Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение межсубъединичных взаимодействий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из E. coli

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение межсубъединичных взаимодействий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из E. coli"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

РГБ ОД

ЛЕВАШОВ ПАВЕЛ АНДРЕЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ МЕЖСУБЪЕДИНИЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ Е. соН

03.00.04.-биохимия, 02.00.15.-химическая кинетика и катализ

На правах рукописи УДК 577 154

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-1997

Работа выполнена в лаборатории биохимии животной клетки НИИ Физико-химической биологии им А. Н. Белозерского и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Муронец В. И. доктор биологических наук, профессор Наградова Н. К. Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Клячко Н. Л. Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Курганов Б. И. кандидат биологических наук, доцент Иванов М. В. Ведущая организация: НИИ экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ.

Защита состоится «*3й> СьЦуп 1997 г. в час. 00 мин на заседании специализированного совета Д 053.05.76 в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевь горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химическогс факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан <&3» С&Ъ 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Роль межсубъединичных контактов в функционировании олигомерных белков многие годы представляет почву для шскуссий и является одной из важнейших фундаментальных проблем в »временной биохимии. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (ГАФД)-[¡ермент, состоящий из 4 идентичных субъединиц, объединенных в прочный мшгомер. Несмотря на то, что данный фермент давно и интенсивно изучается, функциональное значение его олигомерной организации остается до конца не (ыясненным.

В литературе накоплены сведения о различных подходах по изучению межсубъединичных взаимодействий в белках, в частности примененяемых к "АФД из различных источников. Представлялось важным использовать пирокий спектр данных методов для изучения ГАФД из одного источника с <елью получения наиболее целостной картины по данной проблеме. Наиболее 'дачным объектом исследования в данном случае представлялась ГАФД из у coli, принимая во внимание то, что для ГАФД именно из этого источника в лире сейчас наиболее интенсивно идет накопление рекггеноструктурных 1анных и сведений, полученных на основе генно-инженерных подходов.

Цель работы: В ходе работы планировалось адаптировать и отработать пя ГАФД из E.coli методики, применяемые для исследования ГАФД из других (сточников. Также планировалось оптимизировать метод выделения ГАФД из (икого штамма E.coli ( MRE 600 ). Предполагалось подробное изучение шигомера фермента с применением химической модификации отдельных »статков аминокислот для исследования взаимодействия между убъединицами. В цель также работы входило получение различными «етодами изолированных субъединиц, выяснение их способности к катализу в ггсутствие олигомерной организации. В случае наличия ферментативной ¡ктивности у мономерных форм фермента предполагалось изучение их убстратной специфичности.

Научная новизна работы: В работе впервые показана полуцентровая реактивность для ГАФД из Е.соИ. В работе впервые показано, что мономерная форма ГАФД также как и нативный тетрамерный фермент обладает специфичностью по отношению к нефосфорилированной форме кофермента КАБ+. Впервые было проведено изучение ГАФД методом дифференциальной сканирующей калориметрии.

Практическое значение работы: Результаты, полученные в работе открывают новые перспективы в изучении межсубъединичных взаимодействий ГАФД из Е.соИ. Методические подходы, примененные в работе могут быть использованы в спецкурсах и практических занятиях для студентов университетов, обучающихся по специальностям биохимия и энзимология.

Апробация работы: Результаты работы докладывались на семинарах НИИ Физико-химической биологии им А. Н. Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова и кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ им М. В. Ломоносова, на международной конференции "Вюса1а1у51з-95" (Суздаль 1995 ), на международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии", посвященной 90-летию со дня рождения А. Н. Белозерского ( Москва 1995), на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-96" ( Москва 1996 ), на 20м съезде Биохимического общества Российской Академии наук (Москва 1997).

Публикации: По теме диссертации опубликованы 3 работы.

Объем и структура работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения,

выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на_страницах

машинописного текста, содержит_таблиц и_рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изучение каталитических свойств фермента, химически модифицированного по остаткам Arg231 и Cvsl49.

Было проведено алкилирование Cysl49 в активном центве фермента иодацетагом и изучались свойства модифицированной ГАФД. Обнаружено сходство в поведении фермента из E.coli с ферментом из мышц кролика ( Мае Quarrie and Bemhard.,1971, Biochemistry). ГАФД из E.coli демонстрирует линейную зависимость падения активности при титровании активных центров иодацетатом (рис. 1). Модификация остатка Cysl49 одной субъединицы не отражалась на активности других субъединиц. Реакционная способность Cysl49 в каждой субъединице олигомера не зависит от того, промодифицированны ли Cysl49 других субъединиц, что хорошо иллюстрирует рис. 2, который показывает строгое согласование кинетики модификации со схемой простой реакции второго порядка.

Мы провели химическую модификацию Arg231 бутандионом. При этом фермент также обнаружил сходное поведение с ГАФД из мышц кролика (Kuzminskaya et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta). Однако в отличие от фермента из мышц кролика, который при модификации проявляет 2 -3 % активности по сравнению с нативным, в нашем случае модифицированный бутандионом фермент проявляет 18 -20 % активности по сравнению с нативным. Аналогично литературным данным для ГАФД из мышц кролика при титровании функционирующих активных центров модифицированного бутандионом фермента из E.coli обнаруживается (рис. 3), что только 2 из 4 способны к образованию З-фосфоглицероил-фермент-NADH комплекса, который медленно гидролизуегся в отсутствие фосфата, что указывает на наличие полуцентровой реактивности у данного фермента. Однако, при взаимодействии модифицированной бутандионом ГАФД с иодацетамидом мы обнаружили существенные отличия от поведения ГАФД из мышц кролика. На рис. 4 мы видим падение оптической плотности, связанное с разрушением

2 3 4 5 6

[1СН2СООН]/[ГАФД]

Рис. 1. Инактивация ГАФД в присутствии JCH2COOH. Каждый образец содержал 2,2 мкМ ГАФД (в расчете на тетрамер), 75 мкМ NAD и 1-6 кратное количество JCH2COOH по отношению к ГАФД. Измерение остаточной активности проводилось через 110 мин инкубации растворов при 25°С.

о t->

§

в) о

К &

аого

Q015

ааго

Н aoos 8

1 8 1 Ао 7 -

\ А 6

\ 5

\ 4

\ 3

\ 2 \ |

1 23456789 10 11

t, мин

10

15

t, мин

Рис. 2. Кинетика алкилирования ГАФД, регистрируемая по убыли комплекса с переносом заряда между ГАФД и NAD*. Спектофотометрическая кювета (1см оптического пути) содержала 38,8 мкМ JCH2COOH, А и Ао —текущая и начальная оптические плотности соответственно.

а

0.05

t,c

Рис. 3. Определение числа функционально активных цешров в (1) нагнвной, (2) модифицированной бугандионом ГАФД из Ecoli. Экстраполяция зависимостей к нулевому времени соответствует числу функционально активных цешров (количеству образованного NADH). В спектрофотоиетрнческую кювету (длинна оптического пути 1 см) помещался раствор, содержащий 30 мМ веронал-КОН (рН 8,3), 5 мМ ЭДГА, 1 мМ дитиотреигОл, 0,2 мМ NAD*, 3 мМ фермента (в расчете на тетрамер), 70 мМ бутандиона. Реакцию начинали добавкой 3-ФГА( 3-фосфоглицеринового альдегида) до конечной концентрации 0,5 мМ. Эксперимент проведен при 22°С.

о г^ m

3 х

4 о о <о X

Я о. с л

5

о g

X

о

4>

-а 01 ■

t, мин

-аог

Рис. 4. Комплекс NAD+ с ферментом при действии JCHjCONHj . (ф) нативный и (о) модифицированный бутандионом фермент. В спектрофото метрическую кювету (длинна оптического пути I см) помещался раствор, содержащий 50 мМ HEPES-KOH (рН 8,1), 1 мМ ЭДГА, 0,3 иМ дитиотрекгол, I мМ NAD*. 8,25 икМ фермента (в расчете на тетрамер),в случае модифицированного фермента также 70 мМ бутандиона. Реакцию начинали добавкой JCH2CONH2 до конечной концентрации 0,8 мМ. Эксперимент проведен при 15*С.

комплекса с переносом заряда между ферментом и NAD+ при алкилировании остатков Cysl49. Как мы видим, ход кривой для модифицированного бутандионом и нативного фермента совпадает, что свидетельствует о том, что реакционная способность остатков Cysl49 не изменилась при модификации Arg231, в отличие от ситуации для ГАФД из мышц кролика, у которой в аналогичных условиях проявляется неэквивалентность Cysl49. Таким образом, в случае ГАФД из E.coli мы имеем возможность с большой вероятностью предполагать, что полуцентровая реактивность у модифицированного бутандионом фермента проявляется на уровне стадии восстановления NAD+, связанного с ферментом, которое происходит в каталитическом цикле.

2. Получение мономерных форм фермента, их свойства.

' 2.1. Получение иммобилизованного мономера ГАФД из E.coli.

Для получения мономерной формы фермент предварительно иммобилизовывали путем ковалентаой пришивки к BrCN-активированной Sepharose 4В CL через одну субъединицу, по методике аналогичной традиционной (Ashmarina et al.,1982 ,FEBS Lett.). Для удаления несвязанных ковалентно с матрицей субъединиц препарат иммобилизованного фермента обрабатывали раствором мочевины (7,5М). Для реассоциации тетрамера к препарату иммобилизованного мономерного фермента добавляли порциями растворимый фермент, частично денатурированный в присутствии мочевины. Основные характеристики полученных препаратов иммобилизованных форм фермента суммированы в таблице 1. Как мы видим, мономерная форма фермента имеет значения Км, близкие к значениям для нативного растворимого фермента. В литературе обсуждается проблема возможности замены для ГАФД кофермента NAD+ на NADP+ в катализе, изучаются элементы структуры ГАФД, которые, возможно, обеспечивают данную специфичность (Eyschen at al., (1996) Biochemistry). Поэтому мы проверили специфичность полученного

;ономерного фермента по отношению к фосфорилированной форме офермента. При замене NAD+ на NADP+ скорость ферментативной реакции не ревышала 2 -3 % от скорости ферментативной реакции с NAD+ в качестве офермента. Данную небольшую величину можно соизмерить с погрешностью ксперимента, небольшое ненулевое значение скорости здесь может быть также ледствием незначительной примеси NAD+ в реактиве NADP+.

Таблица №1

Концентрация фермента в геле, мг/ мл V/[E], мкмоль/ мгмин Vmax/fE], мкмоль/мг мин Km для 3-ФГА, мМ Km для NAD\ мМ

Растворимый фермент - 121 172 1.8 0.05

Иммобилизованный тетрамер 0.196 62

Иммобилизованный мономер 0.053 15 21 1.2 0.04

эеконструированны шммобилизованны й тетрамер 0.124 55

ij-концентрация фермента. Условия измерения активности: t=I5 °С, 50 тМ гицин, 100 тМ КН2Р04, pH 8.8.

-скорость ферментативной реакции, измеряли при концентрациях NAD+ ImM и ФГА(3-фосфоглицеринового альдегида) 4 тМ (концентрация 3-ФГА не зляется полностью насыщающей (4,5мМ), однако, при больших концентрациях зчинает наблюдаться ингибирование растворимого фермента) Для иммобилизованного тетрамерного фермента V,«« и Км не приводятся ввиду глинейности зависимости в координатах Лайнуивера-Бэрка, вероятно :ледствие частичного вклада диффузии в кинетику химической реакции. В тучае более активных молекул тетрамерного фермента массоперенос возможно ачинает становится лимитирующей стадией.

2.2. Получение мономерной формы фермента в системе обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в октане (ЛОТ) Как известно, в системе АОТ-окган-НгО размер мицелл определяется соотношением [Н20]/[А0Т] -степенью гидратации. В зависимости от среднего размера мицелл в системе для олигомерного белка может смещаться равновесие в сторону диссоциации на составляющие его субъединицы. Данный подход уже практиковался для получения мономерной формы ГАФД из мышц кролика ( Н. Л. Клячко и др., 1995, Биохимия). При измерении зависимости каталитической активности фермента от степени гидратации (рис. 5), ожидая обнаружить характерные пики, соответствующие размерам мицелл оптимальным для отдельных олигомерных форм, мы обнаружили относительно сглаженную кривую. Таким образом, на основании кинетических данных мы не могли делать никаких предположений относительно того, в каких олигомерных формах находится фермент в системе. Мы провели седиментационные эксперименты, которые подтвердили, что при различных степенях гидратации ГАФД из Е.соИ в системе обращенных мицелл АОТ в октане находится в форме мономера, димера, тетрамера ( таблица 2 ). Однако мы обнаружили также, что для препаратов фермента, которые не хранились в замороженном виде диссоциация тетрамера не происходит вовсе. Причем, в кинетических экспериментах замороженные и не замороженные препараты практически не отличались. Таким образом обнаруживается высокая устойчивость структуры ГАФД из Е.соИ к внешним воздействиям. Сглаженность зависимости каталитической активности от степени гидратации также может указывать на высокую устойчивость конформации в области активного центра фермента по отношению к микроокружению белка.

Кинетические параметры для мономерной формы фермента в системе обращенных мицелл АОТ в октане приведены в таблице 3. Фермент демонстрирует каталитическую активность, несколько меньшую, чем в водной среде. Км для ЫАХ)+ и 3-ФГА также ниже в системе обращенных мицелл

X

г

ч о

3

-а

В

о а ш 5

е «

33 -а ч 1»

£

1-1-1-Г

10 15 20 25 30 35 40 45 [Н-ОИАОТ]

?ис. 5. Условия измерения активности: к 2 мл 0,1М раствора АОТ в октане убавляли 17 мкл 70мМ 3-ФГА, 8 мкл ЮОмМ КАО+, 4 мкл 1М КазАяС^, 10 мкл ЗН3СК, буферную смесь глицин-КОН с рН 8,5 (объем в зависимости от гребуемон степени гидратации), смесь энергично встряхивали до получения трозрачного раствора, затем реакцию начинали внесением 1 мкл раствора фермента (концентрация 2,4 мг/мл)

□ О -Результаты двух независимых экспериментов с идентичными условиями проведения. (Кинетические данные приведены для препаратов типа эбразца А (см. далее))

Таблица № 2.

степень гидратации-[Н20]/[А0Т] А В

Б, Б Б, Б

11,7 24,8* 25,9 47,043,4

14 50,6

16 49,7

17 32,0**

20 40,7

22,8 38,1***

33,3 47,2

44,4 61,4

Условия проведения эксперимента: 1=25 °С, при приготовлении образцов к 500мкл 0,1 М раствора АОТ в октане добавляли 2,5мкл 1М раствора ИазАзС^ и раствор фермента с концентрацией 2,5 мг/мл (объем в зависимости от заданной степени гидратации, раствор фермента готовили на основе буферной смеси глицин-КОН с рН 8,5) При приготовлении образца А в отличие от образца В используемый раствор фермента был заморожен и выдержан 12 часов при -10°С.

Рассчитанные значения Мг белка (при допущении того, что различные олигомерные формы фермента удовлетворительно соответствуют сферической форме, что оправдано на основании рентгеноструктурных данных для этого фермента): »44700 Да;* »72600 Да;** »98100 Да.

Таблица №3

УщаЛЕ], мкмоль/мин-мг Км для 3-ФГА, мМ Км для МАБ+, тМ

В водном растворе 167 0,2 0,040

В мицеллярной системе при У/0=Ю 77 0,026 0,015

В мицеллярной системе при Wo=17 112 0.018 0.008

В мицеллярной системе при \У0=23 101 0.012 0.006

Примечание: кинетические данные приведены для препаратов типа образца А (см. таблицу2 ).

Аэрозоля ОТ в октане по сравнению с водным раствором. Понятно, что щекватно сравнивать данные концентрационные параметры с таковыми для ¡одного раствора сложно, так как субстраты в мицелярной системе распределяются не с одинаковой концентрацией по всему объему, а в ¡ависиости от коэффициентов распределения между фазами. Тем не менее максимальная разница для Км по 3-ФГА между системой обращенных мицелл \ОТ в октане и водным раствором составляет 17 раз, что привлекает к себе шимание, поэтому мы при проверке субстратной специфичности данной иономерной формы фермента кроме замены NAD+ на NADP+ также федприняли попытку замены 3-ФГА на глицериновый альдегид (ГА ). Скорость реакции при замене NAD+ на NADP+ составила не более 2-3 % от 1Сходной, как и в случае с иммобилизованным мономерным ферментом. При намене 3-ФГА на 10 кратное количество ГА регистрируемая нами скорость эеакции составила не более 2 % от исходной. Таким образом мы еще раз убедились в сохранении мономерной формой фермента субстратной специфичности, присущей нативному олигомерному ферменту.

3. ГАФД из E.coli в присутствии 3-фосфоглицерапсиназы из E.coh(ФГК).

По литературным данным известно, что ГАФД и ФПС из E.coli образуют иультиферментый комплекс ( Nagradova et al., (1990) FEBS Letters ). Нам представлялось целесообразным исследовать каталитическое поведение ГАФД 1 присутствии ФГК, в условиях когда образуется комплекс.

Обнаружилось, что на каталитические свойства ГАФД присутствие ФГК практически не влияет, как, например, видно из рис. 6 . Вероятно, это опять же свидетельствует о том, что у ГАФД из E.coli относительно сложно изменить конформацию в активном центре путем внешнего воздействия.

110

100

90

^ 80 сг

| 70

ё 60 о

£ 50 < 40 30 20 10 0

0 1 2 3 4 5

Концентрация ФГК, 10"6 М

Рис. 6. Измерение активности ГАФД в присутствие ФГК. Условия: 25°С, рН 8,0, 15 мМ КН2Р04-Ма0Н, 5 мМ ЫаС1, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЫАБ+, 0,25мМ 3-ФГА, 6,94 10"6 М ГАФД (по активным центрам)

4. Исследование ГАФД методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСЮ.

Как известно из литературы, связывание NAD+ с ГАФД оказывает большое влияние на стабильность фермента (напр., Corbier et al., 1994, Biochemistry). Мы сняли кривые ДСК для апо- и холо- ГАФД из E.coli (рис.7). Как видим «температура плавления» практически не отличается. Единственное заметное отличие -площадь пика в области фазового перехода, соответствующая, вероятно, ДН связывания NAD+ с белком. Пик наблюдается

о

о

о

*

3

я

К о

X о

X «л

«

и

4»

3 О

X

а

О

К о

Р о

>> 1Г>

О.

и

о о о

1 Г

3

2

t,°C

20 40 60 80 Рис. 7 Дифференциальная калориметрическая кривая.

1- ало ГАФД 1,1мг/мл в буферном растворе КН2РО4-КОН с рН 8,0

2- ГАФД 1,1мг/мл в буферном растворе 0,1М КН2Р04-К0Нс рН 8,0 с добавкой 50 мкМ ИЛЬ4"

3- базовая линия

я X

«

о 2

3 о

5

е£ О

t,°C

Рис. 8 Дифференциальная калориметрическая кривая.

1- базовая линия

2- ГАФД 0,75мг/мл в буферном растворе 0,1М КН2Р04-К0Н с рН 8,0 с добавкой 1 мМ NAD*

3- ГАФД 0,75мг/мл в буферном растворе 0,1М КН2Ю4-КОН с рН 6,0 с добавкой 1 мМ NAD+

относительно узкий, одинарный, что свидетельствует о высокой интегрированное™ олигомерного белка, плавящегося как единое целое (весь сразу). Неодновременное плавление отдельных доменов, по-видимому, начинает проявляться только при понижении pH (рис.8 ), удалению значения pH от оптимума ферментативной активности. Кстати, последнюю тенденцию мы также наблюдали для ГАФД из мышц кролика и B.stearothermophilus, что ярко иллюстрирует высокую степень функциональной гомологии между ГАФД из разных источников.

ВЫВОДЫ

¡.Впервые продемонстрировано проявление полуцентровой реактивности ГАФД из E.coli, которое служит указанием на то, что на олигомерной организации данного фермента лежит функция тонкой регуляции каталитической активности.

2. Показана принципиальная возможность проявления каталитической активности в отсутствие олигомерной организации у мономерной формы фермента, полученной в иммобилизованном состоянии и в системе обращенных мицелл аэрозоля ОТ в октане.

3. Обнаружено, что мономерная форма фермента полностью сохраняет присущую нативному олигомерному ферменту субстратную специфичность.

4. При использовании системы обращенных мицелл аэрозоля ОТ в октане, в экспериментах с использованием ФГК, в экспериментах использующих метод дифференциальной сканирующей калориметрии продемонстрирована высокая структурная устойчивость и функциональная консервативность олигомерного фермента ГАФД по отношению к различным внешним воздействиям, которая в сумме с возможностью тонкой регуляции функций ГАФД может указывать на ключевую роль данного фермента в регуляции всего метаболического пути.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. P. A. Levashov, Е. V. Schmalhausen, V. I. Muronetz, N. К. Nagradova. E.coli D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase modified by 2,3-butanedione: manifestation of a pairwise non-equivalence of active centers. (1995) Biochemistry and Molecular Biology International, 37, 5,991-1000

2. N. K. Nagradova, E. V. Schmalhausen, P. A. Levashov, R. A. Asryants, V. I. Muronetz. D- glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: properties of the enzyme modified at arginine residues. (1996) Applied Biochemistry and Biotechnology, 61,47 -56

3. П. А. Левашов, С. А. Куркин, H. JI. Клячко, Н. К. Наградова Глицерзльдегид-З-фосфатдегидрогеназа из E.coli в системе обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в октане: особенности каталитического поведения и структурная стабильность, Второй съезд биохимического общества российской академии наук, тезисы стендовых сообщений, ч.1, Пущино,1997, стр. 43