой для передачи механического сигнала на механосенситивные ионные каналы, чем микротубулы.

3. Совместное введение в фибробласты Cytochalasin D и Colchicin демонстрирует, что в пределах используемых концентраций процесс ингибирования MIP при стандартном мембранном потенциале длится разное время, но идет только до определенных значений (32% от исходных уровня), что свидетельствует о полной деполимеризации F-актина и тубулина, принимающего участие в передаче механического сигнала.

4. Внутриклеточное введение АТР демонстрирует, что стабилизация F-актина приводит к увеличению амплитуды MIP. При этом, амплитуда МЕР увеличивается сходно и при концентрации АТР, равной 200 рМ (до 127%), и при концентрации АТР, равной 2 гаМ (до 113%). Следовательно, микрофиламенты фибробластов сердца могут быть передаточным звеном механического воздействия на механосенситивные ионные каналы.

5. Внутриклеточное введение Cytochalasin D и АТР свидетельствует о том, что АТР выраженно уменьшает эффект действия Cytochalasin D на MIP, и этот эффект не зависит от используемой концентрации АТР. При концентрации АТР 200 рМ амплитуда MIP (на уровне -50 mV) через 5 мин диффузии уменьшается только до 81% от исходных значений, а при увеличенной до 2 шМ концентрации АТР (до 84%). Это свидетельствует о

протективном эффекте ATP и подтверждают гипотезу об участии F-актина микрофиламентов в формировании биоэлектрической активности фибробластов сердца.

6. Внутриклеточное введение СТР или Taxol демонстрирует, что стабилизация тубулина микротубул приводит к увеличению амплитуды MIP. Амплитуда MIP (на уровне -50 mV) увеличивается при концентрации СТР, равной 200 цМ и 2 шМ до 130% и 113% соответственно. Под действием Taxol амплитуда MIP (на уровне -50 mV) увеличивается до 122% от исходных значений. Оба соединения увеличивают MIP на близкие величины, следовательно, в обоих случаях полимеризации подверглось сходное количество тубулина. Следовательно, микротубулы фибробластов сердца могут быть передаточным звеном механического воздействия на механосенситивные ионные каналы.

7. Одновременное внутриклеточное введение Colchicine и GTP демонстрирует, что СТР выражение уменьшает эффект действия Colchicine. При концентрации GTP 200 цМ амплитуда MIP (на уровне -50 mV) уменьшалась только до 86%, а при концентрации GTP 2 шМ до 92%. Эксперименты с внутриклеточным введением по 200 цМ Colchicine и Taxol свидетельствуют о том, что и Taxol выраженно уменьшает эффект действия Colchicine. Амплитуда MIP (на уровне -50 mV) уменьшалась только до 86%. Эти эксперименты подтверждают гипотезу об участии тубулина микротубул в формировании биоэлектрической активности фибробластов сердца.

8. Представленная работа демонстрирует, что передача механического сигнала на механосенситивные ионные каналы у фибробластов сердца в значительной мере осуществляется при помощи F-актина микрофиламентов и тубулина микротубул.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Казанский В.Е., Киселева И.С., Камкин А.Г. «Роль микрофиламентов цитоскелета

сердечный фибробластов в возникновении механоиндуцированных потенциалов».

Вестник Российского Государственного Медицинского Университета 2000, N 5, с.

16-24.

2. Камкин А.Г., Киселева И.С., Казанский В.Е. «Практикум по общей физиологии

возбудимых тканей». Москва, 2МОЛГМИ, 1992, 174 страницы.