Роль различных типов антиген-презентирующих клеток в регуляции апоптоза лимфоцитов и репликации ВИЧ-1 при ВИЧ-инфекции

Макарова, Маргарита Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль различных типов антиген-презентирующих клеток в регуляции апоптоза лимфоцитов и репликации ВИЧ-1 при ВИЧ-инфекции
ВАК РФ 03.03.03, Иммунология

Автореферат диссертации по теме "Роль различных типов антиген-презентирующих клеток в регуляции апоптоза лимфоцитов и репликации ВИЧ-1 при ВИЧ-инфекции"

Макарова Маргарита Владимировна

РОЛЬ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ АНТИГЕН-ПРЕЗЕНТИРУЮЩИХ КЛЕТОК В РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ И РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ-1 ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

03.03.03 - иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 7 [.¡АР 2011

Москва-2011

4840420

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант: доктор медицинских наук

Мустафин Ильшат Ганиевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ярилин Александр Александрович

доктор медицинских наук, профессор Воробьева Мая Сергеевна

доктор медицинских наук, профессор Винницкий Леонид Ильич

Ведущая организация: НИИ вакцин и сывороток

им. И.И. Мечникова

Защита диссертации состоится « 23 » марта 2011 г. в 14-00 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан « 20^года

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

Сеславина Лия Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Ведущим звеном патогенеза ВИЧ-инфекции является развитие вторичного иммунодефицита вследствие развития дисфункции и уменьшения количества СБ4+-лимфоцитов (Fauci A.S., 1988; Levy J.A., 1993; Mellors J., 1996; Badley A.D., 2006). Кроме того, CD4+-лимфоциты не являются единственной мишенью для ВИЧ-1. Вирус способен проникать в макрофаги, гистиоциты, дендритные клетки, составляющие периферическое микроокружение Т-лимфоцитов.

Ведущим фактором, обуславливающим снижение абсолютного числа С04+-лимфоцитов, безусловно, является их гибель по механизму апоптоза (Gougeon M.-L., 1993; Badley A.D., 2000). Многочисленные механизмы, вносящие свой вклад в ВИЧ-ассоциированный апоптоз лимфоцитов, включают хроническую иммунологическую активацию; gp 120/160-связывание CD4-рецептора; усиленную продукцию моноцитами, макрофагами, B-клетками и CDB+T-клетками ВИЧ-инфицированных пациентов цитотоксических лигандов или вирусных белков, инициирующих гибель неинфицированных CD4+ Т-клеток. Нарушения в регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции на сегодняшний день не вызывают сомнения. Однако механизмы апоптоза инфицированных и неинфицированных ВИЧ-1 С04+-лимфоцитов остаются до сих пор дискуссионными (Antoni В., 1995; Noraz N., 1997; Herbein G., 1998; Gandhi R., 1998; Rapaport E., 1998).

Установлено, что пусковыми механизмами активации СБ4+-лимфоцитов (Лф), являющихся основными мишенями для ВИЧ-1, являются их взаимодействия с профессиональными антиген-презентирующими клетками (АПК), локализующимися, в основном, в лимфоидной ткани. Данный факт,

Г?

являющийся убедительно доказанным и неоспоримым, тем не менее, не объясняет механизмов репликации ВИЧ-1 и выраженности виремии на стадиях прогрессирования заболевания и развития СПИДа, сопровождающихся, как известно, деструктивными изменениями герминативных центров лимфоидных органов.

В связи с этим, было высказано предположение о возможности активации Лф и индукции репликации ВИЧ-1 за пределами лимфоидной ткани, а именно, непосредственно в кровеносном русле. Эндотелиальные клетки (ЭК) сосудов, известные как полупрофессиональные АПК (Rose M.L., 1998, Pober J. S., 1999) способны вызывать активацию Лф (Ma W., 1998, Mestas J., 1999) и могут индуцировать репликацию ВИЧ-1.

ВИЧ-1 обладает важным для своего выживания свойством -способностью менять фенотип и функции эндотелиальных клеток (ЭК). Несмотря на отсутствие экспрессии CD4 на поверхности ЭК, существует возможность инфицирования ЭК различными штаммами ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (Lafon М., 1993; Scheglovitova О., 1993) через конститутивно экспрессирующиеся хемокиновые рецепторы CXCR4 (Gupta S., 1998; Molino М., 2000). ЭК можно отнести к абортивно-инфицируемым клеткам, являющимися транзиторными резервуарами ВИЧ-1 и способными инфицировать С04+-клетки (Scheglovitova О., 1993, Dianzani F., 1996). Кроме того, абортивно инфицированные ЭК способны продуцировать высокий уровень цитокинов (Corbeil, J., 1995), повышая активацию Т-клеток и вирусную репликацию (Borghi М, 2000).

Вирусные белки, продуцируемые инфицированными клетками, влияют на функциональную активность ЭК. Так, Tat-белок ВИЧ-1 использует интегриновые рецепторы для инфицирования ЭК (Barillari G., 1993). Кроме того, Tat повышает экспрессию промоторов многих цитокиновых генов (ИЛ-6, ИЛ-8), воздействуя на активность фактора транскрипции NF-кВ (Cota-Gomez А., 2002). Инкубация человеческих ЭК с Tat индуцирует экспрессию на

клеточной поверхности молекул адгезии ICAM-1, VCAM-1 и E-selectin (Dhawan S., 1997; Mrowiec T., 1997). При этом gpl20 ВИЧ-1 избирательно снижает экспрессию ICAM-1, но не другие молекулы адгезии на поверхности ЭК (Ren Z., 2002).

Исследования, проведенные Yarwood H. с соавт. (2000), показали, что ЭК активируют Т-лимфоциты и их субпопуляции. Кроме того, существует и обратная сторона этих межклеточных взаимодействий. Показано, что продуцируемые Т-клетками факторы способны активировать ЭК, что, в свою очередь, повышает вероятность их участия в последующей регуляции репликации ВИЧ-1. Например, цитокин-зависимое повышение экспрессии молекул адгезии (ICAM-1, VCAM-1) на мембранах ЭК вызывает активацию Т-клеток (Dianzani F., 1996, Abbate L., 1999; Murakami S., 2001), что является предпосылкой для инициирования вирусной репликации в Т-лимфоцитах, культивируемых с ЭК. Кроме того, такие цитокины, как ИФН-у, ФНО-а, и хемокины (RANTES) также способны стимулировать трансмиссию ВИЧ-1 от абортивно-инфицированных ЭК Т-клеткам путем повышения экспрессии молекул адгезии ICAM-1 (Dianzani F., 1996, Abbate L., 1999).

Учитывая низкий уровень виремии на протяжении длительного периода времени (даже в отсутствии проводимой антиретровирусной терапии) у группы пациентов, инфицированных ВИЧ-1, имеющим делецию гена nef (Huang Y., 1995, Kestler H. W., 1991, Kirchhoff F, 1995, Learmont J. C., 1999), представляло интерес изучение роли данного белка ВИЧ-1 в механизмах вирусной репликации, индуцированнной ЭК.

Базируясь на традиционных представлениях о том, что одним их характерных признаков патогенеза ВИЧ-инфекции является тенденция к прогрессированию заболевания, характеризующаяся нарастанием виремии и неуклонным снижением абсолютного числа СШ+Т-лимфоцитов (Wei X., 1995; O'Brien W.A., 1996; Mellors J., 1997), представляет интерес изучение взаимосвязи вышеуказанных процессов. Данные литературы, иллюстрирующие

зависимость между вирусной нагрузкой и апоптозом иммунокомпетентных клеток, противоречивы. В частности, ряд исследователей не обнаружил связи между этими процессами (Meyaard L., 1992; Muro-Cacho С., 1995).

В связи с этим, представляет интерес исследование способности АПК регулировать апоптоз лимфоцитов при ВИЧ-инфекции и оказывать влияние на репликации ВИЧ-1.

Известно, что применение современных антиретровирусных препаратов способно подавлять репликацию ВИЧ-1 и также влиять на процессы апоптоза Лф в лимфоидной ткани и периферическом русле. Тем не менее, воздействие препаратов на резервуары ВИЧ-1 и индукцию апоптоза латентно инфицированных клеток существенно ограничено и неэффективно. Следовательно, понимание механизмов регуляции апоптоза может явиться предпосылкой для создания новых и перспективных методов терапии ВИЧ-инфекции и синдрома приобретенного иммунодефицита.

Исходя из этого, предпринято настоящее исследование, в котором были поставлены следующие цель и задачи.

Цель работы: Изучить способность профессиональных и полупрофессиональных антиген-презентирующих клеток регулировать апоптоз лимфоцитов при ВИЧ-инфекции и оказывать влияние на репликацию ВИЧ-1 Задачи исследования:

1) Оптимизация способов выделения и культивирования различных типов антиген-презентирующих клеток (дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты, эндотелиальные клетки).

2) Сравнительный анализ способности профессиональных (дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты) и полупрофессиональных (эндотелиальные клетки) антиген-презентирующих клеток активировать различные популяции Т-лимфоцитов и индуцировать репликацию ВИЧ-1

3) Оценка способности различных типов антиген-презентирующих клеток модулировать процессы ano птоза лимфоцитов при их инфицировании ВИЧ-1 in vitro

4) Оценка способности антиген-презентирующих клеток регулировать процессы апоптоза инфицированных и неинфицированных лимфоцитов

5) Изучить взаимосвязь между процессами репликации ВИЧ-1, апоптоза и активационного статуса лимфоцитов, культивированных с различными типами антиген-презентирующих клеток.

6) Изучить роль белка ВИЧ-1 Nef в механизмах репликации ВИЧ-1, индуцированной различными типами антиген-презентирующих клеток

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые установлено, что лиганд-рецепторные взаимодействия являются ведущим фактором межклеточных взаимодействий между профессиональными, полупрофессиональными антиген-презентирующими клетками и CD4-лимфоцитами, инициирующим репликацию ВИЧ-1. Впервые показано, что только эндотелиальные клетки, но не дендритные и макрофаги, обладают способностью инициировать репликацию ВИЧ-1 в С04+-лимфоцитах при минимальном изменении их активационного статуса. Впервые установлено, что эндотелиальные клетки индуцируют устойчивость к апоптозу продуктивно инфицированных лимфоцитов, в то время как профессиональные антиген-презентирующие клетки (дендритные клетки и макрофаги) не обладают данной способностью. Развитие устойчивости продуктивно инфицированных лимфоцитов к апоптозу обусловленно их лиганд-рецепторными межклеточными взаимодействиями с эндотелиальными клетками. Впервые показано, что способность эндотелиальных клеток инициировать репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах связана с экспрессией в инфицированных клетках вирусного белка Nef в то время как дендритные клетки и макрофаги инициируют репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах Nef-независимым путем.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Совершенствование диагностики ВИЧ-инфекции, проведение адекватной терапии невозможно без глубоких знаний о патогенезе и механизмах формирования иммунодефицитного состояния при данном заболевании. Полученные данные о свойствах антиген-презентирующих клетках модулировать процессы вирусной репликации и апоптоза различных популяций С04+-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции открывают путь к созданию новых эффективных подходов в терапии данного заболевания. Модель оценки спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов может быть использована как в комплексном исследовании процессов ПКГ и функциональной активности клеток, участвующих в патогенезе вирусных заболеваний с нарушениями апоптоза, так и для направленного поиска средств фармакологического контроля.

Результаты проведенного исследования могут быть использованы иммунологами, патофизиологами, инфекционистами в научной, практической и учебной работе.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Эндотелиальные клетки обладают способностью усиливать репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах и обеспечивают их устойчивость к программированной клеточной гибели. Выявленный феномен является результатом межклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий и не связан с секрецией растворимых факторов (цитокинов).

2. Репликация ВИЧ-1 в лимфоцитах, взаимодействующих с эндотелиальными клетками, сопровождается их минимальной активацией и происходит в непролиферирующих клетках.

3. Способность эндотелиальных клеток инициировать репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах и их устойчивость к апоптозу обусловлена вирусным

белком Nef. Репликация ВИЧ-1 в лимфоцитах, взаимодействующих с

дендритными клетки и макрофагами, является Nef-независимой.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения и результаты работы доложены на заседании комиссии общества молекулярных биологов, вирусологов и эпидемиологов (Йельский Университет, США; 2003, 2004); 11 международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 2003); 12 международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 2004); 1,3-ей научно-практической конференции с международным участием "Проточная цитофлуорометрия и ее использование в практической медицине" (Санкт-Петербург, 2001,2004); Всероссийском семинаре "Проблемы определения субпопуляций лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц методом проточной цитометрии" (Смоленск, 2004); Российской науч-практ. конф-ция, посвящ-я 110-летию кафедры инф-х.болезней BMA им.С.М.Кирова (С-Петербург, 2006); XVI International AIDS Conference (Toronto, 2006), VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском Национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006), IX Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006г.), V Симпозиуме с международным участием "Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и аллергических заболеваний" (Москва, 2006), VIII Международном конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2007г.), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008г.), Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008), X международном конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Казань, 2009г.), VII съезде

аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунолгии -междисциплинарные проблемы» (С-Петербург, 2010).

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работах, в том числе: 9 статей в научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций; 21 публикация в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Методы культивирования и исследования апоптоза лимфоцитов, предложенные в диссертации, внедрены в практическую работу лаборатории иммунологии РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ Республики Татарстан. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры патофизиологии и кафедры клинической иммунологии и аллергологии Казанского государственного медицинского университета.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков, 7 таблиц. Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы».

Библиография включает 341 источник, в том числе 17 отечественных и 324 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования. Объектом исследования явились мононуклеары периферической крови доноров, эндотелиальные клетки пуповинной вены, дендритные клетки, В-лимфоциты, макрофаги.

Для проведения исследований выделяли мононуклеары периферической крови 80 здоровых доноров в возрасте от 17 до 35 лет обеих полов. У доноров проводилось общеклиническое и лабораторное обследование, включавшее в себя общий анализ крови с лейкоформулой, общий анализ мочи, ФПП, серологические и вирусологические анализы. Методы исследования.

Методы выделения и культивирования клеток.

Мононуклеары периферической крови (МНПК) получали из периферической крови серонегативных доноров центрифугированием с использованием градиента плотности Ficoll-Hypaque (Pharmacia).

Моноциты и С04+-Лф выделяли из МНПК методом отрицательной иммуномагнитной селекции (Dynal). Активированные СБ4+-Лф удаляли из клеточной суспензии методом позитивной иммуномагнитной селекции (Dynal) с использованием моноклональных антител (мАТ) к активационным маркерам CD25, 69 и HLA-DR (Pharmingen). Чистоту выделенных популяций (неактивированные С04+-Лф и моноциты) оценивали методом проточной цитометрии (FACSCalibur, BD) с использованием мАТ к CD4, CD14, CD25, CD69 и HLA-DR (Pharmingen). Т-клетки памяти (CD45RO+) и наивные Т-клетки (CD45RA+) выделяли методом позитивной иммуномагнитной селекции с использованием соответствующих мАТ.

Для получения макрофагов (Мф) из моноцитов периферической крови последние культивировали в 24-луночных плоскодонных пластиковых планшетах (Falcon) течение 5 дней в присутствии ГМ-КСФ (80 нг/мл) (Leucomax, Shering-Plaugh) с последующим определением эстеразной активности. Для дифференцировки ДК из моноцитов последние инкубировали в течение 6 дней в присутствии ГМ-КСФ (40 нг/мл) (Leucomax, Shering-Plaugh) и ИЛ-4 (10 нг/млХЯ&Б Systems). Для получения зрелых ДК в среду RPMI 1640 вносили TNF-a (20 Hr/MJi)(Sigma) и ПГ Е3 (250 нг/мл)(1С>0 за 1 день до их культивирования с неактивированными С04+-Лф. Чистоту полученных популяций ДК и их дифференцировку оценивали методом проточной цитометрии с использованием мАТ к CD80, 83, 86 и HLA-DR (Pharmingen).

Эндотелиальные клетки (ЭК) выделяли из вены пуповины с использованием коллагеназы IV типа (Sigma) и культивировали в покрытых желатином пластиковых планшетах (Falcon) в среде 199 (Sigma) с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen), 2,5 mM L-глутамина (Invitrogen), гепарина (Sigma) и фактора роста эндотелиальных клеток (BD).

Для индукции экспрессии молекул МНС II класса, ЭК инкубировали в течение 3-4 дней с IFN-y (1000 ME/мл) (BioSource).

Культивирование неактивированных С04+-Лф (lxlO5) с различными типами АПК (1х10б) осуществляли в 24-луночных плоскодонных пластиковых планшетах (Falcon) в 1,5 мл среды RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и антибиотиков (все реагенты - Invitrogen) в течение 15 дней при 37°С и 5% С02.

Инфицирование ВИЧ-1 in vitro. В качестве источника ВИЧ-1 использовали лабораторный штамм вируса NL4-3 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA). Плазмидную ДНК последовательно обрабатывали эндонуклеазой EcoRl и лигазой Т4 (New England Biolabs) и клонировали с использованием клеточной линии UltraCompetent -XlO-Gold (Stratagene), с последующим выделением плазмидной ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Трансфекцию генома ВИЧ-1 в клеточную линию СЕМх174 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA) проводили с использованием DEAE-декстрана (Sigma). Полученный штамм ВИЧ-1 использовали для инфицирования Лф периферической крови доноров, серонегативных по ВИЧ-1. Для этого Лф, выделенные центрифугированием на градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Pharmacia), инкубировали в течение 3 дней в среде RPMI 1640 с добавлением ФГА (Gibco) (4мкг/мл) и IL-2 (Sigma) (10 ME/мл) с последующим внесением ВИЧ-1 (p248ag - 100 нг/мл), полученного в результате трансфекции вирусного генома в СЕМх174. Супернатанты аликвотировали, титр вируса определяли методом ИФА (p24gag, Bio-Rad). Инфицирование С04+-Лф, культивированных с различными типами АПК осуществляли путем внесения эквивалентных доз ВИЧ-1, продуцентами которого были ФГА-активированные Лф. Через 12 часов осуществляли полную замену среды RPMI 1640 для удаления не связавшегося ВИЧ-1. Клетки культивировали в течение 15 дней при 37°С и 5% С02. Замену половины среды RPMI 1640 осуществляли каждые 3 дня.

Уровень репликации ВИЧ-1 оценивали путем определения p248as антигена ВИЧ-1 в супернатантах клеточных культур методом ИФА (Bio-Rad). Количество Лф, являющихся продуцентами ВИЧ-1, определяли методом проточной цитометрии с использованием p24gas мАТ (Coulter).

Оценку уровня активации клеток-продуцентов ВИЧ-1 осуществляли по экспрессии активационных маркеров CD25, CD69, CD71 и HLA-DR с помощью соответствующих мАТ (PharMingen). Пролиферативный ответ Лф оценивали методом проточной цитометрии по снижению интенсивности флуоресценции CFSE (Molecular Probes).

Культивирование ЭК с СТ)4+-Лф. Для индукции экспрессии молекул МНС II класса, ЭК инкубировали в течение 3-4 дней с IFN-y (lOOOU/ml) (BioSource) в 24-луночных плоскодонных пластиковых планшетах (Linbro). В лунки, содержащие ЭК (lxlO5), вносили Лф (lxlO6) в 1 мл среды RPMI 1640 с

добавлением 10% ФБС, L-глутамина и антибиотиков (GIBCO BRL). В это же время осуществляли инфицирование культуры ЭК/Лф. Через 12 часов осуществляли полную замену среды RPMI 1640 с целью удаления не связавшегося ВИЧ-1. Клетки культивировали в течение 15 дней при 37°С и 5% С02. Замену половины среды RPMI 1640 осуществляли каждые 3 дня. Определение уровня секреции цитокинов (IL-2 и IFN-y), а также уровня репликации вируса ВИЧ-1 осуществляли методом имммуноферментного анализа с использованием соответствующих тест-систем (R&D Systems и Coulter, соответственно). Количество ВИЧ-инфицированных клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием p24gag мАТ (Coulter).

В ряде случаев культивирование Лф с ЭК осуществляли в присутствии анти-С02 мАТ (TS2/18)(American Type Culture Collection (АТСС), USA), анти-CD58 мАТ (AICD58, Immiunotech), анти-ICAM-l мАТ (МСА532, Serotec), анти-HLA-DR (L243) (АТСС) или изотипических (IgGl) не связывающихся мАТ (НВ64 или К16/16)(АТСС). В отдельных экспериментах осуществляли культивирование Лф, разделенных от ЭК посредством полупроницаемой мембраны (0.2цт) (Nunc Life Technologies).

Определение уровня ИЛ-2 и ИФН-у в супернатантах клеточных культур проводили методом ИФА (BioScore).

Исследование апоптоза лимфоцитов

Исследование апоптоза Лф проводили методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACSCalibur ("Becton Dickinson"), включая определение фрагментации ДНК по выявлению гиподиплоидного пика при окраске PI, выявление экспрессии фосфатидилсерина на поверхности Лф флуоресцентной меткой мероцианин 540 (МС540) и аннексином V, измерение митохондриального потенциала клеток по интенсивности флуоресценции CMX-Ros и DiOC6:

1. Фрагментацию ДНК определяли по наличие гиподиплоидного пика, характерного для апоптоза, оцениваемого с помощью флуорохрома пропидия йодида (PI) ("Sigma") (Nicoletti I., 1991).

2. Изменение клеточной мембраны определяли окрашиванием Лф с помощью флуорохрома мероцианина 540 (МС540) и аннексина V, меченого FITC (AnnV-FITC), специфически связывающихся с молекулами фосфатидилсерина (ФС).

3. Динамику изменения величины трансмембранного митохондриального потенциала (ДЧ'т) Лф, проводили с использованием флюорохромов DiOC6 (Chen L.B. 1988) и CMXRos (Kroemer G., 1996).

Плазмиды и клеточные линии.

В качестве источника ВИЧ-1 использовали штамм NL4-3 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA), геном которого был представлен в виде 2 плазмид (р83-2 и р83-10), содержащих соответственно 5'- и 3'-последовательности генома ВИЧ-1. Плазмида р83-10, содержавшая делецию по гену nef, была любезно предоставлена д-ром J1. Александером (Yale University,

USA). Плазмидную ДНК последовательно обрабатывали эндонуклеазой EcoRl и лигазой Т4 (New England Biolabs) и клонировали с использованием клеточной линии Ultracompetent-XlO-Gold (Stratagene). Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Трансфекцию рекомбинантных плазмид в клеточную линию СЕМх174 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA) осуществляли с использованием DEAE-декстрана (Sigma). Клетки СЕМх174 культивировали в среде RPMI 1640 (GIBCO BRL) общепринятым способом, супернатанты аликвотировали и хранили при -70°С. Титр ВИЧ-1 в супернатантах определяли методом ИФА (EIA p24gag Coulter). Полученный штамм ВИЧ-1 использовали для инфицирования Лф периферической крови доноров. Лф инкубировали в течение 3 дней в полной среде RPMI 1640 с добавлением ФГА (GIBCO BRL) (4|ig/ml) и IL-2 (Sigma) (lOU/мл) с последующим внесением ВИЧ-1 (p24gag -100 ng/мл), полученного в результате трансфекции вирусного генома в СЕМх174, Титр вируса определяли методом ИФА (EIA p24gag, Coulter). Количество ВИЧ-инфицировнных клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием мАТ к p24gag белку ВИЧ-1 (Coulter). Определение инфекционной активности ВИЧ-1 проводили с использованием клеточных линий HeLa/CD4-ß-gal и MAGI-CCR-5 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA).

Статистический анализ полученных результатов проводили на персональном компьютере с применением пакетов прикладных программ "Excell " и "Statgraphics". Достоверность различий полученных результатов оценивали по критерию Стьюдента. Корреляционный анализ полученных результатов проводили с применением методов Пирсона (параметрический) или Спирмена (непараметрический).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Роль эндотелиальных клеток в репликации ВИЧ-1

Для оценки взаимосвязи процессов активации клеток-мишеней и последующей в них вирусной репликации из периферической крови методом отрицательной иммуномагнитной селекции выделяли неактивированные CD4+-лимфоциты (С04+-Лф) и инфицировали их in vitro лабораторным штаммом ВИЧ-1 NL4-3. При инфицировании С04+-Лф, не экспрессирующих активационные маркеры (CD25, 69, HLA-DR), репликация ВИЧ-1 не наблюдалась. В то же время, внесение в культуру ФГА-активированных Лф

аналогичных инфекционных доз ВИЧ-1 приводило к его репликации, пик которой регистрировался на 4-5 сутки культивирования клеток (рис.1).

500 450 -400 ■ 350 -300 -250 -200 -150 ■ 100 -50 -0 -

1 2 3 4 5 6

Рис.1 Репликация ВИЧ-1, оцениваемая по содержанию корового белка ВИЧ-1 (p24gas) в супернатантах неактивированных (курсив) и ФГА-активированных (сплошная линия) CD4+-JI(j>. По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - содержание антигена p24g"g в нг/мл

Дня изучения возможности эндотелиальных клеток (ЭК) инициировать репликацию ВИЧ-1 в С04+-Лф, проводили предварительное культивирование ЭК с ИФН-у. Данная процедура было необходима для активации ЭК и повышению уровня экспрессии молекул, способных вовлекаться в межклеточные взаимодействия с СБ4+-Лф. Например, было выявлено, что культивирование ЭК в течение 3-4 дней с ИФН-у (1000 МЕ/мл) приводило к существенному увеличению экспрессии на их поверхности молекул гистосовместимости II класса (МНС II) и подавляющее число (более 98%) ЭК экспрессировало данную молекулу на своей поверхности (рис.2).

Рис.2. Уровень экспрессии молекул МНС II класса на поверхности ЭК, до (гистограмма 1) и после их инкубации с ИНФ-у (гистограмма 2). По оси абсцисс - интенсивности флуоресценции мАТ к МНС II класса, меченых фикоэритрином (РЕ), по оси ординат -количество клеток.

Внесение ВИЧ-1 в культуру неактивированных CD4+-JI<j>, культивированных с ЭК, приводило к вирусной репликации, пик которой регистрировался на 9-12 сутки культивирования. Выраженная репликация ВИЧ-1 (p24gag - 120-150 ng/ml) наблюдалась только в случае культивирования СБ4+-Лф с ЭК, преактивированных с помощью IFN-y. В то же время, уровень репликации ВИЧ-1 в СБ4+-Лф, культивированных с неактивированными ЭК составил лишь 5-15 ng/ml на аналогичных сроках их совместной инкубации (рис.3). ЭК в данной экспериментальной модели не являлись источником репликации ВИЧ-1, так как уровень p24gag ВИЧ-1 в супернатантах инфицированных вирусом ЭК, культивированных в отсутствии СШ+-Лф, был ниже порога чувствительности используемых тест-систем.

Рис.3 Репликация ВИЧ-1 в СБ4+-Лф, оцениваемая по содержанию корового белка ВИЧ-1 (р248а8) в супернатантах культур. С04+-Лф, культивированных в присутствии неактивированных (курсив) и преактивированных (сплошная линия) ЭК. По оси абсцисс -продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество р24 антигена внг/мл

Аналогичная закономерность была выявлена при оценке внутриклеточного содержания р24т антигена. Количество клеток-продуцентов ВИЧ-1, именуемых в дальнейшем как продуктивно инфицированных клеток, было большим среди в СБ4+-Лф, культивированных с преактивированными ЭК по сравнению с неактивированными (рис.4 А и Б, соответственно). В то же время, как ЭК, так и неактивированные СВ4+-Лф, культивированные по отдельности, не являлись продуцентами ВИЧ-1 (рис. 4В и Г, соответственно).

В Г

Рис.4. Уровень экспрессии p24gag антигена ВИЧ-1, определяемого внутриклеточно в С04+-Лф, культивированных с преактивированными (а), неактивированными (б) ЭК, а также С1)4+-Лф (в) и ЭК(г), культивированных по отдельности. По оси абсцисс - интенсивности флуоресценции мАТкр24гаг, меченых Р1ТС, по оси ординат - количество клеток

Следующим этапом исследований явилась идентификация популяции Лф, являющейся источником вирусной репликации в культуре СБ4+-Лф/ЭК. С этой целью были проведены эксперименты по культивированию ЭК с "наивными" СБ4+-Лф или С04+-Лф, представляющими собой пул клеток-памяти. Разделение данных клеточных популяций проводили с использованием мАТ к С045ЯА и С045Я0, соответственно. Чистота выделенных популяций Лф составила 98% и 89% соответственно.

Внесение лабораторного штамма ВИЧ-1 N1.4-3 в культуру "наивных" Лф, культивированных с ЭК, индуцировало репликацию ВИЧ-1, уровень которой был с 100-150 раз меньшим по сравнению с культурами клеток, содержащих эквивалентные количества СБ4+-Лф, являвшимися клетками - памяти (рис.5). Эффект был дозо-зависимым. Культивирование ЭК без СБ4+-Лф, а также "наивных" СВ4+-Лф или клеток-памяти без ЭК не приводило к вирусной репликации (контроль).

Рис.5. Репликация ВИЧ-1 в CD4+CD45RA+-JI<j> (курсив) и CD4+CD45RO+-JI<]> (сплошная линия), культивированных в присутствии ИФН-у -активированных ЭК. По оси абсцисс -продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество p24gag антигена, в нг/мл

Базируясь на традиционной точке зрения о существовании неразрывной связи между процессами вирусной репликации и активацией продуктивно инфицированных клеток, следующим этапом работы явилась оценка уровня активации CD4+-Jb}>, культивированных с ЭК. Критериями активации клеток-продуцентов ВИЧ-1 являлись синтез и секреция цитокинов, определяемых в супернатантах клеточных культур, а также экспрессия ранних (CD69), промежуточных (CD25, VLA-1) и поздних (HLA-DR) активационных маркеров, определяемых одновременно с внутриклеточным содержанием p24gag антигена ВИЧ-1. Было выявлено существенное увеличение уровня ИЛ-2 и ИФН-у в супернатантах клеточных культур С04+-Лф, культивированных с ЭК. Пик синтеза и секреции данных цитокинов регистрировался на 1 и 3 сутки культивирования (для ИФН-у и ИЛ-2, соответственно) и имел тенденцию к дальнейшую снижению. На 6 сутки культивирования уровень содержания цитокинов в супернатантах всех клеточных культур был ниже порога чувствительности использованных тест-систем. Внесение лабораторного штамма ВИЧ-1 NL4-3 в культуру С04+-Лф, культивированных с ЭК, не изменяло динамику и уровень секреции вышеназванных цитокинов. Культивирование как инфицированных, так и неинфицированных С04+-Лф в отсутствие ЭК, не приводило к спонтанной активации клеток и секреции ИЛ-2

и ИФН-у. Культивирование неинфицированных ЭК в отсутствие СБ4+-Лф также не сопровождалось синтезом вышеназванных цитокинов. В то же время, внесение ВИЧ-1 в культуру ЭК приводило к появлению ИФН-у в супернатантах клеточных культур. Тем не менее, содержание данного цитокина было существенно ниже по сравнению со значениями в супернатантах С04+-Лф, культивированных в присутствии ЭК (таблицы 1 и 2).

Уровень секреции ИЛ-2_Таблица 1

Тип культивируемых клеток Уровень продукции ИЛ-2 (пг/мл)

24 ч 48ч 72ч 96 ч 12 дн

ЭК н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

СР4+Лф н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

ЭК/СБ4+Лф 9.3±2.6 20.6±1.9 27.0±2.9 н.о. н.о.

ЭК + N1.4-3 н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

СБ4+Лф+ N1.4-3 2.1±0.2 н.о. н.о. н.о. н.о.

ЭК/СБ4+Лф+ N1.4-3 7.9±1.4 19.1±2.2 30.3±3.3 н.о. н.о.

Примечание: н.о. - неопределяемыйуровень цитокина

Уровень секреции ИФН-у_Таблица 2

Тип культивируемых клеток Уровень продукции ИФН-у (пг/мл)

24 ч 48ч 72ч 96 ч 12 дн

ЭК н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

СБ4+Лф н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

ЭК/СБ4+Лф 19,9±3.2 41,4±7.8 н.о. н.о. н.о.

ЭК + N14-3 4.4±1.3 6.2±1.6 н.о. н.о. н.о.

СБ4+Лф + МЛ-З 1.2±0.3 0 н.о. н.о. н.о.

ЭК/СБ4+Лф + N14-3 21,7±2.4 44,7±6.2 н.о. н.о. н.о.

Примечание: н.о. -неопределяемыйуровень цитокина

Таким образом, культивирование неактивированных СБ4+-Лф в присутствии ЭК индуциирует их активацию, о чем свидетельствует повышение уровня секреции цитокинов, в первую очередь, ИЛ-2. Это, в свою очередь, может являться фактором, способствующим вирусной репликации в СБ4+-Лф.

Прямым доказательством существования связи между процессами вирусной репликации и активации продуктивно инфицированных клеток являлось одновременное исследование данных параметров на уровне одной клетки. Было обнаружено, что продуктивно инфицированные СБ4+-Лф, культивируемые в присутствии ЭК, не экспрессируют промежуточных и

поздних маркеров активации и лишь незначительная часть клеток-продуцентов ВИЧ-1 экспрессирует ранний активационный маркер - молекулу CD69 (верхние правые квадраты режима dot-plot на рис.6). В то же время, экспрессия активационных маркеров была зарегистрирована исключительно на С04+-Лф, не являвшихся продуцентами ВИЧ-1 (верхние левые квадраты режима dot-plot на рис.6).

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что ЭК обладают инициировать репликацию ВИЧ-1 в СБ4+-Лф. С04+-Лф, являющиеся продуцентами ВИЧ-1, представлены пулом неактивированных и/или минимально активированных клеток, не экспрессирующих «традиционные активационные» маркеры. Следовательно, вирусная репликация в СВ4+-Лф, культивированных в присутствии ЭК, происходит по иным, принципиально отличающимся от традиционных, механизмам.

О ¿¡2

р24

Рис.6 Экспрессия активационных маркеров на пов!рхности продуктивно инфицированных (р248а® -позитивных) и неинфицированных ( р248а® -негативных) Лф, культивированных с ЭК. По оси абсцисс - интенсивности флуоресценции мАТкp24gag, меченых Р1ТС, по оси ординат - интенсивность флюоресценции мАТк маркерам активации

Действительно, результаты проведенных исследований показали, что

уровень экспрессии активационных маркеров на продуктивно инфицированных

клетках существенно выше, а пул клеток-продуцентов ВИЧ-1 в культуре ФГА-

активированных Лф представлен преимущественно активированной популяцией клеток (рис.7).

6.09.014

CD23FITC

Рис.7. Экспрессия CD25 на поверхности продуктивно инфицированных (р24т -позитивных) и неинфицированных (p24gag -негативных) Лф, в культуре ФГА-активированных Лф. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции мАТ к CD25, конъюгированных с FITC, по оси ординат - интенсивность флюоресценции мАТ к p24gag конъюгированных с РЕ

Специфичность фенотипа продуктивно инфицированных Лф, культивированных с ЭК, подтвердилась при изучении уровня пролиферации продуктивно инфицированных и неинфицированных СБ4+-Лф.

Культивирование ЭК с СБ4+-Лф вызывает пролиферацию лимфоцитов, что проявляется в снижении интенсивности флюоресценции CFSE (рис. 8А). Инфицирование ВИЧ-1 СБ4+-Лф, культивируемых в присутствии ЭК, приводит к образованию пула продуктивно инфицируемых клеток, определяемых по наличию в них p24gas антигена ВИЧ-1. Количество Лф, являющихся продуцентами ВИЧ-1, было существенно выше в культуре СВ4+-Лф, культивированных в присутствии ИФН-у-преактивированных ЭК, по сравнению с неактивированными ЭК (рис.8 Б и В, соответственно). Клетки-продуценты ВИЧ-1 не являются пролиферирующими, что подтверждает высокий уровень флуоресценции CFSE у клеток, окрашивающихся по p24gas.

Рис.8. Уровень пролиферации в СБ4+-Лф, культивированных с ЭК. А - без внесения в культуру ВИЧ-1 (контроль), Б и В - внесение в культуру ВИЧ-1; Б- неактивированные ИФН-у ЭК; В- ИФН-у-активированные ЭК. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции СРБЕ, по оси ординат - интенсивность флюоресценции мАТ к p24gag конъюгированных с РЕ

Таким образом, ЭК способны индуцировать репликацию ВИЧ-1 в СБ4+-Лф периферической крови, что сопровождается минимальными изменениями их фенотипа. Пул продуктивно инфицированных СБ4+-Лф представлен непролиферирующими и неактивированными (или минимально активированными клетками).

В то же время, оценка взаимосвязи между уровнем пролиферации и репликации ВИЧ-1 в культуре ФГА-активированных Лф выявила обратную зависимость. Подавляющее число клеток продуцентов ВИЧ-1 было представлено пролиферирующим пулом клеток. Об этом свидетельствовал низкий уровень флюоресценции СББЕ (зона М1 в гистограмме В), определяемый в клетках с высоким содержанием p24gag антигена ВИЧ-1 (рис.9). Клеток с указанным выше фенотипом было подавляющее большинство (92% на рис.9В). В то же время Лф, клетки, не являвшиеся продуцентами ВИЧ-1 в культуре ФГА-активированных Лф (рис.9Б), были гетерогенной популяцией клеток. Наряду с пролиферирующей популяцией Лф (зона М1 в гистограмме Б), большая часть клеток была представлена непролиферирующей популяцией Лф.

Б В

Рис.9. Уровень пролиферации в инфицированных (М1 на гистограмме А) и неинфицированных Лф, преактивированных ФГА. По оси абсцисс - интенсивность флюоресценции мАТ к р24г"г конъюгированных с РЕ (гистограмме А); интенсивность флуоресценции СРБЕ ( гистограммы Б и В)

Следующим этапом исследований явилось изучение механизмов ЭК-индуцированной репликации ВИЧ-1 в С04+-Лф. Очевидно, что репликация ВИЧ-1 в СБ4+-Лф являлась следствием межклеточных взаимоотношений между инфицированными СС4+-Лф с ЭК, а также неинфицированными СБ4+-Лф, активированными со стороны ЭК, так как инфицирование неактивированных СВ4+-Лф, культивированных в отсутствие ЭК, не приводило к репликации ВИЧ-1. Межклеточные взаимодействия, способные инициировать репликацию ВИЧ-1 в инфицированных СБ4+-Лф, могли быть обусловлены как секрецией ЭК растворимых факторов (в первую очередь, цитокинов), так и лиганд-рецепторными взаимоотношениями между вышеназванными типами клеток.

Для выяснения роли растворимых факторов, способных индуцировать репликацию ВИЧ-1 в данной экспериментальной модели были проведены

эксперименты с раздельным культивированием ЭК и СБ4+-Лф. Было выявлено, что инфицирование вирусом СБ4+-Лф, разделенных от ЭК полупроницаемой мембраной, существенным образом снижало репликацию ВИЧ-1 (рис.10).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что роль растворимых факторов, способных инициировать репликацию ВИЧ-1 в СБ4+-Лф, культивируемых с ЭК, минимальна.

Рис.10. Репликация ВИЧ-1 в СБ4+-Лф, культивируемых с ЭК. (сплошная линия - совместное культивирование; прерывистая - культивирование клеток, разделенных полупроницаемой мембраной). По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество p24gag антигена в супернатантах (нг/мл)

При исследовании роли лиганд-рецепторных взаимоотношений между ЭК и СБ4+-Лф в репликации ВИЧ-1 были использованы "блокирующие" мАТ к молекулам СБ2, ЬРА1, ОБ-БЮК и МНС II класса. Для достижения оптимальной концентрации мАТ, последние вносили в культуру клеток каждые 3 дня во время замены половины среды для культивирования. Было выявлено, что внесение в культуру ЭК/СБ4+-Лф мАТ, блокирующих СБ58/ЬРА-3, С02П.¥к-2 и 1САМ-1/ЬРА-1 взаимодействия индуцировало снижение репликации ВИЧ-1. Наибольшее снижение уровня вирусной репликации достигалось при использовании мАТ к молекулам гистовсовместимости II класса (рис. 11). Применение мАТ к СБ2 молекуле, а также ЬРА-1 в меньшей степени ингибировало репликацию ВИЧ-1. Использование мАТ к молекуле 08-БЮ№1 не оказывало влияния на репликацию ВИЧ-1 в использованной нами экспериментальной модели.

—♦—

—О—

Nef+(ant¡-HLA-DR) —х— МеНагНьША-ОР) —Ж— (апй-1_РА-3) —№Г- (атМРА-З) —е— (ап«-С028) О (ап«-С028)

-№Г+ (апИ-С02)

(апК-СР2)

Дни культивирования

Рис.11. Репликация ВИЧ-1 в СБ4+-Лф, культивируемых с ЭК без мАТ, в присутствии изотипических мАТ, мАТ к С02, МНС II класса, ОС-ЗЮКЯ, 1Л-А-1. По оси абсцисс -продолжительность культивирования (дни), по оси ординат - количество p24gag антигена в супернатантах (в нг/мл)

Роль эндотелиальных клеток в регуляции апоптоза продуктивно инфицированных и неинфицированных СЭ4+ - лимфоцитов

Было выявлено, что наиболее восприимчивой к апоптозу популяцией Лф, культивированных с ЭК, являются пул неинфицированных (или латентно инфицированных) СБ4+-Лф. Это иллюстрировали исследования по изучению фрагментации ДНК продуктивно инфицированных и неинфицированных Лф, культивированных в присутствии ЭК (рис.12). Было выявлено, что количество гиподиплоидных клеток (регион М1) среди неинфицированной популяции Лф почти в 3 раза превышает данный показатель у продуктивно инфицированных Лф (рис.13 А и Б, соответственно). Аналогичная закономерность была выявлена и при исследовании других параметров апоптоза Лф, культивированных в присутствии ЭК. Об этом свидетельствовал низкий процент клеток с признаками фрагментации ДНК (рис.13 А), сниженной величиной митохондриального потенциала (рисЛЗБ) и экспрессией фосфатидилсерина (рис.13 В).

26.04.036

10' 10' 10" Propidium Iodide

О j

с10

26.04.035

26%

nimtl imi|'ll^l'W

101 102 103 Propidium Iodide

А Б

Рис.12. Интенсивность флуоресценции пропидиум йодида, окрашивающего ДНК продуктивно инфицированных (А) Лф и неинфицированных (Б), культивированных с ЭК

L.......... ■'

P24-FITC

Г ю3 P24-FITC

............ .......

рй-РЕ

Б В

Рис. 13. Уровень фрагментации ДНК (А - нижние квадранты dot-plot), снижения величины митохондриального потенциала (Б - нижние квадранты dot-plot) и экспрессии фосфатидилсерина (В - верхние квадранты dot-plot) у продуктивно инфицированных (правые квадранты dot-plot) и неинфицированных (левые квадранты dot-plot) СБ4+-Лф, культивированных в присутствии ЭК. По оси абсцисс — интенсивность флуоресценции мАТ к р24 gag; по оси ординат - интенсивность флуоресценции пропидиум йодида (А); хлорометил-Х-розамина (Б); аннексина V (В)

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что ЭК обладают способностью индуцировать репликацию ВИЧ-1 в СБ4+-Лф. Основным пулом клеток-продуцентов ВИЧ-1 в этой экспериментальной модели являются СБ4+-Лф, относящиеся к клеткам-памяти (СШ5ЯО). Продуктивно-инфицированные СБ4+-Лф, обладают специфическим фенотипом, заключающимся в отсутствии классических маркеров клеточной активации и признаков пролиферации. Кроме того, пул продуктивно

инфицированных Лф обладает устойчивостью к программированной клеточной гибели, что может способствовать длительной персистенции данных клеток в организме ВИЧ-инфицированных лиц и обеспечивать поддержание виремии в течение продолжительного периода времени.

Профессиональные антиген-презентирующие клетки и их роль в репликации ВИЧ-1

Было проведено сравнительное изучение способности различных типов антиген-презентирующих клеток (АПК) инициировать репликацию ВИЧ-1 в СБ4+-Лф. Из категории профессиональных АПК, экспрессирующих на своей поверхности основные ко-стимулирующие молекулы семейства В7(СБ80, СБ86) были выбраны дендритные клетки (ДК) и макрофаги.

Было выявлено, что при культивировании моноцитов, выделенных из периферической крови доноров методом положительной иммуномагнитной селекции в течение 5 дней в присутствии цитокинов ГМ-КСФ и ИЛ-4, происходило их созревание в незрелые ДК, сопровождавшееся утратой экспрессии молекулы СО 14 и появлением молекул НЬЛ-БЯ и СБ209. Дальнейшее их культивирование в течение 2 дней с ГМ-КСФ, ФНО-а и ПГЕз приводило к появлению на их поверхности молекул СБ83, являвшихся одним из основным критериев их созревания. Источником макрофагов (Мф), использованных в качестве профессиональных АПК для культивирования с СБ4+-Лф, также являлись моноциты периферической крови доноров. Культивирование моноцитов в течение 6-7 дней в присутствии ГМ-КСФ индуцировало их дифференцировку в макрофаги, определяемую по появлению эстеразной активности в клетках.

Было выявлено, что культивирование профессиональных АПК с СШ+-Лф приводило к их активации, а внесение ВИЧ-1 в культуры ДК/С1)4+-Лф или Мф/С04+-Лф инициировало репликацию ВИЧ-1 в СБ4+-Лф.

В качестве критериев активации СБ4+-Лф, культивированных с ДК или Мф, использовали только уровень экспрессии активационных маркеров, не

определяя при этом в супернатантах культур уровень секреции цитокинов (ИЛ-2 и ИФН-у). Это было обусловлено тем, что как ДК, так и макрофаги могли стать источником синтеза данных цитокинов и поэтому не могли быть использованы в качестве критерия активации СБ4+-Лф, культивированных с данными типами АПК. Было показано, что культивирование профессиональных АПК с СБ4+-Лф инициирует активацию последних, проявлявшуюся в экспрессии всех активационных маркеров (СЭ25, 69, 71, НЬА-ОЯ, УЬА-1). Было отмечено, что процент СБ4+-Лф, экспрессирующих маркеры активации в данных экспериментальных условиях, был достоверно выше по сравнению с СБ4+-Лф, культивированными с ЭК. Данная закономерность была выявлена при исследовании практически всех активационных маркеров, за исключением экспрессии УЬА-1 (табл. 3).

Экспрессия маркеров активации у СБ4+-Лф (в %), Таблица 3

культивированных с ДК, М( ) И ЭК.

С025" С069 С071 НЬА-ОЯ УЬА-1

СБ4+Лф 0 0 0 0 0

СБ4+Лф (ВИЧ-1) 1,1±0.2 0 0 0 0

ЭК/С04+Лф 14,9±2.6 8,9±1.2 8,9±2.2 4,9±0.6 6,2±1.2

ЭК/СР4+Лф (ВИЧ-1) 16,1±3.2 11,9±2.6 7,2±3.6 2,7±1.2 4,4±0.8

ДК/СБ4+Лф 24,8±4.1" 17,1±2.б" 12,0±0.8" 9,9±2.2 " 3,6±0.4

ДК/СБ4+Лф (ВИЧ-1) 22,6±3.4" 19,8±3.2" 12,8±3.4" 8,0±2.8" 4,0±1.0

Мф/СР4+Лф 20,9±1.8" 15,9±1.8" 11,4±0.6" 11,9±3.2" 1,9±0.2

Мф/СИ4+Лф (ВИЧ-1) 19,4±2.2" 17,0±2.8" 13,6±2.8" 12,0±2.4" 3,4±1.2

* - экспрессию СБ69 оценивали 3 сутки культивирования, СВ25, ЖА-БЛ, \ЪА-1 - на 6 сутки культивирования, СТ>1\ - на 9 сутки культивирования

** - р<0.05 по сравнению с аналогичными условиями культивирования СБ4+-Лф в присутствии ЭК.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что "активирующий" потенциал профессиональных АПК значительно превосходит таковой у полупрофессиональных АПК.

Результаты дальнейших исследований подтвердили традиционную точку зрения о способности профессиональных АПК инициировать репликацию ВИЧ-1 в СБ4+-Лф. Было показано, что пик репликации ВИЧ-1 в СБ4+-Лф, культивированных с ДК и Мф наблюдался на 6 и 9 сутки культивирования, соответственно. Тем не менее, уровень репликации ВИЧ-1 в этих случаях был достоверно ниже по сравнению с уровнем вирусной репликации в СБ4+-Лф, культивированных с ЭК (рис.14). ДК и Мф не являлись источниками репликации ВИЧ-1 в использованной нами экспериментальной модели, так как белок ВИЧ-1 р24§ад в супернатантах ДК или Мф, культивированных в

1 3 6 9 12 15 Рис.14. Репликация ВИЧ-1 в СБ4+-Лф, культивируемых с ДК (б), Мф (а) и ЭК (в). По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество p24gag антигена в супернатантах в нг/мл

Помимо различий в динамике вирусной репликации в СЭ4+-Лф, культивированных с различными типами АПК, были также обнаружены существенные различия в фенотипе продуктивно инфицированных клеток. Если популяция клеток-продуцентов ВИЧ-1 в культурах ЭК/С04+-Лф была представлена неактивированными и непролиферирующими клетками, то популяция клеток продуцентов ВИЧ-1 культуре ДК/СБ4+Лф была гетерогенной. Помимо характерной для культуры ЭК/СЕ)4+-Лф неактивированной популяции Лф, значительная часть клеток-продуцентов экспрессировала активационные маркеры (рис.15). Аналогичные результаты

были получены и при исследовании маркеров активации на поверхности продуктивно инфицированных СБ4+Лф, культивированных с Мф.

09.08,017

А Б

Рис.15. Экспрессия активационных маркеров на поверхности продуктивно инфицированных (р248а8 -позитивных - М2 на верхней гистограмме) и неинфицированных (р248а® -негативных М1 на верхней гистограмме) Лф, культивированных с ДК. А-С025, Б -НЬА-ВК; По оси абсцисс - интенсивности флуоресценции мАТ к p24gag, меченых Р1ТС (верхняя гистограмма),- интенсивность флюоресценции мАТ к маркерам активации, (нижние гистограммы А и Б)

Оценка уровня пролиферации продуктивно-инфицированных клеток, культивированных с профессиональными АПК подтвердила точку зрения о гетерогенности данного пула клеток-продуцентов ВИЧ-1. Было обнаружено, что в данных экспериментальных условиях большая часть продуктивно инфицированных клеток была представлена пролиферирующими клетками.

Инфицирование вирусом как СВ45ЯА, так и СБ45ЯО, культивированных с ДК, приводит к репликации ВИЧ-1, оцениваемой по содержанию белка р24838 в супернатантах. Тем не менее, было выявлено, что уровень и динамика репликации ВИЧ-1 в культурах ДК/СВ45ЯО и ДК/СБ45ЯА отличаются друг от друга (рис.16).

Рис.16. Репликация ВИЧ-1 в С04+СВ45ЯА+-Лф (курсив) и СБ4+СБ45КО+-Лф (сплошная линия), культивированных в присутствии ДК. По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество p24gag антигена (нг/мл)

Мф также обладали способностью индуцировать репликацию ВИЧ-1 в наивных Т-Лф и клетках памяти. Были выявлены аналогичные отличия в динамике и уровне репликации между исследуемыми популяциями Т-Лф.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что профессиональные АПК (ДК и Мф) обладают способностью инициировать репликацию ВИЧ-1 как в "наивных" Т-Лф, так и Т-Лф, относящихся к пулу клеток-памяти.

Рис.17. Репликация ВИЧ-1 в СБ4+-Лф, культивируемых с ДК (А - совместное культивирование; Б - культивирование клеток, разделенных полупроницаемой мембраной). По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат -количество p24gag антигена в супернатантах (нг/мл).

Раздельное культивирование ДК или Мф с СБ4+-Лф с использованием полупроницаемой мембраны приводило к значительному снижению уровня вирусной репликации вплоть до полного его подавления (рис.17). Это свидетельствует о том, что основные сигналы, необходимые для инициирования вирусной репликации в инфицированных СБ4+-Лф, исходят со стороны профессиональных АПК.

С целью идентификации лиганд-рецепторных взаимодействий между профессиональными АПК и СБ4+-Лф, инициирующих репликацию ВИЧ-1, были проведены эксперименты с использованием блокирующих мАТ. Было установлено, что культивирование ДК с СБ4+-Лф в присутствии анти-CDBO и aHTH-CD86 мАТ к существенному подавлению вирусной репликации (pO.OOl). Использование мАТ к молекулам МНС II класса также оказывало выраженный ингибирующий эффект (р<0.001).

Внесение в культуру ДК/С04+-Лф анти-СЭ2 мАТ, а также анти-LFAl мАТ не оказывало аналогичного эффекта. Блокада рецептора DC-SIGN с помощью мАТ приводила к умеренному подавлению вирусной репликации. Роль дендритных клеток и макрофагов в регуляции апоптоза продуктивно инфицированных и неинфицированных CD4+ - лимфоцитов

С04+-Лф, культивированные с ДК или Мф, подвергаются апоптозу. Тем не менее, процент клеток, гибнущих по механизму апоптоза, в неинфицированных культурах был чрезвычайно малым. Внесение ВИЧ-1 в культуру ДК/С04+-Лф или Мф/С04+-Лф приводило к существенному повышению процента С04+-Лф, погибающих по механизму апоптоза. Признаки программированной клеточной гибели наблюдались преимущественно у неинфицированных СБ4+-Лф, культивированных с ДК или Мф. Максимальные значения апоптозных клеток были зарегистрированы у неинфицированной популяции СЭ4+-Лф на 6 и 9 сутки культивирования (для культур ДК/СБ4+-Лф и Мф/СБ4+-Лф, соответственно). В то же время наибольшее количество апоптозных клеток среди продуктивно инфицированных С04+-Лф,

культивированных с ДК и Мф наблюдалось на 9 и 12 сутки их совместного культивирования, соответственно (табл. 4 и 5). Количество клеток, подвергающихся апоптозу, среди инфицированных СШ+-Лф было существенно ниже по сравнению с неинфицированными клетками (р<0.01).

Таблица 4

Количество СШ+-Лф (в %), подвергающихся апоптозу _ при их культивировании с ДК_

Маркер апоптоза ДК/С04+-Лф (контроль) ДК/СБ4+-Лф + ВИЧ-1

Время культивирования (дни) Время культивирования (дни)

3 6 9 12 3 6 9 12

Экспрессия ФС 1,1±0,1 1,5±0,8 11,4±3,8 10,2±2 0,6±0,1 4,8±1,8** 27,8±4,б ** 16,2±2,1 **

Снижение 5,2±1,3 8,7±2,9 13,3±5,3 9,9±3,5 15,2±4,3 ** 24,7±3,9 ** 39,4±б,4 ** 31,1±7,б **

Фрагментация ДНК - ■ 1,8±0,9 1,9±0,4 - 1,9±0,96 17,б±3,6 ** 10,2±1,8 **

** - р<0.05 по сравнению с контролем.

Таблица 5

Количество СБ4+-Лф (в %), подвергающихся апоптозу _ при их культивировании с Мф_

Маркер апоптоза Мф/С04+-Лф (контроль) Мф/ СБ4+-Лф + ВИЧ-1

Время культивирования (дни) Время культивирования (дни)

3 6 9 12 3 б 9 12

Экспрессия ФС 1,1±0,1 1,7+0,4 10,4±3,1 16,2+2,1 0,6±0,1 2,9±0,9 14,9±3,1** 27,8±4,6 **

Снижение Д^т 4,2±1,6 7,7±2,8 12,2+3,7 15,2±4,3 15,2±4,3 34,4±4,2** 34,1 ±5,6** 39,4±5,4 **

Фрагментация ДНК - - 1,8±0,6 2,9±0,9 - 1,9±0,96 11,2±1,8** 17,6±3,6 **

** - р<0.05 по сравнению с контролем.

Роль белка ВИЧ-1 Nef в регуляции репликации ВИЧ-1

Учитывая многочисленные литературные данные, свидетельствующие о роли белка ВИЧ-1 Nef в патогенезе ВИЧ-1 инфекции, обусловленные его способностью регулировать процессы вирусной репликации и апоптоза CD4+-

Лф, представляло интерес изучить его свойства в использованных нами экспериментальных моделях вирусной репликации и апоптоза продуктивно инфицированных и неинфицированных С04+-Лф.

Было выявлено, что несмотря на некоторое "запаздывание" процессов репликации Nef-, его содержание p24gag в супернатантах ФГА-активированных Лф были сопоставимы с количествами p24gag вируса, не имевшего в геноме делецию по вышеуказанному гену (Nef+) (рис.18). Также было выявлено отсутствие способности данного белка ВИЧ-1 влиять на количество продуктивно инфицированных клеток в культурах ФГА-активированных Лф

Рис.18. Репликация ВИЧ-1 в ФГА-активированных - Лф (сплошная линия - Nef+; прерывистая - Nef-). По оси абсцисс - продолжительность культивированш клеток (дни), по оси ординат - количество p24gag антигена в супернатантах (нг/мл)

Рис.19. Количество продуктивно инфицированных Лф, преактивированных ФГА (в течение 2 дней) и инфицированных Nef- (А) и Nef+ (Б). Гистограмма Лф на пике вирусной репликации; для Nef+ - 6 день культивирования, для Nef- - на 10 день культивирования. По оси абсцисс - интенсивности флуоресценции мАТкp24gag, меченых FITC, по оси ординат - количество клеток

Инфицирование клеточной линии СЕМх174 показало, что количество продуктивно инфицированных клеток, определяемых по внутриклеточному содержанию p24sag, при их инфицировании Nef+ и Nef- достоверно не отличаются друг от друга (рис.20). Аналогичные результаты были получены при инфицировании с помощью Nef+ и Nef- индикаторной клеточной линии CEM-GFP.

А Б

Рис.20. Количество продуктивно инфицированных клеток линии СЕМх174 на 6 сутки культивирования после внесения эквивалентных доз Nef+ (Б) и Nef- (А). По оси абсцисс -интенсивности флуоресценции мАТ к p24gag , меченых РЕ, по оси ординат - количество клеток

Внесение эквивалентных доз Nef- и Nef+ к С1М+-Лф, культивированным в различными типами АПК выявило существенные различия в динамике и уровне вирусной репликации, оцениваемой как по содержанию p248ag антигена ВИЧ-1 в супернатантах клеточных культур, так и по количеству продуктивно инфицированных клеток. Пик репликации Nef в культуре ЭК/С04+-Лф регистрировался на 12 сутки культивирования клеток. Уровень репликации вируса ВИЧ-1 с фенотипом Nef+ был в 100 раз выше по сравнению с его производным - Nef- (р<0.001). В ряде экспериментов уровень репликации Nef-даже не превышал фоновых значений (табл.6). Культивирование двух типов клеток по отдельности не индуцировало репликацию ВИЧ-1.

Аналогичные закономерность и динамика репликации Nef+ и Nef- в культуре ЭК/СБ4+-Лф наблюдалась как для штамма NL4-3, полученного в результате трансфекции генома ВИЧ-1 в СЕМх174 клетки, так и для этого же

штамма вируса, продуцентами которого были ФГА-активированные Лф серонегативных доноров.

Таблица 6.

Влияние ЭК на уровень репликации ВИЧ-1 (Nef+; Nef-) в СР4+-Лф.

p24 нг/мл на различных сроках культивирования

1 день 3 дня 6 дней 9 дней 12 дней 15 дней

CD4+ (Nef-) 0 0 0 0 0 0

CD4+ (Nef+) 0 1,3+0,11 1,1+0,1 1,6±0,19 1,3±0,21 0

ЭК (Nef+) 0 0 0 0 0 0

ЭК (Nef-) 0 0 0 0 0 0

3K/CD4+ 5,1+0,47 15,2+1,4 70,4± 2,6 120,8± 9,6 90,2± 3,5

(Nef+) 0 ** **♦ *** *** ***

3K/CD4+

(Nef-) 0 0 0 2,0± 0,21 2,3±0,19 1±0,12

** - р<0.01, *** - р<0.001 по сравнению с Nef-,

Инфицирование СБ4+-Лф, культивированных с профессиональными АПК (ДК или Мф), приводит к иным результатам. Было выявлено, что присутствие ДК и Мф способствует репликации в СБ4+-Лф не только ВИЧ-1 с фенотипом Nef+ , но и вируса, в геноме которого имеется делеция по гену nef (Nef-) (рис.21). Количество корового белка ВИЧ-1 в супернатантах культур, инфицированных вирусами с фенотипом Nef+ и Nef- на пике вирусной репликации, достоверно не отличалось друг от друга.

Таким образом, результаты по изучению способности белка ВИЧ-1 Nef индуцировать вирусную репликацию в клетках-мишенях показали, что только при культивировании СБ4+-Лф в присутствии ЭК, данный белок ВИЧ-1 способен существенным образом повлиять на этот процесс.

Все вышеизложенное свидетельствует о том, что сигналы, исходящие со стороны ЭК и получаемые инфицированными СБ4+-Лф, способны инициировать вирусную репликацию. В то же время, отсутствие репликации вируса с фенотипом Nef- в СЮ4+-Лф в этой экспериментальной модели, позволяет предположить, что данный белок ВИЧ-1 способен усиливать сигналы, получаемые СТ)4+-Лф. Другим объяснением выявленного феномена может являться Nef-зависимое снижение порога чувствительности

инфицированных С04+-Лф к активационным сигналам со стороны полупрофессиональных АПК, а именно, ЭК. Отсутствие способности белка Nef усиливать процессы вирусной репликации в С04+-Лф, культивированных с профессиональными АПК (ДК и Мф), может являться следствием эффективной ко-стимуляции клеток-мишеней со стороны ДК и Мф. Известно, что профессиональные АПК экспрессируют на своей поверхности значительно больший спектр ко-стимулирующих молекул по сравнению с ЭК.

120

А Б у л\ / / N

100 -

8060- В / 4 Гт / \ ч ч \ \т 1

40-

20-

_ ., - m ~М ""

1 3 6 9 12 15

Рис.21. Уровень репликации Nef- и Nef+ в С04+-Лф, культивированных с ДК и Мф. (ДК/С04+ -Лф, инфицированные Nef+ и Nef- - А и Б, соответственно; Мф/С04+-Лф, инфицированные Nef+ и Nef- - В и Г, соответственно). По оси абсцисс -продолжительность культивирования (дни), по оси ординат - количество p24gag антигена в супернатантах (нг/мл)

Для подтверждения выдвинутой гипотезы было проведено инфицирование СБ4+-Лф, культивированных в присутствии ЭК и стимулирующих aHTH-CD28 мАТ. Известно, что именно с помощью рецептора CD28 на поверхности Т-Лф происходит восприятие ими главного ко-стимулирующего сигнала, исходящего со стороны профессиональных АПК, а молекулы пары CD80(86) - CD28 являются ключевыми для эффективной пролиферации клеток и дифференцировки "наивных" Т-Лф в клетки эффекторного звена (Pardi R., 1992, Linsley P.S., 1993).

Следовательно, отсутствие экспрессии молекулы CD28 на поверхности ЭК приводит к субпороговой активации клеток мишеней. Было сделано предположение, что в условиях дефицита факторов, обеспечивающих полноценную активацию клеток-мишеней, присутствие вирусного белка Nef в липидных плотах клеточных мембран клеток-мишеней могло являться фактором, снижающим требовательность к подобного рода активационным стимулам, исходящим со стороны молекул семейства В7 (а именно, CD80, 83 и 86). Подтверждением данной гипотезы явилось бы увеличение уровня репликации вируса с фенотипом Nef- в СБ4+-Лф, стимулированных с помощью aHTH-CD28 мАТ и культивированных в присутствии ЭК.

Было обнаружено, что такого рода дополнительная стимуляция С04+-Лф, культивированных в присутствии ЭК, приводит к усилению репликации вируса с фенотипом Nef+ (рис.22).

Рис.22. Уровень репликации Nef- и Nef+ в СБ4+-Лф, культивированных с ЭК в присутствии или отсутствии анти-СБ28-мАТ Nef+ - А (без мАТ) и Б (с мАТ) линии, соответственно; Nef- - В (без мАТ) и Г (с мАТ) линии, соответственно. По оси абсцисс -продолжительность культивирования (дни), по оси ординат - количество p24gag антигена в супернатантах (нг/мл)

Таким образом, способность белка ВИЧ-1 Nef усиливать вирусную репликацию в СБ4+-Лф, культивированных в присутствии ЭК, не обусловлена его способностью "заменять" ко-стимулирующий сигнал, исходящий со стороны молекул семейства В7.

Учитывая традиционную точку зрения о взаимосвязи между процессами вирусной репликации и активации клеток-мишеней, а также существенные различия в уровне репликации Nef+ и Nef- в С04+-Лф, культивированных в присутствии ЭК, было выдвинуто следующее предположение: вирусный белок Nef снижает порог чувствительности инфицированных клеток к активационным сигналам, исходящим со стороны ЭК. Это, в свою очередь, приводит к активации инфицированных Лф, даже в отсутствии проведения основных (С080(6)-опосредованных) ко-стимулирующих сигналов, что, в свою очередь, неизбежно инициирует вирусную репликацию в Лф.

Для проверки выдвинутой гипотезы были проведены исследования по изучению уровня активации Лф, в культурах ЭК/СБ4+-Лф, инфицированных вирусами с фенотипами Nef+ и Nef-. В качестве критерия активации Лф использовали уровень секреции ими ИЛ-2, определяемого по его содержанию в супернатантах. Результаты проведенных исследований показали, что уровень секреции ИЛ-2 в супернатантах ЭК/СБ4+-Лф, инфицированных вирусами с фенотипами Nef+ и Nef- не отличается существенным образом друг от друга (табл. 7).

Таблица 7

Тип культивируемых клеток Уровень продукции ИЛ-2 (пг/мл)

24 ч 48ч 72ч 96 ч 12 дн

ЭК и.о. и.о. н.о. н.о. н.о.

ОТ4+Лф и.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

ЭК/ОТ4+Лф 9.3±2.6 20.6±1.9 27.0±2.9 н.о. н.о.

ЭК + Nef+ и.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

СБ4+Лф+ Nef+ 2.1±0.2 н.о. н.о. н.о. н.о.

ЭК/СБ4+Лф+ Nef+ 7.9±1.4 19.1±2.2 30.3±3.3 н.о. н.о.

ЭК + Nef- и.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

СТ4+Лф+ Nef- и.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

ЭК/СБ4+Лф+ Nef- 9.6±2.2 22.4±0.4 28.6±1.8 н.о. н.о.

Примечание: н.о. - неопределяемый уровень цитокина

Отсутствие различий в уровне ИЛ-2 между культурами, инфицированными Nef+ и Nef- могло быть следствием двух процессов. Во-

первых, несмотря на отсутствие белка Nef в инфицированных Лф, последние реактивируются, но этого является недостаточным для запуска в них процессов вирусной репликации. Во-вторых, процессы вирусной репликации и активации клеток-мишеней могут быть разобщены друг с другом, и репликация ВИЧ-1 может происходить в клетках, не продуцирующих ИЛ-2. В пользу правомочности второй гипотезы свидетельствуют результаты проведенных исследований, свидетельствующие о том, что клетки-продуценты ВИЧ-1 в культурах ЭК/СБ4+-Лф, представлены минимально активированными и непролиферирующими Лф.

Роль белка ВИЧ-1 Nef в регуляции апоптоза СЭ4+-Лф

Изучение механизмов апоптоза продуктивно инфицированных и неинфицированных клеток в культурах клеточных линий и ФГА-активированных Лф показали, что оба типа клеток оказываются подверженными в равной степени апоптозу. Количество продуктивно инфицированных клеток, подвергающихся гибели по механизму апоптоза среди ФГА-активированных Лф, продуцирующих ВИЧ-1 с фенотипом Nef- было даже меньшим по сравнению с культурами ФГА-активированных Лф, являвшихся продуцентами ВИЧ-1 с фенотипом Nef+. Выявленная закономерность прослеживалась на всех сроках культивирования ФГА-активированных Лф и не изменялась при внесении больших или меньших инфекционных доз Nef+ и Nef.

Следующим этапом исследования явилось изучение способности вирусного белка Nef регулировать процессы апоптоза инфицированных и неинфицированных С04+-Лф, культивированных с различными типами АПК.

Учитывая чрезвычайно низкий уровень репликации ВИЧ-1 с фенотипом Nef- в СБ4+-Лф, культивированных с ЭК, была предпринята попытка увеличить количество продуктивно инфицированных клеток в данной экспериментальной модели за счет увеличения инфекционной дозы Nef-. Было обнаружено, что внесение больших инфекционных доз ВИЧ-1 с фенотипами Nef+ и Nef- приводит к некоторому усилению репликации ВИЧ-1 с фенотипом

Nef- (p<0.05). В то же время, внесение в культуру ЭК/СБ4+-Лф эквивалентных инфекционных доз Nef+ приводит в значительному увеличению уровня вирусной репликации (р<0.001).

Изучение механизмов программированной клеточной гибели у Лф, культивированных в присутствии ЭК, выявило, что при внесении в клеточную культуру ВИЧ-1 с фенотипом Nef- (в дозах 20 и 100 наг/мл) клетки-продуценты вируса погибают по механизму апоптоза. В то же время, Лф, продуцирующие ВИЧ-1 с фенотипом Nef+, оказываются по-прежнему резистентными к апоптозу (рис.23). Эта закономерность прослеживалась при изучении всех маркеров апоптоза ( фрагментации ДНК - (нижние правые квадраты рис.23 А, Б; экспрессии фосфатидилсерина - верхние правые квадраты рис.23 В, Г).

ч- 2.03.035 ^ 2.03.036

«а^.5%

со * £ ' ^ о fs\ ъ

Ï3% 0.5% о. Cl. о г о : 7% 0%

10' 10' p2£-FITC

2.03.051

10£ р2ФПТ£

2.03.056

■Го;

; 7% 1%

У%

4% 0.5%

fe.5%

p2ff

р24-РЕ

Рис. 23. Признаки фрагментации ДНК (А, Б) и экспрессии фосфатидилсерина (В, Г) на продуктивно инфицированных (правые квадраты dot-plot) и неинфицированных (левые квадраты dot-plot) Лф, культивированных с ЭК. Инфицирование Nef+ (А, В) и Nef- (Б, Г) в дозе 20 нг/мл. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции мАТ к р24 gag; По оси ординат - интенсивность флуоресценции пропидиум йодида (А, Б); Аннексина V (В, Г).

Таким образом, инфицирование С04+-Лф, культивированных с ЭК, индуцирует репликацию ВИЧ-1. Кроме того, клетки-продуценты ВИЧ-1 являются устойчивыми к апоптозу. Оба этих феномена (репликация ВИЧ-1 и резистентность к апоптозу у продуктивно инфицированных Лф) являются Nef-зависимыми.

Способность белка ВИЧ-1 Nef обуславливать резистентность к апоптозу у продуктивно инфицированных Лф была исследована при их культивировании с другими типами АПК (ДК и Мф). Количество клеток с признаками фрагментации ДНК у клеток-продуцентов ВИЧ-1 с фенотипом Nef+ было меньшим по сравнению с клетками, являвшимися продуцентами ВИЧ-1 с фенотипом Nef- (рис.24). Аналогичная закономерность была выявлена и при исследовании величины митохондриального потенциала и экспрессии фосфатидилсерина.

Различная чувствительность к апоптозу у Лф, продуцирующих Nef+ и Nef-, была выявлена и у CD4 + -Лф, культивированных с Мф. По-прежнему, клетки-продуценты Nef+ обладали большей устойчивостью к апоптозу, по сравнению с Лф, являвшимися продуцентами ВИЧ-1 с фенотипом Nef- (р< 0.05). Эта закономерность наблюдалась при инфицировании СБ4+-Лф как малыми (10 нг/мл), так и большими (100 нг/мл) инфекционными дозами ВИЧ-1.

Время инкубации (сут)

Рис.24. Количество Лф с признаками фрагментации ДНК при их культивировании с ДК и инфицировании Nef+ или Nef- в дозе 20 нг/мл.

Наряду с выявленной устойчивостью к апоптозу у продуктивно инфицированных Лф, культивированных с АПК, было установлено, что неинфицированные Лф интенсивно погибают по механизму апоптоза. Данный феномен был подтвержден и на клеточной линии СЕМ-ОЕР (рис.25). Количество клеток со сниженным митохондриальным потенциалом (АТт10™-клеток) у неинфицированной (вЕР-негативной) популяции клеток линии СЕМ-ОБР (левые нижние квадраты рис.25А) было существенно выше по сравнению с неинфицированной (СРР-позитивной) популяцией. Неинфицированные клетки экспрессировали значительно больше ФС (верхние правые квадраты рис.25Б) по сравнению с инфицированными.

Рис.25. Величина ДЧ*,,, (А) и экспрессия ФС (Б) у инфицированных (GFP+) и неинфицированных (GFP-) клеток линии CEM-GFP на 5 сутки культивирования

Изучение способности белка ВИЧ-1 Nef влиять на апоптоз неинфицированных Лф показало, что в культурах Лф, инфицированных ВИЧ-1 с фенотипом Nef-, количество неинфицированных клеток, подвергающихся программированной клеточной гибели, существенно ниже по сравнению с культурами Лф, инфицированными вирусом с фенотипом Nef+ (pO.OOl). Эта закономерность была выявлена как в культуре ФГА-активированных Лф, так и при культивировании Лф с различными типами АПК, в частности, ЭК и ДК.

Результаты исследования коррелирует с данными о возможности индукции апоптоза неинфицированных клеток белком Nef, высвобождающимся во внеклеточное пространство (James, 2004).

Таким образом, результаты проведенных исследований по изучению взаимосвязи репликации ВИЧ-1 и апоптоза выявили, что репликация ВИЧ-1 сопровождается подавлением программы апоптоза инфицированных клеток, что создает условия для персистенции вируса и его репликации. Ослабление программы апоптоза инфицированных Лф, культивированных с ЭК, обусловлено белком Nef. Данный белок ВИЧ-1 играет также важную роль в индукции апоптоза неинфицированных СБ4+-Лф, что приводит к быстрому снижению их количества, являющегося одним из основных признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Репликация ВИЧ-1 в С04-лимфоцитах является результатом их межклеточных взаимодействий как с профессиональными, так и полупрофессиональными антиген-презентирующими клетками.

2. Ведущим фактором репликации ВИЧ-1 в лимфоцитах,взаимодействующих с различными типами антиген-презентирующих клеток, являются лиганд-рецепторные взаимодействия.

3. Репликация ВИЧ-1 в лимфоцитах, взаимодействующих с эндотелиальными клетками, не сопровождается появлением классических признаков их активации и пролиферации.

4. Эндотелиальные клетки индуцируют устойчивость к апоптозу продуктивно инфицированных лимфоцитов, в то время как профессиональные антиген-презентирующие клетки (дендритные клетки и макрофаги) не обладают данной способностью.

5. Устойчивость продуктивно инфицированных лимфоцитов к апоптозу обусловлена их лиганд-рецепторными межклеточными взаимодействиями с эндотелиальными клетками.

6. Способность эндотелиальных клеток инициировать репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах является результатом экспрессии в инфицированных клетках

вирусного белка Nef. Дендритные клетки и макрофаги инициируют репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах Nef-независимым путем.

7. Устойчивость к апоптозу у продуктивно инфицировнных лимфоцитов, взаимодействующих с эндотелиальными клетками, обусловлена вирусным белком Nef.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Модели индукции и оценки апоптоза лимфоцитов периферической крови могут быть использованы в качестве комплексного анализа предполагаемых нарушений регуляции апоптоза и его механизмов.

2. Методы индукции и оценки апоптоза, использованные в настоящей работе, могут быть применены в качестве тест-систем для оценки эффективности терапии ВИЧ-инфекцией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Boichuk S.V., Mustafi I.G., Makarova M.V. Vascular endothelial cells (ECs) promote apoptosis resistance // Abstr. XVI International AIDS Conference, Toronto, Canada.. - 13-18 August 2006, Toronto, Canada. - Abstract book, Vol.1. - P.295.

2. Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Макарова M.B. Роль эндотелиальных клеток в регуляции апоптоза инфицированных ВИЧ-1 CD4+ лимфоцитов //Медицинская иммунология. - 2006. - № 8(4) - С.523-530.

3. Макарова М.В., Бойчук C.B., Мустафин И.Г. Интерлейкин-7 в процессах репликации ВИЧ-1, активации и апоптоза продуктивно инфицированных лимфоцитов //Аллергология и иммунология. - 2006. - Том 7, №3. - С.404.

4. Макарова М.В., Бойчук C.B., Мустафин И.Г. Причинно-следственные взаимоотношения между процессами активации лимфоцитов, репликации ВИЧ-1 и апоптозом клеток-продуцентов //Российская науч-практ. конф-ция, посвящ-я 110-летию кафедры инф-х.болезней BMA им.С.М.Кирова. - С-Петербург. - 2224 марта 2006 г. - С.200-201.

5. Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Макарова М.В., Дунаев П.Д. Изучение роли ИЛ-7 в репликации ВИЧ-1 in vitro // Медицинская иммунология. - 2006. - №8(2-3). -С.120-121.

6. Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Макарова М.В. Роль эндотелиальных клеток в регуляции апоптоза неинфицированных и инфицированных CD4+ лимфоцитов //Медицинская иммунология. - 2006. -№8(2-3). - С.121.

7. Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Макарова М.В., Дунаев П.Д. Интерлейкин-7 (IL-7) способен модулировать процессы апоптоза неинфицированных и инфицированных ВИЧ-1 лимфоцитов // Медицинская иммунология. - 2006. -№8(2-3). - С. 121-122.

8. Хасанова Г.Р., Макарова М.В., Анохин В.А., Романенко О.М., Назарова O.A. Анализ эффективности проведения химиопрофилактики ВИЧ-инфекции в г.Казани //Казанский медицинский журнал. - 2006 . - Т. 87,- С. 91.

9. Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Макарова М.В. Роль интерлейкина-7 в регуляции апоптоза и репликации ВИЧ-1 //Нижегородский медицинский журнал.

- 2006. - №4. - С.34-38.

Ю.Макарова М.В., Бойчук C.B., Мустафин И.Г. Некоторые механизмы репликации ВИЧ-1: роль процессов активации и апоптоза лимфоцитов и клеточных линий //V Симпозиум с международным участием "Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и аллергических заболеваний" - Москва, 17-18 октября, 2006.

- С.45-46.

11. Хасанова Г.Р., Абросимова A.A., Макарова М.В., Степанова Е.Ю., Романенко О.М. Анемия у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными женщинами //Казанский медицинский журнал. - 2006. - Том 87. - С.92.

12.Макарова М.В., Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Романенко О.М. Роль антиген-презентирующих клеток в репликации ВИЧ-1 //Аллергология и иммунология.

- 2007. - Том 8, №1. - С.100.

13.Макарова М.В., Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Романенко О.М. Роль антиген-презентирующих клеток в репликации ВИЧ-1 //Российский аллергологический журнал. - 2007. - №3. - С.322-323.

14. Макарова М.В. Различная чувствительность продуктивно инфицированных ВИЧ-1 и не инфицированных клеток к апоптозу //Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - №3, том 6. - С. 67-70.

15. Хасанова Г.Р., Степанова Е.Ю., Макарова М.В. Анемия у ВИЧ-инфицированных пациентов //Неврологический вестник том XXXIX вып.З. Материалы IV региональной научно,-практической конференции «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском Федеральном округе», 2007.- С. 191-192.

16.Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Макарова М.В., Дунаев П.Д. Некоторые механизмы репликации ВИЧ-1 и апоптоза СТМ+лимфоцитов //Российский аллергологический журнал. - 2007. - №3. - С.319-320.

17. Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Макарова М.В., Дунаев П.Д., ЛАлександер Механизмы репликации ВИЧ-1 в СБ4+Лф: роль антиген-презентирующих клеток //Иммунология. - 2007. - №4. - С.196-200.

18. В.А.Анохин, В.Д.Менделевич, ДА.Бикмухаметов, М.В.Макарова, О.М.Романенко, Л.И.Бадриева, Ю.Г.Юденков, Р.Р.Таипова Приверженность пациента к антиретровирусной терапии //Казанский медицинский журнал. -2007. - Том 88, №4 . - С. 305-310.

19. Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Макарова М.В. Перспективы применения некоторых цитокинов в качестве иммунноадъювантной терапии ВИЧ-инфекции //VI Национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 16-20 апреля 2007 -С.532-533.

20. Мустафин И.Г., Макарова М.В., Бойчук C.B. Репликация ВИЧ-1 и апоптоз лимфоцитов при их инфицировании in vitro //Российский иммунологический журнал.-2008,- Т.2(11), №2-3.-С.269.

21. Макарова М.В., Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Дунаев П.Д. Роль различных типов антиген-презентирующих клеток в репликации ВИЧ-1 //Российский иммунологический журнал.-2008. - Т.2(11), №2-3,-С.269.

22. Хасанова Г.Р., Мухарямова Л.М., Назарова O.A., Анохин В.А., Макарова М.В., Романенко О.М. Этические аспекты перинатальной профилактики ВИЧ-инфекции //Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2008. -N2(20).-С. 153-158.

23. Бойчук C.B., Иванова A.B., Мустафин И.Г., Макарова М.В., Дунаев П.Д., Александер Л. Различная чувствительность продуктивно инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных клеток к апоптозу //Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2008. - №4 - 7-9.

24. Макарова М.В., Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Иванов A.B., Дунаев П.Д., Александер Л. Апоптоз продуктивно инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных лимфоцитов in vitro //Астраханский медицинский журнал. -2008. -Т.3,№3.-С.113-116

25. П.Д. Дунаев, A.B. Иванкова, C.B. Бойчук, И.Г. Мустафин, М.В. Макарова Инфицирование ВИЧ-1 лимфоцитов in vitro, преинкубированных с цитокинами (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а), снижает их активацию //Российский аллергологический журнал. -2009. - №3(1).- С.269.

26. Макарова М.В., Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Дунаев П.Д. Эндотелиальные клетки и репликация ВИЧ-1 //Аллергология и иммунология. - 2008. - Том 9, №3. -С.300

27. Макарова М.В., Мустафин И.Г., Бойчук C.B., Дунаев П.Д., Иванкова A.B. Роль белка ВИЧ-1 NEF в регуляции апоптоза CD4 лимфоцитов //Аллергология

и иммунология. - 2009. - Том 10, №2. - С.240

28. Макарова М.В., Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Иванкова A.B., Иванов A.B., Александер Л. Роль эндотелиальных клеток и белка Nef в репликации ВИЧ-1 //Инфекционные болезни. - 2009. - Т.7, № 3. - С. 18-24.

29.Иванкова A.B., Бойчук C.B., Мустафин C.B., Макарова М.В. Роль ВИЧ-1 белка Nef в патогенезе ВИЧ-инфекции //Казанский мед. ж. - 2010. - Том 91, № 1.-С.79-85.

30. Иванкова A.B., Дунаев П.Д., Бойчук C.B., Макарова М.В., Мустафин C.B. Наличие в структуре ВИЧ-1 белка Nef обуславливает неблагоприятное течение инфекции в условиях цитокин-индуцированной активации Т-лимфоцитов //Российский аллергологический журнал. -2010. -№5(1) - С.124-125.

Формат 60x90/16. Заказ 991. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Заключение Диссертация по теме "Иммунология", Макарова, Маргарита Владимировна

выводы

2. Ведущим фактором репликации ВИЧ-1 в лимфоцитах взаимодействующих с различными типами антиген-презентирующих клеток, являются лиганд-рецепторные взаимодействия.

6. Способность эндотелиальных клеток инициировать репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах является результатом экспрессии в инфицированных клетках вирусного белка Nef. Дендритные клетки и макрофаги инициируют репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах Nef-независимым путем.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Макарова, Маргарита Владимировна, Москва

1. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников H.H., Кушлинский Н.Е. Система Fas FasL в норме и патологии //Вопр. биол. мед. фарм. химии. - 1999. - № 3. - С. 3-17.

2. Белецкий И.П. Взаимосвязь молекулярных механизмов клеточной гибели, опосредованной рецепторами семейства TNF-Rs: Автореф.дис.д-ра биол.наук. Пущино, 2001. - С. 7-35.

3. Духанин A.C., Патрашев Д.В., Огурцов С.И. Изменение трансмембранного потенциала тимоцитов при дексаметазон- и Са2+-индуцированном апоптозе //Экспер. и клин, фармакология. — 1999. № З.-С. 40-43.

4. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Новые иммунопатогенетические вгляды: апоптотические иммунодефициты //Иммунология. — 1998. № 6. - С.17-18.

5. Никонова М.Ф., Буланова Е.Г., и др. Различная готовность к развитию апоптоза активированных Т-лимфоцитов в норме и при СКВ //Иммунология 1997. - N 4. - С. 21-24.

6. Никонова М.Ф., Литвина М.М., Варфоломеева М.И., Ярилина A.A., Ярилин A.A. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию //Иммунология 1999. № 2.- С. 20-23.

7. Новиков В. С. Программированная клеточная гибель — Наука, Санкт-Петербург. 1996.

8. Норкин М.Н., Леплина О.Ю. и др. Роль апоптоза и анергии Т-клеток в патогенезе гнойно-септических заболеваний //Медицинская иммунология. 2000. - Т. 2 (№1). - С. 35-42.

9. Огурцов С.И., Духанин A.C. Митохондриальная и ядерная глюкокортикоид-чувствительные щелочные протеазы тимоцитов. //Бюллетень эксп. биологии и медицины. 2001. — Том. 132. — С 23-25.

10. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е. и др. Пролиферация Т-клеток и апоптоз мононуклеарных клеток пуповинной крови: связь с состоянием новорожденных, влияние интерлейкинов 2,4,7 и дексаметазона на эти параметры //Иммунология. 2001. — № 3 - С.29-35.

11. Тотолян A.A., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. — СПб.: Наука, 2000. С. 169-172.

12. Ярилин А.А, Никонова М.Ф., и др. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки при клинико-иммунологическом обследовании больных. //Медицинская иммунология. 2000. - Т. 2 (№1). - С. 7-16.

13. Ярилин A.A. Апоптоз и его место в иммунных реакциях. //Иммунология. 1996.-№ 6.- С. 10-22.

14. Ярилин A.A. Апоптоз. Природа феномена и его место в целостном организме. //Патологическая физиология и экспериментальная терапия.- 1998. № 2.- С. 38-48.

15. Ярилин A.A. Апоптоз и патология //Аллергия и иммунопатология (под ред. Порядина Г.В.) Москва, 1999. - С. 167-185.

16. Abbate I., F. Dianzani, F. Bianchi, G. Mosiello, F. Carletti, D. Fiumara, M.R. Capobianchi. RANTES stimulates cell-mediated transmission of HIV-1 infection // J Interfer. Cytokine Res. 1999. - Vol. 19. - P. 345-350.

17. Bussolino F., Mitola S., Serini G., Barillari G., Ensoli B. Interactions between endothelial cells and HIV-1. // J. Biochem. Cell Biol. 2001,- Vol. 33.-P. 371-390.

18. Cohen, O. J., A. Kinter, A. S. Fauci Host factors in the pathogenesis of HIV disease // Immunol Rev. 1997.- Vol. 159. P.31-48.

19. Accornero P., Radrizzani M., Delia D. et al. Differential susceptibility to HIV-GP120-sensitized apoptosis in CD4+ T-cell clones with different T-helper phenotypes: role of CD95/CD95L interactions //Blood. 1997. -Vol.89.-P.558-569.

20. Adachi S., Cross A., Babior B.M„ Gottlieb R,A, Bcl-2 and the outer mitochondrial membrane in the inactivation of cytochrome c during Fasmediated apoptosis //J. Biol. Chem. 1997. - Vol.272. -P.21878-21885.

21. Aiello A., Delia D. et al. Flow cytometric detection of mitochondrial BcL-2 protein in normal and neoplastic human lymphoid cells //Cytometry. — 1992. -Vol.13. -P.502-509.

22. Aiken C., Konner J., Landau N.R., Lenburg M.E., Trono D. Nef induces CD4 endocytosis: Requirement for a critical dileucine motif in the membrane-proximal CD4 cytoplasmic do-main //Cell. 1994. - Vol.76. -P.853-864.

23. Alam A., Cohen L. et al. Early activation of caspases during T lymphocyte stimulation results in selective substrate cleavage in nonapoptotic cells //J. Exp. Med. 1999. - Vol.190 (12). -P.1879-1890.

24. Alnemri E.S., Fernandes T.F. et al. Involvement of BcL-2 in glucocorticoid induced apoptosis in human pre-B-leukemias //Cancer Res. — 1992. — Vol.52. -P.491-495.

25. Alnemri E.S., Livingston D.J. et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. //Cell. 1996. Vol.87. - P.171-189.

26. Ameisen J. Programmed cell death (apoptosis) and AIDS pathogenesis. — // AIDS Research and Human Retr. 1994. - Vol. 10. - P. S3-S5.

27. Andersen J.L., Planelles V. The role of Vpr in HIV-1 pathogenesis //Curr. HIV Res.-2005. Vol.3 (1).-P.43-51

28. Andreola G., Rivoltini L., Castelli C. et al. Induction of lymphocyte apoptosis by tumor cell secretion of FasL-bearing microvesicles //J. Exp. Med. 2002. - Vol.195. - P.1303-1316.

29. Ankarcrona M., Depbaukt J.M. et al. Interleukin-1-beta-induced nitric oxide production inactivates apoptosis in pancreatic RIN 4m 05F cells //Exp. Cell Res. 1994.-Vol.213.-P.172-177.

30. Antoni B., Sabbatini P., Rabson A., White E. Inhibition of apoptosis in human immunodeficiency virus-infected cells enhances virus production and facilitates persistent infection //J. Virol. 1995. - Vol.69. - P.2384-2392.

31. Arai T., Hiromatsu M. et al. Endogeneous interleikin-10 prevents apoptosis oin macrophages during Salmonella infection. //Biochem. Biophys. Res. Communs. 1995. - Vol.213. - P.600-607.

32. Askew D.S., Ashmun R.A. et al. Constitutive c-myc expression in an IL-3-dependent myeloid cell line supresses cycle arrest and accelerates apopotsis. //Oncogen. 1991. - Vol.6. - P. 1915-1922.

33. Bachmann M.F., Oxenius A., Mak T.W., Zinkernagel R.M. //J.Immunol. — 1995. Vol.155. - P. 3727-3733.

34. Badley A.D., Dockreil D., Simpson M. et al. Macrophage-dependent apoptosis of CD4+ T lymphocytes from HIV-infected individuals is mediated by FasL and tumor necrosis factor //J. Exp. Med. 1997. — Vol.185. -P.55-64.

35. Badley A.D., Dockrell D., Simpson M. et al. Macrophage-dependent apoptosis of CD4+ T lymphocytes from HIV-infected individuals is mediated by FasL and tumor necrosis factor //J. Exp. Med. 1997. -Vol.185.-P.55-64.

36. Badley A.D., McElhinny J.A., Leibson PJ. Upregulation of Fas ligand expression by human immunodeficiency virus in human macrophages mediates apoptosis of uninfected T lymphocytes //J. Virol. 1996. -Vol.70. -P.199-206.

37. Badley A.D., Pilon A.A., Landay A., Lynch D.H. Mechanisms of HIV-associated lymphocyte apoptosis //Blood. 2000. - Vol.96. - P.2951-2964.

38. Balasubramanian K., Chandra J., Schroit A.J. Immune clearance of phosphatidylserine expressing cells by phagocytes. The role of beta (2)-glycoprotein I in macrophage recognition //J. biol. Chem. 1997. -Vol.272. — P.31113-31117.

39. Balasubramanian K., Schroit A.J. Characterization of phosphatydylserine-dependet p2-glycoprotein I macrophage interaction: Implications for apoptic cell clearance by phagocytes //J. Biol. Chem. 1998 - Vol.273 - P.29272-29277.

40. Banchereau J., Steinman R. Dendritic cells and control of immunity //Nature. 1998. - Vol.392 - P.245-252.

41. Banda N.K., Bernier J., Kurahara D.K. et al. Crosslinking CD4 by human immunodeficiency virus gpl20 primes T cells for activation-induced apoptosis//J. Exp. Med. 1992. - Vol.76. -P.1099-1106.

42. Bartz S.R, Emerman M. Human immunodeficiency virus type 1 Tat induces apoptosis and increases sensitivity to apoptotic signals by up-regulating FLICE/caspase-8. //J. Virol. -1999. Vol.73 (3). -P.1956-1963.

43. Bartz S.R., Emerman M. Human immunodeficiency vims type 1 Tat induces apoptosis and increases sensitivity to apoptotic signals by up-regulating FLICE/Caspase-8 //J. Virol. 1999. - Vol.73. -P.956-1963.

44. Baughman G., Harrigan M. et al. Genes newly identified as regulated by glucocorticoids inmuribe thymocytes //Mol. Endocrinol. — 1991. — Vol.5. -P.637-644.

45. Beauvais F., Michel L. et al. The nitric oxide donors, acide and hidroxylamine, inhibit the programmed cell death of cytokine-deprived human eosinophils. //FEBS Lett. 1995. Vol. 361. - P.229-232.

46. Bess J.W., Gorelick Jr.R.J., Bosche W.J., Henderson L.E. and Arthur L.O. Microvesicles are a source of contaminating cellular proteins found in purified HIV-1 preparations //Virology. 1997. - Vol.230. - P. 134-144.

47. Bettuzzi S., Troiano L. et al. //Biochem. Biophys. Res. Communs. 1991. -Vol.175.-P.810-815.

48. Bilello J.A., Stellrecht K., Drusano G.L., Stein D.S. Soluble tumor necrosis factor- receptor type II (sTNFRII) correlates with human immunodeficiency virus (HIV) RNA copy number in HIV-infected patients //J. Infect. Dis. -1996. Vol.173. -P.464-467.

49. Blanchard N., Lankar D., Faure F., Regnault A., Dumont C., Raposo G., Hivroz C. TCR activation of human T- cells induces the production of exosomes bearing the TCR/CD3/zeta complex //J. Immunol. -2002. — Vol. 168(7). -P.3235-3241.

50. Blanco J., Barretina J., Henson G. et al. The CXCR4 antagonist AMD3100 efficiently inhibits cell-surface-expressed human immunodeficiency virus type 1 envelope-induced apoptosis //Antimicrob. Agents Chemother. — 2000.- Vol.44. -P.51-56.

51. Bogdanov V.Y., Balasubramanian V., Hathcock J. et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein //Nat. Med. 2003. - Vol.9. - P.458-462.

52. Boldin M.P., Goncharov Y.V. et al. Involvement of MACH, a novel MORTl/FADD-interacting protease, in Fas/APO- and TNF receptor — induced cell death. //Cell. 1996. - Vol.85. - P.803-815.

53. Bolton L., Beom-Ik Hahn, Park E.A. et al. Death of CD4+ T-cell leines caused by immunodefficiency wirus type 1 does not depend on caspases or apoprosis //J. Virology 2002. - Vol.76. - P.5094-5107.

54. Bonderman D., Teml A. Jakowitsch J. et al. Coronary no-reflow is caused by shedding of active tissue factor from dissected atherosclerotic plaque //Blood. -2002. Vol.99 (8). - P.2794-2800.

55. Bossy-Wetzel E., Green D. Caspases induce cytochrome c release from mitochondria by activating cytosolic factors //J. Biol. Chem. 1999. — Vol.274. - P. 17484-17490.

56. Bredesen D.E. Neural apoptosis //Ann. Neurol. 1995. - Vol.38. - P.839-851.

57. Brunner T., Mogil R.J., LaFace D. et al. Cell-autonomous Fas (CD95)/Fas-ligand interaction mediates activation-induced apoptosis in T-cell hybridomas //Nature. 1995. - Vol.373. -P.441-444.

58. Bussolino F., Mitola S., Serini G., Barillari G., Ensoli B. Interactions between endothelial cells and HIV-1. //J. Biochem. Cell Biol. 2001. - Vol. 33.-P. 371-390.

59. Butcher E. C. and L. J. Picker. Lymphocyte homing and homeostasis //Science -1996. Vol.272 - P.60.

60. Buttner J., Dornmair K., Schramm H.J. Screening of inhibitors of HIV-1 protease using an Escherichia coli cell assay //Biochem. Biophy. Res. Comm. 1997. - Vol.233. - P.36-38.

61. Cai J., Yang J., Jones D.P. Mitochondrial control of apoptosis: the role of cytochrome c. //Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol.1366. -P.139-149.

62. Carbonari M., Cibati M. Detection and characterization of apoptotic peripheral blood lymphocytes in human immunodeficiency virus infection and cancer chemotherapy by a novel flow immunocytometry method. //Blood.- 1994. Vol.83. - P.1268-1277.

63. Castedo M., Hirsh T., Susin S.A. et al. Sequential acquisition of mitochondrial and plasma membrane alterations during early lymphocyte apoptosis. //J. Immunol. 1996. - Vol.157. - P.512-521.

64. Cheng J., Zhou T. et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by soluble form of the GAS molecule //Science 1994. - Vol.263. - P. 1759-1762.

65. Chinnaiyan A.M., Woffendin C., Dixit V.M., Nabel G.J. The inhibition of pro-apoptotic ICE-like proteases enhances HIV replication //Nat. Med. -1997.-Vol.3.-P.333-337.

66. Chiu L., Cherwinski H., Ransom J., Dunne J.F. Flow cytometric ratio analysis of the Hoeshst 33342 emission spectrum: multiparametric characterization of apoptosis lymphocytes. //J. Immunol. Methods. 1996. -Vol.189.-P.157-171.

67. Choi, J., D. R. Enis, K. P. Koh, S. L. Shiao, and J. S. Pober. T lymphocyte-endothelial cell interactions annual review of immunology //Annu. Rev. Immunol. -2004. Vol.22 - P.683-709.

68. Chollet-Martin S., Simon F., Matheron S. et al. Comparison of plasma cytokine levels in African patients with HIV-1 and HIV-2 infection //AIDS. 1994. -Vol.8. -P.879-884.

69. Chui V.K., Walsh C.M. et al. BcL-2 blocks degranulation but not Fas-based cell-mediated cytotoxicity //J. Immunol. 1995. - Vol.154. -P.2023-2029.

70. SO.Cicala C., Arthos J., Rubbert A. et al. HIV-1 envelope induces activation of caspase-3 and cleavage of focal adhesion kinase in primary human CD4 (+) T cells /Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol.97. - P. 1178-1183.

71. Clapham D.E. Calcium signalling //Cell. 1995. - Vol.80. - P.259-268.

72. Cohen J.J. Glucocrticoid-induced apoptosis in the thymus //Sem. Immunol. -1992.-Vol.4.-P.363-369.

73. Cohen O. J., A. Kinter, A. S. Fauci Host factors in the pathogenesis of HIV disease // Immunol Rev. 1997.- Vol. 159. - P.31-48.

74. Collins, K. L., B. K. Chen, S. A. Kalams, B. D. Walker, D. Baltimore 1998. HIV-1 Nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes Nature. 391:397-401.

75. Connor R.I., Chen B.K., Choe S., Landau N.R. Vpr is required for efficient replication of human immunodeficiency virus type 1 in mononuclear phagocytes //Virology. 1995. - Vol.206. - P.936-944.

76. Conti L., Rainaldi G., Matarrese P. et al. The HIV-1 vpr protein acts as a negative regulator of apoptosis in a human lymphoblastoid T cell line: possible implications for the pathogenesis of AIDS //J. Exp. Med. 1998. — Vol.187.-P.403-413.

77. Cossarizza A., Kalashnikova G. et al. Mithochondrial modifications during rat thymocyte apoptosis: a study at the single cell level //Exp. Cell Research. 1994. - Vol.214. - P.323-330.

78. Cossarizza A., Troiano L., Mussini C. Mitochondria and HIV infection: The first decade //J. Biol. Regul. and Homeostat.Agents. — 2002. Vol. 16, N1. -P. 18-24.

79. Curnow S.J., Barad M., Brun-Roubereau N., Schmitt-Verhulst AM. Flow-cytometric analysis of apoptotic and nonapoptotic T-cell receptor-transgenic thymocytes following in vitro presentation of antigen //Cytometry. 1994. -Vol.16.-P.41-48.

80. Dao T., Huleatt J., e.a. Specific resistance of T cells to CD95-induced apoptosis during S phase of cell cycle. //J. Immunol. — 1997. Vol.159. -P.4261-4267.

81. Darzynkiewicz Z., Staiano-Caco L., Melamed M.R. Increased mitochondrial uptake of rhodamine 123 during lymphocyte stimulation //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. - Vol.76. - P.2383-2387.

82. De Maeyer E., De Maeyer-Guignard J. Interferon- y //Current opinion in Immunol. 1992. Vol.4. - P.321-326.

83. Deacon, N. J., A. Tsykin, A. Solomon, K. Smith, M. Ludford-Menting, D. J. Hooker, D. A. McPhee, A. L. Greenway.1995. Genomic structure of an attenuated quasi species of HIV-1 from a blood transfusion donor and recipients, cience. 270:988-91.

84. Dezube B.J., Pardee A.B., Chapman B. Pentoxifylline decreases tumor necrosis factor expression and serum triglycerides in people with AIDS //J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. -1993. -Vol.6. -P.787-794.

85. Dias O., Dumont C. et al. Caspase-independent cell death induced by anti-CD2 or staurosporine in activated human peripheral T lymphocytes. //J. Immunol. 1998. - Vol.161. - P.3375-3383.

86. Dransfield I., Buckle A.M. et al. Neutrophil apoptosis is associated with a reduction in CD 16 (FcyRIII) expression //J. Immunol. 1994. - Vol.153. -P.1254-1263.

87. Dransfield I., Stocks S.C., Haslett C. Regulation of cell adhesion molecule expression and function associated with neutrophil apoptosis. //Blood. -1995. Vol.85. - P.3264-3273.

88. Du C., Fang M., Li Y., Li L., Wang X. Smack a mitochondrial protein that promotes cytochrome c dependent caspase activation by elimination IAP proteins //Cell. 2000. - Vol.102. - P.33-42.

89. Duke R.S., Cohen J.J. IL-2 addiction: withdrawal of growth factor activates a suicide program in dependent T cells //Limphokine Res. 1986. -Vol.5. -P.289-299.

90. Dunn A.I. Nitric oxide synthase inhibitors prevent the cerebral tryptophan an seotonergic responses to endotoxin and interluekin 1 //Neurosci. Res. Communs. 1993. -Vol.13, N.3.-P.149-156.

91. Enari M., Talanian W.W. et al. Sequential activation of ICE-like and CPP32-like proteases during Fas-mediated apoptosis //Nature. 1996. — Vol.380.-P.723-726.

92. Enari M., Talanian W.W. et al. Sequential activation of ICE-like and CPP32-like proteases during Fas-mediated apoptosis //Nature. — 1996. — Vol. 80.-P.723-726.

93. English H.F., Kuprianov N. et al. Relationship between DNA fragmentation and apoptosis in the programmed cell death in the rat prostate following castration //Prostate. 1989. - Vol.15. -P.233-250.

94. Epperson D. E., J.S. Pober. Antigen-presenting function of human endothelial cells: direct activation of resting CD8+ T cells. // J.Immunol. -1994.-Vol. 153.-P. 5402-5410.

95. Fadok V.A., Savill J.S., Haslett C. et al. Different populations of macrophages receptor or the phosphatidylserine receptor to recognize and remove apoptotic cells //J. Immunol. 1992. - Vol.149. -P.4029.

96. Fadok V.A., Voelker D.R. et al. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages //J. Immunol. 1992. - Vol.148. - P.2207-2216.

97. Fauci A. S. The human immunodeficiency virus: infectivity and mechanisms of pathogenesis //Science 1988. — Vol.239. P.617-622.

98. Fauci, A. S. Host factors and the pathogenesis of HIV-induced disease // Nature. 1996.- Vol. 384. - P. 529-534.

99. Finzi D., Blankson J., Siliciano J.D. et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy //Nat. Med. 1999. - Vol.5. - P.512-517.

100. Fleischer B. CD26: A surface protease involved in T-cell activation //Immunol. Today. 1994. - Vol.4. -P.180-184.

101. Frassantino M.A., Silvestris F. et.al. Fas/FasL-deregulated apoptosis and IL-6 insensitivity in highly malignant myeloma cells //Clin. Exp. Immunol. 1998.-Vol.114.-P.179-188.

102. Frey T. Correlated flow cytometric analysis of terminal events in apoptosis reveals the absence of some changes in some model systems //Cytometry. 1997. - Vol.28. - P.253-263.

103. Froelich C.J., Dixit V.M. et al. Lymphocyte granule-mediated apoptosis: matters of viral mimicry and deadly proteases //Immunology Today. 1998. -Vol.19. -P.30-36.

104. Gallo R.C. Tat as one key to HIV-induced immune pathogenesis and Pat toxoid as an important component of a vaccine //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.96. - P.8324-8326.

105. Gandhi R., Chen B., Straus S. et al. HIV-directly kills CD4+ T cells by Fas-independent mechanism //J. Exp. Med. 1998. - Vol.187. - P.1113-1122.

106. Garcia, J. V., and A. D. Miller 1991. Serine phosphorylation-independent downregulation of cell-surface CD4 by Nef. Nature. 350: 508-511.

107. Garsia-Ruiz G, Cotell A. et.al. //J. Biol. Chem. 1997. - Vol.272. -P.11369-11273.

108. Gavrieli Y., Sherman Y. et al. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation //J. Cell. Biol. — 1992. -Vol.119.-P.493-501.

109. Gervaix A., D. West, L.M. Leoni, DD. Richman F. Wong-Staal, J. Corbeil 1997. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 94: 4653-4658.

110. Gougeon M.-L., Montagnier L. Apoptosis in AIDS //Science. 1993. -Vol.260.-P.1269-1270.

111. Griffith T.S., Ferguson T.A. The role of FasL-induced apoptosis in immune privilege //Immunol. Today. 1997. Vol.18. - P.240-244.

112. Groux H., Torpier G. et al. Activation-induced death by apoptosis in CD4+ T cells from human immunodeficiency virus-infected asymptomatic individuals. //J. Exp. Med. 1992. - Vol.175. - P.331-340.

113. Hadida F., Vieillard V., Mollet L., Clark-Lewis I., Baggiolini M., Debre P. Cutting edge: RANTES regulates Fas ligand expression and killing by HIV-specific CD8 cytotoxic T cells //J. Immunol. 1999. - Vol.163. - P. 11051109.

114. Hartnell A., Robinson D.S., Kay A.B., Wardlaw A.J. CD69 is expressed by human eosinophils activated in vivo in asthma and in vitro by cytokines //Immunology 1993.-Vol.281.-P. 281-286.

115. Hayry P., E. von Willebrand and L. C. Andersson. Expression of HLAABC and -DR locus antigens on human kidney endothelial, tubular and glomerular cells //Scand. J. Immunol. 1980. - Vol.11 -P.303.

116. He J. Human immunodeficiency virus type 1 protein R (vpr) arrests cells in the G2 phase of the cell cycle by inhibiting p34cdc2 activity //J. Virol. -1995. Vol.69. - P.6705-6711.

117. Herbein G., Mahlknecht U., Batliwalla F. et al. Apoptosis of CD8+ T cells is mediated by macrophages through interaction of HTV gpl20 with chemokine receptor CXCR4. Nature. 1998;395:189-194

118. Herbein G., van Lint., Lovett J., Verdin E. Distinct mechanisms trigger apoptosis in guman immunodefeciency virus type 1-infected and uninfected bystander T lymphocytes //J. Virology. 1998. -.Vol.72. - P.660-670.

119. Higashimoto I., Chihara J. et al. Regulation of eosinophil cell death by adhesion to fibronectin //Int. Arch. Allergy Immunol. 1996. - Vol. 111. -P.66-69.

120. Hockenbery D.M., Oltavai Z.N. et al. BcL-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis //Cell. 1993. - Vol.75. - P.241-251.

121. Holme P.A., Muller F., Solum N.O. et al. Enchanced activation of platellets with abnormal release of RANTES in human immunodificiency virus type 1 infection//The FASEB J. 1998. -Vol.12. - P.79-90.

122. Houenou L.J., Turner P.L. et.al. A serine protease inhibitor, protease neoxin 1. Rescues motoneurons from naturally eccuring and axotomy-induced cell death //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol.92. - P.895-899.

123. Hrimech M., Yao X-J., Bachand F., Rougeau N., Cohen E.A. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) vpr functions as an immediate-early protein during HIV-1 infection //J. Virol. 1999. - Vol.73. - P.4101-4109.

124. Huang M.B., Jin L.L., James C.O., Khan M., Powell M.D., Bond V.C. Characterization of Nef-CXCR4 interactions important for apoptosis induction //J. Virol. 2004. - Vol.78. - P. 11084-11096.

125. Huang Y., Zhang L., Ho D.D. Characterization of nef sequences in a long-term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection //J. Virol. 1995.-Vol.69.-P.93-100.

126. Huang Y., Zhang L., Ho DD 1995. Characterization of nef sequences in a long-term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection. J. Virol. 69: 93-100

127. Itoh K., Hirohata S. The role of IL-10 in human B cell activation, proliferation, and differentiation //J. Immunol. 1995. - Vol.154. - P.4341-4350.

128. Jacobson M.D., Weil M., Raff M.C. Programmed cell death in animal development //Cell. 1997. - Vol.88. - P.347-354.

129. Jacobson M.D., Raff M.C. Programmed cell death and Bcl-2 protection in very low oxygen //Nature 1995. - Vol.374. - P.814-821.

130. Jacotot E., Ravagnan L., Loeffler M. et al. The HIV-1 viral protein R induces apoptosis via a direct effect on the mitochondrial permeability transition pore //J. Exp. Med. 2000. -Vol.191. - P.33-45.

131. James C. O., Huang M.-B., Khan M. et al. Extracellular Nef protein targets CD4+ T cells for apoptosis by interacting with CXCR4 surface receptors //J. Virol. 2004. - Vol.78. - P.3099-3109.

132. James C.O., M-B. Huang., M. Khan., M. Garcia-Barrio, M.D. Powell, V.C. Bond. 2004. Extracellular Nef protein targets CD4+ T cells for apoptosis by interacting with CXCR4 surface receptors. J. Virol. 78: 3099-3109.

133. Jamieson, B. D., G. M. Aldrovandi, V. Planelles, J. B. Jowett, L. Gao, L. M. Bloch, I. S. Chen, J. A. Zack 1994. Requirement of human immunodeficiency virus type 1 nef for in vivo replication and pathogenicity J Virol. 68:3478-3485.

134. Janeway C.A. Thymic selection: two pathways to life and two to death //Immunity 1994. - Vol. 1. - P.3-6

135. Jeremias I., Herr I., Boehler T., Debatin K.M. TRAIL/Apo-2-ligand-induced apoptosis in human T cells //Eur. J. Immunol. -1998. — Vol.28. — P.143-152.

136. Johnson N., Parkin J.M. Anti-retroviral therapy reverses HIV-associated abnormalities in lymphocyte apoptosis //Clin. Exp. Immunol. — 1998. -Vol.113.-P.229-234.

137. Johnson V.A., Byington R.E. Quantitative assays for virus infectivity //In Techniques in HIV research, Stockton Press, London, UK, 1990. -P.71.

138. Kameoka M., Suzuki S., Kimura T. et al. Exposure of resting peripheral blood T cells to HTV-1 particles generates CD25+ killer cells in a small subset, leading to induction of apoptosis in bystander cells //Int. Immunol. — 1997. -Vol.9. —P.1453-1462.

139. Kaneko H., Saito K. et al. Preferential elimination of CD28+ T cells in CLE and the relation with activation-induced apoptosis //Clin. Exp. Immunol. 1996. - Vol. 106. - P.218-229.

140. Katsikis P.D., Wunderlich E.S., Smith C.A., Herzenberg L.A., Herzenberg L.A. Fas antigen stimulation induces marked apoptosis of T lymphocytes in human immunodeficiency virus-infected individuals //J. Exp. Med. — 1995. -Vol.181.-P.2029-2036.

141. Kennedy N., Kataoka T., Tschopp J., Budd R.C. Caspase activation is required for T cell proliferation //J. Exp. Med. 1999. - Vol.190. - P. 18911895.

142. Kerr J.F.R., Wyllie A.H. et all. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. // Br. J. Cancer. 1972. — Vol.26.-P.239-257.

143. Kestler H.W., Ringler D.J., Mori K. et al. Importance of the nef gene for maintenance of high virus loads and for development of AIDS //1991. — Vol.65. -P.651-662.

144. Kestler, H. W., D. J. Ringler, K. Mori, D. L. Panicali, P. K. Sehgal, M. D. Daniel, R. C. Desrosiers 1991. Importance of the nef gene for maintenance of high virus loads and for development of AIDS. 65:651-662.

145. Kim J., Schimming A.W. et al. Ligation of FcyRII (CD32) pivotally regulates survival of human eosinophils //J. Immunol. 1999. - Vol.162. -P.4253-4259.

146. Kirchhoff, F., T. C. Greenough, D. B. Brettler, J. L. Sullivan, R. C. Desrosiers 1995. Brief report: absence of intact nef sequences in a long-term survivor with non-progressive HIV-1 infection N Engl J Med. 332:228-232.

147. Kitajima J., Kawahara K. et al. Nitric oxide-mediate apoptosis in murine mastocytoma //Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994. - Vol.204. - P.244-251.

148. Knijff-Dutmer E.A., Koerts J., Nieuwland R. et al. Elevated levels of platelet microparticles are associated with disease activity in rheumatoid arthritis //Arthritis Rheum. 2002. - Vol.46 (6). - P. 1498-503.

149. Kojima H., Eshima K., Takayama H., Sitkovsky MV. Leukocyte function-associated antigen-1 dependent lysis of Fas+ (CD95+/Apo-l+) innocent bystanders by antigen-specific CD8+ CTL //J. Immunol. 1997. — Vol.158.- P.2728-2734.

150. Koopman G., Reutelingsperger C.P.M. et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cellc undergoing apoptosis //Blood. 1994. - Vol.84. - P.1415-1420.

151. Krammer P. CD95's deadly mission in the immune system //Nature. — 2000. Vol.407. - P.789-795.

152. Kroemer G., Zamzani N., Susin S.A. Mitochondrial control of apoptosis //Immunology Today. 1997.-Vol.18 (1). -P.44-51.

153. Kuerbitz S.J., Plunkett B.S. et.al. Wild-type p53 is a cell cycle check point determinant following irradiation //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1992. — Vol.89.-P.7491-7495.

154. Kuida K., Lippke J.A., Ku G. et al. Altered cytokine export and apoptosis in mice deficient in interleukin-1 beta converting enzyme // Science. — 1995.- Vol.267.-P.2000-2003.

155. La Ferla F.M., Tinkle B.T., Bieberich C.J., Haudenschild C.C., Jay G. The Alzheimer's A beta peptide induces neurodegeneration and apoptotic cell death in transgenic mice //Nat Genet. 1995 Jan. - Vol. 9(1). - P.21-30.

156. Lam M., Dubyak G., Chen L. et al. Evidence that BcL-2 represses apoptosis by regulating endoplasmic reticulum-associated Ca fluxes //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. -P.6569-6573.

157. Lama, J., A. Mangasarian, D. Trono 1999. Cell-surface expression of CD4 reduces HIV-1 infectivity by blocking Env incorporation in a Nef- and Vpu-inhibitable manner Curr Biol. 9:622-631.

158. Laurent-Crawford A.G., Coccia E., Krust B., Hovanessian A.G. Membrane-expressed HIV envelope glycoprotein heterodimer is a powerful inducer of cell death in uninfected CD4+target cells //Res. Virol. 1995. -Vol.146.-P.5-17.

159. Laurent-Crawford A.G., Krust B., Riviere Y. et al. Membrane expression of HIV envelope glycoproteins triggers apoptosis in CD4 cells //AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1993. -Vol.9. - P.761 -773.

160. Le Rouzic E, Benichou S. The Vpr protein from HIV-1: distinct roles along the viral life cycle //Retrovirology. 2005. - Vol.22. - P. 11.

161. Levin A.J., Perry M.E. The role of the p-53 tumour-suppressor gene in tumorgenesis //Br. J. Cancer. 1994. - Vol.69. -P.409-416.

162. Levy J.A. Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection. Microbiol Rev. 1993. - Vol.57. - P. 183-289.

163. Lewis D.E., Ng Tang D.S., Adu-Oppong A., Schober W., Rodgers J.R. Anergy and apoptosis in CD8+ T cells from HIV-infected persons //J. Immunol. 1994.-Vol. 153 - P. 412.

164. Lewis D.E., Ng Tang D.S., Wang X., Kozinetz C. Costimulatory pathways mediate monocyte-dependent lymphocyte apoptosis in HIV //Clin. Immunol. 1999. - Vol.90. - P.302-312.

165. Li C.J., Friedman D.J., Wang C., Metelev V., Pardee A.B. Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein //Science. -1995. Vol.268. - P.429-431.

166. Li J., Eastman A. Apoptosis in interleukin-2-dependent cytotoxic T-lymphocyte cell line is associated with intracellular acidification //J.Biol. Chem. 1995. - Vol.270. - P.3203-3211.

167. Li P., Nijhawan D., Budihardjo I. et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade //Cell. 1997. - Vol.91. - P.479-489.

168. Liegler T.J., Yonemoto W., Elbeik T., Vittinghoff E., Buchbinder S.P., Greene W.C. Diminished spontaneous apoptosis in lymphocytes from human immunodeficiency virus-infected long-term nonprogressors //J. InfectDis. -1998.- Vol.178.-P.669-679.

169. Liepe B.A., Stone C., Koistinaho J., Copenhagen D.R. Nitric oxide synthase in Muller cells and neurons of salamander and fish retina //J. Neurosci. 1994. - Vol.14. -P.7641-7654.

170. Linsley P.S., J.A. Ledbetter. The role of CD28 receptor during T cell responses to antigen //Annu. Rev. Immunol. 1993. - Vol.11 — P.191-198.

171. Liu Z., Hultin L.E., Cumberland W.G. et al. Elavated relative fluorescence intensity of CD38 antigen expression on CD8+T Cells is a marker of prognosis in HIV infection:Results of 6 years of follow-up //Cytometry -1996.-Vol.26.-C.l-7.

172. Loetsher H., Pan J.C. et al. Molecular cloning and expression of the human 55 kd tumor necrosis factor receptor//Cell. 1990. - Vol. 61. -P.351-359.

173. Los M., Van de Craen Requirement of an ICE/CED-3 protease for Fas/APO-1-mediated apoptosis //Nature. 1995. - Vol.375. - P.81-83.

174. Lu Q.L., Hanby A.M. et al. BcL-2 protein localizes to the chromosomes of mitotic nuclei and is correlated with the cell cycle in cultured epithelial cell lines//J. Cell. Sci. 1994. - Vol.107. - P.363-371.

175. Lui Y., Cousin J.M. et al. Glucocorticoids promote nonphlogistic phagocytosis of apoptotic leukocytes //J. Immunol. 1999. - Vol.162. -P.3639-3646.

176. Macho A., Castedo M. et al. Mitochondrial disfunctions in circulating T lymphocytes from human immunodeficiency virus-1 carriers //Blood. -1996. Vol.86. - P.2481-2487.

177. Macho A., Decaudin D., Castedo M., Hirsch T., Susin S.A., Zamzami N., Kroemer G. Chloromethyl-X-Rosamine is an aldehyde-fixable potentialsensitive fluorochrome for the detection of early apoptosis //Cytometry. -1996.-Vol.25.-P.333-340.

178. Mack M., Kleinschmidt A., Brühl H., Klier C. et al. Transfer of the chemokine receptor CCR5 between cells by membrane-derived microparticles: a mechanism for cellular human immunodeficiency virus 1 infection //Nat. Med. 2000. - Vol.6. - P.769-775.

179. Mackay C. R. Dual personality of memory T cells //Nature 1999. -Vol.401 -P.659.

180. Mackey C., Imhof B. Cell adhesion in the immune system // Immunol. Today. 1993. - Vol.14. - P.99-104.

181. Maftah A., Peti J.M., Ratinaud M.H., Julien R. 10-N nonyl-acridine orange: a fluorescent probe which stains mitochondria independently of their energetic state. //Biochem. Biophys. Res. Communs. 1989. - Vol.164. -P.185-190.

182. Marchetti P., Castedo M. et al. Mithochondrial permeability pore transition is a central coordinating event of apoptosis //J. Exp. Med. 1996. - Vol.184. - P.1155-1160.

183. Marchetti P., Hirch T. et al. Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis //J. Immunol. 1999. - Vol.157. - P.4830-4836.

184. Martin S., Tesse A., Hügel B. et al. Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression //Circulation. 2004. - Vol.109. - P. 1653-1659.

185. Martin S J., Newmeyer D.D. Cell-free reconstitution of Fas-, UV radiation-and ceramide induced apoptosis //EMBO J. 1995. - Vol.14. - P.5191-5200.

186. Martin S.J., Reutelingsperger C.P., McGahon A.J. et al. Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl.

187. Maury C.P.J., Lahdevirta J. Correlation of serum cytokine levels with haematological abnormalities in human immunodeficiency virus infection //J. Intern. Med. 1990. - Vol.227. - P.253-257.

188. McCloskey T.W., Oyaizu N., Bakshi S., Kowalski R., Kohn N., Pahwa S. CD95 expression and apoptosis during pediatric HIV infection: early upregulation of CD95 expression //Clin. Immunol. Immunopathol. — 1998. Vol.87.-P.33-41.

189. McCloskey T.W., Oyaizu N., Kaplan M., Pahwa S. Expression of the Fas antigen in patients infected with human immunodeficiency virus //Cytometry. 1995. - Vol.22. - P. 111-114.

190. McConkey D.J., Nicoreta P. et al. Glucocorticoids activate a suicide process in thymocytes throught an elevation of cytosolic Ca concentration //Arch. Biochem. Boiphys. 1989. - Vol.269. - P.365-370.

191. Meagher L.C., Cousin J.M., et al. Opposing effects of glucocorticoids on the rate of apoptosis in neutrophilic and eosinophilic granulocytes //J. Immunol. 1996.- Vol.156. - P.4422-4428.

192. Mellors J.W., Munoz A., Giorgia J.V. Plasma viral load and CD4 lymphocytes as prognostic markers of HIV-1 infection //Ann. Intern. Med. -1997. Vol.126. - P.946-954.

193. Mellors J.W., Rinaldo C.RJr., Gupta P., White R.M., Todd J.A., Kingsley L.A. Prognosis in HIV-1 infection predicted by the quantity of virus in plasma //Science. 1996. - Vol.272. - P. 1167-1170.

194. Memon S.A., Moreno М.В. et al. BcL-2 blocks glucocorticoid- but not Fas- or activation-induced apoptosis in a T-cell hybridoma //J. Immunol. 1995.-Vol. 155.-P.4644-4652.

195. Memon S.A., Moreno M.B. et al. BcL-2 blocks glucocorticoid- but not Fas- or activation-induced apoptosis in a T cell hybridoma //J. Immunol. 1995. Vol. 155. - P.4644-4652.

196. Meyaard L., Otto S., Jonker R.R., Mijnster MJ., Keet R.P., Miedema F. Programmed death of T cells in HIV-l infection //Science. 1992. -Vol.257.-P.217-231.

197. Migliorati G., Pagliacci M. et al. Glucocorticoid-induced apoptosis in mouse natural killer cells and cytotoxic T-lymphocytes //Immunology. — 1994. Vol.81.-P.21-26.

198. Mignon-Godefroy K., Rott O. et al. Curative and protective effects of IL-10 in experimental autoimmune thyroiditis (EAT). Evidence for IL-10-enchanced cell death in EAT //J. Immunol. 1995. - Vol.154. - P.6634-6643.

199. Moreira A.L., Sampaio E.P., Zmuidzinas A. Thalodomide exerts its inhibitory action on tumor necrosis factor alpha by enhancing mRNA degradation.//J. Exp. Med. 1993.-Vol.177.-P.1675-1680.

200. Moutouh L., Estaquier J., Richman D.D., Corbeil J. Molecular and cellular analysis of human immunodeficiency virus-induced apoptosis in lymphoblastoid T-cell-line-expressing wild-type and mutated CD4 receptors //J.Virol. 1998. - Vol.72. -P.8061-8072.

201. Mower D.A., Peckham D.W. et al. Decreased membrane phospholipid packing and decreased cell size precede DNA cleavage in mature mouse В cell apoptosis //J. Immunol. 1994. - Vol.152. - P.4832-4842.

202. Murray A.G., Libby P., Pober J.S. Human vascular smooth muscle cells poorly co-stimulate and actively inhibit allogeneic CD4+ T cell proliferation in vitro//J Immunol.- 1995-Vol. 154-P. 151-161.

203. Muthumani K., Choo A.Y., Premkumar A. et al. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Vpr-regulated cell death: insights into mechanism //Cell Death Differ. 2005. Vol.12. - P.962-970.

204. Muzio M., Chinnaiyan F.C. et al. FLICE, a novel FADD-homologous ICE/CED3-like protease is recruited to the CD95 (Fas/APO-1) death-inducing signaling complex //Cell. 1996. - Vol.85. - P.817-827.

205. Nagahara Y., Ikekita M. et al. Immunosuppressant FTY720 induces apoptosis by direct induction of permeability transition and release of cytochrome c from mitochondria //J. Immunol. — 2000. Vol.165. — P.3250-3259.

206. Neefjes J., Momburg F. Cell biology of antigen presentation // Curr. Opion Immunol. 1993. - Vol.5 -P.27-39.

207. Newton K., Harris A. et al. A dominant interfering mutant of FADD/MORT1 enhances deletion of autoreactive thymocytes and inhibits proliferation of mature T lymphocytes //EMBO J. 1998. - Vol. 17. -P.706-718.

208. Nicholson D.W., Thornberry N.A. et al Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis //Nature. — 1995. -Vol. 376. -P.37-43.

209. Nicoletti I., Migliorati G. et al. A rapid simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry //J. Immunol. Methods. 1991. - Vol.139. - P.271-279.

210. Nicotera P., Zhivotovsky B. et al. Nuclear calcium transport and the role of calcium in apoptosis //Cell. Calcium. 1994. - Vol.16. - P.279-288.

211. Nishikava K., Morii T. et al. //J. Allergy Clin. Immunol. 1992. - Vol.90. -P.379-387.

212. Noraz N., Gozlan J., Corbeil J., Brunner T., Spector S. HTV-induced apoptosis of activated primary CD4+ T lymphocytes is not mediated by Fas-Fas ligand //AIDS. 1997. - Vol.11. - P. 1671-1680.

213. Nossal G.J.V. Negative selection of lymphocytes //Cell. 1994. - Vol.76. -P.229-239.

214. O'Brien W.A., Hartigan P.M., Martin D. et al. Changes in plasma HIV-1 RNA and CD4 lymphocyte counts and the risk of progression to AIDS //N. Engl. J.Med. 1996. —Vol.334. -P.426-431.

215. Ormerod MG. Flow cytometric studies of apoptosis //CMB. 1994. -Vol.1.-P.35-43.253.0rrenius S., Nicotera P. The calcium ion and cell death //J. Neural.

216. Pardi R., Inverardi L., Bender J. Regulatory mechanisms in leucocyte adhesion //Immunol. Today. 1992. - Vol. 13. - P.224-230.

217. Perrin-Wolff M., Bertoglio J. et al. Structure-activity relationships in glucocorticoid-induced apoptosis in T lymphocytes //Biochem. Pharmacol. -1995. -Vol.50. -P.103-110.

218. Petit P.X., Le Cocuer H. et al. Alterations of mitochondrial structure and function are early events in dexamethasone-induced thymocyte apoptosis //J. Cell. Biol. 1995. - Vol.130. - P.157-167.

219. Phenix B.N., Angel J.B., Mandy F. et al. Decreased HIV-associated T cell apoptosis by HIV protease inhibitors //AIDS Res. Hum. Retroviruses. — 2000. -Vol.16. -P.559-567.

220. Phenix B.N., Beckett B., Alam A. et al. HIV protease induces apoptosis of HIV infected T cells through activation of caspase 8 //Eighth. Annual. Canadian Conference of HIV/AIDS Research. Victoria, British Columbia, 1999.- Abstract 409.

221. Phenix B.N., Cooper C., Owen C., Badley A. D. Modulation of apoptosis by HIV protease inhibitors //Apoptosis. 2002. - Vol.7. - P.295-312.

222. Pober J. S. Immunobiology of human vascular endothelium // Immunol Res. 1999. - Vol. 19- P. 225-232.

223. Pober J. S., Collins M. A., Gimbrone Jr., P. Libby and C. S. Reiss. Inducible expression of class II major histocompatibility complex antigens and the immunogenicity of vascular endothelium //Transplantation 1986. -Vol.41 -P.141.

224. Pober J.S., Ma W., Biedermann B., Libby P. Vascular cells have limited capacities to activate and differentiate T-cells: implications fro transplant vascular sclerosis // Transplant Immunology 1997- Vol. 5. - P. 251-254.

225. Poli G., Kinter A., Justement J.S. Tumour necrosis factor functions in an autocrine manner in the induction of human immunodeficiency virus expression //Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol.87. - P.782-785.

226. Poon B., Grovit-Ferbas K., Stewart S.A., Chen ISY. Cell cycle arrest by vpr in HTV-l virions and insensitivity to antiretroviral agents //Science. — 1998. Vol.281. - P.266-269.

227. Radvany L.G., Shi Y. et al. CD28 costimulation inhibits TCR-induced apoptosis during a primary T cell response //J. Immunol. — 1996. Vol.156. -P.1788-1798

228. Rapaport E., Casella C., Ikle D., Mustafa F., Isaak D., Finkel T. Mapping of HIV-1 determinants of apoptosis in infected T cells //Virology. — 1998. -Vol.252. P.407-417.

229. Rebollo A., Pitton C. et al. A role for the intermediate affinity IL-2R in the protection against glucocorticoid-induced apoptosis //Immunology. -1995. -Vol.84. N.3. — P.388-395.

230. Reid S., Penna G., Adorini L. The control of T-cell responses by dendrtic cells subsets // Curr. Opion Immunol. 2000. - Vol.12 - P. 114-121.

231. Rittmaster R.S., Manning A.P. et al. Evidence for atrophy and apoptosis in the ventral prostate of rats given the a-reductase inhibitor finasteride //Endocrinology. 1995. - Vol.136. -P.741-748.

232. Rogers H., Tripp C., Unanue E. Different stages in the natural and acquired resistance to an intracellular pathogen //The Immunologist. -1995. — Vol.3. -P.152-155.

233. Ross, T. M., A. E. Oran, B. R. Cullen 1999. Inhibition of HIV-1 progeny virion release by cell-surface CD4 is relieved by expression of the viral Nef protein Curr Biol. 9:613-621.

234. Rothbard J., Gefter M. Interaction between immunogenic peptides and MHC proteins //Annu. Rev. Immunol. 1991. - Vol.9 - P.527- 535.

235. Rozmyslowicz T., Majka M., Kijowski J. et al. Platelet- and megakaryocytederived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV //AIDS. -2003. Vol.17. — P.33—42.

236. Russel J.H., White C.L. et al. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. -Vol.88.-P.2151-2155.

237. Saikumar P., Dong Z., Weinberg J.M., Venkatachalam M.A. Mechanisms of cell death in hypoxia/reoxygenation injury //Oncogene. 1998. - Vol.17 (25). -P.3341-9.

238. Sallusto F., D. Lenig, R. Forster, M. Lipp and A. Lanzavecchia. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions //Nature 1999.- Vol.401 -P.708.

239. Savil J., Fadok V. Phagocyte recognition of cells ubdergiong apoptosis //Immunol. Today. 1993. - Vol.14. - P. 131-137.

240. Scales D., Ni H., Sahheen F., Capodici J., Cannon G., Weissman D. Nonproliferating bystander CD4+ T cells lacking activation markers support HIV replication during immune activation //J. Immunol. 2001. - Vol.166. -P.6437-6433.

241. Scheglovitova O., M.R. Capobianchi, G. Antonelli, D. Guanmu, F. Dianzani. CD4-positive lymphoid cells rescue HIV-1 replication from abortively infected human primary endothelial cells. // Arch. Virol. 1993. -Vol. 132. - P. 267-280.

242. Schlossmann S., Boumsell L., Gilks W. et al. Leucocyte typing IV: White cell differentiation antigens //Oxford University Press, New York, 1995.

243. Schmidt I., Uittenbogaart C. et al. Sensitive method for measuring apoptosis and cell surface phenotype in human thymocytes by flow cytometry //Cytometry. 1994. - Vol.15. - P. 12-20.

244. Schuler M., Bossy-Wetzel E. et al. P-53 induced apoptosis by caspases activation through mitochondrial cytochrome c release //J. Biol. Chem. -2000. Vol.275 (10). -P.7337-7342.

245. Schwartz, O., V. Marechal, S. Le Gall, F. Lemonnier, J. M. Heard 1996. Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein Nat Med. 2:338-342.

246. Shimizu S., Eguchi Y., Kosaka H. et al. Prevention of hypoxia-induced cell death by Bcl-2 and Bcl-xL //Nature. 1995. - Vol.374. - P.811-813.

247. Silvetris F., Camarda G., Cafforio P., Dammacco F. Upregulation of Fas ligand secretion in non-lymphopenic stages of HIV-1 infection //AIDS. — 1998. -Vol.12.-P.1103-1118.

248. Simmons, A., V. Aluvihare, A. McMichael 2001. Nef triggers a transcriptional program in T cells imitating single-signal T cell activation and inducing HIV virulence mediators Immunity. 14: 763-77.

249. Sperber K., Beuria P., Singha N., Gelman I., Cortes P., Chen H., Kraus T. Induction of apoptosis by HIV-1-infected monocytic cells //J. Immunol. — 2003. Vol.170 -P.1566-1578.

250. Spinozzi F., Agea E. et al. T- lymphocytes bearing the gamma delta T cell receptor are susceptible to steroid-induced programmed cell death //Scand. J. Immunol. 1995. - Vol.41 (5). -P.504-508.

251. Srivastava R.K., Sasaki C.Y., Hardwick J.M., Longo D.L. Bcl-2-mediated drug resistance: inhibition of apoptosis by blocking nuclear factor of activated T lymphocytes (NFAT)-induced Fas ligand transcription //J. Exp. Med. 1999. - Vol.190. -P.253-265.

252. Stoeckler J.D., Stoeckler H.A., Kouttab N. et al. 1,2,5-Dihydroxyvitamin D3 Modulates CD38 Expression on human lymphocytes //J. Immunol. — 1996. Vol.157. - P.4908-4917.

253. Strack P.R., West Frey M., Rizzo C.J. et al. Apoptosis mediated by HIV protease is preceded by cleavage of Bcl-2 //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. Vol.93. - P.9571-9576.

254. Strasser A., Harris A.W. et al. BcL-2 and Fas/APO-1 regulate distinct pathways to lymphocyte apoptosis //EMBO J. 1995. - Vol.14. - P.6136-6147.

255. Suda T., Hashimoto H., Tanaka M., Ochi T., Nagata S. Membrane Fas ligand kills human peripheral blood T lymphocytes, and soluble Fas ligand blocks the killing //J. Exp. Med. 1997. - Vol.186. - P.2045-2050. •

256. Susin S.A., Zamzani N. The central executioner of apoptosis: multiple connections between protease activation and mitochondria in Fas/APO-1/CD95 and ceramide-induced apoptosis //J. Exp. Med. - 1997. - Vol.186. - P.25-37.

257. Susin S.A., Zamzani N. BcL-2 inhibits the mithochondrial release of an apoptogenic protease//J. Exp. Med. 1996.-Vol.184.-P.1331-1341

258. Sutterwala F., Mosser D. The taming of IL-12: suppressing the production of proinflamatory cytokines //J.Leukoc. Biol. 1999. - Vol.284. - P.543-551.

259. Sutterwala F., Mosser D. The taming of IL-12: suppressing the production of proinflammatory cytokines //J. Leukoc. Biol. — 1999. Vol.65 — P.543-551.

260. Swat W., Ignatowicz K. et al. Detection of apoptosis in immature CD4+8+ thymocytes by flow cytometry //J. Immunol. Methods. 1991.- Vol.137. -P.79-87.

261. Tanaka Y., Schroit A.J. Insertion of fluorescent phosphatidylserine into the plasma membrane of red blood cells. Recognition by autologous macrophages//J. Biol. Chem. 1983. - Vol.258. -P.l 1335-11343.

262. Tenniswood M.P., Guenette R.S. Active cell death in hormone-dependent tissue//Cancer Metastasis. Rev. 1992. - Vol.11. -P.197-220.

263. Terenzi F., Diaz-Guerra M.S. et al. Bacterial lipopeptides induced nitric oxide synthase and promote apoptosis through nitric oxide-independent pathways in rat macrophages //J. Biol. Chem. 1995. - Vol.270. - P.6017-6021.

264. Tilly J.L., Tilly K.J. Inhibitors of oxidative stress mimic the ability of follicle stimulating hormone to supress apoptosis in cultured rat ovarian follicles //Endocrinology. 1995. - Vol.136. -P.242-252.

265. Trauth B.C., Klass C. et al. Monoclonal antibody-mediated tumor regresion by induction of apoptosis //Science. 1989. — Vol.245. — P. 301305.

266. Trimble J.J., Salkowitz J.R., Kestler H.W. Animal models for AIDS pathogenesis //Adv. Pharmacol. 2000. - Vol.49. - P.479-514.

267. Vercammen D., Brouckaert G. et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways //J. Exp. Med. 1998.-Vol.188. (5). -P.919-930.

268. Verhagen A. Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins //Cell. -2000.-Vol.102.-P.43-53.

269. Vocero-Akbani A.M., Heyden N.V., Lissy N.A., Ratner L., Dowdy S.F. Killing HIV-infected cells by transduction with an HIV protease-activated caspase-3 protein //Nat. Med. 1999. - Vol.5. - P.29-33.

270. Von Boehmer H. Thymic selection: a matter of life and death //Cell. -1994.-Vol.76.-P.219-228.

271. Walker R.E., Spooner K.M., Kelly G. et al. Inhibition of immunoreactive tumor necrosis factor- by a chimeric antibody in patients infected with human immunodeficiency virus type 1 //J. Infect. Dis. — 1996. — Vol.174. — P.63-68.

272. Walsh G., Wen B. et al. A role for FADD in T cell activation and development //Immunity. 1998. - Vol.8. - P.439-449.

273. Walsh G.M., Williamson M.L. et al. Ligation of CD69 induces apoptosis and cell death in human eosinophils cultured with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor //Blood. 1996. - Vol. 87(7) - P.2815-2821.

274. Watson S. R. and L. M. Bradley. The recirculation of naive and memory lymphocytes //Cell Adhesion Commun. 1998. - Vol.6 - P. 105.

275. Wei X., Ghosh S.K., Taylor M.E. et al. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection //Nature. 1995. -Vol.373. — P. 117-122.

276. Wesch D., Marx S., Kabelitz D. Monocyt-dependet death of freshly isolated T-lymphocytes: induction of phorbolester and mitogens and differential effects of catalase //J. Immunology 1998. - Vol.161 - P.1248-1256.

277. Wesselborg S., Janssen O., Kabelitz D. Induction of activation-driven death (apoptosis) in activated but not resting peripheral blood T cells //J. Immunol. 1993 - Vol.150. -P.4338-4345.

278. Wright S.C., Zhong J. et al. Inhibition of apoptosis mechanisms of tumor promotion //FASEB J. 1994. - Vol. 8. - P.654-660.

279. Yagi T., Sugimoto A., Tanaka M. et al. Fas/FasL interaction is not involved in apoptosis of activated CD4+ cells upon HIV-1 infection in vitro //AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1998. -Vol.18. -P.307-315.

280. Yang L.P., Riley J.L., Carroll R.G. et al. Productive infection of neonatal CD8+ T lymphocytes by HIV-1 //J. Exp. Med. 1998. Vol.187. - P.1139-1144.

281. Yang Y., Mercep M., Ware C.F., Ashwell J.D. Fas and activation-induced Fas ligand mediate apoptosis of T cell hybridomas: inhibition of Fas ligand expression by retinoic acid and glucocorticoids //J. Exp. Med. — 1995. — Vol.181.-P.1673-1682.

282. Yao X-J., Mouland A.J., Subbramanian R.A. et al. Vpr stimulates viral expression and induces cell killing in human immunodeficiency virus type 1-infected dividing Jurkat T cells //J. Virol. 1998. - Vol.72. - P.4686-4693.

283. Yeh W., Pompa J. et al. FADD essential for embryo development and signalling from some, but not all, inducers of apoptosis //Science. 1998. —1. Vol.279. -P.1954-1958.

284. Yoon, K., J. G. Jeong, S. Kim 2001. Stable expression of human immunodeficiency virus type 1 Nef confers resistance against Fas-mediated apoptosis AIDS Res Hum Retroviruses. 17:99-104.

285. Zamzani N., Marchetti P. et al. Inhibitors of permeability transition interfere with the disruption of the mitochondrial transmembrane potential during apoptosis //FEBS. 1996. - Vol.3. - P.53-57.

286. Zamzani N., Marchetti P. et al. Reduction of mithochondrial potential constitutes an early irreversible step of programmed lymphocyte cell death in vivo //J. Exp. Med. 1995. - Vol.181. - P. 1661-1672.

287. Zamzani N., Marchetti P. et al. Sequential reduction of mithochondrial transmembrane potential and generation of reactive oxygen species in early programmed cell death //J. Exp. Med. 1995. - Vol.182. - P.367-377.

288. Zamzani N., Susin S. et al. Mitochondrial control of nuclear apoptosis //J. Exp. Med. 1996. - Vol. 183. - P. 1533 -1544.

289. Zauli G., D. Gibellini, P. Secchiero. 1999. Human immunodeficiency virus type 1 Nef protein sensitizes CD4(+) T lymphoid cell to apoptosis via functional upregulation of the CD95/CD95 ligand pathway. Blood.93:1000-1010.

290. Zhang J., Cado D. et al. Fas-mediated apoptosis and activation-induced T-cell proliferation are defective in mice lacking FADD/Mortl //Nature. — 1998. Vol.392. - P.296-300.

291. Zhang L., Ramratnam B., Tenner-Racz K. Quantifying residual HIV-1 replication in patients receiving combination antiretroviral therapy //N. Engl. J.Med. -1999.-Vol.340.-P.1605-1613.

292. Zubiaga M., Munoz E. et al/ IL-4 and IL-2 selectively rescue Th cell subsets from glucocorticoid induced apoptosis//J. Immunol. —1992. -Vol.149. -P.107-112.* *

Информация о работе

Макарова, Маргарита Владимировна
доктора медицинских наук
Москва, 2011
ВАК 03.03.03

Диссертация

Роль различных типов антиген-презентирующих клеток в регуляции апоптоза лимфоцитов и репликации ВИЧ-1 при ВИЧ-инфекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы