Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение белок-белковых взаимодействий в олигомерных ферментах с помощью системы обращенных мицелл

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение белок-белковых взаимодействий в олигомерных ферментах с помощью системы обращенных мицелл"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УГОЛЬНИКОВА Анна Васильевна

УДК 577.152.111

ИЗУЧЕНИЕ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТАХ С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ

(на примере глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы)

(03.00.04 — биохимия)

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994

Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета и на кафедре химической энзимо-логии химического факультета МГУ.

Научные руководители: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник М. В. Иванов; доктор химических наук, профессор Н. Л. Клячко.

Научный консультант — доктор химических наук, профессор А. В. Левашов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник В. И. Муронец; доктор химических наук, профессор К. Л. Гладилин.

Ведущая организация — Кардиологический научный центр Российской АМН.

Защита состоится » . .... 1994 года

в «/о » часов на заседании специализированного совета .Д.053.05.32 в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «/<?» . ФК^/3^ . . . 1994 года.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

Ю. Н. Лейкин

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .

Актуальность проблемы. В настоящее ' время очевидно,■ что варьирование надмолекулярной организации ферментов- играет исключительно важную роль в регуляции ¡«каталитической активности. Известно, что изменение молекулярного состава и структуры олигомерных ферментов, может солрововдаться . как их активацией или инактивацией, так, и изменением параметров связывания субстратов. В процессе метаболизма многие ферменты образуют- между собой Селок-белковыа комплексы- (ансамбли), что также может'.сопровождаться существенным, изменением, их каталитических параметров.

Изучение всех' этих процессов. ¿п.. у^о затруднено, с одной стороны, сложностью организации живой клетки,, а с другой стороны,-одновременным протеканием в ней множества взаимосвязанных процессов. Поэтому исследователи, как правило, используют для этой цели различные модельные системы. Одной из наиболее перспективных модельных систем является, . на наш взгляд, система обращенных мицелл поверхностно-активного, вещества (ПАВ)- в органическом растворителе. При со'любилизации в.. такой системе . ферменты включаются во внутреннюю полярную полость, мицелл, приобретая оболочку из гидратированных молекул ПАВ. В 197? году в работах группы К.Мартинеха было установленочто включенные в такие системы ферменты проявляют каталитическую активность. Эти работы положили начало "мицеллярной знзимологшг•новому научному направлению, изучающему функционирование ферментов в. системах обращен-, ных мицелл. ' ' "'■*.

Размер внутренней полости мицелл'можно варьировать в широком диапазоне, изменяя содержание вода в ' системе, поэтому в

гидратированных ассоциатах ПАВ может помещаться как одна молекула белка, так и крупные Oí лковые комплексы как единое целое. Таким образом, обращенные мицеллы могут служить матрицами регулиремого размера для разборки и сборки белковых комплексов различного состава. Иными словами, использование обращенных мицелл, как модельной системы, открывает щ инципиально новую возможность изучения взаимодействий между разными олигомерными формами ферментов.

Работы по изучению Оелок-Селковых взаимодействия в система обращенных мицелл до сих пор нэ выполнялись; более того, само число олигомерных ферментов, поведение которых детально изучено в мицеллах, крайне невелико. . .

В качества основного объекта экспериментальных исследований был выбран гликолитический , ферменс из класса олигомерных nad+-зависимых дегидрогеназ - глицэральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД).Как мы полагали, работа с этой дегидрогеназой, детально изученной во многих отношениях в водном раствора, во-первых, облегчит интерпретация получаемых результатов в системе обращенных мицелл и, во-вторых, позволит прийти к"некоторым общим выводам о роли белок-белковых взаимодействии в функционировании олигомерных-ферментов.

Цель работы.Первая цель работы состояла1 в получении различных стабильных и каталитически активных форм ГАФД, а также в характеристике этих форм, как кинетической, так и структурной. Вторая цель работы была связана с получением смешанных комплексов глицеральдогид-3-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогенэзы (ЛДГ) и изучением взаимного влияния субъединиц этих, двух дегидрогеназ друг на друга.

" - г.

В рамках этих проблем были поставлены следующие задачи! ■ п. Изучить поведение тетрамврного Фермента ГАФД в. системе обращенных мицелл и в случае сохранения его каталитической активности установить кинетические параметры функционирования различных олигоморных форм ГАФД в мицеллах;

2).Охарактеризовать независимыми физико-химическими методами образующиеся олигомерные формы ГАФД;

3).Исследовать белок-белковые взаимодействия на примере взаимо- : действия различных олигомерных форм ГАФД и ЛДГ;

4).Выяснить стехиометрию образующихся в система обращенных мицелл биферментных комплексов.

Научная новизна и практическая значимость работы. На сегодняшний день имеется достаточно много информации 6 катализе в обращенных мицеллах ферментами,. молекулы которых являются мономерами. Балки со сложной четвертичной структурой, в том числе и олигомерные ыао''-зависимые, дегидрогеназы, | .молекулы которых' состоят из нескольких суОъедашц, изучены гораздо • менее обстоятельно. Поведение ГАФД в системе обращенных мицелл до сих пор не исследовалось. В диссертации детально . отработана методология изучения олигомерного фермента, в системе обращенных мицелл (на примере функционирования ГАФД в мицеллах).' В обращенных мицеллах-впервые получены и охарактерэзованы физико-химическими методами различные олигомерные Форш ГАФД. На основании (собственных) экспериментальных результатов предложены модели организации мономернойдиыерноп и тетрамерной форм ГАФД, которыа согласуются с имеющимися литературными данными, а в ряде случаев' их существенно дополняют.

В работе большое внимание уделено исследованию биферментной

системы на примере совместного функционирования ГАФД и ЛДГ в обращенных.мицеллах; Ощв делено, что Между ГАФД и ЛДГ происходит образование комплексов и впервые получено несколько различных по стехиометрии гетероолигомерных белок-белковых комплексовкомплекс между мономером ГАФД и мономером ЛДГ, комплекс мевду димером ГАФД и тетрамером ЛДГ. Как было обнаружено, образование всех этих комплексов сопровождается' увеличением каталитической активности каждого фермента.

Таким оорэзом, в работе предложена новая методология конструирования различных гомо- и гетеро- олигомерных форм ГАФД в .системе обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в -октане. Важно отметить, что во всех случаях, образованные гомо- и гетеро- формы ГАФД обладали каталитической активностью.

Применяемый в настоящей работе подход к исследованию . биферментной. системы в обращенных мицеллах может быть использован для изучения функционирования тройных и более белковых комплексов, с целью понимания сущности и смысла процессов жизнедеятельности клетки в целом.

Материалы диссертации могут, использоваться в лекционных курсах, читаемых на кафедре биохимии Биологического факультета' и на кафедре химической энзимолории Химического факультета МГУ.

Апробация работы. Результаты работы полажены на заседании кафедры■ биохимии Биологического факультета МГУ, на научном семинаре кафедры химической энзимологни Химического факультета МГУ,-на X■ Объединенном Симпозиуме биохимических обществ на тему' "Механизм регуляции клеточной активности" (Ташкент,1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,изложения результатов и их обсуждения, выводов и

списка цитируемой литературы. Работа изложена на _ страницах и

включает ____ таблицы и _ рисунка.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы ГАФД из скелетных мышц кролика была получена по методу

Р.Скоупса ( I 978) и обладала удельной активностью равной

77 ед/мг бежа.

ЛДГ из того же источника была получена также по методу

Р.Скоупса (1978) и обладала удельной активностью равной 450 ед/мг

белка. По данным электрофореза в полиакриламидном геле оба

фермента были гомогенны. Кристаллические препараты ГАФД и ЛДГ

хранили в растворе сульфата аммония,- имеющем насыщение 0,67 и

содержащем 5 мМ эталендиаминтетраацетет и 5 мМ дитиотреитол. Перед

употреблением растворы ферментов обессоливали," .пропуская через

колонку с сефадексом с-25, уравновешенную соответствующим буфером.

В работе использовали коммерческий. "препарат бычьего

сывороточного альбумшз (БСА) производства фирмы "Кеапа1".

3-фосфоглицериновый альдегид (3-ФГА)' получали по. методу

Шевчук(1961г) путем химического синтеза . из'-'кальциевой соли

фруктозо~1,6-дифэсфата. ' ■

Для приготовлении системы обращенных мицелл использовали в

качестве поверхностно-активного вещества -Аэрозоль ОТ (АОТ,

натриевая соль ди-2-этилгексилового. эфира сульфоянтарной кислоты)

"мегск"; в качестве органического растворителя-октанСРеахим").

Размер (радиус) внутренней полости обращенных мицелл варьировали от 22 до 64 Л, изменля степень гидратации Аэрозоля ОТ, ио -молярное,соотношение |н2о)/[АОТ) в системе.

' (1)

IАОТI

Все эксперименты с ГАФД проводили в 50 мМ глициновом буфере рн 8,5 при 26°С; с ЛДГ - в 20 ми имидазольном буфере рн 7,о при той же температуре. Взаимодействие дегидрогеназ исследовали при измерении каталитической активности ГАФД в присутствии ЛДГ, а также при работе с меченной ыво- ГАФД в глициновом буфере; в случае измерения каталитической активности ЛДГ в присутствии ГАФД в имидазольном буфере,

Ведение флуоресцентной, матки 7-хлоро-4-нитро-бензо-2-окси-1, 3-диазола (ыво-хлорида) в препарат ГАФД проводили по методике рисе н.С ¿1 Концентрацию мво-хлорида и нво-производаого ГАФД

определяли спектрометрически, используя .коэффициент молярной экстинкции ывв-равный 13«Ю3 ЬГ^см^при 420 нм.

•Кинетические опиты . проводили на спектрофотометре "Вес)стап-25".. Активность ГАФД измеряли спектрофотометрически в прямой реакций по нарастанию оптической плотности иаон при длине волны 340 нм, используя значение с340нм' равное 6,22*103М_1см_1. Активность ЛДГ измеряли этим же методом по уменьшению оптической плотности в результате окисления восстановленного илон при длине волны 366, принимая значение с366(Ш равное 3,3*103Г,Г1см-1.

Для флуориметрических исследований использовали спе'ктрофлуориметр ., '"шласы^-р-зооо" При изучении собственной' белковой флуоресценции , ГАФД длина волны возбуждающего света равнялась 280- им.' Положение.'.максимума., спектра флуоресценции

определяли путем регистрации на приборе его первой производной.

При изучении флуоресценции меченной nbd-хлоридом ГАФД длина волны возбуждающего света равнялась 470 им.

В экспериментах со вторым белком (ЛДГ или БСА), последний вносили в систему в 60-120 кратном избытке и инкубировали вместе с ГАФД в течение 5 минут, после чего регистрировали спектр флуоресценции модифицированной ГАФД в присутствии второго немеченного белка.

Коэффициенты седиментации' пустых и содержащих белок обращенных мицелл определяли на основе- седиыентограмм, полученных на аналитической ультрацентрифуге "bookman еи, снабженной фотоэлектрическим сканирующим устройством с монохроматором и мультиплексором с использованием 12-мм- двухсекторных . ячеек и ротора an-g-ti при скоростях 20000-30000 об/мин. При определении коэффициентов седиментации в системе обращенных мицелл, содержащей нативную ГАФД, сканирование: проводили при. длине волны 280 ил. В случае систем, содержащих nbd-ГАФД в присутствии и отсутствии ЛДГ, сканирование проводили при 420' нм. Коэффициенты седиментации белок-содержащих мицелл рассчитывали из экспереыентальных данных по классической методике (Левашов A.B. и др.,1981).

Для построения теоретических' . зависимостей ^коэффициентов седиментации от степени гидратации пользовались следующими уравнениями: , . , . '

" Sö -ya* Мс — гпри:*0>и0 шт (2) ' mo.(I-P*Vo) ;;

где Эд и з0- соответственно, коэффициенты седиментации белек-содержащих и "пустых" мицелл;

, Мб - молекулярная масса Оелка;

М0 и у0~ соответственно, молекулярная масса и

парциальный удельный объем "пустых" мицелл; Рч- плотность .растворителя.

. "о"- - , сэ>

■ ^

"РИ опт.

где и0 опт- оптимальная степень гидратации;

^о,огт' мо,опт' попт"с0°тветствеш0, коэ№циент ■ седиментации, молекулярная масса и число агрегации ПАВ

I

при оптимальной степени гидратации;

ь - молекулярная масса воды (18 г/моль).

Для определения радиуса , обращенных мицелл (¿ЫД) при определенной степени гидратации (и0) использовали следующую формулу:

гм=1'5ано + 4 ; ' <4)

Радиус сферической молекулы белка (гб,А) связан с его

мрлакулярной массой ЧМ^) следующим соотношением:

гб/0,7*3^ 4 (5)

При обработке -экспериментальных данных пользовались

различными типами статистического. ^ анализа: дисперсионным,, корреляционным, регрессионным. Был применен выборочный метод для

оценки генеральных параметров,, выдвигались и проверялись

статистические гипотезы .для сравнительной оценки этих параметров (Лакин Г.Ф.,1990;Рокицкий П.Ф.,1967).

Результаты и обсуждение I. Изучение свойств глицеральЭегид-З-фосфатвегиОрогеназы в. си стеле о Оращзнных лицелл. 1.1,Регуляция каталитической активности ГАФД изменением содержания воды в системе обращенных мицелл. Для мономершп ферментов,(таких как трипсин, а-химотрипсин, пероксидазэ и др.), .показано, что зависимости каталитической активности от степени гидратации ПАВ(я0) имеют колоколообразный вид. Максимум каталитической. - активности наблюдается при той степени гидратации, при которой радиус внутренней полости мицеллы равен радиусу белковой глобулы. В случае олигомерных ферментов (таких как фосфатаза.алкогольдегидрогеназа, 7-глутемилтрансфераза) на зависимости каталитической активности от степени гидратации обнаруживается несколько максимумов, каэдый из которых соответствует Функционированию одной из молекулярных форм белка. Подобная колоколообразная зависимость, с тремя максимумами (при 'л'о=21,2 8 и 38, см. рис.1) наблюдается- и для ГАФД в системе обращенных мицелл АОГ-вода-октан■

Учитывая имеющиеся в литературе данные о причинах возникновения нескольких максимумов активности олигомерных белков в мицеллах, разумно предположить, что и в случае ГАФД наблюдаемые максимумы обусловлены функционированием раличных надмолекулярных форм , фермента. Для идентификации этих форм использовали метод седиментзционного анализа.

На рис.2, приведены зависимости коэффициентов седиментации ГАФД-содержащих мицелл при разных степенях гидратации в системе обращенных мицелл.

Из эксперементально полученных величин коэффициентов

седиментации определили соответствуйте шл значения молекулярных масс, используя формулы (2) и (3).

На рис.3 представлена зависимость молекулярной массы ГАФД от размера внутренней полости мицелл.

юо| .

"¡8 гг г? Тн Тг V.

. Рис Л Зависимость реакции, катализируемой ГАФД ■

Шсал

от и0 в системе оОраеешшх мицелл. Пунктиром обозначено значение Угаах фермента в водном растворе.

Из полученных результатов следует, что при 1<о от 12 до 21 молекулярная масса фермента равняется 36000 Да, т.е. в мицеллах содержится мономер ГАФД; при ч0 от 22 дс 30 молекулярная масса составляет 72000 Да, что соответствует димеру ГАФД и при от 32 до.40 молекулярная масса равняется ,144000 Да, т.е. . в мицеллах этого размера ГАФД находится в форме тетрамера, ' '

Каждая олигомерная форма фермента' обладает каталитической активностью (см, рис. I).. причем первыЛ максимум на',зависимости утах от сгепени гидратации при и =21 соответствует функционирова-"

ю

нию мономера, второй максимум при но-2в - димеру и третий при ио-эа -тетрамеру ГАФД. Максимальная скорость реакции катализируемой ГАФД Бг.ю"1^)

и $ч

So И te

34 io К

гг

й

18 го 22 гч 26 а» io а Рис.2. Коэффициенты седиментации ГА<

■wo

ЬЧ а ле

ФД-соде.жщих мицелл

при разных степенях гидратации в системе обращенных мицелл.Пунктиром показаны теоретические кривые для: I -мономера;2 -димерз;3 -тримера;4 -тетрамера ГАФД соответственно. Точками - эксперементальные данные.

меняется при переходе- от одной молекулярной формы фермента к другой, а отразится ли изменение олигомерносги на других кинетических параметрах фермента", таких как кщ для nad* и *т для 3--ФГА* На рисунках 4 и 5 представлены зависимости констант Ыихаэлиса для то* и З-ФГА.'йт степени гидратации в системе обращенных мицелл.■ '

Как видно из этих результатов. кт для had*

в системе

обращенных мицелл при различных значение незначительно отличается от соответствую:..

степеней гидратации величины, полученной

•и

140 120 100 ¿0 60 40

г в

Г

Н-ТГ

го гч 28 зг »6 >10 чч

VI,

Рис.3. Зависимость молекулярной массы ГАФД от степени гидратации в системе обращенных мицелл, для этого фермента в водном растворе, и практически одинакова для' разных молекулярных форм ГАФД. В тоже время кт для 3-ФГА зависит от размера внутренней .полости мицеллы и не совпадает с

Более того, при тех степенях имеет свои максимальные значения.

величиной хга в водном растворе

гаах

гидратации, при которых у| величины кю для з-ФГА минимальны. -Таким образом, наибольший эффект наблюдается для . ^

Полученные в этом разделе работы данные указывают на то, что изменение степени гидратации отражается как на структуре, так и на функционировании фермента.Так, ГАФД в системе обращенных мицелл способна существовать в различных олигомерных формах: мономера, дамера и тетрамера. ' Все обнаруженные . формы обладают хорошо выраженной ферментативной активностью, которая зависит от размера

г

мицелл.

и} ¡« Тг гб зо зч а ю-г М

чг

Рис.4. Зависимость

К ,„,„г>+1 ог и в ш(ЫЛО ) о ч

системе обращенных ■ мицелл.Пунктиром показана соответствующая величина

в водном растворе, с

Рис.5.Зависимость

Кш(ЗФГА) от Ио В системе обращенных

мицелл. Пушстиром г.оказана соответствующая величина в водном растворе.

и и гг гв зо гч ая ч!

1.2.Модели организации различных олигомерных форм ГАФД

в системе обращенных мицелл.

Экспериментальные данные, подученные в настоящей работе методом седиментационного анализа, давали возможность оценить размеры' образующихся в системе обращенных мицелл белковых агрегатов. .На основании этой оценки в диссертации были предложены модели организации различных олигомерных форм ГАФД. Из литературных данных (см. работы Россмана и др.,1974), очевидно, что. мономер^ ГАФД имеет вытянутую форму, которую,- в

первом приближении, можно аппроксимировать эллипсоидом вращения. Из результатов, полученных в нашей работе методами кинетики и седиментации, следует, что оптимальная степень гидратации для функционирования мономера ГАФД равна 21. Таким образом, мономер ГАФД (имеющий форму вытянутого эллипсоида вращения) характеризуется длиной большой полуоси 36 А, что соответствует радиусу обращенных"мицелл с иоопт=21.Малая ось такого эллипсоида, определенная из значения объема молекулы мономера ГАФД, оказывается по размеру в два раза меньше, т.е.-соотношение осей было 2:1. Таким образом, согласно предложенной нами модели молекул;^ономера ГАФД, эта олигомерная форма фермента представляет собой эллипсоид с полуосями 18х1Вх36А. Схематическое изображение мономера ГАФД в системе обращенных мицелл представлено на рис.6а. Здесь же (рис.бв.) показана модель организации тетрамера ГАФД в мицеллах. Как видно, молекула тетрамера имеет форму "бабочки", состоящей из четырех одинаковых мономеров, каждый из которых является эллипсоидом с соотношением осей 2:1. Диаметр такого тетрамера

Г) . с.

равен 122А. Такой'же размер имеют мицеллы со степенью гидратации 38. Именно при этом значении и -наблюдается оптимум для функционирования тетрамера ГАФД (см. рис.1.).

Предложенная модель организации тетрамера ГАФД в системе обращенных мицелл, с одной стороны, согласуется с экспериментальными результатами, полученными нами при изучении собственной белковой флуоресценции ГАФД в мицеллах, а с другой, не противоречит данным рентгеноструктурной кристаллографии для ГАФД из скелетных мышц омара (козетапп,1974).

На рис.7а. представлена зависимость интенсивности собственной белковой флуоресценции ГАФД от степени гидратации в системе

обращенных мицелл. Видно, что интенсивность флуоресценции для зоны функционирования ГАФД в форме мономера (ио от 16 до 22) и для зоны

а

мицелла а.

Рис,6.Модели организации различных олигомерных

форм ГАФД в системе обращенных мицэлл:

а.мономер,- б.димер,- в.тетрзмер,

тетрамера (у»0 от 30 до 40) незначительно отличаются друг от друга.

Это, вероятно, указывает на то, что количество контактов мономера

и тетрамера ГАФД с мицеллярной матрицей мало меняется при переходе

от одной олигомврной формы к другой. В то же время, имеется резкое

увеличение интенсивности белковой флуоресценции ГАФД при степенях

гидратации от 22 до'30, т.е. в зоне функционирования фермента в

форме. димера. Вероятно, димер ГАФД локализован в обращенных

мицеллах иначе, чем мономер и тетрамер. На рис.60, показана модель

организации дилера ГАФД. Мы .видим, что димер представляет собой о

половинный фрагмент тетрамера,ц в этом случае имеет повышенное

■в. g.

число контактов с мицеллярной матрицей. Размер такого димера равен размеру мицелл с нпП=28 (92 А).

г. Изучение белок-белковых взаимодействий при совлэстол Функционировании ГАФЛ и ЛАГ б системе обращенных яхщелл.

2Л.Регуляция каталитической активности ГАФД в присутствии ЛДГ изменением содержания воды в системе обращенных мицелл. Мы полагали, что если между ферментами существует взаимодействие, то оно должно-отразиться на профиле зависимости максимальной скорости (V ) от степени гидратации реакции катализируемей ГАФД в присутствии ЛДГ.

На рис.8, представлена эта зависимость. Для сравнения здесь же дана зависимость 7лах для ГАФД о: мо и в отсутствии ЛДГ. .Как видно из этих данных,профиль зависимости 7гоах от в присутствии ЛДГ сильно меняется (в то же время внесение БСА не изменяет зтот профиль).

2.2.Регуляция каталитической активности ЛДГ в присутствии ГАФД

а__ъ_____

изменением содержания воды в системе обращенных мицелл. Аналогичные результаты были получены для ЛДГ при изучении зависимости от степени гидратации реакции катализируемой

этим ферментом в присутствии ГАФД <рис.9.).

Из этих данных следует, что ГАФД изменяет профиль зависимости ушах Реакчш катализируемой ЛДГ от ио в системе обращенных мицелл (присутствие БСА не влияет на vraax для ЛДГ).

Таким образом, оба фермента влияют на каталитические активности друг друга, что, по-видимому, связано с существованием специфических взаимодействий между ниш и образованием смешанных белковых ассоциатов.

2.3.Флуоресцентный анализ ГАФД',меченный лво, в присутствии и отсутствши ЛДГ в системе обращенных мицелл.

Независимым физико-химическим методом,а именно флуоресцентной

ности собственной белковой ' белковой флуоресценции ГАФД

флуоресценции ГАФД от степени в системе обращенных миценлл

3.

гидратации в системе обращен- 1.и =18; 2.и «24;и =14.

' о о о

мицелл." .

спектроскопией, было проведено исследование взаимодействий между

ферментами. Для этого один из них,ГАФД,был модифицирован ыво-

ь

хлоридом,а другой, ЛДГ, сохранялся нативным и добавлялся к

меченной ГАФД. На рис.Ю. показаны спектры флуоресценции ыво, ковалентно связанного с ГАФД. Спектры сняты при степенях гидратации 21 и 34, что соответствует двум новым максимумам на зависимости у|пах от «о для ГАФД в присутствии ЛДГ.

в присутствии ЛДГ. Пунктиром показана . зависимость в

V „„ для ГАФД от в отсутствии ЛДГ.

шал О

Как видно из рис.10, . интенсивность . флуоресценции модифицированной ывр ГАФД в присутствии ДДГ- значительно возрастает, что,по-видимому.является еще одним доказательством (в дополнение к изменении кинетических параметров ГАФД и, ДДГ в присутствии друг друга) наличия взаимодействий между этими дегидрогеназами.При внесении в систему обращенных мицелл БСА (вместо ЛДГ) интенсивность флуоресценции меченной ыви ГАФД не изменяется, что в совокупности с кинетическими данными,полученными для этой пары белков, указывает на отсутствие взаимодействий между ГАФД и БСА. Следует отметить, что в условиях эксперимента в

системе всегда существуют значительные избытки не содержащих белок мицелл, в которые могли бы включаться молекулы ЛДГ, как

о Чо

1С

г

X О л5

6

10

25

го

15

10

5

0

4-

12

14

1« 12

го

Рис.9. Зависимость чтах присутствии ГАФД

гг Й гб гк ло эг лч дб ™<>

от и реакции катализируемой ЛДГ в

Пунктиром показана зависимость

ЛДГ от ио в отсутствии ГАФД.

Рис. 10.Спектры флуоресценции ГAФД-NBD в системе обращенных мицелл.

1.ио"21,ГАФД-ыв0;

2.У)о-21,ГАФД-МВ0 В ПРИСУТСТВИИ ЛДГ;

3.Ио=34,ГАФД-ЫВ0;

4.Ио=3 4,ГАФД-ЫВ0 В

присутствии ЛДГ.

5СО

5ю

Ь'бо "

59о :

620

/V««)

это, вероятно, происходит в случае с БСА. Однако молекулы ЛДГ

предпочитают встраиваться в те мицелЛы, где уже находятся молекулы ГЛФД, и образовывать там биферментные комплексы. ■

2.4. Селиментационный анализ ГАФД-ывс в присутствии ЛДГ в

системе обращенных мицелл. Для того, чтобы определить стехиометрию образующихся белок-белковых комплексов, нами был проведен седиментационный анализ ГАФД и ЛДГ в системе обращенных мицелл. На рис.На показан типичный вид седшентограммы, полученной для модифицированной ыво ГАФД в. отсутствии ЛДГ. Мы видим наличие только одной границы седиментации, что указывает на гомогенность этой системы. На рис. 116 и Ир приведены седиментограммы для ГАФД-ыво в присутствии ЛДГ.Из этих данных следует,что если в мицеллах находится пара этих ферментов,то на седиментограмме имеются две границы, из них первая отражает существование в системе некой тяжелой фракции,вероятно,это и есть - биферментный комплекс; вторая характерна для свободной (не связанной в комплексе), меченной ГАФД.

Рис.II.Седиментограммы для ГАФД-ывп в системе обращенных мицелл при ио=з4. а.ГАФД-№В;б.ГАФД-ыво в присутствии ЛДГ (избыток в 5 раз);Б.ГАФД-ывп в присутствии ЛДГ (избыток в

10 раз).

Из экспериментальных данных были определены коэффициенты седиментации, а потом и молекулярные массы образующихся белковых

фракций (см.формулу (2)). Мы установили, что при степени гидратации 21 в системе обращенных мицелл образуется комплекс между мономером ГАФД и мономером ЛДГ,- при степени гидратации 34 - комплекс между димером ГАФД и тетрамером ЛДГ.

Таким образом, в работе были получены различные по--Стехиометрии , белок-белковые комплексы между ГАФД и ЛДГ. Схематическое изображение моделей указанных комплексов приведено на рис.12.

Рис.12.Модели организации комплексов между ГАФД и ЛЦГ

в системе обращенных мицелл.

I- молекула ГАФД;2- молекула ЛДГ; .

Сфера-это обращенная мицелла.

В диссертации показано, что при гомо- и гетеро-'

олигомеризаДии . мономера ГАФД происходит увеличение его

каталитической активности (см. рис. I и 8), что, по-видимому,

связано, с. существованием различных типов белок-белковых

о

взаимодействий.

выволы

Г. В системе обращенных мицелл АОГ в октвне получены различные каталитически активные формы ГАФД: мономер, димер, тетрамер.

2. Изменение размера мицелл приводит к изменению каталитической активности ГАФД, что обусловлено различием величин кщ для 3-ФГА и vmax реакции катализируемой ГАФД.

3. Предложены модели организации различных олигомэрных форм ГАФД в системе обращенных мицелл,

4. Установлено, что между.ГАФД и ЛДГ происходит образование различных по стехиометрии комплексов. Получен белок-белковый комплекс меаду мономером ГАФД и мономером ЛДГ и комплекс между димером ГАФД и тетремором ЛДГ.. ■

5. Гомо- и гетеро- олигомеризация мономера ГАФД сопровождается увеличением его каталитической активности. ;

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях i

1. Ш.Меркер, А.В.Зарозэ, Н.Л.Клячко, А.В.Кабанов, М.В.Иванов, A.B. Левашов. Олигомерные, ферменты в обращенных мицеллах: лактатдегид-

п

рогеназа, глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа// Тез.. докл.. X Объединенного Симпоз. Биохим. Обществ, Ташкент, 1989, с.52-53.

2. A.Kabanov, N.Klyachko, S.Nametkin, St.Herker, A.Zaroza, V.Bunik, M.Ivanov, A.Levashov. Engineering of functional supra-macromolecular complexes of proteins (enzymes) using reversed . micelles as matrix microreactors.// Protein Engineering. 1991. V, 4. N 8. P. 1009-1017.

3. А.В.Угольнпкова, Н.Л.КЛЯЧКО, М.В.Иванов. А.В.Левашов. Регуляция надмолекулярной структуры . и каталитической . активности ■ D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы в системе обращенных мицелл Аэрозоля-ОТ в октане//Бяохимия,-1994 (в печати)..