Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль олигомерной структуры в функционировании и регуляции активности α-кетоглутаратдегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль олигомерной структуры в функционировании и регуляции активности α-кетоглутаратдегидрогеназы"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи. БУНЕЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

УДК 577.155

•РОЛЬ ОЛЙГОМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ И РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ а-КЕГ0ГЛУТАРАТДЕГВДР0ГЕНАЗН

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1990

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета и в отделе биохимии яивотной клетки Мззфакультетской дробленной научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им. Д.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.ВЛомоносова.

. Научный руководитель: академик С. Е. Северин

Официальные оппоненты: доктор химических паук,

старший научный сотрудник Л.ЬГ.Ршодо'Ш

доктор биологических нар, ведущий научный сотрудник Н.Б.Ливанова

Диссертация направлена на официальный отзыв на кафедру

биохимии Московской медицинской академии юл. И.М.Сеченова.

• - ^

Защита состоится ок.! 1990 года в часов на заседании Специализированного" Совета 32 (Д.053.05.32) по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском государственном университете по адресу: 119899, г.Москва, Ленинские горн, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно -ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "<?)0' А-С&ЦС) .41990 года.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

Е.В.Петрковс

ХАРАКТЕРИСТИКА РЖОТЫ

Актуальность проблем.Одной из наиболее- актуальных проблем современней энзимологш является изучение особенностей строения и функционирования олигомерннх ферментов, состоящих из идентичных субъединиц. В настоящее время известно немало такт ферментов, н для большинства из них показано наличие кооперативных взаимодействий иегду активна® центра!.® олигомора, что, очевидно, служит одним из основных объяснений физиологического смысла существования таких ферментов. Как правило, подобные ферменты действуют в точках пересечения различных метаболических путей и наиболее подвержены регуляторным воздействиям.

Всеми этими свойствами обладает и объект нашего исследования-а-кетоглутаратдегидрогеназа, первый, декарбоксилирупцтЛ компонент полиферментного КГД-комплекса, катализирующего одну из ключевых' реакций метаболизма.

Реакция окислительного декарбоксилирования КГ представляет собой единственный путь его Оиодеградации и локализована в месте пересечения метаболических путей: КГ - общий интермедиат обмена белков и углеводов. Кроме того, декарбоксилирование КГ - единственная, реакция цикла Кребса, приводящая к образованию макроэргической связи на субстратном уровне.

♦/Принятые сокращения: ДТНБ - 5,5'-дитио-бис (2- • нитробензойная)кислота; ДТТ - дитиотреитол; ДТЗ - дитиоэритритол;

ДЭП - диэтшширокарбонат;. КГ -а-кетоглутарат; КГД --а-кетоглутаратдегидрогеназа; КГД-комгоюкс а-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс; ЛшБг (Лит(5Н)г) липое-вая кислота (восстановленная); НАД* (НАДН) - никоишамидаденинди-нуклеотид (восстановленный).

Исследование ВД-комплекса представляет интерес и с той точке зрения, что он является классическим примером надмолекулярной организации ферментов. Изучение принципов строения и функционирования полиферментных комплексов остается важнейшей задачей современной энзимологии. Вместе с тем, выяснение структурной и функциональной организации полиферментного комплекса невозможно без всестороннего изучения его компонентов. Для понимания механизмов действия КГД-комплекса особое значение имеет детальное исследование его первого компонента, осуществляицего пусковую, необратимую и лимитирующую стадию общей реакции и являющегося мишенью большинства регуляторшх воздействий.

Известно, что КГД из грудной мышцы голубя является димером, состоящим из идентичных субъединиц. Оставалось, однако, неясным, необходима ли олигомерна'я структура для функционирования фзрментг или отдельная субъединица обладает способностью к катализу. В toi, случае, если изолированный мономер активен, олигомерной структуре, очевидно, должна принадлежать иная функция: она может играть важную роль в регуляции фермента, основанной на взаимодействии активных центров соседних субъединиц.

Ранее была выявлена негиперболическая зависимость скорости КГД-реакции от концентрации субстрата /Гомазкова, Красовская, 1979/ и кофермента /Гомазкова и др., 1981/,указывающая на межсубъ единичные взаимодействия в днмере фермента. Методом химической мо дификации КГД ДЗП было показано, что наряду с этой формой фермен та, субъедшщы которой кооперативно взаимодействуют в катализе (форма I),существует форма КГД (форма II), активные центры которс функционируют независимо /Буник, Гомазкова, 1985/. Это давало вог мошость предполагать существование в клетке регуляторных механи; мов, переключающих работу активных центров фермента с согласова! ного типа функционирования на независимый.

Цель работы. Целью настоящего исследования явилось решение двух основных задач. Во-первых, выяснение вопроса о том, обладает ли активностью субъединица КГД, или для функционирования этого фермента необходима олигомерная структура. Во-вторых, выявление факторов, определяющих согласованное действие субъединиц в димере Форш КГД, обладающей кооперативными свойства;® (Форш I). Для этого необходимо было провести сравнительный анализ двух форм фермента, исследовать структурные и функциональные различия этих форм и возможности их взаимопревращения.

Наушая новизна работы. С помощью иммобилизации КГД на ВгСН-сефарозе была впервые получена активная мономерная форма фермента. Показано, что удельная активность субъединицы формы КГД, обладающей кооперативными свойствами (формы г), вдвое превыггёет активность димера. Уменьшение активности фермента при ассоциации субъединиц в олигомер дает возможность предполагать, что в димере возникает кооперативность активных центров в процессе катализа. Таким образом, установлено, что олигомерная структура КГД не является необходимой предпосылкой для катализа, а существенна для регуляции фермента.

Исследованы физико-химические и кинетические свойства формы фермента, не выявляющей кооперативности по данным инактивации ДЭН. Показано, что эта форма представляет собой димер, субъединицы которого не отличаются по молекулярной массе от субъединиц формы I, но межсубъединичные контакты ослаблены. Выявлено отсутствие в форме И кинетической кооперативности по связыванию субстрата и ко-фермента. Существенным структурным отличием КГД-п от формы I является пониженное содержание в ней БН-групп. Установлено, что при восстановлении двух БН-групп формы II (наиболее, быстро реагирующей и недоступной ДТНБ в нативном .белке) происходит появление кинетических свойств, характерных для КГД-1. Исследовано восстановление

-з-

БН-групп КГД-И природными моно-- и даюлами. Обнаружена высокая эффективность восстановления фермента, дкгидролипоевой кислотой -интермедаатом полной реакции КГД-комллекса, что позволило сделать предположение о специфичности ее действия. Показано, что при обработав НЩ КГД-комплекса происходит превращение Щ в форме Я в форму I в составе комплекса. Полученные результаты свидетельствуют о том, что активность и кооперативные свойства КГД могут регулироваться окислительно-восстановительным состоянием клетки. При повышении уровня восстановительных эквивалентов, приводящем к восстановлению липоевой кислоты в.составе комплекса, она, в свою очередь, монет восстанавливать КГД-кошонент, превращая его в форму, обладающую более-низкой каталитической эффективностью вследствие согласованного, поочередного функционирования ее активных центров в процессе катализа. Выявление участия в этом процессе тиол-дасульфидного обмена приближает нас к пониманию структурных предпосылок молекулярных механизмов,, которые лежат в основе переключения независимого функционирования активных центров фермента на реализующуюся через мексубъединичнке взаимодействия каталитическу! ^оперативность.

Практическое значение работы. Разработан метод шмобилизаца КГД, что открывает перспективы применения иммобилизованного ферме ита в различных областях биотехнологии. Получены новые сведения регуляции активности КГД, кофакторами которой являются широко ис пользуемые в фармакологии тиамингшрофосфат (кокарбоксилаза) и ли поевая кислота, что мокет иметь значение для медицины.

Апробация работы. Материалы исследования доложены на Есесо'н ной конференции по применению фертнтов в биохимических енализг (Вильнюс, 1984); на 8-м и 10-м объединенных симпозиумах биохшпег ких обществ СССР и ГДР (Рига, 1985; Ташкент, 1983); на 5-й п о-й Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Тбилиси,1585, 1989); ]

5-м Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии ' (Кобулети, 1985); на 5-м Всесоюзном биохимическом съезде (Киев,1986); на Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (Москва,1986); на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва,1989); в отделе биохимии кивотной клетки Межфакультетской ПШЛ им.А.Н.Белозерского и на кафедре биохимии Биологического факультета !,(ГУ (Москва, Г990)..

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (в котором рассматриваются сведения о КГД-компоненте шшферментного КГД-комплекса, методы изучения и биологическая роль четвертичной структуры ферментов, построенных из идентичных субъедишщ, а также исследования, посвященные роли обратимой'моди-* фикации БН-групп ферментов клеточными тиолами в регуляции метабог лизма), описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (235 ссылок). Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, включает 9 таблиц и 32 рисунка.

РЕЗУЛЬТАТУ И ОБСУЖДЕНИЕ '

I. Доказательство активности мономера КГД с помощью метода иммобилизации-Фермента.

При гель-фильтрации КГД на Сефарозе 6В фракции, соответствующие по молекулярной массе мономеру фермента, активностью не обладали, что могло быть результатом нестабильности субъединиц в растворе. Для выяснения принципиальной необходимости олигомерной структуры КГД для катализа необходимо было стабилизировать фермент. Для этого мы применили метод иммобилизации фермента на нерастворимой матрице - ВгСН- активированной Сефарозе 4В. Использование низкой степени активации носителя (3 мг ВгСВГ на I мл геля) позволило

осуществить связывание димерной молекулы I формы фермента с носителем через одну субъединицу: после обработки иммобилизованной Щ 6М мочевиной на носителе оставалась лишь половина от исходного количества белка (нековалентно связанные субъединицы уходили в раствор). Обработка мочевиной приводила к полной инактивации фермента (Таблица'I).

Таблица I. Диссоциация иммобилизованной.в форме I 11ГД I 6М мочевине л при ЮО-кратвсм разведении.

Препарат ц Количество Активность Удельная условия его иммобилизованного активность

обработки белка '

мкг/мл геля %' мкиоль/мл % тюль/иг ' геля в мин белка в каш

Иммобилизован-

ная КГД 312 . 100 72 . 100 0,23 10

Обработка 6М 55

мочевиной 171 - - - -

100-кратное 165 53'

разведение 76 ' lue 0,46 ' 2ü

Для ответа на вопрос, о способности к катализу мономера КГД и подобрали мягкие условия диссоциации димерной молекулы, не привс дящие к денатурации ковалентно связанной с матрицей субъедтшщ обработка 0,2-0,5 М растЕоравд KCl или инкубация I0Q- кратно pai веденной суспензии иммобилизованного фермента в калий- фосфата буфере при pH 7,0 в течение нескольких часов. В этих условиях бы. получены активные иммобилизованные мономеры КГД, причем удельн: активность их в 1,5-2 раза превышала активность исходного иммобз лизованного димера (Таблица I).

Нативность полученных иммобилизованных субъединиц была по, тверадена их реассоциацией с растворимыми. При этом восстанавлив лось исходное количество белка на матрице, а удельная активное

падала до уровня, соответствующего иммобилизованному димеру (Таблица 2).

Таблица 2. Ре ассоциация иммобилизованных мономэров I фор?® КГД с растворимыми.

Препарат Колич. кммобилизов. % Активность % белка (мкг/мл геля) (мкмоль/мин*мг)

йммобнлизов.

димер 212 100 0,15 100

Иммобилизов.

мономер 136 64 0,22 147

'Димер после

реассоциации 212 100 0,15 100

Сопоставление свойств иммобилизованного дкмера и мономера КГД ^ показало, что, как и следовало ожидать, иммобилизация значительно увеличивает стабильность КГД как в процессе хранения, так и при -термообработке. Исследование рН-зависимости активности иммобилизованного и растворимого фермента выявило, что рН-оптимум действия КГД в результате иммобилизации не изменяется.

Изучение кинетических свойств димера, иммобилизованного в форме I, обладающей кооперативными свойствами, показало, что он по своим свойствам не отличается от растворимого. Зависимость скорости КГД-реакции от концентрации КГ у иммобилизованного димера, как и у растворимого фермента, имеет сложный, негиперболическкй характер ,с промежуточными максимумом и минимумом (рис.1). Как и растворимая КГД в форме I, иммобилизованный димер этой формы кнакткви-руется ДЭП в две стадии, что отражает неэквивалентность активных центров в дкмерной молекуле,' вызванную быстрым и прочным связыванием субстрата в одном из них (рис.2,1). Присоединение КГ ко второму активному центру фермента требует преинкубации и привода к тому, что процесс инактивации становится монофазным (рис.2,2).

Рис.1. Зависимость скорости КГД реакции от концентрации субстрата для иммобили-■ зованного димера в форме!.

Рис.2. Инактивация иммобилизованного димера КГД в форме! под действием ДЭП: 1-в отсутствие КГ, 2-пос-ле преинкубации в течение • 10 мин с I мМ КГ.

e>ptn#, нш.

Для иммобилизованного мономера, полученного при диссоциации такого димера, видно существенное упрощение зависимости v([s]), выражающееся в исчезновении промежуточных экстремумов (рис.3)..Для мономера характерна монофазная кривая инактивации под действием ДЭП (рис.4,1). КГ защищает фермент от инактивации, но не приводит к появлению бифазности, что свидетельствует о равноценности всех ' активных центров при связывании субстрата (рис.4,2).

0JOr

ic.3. Зависимость скорости КГД реакции от концентрации субстрата для иммобилизованного мономера в форме I.

ш т,пн°'г0

-в-

Рис.4. Инактивация иммобилизо-

ванного мономера КГД под действием ДЭН: I- без КГ, 2- в присутствии 1кМ КГ.

Таким образом, сравнение кинетических свойств иммобилизованного мономера и димера КГД подтверждает, что особенности кинетического поведения КГД в форме I обусловлены взаимодействием субъединиц в димерной молекуле.

Результаты, полученные с помощью ш,-мобилизации КГД, показали* что четвертичная структура не является обязательной предпосылкой для проявления каталитической активности фермента. В то же время, более бышкая активность мономера по сравнению с димером свидетельствует о том, что олигомерная структура накладывает определенные ограничения на функционирование активных центров КГД. Это согласуется со сделанным ранее на основе результатов химической модификации ДЭП /Буш®,Гомазкова, 1385/ выводом о взаимодействии субъединиц КГД в форме I, проявляющемся, по-пдимому, в поочередном фунциони-ровании активных центров в димере в ходе катализа.

2. Исследование сеойств КГД в форме п.

Форма КГД, не выявляющая кооперативных свойств при связывании субстрата (форма II), была обнаружена в результате исследования кинетики инактивации фермента при модификации его ДЭП /Буник,. ! 987/. Поведете этой Форш КГД при модификации ДЭП было аналогично поведению изолированного мономера КГД. Форма II не была подробно изучена, поэтому еле душим этапом работы было исследование :£и-

зико-химических и кинетических свойств КГД в этой форме и некоторых ее структурных особенностей.

Результаты седиментационного исследования показали, что фермент в этой форме имеет димерную структуру (коэффициент седиментации 8,6±0,4 Б). Но данным электрофореза в присутствии додецилсуль-фата натрия, мы не обнаружили существенных различий в молекулярной массе (около 90 кДа) субъединиц формы I и формы II. -

В соответствии с данными о димерном строении КГД-П довольно неожиданными оказались результаты иммобилизации фермента в этой форме. Далее инкубация иммобилизованных препаратов КГД-П в 6М мочевине не приводила к уменьшению количества белка на матрице. При используемой нами низкой степени активации носителя невозможно представить себе полное связывание фермента с матрицей за 2 субъединицы. Мы предположили, что диссоциация димера КГД в этой форме происходит уже в ходе иммобилизации, в процессе длительного отмывания носителя от не связавшегося белка. Это может объясняться ослаблением мексубъединичных контактов в димерной молекуле КГД в форме II.

Попытки провести реассоциацию иммобилизованного мономера КГД-II с растворимым белком не привели к успеху, несмотря на подбор условий реассоциации, что свидетельствует, по-видимому, о неспособности иммобилизованных субъединиц в этой 'форме образовать прочные контакты с соседними субъединицами.

Данные по иммобилизации КГД коррелируют с результатами гель-фильтрации фермента на сефарозе 6В. При сравнении профилей элюцш двух форм фермента, каждая из которых была нанесена на колонку I виде димера, мы отмечали большую выраженность пика мономера у КГД-II, что указывает на большую подверженность диссоциации в этих условиях II формы по сравнению с I формой. Ослабление мексубъединичных контактов КГД во II форме хорошо согласуется с отсутствием <

нее взаимодействий активных центров, обнаруженным ранее при модификации ДЭП. '

Исследование кинетических свойств КГД в форме II выявило существенные отличия этой формы от КГД-1 (рис.5). Как било показано ранее, форма I обладает сложной кинетической кривой зависимости V([Б]) с промежуточными максимумом и минимумом,и имеет на-кривой насыщения .апофермента ТПФ 2 участка с Ка. различающимися на порядок (70 и 6,5 мкМ). Аналогичные зависимости в случае КГД-П имеют гиперболический характер. Ки для субстрата составляет Г/ мкМ (рис.5,А), а Кш для кофермента (100 мкМ) примерно соответствует участкам с низким сродством I формы (рис.5,Б).

ш

о,го" „ {Щ

Зависимость

0.1 аг °-1{тПФ]0^

некооперативной КГД - от

активности

концентрации КГ (А) и ТП© (Б). На вставках - линеаризация данных в координатах Вульфа - Хофсти.

Существенным структурным отличием формы II от формы I было . меньшее количество БН-груш, титруемых ДГНБ в мочевине. Препараты в кооперативной форме обычно содержали 10-12 БН-групп в расчете на мономер, в то время как количество БН-груш з форме II в большинстве случаев составляло 6-7. Обработка Сорпщридом натрия в 8М мочевине препаратов КГД в этой форме позволила обнаружить все 12 БН-групп, выявляемых ранее в форме I методам! титрования- ДТНБ в

мочевине и аминокислотного анализа. Это свидетельствует в пользу того, что реныпение содержания БН-групп в форме II - результат их окисления, а не изменения структуры молекулы I формы КГД, например, вследствие протеолиза. Проведение выделения фермента в анаэробных условиях (в атмосфере аргона) в присутствии высоких концентраций (З-меркаптоэтанола им ДТТ не привело к выделению из мышц, из которых, как правило, мы получали КГД в форме II, препарата, по-количеству БН-групп и кинетическим свойствам соответствующего "кооперативной" форме. Следует подчеркнуть, что выделение фермента в форме I не требовало тиолсодержащих соединений и проводилось в присутствии в буферах лишь I мМ ЭДТА. Эти результаты позволили предположить, что выделение фермента с преобладанием той или иной формы объясняется особенностями метаболического состояния мышечной ткани, используемой для выделения.

3. Исследование возможности превращения "некооперативной" . -формы КГД в "кооперативную" в результате тиол-■ дисульфидного обмена.

Основываясь на данных о различном содержании БН-групп в двух формах КГД, мы предположили,-что обратимое окисление,- восстановление зн-групп фермента в клетке могло бы регулировать взаимопревращение форм КГД со взаимодействующими и с независимо функционирующими активными центрами. Опираясь на эту гипотезу, мы предприняли попытку превращения формы II КГД в форму I путем восстановления БН-групп фермента. При инкубации КГД с 0,Ш ДТТ (ДГЭ) в трис НС1 буфере рН 9,0 наблюдалось восстановление от двух до шести БН-групп в расчете на мономер, титруемых в 8М мочевине.

Было установлено, что результатом такого восстановления формы II является изменение кинетических свойств фермента. Поскольку метод модификации существенных для активности остатков гистидина КГД

служит индикатором наличия межсубъединичных взаимодействий пр. связывании субстрата в-молекуле КГД /Буник,ГомазковаД985/, одним из основных критериев кооперативных свойств КГД был характер инактивации фермента под действием ДЭП в присутствии-субстрата. Кривые инактивации КГД ДЭП до и после восстановления фермента 0,Ш ДТТ представлены на рис.6. До восстановления все активные центры КГД реагируют с КГ одинаковым образом: в присутствии субстрата наблюдается снижение скорости инактивации всех активных центров. Это проявляется в том, что кажущаяся константа инактивации, определяющая ход процесса при данной концентрации модификатора, уменьшается (от 0,37 глин" до 0,10 мин* на рис.6,А), но процесс инактивации остается монофазным. При этом характер защиты субстратом не меняется в зависимости от времени преинкубации фермента с КГ (рис.6,А, 2,3). Это свидетельствует о том, что связывание субстрата происхо-

новления 0,Ш ДТТ: I - в отсутствие КГ, 2 -КГ, без преинкубации, 3 - преинкубация с Iм.М КГ 5 мин.'

КГД с восстановленными зн-груттами в отсутствие субстрат* инактивируется аналогично КГД в форме II (рие.6,Б,1), однако ее

активные центры реагируют с КГ по-другому. Если восстановленный фермент инактивируется в присутствии КГ без преинкубащш, возникает двухфазная кривая инактивации (рис.6,Б,2). Разложение этой кривой на две составляющие методом графического дифференцирования /Ray et al,1961/ позволяет определить кажущиеся константы инактивации для каждой стадии, равные 1,02 мин"1 и 0,07 мин" . Следовательно, восстановление БН-групп КГД приводит к таким изменениям ее свойств, что быстрое связывание субстрата, выявляемое по снижению скорости инактивации,.происходит лишь в одном из активных центров молекулы фермента. Результатом такого связывания субстрата одной из субъединиц является увеличение скорости реакции с ДЭП активного центра соседней, свободной от КГ, субъединицы, что свидетельствует об изменении ее конформации вследствие кооперативных межсубъедшш-чпых взаимодействий.

Для заполнения субстратом второго активного центра восстановленной КГД требуется преинкубация (рис.6,Б,3). Этот тип активных центров отличается от предыдущего и по прочности связывания КГ: ест преинкубировать восстановленный фермент.с субстратом, а затек осуществить гель-фильтрацию, мы также будем наблюдать бкфазную кривую инактивации (рис.6,Б,2).

Таким образом, форма II после восстановления проявляет меж-су бъедшич ные взаимодействия," тестируемые по кинетике инактивацш ДЗП, характерные для формы I.

Восстановление ^кооперативной КГД в результате тиол-дисульфидного обмена' in и it го приводит и к изменению характера зависимости активности фермента от концентрации субстрата. -Как вид® из рис.7, восстановление фермента обусловливает превращение гиперболи (рас.7,1) в сложную кривую с промежуточными экстремумами <ряз.7,2), наблюдавшуюся ранее в экспериментах с КГД, выделенной : кооперативной форм-ч /Томазкова и др., 1879/'.

?

"с

1-110.7. Зависимость активно

КГД II от концентрации КГ до (1) я после (?,) восстановления ДТТ.

10

Для того, чтобы более детально определить характер бн-групп, восстановление которых приводит к появлению у фермента кооперативных свойств, была исследована кинетика модификации ДТНБ БН-групп обеих форм КГД в нативном состоянии. Мы сгруппировали препараты по количеству БН-групп, титруемых ДТНБ в 8М мочевине. Препараты, содержащие около 12, 10 и 9 БН-групп в расчете на мономер, обладали свойствами формы I. Препараты некооперативной формы содержали 6-7 БН-групп (Таблица 3). Обработка кривых титрования по методу Гугге-нгейма /Березин и др.,1976/ позволила выделить в каждой из групп препаратов три типа БН-групп, титрующихся в нативном белке с различными константами модификации: БН-1 (¿1=2,93+0,60 глин"1 ), БН-п (кг=0,57+0,07 мин"' ') и БН-Ш (¿з=0,06±0,02 мин"1 ).

Таблица 3. Количество БН-групп, титруемых ДТНБ в препаратах КГД формы I и формы п.

Форма БН бн в нативной КГД бн

КГД в мочевине бн-1 бн-п бн-ш скрытые

5,8+0,3 0,3±0,1 0,5±0,1 1,7±0,3 3,4±0,3

..ii 7,0+0,3 0,3±0,2 0,4±0,2 2,3±0,6 4,0+0,7

■ 8,6+0,4 0,7±0,3 0.4+0,2 2,3±0,5 5,2+0,7

I 10,1+0,1 0,6+0,3 0,5-0,1 1,9±0,1 7,2+0,8

12,2+0,1 1,0+0,1 0,7±0,2 2,0+0,1 8,5±0,5

В таблице 3 представлены результаты 46 опытов, проведенных на 26 препаратах. Как следует из таблицы, снижение общего количества

i

SH-групп в расчете на мономер, характерное для II формы, не связано с уменьшением доступных ДТНБ в нативном белке SH-групп типа II и III, а число наиболее быстро реагирующих с ДТНБ SH-групп (SH-I) и число SH-групп,не доступных ДТНБ в нативном белке (так называемых "скрытых") при этом существенно уменьшается.

- Итак, форма I отличается- от формы II по количеству SH-I и скрытых SH-групп. Какое же 'минимальное количество SH-групп и какого типа отвечает за наличие-у фермента кооперативных свойств? Сопоставление вида кривой инактивации при модификации фермента ДЭП в присутствии субстрата, а также характера зависимости скорости КГД-реакции от концентрации КГ с количеством sh-групп, титруемых в мочевине и в нативном белке, показало, что появление двух стадий инактивации в присутствии КГ и возникновение на кривой v([S]) промежуточного максимума и минимума совпадает с восстановлением одной наиболее быстро реагирующей с ДТНБ SH-группы (SH-I) и одной sh-группы, не доступной ДТНБ в нативном белке.

Появление кооперативных свойств при параллельном восстановлении двух SH-групп разных видов может свидетельствовать в пользу того, что эти две SH-группы образуют внутрибелкозый дисульфид. Это предположение согласуется с данными по титрованию восстанавливаемых SH-групп в присутствии арсенита. Известно, что арсенит способен образовывать прочные комплексы с дитиолами. Поэтому по уменьшению числа SH-групп в присутствии арсенита можно судить о наличии близкорасположенных тиолов в белке. Сопоставление результатов титрования -SH-групп КГД 'в форме II в 8М мочевине в присутствии и в отсутствие "арсенита показывает, что из 6 титрует без арсенита в иочевине SH-групп в присутствии арсенита 2 недотитроьываются, что свидетельствует об их Слизком расположении в полипептидной цепи белка. При восстановлении ДТЭ двух SH-групп (от 6 до 8, как показывает определение в отсутствиз арсенита) с арсенитом титруются те

-IG-

ю 4 SH-групш, что и до восстановления. Таким образом, восстанавливаемые SH-группы могут образовывать внутрибелковый дисульфид.

Превращение некооперативной КГД в кооперативную в результате гиол-дисульфидного обмена in vitro позволило нам предположить воз-южность существования подобного механизма регуляции в клетке. Мы «следовали возможность восстановления КГД природным! низкомолеку-пярными моно- и дитиолами при физиологическом значении рН. Было изучено действие наиболее распространенных в природе тиолов - глу-гатиона и цистеина, а также дигидролипоевой .кислоты и коэнзима А, которые являются участниками полной КГД реакции. На рисунке 8 пре-цставлены результаты восстановления КГД при рН 7,0 и концентрации зн-групп восстанавливающего реагента в среде восстаповления ЮмМ (А) и О,ML Видно, что скорость восстановления КГД дигидролипоевой кислотой при концентрации ее SH-групп в среде восстановления 10мМ превышает скорость восстановления КГД глутатионом и цистеи-ном. Восстановление коэнзимом А и ДТТ в этих условиях не идет. При концентрации SH-групп в среде восстановления 0,2мМ ни цистеин, ни глутатион также не эффективны, а дигидролипоевая кислота восстанавливает КГД уже через 15 минут инкубации.

Рис. 8. Восстановление КГД-п различными моно- и- дитиолами в калийтфосфатном буфере pH 7,0. Концентрация КГД: 8 -12 мкМ. Концентрация сульфгидрильных групп тиолов в среде восстановления: А - ЮмМ Б - 0,2мМ. -д—ДТТ,——дигидролипоевая кислота,-®- -глутатион, -цистеин,—1°--коэнзим А.

В то ке время, сравнение значений окислительно- восстановительных потенциалов используемых реагентов показывает, что потенциал пары Лип(бн)2/Лше32 не шике,чем у пары ДТТ/ дисульфид ДТТ /Торчин-ский.1977/, то есть Лип(8Н)г обладает примерно такими же, как ДТТ, восстановительными способностями.

Высокая эффективность восстановления КГД дигидролипоевой кислотой указывает на возможную специфичность ее действия. Восстановление ЛипСБЮг так же, как и-восстановление ДГТ, вызывает появление у КГД кооперативных. свойств. Это выражается в изменении характера инактивации КГД ДЭП в присутствии субстрата и усложнении зависимости го: [Б].

. Результаты этих экспериментов свидетельствуют в пользу возможной роли ЛипфЮг в регуляции функционирования КГД, а следовательно, и всего комплекса, в клетке с помощью тиол- дисульфидного обмена. В составе КГД-комплекса лигоевая кислота ковалентно связана со средним, сукцинилтрансферазным, компонентом и участвует в перекосе сукцинильного остатка от КГД на БН-группу коэнзима А. При этом дисульфидная груша липоевой кислоты восстанавливается, а затем окисляется при участии НАД . Таким образим, липоевая кислота является естественным субстратом КГД и в ходе реакции претерпевает окислительно-восстановительные превращения. Очевидно, что НАДН может восстанавливать дипоевую кислоту при участии липоилдегидроге-назы. Следовательно, в определенных условиях в комплексе может возникать которая,.в свою очередь, могла бы приводить к восстановлению КГД в составе комплекса.

Основываясь на этом предположении, мы предприняли попытку выделения КГД в форме I из мышцы, из которой обычно выделяли фермент в Форме и, добавив КАДН на тех стадиях выделения, когда КГД компонент еще находится в'составе комплекса. В результате мы получили препарат КГД, обогащенный I формой, которую можно отделять от фор-

-i'3-

мы II на одной из стадий выделения, в процессе хроматографии на колонках с гелем фосфата кальция (I форма злюируется раньше П-й).

Зги данные побудили нас исследовать эффект НАДН на выделенном комплексе. Па рисунках 9 п 10 представлены результата опытов, проведенных на КГД в составе комплекса. Комплекс выделяли из партии гшщ, которая всегда служа источником свободной КГД в форме и. КГД в составе комплекса такке не проявляла кооперативных свойств. Об этом свидетельствуют результаты исследования кинетики лнактива-шш ДЗП КГД-ксмпонента в составе комплекса (рис.9,А) и зависимости скорости КГД реакции от кснпентрациз КГ (рис. 10,1) (определяли КГД активность в ферриццанид-редуктазкой системе). Инкубация комплекса с 1С.мкМ НЩ при рН 7,0 и 20°0 в течение £0 минут пр'тводила к изменению кинетических свойств КГД-ксмпонента в составе комплекса, что можзт свидетельствовать о восстановлении КГД в этих условиях (рис.9,Б; 10,2). Контрольные опыты показали, что воздействие НАДН на изолированную КГД не вызывает подобных эффектов. но

;« ¿3

< (Р

Б

&кпя, них.

Ваня, ниц.

Рис.9.

Инактивация-КГД 0,4мМ Д5П в составе комплекса до (А) и после (Б) инкубации комплекса с 10мкМ НАДН. I - в-отсутствие КГ; 2 - 0,2м.М КГ, без преинкубащш; 3 - преинкубащш с 1мМ КГ 5 мин.

Рис Л 0. Зависимость скорост: КГД реакции от концентрации КГ для КГ в составе комплекса до (I) и после (2) ' инкубации комплекса с ЮмкМ ЩН.

[ЩпМ

Таким образом, появление кооперативных свойств КГД в состав комплекса в результате инкубации с НЩ можно объяснить восстало лением фермента дигидролипоевой кислотой, образующейся в этих условиях.

В комплексе, выделенном с использованием инкубации с ЩН одной из стадий выделения, КГД уже сразу после выделения присутс вовала в форме г,о чем свидетельствует появление бифазной крш инактивации КГД в составе комплекса при добавлении субстрата (С прешкубащш). Для талого комплекса мы наблюдали и слозгяый харг тер зависимости у([Б]),причем не только для КГД-реакции, но и д полной реакции.

Обращает на себя внимание уменьшение удельной активности 1 при восстановлении фермента в составе комплекса (рис.10).- Этот ] зультат коррелирует с данными о более низкой удельной активное иммобилизованного димера кооперативной Форш КГД по сравнению с мономером этой формы. В то ке время, при восстановлении изолироз иного КГД-компонента мы не наблюдали такого снижения активное Напротив, восстановление фермента ДТТ, как правило, вызывало д; некоторую активацию фермента (рис.7). Такое повышение удельной : тивности, по-видимому, объясняется тем, что при обработке тнол изолированной из комплекса КГД, наряду с восстановлением БН-гру: определяющих кооперативные свойства фермента, происходит'восста вление и не специфически окисленных -БН-групп, влияющих на акт: -ность. Условия эксперимента по восстановлению КГД в составе кош

зр, Еероятко, более адекватны процессам, происходящим т vivo. лшо предположить, что в этих, условиях идет восстановление лишь мщфических БН-групп,' определяющих кооперативные свойства ферме-га.

Итак, на основании результатов данной работы считаем воз-згееым предполагать существование физиологического механизма регу-ящ® КГД путем взаимопревращения двух форм фермента в результате !юл-дисульфидного обмена. Смена независимого функционирования ак-явных центров фермента механизмом каталитической кооперативное, о-видимому, контролируется окислительно-восстановительны?/! статусы клетки.

вывода '

1. С помощью'иммобилизации КГД на BrCK-сефарозе установлено, ■ то мономер фермента способен к катализу.

2. Выявлена более высокая удельная активность субъедишшд КГД :о сравнению с дилером I формы КГД, проявляющей кооперативные войства, что указывает на взаимодействие субъедишщ в .цшлере в :оде катализа, реализующееся- в поочередном функционировании ачтив-их центров.

3. В сопоставлении с I формой КГД проведено исследование фи-¡лко-химических и кинетических свойств II формы фермента, не выяв-шющей неэквивалентности активных центров по данным инактивации юд..действЕем ДЭП.

, Установлено, что форпа II КГД:

■J представляет собой димер. по свдакентащююшы и эяшрофорзга-шскки свойствам существенно не отличающийся от I фора фермента, ю характеризующийся более высокой способностью к диссопиашгд; }/ в отлте от ШУИ, не щюшггл кинетической ксоператжюсти то сашвшм субстрата и кофермэнта; з/ отшазтся от фзршта иешяш содержанием sk -rp?m¡.

4. Установлено, что при восстановлении 2-х SH-rpyim КГД-П ; реакции тиол-дисульфидного обмена происходит ее превращение в обладающую кооперативными свойствами I форму фермента.

5. Исследована специфичность восстановления КГД-п различным моно- и дитиолами. Выявлена высокая эффективность восстановлени дигидролипоевой кислотой по сравнению с другими природными тяола ми: глутатионом, цистеином, кознзимом А.

. 6. Показано, что под действием НАДН, восстанавливающего липое вую кислоту в КГД-ковдлексе, происходит появление кооперативных свойств у КГД в составе комплекса. Полученные результаты свиде тельстзуют о возможности существования в клетке регуляторного ме ханизма, обусловливающего включение и выключение кооперативного взаимодействия субъединиц в димере КГД.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Кологривова О.А., Гомазкова B.C. Получение и использован] иммобилизованной а-кетоглутаратдегидрогеназы // Тезисы сообщеш Всесоюзной конференции по применению ферментов в биохимических анализах. Вильнюс. 1984. 4.2. С,78-79.

2. Gomaakova V.S., Kologrivova О.A., Severin S.E. Evidence for a-ketoglutarate dehydrogenase monomer activity with the aid enzyme immobilization// Biochera.Int. 1985. V.10. No 6. P.917-925

3. Гомазкова B.C., Кологривова O.A., Северин C.E. Иммобилиза ция а-кетоглутаратдегидрогеназы из грудной мышцы голубя и получ ние активного мономера // Тезисы докладов 8-го объединенного си позкума биохимических обществ СССР-ГДР. Рига. 1935. С.224-225.

4. Гомазкова B.C., Буник В.И., Кологривова 0.А. Межсубъедини те взаимодействия в молекуле а-кетоглутаратдегидрогеназы из гр дной мышцы голубя // Тезисы докладов на 5-и Всесоюзной конферет по биохимии мышц. Тбилиси. 1985. С.31-32.

6. Гомазкова B.C., Кологривова О.А. Использование иммобилиза ции для доказательства . активности мономе а-кетоглутаратдегидрогеназы из грудной мышцы голубя // Тезисы дс

адов 5-го Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии. Кобу-зти. 1985. С.112.

6. Гомазкова В.С.,'Буник В.И., Кологривова О.А. Исследование зжсубъединичных взаимодействий в а-кетоглутаратдегидрогеназе ме-одом химической модификации бежа // 5-й Всесоюзный биохимический ьезд. Тезисы стендовых сообщений. Киев. I98G. Т.2. С.37-38.

7. Гомазкова B.C., Бунеева О.А., Северин С.Е. Использование мобилизации для изучения межсубьединичных взаимодействий в -кетоглутаратдегидрогеназе // Всесоюзный симпозиум по медицинской нзимологии. Тезисы докладов. Москва. 1986. C.I05.

8. Гомазкова B.C., Буш® В.И., Бунеева О.А., Северин С.Е/Мс-ользование методов иммобилизации и химической модификации для сследования мексубъединичных взаимодействий в -кетоглутаратдегидрогеназе // Вестник Академии Медицинских Наук ССР. Москва, Медицина. 1987. С.90-94.

9 Гомазкова B.C., Буник В.И., Бунеева О.А. Форма а-кетоглу-аватдегидрогеназы, не проявляющая кооперативных свойств при вя-ывании субстрата // Биохимия. 1987. Т.52. В.7. C.II44- 1149.

10. Bunik Y.I., Buneeva О.А., Lvova N.B., Gomazkova Y.S. tructural and functional peculiarities of a-ketoglutarate dehyd-ogenase with non-interacting active sites // Biochem. Int. 1989. .18. No 3. P.561-571 . '

11. Gomazkova V.S., Bunik Y.I., Buneeva O.A. Structural and unctional peculiarities of pigeon breast muscle a-ketoglutarate ehydrogenase//Abstract book of International symposium "Molecular " rganisation of biological structures". Moscow. June. 1989. P.144.

12. Гомазкова B.C., Бушж В.И., Бунеева О.А. Взаимопреврзщаю-иеся формы а-кетоглутаратдегидрогеназы из грудной мышцы голубя // езисы докладов 6-й Всесоюзной конференции по биохимии мышц. Тби-иси. 1989. С.44-45.

13. Буши.В.И., Бунеева О.А., Гомазкова B.C. Тиол-дисульфидшй бмен как путь регуляции а-кетоглутаратдегидрогеназы в клетке // езисы докладов 10-го Объединенного симпозиума биохимических об-,еств СССР-ГДР. Ташкент. 1989. С. 15-16.

л