Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение Gо-белка из мозга быка и изучение его свойств

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение Gо-белка из мозга быка и изучение его свойств"

РТ6 ОД

I 7 тп с-зз ■

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ

БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

ИНСТИТУТ

На правах рукописи ГАРЕЕВА АЛЬФИЯ БАХТИЕВНА.

ВЫДЕЛЕНИЕ во-БЕЛКА ИЗ МОЗГА БЫКА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО СВОЙСТВ БИОХИМИЯ ОЗ. 00. 04.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА - 1993

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель

член-корр. РАН

доктор химических наук

профессор Северин Е.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Р.Елаев кандидат биологических наук Е.А.Перфирьева

Ведущая организация -

Всероссийский Эндокринологический Научный Центр Российской Академии Медицинских наук

Защита состоится "_" _ 1993 г. в __часов на

заседании Специализированного Совета К 084.35.02. при Башкирском государственном медицинском' институте по адресу: 450000, г. Уфа, ул, Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БГМИ (450000, Уфа,. Ленина, 3)

Автореферат разослан

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук профессор

Э.Г.Давлетов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Механизмы передачи информации в живых

системах основаны на едином принципе. Взаимодействие сигнала с

рецептором приводит к конформационной перестройке и изменение

функции мембранных белков-посредников, а результатом этого является

биохимическая модификация молекул-эффекторов, через которые

формируется ответ биологической системы. йТР связывающим белкам

(в-белкам) в этой цепи принадлежит роль посредников в осуществлении

контактов между рецепторами и эффекторными системами

Известно несколько.типов в-белков различающихся функционально и

достаточно хорошо изученных. вТР-свяэывающив белки имеют олпг

омерную структуру типа а/Эу. Список членов семейства быстро

увеличивается и на данный момент в нем различают двенадцать

вариантов а-субъединиц, четыре варианта 0-субъединиц и не менее

трех вариантов у-субъединиц. Высокая степень гомологии

а-субъединиц, в основном, определяющих функциональную индиви

дуальность (5-белков, требует разработки высокочувствительных и

специфичных методов их определения в клетках и тканях, к которым

относятся иммунохимические методы.

выбелок, составляющий около 2% всех белков плазматических

мембран мозга, также относится к семейству йТР-связывающих белков.

Функции этого белка в настоящее время четко не определены. В

частности, одни исследователи считают, что й0-белок принимает

участие в регуляции К+-каналов в клетках ЦНС, другие показывают на

„ 2+

его участие в регуляции потенциал-зависимых Са -каналов.

В последнее время в литературе появились данные о том, что выбелок может взаимодействовать с цитоскелетом, что играет определенную роль в регуляции трансмембранной передачи гормо нального сигнала за счет ограничения подвижности белка. Однако этот процесс не изучен.

Таким образом, использован«« иммунохиииче ских подходов на

основе моноклональных антител (МКА), позволяющих идентифицировать

в -белок в нервной ткани, и значительно расширить исследовательские ° о

возможности, а также изучение способности в0~белка взаимо действовать с элементами цитоскелета, углубляющее представления о функционированиии <»0-белка, представляются своевременными и актуальными.

Цель работы заключалась в изучении взаимодействия в0~белка

с цитоскелетом с использованием иммунохимических методов. В работе предусматривалось решение следующих задач:

1. отработка Метода выделения высокоочищенного препарата GQ-CejiKa,

2. изучение свойств , и эпитопной специфичности МКА tf а-субъединице Gq- белка (G^).

3. изучение участка связывания 0оа с комплексом fly при помощи МКА,

4. исследование взаимодействия 60~белка с элементами цитоскелета.

5. выявление * белков плазматических мембран мозга, способных взаимодействовать с а-субъединицей 60~белка,

. Научная новизна работы. В ходе настоящей работы были

подобраны условия для выделения в0-белка за 4 хромотографические стадии. Изучены свойства МКА, полученных к , вм из мозга быка. Показано, что • полученные клоны гибридом секретируот МКА, взаимодействующие с различными антигенными участками GQa. МКА клона 1D2 взаимодействуют с N-концевой областью GQa. Антигенные участки для МКА клонов 3D9, 1Н6 и 2ЕЗ располагаются в С- концевой области молекулы. С помощью МКА клона 1Н6 выявлен участок принимающий

участие во взаимодействии с комплексом 07, расположенный в С-концевой области GQa.

Изучены механизмы, принимающие участие в регуляции взаимодействия GQa с цитоскелетом. При исследовании взаимодействия очищенной Goa с элементами цитоскелета клеток линии MDBK было

установлено, что свободная в-субьединнца может непосредственно взаимодействовать с цитоскелетом. Эффективность взаимодействия GQa с цитоскелетом зависит от типа гуанилового нуклеотида, связанного с а-субъединицей. GDP-0-S значительно увеличивал сродство Goa к цитоскелету по сравнению с негидролизуемым аналогом GTP - GppNHp. ИнгиСирование адсорбции G^. наблюдаемое в присутствии АТР, связано с изменением свойств цитоскелета. Негидролиэуемый аналог АТР, АррННр, подобным действием не обладал, что указывает на участие в э^ом процессе фосфотрансфераэных реакций. Действие АТР может быть в значительной мере обращено путем активации протеинкиназы С форболмиристатацетатом.

Практическое значение работы. Описан метод выделения в0~белка, позволяющий получить высокоочшценный препарат белка за 4 хромотографические стадии. Получены культуры гибридомных клеток, продуцирующих МКА к разным эпитопам GQa. Проведены исследования по изучению взаимодействия'GQe с цитоскелетом. Полученные в работе данные расширяют представления о функционировании GQ-6emH.

Апробация работы. Результаты работы доложены на коллоквиуме проблемной лаборатории "Химии ферментов" биологического факультета ИГУ и на совместном коллоквиуме департамента биотехнологии и лаборатории "Иммунобиотехнологии" Всероссийского Научного Центра Молекулярной Диагностики и Лечения.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы. '

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из

введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 105 страниц машинописного текста, 4 таблицы и 21 рисунка. Список литературы включает 156 источников.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ о Этапы получение моноклональных антител.

Полностью процедура получения МКА включает в себя следующие этапы: иммунизация животных, подготовка клеток к слиянию, слияние, отбор клонов, продуцирующих специфические антитела, клонирование и реклонирование, препаративная наработка МКА в асците, содержащем антитела и очистка антител.

Иммуноферментный анализ.

На 96-луночной плашке сорбировали антиген, внося в каждую лунку по 100 мкл раствора белка (10 мкг/мл) Б PBS и инкубировали в течение ночи при 4°С. после трехкратной отмывки PBST, в лунки вносили по 100 мкл PBS. Каждому клону соответствовал один ряд лунок по горизонтали. Разведение антител всех клонов проводили в соотношении 1/3. После часовой инкубации при 37°С и отмывки в PBST вносили по 100 мкл конъюгата разведенного в PBST в 5000 раз. После инкубации в течение одного часа и отмывки добавляли в каждую лунку по 100 мкл субстрата. После остановки реакции измеряли поглощение на 'фотометре при 492 нм.

Для изучения взаимного расположения антигенных участков для антител клонов 3D9, 1Н6 и 2ЕЗ в третичной структуре Goa-одновременно с раститровкой антител в лунки добавляли по 2 мкл конъюгата антител клона 3D9 с пероксидазой, полученного периодатным митодом. Далее ИФА проводили как обычно.

При изучении взаимодействия с a-субъединицы с ßr комплексом, одновременно с раститровкой антител в лунки добавляли по 4 мкл препарата комплекса ßr следующим образом: в первую лунку ряда антитела клонов 3D9 и 1Н6 добавляли в соответствии 1/100, а антител;! клонов 1D2 и 2ЕЗ - в соответствии 1/10. В последующих лунках разведение антител всех клонов проводили в соотношении 1/3.

Препаративная наработка моноклональных антител.

Мышам линии Balb/c внутрибрсшинно вводили по 0,5 мл пристана.

Через 10 дней внутрибрюшинно вводили гибридомные клетки

Л 7

определенного клона в количестве 5 10-5 10 . Через 20 дней собирали шприцом асцитическую жидкость и центрифугировали при 800 об/мин. Супернатант, содержащий моноклональные антитела переносили в пробирки и хранили при -4 С для последующей обработки.

Выделение и очистка моноклональных антител. Для получения грубой иммуноглобулиновой фракции проводили высаливание белков сульфатом аммония. Для более тонкой очистки антител, асциты наносили на колонку с протеин-А сефарозой, урав повешенную буфером, содержащим 1,5 М глицин и 3 М MaCl (рН 8,9). Антитела элюировали буфером, содержащим 100 мМ цитрат натрия (рН 4). Оптическую плотность определяли с помощью спектрофотометра.

.Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофоретическое разделение проводили в системе Лэммли (Laemly, 1976), используя 4% концентрирующий гель, и 10% разделяющий гель. В образцы белков, перед нанесением на форез, добавляли разрушающую -смесь (33 мкл смеси на 100 мкл пробы). После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры (иммуноблоттинг). Перенос проводили в ячейке для полусухого переноса.

Интенсивность окраски полос определяли на спектрофотометре Hitachi 557 /Япония/.

Ограниченный трипсинолиз белка G Ограниченный трипсинолиз Со~белка осуществляли в среде содержащей 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2> 1 мМ ЭДТА и 0,1% Луброл РХ. Соотношение трипсин/белок варьировал от 1/500 до 1/25, время инкубации - 60 мин. или 2 часа. Продукты протеолиза разделяли методом электрофореза в системе Лэммли, используя 15% разделяющий гель. Иммунореактивные пептиды выявляли методом иммукоблотинга.

5

Получение препарата цитоскелета.

Получение препарата цитоскелета из клеток линии MDBR и HgA (Osborn., Weber., 1977) Клетки промывали PBS, после чего проводили . солюбилизацию клеточных мембран буфером, содержащим 10 мМ Трис, 140 мМ NaCl, 10 мМ MgClg, 0,5% Тритон Х-100, pH 7,5 в течение 10 мин. при комнатной температуре. Несолвбилизированный материал дважды промывали буфером, не содержащим Тритон Х-100. Полученный препарат цитоскелета суспендировали в том же буфере и хранили при -70°С. Биотинилирование GQ.

выбелок (1мг/мл) биотинилировали в среде следующего состава:

10 мМ NaHC03 (рН 8,0), 100 мМ NaCl, 10 кЫ MgClg, 20 MU AlClg, 6 мМ

NaF, 0,1% Луброл РХ. 1 мг/мл биотина NX при комнатной температуре

в течение 4 часов. Непрореагировавший биотин НХ и активаторы

Со-белка удаляли диализом против 10 мМ Трис НС1 (рН 7,5), 10 мМ

MgCl„. За время инкубации с биотином NX и диализа, способность 6 ¿ 3 оа

связывать [ HlGppNHp снижалась на 15-20 %.

Для выявления белков, способных взаимодействовать с Goa<

плазматические мембраны из мозга быка разделяли методом

ДСН-электрофореза. Белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры

<<Bio-Rad>>. Фильтры блокировали в среде содержащей 10 мМ Трис НС1

(рН 7,5), 100 мМ NaCl, 5%-ный бычий сывороточный альбумин (Serva) и

0,1% Твин 20. Заблокированные фильтры преинкубировали с

биотиншшрованой Goa (bt-GQa) в концентрации 1 мкг/мл в среде

следующего состава: 10 мМ Трис НС1 (рН 7,5), 10 мМ NaCl, 10 мЫ

MüCl2, 5% БСЛ, 0,5°/. Луброл РХ, 0,1 мМ GppHHp, либо GDP-0-S, в

течение 2 часов при комнатной температуре. Фильтры отмывали 5 раз

по 10 мин. раствором, содержащим 10 мМ Трис НС1 (рН 7,5), 100 мМ

NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,1% Луброл РХ. bt-GQa выявляли с помощью

конъюгата авидин-пероксидаза фирмы <<Dakopatts>> .

Иммунопреципитация тубулина.

6

Цитозольную фракцию мозга получали путем гомогенизации клеток мозга в среде, содержащей 10 мМ Трис-Н1 (рН-7,5), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 и центрифугировали при 12000g в течение 10 мин. К 0,5 мл супернатанта (1 мг/мл.) добавляли 50 мил. протеин А- сефарозы и инкубировали 15 мин. при 4°С. После центрифугирования осадок отбрасывали, а к 0,5 мл цитозольной фракции мозга добавляли 10 мкг антител (поликлональные антитела барана <<Soythern Biotechnology Associate. Inc>>) и инкубировали 2,5 часа при 4°С. В пробу добавляли 50 мкл Протеин А-сефарозы и инкубировали 1 час при 4°С. Осадок трижды промывали тем же буфером К осадку добавляли разрушающую смесь, белки разделяли методом электрофореза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение Gg-белка.

Методика выделения основного GTP-связывающего белка была предложена Sternweis и Robishaw в 1984 году. Выделение по этому методу GQ-6enKa занимает неделю. Нам удалось модифицировать метод Sternweis и Robishaw, используя на последней стадии очистки белка, колонку с ДЭАЭ-Тойоперлом 650S, в соответствии с методом Katada (Katada et al., 1984). Таким образом, удается получить высоко очищенный препарат во-белка за 4 хромотографические стадии.

Плазматические мембраны мозга получали в соответствии с методом Sternweis и Robishaw. GTP-белки экстрагировали из плазматических мембран, суспендированных В буфере А (20 мМ Трис НС1, рН 8, t мМ ЭДТА, 1 мМ DTT) в концентрации 6-10 мг/мл, 1% холатом натрия при 4°С в течение 60 мин. Несолюбилизированный материал удаляли при 105000 g в течение 60 мин. при 4°С. Надосадочную жидкость, объемом около 500 мл, наносили на колонку с DEAE-сефарозой. Элюцию GTP-белков осуществляли буфером А, содержащим 1% хслат натрия и 150 мМ NaCl, G-белки выходили одним симметричным пиком (рис. 1А). Фракции, содержащие вТРазную активность объединяли, разбавляли

7

скорость элвции 200 мл/час, объем фракций 10 мл. 1 Б. Профиль элвции СТР-белков с октил-сефарозы (2,5 х 20 см), скорость элюции 200 мл/час, объем фракций 10 мл. 1 В. Профиль элюции СТР-белков с ультрогеля АсА34 (5 х 1 м), скорость элюции 30 мл/час, объем фракций 8 мл.

1 Г. Профиль элюции СТР-белков с СЕАЕ-Тойоперла 6503(2,5 х 10 см), скорость элюции 40 мл/час, объем фракций 2,5 мл.

О поглощение при 280. ■ вТР-связывающая активность.

8

Зуфером Л, содержащим ПаС1, до концентрации холата 0.25Х и наносллл колонку с октил-сефарозой (2,5 х 20 см). ОТР-белки эл^пр1) вались в виде одного симметричного пика при концентрации холата ■эколо 0,7% (рис . 1Б) .

Фракции, содержащие ОТР-евязывавдуд активность концентрировали Ю 10 мл. Белок наносили на колонку с ультрогелем ЛсА34 I5 см х 1 -1) С-белки элюировались в виде одного пика, соответствующе го збъему выхода белков с мол. массой около 8000 дальточ (рис фракции, содер^ач^ие О-белнн, объединяли, и наассили на колонку 1ЭАЭ-Тойоперлом 6503 (2,5 х 10см). урааноле^еннув буфером А, гаащим 0,6 % луброл РХ и 25 мН НаС1. Элюцию белков проводили линей

готовленном на буфере А, содержащем 0,6% луброл РХ и 5С0 мМ

1аС1. етр-белки элюировались двумя пиками (рис. 1Г). Первый пик

¡одержал С^-белок, а второй С Чистота выделенного белка была выше

'5%, выход составлял 36%. Субъединпцы С„-белка разделяли на

о

)енил-Сефарозе (Ног№ир еЬ а1., 1983). Локализация антигенных участков в первичной последовательности В нашей лаборатории были получены 15 клонов гибридом, МКА к

.-(чЛтОПт.».!.. О. -Лпууч и- »С , , ,Г, .

, стлпчагщнхсл выел:-".: 1 пг'.'Л'/ ньл : ■и'ш.чь»^ ::' -: .й.п опрелеленл» антпгекч:-,!'' у-:"г- ^ г-^рр!!Ч»г':Л П'л.лел--

ельл. лтл л псполыовал:' -.1 >г: <-■ т>~ч'" л>;1;"1-

^ иолирептидг! оаалелллл уе"ллу ЛСН--.злектрлго! е : 1 рч ли " лтллм геле Л ля аы>1зле:-:;<л п^гтил"^ ''У л-

сзчлч метод иммуноблот ТИ!» - 1

»заимел?и? м ач^лт-лл : V. 2 тгл 'Г!М'-■

'ептилами а-субъединицы . плл'.";ел1 ".лг":л,'!л,чл картина Кал вчл-

:з рисунка 2 Б, антитела клона 309 взаимодействовали с лептидами с

;;) кГ)а. Этот набор пептидов был получен в результате инкубации во и трипсином при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение 60 мин. Как показано на рис. 2 В, при увеличении времени инкубации с трипсином до двух часов, наблюдалось появление иммунореактивного пептида с нол. массой 12 кйа, этот пептид, вероятно, образуется в результате дальнейшей деградации пептидов с мол. массами 17, 16 и 15 кОа. Как следует из рисунка 2 Г, при увеличении концентрации трипсина до соотношения трипсин/белок 1/25 и времени инкубации 2 часа, пептид с мол. массой 12 кБа оказывался единственным продуктом деградации в0, содержащим антигенный участок для антител клона Зй9.

Как показано на рис. 3 Б, взаимодействовали с пептидами с мол. массами 37, 32, 17, 16 и 15 кОа - время трипсинолиза 60 мин, соотношение трипсин/белок 1/500. На рис. 3 В. показано, что пептид с мол. массой 12 кОа, образуедийся в ходе гидролиза а-субъединицы при соотношении трипсин/белок 1/25 в течение 2 часов, на взаимодействовал с антителами клона 1Н6. По-видимому, деградация пептидов с мол. массами 17, 16 и 15 кОа сопровождается разрушением антигенного участка для антител клона 1Н6, лежащего в области груптического расщепления этих полипептидов.

А Б . В Г А Б В Г

- 43 --43

и 53 ^

= -зэ в — 30

20 - 20

= 5 14 ~ ® - - И

Рис. 2 Рис. 3

10

Рисунок 2. Иммунореантивные пептиды, взаимодействующие с антителами

клона 309. Гидролиз белка трипсином осуществляли при соотношешч" трипсин/белок 1/500 в течение 60 мин. (Б), при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение 180 мин (В), при соотношении трипсин/белок 1/25 о течение 120 мин (Г) Л - контроль Рисунок 3 Иммунореактавные пептиды, взаимодействующие с антителами клопа 1Н6 Гидролиз белкя трипсином осуществляли при соотношении трипсин/белок 1/500 п течение 60 мин. (В), при соотнои.енги трипсин/бдпок 1/500 п тсчсттп" мин СБ), при соотноиенр :

трипсвп/оолок 1/25 в течонич 120 иг«-« (Г) Л - контрочь

Из рисунка 4 Б видно, , что антитела клона 2ЕЗ взаимодействовали с пептидами с мол. массами 37 и 20 кИа и тремя пип-тип»».« « •—» наосс" 3 кВа. «аннив иммуноипнктиячм» пвптипм п^-у^—-

при инкубации с трипсином при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение 60 мин. На рис. 4 В показано, что увеличение концентрации трипсина, до соотношении трипсин/белок 1/100, время инкубации 60 мин. приводило к исчезновению пептидов с мол. массами 37 и 20 .КГ/а. Как следует из результатов представленных ранее на рис. 2 Б и 3 В, полипептиды с мол. массой около 5 кРа появляются одновременно с пептидный 17, 16 и 15 кОэ, т.о. они образуются при деградация

Пептидами с мол. массами 34 и 20 кВа. Эти фрагменты были получены

щуа расщеплении С^-белка трипсином в соотношении трипсин/белок 1/5С-0, в течение 60 мин. Как показано на рис. 5 В, эти антитела не взаимодействовали с пептидом с мол. массой 37 кИа, полученным при гздролизе 0ОД. активированной СТР—зг-й при соотношении трипсин/белок 1/500, в течение 60 мин. В этих условиях расщепление происходит в И-концевой области Соа с образованием двух пептидов с мол. массами 37 и 2 кОа (Поп еЬ а1., 1986). Из результатов приведенных здесь,

разрушением

В

• 43

' • - 30 20

14

_ --- 5

Гнсунок 4. Иммунореактивные пептиды, взаимодействующие с антителами клока 2ЕЗ. Гидролиз белка трипсином осуществляли при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение 60 мин. (Б), при соотношении тр;т.син/белок 1/100 в течение 60 мин. (В), А - контроль. Рисунок 5. Иммунореактивные пептиды, взаимодействующие с антителами •лонг 1Р2. Гидролиз белка трипсином осуществляли при соотношении . р).';1снн/(>елок 1/500 в течение 60 мин. (Б), гидролиз а-субъединицы гтизлроьлнной СТР-т-'Э при соотношении трипсин/белок 1/500 в 60 минут. А - контроль Таким образом, ИКА взаимодействуют с различными антигенными

расщепление Соц в этой области сопровождается антигенного участка для антител клона Ю2.

С" 3 д Б

43

<з - <а

- - 30 —

_ ___го

- 14

12

участками G ■ МКА клона 1D2 - с N-концевой областью Goo¡. Анало: ип между данными, полученными для антител клона 2ЕЗ и литературными данными позволяет сделать вывод, что антигенные участки для !1НА клонов 3D9, 1Н6 и 2ЕЗ находятся в С-концевой области молекул.

Расположение антигенных участков Для изучения расположения антигенных участков для антител клонов 3D9, 1Н6, 2ЕЭ в третичной структуре (?оа использовали иетпд ИФА. Изучалась конкуренция МКА клона 3D9 с ферментной моткой с кемеченными антителами клонов 3D9, 1Н6, 2ЕЗ за связывание с антигеном. Было показано, что эффективная конкуренция наблюдал-.сь при использовании антител клонов 3D9 и 1К6 МКА клонов 2ЕЗ не ь-w.i курировали с МКА клона 3D9 (данные не приведены) .

Вероятно, что МКА клопов 3D3 ц 1Ü6 взаимодействуй! с соседними участками G , тпкжо по исключается то, что участии взаимодействия с антителами клонов 3D9 и 1Н6 перекрываются. Далее мы исследовали влияние комплекса /3? на связывание МКА с GQa.

Изучение участка связывания а-субъединицы с комплексом с помощью моноклональных антител. Относительно участка GQa, взаимодействующего с комплексом fiy, в литературе существуют противоречивые мнения. На следующих рисунках приведены результаты экспериментов, в которых исследовалось влияние комплекса на связывание MICA с G Как и в предыдущем

эксперименте, где изучалось расположение антигенных участков, основным методом исследования был ИФА, где одновременно растнтровкой антител клонов 3D9, 1Н6, 2ЕЗ н лунки планш'.г. добавляли препарат комплекса (¡г

На рисунке 6 представлены данные, полученные для антител k.íoh-i 1Н6. Здесь кривая титрования значительно сдвигается в сторону меньших разведений антител в присутствии /3jr Т.е. fli эффективно конкурирует с антителами клона 1Н6 за связывание с G

IV

Для антител клона 3D9 было показано следующее. Из рис. 7 видно,что эффективность влияния комплекса fly, на связывание с G

оа

на порядок ниже, чем в случае антител клона 1Н6. Учитывая, что МКА клонов 3D9 и 1Н6 взаимодействуют с соседними участками G, приведенные результаты могут служить косвенным доказательством того, что детерминанта антител клона 1Н6, располагается в области взаимодействия GQa с комплексом Рг■

OS

V,

'/¿VS '/¿,s? '/"fee

Рис. 6

V,

'/l*

'/¿•<■3 '/г/хг 'у/?- с*

Рис. 7

Рисунок 6. Влияние комплекса субъединиц (3? на связывание антител клона 1Н6, в отсутствии /О / и в присутствии рг /Ь /. Рисунок 7. Влияние комплекса субъединиц ру на связывании антител клона 303, в отсутствии / о / 11 в присутствии рг /О/.

Из рисунка 8 следует, что МКА клона Ю2 не конкурировали с комплексов р?. По литературным данным, Н-концевой пептид О ^ мокет взаимодействовать с комплексом раг. Результаты, приведенные на рисунке не согласуются с эти»; предположением. Н-концевач часть О не принимает участия в связывании с комплексом р7 Пр:; изучении влияние комплекса ру на свпзЕшание

2СЗ

G _

бело пока?<ч<э

дующее. Как видно

антител

графикп 14

приведенного на рисунке 9, кривая титрования в присутствии , значительно сдвигается в сторону больших разведений антител. Из

литературы известно, что С-концевой пептид GQa принимает участие во взаимодействии с рецептором, при этом сродство рецептора к <5 резко возрастает в присутствии комплекса Эт (Birnbaumer, 1987). Результаты, приведенные на рисунке 9, указывают на то, что связывание Goa с антителами клона 2ЕЗ, сильно увеличивается в присутствии комплекса (Зу, по-видимому, за счет увеличения доступности антигенного участка для МКА. Следовательно, конформа пионные изменения С-концевого фрагмента G могут быть причиной

Рисунок в. Влияние комплекса субъаднниц ру на связывание антител клона 1D2 , в отсутствии / О/ и н присутствии fiy

1 ;««уиок 9 Влияние комплекса субъединиц |3у на связывание антител глона 2K:î , в отсутствии /О / и в присутствии fis /©/.

Таким образом, вероятно С-понец принимает участие в связывании рецептора и, возможно, предположение, что взаимодействие антител клона 2ЕЗ с С-концевым фрагментом а-субъединицц моделирует процесс, происходящий при взаимодействии а-субгединицы с рецептором

Изучение взаимодействия субъединшщ G -белка с ццтоскелетом.

Элементы цитоскелета мозга получали путем солюбилизации плазматических мембран в среде, содержащей 10 мМ Трис НС1 (рН 7,5) 100 мМ НаС1, 10 мМ MgCl, 0,5% Тритон Х-100 в течение 10 мин. при >с"*шатной температуре. Несолюбилизированный материал трижды промывали буфером, не содержащим Тритона Х-100. Как показано на рисунке 10 Б, элементы цитоскелета содержали около 30% Еоа> содержащегося в плазматических мембранах.

Аналогичные взаимодействия были ■ обнаружены в клетках нойробластомы Ы2А (данные не приведены)

---- Боа

Рисунок 10 . Взаимодействие с элементами цитоскелета мозга. А -

в составе плазматических мембраны мозга (40 мкг белка). Б -

в составе цитоскелета полученного из плазматических мембран.

Эффективность взаимодействия 0оа с элементами цитоскелета

изменялась в зависимости от типа гуанилового нуклеотида,

присутствующего в среде инкубации. Гуаниловые нуклеотиды, как

известно, вызывают значительные изменения конформации &ос£, которые

могут определять эффективность взаимодействия с цитоскелетом.

преинкубировали с С0Р-р-5 (10 мМ) , либо с СррШр (10 мМ) при 30°С

в течение "45 мин. Несвязавшиеся гуаниловые нуклеотиды удаляли

на колонке с Биогелем Р-30. Полученные препараты сс-субъединицы

добавляли к элементам цитоскелета, преинкубировали смесь в тече

ни? 30 мин. при 30°С. Элементы цитоскелета осаждали центри

фугированием. Как показано на рис. 11 А и Б, степень адсо

рбции О з комплексе с 60Р-|3-3 была значительно выше, чем оа

степень адсорЗцпп Соа в комплексе с ЕррМНр, Полученные данные

16

указывают на то, что конформационные изменения, происходящие при активации а-субъединицы СррЫНр, значительно снижают ее сродство I; элементам цитоскелета.

А "Б " В

О

120

120

йррШ1р. >

Рисунок 11 . Влияние гуаниловых нуклеотицов на взаимодействие с элементами цитоскелета мозга. А - исходное содержание Соа в составе цитоскелета (20 мкг белка плазматических мембран). Б - содержание йоа в составв цитоскелета после преинкубации плазматических мембран (20 мкг белка) с 0,1 мМ СОР-р-Б, в течение 120 мин. В - содержание Йоа в составе цитоскелета после преинкубации плазматических мембран с 0,1 мМ СррКНр, в течение 120 мин.

По имеющимся данным (МсАгс11е еЬ а1., 1988), негидролизуемые аналоги ОТР вызывают выход из плазматических мембран. На рис 13 приведены результаты экспериментов, в которых оценивался выход йоа из плазматических мембран мозга под действием вррИНр. Преинкубация 0ои с аналогами БТР вызывала незначительный выход ич

плазматических мембран (около 6%). Присутствие в надосадочной

жидкости в начале инкубации, по-видимому, связано с неполный осаждением мембран при центрифугировании.

Таким образом, различия в степени адсорбции 6 . наблюдаемые в присутствии ЭррИНр и ОБР-Р-Б, не связаны со способностью СррМЛр

+

освобождать воа из плазматических мембран. Они отражает различия в сродстве йоа к элементам цитоскелета, возникающие в зависимости от типа нуклеотида, присутствующего в среде инкубации. О 15 30 60 120 МИН

Go«

Рисунок 13 . Влияние времени■ преинкубации плазматических мембран

мозга с 0,1 мМ СррЛНрна выход из мембран Соа'

Увеличение времени адсорбции 6оа на элементах цитоскелета,

наблюдаемые при инкубации плазматических мембран с гуаниловыми

нуклеотидами, может быть прямым следствием связывания нуклеотида.

Изучение зависимости степени адсорбции воа от времени преинкубации

плазматических мембран лозга с вррИНр показало,что значительное

увеличение степени адсорбции в наблюдалось к 60 мин. преинкубации 3

Связывание же [ HlGppNHp с Goa достигало равновесия к \30 мин. инкубации.

Таким образом, данные указывают на то, что увеличение степени адсорбции GQa на элементах цитоскелета не является прямым следствием связывания гуанилового нуклеотида с G . По-видимому, в регуляции взаимодействия GQa с цитоскелетом принимают участие дополнительные, не идентифицированные процессы.

Изучение этого вопроса показало, что в регуляции взаимодействия GQ-6eflKa с цитоскелетом принимает участие АТР. Преинкубация плазматических мембран в среде, содержащей АТР и GDP-p-S В) или АТР и GppNHp , вызывала снижение степени адсорбции

Goa. Замена АТР на негидролизуемый аналог AppNHp (100 мкМ) предотвращает снижение степени адсорбции Goa-Таким образом, в регуляции адсорбции GQa на элементах цитоскелета принимают участие АТР-зависимые реакции.

18

На следующем рисунке 1.4 Д и Е представлены доказательства в пользу участия киназы С в регуляции взаимодействия G^-белка с цитоскелетом. При преинкубации плазматических мембран мозга в , присутствии АТР (100 м11) и ингибитора киназы С Н-7 наблюдалось дальнейшее снижение степени адсорбции GQa (рис. 14 Д). В присут ствии активатора киназы С, ФМА, степень адсорбции GQa значительно возрастала ( рис. 14 Е). Таким образом, активация киназы С в значи тельной мере моделирует действие АТР.

А Б' В ГДЕ'

GDP-g-S GppNHp AppNHp Н-7 РМА

АТР — - + - -I" -»

Рисунок 14. Влияние киназы С на взаимодействие GQa с элементами цитоскелета клеток мозга быка. А,В - взаимодействие GQa с цитоскелетом в присутствии 0,1 мМ GTP-(3-S, В, Г - влияние App(NH)p и АТР на взаимодействие GQa с цитоскелетом клеток мозга быка. Д. влияние ингибитора киназы С Н-7 на взаимодействие Go(j с элементами цитоскелета в присутствии АТР (0,1 мМ). Г. - влияние активатора киназы С ФМА на на взаимодействие GQa с элементами цитоскелета R присутствии АТР (0,1 мМ).

Изучение роли отдельных компонентов изучаемой системы. Для изучения роли отдельных компонентов системы проводили преинкубации каждого из компонентов в присутствии нуклеотидов. GQa

19

преинкубировали с GppNHp, GDP-0-S, ATP и AppHHp, в течение 30 мин при 30°С. После преинкубации GQa обессоливали на колонке с Биогелем Р—30, добавляли к суспензии компонентов цитоскелета и инкубировали 1 час при 30°С. Было установлено, что преинкубация Goa с GDP-fl-S, вызывала усиление сорбции Goa на цитоскелете по сравнению с сорбцией <*oat проинкубированного с GppNHp. Адениловые нуклеотиды в данных условиях на сорбцию не влияли (данные не приведены).

А Б В Г

GDP-0-S GppNHp AppHNp ATP

Рисунок 15. Взаимодействие GQa с элементами цитоскелета клеток мозга быка (MDBK) после преинкубации цитоскелета с нуклеотидами. А,В - взаимодействие GQa с цитоскелетом после преинкубации его с 0,1 мМ GTP-0-S и GppNHp, В,Г - после преинкубации с AppNHp и АТР (0,1 мМ). В. экспериментах с участием АТР использовалась регенирирующая система - креатинкиназа (0,5 мкг/мл), креатинфосфат (20 мМ).

Изучение возможности изменения свойств цитоскелета показало, что (рис. 15 А и Б) что гуаниловые нуклеотиды не оказывали влияния на способность цитоскелета адсорировать Goa- АТР, в отличие от AppNHp (рис. 15 В и Г), значительно снижал степень адсорбции GQa. Изучали действие киназы С на реконструированную систему. GQa

20

+

"реинкубировали с киназой С (0,5 мкг в пробу) в присутствии 100 мМ л.ТР, 10 мкМ H ?, 1 мкМ РМА в течение 30 мин. при 30°С. Реакцию станавливали добавлением AppNHp до концентрации 100 и!!, ависимости степени сорбции Goa от действия киназы установить не .--далось. При изучении действия киназы С на сорбцию холо-G^ выявлено величение степени сорбции Gn на цитоскелете при преинкубацин -.to-g с РМА и уменьшение при преинкубации G0 с Н-7.

■ 1лентификация компонентов цитоскелета. способных

"аимодействовать с а-субъединицей G -белка. эксперименты по изучению белкор плазматических мембран мозга, • <оеобных взаимодействовать с активированной GppNHp Gpa показали, ■то биотннилированная Goa взаимодействовала с несколькими белками, имеющими мол. массу около 90 kDa. а также с белками с мол массами = 42 и 2СкВа. Злектрофоретическая подвижность белка с и м. 54 kDa, .овпадала с электрофоретической подвижностью мембранной формы •тобулина (рис. 18 В). Эти результаты позволяют высказать пред положение о том, что тубулин является одним из компонентов цитоскелета, способным взаимодействовать с G

оа

ВЫВОДЫ.

1. Предложен способ выделения выбелка из мозга быка, позволяющий .олучить высокоочищенный препарат G^^-белка с чистотой выше 95 %.

• 'оказано, что антигенные участки ответственные за связывание МКЛ чспслскенк в N- м С- концевых областях молекулы GQa.

лтановлено. что N- концевая часть а-субъединицы не принимает ■^асгия с связывании с комплексом $г.

■ .оказано что взаимодействие С0-белка с цитоскелетом эффективно -1 v.'iiip'; ется нунлеотидами. причем действие гуаниловых нуклеотидов ■* гч»о е •■¡•»йвйвниям»» уонформаиии G, вызывающими изменение -пгтрр >:ипы у пнтсснелет'*/.

■т-нов,-..-.,.! ATP связано с фосфотраисферазными

реакциями, приводящими к изменение способности цитоскелета связывать G^. Под действием киназы С увеличивается степень адсорбции Gq на цитоскелета.

6. Компонентом цитоскелета, взаимодействующим с в0-белком, является тубулин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО РАБОТЕ A.B. Гареева, K.M. Попов, Т.В. Буларгина. Исследование субъеди ничной структуры в0~белка методом натнвного электрофореза // "Меха ннзмы регуляции клеточной активности". Тезисы докладов на X Объеди ненном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР.- 1989,- Стр.24.

K.M. Попов, А.Г. Катруха, A.B. Гареева, A.B. Березникова, Т.В. Буларгина, Е,С. Северин. Локализация антигенных детерминант на а-субъединице* основного GTP-свяэывающего белка мозга Gq // "Кеханнзмы регуляции клеточной активности" Тезисы докладов на X Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР.- 1989,Стр. 61.

А.Г.Катруха, A.B. Березникова, H.A. Кочанова, A.B. Гареева, K.U. Попов. Т.В. Буларгина, Е,С. Северин. Локализация антигенных участков для моноклональных антител, полученных к а-субъединнце в0-белка из мозга быка // Биохимия. - 1990. - Т. 55. - Стр. 1222-1228. '

A.B. Березникова, A.B. Гареева, H.A. Кочанова, K.Ii. Попов, Т.В. Буларгина, Е,С. Северин. Исследование взаимодействия а-субъединицы GTP-связывающего белка из мозга быка, Gq, с цитоскелетом // Биохимия. - 1990. -Т. 55- - Стр. 1228-1235.

ГП «Принт» Зак. № 27 Тирэж \ 00 экз.