Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль цитокинов в регуляции механоэлектрической обратной связи в правом предсердии крыс

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль цитокинов в регуляции механоэлектрической обратной связи в правом предсердии крыс"

На правах рукописи

Митрохин Вадим Михайлович

РОЛЬ ЦИТОКИНОВ В РЕГУЛЯЦИИ МЕХАНОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ОБРАТНОЙ СВЯЗИ В ПРАВОМ ПРЕДСЕРДИИ КРЫС

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

2 8 НОЯ 2013

005540349

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Камкин Андрей Глебович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Фокин Виталий Федорович

профессор,

зав. лабораторией возрастной физиологии мозга ФГБУ "Научный центр неврологии" РАМН

доктор медицинских наук, Мирзоян Рубен Симонович

профессор,

зав. лабораторией фармакологии цереброваскулярных расстройств ФГБУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН

Ведущая организация:

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».

Защита состоится «¿И» 2013 года в /^Г на заседании

Диссертационного Совета Д 208^072.05 при ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава РФ по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ

им. Н.И.Пирогова Минздрава РФ по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан года

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В последние десятилетия активно изучается участие эндогенных веществ иммунной природы - цитокинов - в физиологических реакциях, не связанных с активацией специфических защитных систем организма. Так, накоплено множество данных, свидетельствующих о важной роли провоспалительных цитокинов в регуляции сердечной деятельности [РгаЫш, 2004]. Для направления исследований влияния соединений иммунной природы применительно к сердцу Л.В. Ковальчук и

0.П. Шевченко в 2010 г. ввели термин «кардиоиммунология». В этом аспекте интерлейкины 1Ь-1и, 1ИР, 1Ь-2, 11.-6, И-13, 1Ь-17а, 1Ь-18, а также УЕвР представляют наибольший интерес, поскольку именно к этой группе цитокинов на мембране кардиомиоцитов имеются специфические рецепторы (МеЬга, [1агт^о1ат й а1„ 2005; Каткт, Ивекуа, 2012; уап Kimmenade, }апигг^ 2012).

Механоэлектрическая обратная связь (МЕИ) в сердце является причиной возникновения механоиндуцированных аритмий, нередко заканчивающихся фибрилляцией. Ключевую роль в развитии этого явления играют механоуправляемые ионные каналы (МОСэ), активирующиеся растяжением клеток сердца [Каткт е1 а1., 2000; Каткт е1 а1., 2003]. Недавние исследования, проведенные под руководством профессора А.Г. Камкина, показали, что оксид азота - низкомолекулярное эндогенное соединение, обладающее широким спектром физиологических эффектов - может модулировать работу МССя клеток сердца [Казанский и соавт., 2010; КагапвИ е1 а1., 2011]. Поскольку в организме продукция N0 активируется целым рядом эндогенных регуляторов, в частности, цитокинами, было сделано предположение, что вышеозначенные интерлейкины могут осуществлять регуляцию работы механоуправляемых ионных каналов кардиомиоцитов, предположительно через цепи продукции N0, и, следовательно, могут быть природными регуляторами механоэлектрической обратной связи в сердце, т.е. вызывать или ингибировать аритмии. Исследованию этого вопроса посвящена представленная работа.

Цель работы - изучение роли цитокинов в регуляции механоэлектрической обратной связи в правом предсердии крыс.

Задачи исследования

1. Моделирование пикообразной механоиндуцированной деполяризации кардиомиоцитов правого предсердия крыс, возникающей в ответ на дозированное растяжение ткани.

2. Изучение влияния на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов правого предсердия крыс в норме и при дозированном растяжении ткани следующих провоспалительных цитокинов: 1Ь-1а, 1Ь-1р, 11.-2,1Ь-6,1Ь-17а, 1И8, УЕОИ.

3. Изучение влияния на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов правого предсердия крыс в норме и при дозированном растяжении ткани противоспалительного цитокина IL-13.

4. Оценка возможной физиологической роли цитокинов в регуляции механоэлектрической обратной связи в сердце.

Научная новизна

Впервые в мире на препаратах правого предсердия крыс с использованием микроэлектродной техники было показано, что цитокины могут оказывать влияние на параметры биоэлектрической активности кардиомиоцитов. Провоспалительные цитокины осуществляют эффективную модуляцию механоэлектрической обратной связи в сердце, вызывают изменения APD, которые могут переходить в устойчивые аритмии, если hump-like деполяризация достигает критического уровня. Провоспалительный цитокин IL-13 оказывает разнонаправленное действие на величину APD. Механизм, лежащий в основе кардиотропного влияния цитокинов, может заключаться в изменении активности NO-синтаз и, следовательно, внутриклеточного уровня оксида азота, что модулирует активность механоуправляемых ионных каналов кардиомиоцитов.

Положения, выносимые на защиту

1. Растяжение ткани предсердия вызывает hump-like деполяризацию на уровне APD90 или APD50 фазы реполяризации потенциала действия кардиомиоцитов. Если hump-like деполяризация на уровне APD90 достигает критического уровня, генерируются экстрапотенциалы действия. Hump-like деполяризация, вызванная растяжением, определяется работой механоуправляемых ионных каналов, поскольку блокируется хлоридом гадолиния.

2. В условиях стандартного предрастяжения фрагмента правого предсердия крыс перфузия IL-18 (50 нг/мл) в течение 35 мин вызывает увеличение APD на всех уровнях и не влияет на частоту и силу сокращений. Дискретное растяжение ткани на фоне IL-18 не приводит к возникновению hump-like деполяризации.

3. В условиях стандартного предрастяжения фрагмента правого предсердия крыс перфузия IL-2 (50 нг/мл) в течение 35 мин вызывает увеличение APD на всех уровнях и не влияет на частоту и силу сокращений. IL-2 вызывает возникновение паттернов пароксизмальной тахикардии, переходящих в нормальный ритм. Дискретное растяжение ткани на фоне IL-2 вызывает hump-like деполяризацию, не переходящую в одиночные экстрапотенциалы.

4. В условиях стандартного предрастяжения фрагмента правого предсердия крыс перфузия IL-la (50 нг/мл) в течение 35 мин вызывает увеличение APD90, частоты следования потенциалов действия и не влияет силу сокращений. IL-la вызывает возникновение одиночных экстрасистол. Дискретное растяжение ткани на фоне IL-la

приводит к возникновению редких hump-like деполяризаций, учащению ритма и появлению относительно коротких участков тахикардии. Устранение растяжения приводит к нормализации ритма.

5. В условиях стандартного предрастяжения фрагмента правого предсердия крыс перфузия IL-ip (50 нг/мл) в течение 35 мин не вызывает изменения биоэлектрической активности кардиомиоцитов. Дискретное растяжение клеток на фоне IL-ф также не приводит к изменению исследуемых параметров.

6. В условиях стандартного предрастяжения фрагмента правого предсердия крыс перфузия IL-17a (50 нг/мл) в течение 35 мин вызывает увеличение APD на всех уровнях и не влияет на частоту и силу сокращений. Дискретное растяжение ткани на фоне IL-17a вызывает появление редких hump-like деполяризаций, переходящих в одиночные экстрапотенциалы без развития тахикардии.

7. В условиях стандартного предрастяжения фрагмента правого предсердия крыс перфузия IL-6 (50 нг/мл) в течение 35 мин вызывает увеличение APD на всех уровнях и не влияет на частоту и силу сокращений. Дискретное растяжение ткани на фоне IL-6 вызывает появление редких hump-like деполяризаций, трансформирующихся в одиночные экстрапотенциалы, которые устраняются дополнительным растяжением. После 20 минут перфузии IL-6 происходит возникновение фибрилляции, которая инициируется даже при незначительном растяжении ткани.

8. В условиях стандартного предрастяжения фрагмента правого предсердия крыс перфузия VEGF (50 нг/мл) в течение 35 мин вызывает увеличение APD90, и не влияет на частоту и силу сокращений. Дискретное растяжение ткани на фоне VEGF приводит к возникновению редких hump-like деполяризаций, трансформирующихся в одиночные экстрапотенциалы без развития тахикардии.

9. В условиях стандартного предрастяжения фрагмента правого предсердия крыс перфузия IL-13 (50 нг/мл) в течение 35 мин в 48% случаев вызывает уменьшение APD на всех уровнях, а в в 52% случаев - ее увеличение. IL-13 вызывает hump-like деполяризацию. Дискретное растяжение ткани на фоне IL-13 приводит к развитию аритмий. При этом если в отсутствии растяжения под действием IL13 наблюдалось уменьшение APD, то растяжение вызывает выраженное увеличение ритма, подобное пароксизмальной тахикардии. Если же в отсутствии растяжения ткани наблюдалось увеличение APD, то растяжение вызывает множественные экстрасистолы.

10. Цитокины являются эффективными модуляторами работы механоуправляемых ионных каналов. Влияние на работу MGCs, вероятно, осуществляется через регуляцию работы NO-синтаз, что приводит к росту APD90 и возникновению humplike деполяризации. Можно предположить, что in vivo активация системы цитокинов может быть одной из причин компенсаторного (адаптивного) увеличения

сократительной активности ткани миокарда в интервале времени от нескольких минут до нескольких дней.

Практическая значимость результатов

Помимо исключительно теоретического значения полученные данные представляют интерес для практической медицины. Исследования представляют собой научную базу для поиска методов ранней доклинической диагностики аритмий и фибрилляций, а также могут стать основой разработки принципиально новых фармакологических препаратов для лечения этих заболеваний.

Внедрение результатов исследований

Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс и научно-исследовательскую работу кафедры физиологии, а также НИЛ электрофизиологии НИИФПБИ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ.

Апробация работы

Диссертация апробирована на объединенной научной конференции кафедры фундаментальной и прикладной физиологии МБФ (с 01.09.2012 - кафедры физиологии МБФ) и НИЛ электрофизиологии НИИФПБИ РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ 10 октября 2011 года.

Публикации по теме диссертации: по теме опубликовано 4 статьи.

Структура и объем диссертации

Диссертация написана по стандартному принципу и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов с их обсуждением, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, включая 41 рисунок, 16 таблиц и список литературы из 392 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследований. Работу выполняли на свежевыделенных препаратах фрагментов ткани правого предсердия крыс (самцы линии Вистар, 290-300 г.).

Перфузионнын раствор для жизнеобеспечения ткани предсердий (мМ/л): NaCl - 137, КС1 - 5.4, СаС12 - 1.0, MgCb - 0.5, HEPES - 5.0, глюкоза - 5.5; барбатирование 100% 02; осмолярность 290±5 мОсМ; рН = 7.4±0.02; t = 37+0.2°С.

Используемые соединения:

Вещество Концентрация Функция

IL-la, IL-ip, IL-2, IL-6, IL-17а, IL-18, VEGF 50 нг/мл провоспалительные цитокины

IL-13 50 нг/мл противовоспалительный цитокин

хлорид гадолиния (Gd3+) 40 мкМ/л блокатор MGCs

Система жизнеобеспечения ткани предсердия представляла собой открытую проточную систему подачи раствора в перфузионную камеру при помощи перистальтического насоса.

Мнкроэлектродная техника. Для работы на спонтанно сокращающихся фрагментах ткани правого предсердия был использован метод внутриклеточного исследования биопотенциалов кардиомиоцитов с помощью стандартных «плавающих» микроэлектродов, изготовленных из стеклянных капилляров диаметром 1.0-1.1 мм с пятью филаментами внутри. Микроэлектроды заполняли 2.5 М/л раствором КС1; электрическое сопротивление - в диапазоне 7-10 МОм.

Для регистрации биопотенциалов кардиомиоцитов использовали режим фиксации токов (current clamp). Помимо регистрации базовой активности клеток сердца, проводили измерение биопотенциалов при дозированном растяжении предсердия. Фрагмент ткани предсердия растягивали с помощью микроманипулятора, регистрируя степень растяжения в микрометрах и одновременно фиксируя посредством механоэлектрического преобразователя изменение величины resting force (RF; изометрической силы, регистрируемой в период между сокращениями) и active force (AF; силы сокращений препарата).

Протоколы экспериментов.

Во всех случаях регистрировали RP, АР, RF, AF. В работе применяли 6 различных протоколов, определяемых потенциально возможными механизмами.

Протокол 1 (п=15): предрастяжение ткани —> регистрация в течение 60 мин. Цель - исследование биоэлектрической активности фрагмента правого предсердия крыс в контрольных условиях.

Протокол 2 (п=15): предрастяжение ткани —* растяжение ткани —> устранение растяжения. Цель - исследование биоэлектрической активности фрагмента правого предсердия крыс в контрольных условиях с использованием растяжения.

Протокол 3 (п=15): предрастяжение ткани —* введение исследуемого цитокина. Цель - исследование биоэлектрической активности фрагмента правого предсердия крыс под воздействием исследуемого цитокина.

Протокол 4 (п=15): предрастяжение ткани —> введение исследуемого цитокина —> растяжение ткани. Цель - исследование биоэлектрической активности фрагмента правого предсердия крыс под воздействием исследуемого цитокина с одновременным ступенчатым растяжением.

Протокол 5 (п=15): предрастяжение ткани —> введение Gd3+ —» растяжение ткани. Цель - исследование влияния гадолиния до дискретного растяжения ткани на возможность возникновения механоиндуцированных электрических абнормалыюстей у кардиомиоцитов.

Протокол 6 (п=15): предрастяжение ткани —► растяжение ткани —> введение Gd3+. Цель - исследование влияния гадолиния на механоиндуцированные электрические абнормальности у кардиомиоцитов на фоне дискретного растяжения ткани.

Обработка результатов экспериментов. Полученные с помощью микроэлектродной техники данные оцифровывали (АЦП L-card Е-154, 10 кГц). Для обработки и анализа были отобраны 232 записи, полностью соответствующие планируемому протоколу экспериментов.

Данные проанализированы с помощью коммерческого программного пакета PowerGraph 3.3. Изменяли величину потенциала покоя (RP), амплитуду потенциала действия (АР) и длительность потенциала действия на уровне 25%, 50% и 90% фазы реполяризации (APD25, APD50, APD90, соответственно).

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием программного пакета SPSS 17. Различия считались достоверными при р<0.05. Данные представлены в виде: среднее ± ошибка среднего (п - количество проведенных экспериментов).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И 11ХОБСУЖДЕНИЕ

Биоэлектрическая активность кардиомиоцитов в контрольных условиях

Стандартное предрастяжение препарата вызывало величину AF, равную 0.3 мН. При контрольной регистрации на фоне предрастяжения препарата (0.1 мН), перфузия ткани физиологическим раствором в течение 60 мин (п=15) не приводила к изменениям RF (1.0±0.01 мН), AF (0.3+0.01 мН), RP (-86.4±1.6 мВ), АР (113.8±2.4 мВ), APD25 (5.5+1.0 мс), APD50 (8.9±1.6 мс), APD90 (27.5±4.7 мс), а также частоты сокращений (181.9+0.01 уд/мин).

Биоэлектрическая активность кардиомиоцитов на фоне растяжения

Дозированное растяжение ткани, как и в предыдущих работах научной группы А.Г. Камкина, вызывало изменения биоэлектрической активности кардиомиоцитов в виде удлинения APD90 (-65%) и, реже - APD50 (-35%), с последующим формированием на уровне APD90 и APD50 так называемой hump-like («горбообразной») деполяризации. В случае, если hump-like деполяризация достигала критического уровня, развивались экстрапотенциалы действия. Блокатор механоуправляемых ионных каналов хлорид гадолиния при добавлении как до, так и после механического воздействия, предотвращал развитие изменений биоэлектрической активности клеток, вызванных растяжением ткани. Следовательно, наблюдаемая в наших экспериментальных условиях hump-like деполяризация, определяется активацией MGCs кардиомиоцитов, что согласуется с полученными ранее данными [Kamkin et al„ 2000, 2003, 2010].

Влияние интерленкина-lu на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов

IL-la в отсутствие растяжения через 35 мин перфузии вызывал значимое увеличение APD90 без изменения величин APD25 и APD50 (табл. 1, рис. 1). При этом hump-like деполяризации не наблюдалось.

Табл. 1. Влияние интерлейкина-1 а на длительность потенциала действия на уровне 25%, 50% и 90% фазы реполяризации.

фон IL-la, 35 мин

APD25, мс 4,59 ±0,13 4,67 ± 0,09

APD50. мс 17,35 ±0,73 16,73 ±0,13

APD90, мс 62.65 ± 1.5 75.96 ±0.61***

- р < 0.001 по сравнению с фоном

А Контроль

АР RP ■

Б IL-la, 50 нг/мл, 35 мин

jJ-Jji. 1-85 0,5 сек

АР 1 RP —

Ш1ІШІ

\ \Ж

APD25

APD50

IL-la ,35 мин

APD90

-85

+

контроль 0,25 сек

—---У-1 -85

0,25 сек

Рис. 1. Влияние II.-1а на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов правого предсердия крыс. А - контроль; Б - 35 мин перфузии 1Ь-1а; В - наложенные друг на друга потенциалы действия из (А) и (Б).

Дозированное растяжение ткани на фоне 1Ь-1а вызывало возникновение абнормальностей биоэлектрической активности кардиомиоцитов, заключавшихся преимущественно в удлинении АР090. После 10-12 мин перфузии растяжение препарата приводило к учащению ритма и появлению относительно коротких участков тахикардии (рис. 2). Устранение растяжения приводит к нормализации ритма.

инь

увеличено

il)li!l!ili!i

IL-la, 50 нг/мл, 35 мин

увеличено

RF/

АР RP"

J_i_J i

Растяжение

4

удлинение APD90

i И

-85

I_1_i_»_» I

I

V—V L-85 0,1 сек

Рис. 2. Влияние растяжения ткани правого предсердия крыс на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов и механическую активность препарата на фоне 1Ь-1а: А - и Б -синхронная регистрация биоэлектрической активности и силы сокращения препарата, соответственно, В - увеличенные фрагменты кривых (А). На левой панели - контроль, на правой - 1Ь-1а.

Влияние интерлейкина-1 р на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов

IL-lp не вызывал изменение амплитуды потенциалов действия и величины потенциала покоя в течение 35 минут. Перфузия цитокина не вызывала появления hump-like деполяризации. В тоже время перфузия ткани раствором цитокина вызывала появление паттернов экстрасистолии, которые чередовались с периодами

нормальной активности (рис. 3).

А Контроль

АР ч ....... . . I i I i И ГО

RP- —-

JCuU. 1.85 0,5 сек

IL-ip, SO нг/мл, 35 мин

АР RP-

'"¿-Л; I -85 0,5 сек

Рис. 3. Влияние 1ЫР на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов правого предсердия крыс. А - контроль; Б - 35 мин перфузии 1Ь-1р.

Дозированное растяжение ткани на фоне перфузии 1Ь-1|3 не вызывало изменений биоэлектрической активности кардиомиоцитов (рис. 4).

Контроль

увеличено

АР RP

Б

AF

Л

IL-lß, 50 нг/мл, 35 мин

А увеличено

Ш^ЙУаШа!

шг

0

№ к

2 сек

2 сек

%

хш

RF'

♦ МП!

Растяжение

щшжш

2 сек

ЫЖГ Ы

liüJiiiP

IHM I

-85

1,7 мН

2 сек

В

АР

RP ■

мВ

-85

удлинение ОД сек APD90

0,1 сек

Рис. 4 Влияние растяжения ткани правого предсердия крыс на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов и механическую активность препарата на фоне ¡Ь-ф: А — и Б — синхронная регистрация биоэлектрической активности и силы сокращения препарата, соответственно, В — увеличенные фрагменты кривых (А). На левой панели — контроль, на правой - 1Ь-1р.

Несмотря на то, что 1Ь-1а и 1Ь-1(3 реализуют свои эффекты через один рецептор, отличие в характере влияния на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов может быть связано с различной афинностыо этих цитокинов.

Влияние интерлейкина-2 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов

IL-2 в отсутствие растяжения через 35 мин перфузии вызывал значимое увеличение APD на всех уровнях (табл. 2, рис. 5). При этом цитокин вызывал появление паттернов плавного учащения ритма, за которыми следовали фрагменты пароксизмальной тахикардии, переходящей в нормальный ритм.

Табл. 2. Влияние интерлейкина-2 на длительность потенциала действия на уровне 25%, 50% и 90% фазы реполяризации.

фон IL-2, 35 мин

APD25, мс 9.56 ±0.07 11.23 ±0.13***

APD50, мс 19.67 ±0.07 23.28 ±0.12***

APD90, мс 46.05 ± 0.20 53.98 ±0.34***

*** - р < 0.001 по сравнению с фоном

А Контроль АР

RP -1—

Б IL-2, 50 нг/мл, 35 мин

АР RP ■

АР ) RP

1

illiill

MB

0,5 сек

мВ

-85

0,5 сек

іічі|Ии:іі

MB

-85

0,5 сек

АР 1 RP

ЩИ

0,5 сек

J мВ

85

АР И RP

11!!

uWv

wf.

II

I ^ vi UU si\i W

fO MB

v 1-85

0,5 сек

Рис. 5. Влияние IL-2 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов правого предсердия крыс. А - контроль; Б-Д - фрагменты пароксизмальной тахикардии на фоне IL-2.

Дозированное растяжение ткани на фоне IL-2 вызывало возникновение абнормальностей биоэлектрической активности кардиомиоцитов, заключавшихся преимущественно в удлинении APD90. После 20-25 минут перфузии, растяжение препарата на 1,7 мН приводило к возникновению hump-like деполяризаций без трансформации в одиночные экстрапотенциалы (рис. 6).

Контроль

увеличено

IL-2, 50 нг/мл, 35 мин

illliliiiriliiiiiilliilliliiilli ¡111И

|щ 2 сек

М)

щ \

AF RF t

ч. ¡М^ у**'

jMu

ijM'

м

Lmi

щ

%

L -85

1,7 мН

ИМИ)

Растяжение

♦ MM t

2 сек

В

АР RP

V

нВ

L-85

"hump-like" деполяризация

0,1 сек

Рис. 6. Влияние растяжения ткани правого предсердия крыс на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов и механическую активность препарата на фоне IL-2: А — и Б — синхронная регистрация биоэлектрической активности и силы сокращения препарата, соответственно, В - увеличенные фрагменты кривых (А). На левой панели - контроль, на правой - IL-2.

Влияние интерлейкина-6 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов

IL-6 в отсутствие растяжения через 35 мин перфузии вызывал значимое увеличение APD на всех уровнях (табл. 3, рис. 7). При этом hump-like деполяризации не наблюдалось.

Табл. 3. Влияние интерлейкина-6 на длительность потенциала действия на уровне 25%, 50% и 90% фазы реполяризации.

фон IL-6, 35 мин

APD25, мс 4.59 ±0.07 8.52 ±0.08***

APD50, мс 13.21 ±0.11 22.0 ± 0.11***

APD90, мс 41.03 ±0.25 56.99 ±0.37***

*** - р < 0.001 по сравнению с фоном Дозированное растяжение ткани на фоне IL-6 вызывало возникновение абнормальностей биоэлектрической активности кардиомиоцитов, заключавшихся в удлинении APD90. После 10 мин перфузии растяжение препарата на 1,7 мН вызывало возникновение редких hump-like деполяризаций на уровне APD90. После достижения критического уровня hump-like деполяризации трансформировались в одиночные экстрапотенциалы, в дальнейшем переходящие в тахикардию (рис. 8Б), которая устранялась растяжением ткани. Перфузия IL-6 более 20 мин приводила к появлению фибрилляции, возникающей даже при незначительном растяжении ткани (рис. 8В).

Б

АР RP

IL-6, 50 нг/мл, 35 мин о,5 сек

0,5 сек

APD25

APD50

- IL-6, 35 мин

_S_^APD90 контроль 0,25 сек

мБ

-85

Рис. 7. Влияние 1Ь-6 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов правого предсердия крыс. А - контроль; Б - 35 мин перфузии 1Ь-6; В - наложенные друг на друга потенциалы действия из (А) и (Б).

д Контроль

Г О

АР RP

Hi

Hi1

I|nh-V',' 'i'1';.!1!il'liil

AFx Щ.

RF/ ♦ ♦ ♦ ♦ *

Растяжение IL-б, 50 нг/мл, 10 мин

1,7 мн 2 сек

В IL-6, 50 нг/мл, 23 мин Фибрилляция

ар fliHIIIi'Mliiliiil | !|, !1||1

RP .......------------

lit

иЖ!^

L

IWjjH

alULJJ

Ii„

J_1_LJ i

MB

-85

1,7 MH

Растяжение

LJ HtM

Растяжение

5 сен

Рис. 8. Влияние растяжения ткани правого предсердия крыс на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов и механическую активность препарата на фоне IL-6. А - контроль; Б -10 мин перфузии IL-6; В - 23 мин перфузии IL-6. Верхняя и нижняя кривые - синхронная регистрация биоэлектрической активности и силы сокращения препарата, соответственно.

Влияние интерлейкина-17а на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов

IL-17a в отсутствие растяжения через 35 мин перфузии вызывал значимое увеличение APD (табл. 4, рис. 9). При этом hump-like деполяризации не наблюдалось.

Табл. 4. Влияние интерлейкина-17а на длительность потенциала действия на уровне 25%, 50% и 90% фазы реполяризации.

фон IL-17a, 35 мин

APD25, мс 11.59 ±0.09 12.41 ±0.08**

APD50, мс 26.34 ±0.15 28.32 ±0.15***

APD90, мс 56.0 ±0.27 60.27 ±0,13***

** - р <0.01; *** - р < 0.001 по сравнению с фоном

АР RP

и В

l-85

0,5 сек

Il_-17(Jf SO нг/мл, 35 мин

MB

V ж

APD25 APD50

IL-17«,35 мин

APD90

-85

-85

+

контроль 0,25 СЄК

0,5 сек

Рис. 9. Влияние 1L-I7a на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов правого предсердия крыс. А - контроль; Б - 35 мин перфузии IL-17a; В - наложенные друг на друга потенциалы действия из (А) и (Б).

Дозированное растяжение ткани на фоне IL-17a вызывало возникновение абнормальностей биоэлектрической активности кардиомиоцитов, заключавшихся в удлинении APD90 (рис. 10). После 10 мин перфузии, растяжение препарата на 1,7 мН приводило к возникновению редких hump-like деполяризаций на уровне APD90. После достижения критического уровня hump-like деполяризации трансформировались в одиночные экстрапотенциалы без развития тахикардии. При этом частота следования потенциалов действия значимо не изменялась.

Контроль IL-17a, 50 нг/мл, 35 мин

АРоао

Рис. 10. Влияние растяжения ткани правого предсердия крыс на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов и механическую активность препарата на фоне 1Ь-17а.: А - и Б - синхронная регистрация биоэлектрической активности и силы сокращения препарата, соответственно, В - увеличенные фрагменты кривых (А). На левой панели - контроль, на правой-1Ь-17а.

Влияние интерлейкина-18 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов

IL-18 в отсутствие растяжения не вызывал достоверного изменения величины потенциала покоя, амплитуды и частоты следования потенциалов действия в течение 35 мин перфузии. При этом APD на всех уровнях достоверно увеличивалась (рис. 11). д Контроль

ар 1 М И 1 Ч ! 1 f°"B Bi

Rp J_____I -85 _J_APD25

О

0,5 сек —-APD50

Б IL-18, 50 нг/мл, 35 мин

мВ

-85

АР И И И [ \ : 5 I "■» 0,25 сек

RP jJU^UJUw^U^ 1.85 0,5 сек

Рис. 11. Влияние IL-18 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов правого предсердия крыс. А - контроль; Б - 35 мин перфузии 1L-18; В - наложенные друг на друга потенциалы действия из (А) и (Б). Представлены фрагменты оригинальных записей.

Дозированное растяжение ткани на фоне перфузии IL-18 не вызывало появления «hump-like» деполяризации, аналогичной наблюдаемой в контрольных экспериментах. Частота следования потенциалов действия также не изменялась.

Влияние VEGF на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов

VEGF в отсутствие растяжения через 35 мин перфузии вызывал значимое увеличение APD90 без изменения величин APD25 и APD50 (табл. 5, рис. 12). При этом hump-like деполяризации не наблюдалось.

Табл. 5. Влияние VEGF на длительность потенциала действия на уровне 25%, 50% и 90% фазы реполяризации.

фон VEGF, 35 мин

APD25, мс 8,85 ± 0,24 9,93 ±0,16

APD50, мс 22,87 ±0,16 25,58 ±0,11

APD90, мс 48.23 ±0.18 52.07 ±0.35*

АР RP

Контроль

J—

-85

АР RP

0,5 сек

В VEGF, 50 нг/мл, 35 мин

Г о

0,5 сек

* - р < 0.05 по сравнению с фоном

J_ APD25

¡1

_ APD50

VEGF, 35 глин

. APD90

НВ контроль 0,25 сек

мВ

Рис. 12. Влияние VEGF на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов правого предсердия крыс. А - контроль; Б - 35 мин перфузии VEGF; В - наложенные друг на друга потенциалы действия из (А) и (Б).

Дозированное растяжение ткани на фоне VEGF вызывало возникновение абнормальностей биоэлектрической активности кардиомиоцитов, преимущественно заключавшихся в удлинении APD90 (рис. 13). После 7-10 мин перфузии, растяжение препарата на 1,7 мН приводило к возникновению редких hump-like деполяризаций на уровне APD90. После достижения критического уровня hump-like деполяризации трансформировались в одиночные экстрапотенциалы без развития тахикардии. При этом частота следования потенциалов действия значимо не изменялась.

VEGF, 50 нг/мл, 35 мин

А увеличено

Контроль

увеличено

АР

RP Ш.

0

Б

AFv

мм

jW

RF/"

АР RP

нмп

Растяжение

удлинение APD90

2 сек

2 сек в

0.1 сек

Л

н »t

2 сек

Ч.

нВ

1,7 мН

♦ Н Ht 2 сек

мВ

-85

0,1 сек

Рис. 13. Влияние растяжения ткани правого предсердия крыс на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов и механическую активность препарата на фоне VEGF: А - и Б - синхронная регистрация биоэлектрической активности и силы сокращения препарата, соответственно, В - увеличенные фрагменты кривых (А). На левой панели - контроль, на правой - VEGF.

Влияние противовоспалительного интерлейкина-13 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов

IL-13 в отсутствие растяжения через 35 мин перфузии в 42% случаев вызывал значимое уменьшение (табл. 6, рис.14А), а в 58% случаев - увеличение (табл. 6, рис. 14Б) APD на всех уровнях. Кроме того, IL-13 за 35 мин регистрации уменьшал силу сокращений препарата на 50%.

Табл. 6. Влияние IL-13 на длительность потенциала действия (мсек) на уровне 25%, 50% и 90% фазы реполяризации.

уменьшение APD (п=6) увеличение APD (п=8)

фон IL-13, 35 мин фон IL-13, 35 мин

APD25, мс 7.21 ± 1.51 4.28 ± 1.18** 6.07 ± 1.52 10.0 ± 1.53*

APD50, мс 22.96 ±2.59 13.27 ±3.93*** 16.56 ±2.70 27.66 ±2.28***

APD90, мс 46.72 ±2.91 28.60 ±6.85*** 47.78 ±6.36 59.46 ±5.34*

AI

* - p <0.05; ** - p <0.01; *** - p < 0.001 по сравнению с фоном Контроль

11

АР RP

нВ

-85

A3

0,5 сек

А2 IL-13, 50 нг/мл, 35 мин

АР

RP —

-85

¿5=

_APD25

_APD50

контроль APD90

мВ

-85

IL-13, 35 мин 0,25 сек

БЗ

0,5 сек

Б2 IL-13, 50 нг/мл, 35 мин

I

АР RP

_ APD 25 APD50

IL-13, 35 мин _APD90

U4J 0,5 сек

мВ

■85

мВ

-85

контроль 0,25 сек

Рнс. 14. Влияние IL-13 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов правого предсердия крыс. А - IL-13 уменьшает APD на всех уровнях: AI - контроль; А2 - 35 мин перфузии IL-13; A3 - наложенные друг на друга потенциалы действия из (AI) и (А2). Б - IL-13 увеличивает APD на всех уровнях: Б1 - контроль; Б2 - 35 мин перфузии IL-13; БЗ - наложенные друг на друга потенциалы действия из (Б1) и (Б2).

Дозированное растяжение ткани на фоне IL-13 приводило к нарушениям ритма. При этом характер изменений различался. Если без растяжения ткани под действием цитокина наблюдали уменьшение APD, то растяжение вызывало выраженное увеличение ритма, подобное пароксизмальной тахикардии - частота следования потенциалов увеличивалась на 120%. (рис. 15, левая панель). При этом происходило дальнейшее уменьшение APD. Если же без растяжения ткани под действием IL-13 наблюдали увеличение APD. то растяжение вызывало множественные экстрасистолы (рис. 15, правая панель), а также снижение частоты на 10% по сравнению с контролем. При этом происходило дальнейшее увеличение APD.

Результаты экспериментов с различными провоспалительными цитокинами (1Е-1а, 11^-1 р, 1Е-2, 1Ь-6, \L-\la, 1Е-18, УЕйР) показали сходные эффекты влияния на

биоэлектрическую активность кардиомиоцитов в покое и при растяжении. Как правило, в отсутствие механических воздействий под влиянием цитокинов происходило увеличение APD, а дозированное растяжение ткани на фоне перфузии пептидами вызывало hump-like деполяризацию. В случае противовоспалительного IL-13 наблюдалось разнонаправленное влияние на APD.

IL-13, 50 нг/мл, 35 мин IL-13, 50 нг/мл, 35 мин

А увеличено д увеличено

Рис. 15. Влияние растяжения ткани правого предсердия крыс на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов и механическую активность препарата на фоне 11.-13: А - и Б -синхронная регистрация биоэлектрической активности и силы сокращения препарата, соответственно, В - увеличенные фрагменты кривых (А). На левой панели - эффект растяжения при уменьшении АРР, на правой - при увеличении АРЭ на фоне 1ЫЗ.

Вероятный механизм кардиотропного действия цитокинов связан с влиянием на ТчЮ-синтазы кардиомиоцитов: в случае провоспапительных цитокинов происходит увеличение уровня внутриклеточного оксида азота [Киггшп й а1., 2012], а в случае противовоспалительных - его уменьшение [АЬгатосЬкш е1 а1., 2012]. В результате изменения концентрации N0 меняется активность механочувствительных каналов клеток сердца [К^апвку а а1., 2011]. Так как провоспалительные цитокины [АЬгатос11кт е! а1., 2012; Киггшп е! а1„ 2012] и растяжение ткани [Рей-ой е! а1„ 2001] независимо друг от друга активируют ЫО-синтазы и повышают концентрацию N0, их конечный эффект на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов определяется суммарным уровнем внутриклеточного оксида азота. При этом необходимо учитывать, что в низких концентрациях N0 активирует механоуправляемые каналы кардиомиоцитов, а в высоких - инактивирует их [Кагапвку е! а1., 2011]. Следует отметить, что опосредованная цитокинами регуляция деятельности сердца может осуществляться и Ж>-независимыми путями.

выводы

1. Растяжение ткани предсердия вызывает возникновение hump-like деполяризации кардиомиоцитов. Если деполяризация на уровне APD90 достигает критического уровня, генерируются экстрапотенциалы действия. Механизм этого явления - в активации механоуправляемых ионных каналов, поскольку механоиндуцированная hump-like деполяризация ингибируется неселективным блокатором MGCs хлоридом гадолиния.

2. IL-la в отсутствии растяжения вызывает увеличение APD90 и частоты следования потенциалов действия. Влияние на силу сокращений отсутствует. При этом возникают одиночные экстрасистолы. Дозированное растяжение ткани на фоне IL-la вызывает редкие hump-like деполяризации на уровне APD90, происходит учащение ритма и появление относительно коротких участков тахикардии, устраняемых отменой растяжения.

3. IL-ip в отсутствии растяжения не приводит к изменению на всех уровнях, а также силы сокращений. При этом возникают паттерны экстрасистолии, которые чередуются с периодами нормальной активности. Дозированное растяжение ткани на фоне IL-ip не вызывает изменения биоэлектрической активности кардиомиоцитов.

4. IL-2 в отсутствии растяжения вызывает увеличение APD на всех уровнях. Влияние на силу сокращений отсутствует. При этом возникают паттерны пароксизмальной тахикардии, переходящие в нормальный ритм. Дозированное растяжение ткани на фоне IL-2 вызывает hump-like деполяризацию, не переходящую в экстрапотенциалы.

5. IL-6 в отсутствии растяжения вызывает увеличение APD на всех уровнях. Влияние на частоту и силу сокращений отсутствует. Дозированное растяжение ткани на фоне IL-6 через 7-10 минут вызывает hump-like деполяризации на уровне APD90, которые трансформируются в одиночные экстрапотенциалы, устраняющиеся дополнительным растяжением. Через 10 мин и далее IL-6 на фоне растяжения вызывает фибрилляцию, возникающую даже при незначительном механическом воздействии.

6. IL-17a в отсутствии растяжения вызывает увеличение APD на всех уровнях. Влияние на частоту и силу сокращений отсутствует. Дозированное растяжение ткани на фоне IL-17a вызывает редкие hump-like деполяризации на уровне APD90, которые трансформируются в одиночные экстрапотенциалы без развития тахикардии. Частота следования потенциалов действия не изменяется.

7. IL-18 в отсутствии растяжения вызывает увеличение APD на всех уровнях. Влияние на частоту и силу сокращений отсутствует. Дозированное

растяжение ткани на фоне IL-18 не вызывает изменения биоэлектрической активности кардиомиоцитов.

8. VEGF в отсутствии растяжения вызывает увеличение APD90. Влияние на частоту и силу сокращений отсутствует. Дозированное растяжение ткани на фоне VEGF вызывает редкие hump-like деполяризации на уровне APD90, которые трансформируются в одиночные экстрапотенциалы без развития тахикардии. Частота следования потенциалов действия не изменяется.

9. IL-13 в отсутствии растяжения в 52% экспериментов вызывает увеличение, а в 48% - уменьшение APD на всех уровнях. При этом возникает humplike деполяризация. В случаях, когда IL-13 вызывает уменьшение APD, дозированное растяжение ткани приводит к выраженному увеличению ритма, подобному пароксизмальной тахикардии. В случаях, когда IL-13 вызывает увеличение APD, дозированное растяжение ткани приводит к некоторому уменьшению ритма и возникновению множественных экстрасистол.

10. Вероятная физиологическая роль цитокинов в регуляции механоэлектрической обратной связи заключается во влиянии на механоуправляемые каналы. Вызывая благодаря активации MGCs деполяризацию кардиомиоцитов, рост APD90 и возникновение hump-like деполяризации, цитокины в интервале времени от нескольких десятков минут до нескольких дней могут таким образом увеличивать сократительную активность ткани миокарда, что может выступать компенсаторным механизмом.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Mitrochin V.M. The role of proinflammatory cytokines in regulation of cardiac bioelectrical fctivity: link to mechanoelectrical feedback. / Kuzmin V.S., Abramochkin D.V., Mitrochin V.M., Tian В., Makarenko E.Yu., Kovalchuk L.V., Khoreva M.V., Nikonova A., Kalugin L., LysenkN.N., Lozinsky I., Rozanov A., Arutyunov G., Kiseleva I., Kamkin A. // Mechanosensitivity in cells and tissues. V. 5, P. 107-154, 2012.

2. Mitrochin V.M. An anti-inflammatory cytokine interleukin-13: physiological role in the heart and mechanoelectrical feedback. / Abramochkin D.V., Makarenko E.Yu., Mitrochin V.M., Tian В., Kuzmin V.S., Kalugin L., Kovalchuk L.V., Khoreva M.V., Nikonova A., Lozinsky I., Kamkin A. // Mechanosensitivity in cells and tissues. V. 5, P. 155-164,2012.

3. Митрохин B.M. Влияние оксида азота на механоэлектрическую обратную связь в правом предсердии крыс. / Абрамочкин Д.В., Макаренко Е.Ю., Митрохин В.М., Tian В., Калугин Л.Ю., Сутягин П.В., Камкин А.Г. // Бюллетень экспериментальной биологии н медицины 153(1): 39-42,2012.

4. Митрохин В.М. Влияние интерлейкина-13 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов предсердия крыс в норме и при дозированном растяжении ткани. / Митрохин В.М., Макаренко Е.Ю., Абрамочкин Д.В., Камкин А.Г. // Российский физиологический журнал им И.М. Сеченова, 98(7): 827-835,2012.

Отпечатано в «типография «Унопресе» Телефон: +7 (495) 660-30-44 Почта: uno@unopress.ru www.unopress.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Митрохин, Вадим Михайлович, Москва

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И. ПИРОГОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

04201450419

Митрохин Вадим Михайлович

РОЛЬ ЦИТОКИНОВ В РЕГУЛЯЦИИ МЕХАНОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ОБРАТНОЙ СВЯЗИ В ПРАВОМ ПРЕДСЕРДИИ КРЫС

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

03.03.01 - физиология

Научный руководитель:

д. м. н., профессор А. Г. Камкин

г. Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................................................7

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................14

1.1. Теория механоэлектрической обратной связи в сердце.........................................14

1.2. Система цитокинов............................................................................................16

1.2.1. Характеристика системы цитокинов..........................................................18

1.3. Общие характеристики цитокинов:................................................................19

1.4. Роль некоторых цитокинов в патогенезе заболеваний сердечно-сосудистой системы ............................................................................................................20

1.4.1. Инициирующие триггеры............................................................................20

1.4.2. Прогрессирующая сердечная недостаточность.........................................21

1.4.3. Кардиотропные цитокины - адаптивный ответ на стресс.........................22

1.4.4. Патологичекое влияние цитокинов.............................................................22

1.5. Роль цитокинов в регуляции механоэлектрической обратной связи в сердце.........23

1.5.1. Кардиотропные эффекты провоспалительных цитокинов и их возможные механизмы...........................................................................................................24

1.5.2. Провоспалительные цитокины при остром инфаркте миокарда.............26

1.5.3. Роль провоспалительных цитокинов в развитии сердечной недостаточности......................................................................................................................28

1.5.4. Провоспалительные цитокины как индукторы аритмии.......................................28

1.5.5. Изменение ионных токов - вероятный механизм кардиотропного действия цитокинов ............................................................................................................29

1.6. Цитокины и механосенситивность в сердце..................... ....................................33

1.6.1. Фактор некроза опухоли альфа...................................................................34

1.6.2. Интерлейкин 6...................................................................................................35

1.6.3. Интерлейкин-13................................................................................................36

1.7. Оксид азота как один из механизмов реализации влияния цитокинов на кардиомиоциты..........................................................................................................36

1.7.1. Влияние оксида азота на натриевые каналы..............................................36

1.7.2. Влияние оксида азота на кальциевые каналы............................................37

1.7.3. Влияние оксида азота на калиевые каналы................................................39

1.7.4. Влияние оксида азота на механосенситивные каналы..............................40

1.8. Заключение.......................................................................................................42

ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ........................................................43

2.1. Объект исследований.........................................................................................43

2.2. Методика получения препарата правого предсердия............................................43

2.3. Перфузионная среда..........................................................................................44

2.4. Факторы воздействия на клетки..........................................................................45

2.5. Метод исследования микроэлектродной техникой...............................................46

2.6. Экспериментальная установка для микроэлектродных исследований клеток возбудимых тканей....................................................................................................46

2.7. Электронно-измерительная система для регистрации биопотенциалов клеток.......47

2.8. Электронно-измерительная аппаратура для регистрации сократительной активности фрагментов предсердий и их механической стимуляции.............................48

2.9. Характеристика регистрируемых параметров......................................................50

2.10. Протоколы исследований...................................................................................51

2.11. Обоснование применения многоклеточного препарата и метода current-clamp для исследований.............................................................................................................52

2.12. Технические особенности (ограничения).............................................................53

2.13. Методы обработки результатов экспериментов...................................................54

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................55

2.14. Изучение биоэлектрических и механических параметров фрагмента ткани правого предсердия крыс в норме................................................................................55

2.15. Изучение механо-индуцированных электрических абнормальностей

кардиомиоцитов при растяжении................................................................................56

2.16. Деполяризация, вызванная растяжением, является механоиндуцированной деполяризацией..........................................................................................................64

2.17. Влияние 1Ь-13 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов........................66

2.17.1. Обсуждение полученных результатов......................................................71

2.17.2. Вывод...........................................................................................................72

2.18. Влияние 1Ь-18 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов........................73

2.18.1. Обсуждение полученных результатов......................................................76

2.18.2. Вывод...........................................................................................................78

2.19. Влияние 1Ь-2 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов..........................78

2.19.1. Обсуждение полученных результатов......................................................81

2.19.2. Вывод...........................................................................................................83

2.20. Влияние 1Ь-1 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов..........................83

2.20.1. Обсуждение полученных результатов......................................................89

2.20.2. Вывод...........................................................................................................90

2.21. Влияние 1Ь-17а на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов......................90

2.21.1. Обсуждение полученных результатов......................................................94

2.21.2. Вывод...........................................................................................................94

2.22. Влияние 1Ь-6 на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов..........................95

2.22.1. Обсуждение полученных результатов......................................................98

2.23. Вывод..............................................................................................................99

2.24. Влияние УЕОР на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов.......................99

2.24.1. Обсуждение полученных результатов....................................................102

2.25. Вывод............................................................................................................103

2.25.1. Заключение................................................................................................103

2.26. Практическое значение....................................................................................105

ВЫВОДЫ........................................................................................................................................106

БЛАГОДАРНОСТЬ........................................................................................................................139

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................108

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

русскоязычных терминов и эквивалентных им международных аналогов

Высокопроницаемые контакты мембран (нексусы применительно к сердцу) - gap junctions (GJ).

Длительность потенциала действия на уровне 25% фазы реполяризации - action potential duration at 25% (APD25).

Длительность потенциала действия на уровне 50% фазы реполяризации - action potential duration at 50% (APD50).

Длительность потенциала действия на уровне 90% фазы реполяризации - action potential duration at 90% (APD90).

Донор NO SNAP - S-Nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP).

Донор NO DEA-NO - 2-(N,N-Diethylamino)-diazenolate-2-oxide diethylam-monium salt (DEA-NO).

Изометрическая сила, регистрируемая у несокращающейся мышцы (или в период между сокращениями) при данной степени предрастяжения или растяжения - resting force (RF).

Изометрическая сила, регистрируемая у сердечной мышцы в период сокращения - active force (AF).

Конфигурация whole-cell - конфигурация взаимоотношений patch-пипетка - мембрана в методе patch-clamp, при которой клетка целиком удерживается микропипеткой, а ее внутреннее содержимое контактирует (или определяется) с раствором, заполняющим patch-пипетку.

Ловушка эндогенного оксида азота: РТЮ - 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethyl-imidazoline-1-1 -оху-3 -oxide (РТЮ).

Механо-электрическая обратная связь - mechano-electrical feedback (MEF). Механо-индуцированная деполяризация - stretch induced depolarization (SID) - МИД. Механо-управляемые каналы - mechanically gated channels (MGCs).

Механо-управляемые каналы, активируемые растяжением - stretch-activated channels (SACs).

Механо-индуцированная деполяризация на уровне 50% фазы реполяризации потенциала действия - stretch induced depolarization at APD50 (SID-APD50).

Механо-индуцированная деполяризация на уровне 90% фазы реполяризации потенциала действия - stretch induced depolarization at APD90 (SID-APD90).

Метод изучения ионных токов, протекающих через мембрану целой клетки или одиночного ионного канала - patch-clamp.

Неспецифический блокатор NO-синтаз: L-NAME - N-нитро-Ь-аргинин (L-NAME).

Неспецифический блокатор NO-синтаз: L-NMMA - 1Ч-монометил-Ь-аргинина (L-NMMA).

NO-синтазы - совокупность трех существующих NO-синтаз (NOS1, NOS2, NOS3). Оксид азота - N0.

Пикообразная деполяризация на фоне фазы реполяризации потенциала действия - humplike depolarization (HLD).

Пикообразная механо-индуцированная деполяризация на фоне фазы реполяризации потенциала действия - hump-like stretch induced depolarization (HL-SID).

Пикообразная деполяризация на фоне фазы реполяризации потенциала действия, аналогичная механо-индуцированной деполяризация - hump-like stretch induced-like depolarization (HL-SILD).

Потенциал покоя - resting potential (RP).

Потенциал действия - action potential (AP).

Предрастяжение ткани - preload.

Синусо-артериальный узел - SA узел.

Фактор некроза опухоли (ФНО - TNF).

Электромеханическое сопряжение - excitation-contraction coupling (ЕСС).

Интерлейкин-1 альфа-IL-1а.

Интерлейкин-1 бета-IL-ip.

Интерлейкин-2 - IL-2.

Интерлейкин-6 - IL-6.

Интерлейкин-13 - IL-13.

Интерлейкин-17 альфа - IL-17a.

Интерлейкин-18 - IL-18.

Фактор роста эндотелия сосудов - VEGF.

ВВЕДЕНИЕ

Согласно закону Франка-Старлинга, «энергия сокращений, независимо от способа измерения, является функцией длины мышечных волокон», предшествующей сокращению [241; 242; 335; 365]. Данные полученные экспериментально и клинически косвенно свидетельствуют, что помимо хорошо известного электромеханического сопряжения, в сердце может существовать и механоэлектрическая обратная связь, в результате которой механические воздействия на сердечную мышцу ведут к изменению электрических процессов в миокарде. Примеры, косвенно подтверждающие наличие в сердце механоэлектрической обратной связи и ее роли в формировании аритмий, хорошо известны в клинике. Более того, одним из видов аритмий, заканчивающихся фибрилляцией, являются механоиндуцированные аритмии. Например, у больных с растяжением предсердий или с их гипертрофией нередко наблюдается развитие аритмий. Описаны случаи, когда механически индуцированная аритмия возникала у здоровых людей, если предсердия подвергались механическому раздражению (например, при введении катетера в сердце).

В 1967 году немецкие ученые R. Kaufmann и U. Theophile предположили возможность механоэлектрической обратной связи в мышечной ткани [2]. К сожалению, они не продолжили эти исследования. А в 1968 году английский физиолог MJ. Lab [354] высказал предположение о наличии механоэлектрической обратной связи в сердце. Из-за несовершенства экспериментальных методов того времени он не смог доказать ее наличие даже в более поздних работах. По его мнению, к механическим факторам, модулирующим электрическую активность сердца, относятся растяжение миокарда и/или изменение его сократительной активности. Только к 1996 году M.J. Lab показал, что монофазный потенциал действия изменяет свою форму при растяжении сердца внутрикамерными баллончиками (рис.1).

Рис. 1. Механоиндуцированная деполяризация кардиомиоцитов. Типичный монофазный потенциал действия нерастянутого левого предсердия (пунктирная линия) и монофазный потенциал действия на фоне растяжения предсердия (сплошная линия), зарегистрированный при помощи электрода-присоски. У последнего продемонстрировано появление механоиндуцированной ранней автодеполяризации, приводящей к удлинению АРБ90 (по [224]).

В дальнейших работах, выполненных преимущественно с использованием внеклеточного отведения биопотенциалов сердца, многие исследователи пытались доказать этот феномен, как механизм, лежащий в основе аритмий и фибрилляции, но дальше весьма спорных данных эти исследования не продвинулись. Было показано, что во фрагменте сердечной ткани, так же как и в целом сердце, растяжение деполяризовало мембраны клеток во время диастолы, меняя потенциалы действия и вызывая преждевременные возбуждения желудочков и аритмию [26; 59; 86; 87; 107; 109; 178]. Даже у эмбрионов растяжение изменяло работу сердца. Так у эмбрионов цыплят растяжение покоящейся сердечной трубки инициировало ее сокращения (рис. 2) [254]. Следовательно, в инициации работы сердца эмбриона может принимать участие увеличение внутрилюминального объема жидкости и давления [255]. Принципиальная возможность механоэлектрической обратной связи была продемонстрирована у различных животных в миокарде левого предсердия [224; 366], миокарде желудочков [85; 179; 180; 359], изолированном сердце [34; 109; 184; 257; 354], интактном сердце лабораторных животных [59; 86] и даже в сердце человека [188; 288; 289].

ОпА — Оммрт.ст

о па - w4m i. ц. 1 . i a i I . h:!t ** -50

2 па |

Рис. 2. Влияние растяжения на катионселективный канал в сердечной мышце эмбриона цыпленка. Входящий ток представляет собой смещение нулевого тока вниз (150 мМ К+ - в patch пипетке и раствор Тироде - в камере; потенциал пипетки +50 мВ) (по [254]).

Принципиальный прорыв в представлениях о механосенситивности произошел в 1984 году. Так, группа F. Sachs с применением новейшего на тот момент метода patch-clamp в конфигурациях cell-attached и outside-out patch показала, что изменение давления внутри patch-пипетки приводит к активации специфических ионных каналов, которые авторы назвали каналами, активирующимися при растяжении (stretch-activated channels) [100]. Позднее эти каналы были названы механоуправляемыми каналами (mechanically gated channels: MGC).

В ходе экспериментальной работы под руководством профессора Камкина было показано, что сердечные фибробласты являются механоэлектрическими преобразователями [343; 377; 384]. У этих электроневозбудимых клеток сокращение миокарда с последующим расслаблением вызывает пиковый потенциал, названный

механоиндуцированным потенциалом. Механоиндуцированный потенциал сердечного фибробласта возникает с небольшой задержкой относительно потенциала действия кардиомиоцита и повторяет кривую силы его сокращений. Было высказано предположение, что сердечный фибробласт - механоэлектрический преобразователь с мембранной системой чувствительной к механическим влияниям.

Далее, на ткани предсердий, было показано, что при растяжении в сочетании с микроэлектродной регистрацией возникает удлинение на уровне 90% фазы реполяризации (увеличение APD90) и увеличение амплитуды, которое при дальнейшем растяжении ткани переходит в так называемую горбообразную (hump-like) деполяризацию (рис. 3) [385].

прядрястижйии»

1мн aaf-o мн

Дар* о.зз мн

<- -85

i-1

5с

aaf» 0.40 мн

Рис. 3. Влияние растяжения ткани правого предсердия крыс на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов и механическую активность препарата: А и Б - синхронная регистрация биоэлектрической активности и силы сокращения препарата, соответственно, В - увеличенные фрагменты кривой (А). Обозначения: | - растяжение ткани; | - устранение растяжения; АБ - сила сокращений препарата; ЯР - изометрическая сила, регистрируемая в период между сокращениями; АР - потенциал действия; ЯР - потенциал покоя [385].

К середине 90-х годов считалось, что механизм механоэлектрической обратной связи включает в себя несколько уровней [354]. В физиологических условиях на клеточном уровне механические события (изменение длины и силы сокращения мышц) могут влиять на электрические процессы на мембране кардиомиоцитов за счет прямого влияния на мембрану клетки через механоуправляемые каналы [21; 122; 264; 265] или опосредовано за счет изменения концентрации свободного внутриклеточного кальция [33].

На уровне клеточной мембраны наличие механоуправляемых каналов позволяет понять механочувствительность клетки и ее роль в механизме механоэлектрической обратной связи. MGC активируются при растяжении, и это означает, что возможность их перехода в открытое состояние возрастает по мере увеличения напряжения (tension) клеточной мембраны. Известны как катионселективные и катионнеселективные MGC, так и анионные. Активация механоуправляемых каналов требует специфической конфигурации цитоскелета [282]. Несмотря на то, что модулирующее влияние растяжения миокарда на его электрическую активность убедительно показано в множестве экспериментов, участие MGC в механизме механоэлектрической обратной связи требовало прямых доказательств. В настоящее время наличие механоуправляемых каналов, реагирующих на изменение напряжения мембраны кардиомиоцитов, показано в работах целого ряда авторов [52; 158; 262; 289; 314; 315