Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение Go-белка из мозга быка и изучение его свойств

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение Go-белка из мозга быка и изучение его свойств"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ

БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи ГАРЕЕВА АЛЬФИЯ БАХТИЕВНА.

ВЫДЕЛЕНИЕ Со-БЕЛКА ИЗ МОЗГА БЫКА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО СВОЙСТВ БИОХИМИЯ 03. 00. 04.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА - 1993

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета имени II.В.Ломоносова

Научный руководитель " ■. . член-корр. РАН

доктор химических наук / профессор Северин Е.С.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Н.Р.Елаев кандидат биологических наук Е.А.Перфирьева

Ведущая организация - Всероссийский Эндокринологический

Научный Центр Российской Академии Медицинских наук

Защита состоится "_" __ 1993 г. в __часов на

заседании Специализированного Совета К 084.35.02. при Башкирском государственном медицинском институте по адресу: 450000, г. Уфа, ул, Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БГМИ (450000, Уфа,.Ленина, 3)

Автореферат разослан "_" _ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук

профессор Э.Г.Давлетов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Механизмы передачи информации в живых системах основаны на едином принципе. Взаимодействие сигнала с рецептором приводит к ко нфо рмациокной перестройке и изменению функции мембранных белков-посредников, а результатом этого является биохимическая модификация молекул-эффекторов, через которые формируется ответ биологической системы. вТР связывающим белкам (в-белкам) в этой цепи принадлежит роль посредников в осуществлении контактов между рецепторами и эффекторными системами.

Известно несколько.типов й-белков различающихся функционально и достаточно хорошо изученных. ОТР-связывающие белки имеют олиг бмерную структуру типа а$г. Список членов семейства быстро увеличивается и на данный момент в нем различают двенадцать вариантов а-субъединиц, четыре варианта /3-субъединиц и не менее трех вариантов »-субъединиц. Высокая степень гомологии а-субъединиц, в основном, определяющих функциональную индиви дуальность в-белков, требует разработки высокочувствительных и специфичных методов их определения в клетках и тканях, к которым относятся .иммунохимические методы.

выбелок, составляющий около 2% всех белков плазматических мембран мозга, такте относится к семейству СТР-связывающих белков. Функции этого белка в настоящее время четко не определены. В

частности, одни исследователи считают, что б -белок принимает +

участие в регуляции К -каналов в клетках ЦНС, другие показывают на

« 2+

его участие в регуляции потенциал-зависимых Са -каналов.

В последнее время в литературе появились данные о том, что .йо~белок может взаимодействовать с цитоскелетом, что играет определенную роль в регуляции трансмембранной передачи гормо нального сигнала за счет ограничения подвижности белка. Однако этот процесс не изучен.

Таким образом, использование иммунохимических подходов на

основе моноклональных антител (МКА), позволяющих идентифицировать

G -белок в нервной ткани, и значительно расширить исследовательские о о

возможности, а также изучение способности Оо~белка взаимо действовать с элементами цитоскелета, углубляющее представления о функционированиии выбелка, представляются своевременными и актуальными.

Цель работы заключалась в изучении взаимодействия Б^белка с цитоскелетом с использованием иммунохимических методов. В работе предусматривалось решение следующих задач:

1. отработка Метода выделения высоноочищенного препарата GQ-BenKa,

2. изучение свойств,и эпитопной специфичности МКА к" а-субъединице

V белка (0«Л

3. изучение участка связывания G^ с комплексом 0т при помощи МКА,

4. исследование взаимодействия во~белка с элементами цитоскелета.

5. выявление -белков плазматических мембран мозга, способных взаимодействовать с а-субъединицей 60-белка.

Научная новизна работы. В ходе настоящей работы были

подобраны условия для выделения выбелка за 4 хромотографические

стадии. Изучены свойства МКА, полученных к . GQa из мозга быка.

Показано, что полученные клоны гибридом секретирупт МКА,

взаимодействующие с различными антигенными участками GQa. МКА клона

1D2 взаимодействуют с Н-концевой областью 0оо- Антигенные участки

для МКА клонов 3D9, 1Н6 и 2ЕЗ располагаются в С- концевой области

молекулы. С помощью МКА клона 1Н6 выявлен участок GQa, принимающий

участие во взаимодействии с комплексом Рг, расположенный в

С-концевой области G_ .

Оа

Изучена механизмы, принимающие участие в регуляции взаимодействия GQa с цитоскелетом. При исследовании взаимодействия очищенной G с элементами цитоскелета клеток линии MDBK было

установлено, что свободная а-субъединица момет непосредственно взаимодействовать с цитоскелетом. Эффективность взаимодействия GQa с цитоскелетом зависит от типа гуанилового нунлеотида, связанного с а-субъединицей. GDP-/J-S значительно увеличивал сродство Goa к цитоскелету по сравнению с негидролизуемыы аналогом GTP - GppNHp. Ингибнрование адсорбции GQa, наблюдаемое а присутствии АТР, связано с изменением свойств цитоскалета. Негндролвзуеиый аналог АТР, AppNHp, подобным действием не обладал, что указывает на участие в этом процессе фосфотрансферазных реакций. Действие АТР может быть в значительной мере обращено путем активации протеинкиназы С форбодмкристатацегатом.

" Практическое значение работы. Описан метод выделения GQ-6enna,

позволяющий получить высокоочищенный препарат белка за 4 хромотографические стадии. Получены культуры гибридомных клеток, продуцирующих ЫКА к разным эпктопам воа■ Проведены исследования по изучению взаимодействия (¡оа с цитоскелетом, Полученные в работе данные расширяют представления о функционировании выбелка.

Апробация работы. Результаты работы доложены на коллоквиуме проблемно^ лаборатории "Химии ферментов" биологического факультета МГУ и на совместном коллоквиуме департамента биотехнологии и лаборатории "Иммунобиотехнологии" Всероссийского Научного Центра Молекулярной Диагностики и Лечения.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы. ' Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из

введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 105 страниц машинописного текста, 4 таблицы и 21 рисунка. Список литературы включает 156 источников.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ о Этапы получение моноклональных антител.

Полностью процедура получения МКА включает в себя следующие этапы: иммунизация животных, подготовка клеток к слиянию, слияние, отбор клонов, продуцирующих специфические антитела, клонирование и реклонирование, препаративная наработка МКА в асците, содержащем антитела и очистка антител.

Иммуноферментный анализ .

На 96-луночной плашке сорбировали антиген, внося в каждую лунку по 100 мкл раствора белка (10 мкг/мл) в PBS и инкубировали в течение ночи при 4°С. после трехкратной отмывки PBST, в лунки вносили по 100 мкл PBS. Каждому клону соответствовал один ряд лунок по горизонтали. Разведение антител всех клонов проводили в соотношении 1/3. После часовой инкубации при 37°С и отмывки в PBST вносили по 100 мкл конъюгата разведенного в PBST в 5000 раз. После инкубации в течение одного часа и отмывки добавляли в каждую лунку . по 100 мкл субстрата. После остановки реакции измеряли поглощение на 'фотометре при 492 нм.

Для изучения взаимного расположения антигенных участков для антител клонов 3D9, 1Н6 и 2ЕЗ в третичной структуре 600,-одновременно с раститровкой антител в лунки добавляли по 2 мкл конъюгата антител клона 3D9 с пероксидазой, полученного периодатным методом. Далее ИФА проводили как обычно.

При изучении взаимодействия с а-субъединицы с рг комплексом, одновременно с раститровкой антител в лунки добавляли по 4 мкл ирчнарата комплекса р? следующим образом: в первую лунку ряда антитела клонов 3D9 и 1Н6 добавляли в соответствии 1/100, а антитела клонов 1D2 и 2ЕЗ - в соответствии 1/10. В последующих лучках разведение антител всех клонов проводили в соотношении 1/3.

4

Препаративная наработка ыоноклональных антител. Нышам линии Balb/c внутриброшинно вводили по 0,5 ил пристана. Через 10 дней внутрнбрюшинко вводили гибридомные клетки

* 7

определенного кяона в количестве 5 10 -5 10 . Через 20 дней собирали шприцом асцитическую жидкость и центрифугировали при 800 об/мин. Супернатант, содержащий моноклональные антитела переносили в пробирки и хранили при -4°С для последующей обработки.

Выделение и очистка моноклональных антител. Для получения грубой иммуноглобулиновой фракции проводили высаливание белков сульфатом аммония. Для более тонкой очистки антител, асциты наносили на колонку с протеин-А сефарозой, урав новешеннуп буфером, содержащим 1,5 U глицин и 3 11 NaCl (рН 8,9). Антитела элсировали буфером, содержащим 100 uU цитрат натрия (рН 4). Оптическую плотность определяли с помощью спектрофотометра.

.Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофоретическое разделение проводили в системе Лэмкли (Laemly, 1976), используя 4% концентрирующий гель, и 10% разделяющий гель. В образцы белков, перед нанесением на форез, добавляли разрушающую -смесь (33 мкл смеси на 100 мкл пробы). После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры (иммуноблоттинг). Перенос проводили в ячейке для полусухого переноса.

Интенсивность окраски полос определяли на спектрофотометре Hitachi 557 /Япония/.

Ограниченный трйпсинолиз белка Go-Ограниченный трипсинолиэ б^белка осуществляли в среде содержащей 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgClg, 1 мМ ЭДТА и 0,1% Луброл Рх. Соотношение трипсин/белок варьировал от 1/500 до 1/25, время инкубации - 60 мин. или 2 часа. Продукты протеолиза разделяли методом электрофореза в системе Лэммли, используя 15% разделяющий гель. Иммунореактивные пептиды выявляли методом иммупоблотинга.

5

Получение препарата цитоскелета. Получение препарата цитоскелета из клеток линии MDBR и N^A (Osborn., Weber., 1977) Клетки промывали PBS, после чего проводили солюбилизацию клеточных мембран буфером, содержащим 10 mU Трис, 140 мМ NaCl, 10 мМ MgClg, 0,5% Тритон Х-100, pH 7,5 в течение 10 мин. при комнатной температуре. Несолюбилизированный материал дважды промывали буфером, не содержащим Тритон Х-100. Полученный препарат цитоскелета суспендировали в том же буфере и хранили при -70°С.

Биотинилирование GQ.

выбелок (1мг/мл) биотинилировали в среде следующего состава:

10 ми NaHC03 (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 10 мМ UgClg, 20 MU AlClg, 6 M«

NaF, 0,1 % Луброл PX. 1 мг/мл биотина NX при комнатной температуре

в течение 4 часов. Непрореагировавший биотин NX и активаторы

G^^-пелка удаляли диализом против 10 мМ Трис HCl (pH 7,5), 10 мМ

HgCl„. За время инкубации с биотином NX и диализа, способность G ¿ 3 • оа

связывать [ HlGppNHp снижалась на 15-20 %.

; Для выявления белков, способных взаимодействовать с Goct> плазматические мембраны из мозга быка разделяли методом ДСН-электрофореза, Белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры <<Bio-Rad>>. Фильтры блокировали в среде содержащей 10 мИ Трис HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl, 5%-ный бычий сывороточный альбумин (Serva) и 0,1% Твин 20. Заблокированные фильтры преинкубировали с бнотинилированой GQa (bt-Goa) в концентрации 1 мкг/мл в среде следующего состава: 10 мЫ Трис HCl (pH 7,5), 10 MU NaCl, 10 мМ UgCl2, 5% БСА, 0,5% Луброл PX, 0,1 мМ GppNHp, либо GDP-p-S, в течение 2 часов при комнатной температуре. Фильтры отмывали 5 раз по 10 мин. раствором, содержащим 10 мМ Трис HCl (pH 7,5), 100 нМ NaCl, 5 мЫ MgCl2, 0,1% Луброл PX. bt-Goa выявляли С помощью конъюгата авидин-пероксидаза фирмы < <Dakopatts>>, Иммунопреципитация тубулина.

6

Цитозольную фракции мозга получали путем гомогенизации клеток мозга в среде, содержащей 10 мМ Трис-Н1 (рН-7,5), 100 мМ NaCl, 10 мМ KgClg и центрифугировали при 12000g в течение 10 мин. К 0,5 мл супернатанта (1 мг/мл.) добавляли 50 мкл. протеин А- сефарозы и инкубировали 15 мин. при 4°С. После центрифугирования осадок отбрасывали, а к 0,5 мл цитозольной фракции мозга добавляли 10 мкг антител (поликлональные антитела барана <<Soythern Biotechnology Associate. Inc.>>) и инкубировали 2,5 часа при 4°С. В пробу добавляли 50 мкл Протеин А-сефарозы и инкубировали 1 час при 4°С. Осадок трижды промывали тем же буфером К осадку добавляли разрушающую смесь, белки разделяли методом электрофореза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение в0~белка.

Методика выделения основного GTP-связывающего белка была предложена Sternweis и Robishaw в 1984 году. Выделение по этому методу выбелка занимает неделю. Нам удалось модифицировать метод Sternweis и Robishaw, используя на последней стадии очистки белка, колонку с ДЭАЭ-Тойоперлом 650S, в соответствии с методом Katada (Katada et al., 1984). Таким образом, удается получить высоко очищенный препарат выбелка за 4 хромотографические стадии.

Плазматические мембраны мозга получали в соответствии с методом Sternweis и Robishaw. GTP-белки экстрагировали из плазматических мембран, суспендированных в буфере А (20 мМ Трис НС1, рН 8, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT) в концентрации 6-10 мг/мл, 1% холатом натрия при 4°С в течение 60 мин. Несолюбилизированный материал удаляли при 105000 g в течение 60 мин. при 4°С. Надосадочную жидкость, объемом около 500 мл, наносили на колонку с DEAE-сефарозой. Элюцию GTP-белков осуществляли буфером А, содержащим 1% хслат натрия и 150 мМ NaCl. G-белки выходили одним симметричным пиком (рис. 1А). Фракции, содержащие вТРазную активность объединяли, разбавляли

7

-скорость элюции 200 ил/час, объем фракций 10 мл. 1 Б. Профиль элюции БТР-белков с октил-сефарозы (2,5 х 20 см), скорость элюции 200 мл/час, объем фракций 10 мл. 1 В. Профиль элюции ЭТР-белков с ультрогеля АсА34 (5 х 1 м), скорость элюции 30 мл/час,, объем фракций 8 мл.

1 Г. Профиль элюции ОТР-белков с ПЕАЕ-Тоноперла 6505(2,5 х Ю см), скорость элюции 40 мл/час, объем фракций 2,5 мл.

9 поглощение при 280. ■ вТР-связывавщая активность.

8

буфером А, содержащим NaCl, до концентрации холата 0,25% и наносили на колонку с октил-сефарозой (2,5 х 20 см). GTP-белки элюиро вались в виде одного симметричного пика при концентрации холата около 0,7% (рис. 1Б).

Фракции, содержащие GTP-связывающув активность концентрировали до 10 мл. Белок наносили на колонку с ультрогелем АсА34 (5 см х 1 м). G-белки элюировались в виде одного пика, соответствующего объему выхода белков с мол. массой около 8000 дальтон (рис. 1В). Фракции, содержащие G-белки, объединяли, и наносили на колонку с ДЭАЭ-Тойоперлом 650S (2,5 х 10см), уравновешенную буфером А, содер ржащим 0,6 % луброл РХ и 25 мМ NaCl. Элюцию белков проводили линей «ым градиентом концентрации NaCl (от 0 мМ до 200 мМ), при готовленном на буфере А, содержащем 0,6% луброл РХ и 500 мМ NaCl. GTP-белки элюировались двумя пиками (рис. 1Г). Первый пик содержал G^-белок, а второй GQ. Чистота выделенного белка была выше 95%, выход составлял 36%. Субъединицы Gg-белка разделяли на фенил-Сефарозе (Northup et al., 1983).

Локализация антигенных участков в первичной последовательности GQ| В нашей лаборатории были получены 15 клонов гибридом, МКА к а-субъединице Gg-белка. Из 15 клонов гибридом было отобрано четыре клона, отличающихся высокой продуктивностью и стабильностью.

Для определения антигенных участков в первичной последова тельности Gq использовали метод ограниченного гидролиза трипсином. Полученные полипептиды разделяли методом ДСН-электрофореза в градиентном геле. Для выявления иммунореактмвных пептидов исполь зовали метод иммуноблоттинга.

При изучении взаимодействия антител нлона 3D9 с трилтическими пептидами а-субъединицы, была получена следующая картина. Как видно из рисунка 2 Б, антитела клона 3D9 взаимодействовали с пептидами с мол. массами 37, 32, 17, 16 и 15 kD'a, и с минорными пептидами 34 и

9

кОа. Этот набор пептидов был получен в результате инкубации с грнпсинон при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение 60 мин. Как показано на рис. 2 В, при увеличении времени инкубации с трипсином до двух часов, наблюдалось появление иммунореактивного пептида с мол. массой 12 кИа, этот пептид, вероятно, образуется в результате дальнейшей деградации пептидов с мол. массами 17, 16 и 15 кБа. Как следует из рисунка 2 Г, при увеличении концентрации трипсина до соотношения трипсин/белок 1/25 и времени инкубации 2 часа, пептид с мел. массой 12 кРа оказывался единственный продуктом деградации С , содержащим антигенный участок для антител клона Зй9.

Как показано на рис. 3 Б, взаимодействовали с пептидами с мол. массами 37, 32, 17, 16 и 15 к!)а - время трипсинолиза 60 мин, соотношение трипсин/белок 1/500. На рис. 3 В. показано, что пептид о. мол. массой 12 №а, образу ¿„дайся в ходе гидролиза а-субъединицы при соотношении трипсин/белок 1/25 в течение 2 часов, не взаимодействовал с антителами клона 1Н6. По-видимому, деградация пептидов с мол. массами 17, 16 и 15 кОа сопровождается разрушением антигенного участка для антител клока 1Н6, лежащего в области грнптичеакого расщепления этик полипептидов.

А В В Г

А

Б

В

Г

43

43

33 20 14

Рис. 2

Рис. 3

30 20

14

ю

Рисунок 2. Иммунореактивные пептиды, взаимодействующие с антителами клона 3D9. Гидролиз белка трипсином осуществляли при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение 60 мин. (Б), при соотношении трипсин/белок 1/500 в точения 120 мин. (В), при соотношении трипсин/белок 1/25 в течение 120 мин. (Г) А - контроль. Рисунок 3. Иммунореактивные пептиды, взаимодействующие с антителами клона 1Н6. Гидролиз белка трипсином осуществляли при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение 60 мин. (Б), при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение' 120 ним. (В), при соотношении трипсин/белок 1/25 в течение 120 пин. (Г) А - контроль.

!1з рисунка 4 Б видно, что антитела клона 2ЕЗ взаимодействовали с пептидами с мол. массами 37 и 20 kDa и тремя пептидами с мол. массой около 5 kDa. Данные иммунореактивные пептиды были получены при инкубации Gq с трипсином при соотношении трипсин/белок 1/500 в течения 60 млн. Па рис. 4 В показано, что увеличение концентрации трипсина, до соотношения трипсин/белок 1/100, время инкубации 60 mito. приводила к исчезновения пептидов с иол. массами 37 и 20 .kDa. Как следупт из результатов представленных ранее на рис. 2 Б и 3 В, полипептнци с иол. массой около 5 kDa появляется одновременно с пептидв»»». 17, 16 и 15 kDa, т.е. они образуются при, деградаш::: общего предшественника. По литературным данным (fung et al., 1983), пептид с мол. массой 5 kDa образуется в результате расцепления г С-копцепоД области G. 3 аналогичной области в располагаются- три точки г л скопления Lva" ' ". Arg'" А и Lys*'"1' (Iton et al. ,198ó). Расотплешко по от.нм остаткам, по-впдикоуу, приводит к образован.'::-; трог с мол. массой около 5 kDa. Вероятно, псе С-коицгькч

пеитпр." оо-д^ргат антигенами уч"СТО!< """ антител клона 2КЗ.

д иг -ч!-г1ТЯл клопа 1D¡' было выявлено c.TsHVfj:"ea . Как видно ' и; рисунка 5 П. аитит'ела клона 1D2 взаимодействовали с двумя Пелт!'".',"!" -, мол массам;* ЗЛ и 20 kDa. Эти ¿рагмзнтн были получен:-;

11

при расщеплении Отбелка трипсином в соотношении трипсин/белок 1/500, в течение 60 мин. Как показано на рис. 5 В, эти антитела не взаимодействовали с пептидом с мол. массой 37 кОа, полученным при гидролизе Б , активированной вТР-у-З при соотношении трипсин/белок 1/500, в течение 60 мин. В этих условиях расщепление происходит в Ы-концевой области с образованием двух пептидов с мол. массами 37 и 2 кБа (Поп et а1. , 1986). Из результатов приведенных здесь, расщепление в этой области сопровождается разрушением

антигенного участка для антител клона Ш2.

к Б- В. л Б В

. 43

о

~ - 30

' 20

, - 14. .14

_ __Ь

Рисунок 4. Иммунореактивные пептиды, взаимодействующие с антителами клона 2ЕЗ. Гидролиз белка трипсином осуществляли при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение 60 мин. (Б), при соотношении трипсин/белок 1/100 в течение 60 мин. (В), А - контроль. Рисунок 5. Иммунореактивные пептиды, взаимодействующие с антителами клона Ю2. Гидролиз белка трипсином осуществляли при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение 60 мин. (Б), гидролиз а-субъединицы ...ктивлров.'шной СТР-г-Э при соотношении трипсин/белок 1/500 в течение 60 минут. А - контроль

Таким образом, МКА взаимодействуют с различными антигенными

43

30

•____20

12

участками йоа■ МКА клона Ю2 - с М-концевой областью <»оа. Аналогия между данными, полученными для антител клона 2ЕЗ и литературными данными позволяет сделать вывод, что антигенные участки для МКА клонов 309,'1Н6 и 2ЕЗ находятся в С-концевой области молекул.

Расположение антигенных участков. Для изучения расположения антигенных участков для антител клонов 309, 1Н6, 2ЕЗ в третичной структуре Сод использовали мотод ИФА. Изучалась конкуренция МКА клона ЗЭ9 с ферментной меткой с немеченными антителами клонов 309, 1Н6, 2ЕЗ за связывание с антигеном. Было показано, что эффективная конкуренция наблюдалась при использовании антител клонов 309 и 1Н6. МКА клонов 2ЕЗ не кон курировали с МКА клона 309 (данные не приведены).

Вероятно, что МКА клонов 309 и 1Н6 взаимодействуют с ' соседними участками £>оа, также не исключается то, что участки взаимодействия с антителами клонов 309 и 1Н6 перекрываются. Далее мы исследовали влияние комплекса (Зг на связывание МКА с .

Изучение участка связывания а-субъединицы с комплексом /5/ с помощью моноклональных антител. Относительно участка йод, взаимодействующего с комплексом (¡1, в литературе существуют противоречивые мнения. На следующих рисунках приведены результаты экспериментов, в которых исследовалось влияние комплекса . Рг на связывание МКА с О ".' Как и в предыдущем эксперименте, где- изучалось расположение антигенных участков, основным методом исследования был ИФА, где одновременно с раститровкой антител клонов 309, 1Н6, 2ЕЗ в лунки планшета добавляли препарат комплекса

На рисунке 6 представлены данные, полученные для антител клона 1Н6. Здесь . кривая титрования значительно сдвигается в сторону меньших разведений антител в присутствии $1. Т . е , /3г эффективно конкурирует с антителами клона 1Н6 за связывание с 0оа.

13

Для антител клона Зй9 было показано следующее. Из рис. 7 видно,что эффективность влияния комплекса 0тг, на связывание с Соа на порядок нише, чем в случае антител клона 1Н6. Учитывая, что ЫКА клонов 309 и 1Н6 взаимодействуют с соседними участками сО0(, приведенные результаты могут служить косвенным доказательством

области

того, что детерминанта антител клона 1Н6, располагается

в

взаимодействия с комплексом (3г .

а 9 о г

'Л

'/«ч '/г. г* '/'•

Рис. 6

'/л

'//9? с г

Рис .

Рисунок 6. Влияние комплекса субъедшшц р? на связывание антител клона 1К0, в отсутствии /О / и в присутствий Рг /О /. Рисунок 7. Влияние комплекса субъединиц 01 на связывание антител клона ЗС9, в отсутствии / О/ и в присутствии Р7 /•'.;>/.

Из рисунка в следует, что ИКД клопа 19.2 не конкурировал!] с комплексом вг . По лктзрутуркг;:! даннам, И-кояцэвой неатп;: мояс-т

взпп;1с.-де::ст;ю2ать с комплексом ¿'у. Результат;;, пргг-с тешша к"1 рпсункс к-, согласуются с зтпм предположением. К-коицовач 'г.зтч С _ не лрнккпчет участия у связываний с комплексе!: Р?

Пр; изучении вяияпк" комплекса 0? па связывание антител клопа

2Е"

С.

бкле

покс." с;

следующее .

Как

графика, 14

приведенного на рисунке 9, кривая титрования в присутствии (¡г,

значительно сдвигается в сторону больших разведений антител. Из литературы известно, что С-коицевой пептид принимает участие во взаимодействии с рецептором, при этом сродство рецептора к (» резко возрастает в присутствии комплекса р? (ВхгпЬашпег, 1987). Результаты, приведенные на рисунке 9, указывают на то, что связывание в с антителами клона 2ЕЗ, сильно увеличивается в присутствии комплекса (Зу, по-видимому, за счет увеличения доступности антигенного участка для 1!НА. Следовательно, кояформа ционкые изменения С-концевого фрагмента &оа могут быть причиной увеличения сродства С_~бзлка к рецептору.

Рисунок 0. Влияние комплекса субъединиц ру на связывание антител клона 102 , в отсутствии /О/ и в присутствии ¡¡ц /О /. Рисунок 9 . Влияние комплекса субъединиц Ри на связывание антител клона 2ЕЗ. з отсутствии /О / и в присутствии /3? /©/.

Таким образом, вероятно С-конец принимает участие в связывании рецептора и, возможно, предположение, что взаимодействие антител клона 2ЕЗ с С-концевым фрагментом а-субъединицы моделирует процесс, происходящий при взаимодействии а-субъединицы с рецептором.

Изучение взаимодействия субъединицы С -белка с цитоскелетом.

''з '/¿г

'/з '/¿г '/не'

15

Элементы цитоскелета мозга получали путем солюбилизации плазматических мембран в среде, содержащей 10 мМ Трис НС1 (рН 7,5) 100 мМ НаСХ, 10 мМ МяС1, 0,5% Тритон Х-100 в течение 10 мин. при (смнатной температуре. Несолюбилизированный материал трижды промывали буфером, не содержащим Тритона Х-100. Как показано на рисунке 10 Б, элементы цитоскелета содержали около 30% содержащегося в плазматических мембранах.

Аналогичные взаимодействия были обнаружены в клетках нойробластомы Ы2А (данные не приведены)

. А Б

^ржЛ ттг/ ®оа

Рисунок 10 . Взаимодействие Соа с элементами цитоскелета мозга. А -

В в составе плазматических мембраны мозга (40 мкг белка). Б - й оа оа

в составе цитоскелета полученного из плазматических мембран.

Эффективность взаимодействия Соц с элементами цитоскелета изменялась в зависимости , от типа гуанилового нуклеотида, присутствующего в среде инкубации. Гуаниловые нуклеотиды, как известно, вызывают значительные изменения «онформации Б , которые могут определять эффективность взаимодействия с цитоскелетом. 0оа преинкубировали с ООР-р-Б (10 мМ), либо с вррИНр (10 мМ) при 30°С в течение '45 мин. Несвязавшиеся гуаниловые нуклеотиды удаляли на колонке с Биогелем Р-30. Полученные препараты а-субъединицы добавляли к элементам цитоскелета, преинкубировали смесь в тече ние 30 мин. при 30°С. Элементы цитоскелета осаждали центри

фугированием. Как показано на рис. 11 А и В, степень адсо рбции Ооа в комплексе с ЯБР-р-й была значительно выше, чем степень адсорбции в комплексе с СррШр. Полученные данные

16

указывает на то, что конформационные изменения, происходящие при активации а-субъединицы GppNHp, значительно снижают ее сродство к элементам цитоскелета.

А В В

О

120

120

GDP-0-S ~ GppNHp.. _

Влияние гуаниловых нуклеотидов на взаимодействие Goa с

в составе содержание

Рисунок И

элементами цитоскелета мозга. А - исходное содержание G( цитоскелета (20 мкг белка плазматических мембран). В -Goa в составе цитоскелета после преинкубации плазматических мембран (20 мкг белка) с 0,1 mil GDP-p-S, в течение 120 мин. В - содержание G^ в составе цитоскелета после преинкубации плазматических мембран с 0,1 mil GppNHp, в течение 120 мин.

По имеющимся данным (McArdle et al., 1988), негидролизуемые аналоги GTP вызывают выход GM из плазматических мембран. На рис. 13 приведены результаты экспериментов, в которых оценивался выход G^ из плазматических мембран мозга под действием GppNHp. Преинкубация Goa с аналогами GTP вызывала незначительный выход из плазматических мембран (около 6%). Присутствие GQa в надосадочной жидкости в начале инкубации, по-видимому, связано с неполным осаждением мембран при центрифугировании.

Таким образом, различия в степени адсорбции наблюдаемые в

присутствии GppNHp и GDP-/3-S, не связаны со способностью GppNHp

17

+

освобождать Gqo из плазматических мембран. Они отражают различия в сродстве Goa к элементам цитоскелета, возникающие в зависимости от тина нуклеотида, присутствующего в среде инкубации. О 15 30 60 120 МИН

-Go«

Рисунок 13 . Влияние времени преинкубации плазматических мембран

мозга с 0,1 мМ вррЫНр на выход из мембран йоа-

Увеличение времени адсорбции 6оа на элементах цитоскелета,

наблюдаемые при инкубации плазматических мембран с гуаниловыми

нуклеотидами,( может быть прямым следствием связывания нуклеотида.

Изучение зависимости степени адсорбции воа от времени преинкубации

плазматических мембран мозга с вррШр показало,что значительное

увеличение степени адсорбции в наблюдалось к 60 мин. преийкубации 3

Связывание же [ HlGppNHp с GQa достигало равновесия к \30 мин. инкубации.

Таким образом, данные указывают на то, что увеличение степени адсорбции Goa на элементах цитоскелета не является прямым следствием связывания гуанилового нуклеотида с G . По-видимому, в регуляции взаимодействия GQa с цитоскелетом принимают участие дополнительные, не идентифицированные процессы.

Изучение этого вопроса показало, что в регуляции взаимодействия Со~белка с цитосцелетом принимает участие АТР. Преинкубация плазматических мембран в среде, содержащей АТР и GDP-/3-S Б) или АТР и GppNHp , вызывала снижение степени адсорбции

G . Замена АТР на негидролизуемый аналог АррННр (100 мкМ) предотвращает снижение степени адсорбции G .

Таким образом, в регуляции адсорбции GM на элементах цитоскелета принимают участие АТР-зависимые реакции.

18

На следующем рисунке 1.4 Д и Е представлены доказательства в пользу участия киназы С в регуляции взаимодействия выбелка с цитоскелетом. При преинкубации плазматических мембран мозга в присутствии 'АТР (100 мМ) и ингибитора киназы С Н-7 наблюдалось дальнейшее снижение степени адсорбции GQa (рис. 14 Д). В присут ствии активатора кииази С, ФМА, степень адсорбции GQe значительно возрастала ( рис. 14 Е). Таким образом, активация киназы С в значи тельной мере моделирует действие АТР.

А В В Г Д Е

GDP-0-S + - • - — - —

GppNHp . - . + - - - —

АррННр — - ~ ■+ — —

Н-7 - ~ - - - ' + —

PMA - - - - - +

АТР — - -h - i -t

Рисунок 14. Влияние киназы С на взаимодействие Goa с элементами цитоскелета клеток мозга быка. А,В - взаимодействие GQa с цитоскелетом в присутствии ОД мМ GTP-0-S, В,Г - влияние App(NH)p и АТР на взаимодействие GQa с цитоскелетом клеток мозга быка. Д. -влияние ингибитора киназы С Н-7 на взаимодействие Goa с элементами цитоскелета в присутствии АТР (0,1 мМ). Г. - влияние активатора киназы С ФМА на на взаимодействие GQa с элементами цитоскелета в присутствии АТР (0,1 мМ).

Изучение роли отдельных компонентов изучаемой системы.

Для изучения роли отдельных компонентов системы проводили преинкубацию каждого из компонентов в присутствии нуклеотидов. Goa

19

прешшубировали с GppHHp. GDP-£-S, ATP и AppHHp, в течение 30 мин при 30 С. После преинкубации G^ обессоливали на колонке с Биогелем Р-30, добавляли к суспензии компонентов цитоскелета и инкубировали i час при 30°С. Было установлено, что преинкубация G^ с GDP-fi-S, вызывала усиление сорбции С^ на цитоскедете по сравнение с сорбцией G^, преинкубироваяного с GppHHp. Адениловые нуклеотиды в данных условиях на сорбции не влияли (данные не приведены).

А Б В Г

•GDP-P-S GppNHp AppHNp ATP

Рисунок 15. Взаимодействие G^ с элементами цитоскелета клеток мозга быка (HDBK) после преинкубации цитоскелета с куклеотидами. А,В - взаимодействие Goa с цитоскелетом после преинкубации его с 0,1 мМ GTP-0-S И GppHHp, В,Г - после преинкубации с АррМНр и АТР (0,1 мК). В. экспериментах с участием АТР использовалась регенирирутацая система - креатиякиназа (О,5 мкг/мл), креатинфосфат (20 мМ).

Изучение возможности изменения свойств цитоскелета показало, что (рис. 15 А и Б) что гуаниловые нуклеотиды не оказывали влияния на способность цитоскелета адсорировать G0(](- АТР, в отличие от AppNHp (рис. 15 В и Г), значительно снижал степеиь адсорбции G . Изучали действие кииазы С на реконструированную систему. G^

20

лреинкубировали с киназой С (0,5 мкг в пробу) в присутствии 100 мМ <YTP, 10 мкМ H 7, 1 мкМ РМА в течение 30 мин. при 30°С. Реакцию останавливали добавлением AppNHp до концентрации 100 мМ. Зависимости степени сорбции Goa от действия ниназы установить не удалось. При изучении действия киназы С на сорбцию холо-Сп выявлено .увеличение степени сорбции GQ на цитоскелете при преинкубацин •■'ОЛО-G с РМА и уменьшение при преинкубации GQ с Н-7.

Идентификация компонентов цитоскелета, способных ^аимодействовать с а-субъединицей во-белна. Зксперименты по изучению белков плазматических мембран мозга, способных взаимодействовать с активированной GppNHp Goa показали, что биотинилированная G^ взаимодействовала с несколькими белками, имеющими мол. массу около 90 kDa, а также с белками с моп. массами "54,42 и 20kDa. ЭЛектрофоретическая подвижность белка с м.м.54 kDa, совпадала с электрофоретической подвижностью мембранной формы тубулина (рис. 18 В). Эти результаты позволяют высказать пред положение о том, что тубулин является одним из компонентов иитоскелета, способным взаимодействовать с

ВЫВОДЫ.

L. Предложен способ выделения выбелка из мозга быка, позволяющий .¡олучить высокоочищенный препарат выбелка с чистотой выше 95 %. 2. Показано, что антигенные участки ответственные за связывание МНА расположены в N- и С- концевых областях Молекулы Goa. ), Установлено, что N- концевая часть а-субъединицы не принимает участия в связывании с комплексом fir.

4. Показано, что взаимодействие в0~белка с цитоскелетом эффективно регулируется нуклеотидами, причем действие гуаниловых нуклеотидов связано с изменениями конформации GQa, вызывающими изменение сродства а-субъединицы к цитоскелету.

''■>. Установлено, что действие АТР связано с " фосфотрансферазными

21

реакциями, приводящими к изменение способности цитоскелета связывать G . Под действием киказы С увеличивается степень адсорбции Gq на цитоскелета.

6. Компонентом цитоскелета, взаимодействующим с в0~белком, является тубулин•

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО РАБОТЕ A.B. Гареева, K.M. Попов, Т.В. Буларгина. Исследование субъеди ничной структуры 0о~белка методом нативного электрофореза // "Меха ннзиы регуляции клеточной активности". Тезисы докладов на X Объеди ненном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР. - 1989,- Стр.24.

К.Ы. Попов, А.Г. Катруха, A.B. Гареева, A.B. Березникова, Т.В. Буларгина, Е,С. Северин. Локализация антигенных детерминант на а-субъединице' основного GTP-свяэывающего белка мозга GQ // "Механизмы регуляции клеточной активности" Тезисы докладов на X Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР.- 1989 -Стр. 61.

А.Г. Катруха, A.B. березникова, H.A. Кочанова, A.B. Гареева, K.M. Попов, Т.В. Буларгина, Е,С. Северин. Локализация антигенных участков для моноклональных' антител, полученных к а-субъединице во-белка из мозга быка // Биохимия. - 1990. - Т. 55. - Стр. 1222-1228. '

A.B. Березникова, A.B. Гареева, H.A. Кочанова, К. II. Попов, Т.В, Буларгина, Е,С, Северин. Исследование взаимодействия а-субъединицы GTP-свяэывающего белка из мозга быка, GQ, с цитоскелетом // Биохимия. - 1990. - Т. 55- - Стр. 1226-1235.

ГП «Принт» Зак. № 97 Тираж WO экз.