Роль цАМФ-связывающих белков ЕРАС в регуляции сократимости кровеносных сосудов и сердца

Суханова, Ирина Федоровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль цАМФ-связывающих белков ЕРАС в регуляции сократимости кровеносных сосудов и сердца
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль цАМФ-связывающих белков ЕРАС в регуляции сократимости кровеносных сосудов и сердца"

На правах рукописи

-"оиао^д

СУХАНОВА ИРИНА ФЕДОРОВНА

РОЛЬ цАМФ-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ЕР АС В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИМОСТИ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ И СЕРДЦА

03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003058340

Работа выполнена в лаборатории общей физиологии им X С Коштоянца Института биологии развития им Н К Кольцова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Павел Владимирович Авдонин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор биологических наук

Игорь Сергеевич Захаров Андрей Андреевич Галкнн

Ведущее учреждение:

Иститут сравнительной биохимии и физиологии им И М Сеченова РАН, г Санкт-Петербург

Автореферат разослан <d£> апреля 2007 года

Защита диссертации состоится «23» мая 2007 года в 1100 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 238 01 при Институте биологии развития им Н К Кольцова РАН (119334, Москва, улица Вавилова, дом 26)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им Н К Кольцова РАН Факс (495) 135-80- 12 E-mail volma46@bkru

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002 238 01, кандидат биологических наук

Волина Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы цАМФ был открыт в конце 50-х годов прошлого века как вторичный посредник, передающий сигналы в клетку от множества юрмонов, нейротрансмиттеров, простагландинов, ряда других субстанций, которые активируют аденилатциклазу До недавнего времени считалось, что универсальным механизмом действия цАМФ является активация протеинкиназы А В 1998 г были обнаружены новые внутриклеточные мишени цАМФ - белки Epacl и Ерас2 (Exchange Proteins Activated by cAMP) Они широко распространены в организме и по крайней мере один из этих белков, Epacl, выявлен во всех исследованных тканях Связывая цАМФ, белки Ерас взаимодействуют с низкомолекулярными G-белками RaplA/2B и стимулируют замещение ГДФ на ГТФ в их регуляторном центре, поэтому их обозначают также как cAMP-GEF (guanine nucleotide exchange factor) Белки Rap активируют протеинкиназу B-Raf, которая, в свою очередь, активирует протеинкиназный каскад MEK/Erk Несколько позднее было установлено, что помимо Rap, белки Ерас активируют специфичную к фосфоинозитидам фосфолипазу C-s, KATP-каналы, влияют на функционирование хлорных каналов (Holz, 2006) В кардиомиоцитах мыши выявлен макромолекулярный комплекс Epacl с рианодиновыми рецепторами, протеинкиназой А и фосфодиэстеразой цАМФ (Dodge-Kafka et al, 2005)

Изучение роли белков Ерас в регуляции цАМФ-зависимых физиологических процессов находится на начальной стадии Показано, что, наряду с протеинкиназой А, белки Ерас активируют секрецию, влияют на межклеточные взаимодействия, процессы дифференцировки и апоптоза, принимают участие в регуляции ионных каналов и передачи сигнала в синапсе (Holz, 2006) цАМФ играет ключевую роль в регуляции работы сердца и всей сердечно-сосудистой системы, вызывая расслабление кровеносных сосудов (Kotlikoff, 1996) и стимуляцию сократимости сердца (Kammerer, 2003) Доказано, что в реализации этих эффектов цАМФ участвует протеинкиназа А, однако роль белков Ерас в проявлении действия цАМФ на сосуды и сердце не исследовалась

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению механизмов цАМФ-зависимой регуляции сократимости сосудов и сердца и выяснению роли белков Ерас в проявлении действия цАМФ на эти органы В работы были поставлены следующие задачи

1 Определить, участвуют ли белки Ерас в цАМФ-зависимой регуляции сосудистого тонуса

2 Оценить специфичность действия аналогов цАМФ, использованных для активации бечков Ерас

3 Исследовать влияние цАМФ на кальциевый обмен в культивируемых гладкомышечных клетках аорты крысы

4 Оценить роль белков Ерас и протеинкиназы А в цАМФ-опосредованной регуляции сократимости сердца, используя в качестве модели изолированное сердце виноградной улитки Helix pomatia

5 Исследовать на модели изолированного сердца виноградной улитки цАМФ-независимые пути активации сердечной сократимости

Научная новизна и практическая значимость работы. Установлено, что расслабление аорты крысы, вызванное цАМФ, опосредовано активацией не только протеинкиназы А, но и бет ков Ерас Показано, что одним из механизмов цАМФ-индуцированного расслабления кровеносных сосудов является подавление повышения концентрации ионов кальция в цитоплазме гладкомышечных клеток в ответ на вазоконстрикторные стимулы

Показано, что подавление под влиянием цАМФ агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, опосредовано протеинкиназой А без участия белков Ерас

Обнаружено, что активаторы белков Ерас и протеинкиназы А увеличивают амплитуду вызванного серотонином сокращения сердца виноградной улитки Helix pomatia Это свидетельствует об участии данных мишеней цАМФ в регуляции сократимости сердца Установлено, что активация сократимости сердца виноградной улитки Н pomatia, вызванная серотонином, опосредована двумя видами рецепторов Рецепторы одного вида сопряжены с аденилатциклазой и повышают уровень цАМФ Второй вид подобен 5НТ3-рецепторам, относящимся к типу ионотропных рецепторов и активирующих сердце по цАМФ-независимому механизму

Установлено, что цАМФ-независимый механизм реализуется при активации сокращений сердца виноградной улитки тромбином Полученные данные свидетельствуют, что тромбин активирует в сердце улитки рецепторы, гомологичные активируемым протеазами рецепторам 1-го и 4-го типов млекопитающих

Проведенные исследования расширяют представления о биохимических основах работы сердечно-сосудистой системы Они создают предпосылки для бочее детального изучения механизмов действия на сосуды и сердце гормонов и нейротрансмиттеров, связывающихся с рецепторами, активирующими аденилатциклазу Полученные результаты могут иметь значение при разработке научно обоснованных подходов к лечению сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку многие фармакологические препараты, влияющих на сердце и сосуды, оказывают свое действие через систему обмена цАМФ

Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 2 статьи Результаты диссертации были представлены на 13-м международном совещании по эволюционной физиологии (СПб, 2006), на Международной конференции по простым нервным системам, (Казань, 2006) и на конференциях молодых ученых ИБР РАН (2005,2006)

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и

списка цитируемой литературы Диссертация изложена на //^2- страницах и содержит рисунков и 3 таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Аналоги цАМФ, избирательно действующие на белки Ерас и протеинкиназу А

Основной подход, который применяется для изучения физиологических функций белков Ерас, заключается в использовании аналогов цАМФ, избирательно активирующие белки Ерас (Schwede et al, 2000, Kang et al, 2003) Специфические ингибиторы этих белков отсутствуют В настоящей работе для активации белков Ерас были использованы соединения 8-(4-метоксифенилтио)-2'-0-метиладенозин-цАМФ (8-рМеОРТ-2'-0-Ме-сАМР) и 8-(4-хлорофенилтио)-2'-0-метиладенозин-цАМФ (8-СРТ-2'-0-Ме-сАМР) Для избирательной активации и ингибирования протеинкиназы А применяли Sp-8-Br-cAMPS и Rp-8-Br-cAMPS, соответственно (рис 1)

CHj

O-pMüQPT-a'-O-Ws-cAAtP В-рСРТ-г'-О-Ме-сАНР

1>т«дм»0 сгч-вг-сАМра

Рис.1. Структура аналогов цАМФ, избирательно действующих на белки Ерас и протеинкиназу А.

Измерение силы изометрического сокращения изолированных фрагментов аорты крысы

Измерение силы сокращения изолированных фрагментов грудного отдела аорты крысы при действии на них вазоактивных гормонов и нейротрансмиттеров проводили в изометрическом режиме (Кожевникова и соавт, 2006)

Культивирование гладкомышечных клеток аорты крысы

Гладкомышечные клетки выделяли из препаратов аорты крыс-самцов линии Wistai методом эксплантов Для экспериментов использовали клетки 2-8 пассажей Их культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка

Измерение амплитуды сокращений изолированного сердца улитки Исследования проводились в июле-сентябре на Кропотовской биологической станции Института биологии развития им Н К Кольцова В опытах использовали крупных виноградных улиток Helix pomatia с размером раковины 35-45 мм Эксперименты проводили при температуре 23-25°С Сокращения изолированного желудочка сердца Н pomatia регистрировали по ранее описанному методу в изотоническом режиме (Suslova, Solomonova et al, 2005) На рисунках показаны изменения амплитуды сокращений сердца Измерение активности аденилатциклазы в препаратах мембраны сердца улитки

Для выделения мембран 10 свежепрепарированных сердец разрушали гомогенизатором типа "Политрон" в охлажденном до +4°С буфере (20 мМ трис-С1, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4), далее проводили центрифугирование при температуре +4°С в течение 1 часа при 100000g Полученный осадок мембран ресуспендировали в этом же буфере Активность аденилатциклазы определяли в среде объемом 50 мкл, содержащей 0,5-1 цО [а-32Р]АТФ, 0,05 мМ АТФ, 1 мМ цАМФ, 10 мкМ ГТФ, 1 мМ MgCb, 2 мМ креатинфосфата, 0,1 мг/мл креатинфосфокиназы, 10 мМ HEPES-Na (рН 7,2) Инкубацию проводили в течение 20 минут при 25°С Образовавшийся [32Р]цАМФ отделяли от [ос-32Р]АТФ и продуктов его распада путем хроматографии на колонках с А1203 (White, 1974)

Измерение агрегации тромбоцитов

Измерение агрегации проводили по изменению светопропускания по стандартному методу Борна на приборе фирмы «Биола» (Москва) Агрегацию индуцировали добавлением 5 мкМ АДФ Для определения действия активаторов протеинкиназы А и белков Ерас тромбоциты преинкубировали с этими веществами в течение 10 минут при 37 °С перед добавлением АДФ

Измерение концентрации цитоплазматического кальция с помощью флуоресцентного зонда Fura-2

Для измерения концентрации цитоплазматического кальция использовались клетки 2-8 пассажей Прокраску клеток проводили с 8 мкМ Fura-2(AM) в присутствии 0,0002% Pluromc в течение 40 минут при температуре 23-25 °С Измерение цитоплазматической концентрации кальция

проводили на инвертированном микроскопе Nikon оборудованном CCD камерой CoolSnap-fx ("Roper Scientific",США) Данные, полученные при помощи Ca2f чувствительного зонда Fura-2 представлены как отношение интенсивностей флуоресценции, возбуждаемой при длинах волн 340 и 380 нм (F340/F380) Все растворы готовили на буфере состава (мМ) NaCl - 145, КС] -5, MgCl2 - 1, СаС12 ~ 1, Hepes - 5, D-глюкоза - 10 (рН = 7,4 при 25°С) и добавляли путем полной замены раствора в камере с клетками Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка данных проводилась в программе MS Exel При оценке достоверности различий показателей использовали t- критерий Стьюдента Различия считались достоверными при р < 0,05

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Исследование механизмов действия цАМФ на сократимость сосудов Влияние форсколина и аналогов цАМФ, активирующих белки Ерас и протеинкиназу А, на сократимость изолированной аорты крысы

Для того, чтобы оценить влияние цАМФ на сократимость сосудов был использован активатор аденилатциклазы форсколин На рис 2 показано, что форсколин (0,2 мкМ) вызывает расслабление изолированной аорты, предсокращенной норадреналином Высокоселективный ингибитор протеинкиназы А Rp-8-Br-cAMPS почти полностью снимал расслабляющий эффект форсколина (рис 2В) Однако при повторном добавлении к сосудам более высокой концентрации форсколина (0,4 мкМ) его расслабляющее действие на аорту вновь проявлялось Причем в данном случае расслабление происходило более медленно, чем в контроле при использовании меньшей концентрации форсколина (рис 2Б) Ингибитор протеинкиназы А (Rp-8-Br-cAMPS) является конкурентным по отношению к цАМФ Поэтому при

Рис 2 Расслабление изолированной аорты, вызванное форсколином (Ф) и влияние селективного ингибитора протеинкиназы А Ыр-в-Вг-сАМРБ (В) на действие форсколина. Форсколин применяли в концентрациях 0,2 мкМ (Б), 0,2 и 0,4 мкМ (В) Концентрация Rp-8-Br-cAMPS составляла 100 мкМ, норадреналина (НА) - 10 мкМ

увеличении концентрации форсколина до 0,4 мкМ уровень цАМФ в клетке возрастает в большей степени , что может приводить к вытеснению Кр-8-Вг-сАМРБ из участка связывания на регуляторной субъединице протеинкиназы А

В то же время нельзя исключить и существования альтернативного цАМФ-зависимого механизма расслабления, который реализуется при более высокой концентрации цАМФ, чем требуется для активации протеинкиназы А Мы предположили, что белки Ерас принимают участие в процессе цАМФ-зависимого расслабления сосудов Для оценки возможного влияния белков Ерас на сократимость аорты были использованы высокоизбирательные активаторы этих белков - 8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР и 8-СРТ-2'-0-Ме-сАМР

г~

100 мг

10 мин

♦

НА

ФЭ

НА

8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР

л-

НА

8-рСРТ 2'-0-Ме-сАМР

ФЭ

вр-в-Вг-сАМРЗ 1

НА

Рнс.З. Расслабление кольца аорты крысы под влиянием активаторов белков Ерас и протеинкиназы А. Показано влияние 8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР (100 мкМ) и 8р-8-Вг-сАМРБ (40 мкМ) на сокращение аорты, вызванное норадреналином (А,В) и влияние 8-рСРТ-2'-0-Ме-сАМР (100 мкМ) на сокращение вызванное фенилэфрином Концентрации норадреналина (НА) и фенилэфрина (ФЭ) сотавляли 0,1 мкМ

Оказалось, что эти соединения вызывают расслабление аорты, предсокращенной норадреналином и фенилэфрином (рис ЗА,Б).

Расслабление аорты наступает также при избирательной активации протеинкиназы А с помощью селективного активатора этого фермента 5р-8-Вг-сАМРБ (рис ЗВ)

Нами показано, что релаксирующее действие активаторов белков Ерас и протеинкиназы А является дозозависимым Полумаксимальные эффекты на

сократимость аорты наблюдаются при концентрациях Зр-В-Вг-сАМРБ (активатор ПКА) и 8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР (активатор Ерас) 17,0-0,6 и 64+7 мкМ, соответственно (рис 4) Из приведенных на рисунке 4 данных видно, что даже при насыщающих концентрациях активатора Ерас 8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР расслабление было неполным, тогда как активация протеинкиназы А вызывает 100%-ое расслабление аорты

Рис.4. Зависимость степени расслабления предсокращенной норадреналином аорты от

концентрации 8р-8-Вг-сАМРБ (активатор протеинкиназы А) и 8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР (активатор Ерас)

Расслабление 120

8-рМе0РТ-2-0-Ме-сАМР

80 1Ю 120 Копцетрация, мкМ

Принципиально важно было выяснить, действительно ли действие активаторов Ерас (8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР и 8-СРТ-2'-0-Ме-сАМР) специфично и не опосредовано активацией протеинкиназы А Специфичность действия активаторов белков Ерас доказывают опыты, проведенные на тромбоцитах Известно, что в тромбоцитах повышение уровня цАМФ блокирует увеличение концентрации цитоплазматического Са2+ и подавляет их агрегацию (Авдонин и соавт, 1985) Установлено, что цАМФ-зависимое подавление агрегации тромбоцитов происходит при участии протеинкиназы А Действительно, как видно из приведенных в таблице данных, активация эндогенной протеинкиназы А 8р-8-Вг-сАМР8 полностью блокировала АДФ - индуцированную агрегацию тромбоцитов человека (таблица) В отличие от этого, активатор белков Ерас 8-рМеОРТ-2'-О-Ме-сАМР в концентрации 200 мкМ не влиял на данный процесс Аналогичные результаты были получены и в опытах на тромбоцитах крысы Следовательно, белки Ерас не ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов Второй вывод, который следует из этих результатов - это то, что активатор белков Ерас 8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР даже в концентрации 200 мкМ не вызывает активацию протеинкиназы А, то есть является специфичным по отношению к белкам Ерас

Из этого следует, что расслабляющее действие активатора бечков Ерас на сосуды также не связано с активацией протеинкиназы А, поскольку

использованная в этом случае концентрация 8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР была как минимум в два раза ниже, чем в экспериментах с тромбоцитами

Таблица

Влияние активаторов белков Ерас (8-р-Ме0РТ-2'-0-сАМР) и протеинкиназы А (8р-8-Вг-сАМР8) на агрегацию тромбоцитов человека, индуцированную АДФ______________

Условия экспериментов Степень агрегации

5 мкМ АДФ 100+14%

200 мкМ Бр-8-Вг-сАМР5, 5 мкМ АДФ -3,3 + 0,5%

200 мкМ 8-р-Ме0РТ-2'-0-сАМР, 5 мкМ АДФ 99 + 4 %

Для каждого значения приведены данные 3-х измерений и стандартные ошибки среднего

Дополнительным подтверждением вышесказанного являются опыты с ингибитором протеинкиназы А Ир-Б-Вг-сАМРБ, добавление которого в концентрации 100 мкМ не предотвращало расслабление аорты под действием 100 мкМ 8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР (данные не приводятся) Следует

8 рМеОРТ 2' О Ме сАМР Яр-в-ВгсСИРЗ I

8 рМеОРТ-21 О-Ме сАМР 1 I Нитроглицерин

ФЭ

Рис 5. Оценка влияния ингибитора протеинкиназы С Ир-вВг-сСМРв (100 мкМ) на расслабляющее действие активатора белков Ерас 8-рСРТ-2'-0-Ме-сАМР (100 мкМ) и нитроглицерина. Нитроглицерин использовали в концентрациях 11, 22, 44, 110 нМ и 4,4 мкМ Добавление нитроглицерина обозначено тонкими стрелками Аорту предсокращали путем добавления 0,1 мкМ фенилэфрина (ФЭ)

отметить, что данный ингибитор протеинкиназы А в концентрации 100 мкМ уменьшал релаксирующее действие форсколина (рис 2)

Важнейший механизм релаксации сосудов реализуется через КГО/цГМФ-сигнальный путь Если расслабление при участии белков Ерас каким-то образом сопряжено с этим сигнальным путем, то эффект активаторов Ерас на сосуды можно заблокировать при помощи селективного ингибитора цГМФ-активируемой протеинкиназы в Для проверки этой гипотезы нами было исследовано влияние ингибитора цГМФ-активируемой протеинкиназы Кр-8-бромогуанозин-3',5'-циклического монофосфоротиоата (11р-8-Вг-сОМР5) на вызываемое активатором белков Ерас 8-СРТ-2'-0-Ме-сАМР расслабление аорты Как видно на рисунке 5, в присутствии ингибитора протеинкиназы в расслабление аорты под влиянием 8-СРТ-2'-0-Ме-сАМР было таким же, как в контрольном эксперименте Для того, чтобы проверить, эффективен ли используемый ингибитор протеинкиназы в в условиях нашего эксперимента, было определено его действие на эффект донора N0 — нитроглицерина Оказалось, что ингибитор цГМФ-активируемой протеинкиназы подавлял действие нитроглицерина, делая его эффект обратимым (рис 5) Полученные результаты говорят о том, что расслабление аорты при действии активаторов белков Ерас не связано с ЫО/цГМФ-сигнальным путем

Таким образом, поставленные нами контрольные эксперименты доказывают, что действие 8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР и 8-СРТ-2'-0-Ме-сАМР специфично, и именно один из белков или оба белка Ерас вызывают расслабление аорты Вопрос о том, каков механизм действия этих белков, остается пока открытым Можно предположить, что они действуют непосредственно в гладкомышечных клетках, подавляя вызванный вазоконстрикторными гормонами или нейротрансмиттерами подъем [Са2+]ЦЙТ, вызывают эндотелий-зависимое расслабление сосудов или ингибируют Са-независимый механизм сокращения гладких мышц сосудов

Исследование влияния цАМФ на повышение концентрации кальция в гладкомышечных клетках сосудов под действием серотошша

Расслабление сосудов, предсокращенных гормонами или другими вазоактивными веществами, может происходить в результате ингибирования подъема уровня цитоплазматического кальция ([Са2+]цит), вызванного вазоконстрикторами в гладкомышечных клетках (ГМК) Известно, что серотонин является мощным индуктором, повышающим уровень цитоплазматического кальция в ГМК Мы оценивали влияние цАМФ на уровень повышения кальция под действием серотонина, регистрируя изменение концентрации [Са2+]цит при помощи флуоресцентного зонда Рига-2 В контрольном эксперименте повторное добавление серотонина через 20 минут после первой добавки практически не снижало амплитуду кальциевого сигнала (рис 6А) Однако после преинкубации клеток в течение 10 минут с 10 мкМ форсколина перед повторным добавлением серотонина амплитуда кальциевого сигнала уменьшалась бочее, чем в два раза (рис 6 Б,В)

Сер

1MB 1506

г®»

Время, сек

1200 1SÜ0 24Ю

Бремя, сек

Контроль

Форс ко ЛИН

Рис.6. Влияние форсколина на повышение концентрация

цитоплазматического кальция

вызванной серотоннном. А,Б - кинетика изменения В глэдкомышечкых

клетках без преинкубации (А) и с преинкубацией с форсколином (Б), В-изменения реакции клеток при повторном добавлении в отсутствии и в присутствие форсколина. Концентрация серотонина составляла 10 мкМ, концентрация форсколина -10 мкМ. п - количество клеток.

Таким образом, можно предположить, что одним из механизмов действия цАМФ приводящим к расслаблению сосудов является ингибирование повышения концентрации цитоплазматического калышя в гладкомышечных клетках аорты крысы.

Исследование механизмов действия цАМФ на сократимость сердца Влияние форсколина на сокращение сердца виноградной улитки

Для изучения цАМФ-зависимых механизмов регуляции сократимости сердца и роли белков Ерас мы выбрали хорошо охарактеризованный в нашей лаборатории объект - сердце виноградной улитки Helix pomaíia. Сердце улитки является чрезвычайно удобным объектом для проведения физиологических экспериментов, поскольку оно способно часами стабильно самопроизвольно сокращаться, а при хранении при 4ÜC сохраняет жизнеспособность в течение нескольких суток, В отличие от млекопитающих, у моллюсков активацию сократимости сердца вызывает серотонин, а не катехол амины. В активации сокращений сердца серотонином участвует цАМФ (Wollemann and Ro2sa, 1975), однако детали этого процесса

и механизмы .действия цАМФ не исследованы. Влияние возрастающих концентраций серотонина на сокращения сердца виноградной улитки показано на рис. 7. Серотонин влияет на амплитуду сокращений и, как правило, не приводит к изменению частоты сокращения сердца.

Рис.7. Активация серотонин ом (5-НТ) сокращения сердца виноград кон улитки Н.ротайа.

К-раствор Рингсра. Концентрацию серотонина увеличивали путем смены раствора в кашолс, к которой был прикреплен изолированный желудочек сердца улитки.

1 1111111

» 0,95 1.9 3,3 15,6 31,2 61.2 125

5-НГ.нМ

Мы убедились что серотонин активирует синтез цАМФ в мембранах, выделенных из сердца виноградной улитки (рис.8). Для того, чтобы оценить влияние цАМФ на сократимость сердца улитки, был использован активатор аденилащиклазы форс ко ли и. Он оказывает значительно более сильный, по

Рис.8. Влияние серотонина и фор с коли на на активность аденилащиклазы в мембранах сердца виноградной улитки.

Рис.9. Влияние форсколина (А) и серотонина (Б) на амплитуду сокращений желудочка сердца виноградной улитки.

Серотонин, пМ

сравнению с се ротон и ном, стимулирующий эффект на аде н и л атцикл азу в мембранах, выделенных из сердца улитки (рис,8). Однако при сравнении влияния серотонина и форсколина на сократимость изолированного сердца улитки оказалось, что действие последнего значительно слабее (рис.9).

Исследование роли лротеинкиназы А и белков Ерас в проявлении активирующего действия цАМФ на сократимость сердца

600 -¡Р 500 -| 400 -

% 300 -? 200 -I -

о -

Кон г роль Серотонин Форсколин

Форсколин, 10 11М

Возникает вопрос о том, какова функция цАМФ в регуляции сократимости сердца Из приведенных ранее данных (рис 9) видно, что просто повышение уровня цАМФ в сердце не приводит к сильному увеличению сократимости эффект форсколина значительно слабее эффекта серотонина Мы предположили, что в сердце моллюсков при воздействии серотонина реализуются цАМФ-зависимый и цАМФ-независимый механизмы активации сократимости Для оценки влияния цАМФ на сократимость сердца улитки и выяснения механизмов его действия были использованы проникающие через мембрану аналоги цАМФ, селективно активирующие протеинкиназу А и белки Ерас, Бр-8-Вг-сАМР8 и 8-СРТ-2'-0-Ме-сАМР, соответственно На рис 10 показано, что преинкубация изолированного сердца с каждым из этих соединений достоверно увеличивает амплитуду реакции сердца на серотонин Ни одно из них в отсутствие серотонина не увеличивает амплитуду сокращения сердца А Б

Рис.10. Влияние 8-СРТ-2'-0-Ме-сАМР и Я-Вг-сАМРЭ на вызываемое серотонином увеличение амплитуды сокращения сердца виноградной улитки. Зависимости амплитуды сокращения сердца от концентрации серотонина определяли в контрольных условиях (нижние кривые) и в присутствии 8-рМе0РТ-2'-0-Ме-сАМР и 8р-8-Вг-сАМР8 в концентрациях 100 мкМ и 200 мкМ, соответственно Данные соединения добавляли к сердцу за 20 минуг до серотонина Дозовые зависимости от серотонина (5-НТ) в контрольных условиях определяли за 40 минут до преинкубации сердец с аналогами цАМФ В отдельных экспериментах показано, что без преинкубации с активаторами протеинкиназы А и белков Ерас реакция на серотонин не изменяется

Причина этого пока не установлена Можно предполагать, что для усиления сократимости при действии цАМФ необходима одновременная стимуляция протеинкиназы А и белков Ерас

Активация сокращения сердца улитки серотонином через рецепторы, не сопряженные с аденилатциклазой

Приведенные выше данные говорят о том, что цАМФ не является основным фактором, регулирующим сердечную деятельность у виноградной улитки При действии серотонина реализуется также другой, независимый от цАМФ механизм активации сократимости сердца Мы предположили что в сердце виноградной улитки существует несколько видов рецепторов серотонина, активирующих сердце О существовании более чем одного вида рецепторов серотонина в сердце улитки говорит тот факт, что зависимость амплитуды сократимости сердца от концентрации серотонина при анализе в координатах Скетчарда представляет из себя вогнутую двухфазную кривую (рис 11)

Рис. 11. Зависимость

ое

амплитуды сокращения сердца от концентрации серотонина а представленная в координатах Скетчарда. По оси абцисс 04 отложена величина амплитуды оз сокращений, выраженная в процентах от максимальной По 02 оси ординат отложено отношение амплитуды сокращения (%) к 0< концентрации серотонина в нМ 03

40 SO 60 70 ВО 90 <03

Для млекопитающих показано наличие 7 типов серотониновых рецепторов, большинство из которых сопряжены с G белками и влияют на активность аденилатциклазы и фосфолипазы С Из этих семи типов 5НТ-рецепторов только 5Н1 з-рецепторы не сопряжены с G-белками и являются ионными каналами, через которые осуществляется транспорт катионов (Aghajaman and Sanders-Bush, 1999) Серотониновые рецепторы улитки не изучены, но, по аналогии с млекопитающими, мы предположили, что в реализации действия серотонина на сердце принимают участие различные типы серотониновых рецепторов, включая 5НТ3 В связи с этим было исследовано действие агониста серотониновых рецепторов третьего типа 5-HTQ (иодида ]\,Кт,Х-гриметил-серотонина) Оказалось, что действие 5-HTQ на сердце улитки вызывает дозозависимое увеличение амплитуды сокращения сердца (рис 12) Помимо этого, специфический антагонист 5НТз-рецепторов 3-тропонил-3,5-дихлорбензоат при концентарции 50 мкМ подавляет реакцию сердца на серотонин Эти данные доказывают, что в сердце виноградной улитки имеются рецепторы, родственные 5НТ3-рецепторам млекопитающих, которые, в отличие от всех остальных рецепторов серотонина, не сопряжены с G-белками и относятся к типу

ионотроиных рецепторов. Таким образом, существует путь регуляция сократимости сердца который не зависит от цАМФ.

лтN шЛ

^ 1М1 I ! I I

11111111 1 1 1 I I 1

к 0,96 1.9 15,8 31,2 61,2 125 Л 1 10 100 1000 10000

1111 пит 111 ГгттТг 1

я г а а <е ж И121 аокп «га я 1р 1р г < а к л и я 5-НТ, XVI 4-КТ.(«|

+»миктр

Рис. 12, Увеличение амплитуды сокращения сердца под действием агониста 5НТ3 рецепторов 5-НТО (А) и ингнбированне эффекта серотонина блокатором 5НТ3-рецепгоров 3-тропоннл-3,5-дихлорбензоатом (Тр) (Б). Слева приведены контрольные зависимости амплитуды сокращений от концентрации серотонина. При определении действия блокатора 5 НТ3-рецепторов его добавляли в концентрации 50 мкМ в отсутствие серотонина, а затем добавляли возрастающие концентрации серотонина одновременно с блокатором (Б, правая часть). Н — раствор Рингера,

цАМФ независимый механизм регуляции сократимости сердца улитки тромбином

Так как действие цАМФ на сократимость сердца имеет, судя по всему, модулирующий характер, возникает закономерный вопрос о наличии полностью независимых от цАМФ механизмов регуляции сердечной деятельности. Мы обнаружили, что тромбин увеличивает амплитуду сокращений сердца (рис, 13). Частота сокращений сердца до добавления тромбина составляла 40 ударов в минуту и не изменялась под действием тромбина. Вызванная тромбином активация сокращений сердца была обратимой - после его отмывания амплитуда сокращений быстро опускалась до исходного уровня.

При последующем после отмывания добавлении тромбина прирост амплитуды уменьшался не сильно. Это свидетельствует об избыточном

содержании рецепторов тромбина и отсутствии существенной десенситизапии. Характерная для лиганд-реценторного взаимодействия зависимость эффекта тромбина от его концентрации свидетельствует, что тромбин связывается со специфичными для него рецепторами, В такой же области концентраций тромбин вызывает увеличение концентрации ионов Са"' в цитоплазме гладкомыщечных клеток аорты крысы и человека (Уи£и е1 а!, 2005).

Рис.13. Влияние тромбина на амплитуду сокращений желудочка сердца улитки H.pomatia

ЦШ + + ♦

О 001 0.01 0.1 1,0 Т41 о м 6 и к, Ец^м л

Можно предполагать, что тромбин имитирует действие эндогенной протеазы, присутствующей а крови улитки Н. pomatia. У млекопитающих действие тромбина на сердце и сосуды опосредовано активируемыми протеазами рецепторами первого, третьего и четвертого типа (Protease Activated Receptor PAR[34 ). Селективные пептидные лиганды рецепторов PAR] и PAR4, имитирующие действие тромбина, имеют последовательности Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn (SFLLRN) и Glu-Tyr-Pro-GIy-Lys-Phe (QYPGKF), соответственно. Мы обнаружили, что оба эти лиганда влияют на сократимость изолированного сердца H.pomatia, увеличивая амплитуду сокращений (рис.14). Пороговая концентрация, при которой данные пептиды активиронали сокращение сердца, составляла около 10 мкМ. При концентрации выше 10"' М лиганд рецепторов PAR¡ вызывал контрактуру сердца. В отличие от с ер ото ни на, пи тромбин, ни пептидные лиганды не стимулировали синтез цАМФ в мембранном препарате из сердца улитки (рис.15). В клетках млекопитающих рецепторы тромбина также не активируют, а, наоборот, подавляют синтез цАМФ. Рецепторы PARi сопряжены с несколькими видами ГТФ-связывающих гетеро гримерных G-белков; Gl, GZí Gq,]lä Gn/n {Barr et al, 1997; Marinissen et al, 2003). Если пептид SFLLRN действительно активирует сердце моллюсков через рецепторы, гомологичные PARi, тогда он тоже может запускать разные сигнальные механизмы. Диапазон действия рецепторов PAR4, если судить ПО имеющимся данным, более узкий. Эти рецепторы активируют внутриклеточный кальциевый обмен через белки Gq/i 1 и фосфолипазу С (Macfarlane, Seatter et al, 2001).

Приведенные в настоящей работе данные свидетельствуют о наличие в сердце моллюска Н.ровдзЙа активируемых тромбином рецепторов, гомологичных рецепторам РЛЯ, и РАРЦ млекопитающих.

10 " 10 » 10 1 1 О ■* ю-' 10 s 1.5х!0-'

[S FLLRN], М

1 мин

4 * 4 + 4 ♦ 4

10 ю ю-* 10 я 10» 10 s 10 1 10<

fQYPQKF], И

1'ис. 14. Зависимости амплитуды сокращений желудочков сердца H.pomatia от концентраций пептидов SFLLRSS и QYPGKF, лига нд О в рецепторов PAR] и PARt, соответственно.

Рис.15. Влияние ееротонина, тромбина и пептидных лигаидов рецепторов PAR] и PAR^ (SFLLRN и QYPGKF) на акпгивность аденилатциклазы в мембранах сердца виноградной улитки.

Заключение

В настоящей работе показано, что белки Ерас участвуют в цАМФ-зависимом расслаблении сосудов. Их активация приводит к уменьшению

^ 300 1

a «о ш

| ню- А ■ П к&ч {йа

j »UJL1 .1.1

//SS/

силы сокращения изолированной аорты, вызываемого вазоконстрикторным нейротрансмиттером норадреналииом или альфа1-адреномиметиком фенилэфрином Однако вопрос о том, по какому механизму осуществляется их действие, остается открытым Возможно, что белки Ерас влияют на обмен ионов Са2+ в гладкомышечных клетках (ГМК) Эксперименты, в которых было показано ингибирование форсколином подъема [Са2А]цит в ГМК в ответ на серотонин, позволяют высказывать такое предположение Нельзя исключить, что активация белков Ерас запускает происходящие в эндотелиальных клетках процессы, приводящие к релаксации сосудов Расслабление сосудов, вызванное активаторами белков Ерас не превышает, как правило, 50-ти процентов В отличие от этого, активация протеинкиназы А приводит к полному расслаблению изолированной аорты, предсокращенной норадреналииом Этот факт свидетельствует в пользу того, что цАМФ-зависимые механизмы расслабления аорты, опосредованные протеинкиназой А и белками Ерас, принципиально различаются

Эксперименты, выполненные на тромбоцитах, показали, что подавление в этих клетках Са-зависимого процесса АДФ-индуцироанной агрегации под влиянием цАМФ происходит без участия белков Ерас Очень важным следствием этих опытов стало доказательство специфичности действия аналога цАМФ, активирующего Ерас

На модели изолированного сердца виноградной улитки мы показали, что обе цитоплазматические мишени цАМФ - и протеинкиназа А, и белки Ерас, регулируют сердечную сократимость Оказалось, что в сердце виноградной улитки, в отличие от сердца млекопитающих, цАМФ не является основным фактором, вызывающим увеличение амплитуды сокращений сердца, а оказывает скорее модулирующее действие Однако остается не ясным, почему, в отличие от активатора аденилатциклазы форсколина, который вызывает увеличение амплитуды сокращения сердца, ни активатор протеинкиназы А, ни активатор белков Ерас сами по себе не вызывали увеличения амплитуды сокращений сердца Можно предположить что для проявления активаторного действия цАМФ на сердце виноградной улитки необходимо, чтобы эти два механизма работали согласованно

Нами обнаружены в сердце улитки серотониновые рецепторы подобные 5НТ3-рецепторам млекопитающих Эти рецепторы не сопряжены с аденилатциклазой и представляют из себя катионные каналы, проницаемые для ионов натрия и кальция Активации ими сокращений сердца, по-видимому, обусловлена входом ионов кальция или деполяризацией плазматической мембраны за счет входа ионов натрия и активацией потенциалуправляемых кальциевых каналов Можно предположить, что цАМФ, образующаяся при активации 5НТ-рецепторов серотонина, сопряженных с аденилатциклазой, потенциирует активность этих каналов, действуя через протеинкиназу А, аналогично тому, как активируются потенциалулравляемые кальциевые каналы в сердце млекопитающих Основываясь на недавно опубликованных данных о взаимодействии белков Ерас с протеинкиназой А и рианодиновыми рецепторами ретикулама в

кардиомиоцитах мыши (Dodge-Kafka et al., 2005), можно предположить, что в сердце белки Ер ас каким-то образом активируют кальциевый обмен и таким образом усиливают сократимость. Выяснение этих вопросов требует дальнейших исследований.

Рис. 16. Предполагаемые механизмы регуляции сократимости сердца улитки.

В данной работе описан цАМФ-независимый механизм активации сократимости сердца виноградной улитки под действием тромбина. Полученные данные говорят о том, что тромбин действует через активируемые протсазами рецепторы PAR, и PAR). Это первое свидетельство того, что рецепторы данного типа есть не только у млекопитающих, но и у представителей филогенетически отдаленного типа животных - моллюсков. Однако для полной уверенности в том, что такие рецепторы у улитки существуют, их необходимо клонировать. По-видимому, окончательное решение данного вопроса будет достигнуто после расшифровки генома данного представителя брюхоногих моллюсков.

Гипотетическая модель, описывающая возможные механизмы активации сердца виноградной улитки по цАМФ-завиеимому и цАМФ-независимому механизмам, изображена на рис.16. Мы предполагаем, что наиболее вероятным путем действия тромбина является активация фосфолипазы С через белок Gq, тогда как серотонин запускает два других

механизма - синтез цАМФ и открывание катионных каналов, транспортирующих кальций

ВЫВОДЫ

1 Расслабление аорты, вызванное цАМФ, опосредовано активацией протеинкиназы А и белков Ерас Одним из механизмов цАМФ-индуцированного расслабления аорты является подавление рецептор-опосредованного повышения концентрации ионов кальция в цитоплазме

2 В отличие от сосудов, в тромбоцитах белки Ерас не участвуют в проявлении действия цАМФ - подавлении АДФ-индуцированной агрегации В данном эффекте цАМФ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов принимает участие только прогеинкиназа А

3 Аналоги цАМФ, избирательно активирующие протеинкиназу А и белки Ерас, увеличивают амплитуду сокращения сердца виноградной улитки в ответ на серотонин Это свидетельствует об участии обеих цитоплазматических мишеней цАМФ в регуляции сократимости сердца

4 Активация сократимости сердца виноградной улитки Н pomatia, вызванная серотонином, опосредована разными видами 5НТ-рецепторов Одни рецепторы сопряжены с аденилатциклазой и повышают уровень цАМФ Второй вид рецепторов подобен 5НТ3-рецепторам млекопитающих и относится к типу ионотропных рецепторов

5 Описан цАМФ-независимый механизм активации сократимости сердца виноградной улитки тромбином Полученные данные свидетельствуют, что тромбин активирует в сердце улитки рецепторы, гомологичные активируемым протеазами рецепторам 1-го и 4-го типов млекопитающих

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Суханова И Ф , Кожевникова Л М, Попов Е Г, Подмарева О Н, Авдонин П В Активаторы белков Ерас вызывают расслабление изолированной аорты крысы // Доклады Российской академии наук, 2006, том 411, №5, с 1-5

2 Соломонова В Г , Авдонин ПII, Виниченко Е С , Суханова И Ф , Авдонин ПВ Активация сократимости сердца виноградной улитки Н pomatia под действием тромбина Исследование роли сАМР // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2007, том 43, с 32-38

3 Бердышева JT В , Суханова И Ф , Соломонова В Г, Авдонин П В Кинетика положительной инотропной реакции сердца виноградной улитки Helix pomatia на серотонин // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2007, в печати

4 Суханова И Ф , Подмарева О Н, Кожевникова JIМ, Авдонин П В цАМФ подавляет вторую фазу эндотелий-зависимого расслабления крысиной

аорты // 13-ое международное совещание и 6-ая школа по эволюционной физиологии, СПб, 2006, с 24-25

5 Berdysheva L V , Solomonova V G , Sukhanova IF , Avdonm P V The kinetic parameters of positive lonotropic effect of serotonin in the heart of snail Helix po-matia // Материалы Международной конференции по простым нервным системам, Казань, 2006, с 6

6 Суханова И Ф Исследование роли ПКА и белков Ерас в цАМФ - и карбахол-зависимом расслаблении сосудов // Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им Н К Кольцова РАН, 2005 Онтогенез 2006, т 37, №4, с 319.

7 Суханова И Ф Независимые от протеинкиназы А механизмы регуляции сократимости сердца и кровеносных сосудов циклической АМФ Роль белков Ерас // Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им Н К Кольцова РАН, 2006 Онтогенез 2007, т 38, №4, с

Подписано в печать 20 04 2007 г Исполнено 20 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ №410 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суханова, Ирина Федоровна

Введение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Внутриклеточный метаболизм цАМФ.

1.1.1. G-белок сопряженные рецепторы и G-белки.

1.1.1.1 Рецепторы серотонина.

1.1.2. Аденилатциклазы.

1.1.3. Фосфодиэстеразы.

1.2. Внутриклеточные мишени цАМФ.

1.2.1. Стуктура цАМФ-связывающих белков.

1.2.2. цАМФ-зависимая протеинкиназа А.

1.2.3. Каналы активируемые циклическими нуклеотидами.

1.2.4. Семейство EPAC/cAMP-GEF.

1.2.5. Белки CRP/CAP.

1.3. Фармакологические агенты, направленно действующие на компоненты цАМФ сигнального пути.

1.3.1. Аналоги цАМФ.

1.3.2. Ингибиторы, направленные на каталитическую субъединицу протеинкиназы А.

1.4. Физиологические функции цАМФ.

1.4.1. Регуляция протеинкиназой А функционирования органов и внутриклеточных процессов.

1.4.1.2. Регуляция метаболизма в адипоцитах.

1.4.1.3. Регуляция иммунного ответа.

1.4.1.4. Передача сигнала цАМФ в ядро и регуляция экспресии генов.

1.4.1.5. Регуляция сердечной деятельности у млекопитающих.

1.4.1.6. Регуляция сердечной деятельности у моллюсков.

1.4.1.7. Регуляция сократимости гладких мышц. Пример взаимодействия между цАМФ- и цГМФ- сигнальными путями.

1.4.2. Роль белков Ерас в проявлении действия цАМФ на клетки.

1.4.2.1. Опосредованная белками Ерас цАМФ-зависимая регуляция функционирования ионных каналов.'.

1.4.2.2. Роль белков Ерас в регуляции внутриклеточных Са2+-сигналов.

1.4.2.3. Процессы ионного транспорта регулируемые белками Ерас.

1.4.2.4. Ерас связывает выработку цАМФ со стимуляцией экзоцитоза.

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Выделение изолированной аорты и измерение силы изометрического сокращения сосудов.

2.2. Измерение амплитуды сокращений изолированного сердца виноградной улитки Н. pomatia.

2.3. Измерение активности аденилатциклазы в препаратах мембраны сердца виноградной улитки.

2.4. Измерение агрегации тромбоцитов по методу Борна.

2.4.1. Получение плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (PRP -platelet rich plasma).

2.4.2.Измерение агрегации тромбоцитов.

2.5. Измерение концентрации цитоплазматического кальция с помощью флуоресцентного зонда фура-2.

2.5.1.Выделение гладкомышечных клеток из аорты крысы.

2.5.2. Криоконсервация гладкомышечных клеток, выделенных из аорты крысы.

2.5.3. Подготовка стекол для экспериментов с гладкомышечными клетками из аорты крысы.

2.5.4. Измерение концентрации цитоплазматического кальция с помощью флуоресцентного зонда фура-2.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследование механизмов расслабления сосудов под действием цАМФ.

3.1.1. Влияние на сократимость изолированной аорты вазоактивных агонистов.

3.1.2. Влияние форсколина и аналогов цАМФ, активирующих белки Ерас и протеинкиназу А, на сократимость изолированной аорты крысы.

3.2. Исследование влияния цАМФ на повышение концентрации кальция в гладкомышечных клетках сосудов под действием серотонина.

3.3. Регуляция сократимости сердца виноградной улитки H.pomatia. Исследование механизмов действия цАМФ.

3.3.1. цАМФ зависимые механизмы регуляции сердечной сократимости 71 3.3.1.1. Исследование роли протеинкиназы А и белков Ерас в проявлении активирующего действия цАМФ на сократимость сердца.

3.3.2. Активация сокращения сердца улитки серотонином через рецепторы, не сопряженные с аденилатциклазой.

3.3.3. цАМФ независимый механизм регуляции сократимости сердца улитки.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль цАМФ-связывающих белков ЕРАС в регуляции сократимости кровеносных сосудов и сердца"

Актуальность проблемы. цАМФ был открыт в конце 50-х годов прошлого века как вторичный посредник, передающий сигналы в клетке от множества гормонов, нейротрансмиттеров, простагландинов, ряда других субстанций, которые активируют аденилатциклазу. До недавнего времени считалось, что универсальным механизмом действия цАМФ является активация протеинкиназы А. Помимо протеинкиназы А в сетчатке, нейронах, некоторых других клетках и тканях функционируют ионные каналы плазматической мембраны, связывающие цАМФ. В 1998 г. были обнаружены новые внутриклеточные мишени цАМФ - белки Epacl и Ерас2 (Exchange Proteins Activated by с AMP). Они широко распространены в организме и, по крайней, мере один из этих белков, Epacl, выявлен во всех исследованных тканях. Связывая цАМФ, белки Ерас взаимодействуют с низкомолекулярными G-белками RaplA/2B и стимулируют замещение ГДФ на ГТФ в их регуляторном центре, поэтому их обозначают также как сАМР-GEF (guanine nucleotide exchange factor). Белки Rap активируют протеинкиназу B-Raf, которая, в свою очередь, активирует протеинкиназный каскад MEK/Erk. Несколько позднее было установлено, что помимо Rap, белки Ерас активируют специфичную к фосфоинозитидам фосфолипазу С-£, Кдтр-каналы, влияют на функционирование хлорных каналов [Holz, 2006]. В кардиомиоцитах мыши выявлен макромолекулярный комплекс Epacl с рианодиновыми рецепторами, каркасным белком тАКАР, протеинкиназой А и фосфодиэстеразой цАМФ [Pare et al., 2005].

Изучение роли белков Ерас в регуляции цАМФ-зависимых физиологических процессов находится на начальной стадии. Показано, что, наряду с протеинкиназой А, белки Ерас активируют секрецию, влияют на межклеточные взаимодействия, процессы дифференцировки и апоптоза, принимают участие в регуляции ионных каналов и передачи сигнала в синапсе [Holz et al., 2006]. цАМФ играет ключевую роль в регуляции работы сердца и всей сердечно-сосудистой системы, вызывая расслабление кровеносных сосудов [Kotlikoff and Kamm, 1996] и стимуляцию сократимости сердца [Kammerer et al., 2003]. Доказано, что в реализации этих эффектов цАМФ участвует протеинкиназа А, однако роль белков Ерас в проявлении действия цАМФ на сосуды и сердце не исследовалась.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению механизмов цАМФ-зависимой регуляции сократимости сосудов и сердца и выяснению роли белков Ерас в проявлении действия цАМФ на эти органы. В работы были поставлены следующие задачи:

1. Определить, участвуют ли белки Ерас в цАМФ-зависимой регуляции сосудистого тонуса.

2. Оценить специфичность действия аналогов цАМФ, использованных для активации белков Ерас.

3. Исследовать влияние цАМФ на кальциевый обмен в культивируемых гладкомышечных клетках аорты крысы.

4. Оценить роль белков Ерас и протеинкиназы А в цАМФ-опосредованной регуляции сократимости сердца, используя в качестве модели изолированное сердце виноградной улитки Helix pomatia.

5. Исследовать на модели изолированного сердца виноградной улитки цАМФ-независимые пути активации сердечной сократимости.

Научная новизна и практическая значимость работы. Установлено, что расслабление аорты крысы, вызванное цАМФ, опосредовано активацией не только протеинкиназы А, но и белков Ерас. Показано, что одним из механизмов цАМФ-индуцированного расслабления кровеносных сосудов является подавление повышения концентрации ионов кальция в цитоплазме гладкомышечных клеток в ответ на вазоконстрикторные стимулы.

Показано, что подавление под влиянием цАМФ агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, опосредовано протеинкиназой А без участия белков Ерас.

Обнаружено, что активаторы белков Ерас и протеинкиназы А увеличивают амплитуду вызванного серотонином сокращения сердца виноградной улитки Helix pomatia. Это свидетельствует об участии данных мишеней цАМФ в регуляции сократимости сердца. Установлено, что активация сократимости сердца виноградной улитки H.pomatia, вызванная серотонином, опосредована двумя видами рецепторов. Рецепторы одного вида сопряжены с аденилатциклазой и повышают уровень цАМФ. Второй вид подобен 5НТз-рецепторам, относящимся к типу ионотропных рецепторов. Через них серотонин активирует сердце виноградной улитки по цАМФ-независимому механизму.

Установлено, что цАМФ-независимый механизм реализуется при активации сокращений сердца виноградной улитки тромбином. Полученные данные свидетельствуют, что тромбин активирует в сердце улитки рецепторы,, гомологичные активируемым протеазами рецепторам 1-го и 4-го типов млекопитающих.

Проведенные исследования расширяют представления о биохимических основах работы сердечно-сосудистой системы. Они создают предпосылки для более детального изучения механизмов действия на сосуды и сердце гормонов и нейротрансмиттеров, связывающихся с рецепторами, активирующими аденилатциклазу. Полученные результаты могут иметь значение при разработке научно обоснованных подходов к лечению сердечнососудистых заболеваний, поскольку многие фармакологические препараты, влияющие на сердце и сосуды, оказывают свое действие через систему обмена цАМФ.

Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 2 статьи. Результаты диссертации были представлены на 13-м международном совещании по эволюционной физиологии (СПб, 2006), на Международной конференции по простым нервным системам (Казань, 2006) и на конференциях молодых ученых ИБР РАН (2005, 2006).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Суханова, Ирина Федоровна

выводы

1.Расслабление аорты, вызванное цАМФ, опосредовано активацией протеинкиназы А и белков Ерас. Одним из механизмов цАМФ-индуцированного расслабления аорты является подавление рецептор-опосредованного повышения концентрации ионов кальция в цитоплазме.

2.В отличие от сосудов, в тромбоцитах белки Ерас не участвуют в проявлении действия цАМФ - подавлении АДФ-индуцированной агрегации. В данном эффекте цАМФ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов принимает участие только протеинкиназа А.

3.Аналоги цАМФ, избирательно активирующие протеинкиназу А и белки Ерас, увеличивают амплитуду сокращения сердца виноградной улитки в ответ на серотонин. Это свидетельствует об участии обеих цитоплазматических мишеней цАМФ в регуляции сократимости сердца.

4.Активация сократимости сердца виноградной улитки H.pomatia, вызванная серотонином, опосредована разными видами 5НТ-рецепторов. Одни рецепторы сопряжены с аденилатциклазой и повышают- уровень цАМФ. Второй вид рецепторов подобен 5НТ3-рецепторам млекопитающих и относится к типу ионотропных рецепторов.

5.0писан цАМФ-независимый механизм активации сократимости сердца виноградной улитки тромбином. Полученные данные свидетельствуют, что тромбин активирует в сердце улитки рецепторы, гомологичные активируемым протеазами рецепторам 1-го и 4-го типов млекопитающих.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе показано, что белки Ерас участвуют в цАМФ-зависимом расслаблении сосудов. Их активация приводит к уменьшению силы сокращения изолированной аорты, вызываемого вазоконстрикторным нейротрансмиттером норадреналином или альфа 1-адреномиметиком фенилэфрином. Однако вопрос о том, по какому механизму осуществляется их действие, остается открытым. Возможно, что белки Ерас каким - то образом подавляют сокращение, вызванное вазоконстрикторами, действуя на уровне гладкомышечных клеток (ГМК). В этом случае возможные субстраты для белков Ерас в гладкомышечных клетках сосудов - это фосфолипаза С-е, рецепторы инозитолтрисфосфата, кальциевые насосы (SR и плазматической мембраны), протеинкиназы легких цепей миозина (MLCK), р42/р44 MAP киназы и Rho киназы [Somlyo, 1999]. В случае, если белки Ерас действуют на на фосфолипазу С-е, рецепторы инозитолтрисфосфата, кальциевые насосы (SR и плазматической мембраны), протеинкиназы легких цепей' миозина (MLCK), р42/р44 MAP киназы, и Rho киназы, то по логике вещей они должны каким-то образом напрямую или косвенно вызывать ингибирование активностей вышеперечисленных мишеней. При этом наиболее вероятной на данный момент представляется гипотеза о том, что белки Ерас, действуя на

Ох одну или несколько этих мишеней, влияют на обмен ионов Са в гладкомышечных клетках. Эксперименты, в которых было показано

2+ ингибирование форсколином подъёма [Са ]цит в ГМК в ответ на серотонин, позволяют высказывать такое предположение.

Нельзя исключить, что активация белков Ерас запускает происходящие в эндотелиальных клетках процессы, приводящие к релаксации сосудов. В этом случае можно предполагать, что активация белков Ерас каким-то обрзом связана с выбросом эндотелий-зависимого расслабляющего фактора (EDHF). Наблюдаемое при активации Ерас расслабление аорты не связано с выбросом NO и простациклина, так как наши эксперименты показали, что на расслабление вызванное активаторами белков Ерас никак не влияют специфический ингибитор протеинкиназы G и специфический ингибитор протеинкиназы А.

Расслабление сосудов, вызванное активаторами белков Ерас не превышает, как правило, 50%. В отличие от этого, активация протеинкиназы А приводит к полному расслаблению изолированной аорты, предсокращенной норадреналином. Этот факт свидетельствует в пользу того, что цАМФ-зависимые механизмы расслабления аорты, опосредованные протеинкиназой А и белками Ерас, принципиально различаются.

Эксперименты, выполненные на тромбоцитах, показали, что подавление в этих клетках Са-зависимого процесса АДФ-индуцированной агрегации под влиянием цАМФ происходит без участия белков Ерас. Очень важным следствием этих опытов стало доказательство специфичности действия аналога цАМФ, активирующего Ерас.

На модели изолированного сердца виноградной улитки мы показали, что обе цитоплазматические мишени цАМФ - и протеинкиназа А, и белки Ерас, регулируют сердечную сократимость. Оказалось, что в сердце виноградной улитки, в отличие от сердца млекопитающих, цАМФ не является основным фактором, вызывающим увеличение амплитуды сокращений сердца, а оказывает скорее модулирующее действие. Однако остается не ясным, почему, в отличие от активатора аденилатциклазы -форсколина, который вызывает увеличение амплитуды сокращения сердца, ни активатор протеинкиназы А, ни активатор белков Ерас сами по себе не вызывали увеличения амплитуды сокращений сердца. Можно предположить, что для проявления активаторного действия цАМФ на сердце виноградной улитки необходимо, чтобы эти два механизма работали согласованно.

Нами обнаружены в сердце улитки серотониновые рецепторы, подобные 5ШУрецепторам млекопитающих. Эти рецепторы не сопряжены с аденилатциклазой и представляют из себя катионные каналы, проницаемые для ионов натрия и кальция. Активация ими сокращений сердца, по-видимому, обусловлена входом ионов кальция или деполяризацией плазматической мембраны за счет входа ионов натрия и активацией потенциалуправляемых кальциевых каналов. Можно предположить, что цАМФ, образующаяся при активации 5НТ-рецепторов серотонина, сопряженных с аденилатциклазой, потенциирует активность этих каналов, действуя через протеинкиназу А, аналогично тому, как активируются потенциалуправляемые кальциевые каналы в сердце млекопитающих. Основываясь на недавно опубликованных данных о взаимодействии белков Ерас с протеинкиназой А и рианодиновыми рецепторами ретикулума в кардиомиоцитах мыши (Dodge-Kafka et al., 2005), можно предположить, что в сердце белки Ерас каким-то образом активируют кальциевый обмен и таким образом усиливают сократимость. Выяснение этих вопросов требует дальнейших исследований.

В данной работе описан цАМФ-независимый механизм активации сократимости сердца виноградной улитки под действием тромбина. Полученные данные говорят о том, что тромбин действует через активируемые протеазами рецепторы PAR] и PAR4. Это первое свидетельство того, что рецепторы данного типа есть не только у млекопитающих, но и у представителей филогенетически отдаленного типа животных - моллюсков. Однако для полной уверенности в том, что такие рецепторы у улитки существуют, их необходимо клонировать. По-видимому, окончательное решение данного вопроса будет достигнуто после расшифровки генома данного представителя брюхоногих моллюсков.

Гипотетическая модель, описывающая возможные механизмы активации сердца виноградной улитки по цАМФ-зависимому и цАМФ-независимому механизмам, изображена на рисунке 3.20. Мы предполагаем, что наиболее вероятным путем действия тромбина является активация фосфолипазы С через белок Gq, тогда как серотонин запускает два других механизма - синтез цАМФ и открывание катион ных каналов, транспортирующих кальций.

Рис. 3.21. Предполагаемые механизмы регуляция со краш мости сердца улитка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суханова, Ирина Федоровна, Москва

1. Abdel-Latif A. A. Cross talk between cyclic nucleotides and polyphosphoinositide hydrolysis, protein kinases, and contraction in smooth muscle//Exp Biol Med (Maywood).-2001.-V.226.-N.3.-P. 153-163.

2. Amano M., Ito M., Kimura K., Fukata Y., Chihara K., Nakano Т., Matsuura Y. and Kaibuchi K. Phosphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase (Rho-kinase)//J Biol Chem.-1996.-V.271.-N.34.-P.20246-20249.

3. Anholt R. R. Molecular neurobiology of olfaction//Crit Rev Neurobiol.-1993.-V.7.-N.l.-P.l-22.

4. Aromataris E. C., Roberts M. L., Barritt G. J. and Rychkov G. Y. Glucagon activates Ca2+ and CI- channels in rat hepatocytes//J Physiol.-2006.-V.

5. Attwood Т. K. and Findlay J. B. Fingerprinting G-protein-coupled receptors//Protein Eng.-1994.-V.7.-N.2.-P. 195-203.

6. Авдонин П.В. Структура и сигнальные свойства G-белок сопряженных рецепторных комплексов //Биологические мембраны.-2005.-T.22.-N. 1 .-С.3-26.

7. Barg S., Huang P., Eliasson L., Nelson D. J., Obermuller S., Rorsman P., Thevenod F. and Renstrom E. Priming of insulin granules for exocytosis by granular Cl(-) uptake and acidification//J Cell Sci.-2001.-V.l 14.-N.Pt 11.-P.2145-2154.

8. Bark N., Blomback B. and Fatah K. On the occurrence of thrombin-Iike enzymes in mosquitoes//Thromb Res.-1996.-V.81.-N.6.-P.623-634.

9. Barr A. J., Brass L. F. and Manning D. R. Reconstitution of Receptors and GTP-binding Regulatory Proteins (G Proteins) in Sf9 Cells. A DIRECT EVALUATION OF SELECTIVITY IN RECEPTORG PROTEIN COUPLING//! Biol. Chem.-1997.-V.272.-N.4.-P.2223-2229.

10. Barradeau S., Imaizumi-Scherrer Т., Weiss M. C. and Faust D. M. Intracellular targeting of the type-I alpha regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase//Trends Cardiovasc Med.-2002.-V.12.-N.6.-P.235-241.

11. Baukrowitz Т., Schulte U., Oliver D., Herlitze S., Krauter Т., Tucker S. J., Ruppersberg J. P. and Fakler В. PIP2 and PIP as determinants for ATP inhibition of KATP channels//Science.-1998.-V.282.-N.5391.-P.1141-1144.

12. Beavo J. A. and Brunton L. L. Cyclic nucleotide research -- still expanding after half a century//Nat Rev Mol Cell Biol.-2002.-V.3.-N.9.-P.710-718.

13. Bers D. M. Cardiac excitation-contraction coupling//Nature.-2002.-V.415.-N.6868.-P.198-205.

14. Bjarnadottir Т. K., Fredriksson R., Hoglund P. J., Gloriam D. E., Lagerstrom M. C. and Schioth H. B. The human and mouse repertoire of the adhesion family of G-protein-coupled receptors//Genomics.-2004.-V.84.-N.l.-P.23-33.

15. Bois P., Renaudon В., Baruscotti M., Lenfant J. and DiFrancesco D. Activation of f-channels by cAMP analogues in macropatches from rabbit sino-atrial node myocytes/Л Physiol.-1997.-V.501 (Pt3).-P.565-571.

16. Bonigk W., Bradley J., Muller F., Sesti F., Boekhoff I., Ronnett G. V., Kaupp U. B. and Frings S. The native rat olfactory cyclic nucleotide-gated channel is composed of three distinct subunits//J Neurosci.-1999.-V.19.-N.13.-P.5332-5347.

17. Bornfeldt К. E. and Krebs E. G. Crosstalk between protein kinase A and growth factor receptor signaling pathways in arterial smooth muscle//Cell Signal.-1999.-V.l 1.-N.7.-P.465-477.

18. Bos J. L. Epac: a new cAMP target and new avenues in cAMP research//Nat Rev Mol Cell Biol.-2003.-V.4.-N.9.-P.733-738.

19. Bos J. L., de Rooij J. and Reedquist K. A. Rapl signalling: adhering to new models//Nat Rev Mol Cell Biol.-2001.-V.2.-N.5.-P.369-377.

20. Bourne H. R. How receptors talk to trimeric G proteins//Curr Opin Cell Biol.-1997.-V.9.-N.2.-P.134-142.

21. Bradley J., Frings S., Yau K. W. and Reed R. Nomenclature for ion channel subunits//Science.-2001.-V.294.-N.5549.-P.2095-2096.

22. Branham M. Т., Mayorga L. S. and Tomes C. N. Calcium induced acrosomal exocytosis requires cAMP acting through a РКА-independent, EPAC-mediated pathway//J Biol Chem.-2006.-V.

23. Brodde О. E., Broede A., Daul A., Kunde K. and Michel M. C. Receptor systems in the non-failing human heart//Basic Res Cardiol.-1992.-V.87 Suppl 1.-P. 1-14.

24. Broillet M. C. and Firestein S. Cyclic nucleotide-gated channels. Molecular mechanisms of activation//Ann N Y Acad Sci.-1999.-V.868.-P.730-740.

25. Brunet A. and Pouyssegur J. Identification of MAP kinase domains by redirecting stress signals into growth factor responses//Science.-1996.-V.272.-N.5268.-P. 1652-1655.

26. Buckett K. J., Peters M., Dockray G. J., Van Minnen J. and Benjamin P. R. Regulation of heartbeat in Lymnaea by motoneurons containing FMRFamide-like peptides/Л Neurophysiol.-1990.-V.63.-N.6.-P. 1426-1435.

27. Busby S., Spassky A. and Chan B. RNA polymerase makes important contacts upstream from base pair -49 at the Escherichia coli galactose operon PI promoter//Gene.-1987.-V.53.-N.2-3.-P. 145-152.

28. Cabrera-Vera Т. M., Vanhauwe J., Thomas T. 0., Medkova M., Preininger A., Mazzoni M. R. and Hamm H. E. Insights into G protein structure, function, and regulation//Endocr Rev.-2003.-V.24.-N.6.-P.765-781.

29. Caicedo A., Pereira E., Margolskee R. F. and Roper S. D. Role of the G-protein subunit alpha-gustducin in taste cell responses to bitter stimuli//J Neurosci.-2003.-V.23.-N.30.-P.9947-9952.

30. Cardot J. The monoamines in molluscs. II. Dopamine and neurotransmission. Cardiac dopaminergic innervation in Helix pomatia (author's transl).//J Physiol (Paris).-1979.-V.75.-N.7.-P.715-728.

31. Caron E. Cellular functions of the Rapl GTP-binding protein: a pattern emerges//J Cell Sci.-2003.-V.l 16.-N.Pt 3.-P.435-440.

32. Cary D. A. and Mendelsohn F. A. Effect of forskolin, isoproterenol and IBMX on angiotensin converting enzyme and cyclic AMP production by cultured bovine endothelial cells//Mol Cell Endocrinol.-1987.-V.53.-N.l-2.-P.103-109.

33. Cassel D., Levkovitz H. and Selinger Z. The regulatory GTPase cycle of turkey erythrocyte adenylate cyclase//J Cyclic Nucleotide Res.-1977.-V.3.-N.6.-P.393-406.

34. Chang F., Cohen I. S., DiFrancesco D., Rosen M. R. and Tromba C. Effects of protein kinase inhibitors on canine Purkinje fibre pacemaker depolarization and the pacemaker current i(f)//J Physiol.-1991.-V.440.-P.367-384.

35. Chang G. W., Stacey M., Kwakkenbos M. J., Hamann J., Gordon S. and Lin H. H. Proteolytic cleavage of the EMR2 receptor requires both the extracellular stalk and the GPS motif//FEBS Lett.-2003.-V.547.-N.l-3.-P.145-150.

36. Cheung U., Atwood H. L. and Zucker R. S. Presynaptic effectors contributing to cAMP-induced synaptic potentiation in Drosophila//J Neurobiol.-2006.-V.66.-N.3.-P.273-280.

37. Chin E. C. and Abayasekara D. R. Progesterone secretion by luteinizing human granulosa cells: a possible cAMP-dependent but РКА-independent mechanism involved in its regulation/Л Endocrinol.-2004.-V. 183 .-N. 1 .-P.51 -60.

38. Choi E. J., Xia Z., Villacres E. C. and Storm D. R. The regulatory diversity of the mammalian adenylyl cyclases//Curr Opin Cell Biol.-1993.-V.5.-N.2.-P.269-273.

39. Colledge M. and Scott J. D. AKAPs: from structure to function//Trends Cell Biol.-1999.-V.9.-N.6.-P.216-221.

40. Collins S., Bouvier M., Lohse M. J., Benovic J. L., Caron M. G. and Lefkowitz R. J. Mechanisms involved in adrenergic receptor desensitization//Biochem Soc Trans.-1990.-V.18.-N.4.-P.541-544.

41. Conti M. Phosphodiesterases and cyclic nucleotide signaling in endocrine cells//Mol Endocrinol.-2000.-V.14.-N.9.-P.1317-1327.

42. Cooper D. M. Regulation and organization of adenylyl cyclases and cAMP//Biochem J.-2003.-V.375.-N.Pt 3.-P.517-529.

43. Cunnick J. M., Hurt D., Oppert В., Sakamoto K. and Takemoto D. J. Binding of the gamma-subunit of retinal rod-outer-segment phosphodiesterase with both transducin and the catalytic subunits of phosphodiesterase//Biochem J.-1990.-V.271.-N.3.-P.721-727.

44. Daaka Y., Luttrell L. M. and Lefkowitz R. J. Switching of the coupling of the beta2-adrenergic receptor to different G proteins by protein kinase A//Nature.-1997.-V.390.-N.6655.-P.88-91.

45. Defer N., Best-Belpomme M. and Hanoune J. Tissue specificity and physiological relevance of various isoforms of adenylyl cyclase//Am J Physiol Renal Physiol.-2000.-V.279.-N.3.-P.F400-416.

46. Dhallan R. S„ Yau K. W., Schrader K. A. and Reed R. R. Primary structure and functional expression of a cyclic nucleotide-activated channel from olfactory neurons//Nature.-1990.-V.347.-N.6289.-P. 184-187.

47. DiPilato L. M., Cheng X. and Zhang J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments//Proc Natl Acad Sci U S A.-2004.-V.101.-N.47.-P.16513-16518.

48. Dodge-Kafka K. L., Soughayer J., Pare G. C., Carlisle Michel J. J., Langeberg L. K„ Kapiloff M. S. and Scott J. D. The protein kinase A anchoring protein mAKAP coordinates two integrated cAMP effector pathways//Nature.-2005.-V.437.-N.7058.-P.574-578.

49. Dremier S., Kopperud R., Doskeland S. 0., Dumont J. E. and Maenhaut C. Search for new cyclic AMP-binding proteins//FEBS Lett.-2003.-V.546.-N.l.-P.103-107.

50. Ebina Т., Kawabe J., Katada Т., Ohno S., Homey C. J. and Ishikawa Y. Conformation-dependent activation of type II adenylyl cyclase by protein kinase C//J Cell Biochem.-1997.-V.64.-N.3 .-P.492-498.

51. Eckly-Michel A., Martin V. and Lugnier C. Involvement of cyclic nucleotide-dependent protein kinases in cyclic AMP-mediated vasorelaxation//Br J Pharmacol.-1997.-V.122.-N.1.-P.158-164.

52. Edvardsen 0., Reiersen A. L., Beukers M. W. and Kristiansen K. tGRAP, the G-protein coupled receptors mutant database//Nucleic Acids Res.-2002.-V.30.-N.l.-P.361-363.

53. Emmer M., deCrombrugghe В., Pastan I. and Perlman R. Cyclic AMP receptor protein of E. coli: its role in the synthesis of inducible enzymes//Proc Natl Acad Sci U S A.-1970.-V.66.-N.2.-P.480-487.

54. Essayan D. M. Cyclic nucleotide phosphodiesterases//.! Allergy Clin Immunol.-2001.-V.108.-N.5.-P.671-680.

55. Fesenko E. E., Kolesnikov S. S. and Lyubarsky A. L. Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment//Nature.-1985.-V.313.-N.6000.-P.310-313.

56. Frank K. and Kranias E. G. Phospholamban and cardiac contractility//Ann Med.-2000.-V.32.-N.8.-P.572-578.

57. Fujimoto K., Shibasaki Т., Yokoi N., Kashima Y., Matsumoto M., Sasaki Т., Tajima N., Iwanaga T. and Seino S. Piccolo, a Ca2+ sensor in pancreatic beta-cells. Involvement of cAMP

58. GEFII.Rim2.Piccolo complex in cAMP-dependent exocytosis//J Biol Chem.-2002.-V.277.-N.52.-P.50497-50502.

59. Gallagher P. J. and Stull J. T. Localization of an actin binding domain in smooth muscle myosin light chain kinase//Mol Cell Biochem.-1997.-V.173.-N.l-2.-P.51-57.

60. Gao Q. and Chess A. Identification of candidate Drosophila olfactory receptors from genomic DNA sequence//Genomics.-1999.-V.60.-N.l.-P.31-39.

61. Gauss R., Seifert R. and Kaupp U. B. Molecular identification of a hyperpolarization-activated channel in sea urchin sperm//Nature.-1998.-V.393.-N.6685.-P.583-587.

62. Gether U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors/ZEndocr Rev.-2000.-V.21.-N.l.-P.90-l 13.

63. Goulding E. H., Tibbs G. R. and Siegelbaum S. A. Molecular mechanism of cyclic-nucleotide-gated channel activation//Nature.-1994.-V.372.-N.6504.-P.369-374.

64. Greenberg D. L., Mize G. J. and Takayama Т. K. Protease-activated receptor mediated RhoA signaling and cytoskeletal reorganization in LNCaP cells//Biochemistry.-2003.-V.42.-N.3.-P.702-709.

65. Hardie G. Pseudosubstrates turn off protein kinases//Nature.-1988.-V.335.-N.6191.-P.592-593.

66. Harmar A. J. Family-B G-protein-coupled receptors//Genome Biol.-2001.-V.2.-N.12.-P.REVIEWS3013.

67. Hauet Т., Liu J., Li H., Gazouli M., Culty M. and Papadopoulos V. PBR, StAR, and PKA: partners in cholesterol transport in steroidogenic cells//Endocr Res.-2002.-V.28.-N.4.-P.395-401.

68. Helms M. N., Chen X. J., Ramosevac S., Eaton D. C. and Jain L. Dopamine regulation of amiloride-sensitive sodium channels in lung cells//Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.-2006.-V.290.-N.4.-P.L710-L722.

69. Hollinger S. and Hepler J. R. Cellular regulation of RGS proteins: modulators and integrators of G protein signaling//Pharmacol Rev.-2002.-V.54.-N.3.-P.527-559.

70. Holz G. G., Kang G., Harbeck M., Roe M. W. and Chepurny O. G. Cell physiology of cAMP sensor Epac//J Physiol.-2006.-V.577.-N.Pt 1.-P.5-15.

71. Hoon M. A., Adler E., Lindemeier J., Battey J. F., Ryba N. J. and Zuker C. S. Putative mammalian taste receptors: a class of taste-specific GPCRs with distinct topographic selectivity//Cell.-1999.-V.96.-N.4.-P.541-551.

72. Horowitz A., Menice С. В., Laporte R. and Morgan K. G. Mechanisms of smooth muscle contraction//Physiol Rev.-1996.-V.76.-N.4.-P.967-1003.

73. Houslay M. D. and Adams D. R. PDE4 cAMP phosphodiesterases: modular enzymes that orchestrate signalling cross-talk, desensitization and compartmentalization//Biochem J.-2003.-V.370.-N.Pt 1.-P.1-18.

74. Iwami G., Kawabe J., Ebina Т., Cannon P. J., Homey C. J. and Ishikawa Y. Regulation of adenylyl cyclase by protein kinase A//J Biol Chem.-1995.-V.270.-N.21.-P.12481-12484.

75. Jacobowitz 0., Chen J., Premont R. T. and Iyengar R. Stimulation of specific types of Gs-stimulated adenylyl cyclases by phorbol ester treatment//J Biol Chem.-1993.-V.268.-N.6.-P.3829-3832.

76. Johnson D. A., Akamine P., Radzio-Andzelm E., Madhusudan M. and Taylor S. S. Dynamics of cAMP-dependent protein kinase//Chem Rev.-2001.-V.101.-N.8.-P.2243-2270.

77. Kammerer R. A., Frank S., Schulthess Т., Landwehr R., Lustig A. and Engel J. Heterodimerization of a functional GABAB receptor is mediated by parallel coiled-coil alpha-helices//Biochemistry.-1999.-V.38.-N.40.-P. 13263-13269.

78. Kang G. and Holz G. G. Amplification of exocytosis by Ca2+-induced Ca2+ release in INS-1 pancreatic beta cells//J Physiol.-2003.-V.546.-N.Pt 1.-P.175-189.

79. Kang G., Chepurny O. G. and Holz G. G. cAMP-regulated guanine nucleotide exchange factor II (Epac2) mediates Ca2+-induced Ca2+ release in INS-1 pancreatic beta-cells//J Physiol.-2001.-V.536.-N.Pt 2.-P.375-385.

80. Kashima Y., Miki Т., Shibasaki Т., Ozaki N., Miyazaki M., Yano H. and Seino S. Critical role of cAMP-GEFII—Rim2 complex in incretin-potentiated insulin secretion//J Biol Chem.-2001 .-V.276.-N.49.-P.46046-46053.

81. Katoch S. S., Su X. and Moreland R. S. Ca(2+)- and protein kinase C-dependent stimulation of mitogen-activated protein kinase in detergent-skinned vascular smooth muscle//J Cell Physiol.T-1999.-V. 179.-N.2.-P.208-217.

82. Kaupp U. B. and Seifert R. Molecular diversity of pacemaker ion channels//Annu Rev Physiol.-2001.-V.63.-P.235-257.

83. Kaupp U. B. and Seifert R. Cyclic nucleotide-gated ion channels//Physiol Rev.-2002.-V.82.-N.3.-P.769-824.

84. Kawabe J., Ebina Т., Toya Y., Oka N. Schwencke C., Duzic E. and Ishikawa Y. Regulation of type V adenylyl cyclase by PMA-sensitive and -insensitive protein kinase С isoenzymes in intact cells//FEBS Lett.-1996.-V.384.-N.3.-P.273-276.

85. Kawasaki H., Springett G. M., Mochizuki N., Toki S., Nakaya M., Matsuda M., Housman D. E. and Graybiel A. M. A family of cAMP-binding proteins that directly activate Rapl//Science.-1998.-V.282.-N.5397.-P.2275-2279.

86. Knall C. and Johnson G. L. G-protein regulatory pathways: rocketing into the twenty-first century//J Cell Biochem Suppl.-1998.-V.30-31.-P.137-146.

87. Kolakowski L. F., Jr. GCRDb: a G-protein-coupled receptor database//Receptors Channels.-1994.-V.2.-N.l.-P.l-7.

88. Kooistra M. R., Corada M., Dejana E. and Bos J. L. Epacl. regulates-integrity of endothelial cell junctions through VE-cadherin//FEBS Lett.-2005.-V.579.-N.22.-P.4966-4972.

89. Kopperud R., Christensen A. E., Kjarland E., Viste K., Kleivdal H. and Doskeland S. 0. Formation of inactive cAMP-saturated holoenzyme of cAMP-dependent protein kinase under physiological conditions//J Biol Chem.-2002.-V.277.-N.16.-P.13443-13448.

90. Kotlikoff M. I. and Kamm К. E. Molecular mechanisms of beta-adrenergic relaxation of airway smooth muscle//Annu Rev Physiol.-1996.-V.58.-P.l 15-141.

91. Krupinski J. The adenylyl cyclase family//Mol Cell Biochem.-1991.-V.104.-N.l-2.-P.73-79.

92. Kwakkenbos M. J., Кор E. N., Stacey M., Matmati M., Gordon S., Lin H. H. and Hamann J. The EGF-TM7 family: a postgenomic view//Immunogenetics.-2004.-V.55.-N.10.-P.655-666.

93. Laroche-Joubert N., Marsy S., Michelet S., Imbert-Teboul M. and Doucet A. Protein kinase A-independent activation of ERK and H,K-ATPase by cAMP in native kidney cells: role of Epac I//J Biol Chem.-2002.-V.277.-N.21.-P. 18598-18604.

94. Lee С. M., Lin J. T. and Tsai T. S. Effects of neuroactive agents on the isolated heart activities of marine bivalve Meretrix lusoria//Chin J Physiol.-1993.-V.36.-N.3.-P.165-170.

95. Lee S. B. and Rhee S. G. Significance of PIP2 hydrolysis and regulation of phospholipase С isozymes//Curr Opin Cell Biol.-1995f-V.7.-N.2.-P.183-189.

96. Levin L. R. and Reed R. R. Identification of functional domains of adenylyl cyclase using In vivo chimeras//J Biol Chem.-1995.-V.270.-N.13.-P.7573-7579.

97. Lin H. H., Stacey M., Hamann J., Gordon S. and McKnight A. J. Human EMR2, a novel EGF-TM7 molecule on chromosome. 19pl3.1, is closely related to CD97//Genomics.-2000.-V.67.-N.2.-P. 188-200.

98. Lin H. H., Chang G. W., Davies J. Q., Stacey M., Harris J. and Gordon S. Autocatalytic cleavage of the EMR2 receptor occurs at a conserved G protein-coupled receptor proteolytic site motif//J Biol Chem.-2004.-V.279.-N.30.-P.31823-31832.

99. Lincoln Т. M. and Fisher-Simpson V. A comparison of the effects of forskolin and nitroprusside on cyclic nucleotides and relaxation in the rat aorta//Eur J Pharmacol.-1984.-V.101.-N.1-2.-P. 17-27.

100. Liu M. and Simon M. I. Regulation by cAMP-dependent protein kinease of a G-protein-mediated phospholipase C//Nature.-1996.-V.382.-N.6586.-P.83-87.

101. Liu X., Malbon С. C. and Wang H. Y. Identification of amino acid residues of Gsalpha critical to repression of adipogenesis//J Biol Chem.-1998.-V.273.-N.19.-P. 11685-11694.

102. Lloyd P. E. Cardioactive neuropeptides in gastropods//Fed Proc.-1982.-V.41.-N.13.-P.2948-2952.

103. Ludwig A., Zong X., Jeglitsch M., Hofmann F. and Biel M. A family of hyperpolarization-activated mammalian cation channels//Nature.-1998.-V.393.-N.6685.-P.587-591.

104. Luo S. F., Chiu С. Т., Tsao H. L„ Fan L. W., Tsai С. Т., Pan S. L. and Yang С. M. Effect of forskolin on bradykinin-induced calcium mobilization in cultured canine tracheal smooth muscle cells//Cell Signal.-1997.-V.9.-N.2.-P.159-167.

105. Lustig K. D., Conklin B. R., Herzmark P., Taussig R. and Bourne H. R. Type II adenylylcyclase integrates coincident signals from Gs, Gi, and Gq//J Biol Chem.-1993.-V.268.-N.19.-P.13900-13905.

106. Macfarlane S. R., Seatter M. J., Капке Т., Hunter G. D. and Plevin R. Proteinase-activated receptors//Pharmacol Rev.-2001.-V.53.-N.2.-P.245-282.

107. Malbon С. C. Frizzleds: new members of the superfamily of G-protein-coupled receptors/ZFront Biosci.-2004.-V.9.-P.1048-1058.

108. Mayr B. and Montminy M. Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependent factor CREB//Nat Rev Mol Cell Biol.-2001.-V.2.-N.8.-P.599-609.

109. McCullough A. R. An update on the PDE-5 inhibitors (PDE-5i)//J Androl.-2003.-V.24.-N.6 Suppl.-P.S52-58.

110. Means A. R. Regulatory cascades involving calmodulin-dependent protein kinases//Mol Endocrinol.-2000.-V.14.-N.l.-P.4-13.

111. Montminy M. Transcriptional regulation by cyclic AMP//Annu Rev Biochem.-1997.-V.66.-P.807-822.

112. Morel E., Marcantoni A., Gastineau M., Birkedal R., Rochais F., Gamier A., Lompre A. M., Vandecasteele G. and Lezoualc'h F. cAMP-Binding Protein Epac Induces Cardiomyocyte Hypertrophy//Circ Res.-2005.-V.

113. Moulis A. RFamide neuropeptide actions on the molluscan heart//Acta Biol Hung.-2004.-V.55.-N.1-4.-P.335-341.

114. Moulis A., Huddart H. and Hill R. B. Comparative potency of some extended peptide chain members of the RFamide neuropeptide family, assessed on the hearts of Busycon canaliculatum and Buccinum undatum//J Comp Physiol B.-2003.-V.173.-N.8.-P.637-642.

115. Movsesian M. A. cAMP-mediated signal transduction and sarcoplasmic reticulum function in heart failure//Ann N Y Acad Sci.-1998.-V.853.-P.231-239.

116. Nakamura Т., Hayashi K. and Seki J. Eight-channel ultrasonic displacement meter for implantable miniature sensors//Med Biol Eng Comput.-1987.-V.25.-N.3.-P.355-358.

117. Nakazaki M., Crane A., Ни M., Seghers V., Ullrich S., Aguilar-Bryan L. and Bryan J. cAMP-activated protein kinase-independent potentiation of insulin secretion by cAMP is impaired in SUR1 null islets//Diabetes.-2002.-V.51.-N.12.-P.3440-3449.

118. Neary J. T. Trophic actions of extracellular ATP on astrocytes, synergistic interactions with fibroblast growth factors and underlying signal transduction mechanisms//Ciba Found Symp.-1996.-V. 198.-P. 130-139; discussion 139-141.

119. Nguyen Q. D., Faivre S., Bruyneel E., Rivat C., Seto M., Endo Т., Mareel M., Emami S. and Gespach C. RhoA- and RhoD-dependent regulatory switch of Galpha subunit signaling by PAR-1 receptors in cellular invasion//Faseb J.-2002.-V.16.-N.6.-P.565-576.

120. Nikolaev V. O., Bunemann M., Hein L., Hannawacker A. and Lohse M. J. Novel Single Chain cAMP Sensors for Receptor-induced Signal Propagation/Л Biol Chem.-2004.-V.279.-N.36.-P.37215-37218.

121. Ozaki N., Shibasaki Т., Kashima Y., Miki Т., Takahashi K., Ueno H., Sunaga Y., Yano H., Matsuura Y., Iwanaga Т., Takai Y. and Seino S. cAMP-GEFII is a direct target of cAMP in regulated exocytosis//Nat Cell Biol.-2000.-V.2.-N.ll.-P.805-811.

122. Patel S., Joseph S. K. and Thomas A. P. Molecular properties of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors//Cell Calcium.-1999.-V.25.-N.3.-P.247-264.

123. Paterson J. M., Smith S. M., Harmar A. J. and Antoni F. A. Control of a novel adenylyl cyclase by calcineurin//Biochem Biophys Res Commun.-1995.-V.214.-N.3.-P.1000-1008.

124. Petrashevskaya N. N., Koch S. E., Bodi I. and Schwartz A. Calcium cycling, historic overview and perspectives. Role for autonomic nervous system regulation//J Mol Cell Cardiol.-2002.-V.34.-N.8.-P.885-896.

125. Picco C., Gavazzo P. and Menini A. Co-expression of wild-type and mutant olfactory cyclic nucleotide-gated channels: restoration of the native sensitivity to Ca(2+) and Mg(2+) blockage//Neuroreport.-2001.-V.12.-N.ll.-P.2363-2367.

126. Pohl S. L., Birnbaumer L. and Rodbell M. Glucagon-sensitive adenyl cylase in plasma membrane of hepatic parenchymal cells//Science.-1969.-V.164.-N.879.-P.566-567.

127. Pohl S. L., Birnbaumer L. and Rodbell M. The glucagon-sensitive adenyl cyclase system in plasma membranes of rat liver. I. Properties/Я Biol Chem.-1971.-V.246.-N.6.-P.1849-1856.

128. Qiao J., Mei F. C., Popov V. L., Vergara L. A. and Cheng X. Cell cycle-dependent subcellular localization of exchange factor directly activated by cAMP//J Biol Chem.-2002.-V.277.-N.29.-P.26581-26586.

129. Rehmann H., Rueppel A., Bos J. L. and Wittinghofer A. Communication between the regulatory and the catalytic region of the cAMP-responsive guanine nucleotide exchange factor Epac//J Biol Chem.-2003.-V.278.-N.26.-P.23508-23514.

130. Rehmann H., Schwede F., Doskeland S. O., Wittinghofer A. and Bos J. L. Ligand-mediated activation of the cAMP-responsive guanine nucleotide exchange factor Epac//J Biol Chem.-2003.-V.278.-N.40.-P.38548-38556.

131. Rehmann H., Prakash В., Wolf E., Rueppel A., De Rooij J„ Bos J. L. and Wittinghofer A. Structure and regulation of the cAMP-binding domains of Epac2//Nat Struct Biol.-2003.-V.10.-N.1.-P.26-32.

132. Reich G., Doble К. E., Price D. A. and Greenberg M. J. Effects of cardioactive peptides on myocardial cAMP levels in the snail Helix aspersa//Peptides.-1997.-V.18.-N.3.-P.355-360.

133. Reznikoff W. S. The lactose operon-controlling elements: a complex paradigm//Mol Microbiol.-1992.-V.6.-N. 17.-P.2419-2422.

134. Ringheim G. E. and Taylor S. S. Effects of cAMP-binding site mutations on intradomain cross-communication in the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase Ш Biol Chem.-1990.-V.265.-N.32.-P.19472-19478.

135. Rodbell M., Birnbaumer L. and Pohl S. L. Adenyl cyclase in fat cells. 3. Stimulation by secretin and the effects of trypsin on the receptors for lipolytic hormones//J Biol Chem.-1970.-V.245.-N.4.-P.718-722.

136. Rodbell M., Birnbaumer L., Pohl S. L. and Krans H. M. The glucagon-sensitive adenyl cyclase system in plasma membranes of rat liver. V. An obligatory role of guanylnucleotides in glucagon action//J Biol Chem.-1971.-V.246.-N.6.-P.1877-1882.

137. Rybalkin S. D., Yan C., Bornfeldt К. E. and Beavo J. A. Cyclic GMP phosphodiesterases and regulation of smooth muscle function//Circ Res.-2003.-V.93.-N.4.-P.280-291.

138. Sakaba T. and Neher E. Quantitative relationship between transmitter release and calcium current at the calyx of held synapse//J Neurosci.-2001.-V.21.-N.2.-P.462-476.

139. Sakaba T. and Neher E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of Held synapse//J Neurosci.-2003.-V.23.-N.3.-P.837-846.

140. Santoro В., Liu D. Т., Yao H., Bartsch D., Kandel E. R., Siegelbaum S. A. and Tibbs G. R. Identification of a gene encoding a hyperpolarization-activated pacemaker channel of brain//Cell.-1998.-V.93.-N.5.-P.717-729.

141. Sawada H. Ascidian sperm lysin system//Zoolog Sci.-2002.-V.19.-N.2.-P.139-151.

142. Schmidt M., Evellin S., Weernink P. A., von Dorp F., Rehmann H., Lomasney J. W. and Jakobs К. H. A new phospholipase-C-calcium signalling pathway mediated by cyclic AMP and a Rap GTPase//Nat Cell Biol.-2001.-V.3.-N.ll.-P.1020-1024.

143. Schwede F., Maronde E., Genieser H. and Jastorff B. Cyclic nucleotide analogs as biochemical tools and prospective drugs//Pharmacol Ther.-2000.-V.87.-N.2-3.-P. 199-226.

144. Schwinger R. H. and Frank K. F. Calcium and the failing heart: phospholamban, good guy or bad guy?//Sci STKE.-2003.-V.2003.-N.180.-P.pel5.

145. Seino S. and Shibasaki T. РКА-dependent and РКА-independent pathways for cAMP-regulated exocytosis//Physiol Rev.-2005.-V.85.-N.4.-P. 1303-1342.

146. Shapiro M. S. and Zagotta W. N. Structural basis for ligand selectivity of heteromeric olfactory cyclic nucleotide-gated channels//Biophys J.-2000.-V.78.-N.5.-P.2307-2320.

147. Shibasaki Т., Sunaga Y., Fujimoto K., Kashima Y. and Seino S. Interaction of ATP sensor, cAMP sensor, Ca2+ sensor, and voltage-dependent Ca2+ channel in insulin granule exocytosis//J Biol Chem.-2004.-V.279.-N.9.-P.7956-7961.

148. Shimomura H., Imai A. and Nashida T. Evidence for the involvement of cAMP-GEF (Epac) pathway in amylase release from the rat parotid gland//Arch Biochem Biophys.-2004.-V.431 .-N. 1 .-P. 124-128.

149. Shyng S. L. and Nichols C. G. Membrane phospholipid control of nucleotide sensitivity of KATP channels//Science.-1998.-V.282.-N.5391.-P.l 138-1141.

150. Skalhegg B. S., Tasken K., Hansson V., Huitfeldt H. S., Jahnsen T. and Lea T. Location of cAMP-dependent protein kinase type I with the TCR-CD3 complex//Science.-1994.-V.263.-N.5143.-P.84-87.

151. Smith С. M., Radzio-Andzelm E., Madhusudan, Akamine P. and Taylor S. S. The catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase: prototype for an extended network of communication//Prog Biophys Mol Biol.-1999.-V.71.-N.3-4.-P.313-341.

152. Somlyo A. P. Kinases, myosin phosphatase and Rho proteins: curiouser and curiouser//J Physiol.-1999.-V.516 (Pt 3).-P.630.

153. Stacey M., Lin H. H., Gordon S. and McKnight A. J. LNB-TM7, a group of seven-transmembrane proteins related to family-B G-protein-coupled receptors//Trends Biochem Sci.-2000.-V.25.-N.6.-P.284-289.

154. Stern A. S„ Magram J. and Presky D. H. Interleukin-12 an integral cytokine in the immune response//Life Sci.-1996.-V.58.-N.8.-P.639-654.

155. Stork P. J. Does Rapl deserve a bad Rap?//Trends Biochem Sci.-2003.-V.28.-N.5.-P.267-275.

156. Su T. Z., Qi S., Yun W. H. and Xiu L. Regulation in the expression of alpha-galactosidase gene in raf operon in Escherichia coli.//Wei Sheng Wu Xue Bao.-1989.-V.29.-N.3.-P. 180-186.

157. Takahashi N. Kadowaki Т., Yazaki Y., Ellis-Davies G. C., Miyashita Y. and Kasai H. Post-priming actions of ATP on Ca2+-dependent exocytosis in pancreatic beta cells//Proc Natl Acad Sci U S A.-1999.-V.96.-N.2.-P.760-765.

158. Takai Y., Sasaki T. and Matozaki T. Small GTP-binding proteins//Physiol Rev.-2001.-V.81 .-N. 1 .-P. 153-208.

159. Tang W. J., Yan S. and Drum C. L. Class III adenylyl cyclases: regulation and underlying mechanisms//Adv Second Messenger Phosphoprotein Res.-1998.-V.32.-P.137-151.

160. Taussig R. and Zimmermann G. Type-specific regulation of mammalian adenylyl cyclases by G protein pathways//Adv Second Messenger Phosphoprotein Res.-1998.-V.32.-P.81-98.

161. Torgersen К. M., Vang Т., Abrahamsen H., Yaqub S. and Tasken K. Molecular mechanisms for protein kinase A-mediated modulation of immune function//Cell Signal.-2002.-V.14.-N.1.-P.1-9.

162. Uckert S., Kuthe A., Jonas U. and Stief C. G. Characterization and functional relevance of cyclic nucleotide phosphodiesterase isoenzymes of the human prostate//J Urol.-2001.-V.166.--N.6.-P.2484-2490.

163. Varnum M. D. and Zagotta W. N. Subunit interactions in the activation of cyclic liucleotide-gated ion channels//Biophys J.-1996.-V.70.-N.6.-P.2667-2679.

164. Veillette A., Latour S. and Davidson D. Negative regulation of immunoreceptor signaling//Annu Rev Immunol.-2002.-V.20.-P.669-707.

165. Vogt S., Grosse R., Schultz G. and Offermanns S. Receptor-dependent RhoA activation in G12/G13-deficient cells: genetic evidence for an involvement of Gq/Gll/Я Biol Chem.-2003.-V.278.-N.31 .-P.28743-28749.

166. Vorherr Т., Knopfel L., Hofmann F., Mollner S., Pfeuffer T. and Carafoli E. The calmodulin binding domain of nitric oxide synthase and adenylyl cyclase//Biochemistry.-1993.-V.32.-N.23.-P.6081-6088.

167. Vossler M. R., Yao H., York R. D., Pan M. G., Rim C. S. and Stork P. J. cAMP activates MAP kinase and Elk-1 through a B-Raf- and Rap 1-dependent pathway//Cell.-1997.-V.89.-N.l.-P.73-82.

168. Wang H. and Storm D. R. Calmodulin-regulated adenylyl cyclases: cross-talk and plasticity in the central nervous system//Mol Pharmacol.-2003.-V.63.-N.3.-P.463-468.

169. Wang H. Y. and Malbon С. C. Wnt-frizzled signaling to G-protein-coupled effectors//Cell Mol Life Sci.-2004.-V.61 .-N. 1 .-P.69-75.

170. Wayman G. A., Wei J., Wong S. and Storm D. R. Regulation of type I adenylyl cyclase by calmodulin kinase IV in vivo//Mol Cell Biol.-1996.-V.16.-N.ll.-P.6075-6082.

171. Weber I. T. and Steitz T. A. Structure of a complex of catabolite gene activator protein and cyclic AMP refined at 2.5 A resolution//J Mol Biol.-1987.-V.198.-N.2.-P.311-326.

172. Weber I. Т., Takio K., Titani K. and Steitz T. A. The cAMP-binding domains of the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase and the catabolite gene activator protein are homologous//Proc Natl Acad Sci U S A.-1982.-V.79.-N.24.-P.7679-7683.

173. Weber I. Т., Steitz T. A., Bubis J. and Taylor S. S. Predicted structures of cAMP binding domains of type I and II regulatory subunits of cAMP-dependent protein kinase//Biochemistry.-1987.-V.26.-N.2.-P.343-351.

174. Wei J., Wayman G. and Storm D. R. Phosphorylation and inhibition of type III adenylyl cyclase by calmodulin-dependent protein kinase II in vivo//J Biol Chem.-1996.-V.271.-N.39.-P.24231-24235.

175. Wei J. Y., Roy D. S., Leconte L. and Barnstable C. J. Molecular and pharmacological analysis of cyclic nucleotide-gated channel function in the central nervous system//Prog Neurobiol.-1998.-V.56.-N.l.-P.37-64.

176. Wen W., Taylor S. S. and Meinkoth J. L. The expression and intracellular distribution of the heat-stable protein kinase inhibitor is cell cycle regulated//J Biol Chem.-1995.-V.270.-N.5.-P.2041-2046.

177. Wen W., Harootunian A. Т., Adams S. R., Feramisco J., Tsien R. Y., Meinkoth J. L. and Taylor S. S. Heat-stable inhibitors of cAMP-dependent protein kinase carry a nuclear export signal//J Biol Chem.-1994.-V.269.-N.51.-P.32214-32220.

178. Wess J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition//FASEB J.-1997.-V.11.-N.5.-P.346-354.

179. White A. A. Separation and purification of cyclic nucleotides by alumina column chromatography//Methods Enzymol.-1974.-V.38.-P.41-46.

180. Willoughby D., Yeoman M. S. and Benjamin P. R. Cyclic AMP is involved in cardioregulation by multiple neuropeptides encoded on the FMRFamide gene//J Exp Biol.-1999.-V.202.-N.Pt 19.-P.2595-2607.

181. Wollemann M. and Rozsa K. S. Effects of serotonin and catecholamines on the adenylate cyclase of molluscan heart//Comp Biochem Physiol C.-1975.-V.51.-N.1.-P.63-66.

182. Wu Z. L., Thomas S. A., Villacres E. C., Xia Z., Simmons M. L., Chavkin C., Palmiter R. D. and Storm D. R. Altered behavior and long-term potentiation in type I adenylyl cyclase mutant mice//Proc Natl Acad Sci U S A.-1995.-V.92.-N.1.-P.220-224.

183. Wuttke M. S., Buck J. and Levin L. R. Bicarbonate-regulated soluble adenylyl cyclase//Jop.-2001 .-V.2.-N.4 Suppl.-P. 154-158.

184. Xavier R., Brennan Т., Li Q., McCormack C. and Seed B. Membrane compartmentation is required for efficient T cell activation//Immunity.-1998.-V.8.-N.6.-P.723-732.

185. Xia Z. and Storm D. R. Calmodulin-regulated adenylyl cyclases and neuromodulation//Curr Opin Neurobiol.-1997.-V.7.-N.3.-P.391-396.

186. Yang X., Taylor L. and Polgar P. Mechanisms in the transcriptional regulation of bradykinin B1 receptor gene expression. Identification of a minimum cell-type specific enhancer//J Biol Chem.-1998.-V.273.-N.17.-P.10763-10770.

187. Yang X., Taylor L. and Polgar P. Effect of the G-protein, G alpha(i2), and G alpha(i3) subunit knockdown on bradykinin-induced signal transduction in rat-1 cells//Mol Cell Biol Res Commun.- 1999.-V. 1 .-N.3.-P.227-236.

188. Yau K. W. Cyclic nucleotide-gated channels: an expanding new family of ion channels//Proc Natl Acad Sci U S A.-1994.-V.91.-N.9.-P.3481-3483.

189. Yip К. P. Epac mediated Ca2+ mobilization and exocytosis in inner medullary collecting duct//Am J Physiol Renal Physiol.-2006.-V.

190. York R. D., Yao H., Dillon Т., Ellig C. L., Eckert S. P., McCleskey E. W. and Stork P. J. Rapl mediates sustained MAP kinase activation induced by nerve growth factor//Nature.-1998.-V.392.-N.6676.-P.622-626.

191. Yoshimura M. and Cooper D. M. Cloning and expression of a Ca(2+)-inhibitable adenylyl cyclase from NCB-20 cells//Proc Natl Acad Sci U S A.-1992.-V.89.-N.15.-P.6716-6720.

192. Yoshimura M., Ikeda H. and Tabakoff B. mu-Opioid receptors inhibit dopamine-stimulated activity of type V adenylyl cyclase but enhance dopamine-stimulated activity of type VII adenylyl cyclase//Mol Pharmacol.-1996.-V.50.-N.1.-P.43-51.

193. Yue C., Dodge K. L., Weber G. and Sanborn В. M. Phosphorylation of serine 1105 by protein kinase A inhibits phospholipase Cbeta3 stimulation by Galphaq//J Biol Chem.-1998.-V.273.-N.29.-P. 18023-18027.

194. Zhao J., Li L., Wu C. and He R. Q. Hydrolysis of fibrinogen and plasminogen by immobilized earthworm fibrinolytic enzyme II from Eisenia fetida//Int J Biol Macromol.-2003.-V.32.-N.3-5.-P. 165-171.

195. Zhong N. and Zucker R. S. cAMP acts on exchange protein activated by cAMP/cAMP-regulated guanine nucleotide exchange protein to regulate transmitter release at the crayfish neuromuscular junction//J Neurosci.-2005.-V.25.-N.l.-P.208-214.

196. Жуковский С. В., Коробов Н. В., Диегии В. И., Помогайбо С. В. и Виноградов В. А. Изучение механизма гипертензивного эффекта FMRF-подобных пептидов//Бюлл Всесоюзного Кардиол Научн Центра АМН СССР.-1989.-Т.12.-Н.1.-С.45-47.

197. Zimmermann G., Zhou D. and Taussig R. Activating mutation of adenylyl cyclase reverses its inhibition by G proteins//Mol Pharmacol.-1999.-V.56.-N.5.-P.895-901.

198. Zubay G., Schwartz D. and Beckwith J. Mechanism of activation of catabolite-sensitive genes: a positive control system//Proc Natl Acad Sci U S A.-1970.-V.66.-N.1.-P.104-110.

Информация о работе

Суханова, Ирина Федоровна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.13

Диссертация

Роль цАМФ-связывающих белков ЕРАС в регуляции сократимости кровеносных сосудов и сердца - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы