Роль посттрансляционных модификаций в регуляции активностей протеасом при генотоксическом стрессе в клетках К562

Моисеева, Татьяна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль посттрансляционных модификаций в регуляции активностей протеасом при генотоксическом стрессе в клетках К562
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль посттрансляционных модификаций в регуляции активностей протеасом при генотоксическом стрессе в клетках К562"

На правах рукописи

Моисеева

Татьяна Николаевна

РОЛЬ ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫХ МОДИФИКАЦИЙ В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТЕЙ ПРОТЕАСОМ ПРИ ГЕНОТОКСИЧЕСКОМ СТРЕССЕ

В КЛЕТКАХ К562

03.01.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 ОКТ

Санкт-Петербург 2010

004611263

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научные руководители: доктор биологических наук

Барлев Николай Анатольевич, Институт цитологии РАН,

кандидат биологических наук Миттенберг Алексей Георгиевич Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Корнилова Елена Сергеевна, Институт цитологии РАН,

доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович, НИИ экспериментальной медицины РАМН,

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный Университет, биолого-почвенный факультет

Защита диссертации состоится «22» октября 2010 года в 14 часов на заседании

Диссертациошюго совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. 4

e-mail: cellbio@maiI.cytspb.rssi.ru

Сайт: http://www.cytspb.rssi.ru

Факс: 8(812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан «20» сентября 2010 года

Ученый секретарь Диссертациошюго совета, кандидат биологических наук Е.В.Каминская

Общая характеристика работы Актуальность проблемы.

Регуляторы протеолитических активностей протеасом получили широкое применение в медицине в качестве противоопухолевых препаратов. Для лечения онкологических заболеваний используются различные ингибиторы протеасом: бортезомиб, эпоксимицин, лактацистин, салиноспорамиды, сиринголин и другие (Moore et al., 2008). Данные препараты способны специфически подавлять одну или несколько пептидазных активностей протеасом, изменяя спектр расщепляемых ими белковых субстратов. Однако в природе протеолитические активности протеасом также подвергаются тонкому регулированию при различных изменениях физиологического состояния клетки или стрессовых воздействиях. В этих случаях изменяется как субъедшшчный состав протеасом, так и спектр их постгрансляционцых модификаций.

Наиболее известным примером протеасомы с изменённым субъединичным составом может служить иммунопротеасома, в которой каталитические субъединицы pi, р2 и р5 заменены их индуцибельными аналогами pli, P2i и p5i, соответственно. Содержание в клетке таких протеасом увеличивается под воздействием иммуномодулятора гамма-интерферона. Пептидазные активности иммунопротеасомы существенно отличаются от таковых для обычной протеасомы, что приводит к более эффективному образованию пептидов для представления на молекулах главного комплекса гистосовместимости класса 1 (Tanaka and Kasahara, 1998). Кроме того, недавно появились данные о существовании тканеспецифичной субъединицы P5t, экспрессирующейся исключительно в тимоцитах. При включении такого белка вместо субъединицы Р5 трипсиноподобная активность протеасом существенно снижается, что позволяет говорить о специфической регуляции пептидазных активностей через изменение субъединичного состава протеасом (Murata et al., 2008).

субъединиц по лизинам (Choudhary et al., 2009) и N-концам (Claverol et al., 2002), гликозилирование (Zachara and Hart, 2004), 4-гидрокси-2-ноненил-алкилирование (Bulteau et al., 2001), миристилирование (Kirnura et al., 2003) и окисление серосодержащих аминокислот (Schmidt et al., 2006). Спектр модификаций изменялся при нейродегенеративных заболеваниях (Diaz-Hernandez et al., 2003; Gillardon et al., 2007), закупорке/реперфузии коронарных сосудов у крыс (Bulteau et al., 2001), возрастной атрофии мышц (Husom et al., 2004) и старении сетчатки у человека (Ethen et al., 2007), что может говорить о специфической регуляции функций протеасом с помощью постгрансляционных модификаций. Кроме того, дефосфорилирование аЗ и а.1 субъединиц протеасом приводило к снижению двух пептидазиых активностей протеасом (Mason et al., 1996), что тоже свидетельствует в пользу этой гипотезы.

Кроме перечисленных выше модификаций, субъединицы протеасом также могут подвергаться убиквитинилированию. На сегодняшний день существует только две публикации о наличии на протеасомных субъединицах остатков убиквитина (Denis et al., 2007; Meierhofer et al., 2008). Данные модификации были обнаружены в результате глобального скрининга убиквитинилированных белков, поэтому биологические функции этой модификации совершенно не исследованы. Между тем, убиквитинилирование способно не только направлять белки на расщепление по убиквитин-зависимому механизму (Glickman and Ciechanover, 2002), но и регулировать каталитические активности некоторых белков (Bienko et al., 2010; Yin et al., 2010), а также их внутриклеточную локализацию (Chen et al., 2009) и белок-белковые взаимодействия (Mosesson and Yarden 2006). Соответственно, необходимым представляется тщательное изучение роли убиквитинилирования субъединиц протеасом в регуляции их способности к расщеплению белковых субстратов и других функций в клетке.

Известно, что под действием доксорубицина происходит активация убиквитин-протеасомной системы расщепления белков па нескольких уровнях (Liu et al., 2008). В частности, повышаются пептидазные активности протеасом. Однако механизм регуляции данных активностей при действии на клетки доксорубицина остаётся неизученным. Исходя из этого, существенный интерес представляет исследование изменения спектра постгрансляционных модификаций субъединиц протеасом при повреждении ДНК доксорубицином и возможной связи этого изменения с регуляцией каталитических активностей протеасом.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось исследование влияния посттрансляционных модификаций на активности протеасом при воздействии на клетки доксорубицина. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ посттрансляционных модификаций субъединиц протеасом до и после индукции генотоксического стресса в клетках К562 доксорубицином.

2. Исследовать влияние генотоксического стресса, вызванного доксорубицином, на пептидазные активности протеасом из ядер и цитоплазмы клеток К562.

3. Исследовать влияние убиквитинилирования in vitro на пептидазные активности протеасом.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Субъединицы а5, аб, а7 и pi подвергаются убиквитинилированию в клетках К562.

2. При индукции повреждений ДНК в клетках К562 доксорубицином происходит изменение статусов фосфорилирования и убиквитинилирования субъединиц цитоплазматических протеасом.

3. При генотоксическом стрессе в клетках К562 происходит повышение пептидазных активностей протеасом.

4. Убиквитшшлирование in vitro способно изменять пептидазные активности протеасом.

Научная новизна полученных результатов.

В настоящей работе впервые показано, что субъедшшцы а5, аб, а7 и Р1 подвергаются убиквитинилированию в клетках проэритролейкемии человека линии К562.

Впервые выявлены изменения статусов фосфорилирования и убиквитинилирования цитоплазматических протеасом при индукции генотоксического стресса в клетках К562.

Впервые показано влияние убиквитинилирования субъединиц на пептидазные активности протеасом. Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы о специфической регуляции активностей протеасом с помощью поспрансляционных модификаций.

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные результаты свидетельствуют об изменении пептидазных активностей и спектра поспрансляционных модификаций протеасом при индукции доксорубицином генотоксического стресса в клетках К562. Кроме того, показано участие убиквитинилирования в регуляции каталитических активностей протеасом, что является важным результатом для дальнейшего исследования регуляции протеолитических активностей протеасом с помощью поспрансляционных модификаций. Данные об изменениях свойств протеасом при индукции повреждений ДНК в раковых клетках с помощью противоракового препарата (доксорубицина) могут использоваться в разработке новых подходов к лечению онкологических заболеваний с применением специфических шггибиторов протеасом и других терапевтических агентов.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 6 статей в рецензируемых журналах.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2008» (Казань, 2008), Политехнических симпозиумах «Молодые учёные -промышленности Северо-Западного региона» 2009 и 2010 года (Санкт-Петербург),

Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), 13-й и 14-й Международных Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009 и 2010), 34-м и 35-м конгрессах Европейского биохимического сообщества (Прага, 2009; Гётеборг, 2010) и 2-й конференции молодых учёных ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, 2010).

Финансовая поддержка работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты №08-04-00834 и №10-04-01234) и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на ■/ страницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит 1 таблицу и рисунков.

Материалы и методы исследований.

Клетки проэритролейкемии человека линии К562 (Lozzio, Lozzio, 1975), полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН), культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. Для индукции генотоксического стресса в культуральную жидкость добавляли доксорубицин (ДР) в концентрации 4 мкМ (Anand et al., 1995) и инкубировали клетки в течение 24 ч.

Выделение протеасом. Ядра и цитозоль выделяли согласно методу, описанному Константиновой и соавторами (1995). 26S протеасомы выделяли из постмитохондриального супернатанта цитозоля клеток или из ядерного экстракта с помощью центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (15-30%) и ионообменной хроматографии на DE целлюлозе (Hough et al., 1987).

Пептидазну ю активность протеасом трипсиноподобного типа определяли по степени гидролиза флуорогенного пептида Ac-Arg-Leu-Arg-AMC (BioMol, Великобритания), химотрипсиноподобного типа - по гидролизу N-Succinyl-Lue-Leu-Val-Tyr-AMC (BioMol, Великобритания), а каспазоподобного типа - по

гидролизу Z-Leu-Leu-Glu-AMC. Для этого 0.05 мкмоль субстрата инкубировали с 5 мкг протеасом в течение 45 мин при температуре 37 "С в буферном растворе, содержащем 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 5 мМ MgC12, 40 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.5 мМ АТФ. Реакцию останавливали, добавляя равный объем раствора, содержащего 70 мМ уксусной кислоты, 100 мМ хлорацетата натрия и 30 мМ ацетата натрия (Barret, 1980). Концентрацию продукта гидролиза (7-амино-4-метилкумарина) определяли на флуориметре (Туроверов и др., 1998), измеряя экстинкцию и эмиссию при длинах волн 365 и 440 нм соответственно (Barret, 1980).

Двухмерный электрофорез белков. Двухмерный электрофорез (2-ДЭ) белков проводили согласно инструкциям фирмы-зготовителя (GE Healthcare, США). Электрофорез во втором направлении проводили в 12%-ном ПААГ в стандартной системе Лэммли (Laemmli, 1970). Белки визуализировали при помощи окрашивания Coomassie.

Концентрацию белка в очищенных препаратах 26S протеасом определяли спектрофотометрически методом Брэдфорд (Bradford, 1976) и уравнивали пробы по количеству белка для дальнейших экспериментов. Вестерн-блоттинг проводили по стандартным методикам. Белки выявляли методом усиленной хемилгаминесценции (ECL), согласно инструкции фирмы-изготовителя SuperSignal Elisa Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, США). В качестве специфических антител использовали антитела к субъединицам протеасом а5, аб, а7, ßl (все BioMol, Великобритания). В качестве вторичных антител были использованы кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (Sigma, США).

Убиквитинилирование in vitro проводили с помощью набора для убиквитинилирования согласно инструкциям производителя (BioMol, Великобритания).

Масс-спектрометрия. Пятна, содержащие исследуемые белки, были вырезаны из геля и отмыты от Coomassie. Трипсинолиз белков в геле (Speicher et al., 2000) проводили с помощью автомата Multiprobe II Plus EX (Perkin Elmer, Великобритания). Перед масс-спетрометрией (MS) проводилась жидкостная хроматография (LC) на обратно-фазовой колонке, содержащей среду Acclaim РерМар (Dionex, Великобритания), а затем на обратно-фазовой колонке, содержащей Waters Symmetry CI8 100Е (Waters, Великобритания). Полученные фракции распылялись

непосредственно в масс-спектрометр 4000 Q-Trap (Applied Biosysíems, Великобритания). Спектр ионов, полученный в результате LC-MS/MS, обрабатывали с помощью поисковой программы MASCOT (Perkins et al., 1999) и базы данных UniProtKB/Swiss-Prot (The UniProt Consortium, 2009) с использованием соответствующих параметров. Рассматривались только те белки, для которых было обнаружено 3 и более пептида с р < 0.05.

Результаты и обсуждение.

Работа выполнена на модели генотоксического стресса в клетках проэритролейкемии человека линии К562. Повреждения ДНК вызывались добавлением в культуральную среду доксорубицина - противоопухолевого препарата антрациклинового ряда. Данный агент оказывает на клетки целый ряд воздействий: шггеркаляция в ДНК с последующим подавлением репликации, образование свободных радикалов, приводящее к повреждению ДНК и окислению липидов, образование межнитевых сшивок в ДНК и алкилирование нуклеотидов, ингибирование ДНК топоизомеразы II, приводящее к повреждению ДНК, и другие (обзор Gewirtz, 1999). Точный механизм терапевтического действия доксорубицина пока до конца не известен, поэтому изучение регуляции различных клеточных процессов имеет важное прикладное значение, в том числе и для борьбы с побочными эффектами при лечении онкологических заболеваний.

Для сравнения посттрансляционных модификаций субъединиц протеасом до и после индукции генотоксического стресса, изучаемые белки были разделены с помощью двухмерного электрофореза (рис. 1). Пятна, соответствующие субъединицам 20S протеасомы, были вырезаны из геля и проанализированы с помощью масс-спектрометрии.

Исследование показало, что субъединицы а5, аб и а7 подвергаются фосфорилированию в клетках К562 (табл. 1). Согласно литературным данным, фосфорилирование влияет на присоединение регуляторных комплексов к 20S протеасоме и на её протеолитические активности. В частности, дефосфорилирование субъединицы С8 (а7) при воздействии на клетки гамма-интерферона приводило к снижению концентрации 26S протеасом и повышению количества иммунопротеасом (Bose et al., 2004).Такие данные говорят о возможном участии фосфорилирования в

регуляции спектра расщепляемых белковых субстратов через изменение предпочтительных регуляторных комплексов, ассоциирующихся с протеасомой.

При воздействии доксорубицина происходило дефосфорилирование сайта 8ег250 субъединицы а7 ядерных протеасом, однако появлялась дополнительная модификация - фосфорилирование одного аминокислотного остатка в ^-концевой области. Перенос заряда с С-конца белка на его >1-конец может оказывать существенное воздействие на белок-белковые взаимодействия, что свидетельствует как о регуляции присоединения регуляторных комплексов, так и о возможном влиянии на доступ белковых субстратов в протеасому.

М, кДа 1) контроль

117 85 48

34 1 " г,-, абаб' XV

... «7 Р2 «4а4'.

а5 ♦ I* * - а! *

26 сх2* ос2'

р. - , ?5

М, кДа 2) доксорубицин

117 85 48 34

р2 «баб'

-05

р1 3 р1 10

Рис. 1. Двухмерный электрофорез субъединиц протеасом, выделенных из цитоплазмы контрольных клеток (1) и клеток, обработанных доксорубицином (2). Подписаны пятна, экстракты из которых были исследованы с помощью масс-спектрометрии.

Субъединица а7, согласно литературным данным (Ог1о\¥зк1 апс1 \¥Пк, 2003), является ключевым элементом в процессе убиквитин-независимого расщепления

протеасомой некоторых белков, поэтому изменение статуса её фосфорилирования также может приводить к изменению спектра субстратов, узнаваемых протеасомой по убиквитин-независимому механизму.

Индукция генотоксического стресса в клетках К562 также приводила к фосфорилированшо субъединицы а5 как цитоплазматических, так и ядерных протеасом. Значение данной модификации пока пе изучено, однако субъединица а5 известна как одна из двух субъединиц, отвечающих за РНКазную активность протеасом (Petit et al., 1997), поэтому фосфорилирование данного белка может участвовать в регуляции узнавания и расщепления протеасомой РНК-субстратов. Кроме того, согласно литературным данным, субъедшшца а5 обнаружена в клетке в свободном виде (Jorgensen and Hendil, 1999) и играет ключевую роль в процессе сборки а-кольца при созревании 20S протеасомы совместно с а7 (Hirano et al., 2005), поэтому её фосфорилирование может играть важную роль в создании гетерогенности популяции протеасом в клетке.

Таблица 1. Посггрансляционные модификации субъединиц протеасом, выделенных из цитоплазмы и ядер контрольных и обработанных доксорубицином клеток К562. Р -фосфорилирование, Ub - убиквитинилирование. Модификации подчёркнутых аминокислотных остатков выявлены впервые.

Субъединица ПТМ Цитоплазма Ядро

контроль доксорубицин контроль доксорубицин

а5 иь Lvsl96. Lys203

р Serl 6, Thr55, Ser56, Thr213/219 Thr55,Ser56

аб иь Lysl15 Lvs30, Lysl 15. Lys189. Lys208 Lysl15

р Tvr6. Thrl 1

а7 иь Lvs52

р Ser250 Ser250 Ser250 Фосфорилтоован I из 4 сайтов на участке 2-8

Р1 иь Lvs67

До настоящего момента на субъединице аб протеасом человека был обнаружен лишь один сайт фосфорилирования - 8ег14 (БерЬоиге Й а!., 2008). Под действием доксорубицина в ядерных протеасомах происходило присоединение фосфатных

групп к двум другим аминокислотам - Тугб и Thrl 1. Именно N-концевые области а-субъединиц образуют канал, через который происходит доступ белковых субстратов в протеасому (Groll et al., 2000), поэтому фосфорилирование субъединиц а5, аб и al на этих участках может свидетельствовать о специфической регуляции спектра белков, расщепляемых протеасомой с помощью дашшх посттрансляционных модификаций.

Другой важнейшей посттрансляционной модификацией, которой подвергаются субъединицы протеасом в клетках К562, является убиквитинилирование. Масс-спектрометрическое исследование позволило идентифицировать несколько сайтов убиквитинилирования на субъединицах а5, аб, а7 и ßl (табл. 1). Существует сравнительно небольшое количество литературных данных об убиквитинилировании субьединиц протеасом: были обнаружены 2 сайта убиквитинилирования аб (Meierhofer et al., 2008): Lysl 15 и Lys208, a также 1 сайт убиквитинилирования на al (Denis et al., 2007), однако большая часть масс-спектрометрических исследований протеасомы этих модификаций не выявила. Сложности с обнаружением убиквитинилирования протеасомы могут объясняться тем, что существует несколько деубиквитинилирующих ферментов, взаимодействующих с протеасомой (обзор Koulich et al., 2008), поэтому данная модификация может носить временный обратимый характер.

Согласно литературным данным, белок а5 является ключевым элементом в расщеплении протеасомами РНК (Petit et al., 1997; Kulichkova et al., 2010), a субъединицы al и ßl - в расщеплении белковых субстратов (al в убиквитин-независимом протеолизе (Orlowski et al., 2003), a ßl в осуществлении каспазоподобной активности (Tanaka, 2009)), поэтому независимое регулирование данных субъединиц в цитоплазме клеток вполне объяснимо. Однако конкретные функции убиквитинилирования компонентов 20S протеасомы пока остаются неясными.

Для подтверждения присутствия в клетках убиквитинилированных форм субъединиц а5 и а7 был проведён иммуноблоттинг клеточного экстракта, приготовленного из контрольных и обработанных доксорубицином клеток К562 в присутствии ингибитора деубиквитинилирующих ферментов леупептина, с использованием специфических антител к данным субъединицам. Данный

эксперимент показал наличие в клеточном экстракте дополнительных форм субъединиц а5 и а7, отличающихся от канонических по молекулярной массе, причём отличие приблизительно соответствовало молекулярной массе единичного убиквитина (8,5 кДа), что говорит о присутствии в клетках К562 моноубиквитинилированных форм данных субъединиц.

Рис. 2. Иммуноблотгинг клеточного экстракта, приготовленного из контрольных (К) и обработанных доксорубицином (Д) клеток К562 в присутствии ингибитора протеаз леупептина, с использованием антител к субъединицам а5, аб и а7. PS - протеасомы, выделенные из клеток К562 без использования леупептина

чётко видно обогащение моноубиквитинилированной изоформой после индукции генотоксического стресса, что соответствует данным, полученным с помощью масс-спектрометрического анализа. Масс-спектрометрия выявила два сайта убиквитинилирования на белке а5 из цитоплазматических протеасом после воздействия доксорубицина, однако данные вестерн-блоттинга говорят о том, что рассматриваемые модификации чаще всего не встречаются на одной и той же молекуле белка, а являются взаимоисключающими. Таким образом, можно говорить о том, что субъединицы а5 и а7 в клетках К562 подвергаются моноубиквитинилированию.

Обнаруженные в настоящей работе постгрансляционные модификации зависели не только от физиологического состояния клетки, но и от внутриклеточной локализации протеасом (табл. 1). Из литературных данных известно, что фосфорилирование субъединицы а2 протеасом крысы играло важную роль в определении ядерной локализации данного белка (Benedict et al., 1996), поэтому мы можем предполагать, что в клетках К562 осуществляется одии из двух вариантов рефляции: 1) локализация протеасом определяет спектр киназ и убиквитин-лигаз, модифицирующих их субъединицы; 2) модификация отдельных субъединиц

а5 аб а7

к д к д к д Кроме того, для субъединицы а5

приводит к изменению внутриклеточной локализации протеасом (импорту в ядро или экспорту в цитоплазму).

Моноубиквитилирование не приводит к направленному расщеплению белков протеасомами, а обычно регулирует каталитические активности, внутриклеточную локализацию или белок-белковые взаимодействия. Исходя из этого, мы предположили, что обнаруженные нами остатки убиквитипа могут влиять на способность протеасом к расщеплению белков. Для проверки влияния идентифицированных в данной работе посттрансляционных модификаций на протеолитическую активность протеасомы мы исследовали пептидазные активности протеасом, выделенных из цитоплазмы контрольных и обработанных доксорубицином клеток, с использованием флуорогенных пептидных субстратов (рис. 3).

Рис. 3. Сравнение пептидазных активностей протеасом, выделенных из контрольных и обработанных доксорубицином клеток К562 (белые столбики - контроль, штрихованные -доксорубицин)

Как ранее было показано, влияние доксорубицина на протеолитические активности протеасом зависит от его концентрации: концентрация 0.1 — 5 мкМ доксорубицина приводит к активации протеасом, а при 10 мкМ происходит ингибирование протеасом (Liu et al., 2008). В своей работе мы использовали доксорубицин в концентрации 4 мкМ, поэтому наши результаты о стимуляции протеолитической активности протеасом доксорубицином вполне соответствуют литературным данным. Однако остаётся до конца не изученным механизм регуляции протеолитических активностей протеасомы. Среди возможных вариантов -изменение субъединичного состава протеасом, различные посттрансляционные модификации и непосредственное связывание протеасомы с доксорубицином. Мы обнаружили, что при генотоксическом стрессе происходят изменения статуса

800 -------

600 -400 ■ - -200 —

каспзэо-подобная трипсино-подобная химотрипсино-

подобная

фосфорилирования и убиквитинилирования субъедиииц протеасом, поэтому не исключено, что именно посттрапсляционные модификации играют ключевую роль в регуляции пептидазных активностей протеасом при генотоксическом стрессе. Для проверки данной гипотезы мы исследовали влияние убиквитинилирования протеасом in vitro на их способность к расщеплению флуорогенных пептидных субстратов.

Для убиквитинилирования белкового субстрата необходимо последовательное действие нескольких ферментов. На первом этапе Е1 (убиквитин-активирующий фермент) переводит убиквитин в активное состояние. Затем убиквитин-конъюгирующий фермент Е2, действуя совместно с убиквитин-лигазой ЕЗ, распознаёт белковый субстрат и прикрепляет к нему убиквитин. Ферменты Е2 и ЕЗ высокоспецифичны для каждого субстрата.

Рис. 4. Убиквитинилирование протеасом с использованием различных ферментов Е2. Детектирование убиквитина

производилось с помощью стрептавидин-биотиновой стистемы. На двух крайних правых дорожках -контроли без добавления убиквитина и без добавления протеасом

XI ю

Ц- М.Ша

В реакции in vitro присоединение единичных молекул убиквитина к белкам-мишеням происходит и в отсутствие ЕЗ, который оказывается необходимым лишь для образования полиубиквитиновых цепей. Известно 30 различных ферментов Е2, различающихся своей специфичностью, которые могут экспрессироваться в клетках человека. Для того, чтобы определить Е2 ферменты, специфичные для субъединиц 20S протеасомы, мы провели соответствующий in vitro скрининг, используя в качестве субстрата для убиквитинилирования протеасомы, выделенные из клеток К562. Были проверены следующие Е2 ферменты: UbcHl, UbcH2, UbcH3, UbcH5a, UbcH5b, UbcH5c, UbcH6, UbcH7, UbcH8, UbcHIO, UbcHl3. Благодаря использованию биотинилированного рекомбинантного убиквитина, после электрофореза и переноса

на нитроцеллюлозную мембрану, убиквитинилированные белки можно было детектировать с помощью стрептавидин-биотиновой системы (рис. 4). Данный эксперимент показал, что наиболее эффективно убиквитинилирование происходило в присутствии Е2-ферментов UbcHl, UbcH2, UbcH3, UbcH5a, UbcH5b, UbcHÓ, UbcH7 или UbcH13. Аналогичный эксперимент с использованием коммерческого препарата 20S протеасом (BioMol, Великобритания) подтвердил специфичность данных Е2 по отношению к компонентам протеасомы.

Из литературных данных известно, что моноубиквитинилирование различных белков играет важную роль в регуляции мембранного транспорта, транскрипции (модификации гистонов) и почкования ретровирусов (Hicke, 2001). Кроме того, оно влияет на каталитические активности некоторых белков (ДНК-полимераза г) (Bienko et al., 2010), фосфолипаза DI (Yin et al., 2010)), что позволяет предположить, что в нашем случае моноубиквитинилирование также участвует в регуляции каталитических активностей протеасомы.

Рис. 5. Влияние убиквитинилирования протеасом при помощи убиквитин-кош>югирующих ферментов 11ЬсН1, иЬсН2, иЬсНЗ, 11ЬсН5а, иЬсН5Ь, иЬсНб, иЬсН7 и иЬсН13 на их химотрипсиноподобную активность. За единицу принята активность протеасом из

контрольных клеток до убиквитинилирования.

Исходя их вышесказанного, протеасомы, выделенные из клеток К562, были убиквитинилированы in vitro в присутствии следующих Е2-ферментов: UbcHl, UbcH2, UbcH3, UbcH5a, UbcH5b, UbcH6, UbcH7 и UbcH13. После этого производилось измерение их пептидазных активностей по отношению к флуорогенным пептидным субстратам (рис. 5). Эксперимент показал, что убиквитинилирование с помощью всех проверенных Е2-ферментов приводило к снижению химотрипсиноподобной активности протеасом на 50-80%.

Аналогичный эксперимент был проведён с использованием флуорогенного субстрата для исследования каспазоподобной активности протеасом до и после убиквитинилирования их субъединиц in vitro. Данные этого эксперимента указывают на то, что все проверенные Е2-ферменты вызывают подавление каспазоподобной активности протеасом на 70-85% (рис. 6) за счёт убиквитинилирования.

Рис. 6. Влияние убиквитинилирования протеасом при помощи убиквитин-конъюгирукнцих ферментов иЬсН1, иЬсН2, иЬсНЗ, иЬсН5а, иЬсН5Ь, иЬсНб, иЬсН7 и иЬсН13 на их каспазоподобиую активность. За единицу принята активности протеасом из

контрольных клеток до убиквитинилирования.

Пептидазные активности протеасом локализованы на трёх субъединицах бета-типа: субъединица р 1 отвечает за каспазоподобиую, р2 - за трипсиноподобную, а Р5 -за химотрипсиноподобную активности. Убиквитинилирование данных субъединиц вполне может изменять их конформацию, влияя на способность протеасом к расщеплению пептидов. Маловероятно, что убиквитин, ковалентно присоединенный к а-субъединицам протеасомы, непосредственно воздействует на сайты пептидазных активностей. Однако присутствие убиквитина на субъединицах а5, аб и а7 может регулировать доступ субстрата во внутреннюю камеру 20S протеасомы, где и происходит расщепление субстрата, а также влиять на присоединение рехуляторных комплексов, что тоже приводит к изменению спектра субстратов, расщепляемых протеасомой.

Суммируя результаты данной работы, можно говорить о том, что субъединицы pi, а5, аб и а7 подвергаются убиквитинилированию и фосфорилированию в клетках К562. Более того, при индукции генотоксического стресса в клетках К562 доксорубицином спектр посттрансляционных модификаций данных субъединиц существенно изменяется параллельно активации пептидазных активностей протеасом. Наши результаты также подтверждают гипотезу о регуляции активностей

протеасом с помощью постгрансляционных модификаций, в частности, с помощью присоединения убиквитина: убиквитинилирование протеасом, выделенных из клеток К562 in vitro, вызывало понижение их химотрипсиноподобной и каспазподобной пептидазных активностей. Возникающее на первый взгляд противоречие между увеличением пептидазных активностей после воздействия доксорубицина и подавлением их после убиквитинилировапия легко объяснимо. Дело в том, что генотоксический стресс in vivo вызывает целый каскад посттрансляционных модификаций протеасом (в частности, фосфорилирование). При этом не все рассматриваемые субъединицы подвергаются убиквитинилированшо: белки pi и а7, напротив, теряют остатки убиквитина при воздействии на клетки доксорубицина. Поэтому, несмотря на то, что наши эксперименты подтверждают гипотезу об участии убиквитшшлирования в регуляции активностей протеасом, они могут не вполне адекватно отражать ситуацию in vivo. Тем не менее, результаты данного исследования дают начало изучению влияния убиквитинилировапия на свойства протеасомных субъединиц и в дальнейшем будут вписаны в общую картину регуляции активности протеасом за счет посттрансляционных модификаций.

Выводы:

1. Субъединицы а5, аб и а7 подвергаются фосфорилированшо и убиквитинилированию в клетках К562, а субъединица pi убиквитинилируется. Спектр фосфорилирования и убиквитинилировапия субъединиц протеасом различается в ядре и цитоплазме.

2. При индукции генотоксического стресса в клетках К562 доксорубицином спектр фосфорилирования и убиквитинилировапия субъединиц 20S протеасом существенно изменяется.

3. Индукция генотоксического стресса в клетках К562 приводит к активации химотрипсиноподобной и каспазоподобной активностей протеасом.

4. Убиквитинилирование протеасом in vitro приводит к подавлению химотрипсиноподобной и каспазоподобной активностей протеасом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Цимоха А.С., Куличкова В.А., Евтеева И.Н., Ватажок Ю.Я., Моисеева Т.Н., Ермолаева Ю.Б., Вашукова Е С., Гаузе Л.Н., Константинова И М. Специфичность изменений в протеасомах клеток К562 при апоптозе, индуцированном диэтилмалеатом // Цитология. 2006.48 (2): 133-141.

2. Миттенберг А.Г., Моисеева Т.Н., Пугачева И.В., Куличкова В.А., Цимоха А.С., Гаузе Л.Н., Константинова ИМ.. Регуляция специфичности эндорибонуклеазной активности протеасом при действии индукторов дифференцировки и апоптоза на клетки линии К562. II Цитология. 2007. 49(2): 142-148.

3. Tsimokha A S., Mittenberg AG., Kulichkova V A., Vashukova E.S., Vatajok Yu.Ya., Moiseeva T.N., Evteeva I.N., Ermolaeva Yu.B., Gause L.N., Konstantinova I.M. Reprogramming of nuclear proteasome undergoing apoptosis in K562 cells. I. Effect of glutathione-depleting agent diethylmaleate //Cell and Tissue Biology. 2007. l(4):334-342.

4. Mittenberg A.G., Moiseeva T.N., Barlev N.A. The role of proteasomes in transcription and their regulation by post-translational modifications//Frontiers in Bioscience. 2008. 13:7184-7192.

5. Моисеева Т.Н., Семёнова Н.Ю., Кучина П.В., Миттенберг А.Г. Эндорибонуклеазная активность субъединиц протеасом и её регуляция с помощью посттрансляционных модификаций // Биология: традиции и инновации в XXI веке. 2008. с.67-69.

6. Моисеева Т.Н. Определение альфа-субъедшшц, обладающих эндорибонуклеазными активностями, и исследование их изменений при воздействии на клетки доксорубицина // Материалы конференций Политехнического симпозиума. 2009. с. 183-184.

7. Моисеева Т.Н. Эндорибонуклеазные активности альфа-субъединиц протеасом и их изменения при воздействии на клетки доксорубицина // Ломоносов - 2009: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных; Секция «Биология». 2009. Сборник тезисов, с.190-191.

8. Moiseeva T.N. Fedorova O A., Mittenberg A G., Barlev N.A. Novel RNAse activities of proteasome alpha-type subunits are found to be affected by apoptosis induction // FEBS J. 2009. Vol.276 supp.l,p.212-213.

9. Моисеева Т.Н., Фёдорова O A., Миттенберг А.Г., Барлев Н А. Протеасомные субъединицы альфа-типа обладают регулируемой эндорибонуклеазной активностью // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА. 13-я Пущинекая международная школа-конференция молодых учёных. 2009. Сборник тезисов, с.30.

10. Моисеева Т.Н., Миттенберг А.Г., Барлев Н.А. Протеасомы и их роль в регуляции транскрипции//Цитология. 2010.52(3):195-203.

11. Kulichkova V A., Fedorova O A., Tsimokha A S., Moiseeva T.N., Bottril A., Lezina L., Gauze L.N., Konstantinova I.M., Mittenberg A.G. and Barlev N.A. 26S proteasome exhibits endoribonuclease activity controlled by extra-cellular stimuli // Cell Cycle. 2010. 9(4): 840 - 849.

12. Моисеева Т.Н., Миттенберг А.Г., Барлев Н А. Влияние индукции повреждений ДНК в клетках К562 доксорубицином на свойства и РНКазные активности альфа-субъединиц протеасом // Цитология 2010. 52 (6): 500-501

13. Моисеева Т.Н., Миттенберг А.Г., Барлев Н А. Индукция повреждений ДНК в клетках К562 вызывает изменение свойств и активностей альфа-субъединиц протеасом II БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА. 14-я Пущинекая международная школа-конференция молодых учёных. 2010. Сборник тезисов, т.2, с. 159.

14. Моисеева Т.Н. Влияние индукции повреждений ДНК в клетках К562 на посттрансляционные модификации и каталитические активности протеасом // Материалы конференций Политехнического симпозиума 20 мая 2010 г. 2010. с.196-197.

15. Moiseeva T.N., Fedorova O A., Mittenberg A.G., Barlev N.A. DNA-damage induction affects RNAse activities and posttranslational modifications of proteasome alpha-type subunits // FEBS J. 2010. Vol.277 supp.l, p.291.

Список цитируемой литературы

1. Туроверов К.К., Бикгашев А.Г. Дорофеюк А.В. и Кузнецова И.М. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе // Цитология. 40:806-817.

2. Anand S., Verma Н., Kumar L., Singh N. Induction of apoptosis in chronic myelogenous leukemia lymphocytes by hydroxyurea and adriamycin II Cancer Lett. 1995. 88(1):101-105.

3. Barrett A.J. Fluorimetric assays for cathepsin В and cathepsin H with methylcoumarylamide substrates//Biochem J. 1980. 187(3): 909-912.

4. Beausoleil S.A., Jedrychowski M., Schwartz D., Elias J.E., Viilen J., Li J., Cohn M.A., Cantley L.C., Gygi S.P. Large-scale characterization of HeLa cell nuclear phosphoproteins // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. 101(33): 12130-12135.

5. Benedict C.M., Clawson G.A. Nuclear multicatalytic proteinase subunit RRC3 is important for growth regulation in hepatocytes // Biochemistry. 1996. 35(36): 11612-11621.

6. Bienko M., Green C.M., Sabbioneda S., Crosetto N„ Matic I., Hibbert R.G., Begovic Т., Niimi A., Mann M., Lehmann A.R., Dikic I. Regulation of translesion synthesis DNA polymerase eta by monoubiquitination // Mol Cell. 2010. 37(3):396-407.

7. Bose S., Stratford F.L., Broadfoot K.I., Mason G.G., Rivett A.J. Phosphorylation of 20S proteasome alpha subunit C8 (alpha7) stabilizes the 26S proteasome and plays a role in the regulation of proteasome complexes by gamma-interferon // Biochem J. 2004. 378:177-184.

8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal Biochem. 1976. 72:248-254.

9. Bulteau A.L., Lundberg K.C., Humphries K M., Sadek H.A., Szweda P.A., Friguet В., Szweda L.I. Oxidative modification and inactivation of the proteasome during coronary occlusion/reperfosion // J Biol Chem. 2001. 276(32):30057-30063.

10. Chen B.B., Mallampalli R.K. Masking of a nuclear signal motif by monoubiquitination leads to mislocalization and degradation of the regulatory enzyme cytidylyltransferase// Mol Cell Biol. 2009. 29(11 ):3062-3075.

11. Choudhary C., Kumar C., Gnad F., Nielsen M.L., Rehman M., Walther T.C., Olsen J.V., Mann M. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions // Science. 2009. 325(5942):834-840.

12. Claverol S.( Burlet-Schiltz O., Girbal-Neuhauser E., Gairin J.E., Monsarrat B. Mapping and structural dissection of human 20 S proteasome using proteomic approaches // Mol Cell Proteomics. 2002. l(8):567-578.

13. Denis N.J., Vasilescu J., Lambert J.-P., Smith J.C., Figeys D. Tryptic digestion of ubiquitin standards reveals an improved strategy for identifying ubiquitinated proteins by mass spectrometry //Proteomics. 2007. 7:868-874.

14. Dephoure N„ Zhou C., Viilen J., Beausoleil S.A., Bakalarski C.E., Elledge S.J., Gygi S.P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation U Proc Natl Acad Sci USA. 2008. 105(31): 1076210767.

15. Diaz-IIernandez M., Hernandez F., Martin-Aparicio E., Gomez-Ramos P., Moran M.A., Castano J.G., Ferrer I., Avila J., Lucas J.J. Neuronal induction of the immunoproteasome in Huntington's disease//J Neurosci. 2003. 23(37):11653-11661.

16. Ethen C.M., Hussong S.A, Reilly C., Feng X., Olsen T.W., Ferrington D.A. Transformation of the proteasome with age-related macular degeneration // FEBS Lett. 2007. 581(5):885-890.

17. Gewirtz D.A. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin // Biochem Pharmacol. 1999. 57(7):727-741.

18. Gillardon F., Kloss A., Berg M., Neumann M., Mechtler K., Hengerer В., Dahlmann B. The 20S proteasome isolated from Alzheimer's disease brain shows post-translational modifications but unchanged proteolytic activity // J Neurochem. 2007. 101(6): 1483-1490.

19. Glickman M.H., Ciechanovcr A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction // Physiol Rev. 2002. 82(2)373-428.

20. Groll M., Bajorek M., Kohler A., Moroder L., Rubin D., Huber R., Glickman M., Finley D. A gated channel into the proteasome core particle // Nat Struct Biol. 2000. 7:1062-1067.

21. Hicke L. Protein regulation by monoubiquitin // Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. 2(3): 195201.

22. Hirano Y., Hendil K.B., Yashiroda H., Iemura S., Nagane R., Hioki Y., Natsume T., Tanaka K., Murata S. A heterodimeric complex that promotes the assembly of mammalian 20S proteasomes// Nature. 2005. 437(7063): 1381-1385.

23. Hough R., Pratt G., Rechsteiner M. Purification of two high molecular weight proteases from rabbit reticulocyte lysate // J Biol Chem. 1987. 262(17):8303-8313.

24. Ilusom A.D., Peters E.A., Kolling E.A., Fugere N.A., Thompson L.V., Ferrington D A. Altered proteasome function and subunit composition in aged muscle // Arch Biochem Biophys. 2004. 421(l):67-76.

25. Jergensen L., Hendil K.B. Proteasome subunit zeta, a putative ribonuclease, is also found as a free monomer // Mol Biol Rep. 1999. 26(1-2): 119-123.

26. Kimura Y., Saeki Y., Yokosawa H., Polevoda B., Sherman F., Hirano H. N-Terminal modifications of the 19S regulatory particle subunits of the yeast proteasome // Arch Biochem Biophys. 2003. 409(2):341-348.

27. Koulich E., Li X., DeMartino G.N. Relative structural and functional roles of multiple deubiquitylating proteins associated with mammalian 26S proteasome // Mol Biol Cell. 2008. 19(3): 1072-1082.

28. Kulichkova V.A., Fedorova O A., Tsimokha A S., Moiseeva T.N., Bottril A., Lezina L., Gauze L.N., Konstantinova I.M., Mittenberg A G. and Barlev N.A. 26S proteasome exhibits endoribonuclease activity controlled by extra-cellular stimuli // Cell Cycle. 2010. 9(4): 840 - 849.

29. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. 227: 680-685.

30. Liu J., Zheng H., Tang M., Ryu Y.C., Wang X. A therapeutic dose of doxorubicin activates ubiquitin-proteasome system-mediated proteolysis by acting on both the ubiquitination apparatus and proteasome // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008. 295(6):H2541- H2550.

31. Lozzio C.B., and Lozzio B.B. Human chronic myelogenous leukemia cell-line with positive Philadelphia chromosome // Blood (45): 321-334.

32. Mason G.G., Hendil KB., Rivett A.J. Phosphorylation of proteasomes in mammalian cells. Identification of two phosphorylated subunits and the effect of phosphorylation on activity //Eur. J. Biochem. 238: 453^162.

33. Meierhofer D., Wang X., Huang L., Kaiser P. Quantitative analysis of global ubiquitination in HeLa cells by mass spectrometry // J. Proteome Res. 2008. 7:4566-4576.

34. Minotti G., Menna P., Salvatorelli E., Cairo G., Gianni L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity // Pharmacol Rev. 2004. 56(2): 185-229.

35. Moore B.S., Eustaquio A.S., McGlinchey R.P. Advances in and applications of proteasome inhibitors // Curr Opin Chem Biol. 2008. 12(4):434-440.

36. Mosesson Y., Yarden Y. Monoubiquitylation: a recurrent theme in membrane protein transport // Isr Med Assoc J. 2006. 8(4):233-237.

37. Murata S., Takahama Y., Tanaka K. Thymoproteasome: probable role in generating positively selecting peptides // Curr Opin Immunol. 2008. 20(2): 192-196.

38. Orlowski M., Wilk S. Ubiquitin-independent proteolytic functions of the proteasome // Arch Biochem Biophys 2003. 415(l):l-5.

39. Perkins D.N., Pappin D.J.C., Creasy D.M., Cottrell J.S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data // Electrophoresis. 1999. 20:3551-3567.

40. Petit F., Jarrousse A.-S., Dahlmann B., Sobek A., Hendil K.B., Buri J., Briand Y., Schmid H.-P. Involvement of proteasomal subunits zeta and iota in RNA degradation // Biochem J. 1997. 326:93-98.

41. Rush J., Moritz A., Lee K.A., Guo A., Goss V.L., Spek E.J., Zhang H., Zha X.M., Polakiewicz R.D., Comb M.J. Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells //NatBiotechnol. 2005. 23(1):94-101.

42. Schmidt F., Dahlmann B., Janek K., KIoss A., Wacker M, Ackermann R., Thiede B., Jungblut P.R. Comprehensive quantitative proteome analysis of 20S proteasome subtypes from rat liver by isotope coded affinity tag and 2-D gel-based approaches // Proteomics. 2006. 6(16) 46224632.

43. Speicher K.D., Kolbas O., Harper S., Speicher D.W. Systematic analysis of peptide recoveries from in-gel digestions for protein identifications in proteome studies // Journal of Biomolecular Techniques. 2000. 11:74-86.

44. Tanaka K. The proteasome: overview of structure and functions. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sei. 2009. 85(1): 12-36.

45. Tanaka K., Kasahara M. The MHC class I ligand-generating system: roles of immunoproteasomes and the interferon-gamma-inducible proteasome activator PA28 // Immunol Rev. 1998. 163:161-176.

46. The Uniprot Consortium. The Universal Protein Resource (UniProt) // Nucl Acids Res. 2009. 37:169-174.

47. Wang X., Chen C.F., Baker P R, Chen P.L., Kaiser P., Huang L. Mass spectrometric characterization of the affinity-purified human 26S proteasome complex // Biochemistry. 2007. 46(11):3553-3565.

48. Yin H., Gui Y., Du G., Frohman M.A., Zheng X L. Dependence of phospholipase D1 multi-monoubiquitination on its enzymatic activity and palmitoylation // J. Biol. Chem. 2010. 285(18): 13580-13588.

49. Zachara N.E., Hart G.W. O-GlcNAc modification: a nutritional sensor that modulates proteasome function // Trends Cell Biol. 2004. 14(5):218-221.

Подписано в печать 16.09.2010. Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 387

Отпечатано в типографии ООО «Адмирал»

199048, Санкт-Петербург, В. О., 6-я линия, д. 59 корп. 1, оф. 40Н

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Моисеева, Татьяна Николаевна

1. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна полученных результатов.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Публикации.

1.7. Апробация работы.

1.8. Финансовая поддержка работы.

1.9. Структура и объем работы.

2. Обзор литературы.

2.1. Протеасома.

2.2. 26Б протеасома.

2.3. 20Б протеасома.

2.3.1. Гетерогенность популяции 20Э протеасом.

2.4. Регуляторные комплексы.

2.4.1. 19Б регуляторная частица (РА700).

2.4.2. 118 регулятор протеасом (РА28).

2.4.3. Регулятор протеасом РА200 (В1ш10).

2.4.4. Регулятор протеасом Р131.

2.5. Локализация протеасом в клетке.

2.5.1. Протеасомы в ядре.

2.6. Протеолитические активности протеасом.

2.7. Убиквитин-зависимый протеолиз.

2.8. Убиквитин-независимый протеолиз.

2.9. Ингибиторы протеолитических активностей протеасом.

2.10. Эндорибонуклеазная активность протеасом.

2.11. Посттрансляционные модификации протеасом.

2.11.1. Фосфорилирование.

2.11.2. Ацетилирование.

2.11.3. О-гликозилирование.

2.11.4. Окисление серосодержащих аминокислот.

2.11.5. Моноубиквитинилирование.

2.11.6. Другие модификации субъединиц протеасом.

2.12. Влияние физиологического состояния клетки на субъединичный состав протеасом.

3. Материалы и методы.

3.1. Культивирование клеток К562.

3.2. Выделение цитоплазматических протеасом.

3.3. Выделение ядерных протеасом.

3.4. Двумерный электрофорез белков.

3.4.1. Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ).

3.4.2. Электрофоретическое разделение белков по молекулярным массам в денатурирующих условиях.

3.5. Вестерн-блоттинг.

3.5.1. Перенос белков из геля на мембрану PVDF.

3.5.2. Иммуноблоттинг с антителами к субъединицам протеасом.

3.5.3. Отмывка мембран от антител для повторного окрашивания.

3.6. Масс-спектрометрический анализ белков.

3.7. Убиквитинилирование белков in vitro.

3.8. Измерение пептидазных активностей протеасом.

3.9. Приготовление клеточного экстракта.

4. Результаты.

4.1. Индукция повреждения ДНК в клетках К562 доксорубицином приводит к повышению химотрипсиноподобной и каспазоподобной активностей протеасом.

4.2. Индукция повреждения ДНК в клетках К562 доксорубицином приводит к изменению спектра посттрансляционных модификаций субъединиц протеасом.

4.3. В клетках К562 присутствуют утяжелённые изоформы субъединиц а5, аб и а7.

4.4. Убиквитинилирование протеасом in vitro приводит к подавлению их пептидазных активностей.

5. Обсузвдение.

5.1. Активация пептидазных активностей протеасом при индукции повреждений ДНК доксорубицином.

5.2. Посттрансляционные модификации субъединиц протеасом при индукции повреждений ДНК в клетках К562 доксорубицином.

5.2.1. Фосфорилирование.

5.2.2. Убиквитинилирование.

5.3. Субпопуляции ядерных и цитоплазматических протеасом отличаются набором посттрансляционных модификаций.

5.4. Регуляция способности протеасом к расщеплению белков убиквитинилированием.

6. Выводы.

Список сокращений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль посттрансляционных модификаций в регуляции активностей протеасом при генотоксическом стрессе в клетках К562"

1.1. Актуальность проблемы.

Регуляторы протеолитических активностей протеасом получили широкое применение в медицине в качестве противоопухолевых препаратов. Для лечения онкологических заболеваний используются различные ингибиторы протеасом: бортезомиб, эпоксимицин, лактацистин, салиноспорамиды, сиринголин и другие (Moore et al., 2008). Данные препараты способны специфически подавлять одну или несколько пептидазных активностей протеасом, изменяя спектр расщепляемых ими белковых субстратов. Однако в природе протеолитические активности протеасом также подвергаются тонкому регулированию при различных изменениях физиологического состояния клетки или стрессовых воздействиях. В этих случаях изменяется как субъединичный состав протеасом, так и спектр их посттрансляционных модификаций.

Наиболее известным примером протеасомы с изменённым субъединичным составом является иммунопротеасома, в которой каталитические субъединицы ßl, ß2 и ß5 заменены их индуцибельными аналогами ßli, ß2i и ß5i, соответственно. Содержание в клетке таких протеасом увеличивается под воздействием гамма-интерферона. Пептидазные активности иммунопротеасомы существенно отличаются от таковых для обычной протеасомы, что приводит к более эффективному образованию пептидов для представления на молекулах главного комплекса гистосовместимости класса 1 (Tanaka and Kasahara, 1998). Кроме того, недавно появились данные о существовании тканеспецифичной субъединицы ß5t, экспрессирующейся исключительно в тимоцитах. При включении такого белка вместо субъединицы ß5 трипсиноподобная активность протеасом существенно снижается, что позволяет говорить о специфической регуляции пептидазных активностей через изменение субъединичного состава протеасом (Murata et al., 2008).

Другим важнейшим способом регуляции активностей белков являются различные посттрансляционные модификации. Большое количество протеомных исследований протеасом привело к выявлению множества сайтов фосфорилирования субъединиц 20S протеасом и 19S регуляторных комплексов (Claverol et al., 2002; Beausoleil et al., 2004; Rush et al., 2005; Wang et al., 2007). Кроме того, были обнаружены такие модификации компонентов протеасом как ацетилирование субъединиц по лизинам (Choudhary et al., 2009) и N-концам (Claverol et al., 2002), гликозилирование (Zachara and Hart, 2004), 4-гидрокси-2-ноненил-алкилирование (Bulteau et al., 2001), миристилирование (Kimura et al., 2003) и окисление серосодержащих аминокислот (Schmidt et al., 2006). Спектр модификаций изменялся при нейродегенеративных заболеваниях (Diaz-Hernandez et al., 2003; Gillardon et al., 2007), закупорке/реперфузии коронарных сосудов y крыс (Bulteau et al., 2001), возрастной атрофии мышц (Husom et al., 2004) и старении сетчатки у человека (Ethen et al., 2007), что может говорить о специфической регуляции функций протеасом с помощью посттрансляционных модификаций. Кроме того, дефосфорилирование субъединиц протеасом аЗ и а7 приводило к снижению двух пептидазных активностей протеасом (Mason et al., 1996), а фосфорилирование 20S протеасом из кардиомиоцитов грызунов киназой РКА или ингибирование фосфатазы РР2А усиливало их протеолитическую активность, причём мишенями данных ферментов оказывались как а-, так и Р-субъединицы протеасом (Zong et al., 2006; Lu et al., 2008), что тоже свидетельствует в пользу гипотезы об участии фосфорилирования в регуляции каталитических активностей протеасом. Влияние ацетилирования субъединиц протеасом на их способность к расщеплению белков было косвенно показано при изучении протеасом из штамма дрожжей, делеционного по гену одной из N-ацетилтрансфераз. Такие протеолитические комплексы обладали пониженной химотрипсиноподобной активностью, что может говорить о необходимости ацетилирования субъединиц для правильного функционирования протеасом (Kimura et al.,

2000). Однако N-ацетилирование не влияло на протеолитическую активность 26 S протеасом дрожжей в присутствии АТФ (Kimura et al., 2003), что позволило предположить влияние данной модификации на присоединение регуляторных комплексов к 20S протеасоме.

Кроме перечисленных выше модификаций, субъединицы протеасом также могут подвергаться убиквитинилированию. Существует только две публикации о наличии на протеасомных субъединицах сайтов убиквитинилирования (Denis et al., 2007; Meierhofer et al., 2008). Данные модификации были обнаружены в результате скрининга широкого спектра убиквитинилированных белков, и их функции совершенно не исследованы. Между тем, убиквитинилирование способно не только направлять белки на расщепление по убиквитин-зависимому механизму (Glickman and Ciechanover, 2002), но и регулировать каталитические активности некоторых белков (Bienko et al., 2010), а также их внутриклеточную локализацию (Chen and Mallampalli, 2009) и белок-белковые взаимодействия (Mosesson and Yarden, 2006). Моноубиквитинилирование играет ключевую роль в регуляции таких процессов как эндоцитоз, репарация, передача сигнала и другие. Не исключено, что подобные модификации субъединиц протеасом могут иметь важное физиологическое значение для регуляции внутриклеточного протеолиза, поэтому представляется необходимым тщательное изучение роли убиквитинилирования субъединиц протеасом в регуляции их способности к расщеплению белковых субстратов и других функций в клетке.

ДНК-повреждающий агент доксорубицин является противораковым препаратом антрациклиновой группы, широко применяемым при лечении различных онкологических заболеваний. Главным недостатком доксорубицина является кардиотоксичность, механизм которой до конца не исследован (Minotti et al., 2004). Исследования показали, что ингибирование протеасом специфически подавляет сигнал о повреждениях ДНК в кардиомиоцитах (Lyu et al., 2007), что говорит о возможном участии протеасом в проявлении кардиотоксичности доксорубицина. В связи с этим изучение воздействия доксорубицина на активности и посттрансляционные модификации протеасом представляет практическую ценность для возможного предотвращения данного побочного действия препарата.

Известно, что под действием доксорубицина происходит активация убиквитин-протеасомной системы расщепления белков на нескольких уровнях (Liu et al., 2008). В частности, повышаются пептидазные активности протеасом. Однако механизм регуляции данных активностей при действии на клетки доксорубицина остаётся неизученным. Исходя из этого, представляет интерес исследование изменения спектра посттрансляционных модификаций субъединиц протеасом при повреждении ДНК доксорубицином и возможной связи этого изменения с регуляцией каталитических активностей протеасом.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Моисеева, Татьяна Николаевна

6. Выводы:

1. Субъединицы а5, аб и а7 подвергаются фосфорилированию и убиквитинилированию в клетках К562, а субъединица pi убиквитинилируется. Спектр фосфорилирования и убиквитинилирования субъединиц протеасом различается в ядре и цитоплазме.

2. При индукции генотоксического стресса в клетках К562 за счёт обработки доксорубицином спектр фосфорилирования и убиквитинилирования субъединиц 20S протеасом существенно изменяется.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Моисеева, Татьяна Николаевна, Санкт-Петербург

1. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов B.JL Протеасома: разрушать чтобы жить // Молек. Биол. - 2002. - т. 36. - N 5. - с. 761-776.

2. Ahn K., Erlander M., Leturcq D., Peterson P.A., Fruh K., Yang Y. In vivo characterization of the proteasome regulator PA28 // J Biol Chem. 1996. - Vol. 271.-N30.-p. 18237-18242.

3. Akopian T.N., Kisselev A.F., Goldberg A.L. Processive degradation of proteins and other catalytic properties of the proteasome from Thermoplasma acidophilum // J Biol Chem. 1997. - Vol. 272. - N 3. - p. 1791-1798.

4. Alvarez-Castelao B., Castaño J.G. Mechanism of direct degradation of IkappaBalpha by 20S proteasome // FEBS Lett. 2005. - Vol. 579. - N 21. - p. 4797-4802.

5. Andersen K.M., Hofmann K., Hartmann-Petersen R. Ubiquitin-binding proteins: similar, but different // Essays Biochem. 2005. - Vol. 41. - p. 49-67.

6. Arabi A., Rustum C., Hallberg E., Wright A.P. Accumulation of c-Myc and proteasomes at the nucleoli of cells containing elevated c-Myc protein levels // J Cell Sci. 2003. -Vol. 116.-p. 1707-1717.

7. Bach I., Ostendorf H.P. Orchestrating nuclear functions: ubiquitin sets the rhythm // TiBS. 2003. - Vol. 28. - N 4. - p. 189-195.

8. Baugh J.M., Viktorova E.G., Pilipenko E.V. Proteasomes can degrade a significant proportion of cellular proteins independent of ubiquitination // J Mol Biol. 2009. - Vol. 386. - N 3. - p. 814-827.

9. Baumeister W., Lupas A. The proteasome // Curr Opin Struct Biol. 1997. -Vol.7. - N 3. - p. 273-278.

10. Beausoleil S.A., Jedrychowski M., Schwartz D., Elias J.E., Villen J., Li J., Cohn M.A., Cantley L.C., Gygi S.P. Large-scale characterization of HeLa cell nuclear phosphoproteins // Proc Natl Acad Sci USA.- 2004. Vol. 101. - N 33. -p. 12130-12135.

11. Benaroudj N., Goldberg A.L. PAN, the proteasome-activating nucleotidase from archaebacteria, is a protein-unfolding molecular chaperone // Nat Cell Biol. -2000. Vol. 2. - N 11. - p. 833-839.

12. Benedict C.M., Clawson G.A. Nuclear multicatalytic proteinase subunit RRC3 is important for growth regulation in hepatocytes // Biochemistry. 1996. -Vol. 35.-N36.-p. 11612-11621.

13. Bienko M., Green C.M., Sabbioneda S., Crosetto N., Matic I., Hibbert R.G., Begovic T., Niimi A., Mann M., Lehmann A.R., Dikic I. Regulation of translesion synthesis DNA polymerase eta by monoubiquitination // Mol Cell. 2010. - Vol. 37.-N3.-p. 396-407.

14. Boelens W.C., Croes Y., de Jong W.W. Interaction between alphaB-crystallin and the human 20S proteasomal subunit C8/alpha7 // Biochim Biophys Acta. 2001. - Vol. 1544. - N 1-2. - p. 311-319.

15. Brannigan J.A., Dodson G., Duggleby H.J., Moody P.C., Smith J.L., Tomchick D.R., Murzin A.G. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation // Nature. 1995. - Vol. 378. - N 6555. - p. 4164-4119.

16. Braun B., Glickman M., Kraft R., Dahlmann B., Kloetzel P.-M., Finley D., Schmidt M. The base of the proteasome regulatory particle exhibits chaperone-like activity // Nature Cell Biol. 1999. - N 1. - p. 221-226.

17. Bulteau A.L., Lundberg K.C., Humphries K.M., Sadek H.A., Szweda P.A., Friguet B., Szweda L.I. Oxidative modification and inactivation of the proteasome during coronary occlusion/reperfusion // J Biol Chem. 2001. - Vol. 276. - N 32. -p. 30057-30063.

18. Cerutti P., Ghosh R., Oya Y., Amstad P. The role of the cellular antioxidant defense in oxidant carcinogenesis // Environ Health Perspect. 1994. - Vol. 102 Suppl 10.-p. 123-129.

19. Chen B.B., Mallampalli R.K. Masking of a nuclear signal motif by monoubiquitination leads to mislocalization and degradation of the regulatory enzyme cytidylyltransferase // Mol Cell Biol. 2009. - Vol. 29. - N 11. - p. 30623075.

20. Choudhary C., Kumar C., Gnad F., Nielsen M.L., Rehman M., Walther T.C., Olsen J.V., Mann M. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions // Science. 2009. - Vol. 325. - N 5942. - p. 834-840.

21. Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome pathway: on protein death and cell life // EMBO J. 1998. - Vol. 17. -N24. - p. 7151-7160.

22. Ciechanover A., Brundin P. The ubiquitin proteasome system in neurodegenerative diseases: sometimes the chicken, sometimes the egg // Neuron. -2003. Vol. 40. - p. 427-446.

23. Claverol S., Burlet-Schiltz O., Girbal-Neuhauser E., Gairin J.E., Monsarrat B. Mapping and structural dissection of human- 20 S proteasome using proteomic approaches // Mol Cell Proteomics. 2002. - Vol. 1. - N 8. - p. 567-578.

24. Dahlmann B., Ruppert T., Kuehn L., Merforth S., Kloetzel P.-M. Different proteasome subtypes in a single tissue exhibit different enzymatic properties // J Mol Biol. 2000. - Vol. 303. - N 5. - p. 643-653.

25. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects // J Biol Chem. 1987. - Vol. 262. - N 20. - p. 9895-9901.

26. De M., Jayarapu K., Elenich L. Monaco J.J., Colbert R.A., Griffin T.A. Beta 2 subunit propeptides influence cooperative proteasome assembly // J Biol Chem. -2003. Vol. 278. - N 8. - p. 6153-6159.

27. Denis N.J., Vasilescu J., Lambert J.P., Smith J.C., Figeys D. Tryptic digestion of ubiquitin standards reveals an improved strategy for identifyingubiquitinated proteins by mass spectrometry // Proteomics. 2007. - Vol. 7.-N6. -p. 868-874.

28. Dephoure N., Zhou C., Villen J., Beausoleil S.A., Bakalarski C.E., Elledge S J., Gygi S.P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation // Proc Natl Acad SciU S A. 2008. - Vol. 105.-N31.-p. 10762-10767.

29. Deveraux Q., Jensen C., Rechsteiner M. Molecular cloning and expression of a 26 S protease subunit enriched in dileucine repeats // J Biol Chem. 1995. -Vol. 270. - N 40. - p. 23726-23729.

30. Diaz-Hernandez M., Hernandez F., Martin-Aparicio E., Gomez-Ramos P., Moran M.A., Castano J.G., Ferrer I., Avila J., Lucas J.J. Neuronal induction of the immunoproteasome in Huntington's disease // J Neurosci. 2003. - Vol. 23. - N 37. -p. 11653-11661.

31. Drews O., Zong C., Ping P. Exploring proteasome complexes by proteomic approaches // Proteomics. 2007. - Vol. 7. - N 7. - p. 1047-1058.

32. Enenkel C., Lehmann A., Kloetzel P.-M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast // EMBO J. 1998. - Vol. 17. - N 21. - p. 61446154.

33. Ethen C.M., Hussong S.A., Reilly C., Feng X., Olsen T.W., Ferrington D.A. Transformation of the proteasome with age-related macular degeneration // FEBS Lett. 2007. - Vol. 581. - N 5. - p. 885-890.

34. Evdonin A.L., Kulichkova V.A., Volkova I.P., Ermolaeva Yu.D., Nikol'skii N.N., Konstantinova I.M., Medvedeva N.D. Transcription factor STAT1 is bound to proteasomes in A-431 cells // Dokl Biochem. 2000. - Vol. 374. - N 1-6. - p. 208-209.

35. Fabunmi R.P., Wigley W.C., Thomas P.J., DeMartino G.N. Interferon gamma regulates accumulation of the proteasome activator PA28 and immunoproteasomes at nuclear PML bodies // J Cell Sci. 2001. - Vol. 114. - p. 29-36.

36. Fehlker M., Wendler P., Lehmann A., Enenkel C. Blm3 is part of nascent proteasomes and is involved in a late stage of nuclear proteasome assembly // EMBO Rep. 2003. Vol. 4. - N 10. - p. 959-63.

37. Fernandez-Murray P., Pardo P.S., Zelada A.M., Passeron S. In vivo and in vitro phosphorylation of Candida albicans 20S proteasome // Arch Biochem Biophys. 2002. - Vol. 404. - N 1. - p. 116-125.

38. Gauci S., Helbig A.O., Slijper M., Krijgsveld J., Heck A.J., Mohammed S. Lys-N and trypsin cover complementary parts of the phosphoproteome in a refined SCX-based approach // Anal Chem. 2009. - Vol. 81. - N 11. - p. 4493-4501.

39. Gerards W.L., de Jong W.W., Boelens W., Bloemendal H. Structure and assembly of the 20S proteasome // Cell Mol Life Sci. 1998. - Vol. 54. - N 3. - p. 253-262.

40. Gewirtz D.A. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin // Biochem Pharmacol. 1999. - Vol. 57. - N 7. - p. 727-741.

41. Glickman M.H., Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction // Physiol Rev. 2002. - Vol. 82. -N2.-p. 373-428.

42. Glickman M.H., Rubin D.M., Fried,V.A., Finley D. The regulatory particle of the Saccharomyces cerevisiae proteasome // Mol Cell Biol. 1998. - Vol. 18. -N6.-p. 3149-3162.

43. Gomes A.V., Zong C., Edmondson R.D., Li X., Stefani E., Zhang J., Jones R.C., Thyparambil S., Wang G.W., Qiao X., Bardag-Gorce F., Ping P. Mapping the murine cardiac 26S proteasome complexes // Circ Res. 2006. - Vol. 99. - N 4. -p. 362-371.

44. Griffin T.A., Nandi D., Cruz M., Fehling H.J., Kaer L.V., Monaco J.J., Colbert R.A. Immunoproteasome assembly: cooperative incorporation of interferon gamma (IFN-gamma)-inducible subunits // J Exp Med. 1998. - Vol. 187. -N 1. - p. 97-104.

45. Groettrup M., Standera S., Stohwasser R., Kloetzel P.M. The subunits MECL-1 and LMP2 are mutually required for incorporation into the 20S proteasome // Proc Natl Acad Sci USA.- 1997. Vol. 94 - N 17. - p. 8970-8975.

46. Groll M., Bajorek M., Kohler A., Moroder L., Rubin D., Huber R., Glickman M., Finley D. A gated channel into the proteasome core particle // Nat Struct Biol. 2000. - Vol. 7. - p. 1062-1067.

47. Groll M., Ditzel L., Lowe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H.D., Huber R. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4A resolution // Nature. 1997. - N 386.-p. 463-471.

48. Grune T., Reinheckel T., Davies K.J. Degradation of oxidized proteins in mammalian cells // FASEB J. 1997. - Vol. 11. - N 7. - p. 526-534.

49. Hamazaki J., Iemura S., Natsume T., Yashiroda H., Tanaka K., Murata S. A novel proteasome interacting protein recruits the deubiquitinating enzyme UCH37 to 26S proteasomes // EMBO J. 2006. - Vol. 25. - N 19. - p. 4524-4536.

50. Harries J.R. Release of a macromolecular protein component from human erythrocyte ghosts // Biochem. Biophys. Acta. 1968. - N 150. - p. 534-537.

51. Haupt Y., Maya R., Kazaz A., Oren M. Mdm2 promotes the rapid degradation of p53 // Nature. 1997. - Vol. 387. - N 6630. - p. 296-299.

52. Hendil K., Khan S., Tanaka K. Simultaneous binding of PA28 and PA700 activators to- 20 S proteasomes // Biochem J. 1998, Vol. 332. - p. 749-754.

53. Herrmann J., Ciechanover A., Lerman O., Lerman A. The ubiquitin-proteasome system in cardiovascular diseases a hypothesis extended // Cardiovascular Res. - 2004. - Vol. 61.-p. 11-12.

54. Hicke L. Protein regulation by monoubiquitin // Nat Rev Mol Cell Biol. -2001. Vol. 2. - N 3. - p. 195-201.

55. Higashitsuji H., Liu Y., Mayer R.J., Fujita J. The oncoprotein gankyrin negatively regulates both p53 and RB by enhancing proteasomal degradation // Cell Cycle. 2005. - Vol. 4. - N 10. - p. 1335-1337.

56. Hirano Y., Hendil K.B., Yashiroda H., Iemura S., Nagane R., Hioki Y., Natsume T., Tanaka K., Murata S. A heterodimeric complex that promotes the assembly of mammalian 20S proteasomes // Nature. 2005. - Vol. 437. - N 7063. -p. 1381-1385.

57. Hirsch C., Ploegh H.L. Intracellular targeting of the proteasome // Trends Cell Biol. 2000. - Vol. 10. - N 7. - p. 268-272.

58. Hobler S.C., Williams A., Fischer D., Wang J.J., Sun X., Fischer J.E., Monaco J.J., Hasselgren P.O. Activity and expression of the 20S proteasome are increased in skeletal muscle during sepsis // Am J Physiol. 1999. - Vol. 277. - N 2. - p. R434-440.

59. Horiguchi R., Dohra H., Tokumoto T. Comparative proteome analysis of changes in the 26S proteasome during oocyte maturation in goldfish // Proteomics. 2006. - Vol. 6. - N 14. - p. 4- 195-202.

60. Hu M., Li P., Song L., Jeffrey P.D., Chenova T.A., Wilkinson K.D., Cohen R.E., Shi Y. Structure and mechanisms of the proteasome-associateddeubiquitinating enzyme USP14 // EMBO J. 2005. - Vol. 24. - N 21. - p. 37473756.

61. Huang T.T., D'Andrea A.D. Regulation of DNA repair by ubiquitylation // Nat Rev Mol Cell Biol. 2006. - Vol. 7. - N 5. - p. 323-334.

62. Humbard M.A., Stevens S.M. Jr, Maupin-Furlow J.A. Posttranslational modification of the 20S proteasomal proteins of the archaeon Haloferax volcanii // J Bacteriol. 2006. - Vol. 188. - N 21. - p. 7521-7530.

63. Husnjak K., Elsasser S., Zhang N., Chen X., Randies L., Shi Y., Hofmann K., Walters K.J., Finley D., Dikic I. Proteasome subunit Rpnl3 is a novel ubiquitin receptor // Nature. 2008. - Vol. 453. - N 7- 194. - p. 481-488.

64. Husom A.D., Peters E.A., Kolling E.A., Fugere N.A., Thompson L.V., Ferrington D.A. Altered proteasome function and subunit composition in aged muscle // Arch Biochem Biophys. 2004. - Vol. 421. - N 1. - p. 67-76.

65. Iwafune Y., Kawasaki H., Hirano H. Electrophoretic analysis of phosphorylation of the yeast 20S proteasome // Electrophoresis. 2002. - Vol. 23. -N2.-p. 329-338.

66. Iwafune Y., Kawasaki H., Hirano H. Identification of three phosphorylation sites in the alpha7 subunit of the yeast 20S proteasome in vivo using mass spectrometry // Arch Biochem Biophys. 2004. - Vol. 431. - N 1. - p. 9-15.

67. Johnson L.N. The regulation of protein phosphorylation // Biochem Soc Trans. 2009. - Vol. 37. - Pt 4. - p. 627-641.

68. Jergensen L., Hendil K.B. Proteasome subunit zeta, a putative ribonuclease, is also found as a free monomer // Mol Biol Rep. 1999. 26. - N 1-2. - p. 119-123

69. Kang Y., Vossler R.A., Diaz-Martinez L.A., Winter N.S., Clarke D.J., Walters K.J. UBL/UBA ubiquitin receptor proteins bind a common tetraubiquitin chain // J Mol Biol. 2006. - Vol. 356. - N 4. - p. 1027-1035.

70. Kimura Y., Saeki Y., Yokosawa H., Polevoda B., Sherman F., Hirano H. N-Terminal modifications of the 19S regulatory particle subunits of the yeast proteasome // Arch Biochem Biophys. 2003. - Vol. 409. - N 2. - p. 341-348.

71. Kimura Y., Takaoka M., Tanaka S., Sassa H., Tanaka K., Polevoda B., Sherman F., Hirano H. N. N alpha)-acetylation and proteolytic activity of the yeast- 20 S proteasome // J Biol Chem. - 2000. - Vol. 275. - N 7. - p. 4635-4639.

72. Kinyamu H.K., Archer T.K. Proteasome activity modulates chromatin modifications and RNA polymerase II phosphorylation to enhance glucocorticoid receptor-mediated transcription // Mol Cell Biol. 2007. Vol. 27. N 13. p. 48914904.

73. Kisselev A., Akopian T., Woo K. M., Goldberg A. The Sizes of Peptides Generated from Protein by Mammalian 26 and 20S Proteasomes // J Biol Chem. -1999. Vol. 274. - p. 3363-3371.

74. Kisselev A., Songyang Z., Goldberg A.Why does threonine, and not serine, function as the active site nucleophile in proteasomes? // J Biol Chem. 2000. -Vol. 275. - N- 20. - p. 14831-14837.

75. Knowlton J., Johnston S., Whitby F., Realini C., Zhang Z., Rechsteiner M., Hill C. p. Structure of the proteasome activator REGalpha PA28alpha // Nature. -1997.-Vol.390.-p. 639-643.

76. Kopp F., Dahlmann B., Hendil K.B. Evidence indicating that the human proteasome is a complex dimmer // J Mol Biol. 1993. - Vol. 229. - N 1. - p. 1419.

77. Kopp F., Hendil K.B., Dahlmann B., Kristensen P., Sobek A.,.Uerkvitz W. Subunit arrangement in the human 20S proteasome // Proc Natl Acad Sci U S A. -1997. Vol. 94. - N 7. - p. 2939-2944.

78. Koulich E., Li X., DeMartino G.N. Relative structural and functional roles of multiple deubiquitylating proteins associated with mammalian 26S proteasome // Mol Biol Cell. 2008. - Vol. - 19. - N 3. - p. 1072-1082.

79. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - N 227. - p. 680-685.

80. Lai Z., Ferry K.V., Diamond M.A., Wee K.E., Kim Y.B., Ma J., Yang T.,

81. Benfield P.A., Copeland R.A., Auger K.R. Human mdm2 mediates multiple mono-ubiquitination of p53 by a mechanism requiring enzyme isomerization // J Biol Chem. 2001. - Vol. 276. - N 33. - p. 31357-13167.

82. Lam Y.A., Lawson T.G., Velayutham M., Zweier J.L., Pickart C.M. A proteasomal ATPase subunit recognizes the polyubiquitin degradation signal // Nature. 2002. - Vol. 416. - N 6882. - p. 763-767.

83. Laporte D., Salin B., Daignan-Fornier B., Sagot I. Reversible cytoplasmic localization of the proteasome in quiescent yeast cells // J Cell Biol. 2008. - Vol. 181.-N5.-p. 737-745.

84. Lee C., Schwartz M.P., Prakash S., Iwakura M., Matouschek A. ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively unraveling them from the degradation signal // Mol Cell. 2001. - Vol. 7. - N 3. - p. 627-637.

85. Li M., Brooks C.L., Wu-Baer F., Chen D., Baer R., Gu W. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2 // Science. 2003. -Vol. 302. - N 5652. - p. 1972-1975.

86. Liu C.W., Corboy M.J., DeMartino G.N., Thomas P.J. Endoproteolytic activity of the proteasome // Science. 2003. - Vol. 299. - N 5605. - p. 408-411.

87. Lowe J., Stock D., Jap B., Zwickl P., Baumeister W., Huber R. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution // Science. 1995. - Vol. 268. - N 5210. - p. 533-539Lu et al.,- 2008.

88. Lucero P., Penalver E., Vela L., Lagunas R. Monoubiquitination is sufficient to signal internalization of the maltose transporter in Saccharomyces cerevisiae // J Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - N 1. - p. 241-243.

89. Ludemann R., Lerea K.M., Etlinger J.D. Copurification of casein kinase II with- 20 S proteasomes and phosphorylation of a 30-kDa proteasome subunit // J Biol Chem. 1993. - Vol. 268. - N 23. - p. 17413-17417.

90. Marchenko N.D., Moll U.M. The role of ubiquitination in the direct mitochondrial death program of p53 // Cell Cycle. 2007. - Vol. 6. - N 14. - p. 1718-1723.

91. Marchenko N.D., Zaika A., Moll U.M. Death signal-induced localization of p53 protein to mitochondria. A potential role in apoptotic signaling // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275. - N 21. - p. 16202-16212.

92. Marques A.J., Glanemann C., Ramos P.C., Dohmen R.J. The C-terminal extension of the beta7 subunit and activator complexes stabilize nascent- 20 S proteasomes and promote their maturation // J Biol Chem. 2007. - Vol. 282. - N 48. - p. 34869-34876.

93. Mason G.G., Hendil K.B., Rivett A.J. Phosphorylation of proteasomes in mammalian cells. Identification of two phosphorylated subunits and the effect of phosphorylation on activity // Eur J Biochem. 1996. - Vol. 238. - N 2. - p. 453462.

94. Maupin-Furlow J.A., Humbard M.A., Kirkland P.A., Li W., Reuter C.J., Wright A.J., Zhou G. Proteasomes from structure to function: perspectives from Archaea // Curr Top Dev Biol. 2006. - N 75. - p. 125-169.

95. Meierhofer D., Wang X., Huang L., Kaiser P. Quantitative analysis of global ubiquitination in HeLa cells by mass spectrometry // J Proteome Res. 2008. - Vol. 7. - N 10. - p. 4566-4576.

96. Messick T.E., Greenberg R.A. The ubiquitin landscape at DNA doublestrand breaks // J Cell Biol. 2009. - Vol. 187. - N 3. - p. 319-326.

97. Minami Y., Kawasaki H., Minami M., Tanahashi N., Tanaka K., Yahara I. A Critical Role for the Proteasome Activator PA28 in the Hsp90-dependent Protein Refolding // J Biol Chem. 2000. - N 275. - p. 9055-9061.

98. Minotti G., Menna P., Salvatorelli E., Cairo G., Gianni L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity // Pharmacol Rev. 2004. - Vol. 56. - N 2. - p. 185-229.

99. Moore B.S., Eustaquio A.S., McGlinchey R.P. Advances in and applications of proteasome inhibitors // Curr Opin Chem Biol. 2008. - Vol. 12. - N 4. - p. 434440.

100. Mosesson Y., Yarden Y. Monoubiquitylation: a recurrent theme in membrane protein transport // Isr Med Assoc J. 2006. - Vol. 8. - N 4. - p. 233237.

101. Murata S., Takahama Y., Tanaka K. Thymoproteasome: probable role in generating positively selecting peptides // Curr Opin Immunol. 2008. - Vol. - 20. - N2. - p. 192-196.

102. Mykles D.L. Biochemical properties of insect and crustacean proteasomes // Mol Biol Rep. 1997. Vol. 24. - N 1-2. - p. 133-138.

103. Nakatsu F., Sakuma M., Matsuo Y., Arase H., Yamasaki S., Nakamura N., Saito T., Ohno H. A Di-leucine signal in the ubiquitin moiety. Possible involvement in ubiquitination-mediated endocytosis // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275.-N34.-p. 26213-26219.

104. Ng D.T.W., Spear E.D., Walter P. The unfolded protein response regulates multiple aspects of secretory and membrane protein biogenesis and endoplasmic reticulum quality control // J Cell Biol. 2000. - Vol. 150. - p. 77-88.

105. Orlowski M., Wilk S. Ubiquitin-independent proteolytic functions of the proteasome // Arch Biochem Biophys. 2003. - Vol. 415. - N 1. - p. 1-5.

106. Ortega J., Heymann J.B., Kajava A.V., Ustrell V., Rechsteiner M., Steven A.C. The axial channel of the 20S proteasome opens upon binding of the PA200 activator // J Mol Biol. 2005. - Vol. 346. - N 5. - p. 1221-1227.

107. Osmulski P., Gaczynska M. Nanoenzymology of the 20S proteasome: proteasomal actions are controlled by the allosteric transition // Biochemistry. -2002. Vol. 41 - p. 7047-7053.

108. Pereira M.E., Wilk S. Phosphorylation of the multicatalytic proteinase complex from bovine pituitaries by a copurifying cAMP-dependent protein kinase // Arch Biochem Biophys. 1990. - Vol. 283. - N 1. - p. 68-74.

109. Peters J.M., Franke W.W., Kleinschmidt J.A. Distinct 19 S and 20 S subcomplexes of the 26 S proteasome and their distribution in the nucleus and the cytoplasm // J Biol Chem. 1994. Vol. 269. - N 10. - p. 7709-7718.

110. Petit F., Jarrousse A. -S., Boissonnet G., Dadet M. -H., Buri J., Briand Y., Schmid H-P. Proteasome prosome associated endonuclease activity // Mol Biol Rep. 1997a.-Vol. 24.-p. 113-117.

111. Petit F., Jarrousse A. -S., Dahlmann B., Sobek A., Hendil K.B., Buri J., Briand Y., Schmid H. -P. Involvement of proteasomal subunits zeta and iota in RNA degradation // Biochem J. 1997b. - Vol. 326 - p. 93-98.

112. Pham A.D., Sauer F. Ubiquitin-activating/conjugating activity of TAFII250, a mediator of activation of gene expression in Drosophila // Science. 2000. - Vol. 289. - N 5488. - p. 2357-2360.

113. Plafker S.M., Plafker K.S., Weissman A.M., Macara I.G. Ubiquitin charging of human class III ubiquitin-conjugating enzymes triggers their nuclear import // J Cell Biol. 2004. - Vol. 167. - N 4. - p. 649-659.

114. Polevoda B., Sherman F. Nalpha -terminal acetylation of eukaryotic proteins // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275. - N 47. - p. 36479-36482.

115. Pouch M., Petit F., Buri J., Briand Y., Schmid H. -P. Identification and initial characterization of a specific proteasome prosome associated RNase activity // J Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - p. 22023-22028.

116. Rabl J., Smith D.M., Yu Y., Chang S.C., Goldberg A.L., Cheng Y. Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases // Mol Cell. 2008. - Vol. 30. - N 3. - p. 360-368.

117. Ramos P.C., Marques A.J., London M.K., Dohmen R.J. Role of C-terminal extensions of subunits beta2 and beta7 in assembly and activity of eukaryotic proteasomes // J Biol Chem. 2004. - Vol. 279. - N 14. - p. 14323-14330.

118. Rape M., Jentsch S. Productive RUPture: activation of transcription factors by proteasomal processing // Biochim Biophys Acta. 2004. - Vol. 1695. - N 1-3. -p. 209-213.

119. Realini C., Jensen C.C., Zhang Z., Johnston S.C., Knowlton J.R., Hill C.P., Rechsteiner M. Characterization of recombinant REGalpha, REGbeta, and REGgamma proteasome activators // J Biol Chem. 1997. - Vol. 272. - N 41. - p. 25483-25492.

120. Rechsteiner M., Hill C.P. Mobilizing the proteolytic machine: cell biological roles of proteasome activators and inhibitors // Trends Cell Biol. 2005. - Vol. 15. -Nl.-p. 27-33.

121. Rechsteiner M., Rogers S.W. PEST sequences and regulation by proteolysis // Trends Biochem Sci. 1996. - Vol. 21. - N 7. - p. 267-271.

122. Reits E.A., Benham A.M., Plougastel B., Neefjes J., Trowsdale J. Dynamics of proteasome distribution in living cells // EMBO J. 1997. - Vol. 16. - N- 20. - p. 6087-6094.

123. Reyes-Turcu F.E., Wilkinson K.D. Polyubiquitin binding and disassembly by deubiquitinating enzymes // Chem Rev. 2009. - Vol. 109. - N 4. - p. 14951508.

124. Rivett A.J., Palmer A., Knecht E. Electron microscopic localization of the multicatalytic proteinase complex in rat liver and in cultured cells // J Histochem Cytochem.- 1992.- Vol. 40.-N8.-p. 1165-1172.

125. Robzyk K., Recht J., Osley M.A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast // Science. 2000. - Vol. 287. - N 5452. - p. 501-504.

126. Rockel T., von Mikecz A. Proteasome-dependent processing of nuclear proteins is correlated with their subnuclear localization // Dino J Struct Biol. -2002. Vol. 140. - N 1-3. - p. 189-199.

127. Rockel T.D., Stuhlmann D., von Mikecz A. Proteasomes degrade proteins in focal subdomains of the human cell nucleus // J Cell Sei. 2005. - Vol. 118. - p. 5231-5242.

128. Rosenberg-Hasson Y., Bercovich Z., Ciechanover A., Kahana C. Degradation of ornithine decarboxylase in mammalian cells is ATP dependent but ubiquitin independent // Eur J Biochem. 1989. - Vol. 185. - N 2. - p. 469-474.

129. Rosenzweig R., Glickman M.H. Chaperone-driven proteasome assembly // Biochem Soc Trans. 2008. - Vol. 36. - Pt 5. - p. 807-812.

130. Rush J., Moritz A., Lee K.A., Guo A., Goss V.L., Spek E.J., Zhang H., Zha X.M., Polakiewicz R.D., Comb M.J. Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells // Nat Biotechnol. 2005. - Vol. 23. - N 1. - p. 94101.

131. Russell S.J., Steger K.A., Johnston S.A. Subcellular localization, stoichiometry, and protein levels of 26 S proteasome subunits in yeast // J Biol Chem. 1999. - Vol. 274. - N 31. - p. 2- 1943-1952.

132. Sadre-Bazzaz K., Whitby F.G., Robinson H., Formosa T., Hill C.P. Structure of a BlmlO complex reveals common mechanisms for proteasome binding and gate opening // Mol Cell. 2010. - Vol. 37. - N 5. - p. 728-735.

133. Scheffner M. Moving protein heads for breakdown // Nature. 1999. - Vol. 398.-N6723.-p. 103-104.

134. Schmidt F., Dahlmann B., Hustoft H.K., Koehler C.J., Strozynski M., Kloß A., Zimny-Arndt U., Jungblut P.R., Thiede B. Quantitative proteome analysis of the 20S proteasome of apoptotic Jurkat T cells // Amino Acids. 2010. Ahead of print.

135. Schmidt M., Haas W., Crosas B., Santamaria P.G., Gygi S.P., Walz T., Finley D. The HEAT repeat protein BlmlO regulates the yeast proteasome by capping the core particle // Nat Struct Mol Biol. -2005. Vol. 12. - N 4. - p. 294303.

136. Schwartz A.L., Ciechanover A., Brandt R.A., Geuze HJ. Immunoelectron microscopic localization of ubiquitin in hepatoma cells // EMBO J. 1988. - Vol. 7.-N10.-p. 2961-2966.

137. Sdek P., Ying H., Chang D.L., Qiu W., Zheng H., Touitou R., Allday M.J., Xiao Z.X. MDM2 promotes proteasome-dependent ubiquitin-independent degradation of retinoblastoma protein // Mol Cell. 2005. - Vol. - 20. - N 5. - p. 699-708.

138. Sears R.C. The life cycle of C-myc: from synthesis to degradation // Cell Cycle. 2004. - Vol. 3. - N 9. - p. 1133-1137.

139. Sharon M., Taverner T., Ambroggio X.I., Deshaies R.J., Robinson C.V. Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes // PLoS Biol. 2006. - Vol. 4. - N 8. - p. e267.

140. Smalle J., Vierstra D. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway // Annu Rev Plant Biol. 2004. - Vol. 55. - p. 555-590.

141. Smith D.M., Kafri G., Cheng Y., Ng D., Walz T., Goldberg A.L. ATP binding to PAN or the 26S ATPases causes association with the 20S proteasome, gate opening, and translocation of unfolded proteins // Mol Cell. 2005. - Vol. -20.-N5.-p. 687-698.

142. Sumegi M., Hunyadi-Gulyas E., Medzihradszky K.F., Udvardy A. 26S proteasome subunits are O-linked N-acetylglucosamine-modified in Drosophilamelanogaster // Biochem Biophys Res Commun. 2003. - Vol. 312. - N 4. - p. 1284-1289.

143. Takeda K., Yanagida M. Regulation of nuclear proteasome by Rhp6/Ubc2 through ubiquitination and destruction of the sensor and anchor Cut8 // Cell. -2005. Vol. 122. - N 3. - p. 393-405.

144. Tanaka K. The proteasome: overview of structure and functions. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009. - Vol. 85. - N 1. - p. 12-36.

145. Tanaka K., Kasahara M. The MHC class I ligand-generating system: roles of immunoproteasomes and the interferon-gamma-inducible proteasome activator PA28 // Immunol Rev. 1998. - Vol. 163. - p. 161-176.

146. To W., Wang C. Identification and characterization of an activated 20S proteasome in Trypanosoma brucei // FEBS Lett. 1997. - Vol. 404. - p. 253-262.

147. Tokumoto M., Horiguchi R., Nagahama Y., Tokumoto T. Identification of the Xenopus 20S proteasome alpha4 subunit which is modified in the meiotic cell cycle // Gene. 1999. - Vol. 239. - N 2. - p. 301-308.

148. Tsukahara T., Tanaka K., Ogawa T., Ishiura S., Funabiki R., Sugita H. RNA degrading activity is tightly associated with the multicatalytic proteinase, ingensin //FEBSLett. 1989.-Vol. 255.-Nl.-p. 179-183.

149. Ullrich O., Grune T. Proteasomal degradation of oxidatively damaged endogenous histones in K562 human leukemic cells // Free Radic Biol Med. -2001. Vol. 31. - N 7. - p. 887-893.

150. Umeda M., Manabe Y., Uchimiya H. Phosphorylation of the C2 subunit of the proteasome in rice (Oryza sativa L.) // FEBS Lett. 1997. - Vol. 403. - N 3. - p. 313-137.

151. Ustrell V., Hoffman L., Pratt G., Rechsteiner M. PA200, a nuclear proteasome activator involved in DNA repair // EMBO J. 2002. - N 21. - p. 35163525.

152. Wakata Y., Tokumoto M., Horiguchi R., Ishikawa K., Nagahama Y., Tokumoto T. Identification of alpha-type subunits of the Xenopus 20 S proteasome and analysis of their changes during the meiotic cell cycle // BMC Biochem. -2004. Vol. 5.-Nl.-p. 18.

153. Wang H.R., Kania M., Baumeister W., Nederlof P.M. Import of human and Thermoplasma 20S proteasomes into nuclei of HeLa cells requires functional NLS sequences // Eur J Cell Biol. 1997. - Vol. 73. - N 2. - p. 105-113.

154. Wang X., Chen C.F., Baker P.R., Chen P.L., Kaiser P., Huang L. Mass spectrometric characterization of the affinity-purified human 26S proteasome complex//Biochemistry. -2007. Vol. 46. -N 11. - p. 3553-3565.

155. Weissman A.M. Regulating protein degradation by ubiquitination // Immunol Today. 1997. Vol. 18. N 4. - p. 189-198.

156. Wells L., Vosseller K., Cole R.N., Cronshaw J.M., Matunis M.J., Hart G.W. Mapping sites of O-GlcNAc modification using affinity tags for serine and threonine post-translational modifications // Mol Cell Proteomics. 2002. - Vol. 1. -N10.-p. 791-804.

157. Whitby F.G., Masters E.I., Kramer L., Knowlton J.R., Yao Y., Wang C.C., Hill CP. Structural basis for the activation of 20S proteasomes by 1 IS regulators // Nature. 2000. -Vol. 408. - N 6808. - p. 115-120.

158. Wigley W.C., Fabunmi R.P., Lee M.G., Marino C.R., Muallem S., DeMartino G.N., Thomas P.J. Dynamic association of proteasomal machinery with the centrosome // J Cell Biol. 1999. - Vol. 145. - N 3. - p. 481-490.

159. Wilkinson C.R., Wallace M., Morphew M., Perry P., Allshire R., Javerzat J.P., Mcintosh J.R., Gordon C. Localization of the 26S proteasome during mitosis and meiosis in fission yeast // EMBO J. 1998. - Vol. 17. - N 22. - p. 6465-6476.

160. Yao Y., Huang L., Krutchinsky A., Wong M. -L., Standing K.G., Burlingame A. L., Wang C.C. Structural and functional characterizations of the proteasome-activating protein PA26 from Trypanosoma brucei // J Biol Chem. -1999. Vol. 274 - p. 33921 - 33930.

161. Yi P., Feng Q., Amazit L., Lonard D.M., Tsai S.Y., Tsai M.J., O'Malley B.W. Atypical protein kinase C regulates dual pathways for degradation of the oncogenic coactivator SRC-3/AIB1 // Mol Cell. 2008. - Vol. 29. - N 4. - p. 465476.

162. Yin H., Gui Y., Du G., Frohman M.A., Zheng X.L. Dependence of phospholipase D1 multi-monoubiquitination on its enzymatic activity and palmitoylation // J. Biol. Chem. 2010. - Vol. 285. - N 18. - p. 13580-13588.

163. Zachara N.E., Hart G.W. O-GlcNAc modification: a nutritional sensor that modulates proteasome function // Trends Cell Biol. 2004. - Vol. 14. - N 5. - p. 218-221.

164. Zaiss D.M., Standera S., Kloetzel P.M., Sijts A.J. PI31 is a modulator of proteasome formation and antigen processing // Proc Natl Acad Sci USA.- 2002. Vol. 99. - N 22. - p. 14344-14349.

165. Zhang D., Chen T., Ziv I., Rosenzweig R., Matiuhin Y. Bronner V., Glickman M.H., Fushman D. Together, RpnlO and Dsk2 can serve as a polyubiquitin chain-length sensor // Mol Cell. 2009. - Vol. 36. - N 6. - p. 10181033.

166. Zhang F., Su K., Yang X., Bowe D.B., Paterson A.J., Kudlow J.E. O-GlcNAc modification is an endogenous inhibitor of the proteasome // Cell. 2003. -Vol. 115.-N6. -p. 715-725.

167. Zhang Z., Clawson A., Realini C., Jensen C., Knowlton J.R., Hill C.P., Rechsteiner M. Identification of an activation region in the proteasome activator REGalpha // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. - Vol. 95. - p. 2807-2811.

168. Zhang Z., Torii N., Furusaka A., Malayaman N., Hu Z., Liang T.J. Structural and functional characterization of interaction between hepatitis B virus X protein and the proteasome complex // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275. - N 20. - p. 1515715165.

169. Zhang Z., Zhang R. Proteasome activator PA28 gamma regulates p53 by enhancing its MDM2-mediated degradation // EMBO J. 2008. - Vol. 27. - N 6. -p. 852-864.

170. Zong C., Gomes A.V., Drews O., Li X., Young G.W., Berhane B., Qiao X., French S.W., Bardag-Gorce F., Ping P. Regulation of murine cardiac 20S proteasomes: role of associating partners // Circ Res. 2006. - Vol. 99. - N 4. - p.372.380.

Информация о работе

Моисеева, Татьяна Николаевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Роль посттрансляционных модификаций в регуляции активностей протеасом при генотоксическом стрессе в клетках К562 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы