Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль NH2-концевого участка цепи Вбета в процессе самосборки фибрина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль NH2-концевого участка цепи Вбета в процессе самосборки фибрина"

?Г5 Ой

, г - «{-г •

1 и V , і 1 "

ПЛЦЮПЛЛЫ1Л АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. Палладіна

На правах рукопису

ЧУДНОВЕЦЬ Віктор Степанович

РОЛЬ >ШгКІНЦЕВОГО ФРАГМЕНТУ ЛАНЦЮГА Вр В ПРОЦЕСІ САМОСКЛАДАННЯ ФІБРИНУ

03.00.04 - біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ 1995

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України.

Науковий керівник кандидат біологічних наук, с.н.с.,

в.о. завідуючого відділу молекулярної імунології Луговський Е.В.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

професор Веремєєнко К.М.

доктор біологічних наук, с.н.с. Варецька Т.В.

Провідна організація - Інститут біоорганічної хімії та

нафтохімії HÂH України. •

Захист відбудеться ЗО жовтня 1995 року о 14:00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.84.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 252601, Київ-30, вул. Леон-товича, 9. .

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Автореферат розісланий ЗО вересня 1995 року.

>

Вчений секретар спеціалізованої ради

О.В. Кірсенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Фібриноген є центральною компонентою системи зсідання крові, який під дією тромбіну перетворюється в фібрин, здатний спонтанно полімеризуватися з утворенням фібринового гелю (Doolittle, 1984). Асоціація фібрину проходить ступінчасто і є шісокоупорядконаким процесом, в якому функціональна роль і просторове положення кожної молекули детерміновано. Полімеризація обумовлена взаємодією мономсрних молекул та їх надмолекулярних структур за допомогою специфічних центрів “А”, “В”, розташованих в N-кінцевих ділянках а- та ß-ланцюгів одної молекули (Doolittle R. et al., 1980), з комплементарними їм центрами “а”, “Ь”, які знаходяться в С-кінцевих ділянках у- та ß-лан-цюгів другої молекули (Shimizu A. et al., 1992, Medved L.V. et al., 1993). Самоскладання фібрину стає можливим після відщеплення FpA (Blomback В. et al., 1979). При цьому утворюється fmdesAA, який має здатність асоціювати з утворенням повноцінного згустку. При відщепленні FpB тромбіном утворюється fmdesAABB, у якого полімеризаційна активність більша, ніж у fmdesAA (Siebenlist K.R. et al., 1990, Weisel J.W. et al, 1986). В літературі представлені різні міркування про роль відщеплення FpB (Doolittle R. ct al., 1984, Pandya B.V. et al., 1991), але функція його вивільнення на сьогоднішній день остаточно не визначена. З мономерів за рахунок взаємодії центрів “А” - “а" спочатку формуються протофібрили, товщина яких дорівнює товщині двох молекул фібрину (Ferry J., 1952, Krakow et а!., 1972). Після досягнення певної довжини протофібрили латерально асоціюють, утворюючи основний елемент трьохвимірко! фібринової сітки - фібрили (Hantgan R. et al., 1980). Механізм латеральної асоціації протофібрил в фібрили остаточно не з'ясований до цього часу.

МЕТА РОБОТИ ТА ЗАВДАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ. Метою роботи було вивчення ролі N-кінцевої ділянки ланцюга Bß при полімеризації мономерного фібрину в згусток, а також ролі вивільнення FpB та впливу Са'2+ на цей процес. Виходячи з мети дослідження та враховуючи стан проблеми самоскладання фібрину, були визначені такі завдання експериментальних досліджень:

1. Вивчити функціональну роль N-кінцсвої ділянки ланцюга Bß фібриногену в процесі самоскладання фібрину, використовуючи моно-клональні антитіла, з епітопами для них в цій ділянці молекули.

2. Вивчити вплив D- та D-D-фрагментів на процес полімеризації двох форм мономерного фібрину.

3. Провести дослідження механізму взаємодії N-кінцевої ділянки ланцюга В0 фібрину з D- та D-D-фрагментами.

4. Порівняти полімеризацію двох форм мономерного фібрину та її залежність від концентрації іонів Са2+.

НАУКОВА НОВИЗНА. Для виконання роботи було розроблено метод отримання поліпептидних ланцюгів - фрагментів фібрин(оген)у: Аа1-51, Вр 1-118, а17-5і, р15-118, yl-78. Також були отримані моноклольні антитіла 2d-2a та їх Fab-фрагменти (з епіто-пами для них в N-кінцевій ділянці молекули), які були високо-специфічними та ефективними інгібіторами полімеризації фібрину. За допомогою цих моноклональних антитіл показана участь N-кінцевої ділянки пептидного фрагменту 15-53 ¡3-ланцюга фібрину, що озна-чає участь центрального Е-домену молекули в процесі латеральної асоціації протофібрил. На отриманих високоактивних плазмінових фрагментах (D- та D-D-) фібрину людини показано, що D-D-фрагмент є вдвічі сильніший інгібітор полімеризації фібрину. Показано комплексоутворення (115-118 з цими фрагментами фібрину при низькій температурі, яке моделювало зв'язування центрів “В” - "Ь" в процесі полімеризації. Знайдено, що при утворенні комплексу з рі5-118 фрагмент D-D втрачав властивості інгібітора полімеризації фібрину, тоді як D-фрагмент їх зберігав. При цьому знайдено, що D-фрагмент набував здібності до утворення димерів, що свідчило про збільшення обопільної спорідненності D-доменів фібрину після зв’язування центрів “В” -”Ь” типу.

ПРАКТИЧНА ЗНАЧИМІСТЬ РОБОТИ. Показана можливість використання моноклональних антитіл та їх Fab-фрагментів як молекулярних зондів при вивченні механізму полімеризації фібрину. Отримані результати дозволяють глибше з’ясувати механізм полімеризації фібрину та можуть бути корисними для розробки діагностики тромбозів.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріали дисертації доповідались на Всесоюзному симпозіумі по хімії пептидів (Рига, 1990), на VIII

Симпозіумі по хімії пептидів та білків FRG-USSR (Aachen, 1991), на II Симпозіумі по хімії пептидів та білків, Росія-Ізраїль (Москва, 1992), на XII Міжнародній школі по фібриногену (Wrightsville Beach USA, 1993), на XIII Міжнародній школі по фібриногену (Manchester, 1994) та на наукових семінарах відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Малладіна HAÏ І України.

СТРУКТУРА ДИСЕРТАЦІЇ. Дисертаційну роботу викладено на 101 сторінках машинописного тексту. Робота складається зі вступу, чотирьох глав, списку літератури, з 185-и посилань на роботи вітчизняних та зарубіжних авторів, 43-х рисунків, 9-й таблиць.

КОНКРЕТНИЙ ОСОБИСТИЙ ВНЕСОК ДИСЕРТАНТА. Експериментальна частина роботи виконана дисертантом особисто.

МЕТОДОЛОГІЯ, МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.

Фібриноген одержували із плазми кропі людини методом висолювання сульфатом натрію (Варсцкая и др., 1960).

Фібрин-мономер desAABB одержували при обробці фібриногену тромбіпом з наступним розчиненням згустку в 0,15% розчині оцетової кислоти (Белицер и др., 1968).

Фібрин-мономер desAA одержували, використовуючи обмежений тромбіновий гідроліз фібриногену (Луговской и др., 1978). Мшокдощлм^жтатіда (монАТ) до центральної частини молекул фібриногену та фібрину, виготовлені при гібридизації 50% поліетиленгликолем спленоцитів мишей лінії BALB/c, які були імунізовані внутрічеревно NDSK/desAABB-NDSK з клітинами мієломи X63-Ag8.6.5.3. Специфічність монАТ визначали методом твердофазного імуноферментного аналізу (Колесникова и др:, 1991). Fab-фрагменти моноклональиих антитіл одержували, застосовуючи панаїновий гідроліз при ваговому співвідношенні ферменту до субстрату 32:100. Гідроліз зупиняли, додаючи монойодоцетову кислоту до кінцевої концентрації ЮцкМ, а суміш Fab- та Fc-фрагментів розділяли методом афінної хроматографії на колонках з носіями: протеїн А-сефарозою та фібриноген-сефарозою (Луговской и др., 1995). D-фрагменти одержували плазміновим гідролізом непрошитого фібрину в присутності кальцію.

D-D-фрагменти одержували плазміновим гідролізом прошитого фібрину в присутності кальцію.

МП5К та сІезААВВ-НРЗК одержували шляхом бромціанового розщеплення фібриногену (1,3г ВгСИ на 1г фібриногену) в 70% мурашиній кислоті. Очищені фрагменти виділяли хроматографічно (Чудновец и др., 1991).

Очистку відновленних та карбосиметильованих фрагментів поліпен-тидних ланцюгів, які складали ИРЗК та desAABB'NDSK проводили методом НРІХ на колонці ХогЬах С-18 (Чудновец и др., 1991).

ланцюгах визначали на амінокислотному сіквенаторі в лабораторії

І.В. Назімова в Інституті біоорганічної хімії ім. ИІемякіна АН Росії. Антиполімеризанійну активність антитіл та фрагментів реєстрували по зміні параметрів, характерних для формування згустків (Еигіап сі аі., 1973) на спектрофотометрі СФ-26 (ЛОМО).

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ.

ВПЛИВ МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ ТА ЇХ ЕаЬ-ФРАГМЕН-ТІВ НА ПРОЦЕС САМОСКЛАДАННЯ ФІБРИНУ.

Перша частина роботи включає результати, які були отримані при вивченні впливу моноклональних антитіл та їх РаЬ-фрагментів на процес самоскладання фібрину.

З ряду моноклональних антитіл, отриманих проти М-кінцевих ди-сульфідних вузлів фібриногену та фібрину, були відібрані три ім-муноглобуліни класу Є, які мали різну специфічність до фібриногену та фібрину.

З Таблиці 1 видно, що епітопи всіх трьох монАТ були розташовані в 1\т-кінцевому фрагменті ланцюга Вр до 54 амінокислотного залишку (епітоп для монАТ 2d-2a включав пептидний зв'язок ВрА^14-ау15).

___________________________________________________Таблиця 1

Антиген монАТ

2сі-2а* В-4С” О-ІВ**

фібриноген 1,0 х 10‘9М 2,3 х 10’7М 3,4 х <0'7М

ШйК 6,4 х 10'8М 1,0 х 10-'М 1,7 х 10‘7М

а^ААВВ-ШЯК - 2,7 х 10‘8М 5,6 х 10'7М

Е3 - -

Аа(1-51) 5,8 х 10‘6М 3,0 х 10'6М ■

а(17-51) - - -

Вр(1-118) 5,3 х 1СГ8М 1,2 х 10‘7М 3,0 х 10'7М

Р(15-118) - 2,6 х 10'7М 2,7 х 10'7М

у(1-78) - 1,4 х 10"7М 6.8 х І0-7М

* - антитіла отримані проти ^’ПБК; *• - аіггіггіла оі-римані проти (^ААВВ-ЖЗК

Вплив моноклональних антитіл іга полімеризацію фібрину вивчали методом розсіювання світла. Хантган із співробітниками показали, що характерні криві змінювання світлорозсіювання при полімеризації фібрину відображають двостадійність процесу самоскладання. Період від початку полімеризації до різкого зростання розсіювання світла відповідає стадії формування протофібрил. Період різкого зростання розсіювання світла відповідає другій стадії самоскладання

і відображає латеральну асоціацію протофібрил у фібрили. Для характеристики першої стадії самоскладання користуються параметром т, який відповідає оберненій величині швидкості формування протофібрил, а другої стадії параметром V, який відповідає максимальній швидкості зростання розсіювання світла і характеризує швидкість латеральної асоціації протофібрил.

Нами було встановлено, що збільшення концентрації монАТ 2сІ-2а суттєво зменшувало швидкість латеральної асоціації протофібрил у фібрили, як при активації фібриногену тромбіном, так і при полімеризації їщскзАА (Рис. 1). Присутність монАТ 2сІ-2а не впливала на полімеризаційні властивості іщ<іехААВВ (Рис. 1).

Рис. 1. Залежність швидкості латеральної асоціації протофібрил (V) від концентрації монАТ 2с1-2а; а - полімеризація ^„сІїкААВВ в присутності монАТ; 6 - зсідання фібриногену в присутності тромбіну монАТ; в - полімеризація

2 3 ^ііеяАА в при-сутності монАТ

Слід відзначити, іцо гальмування полімеризації фібрину монАТ 2(і-2а було писокоспсцифічним, на що вказувало максимальне інгібування процесу вже при еквімолярному співвідношенні антитіл до нолімери-зуючогося білісі

На Рисунку 2 видно, що при еквімолярному співвідношенні антитіл до полімсризуючогося білка (в системі фібриноген + тромбін) кількість відщеплюсмих РрВ зменшувалась вдвічі і залишалась постійного при подальшому збільшенні концентрації антитіл (Рис. 2а). Таким чином, в присутності антитіл від димерної молекули фібриногену відщеплювався лише один моль РрВ.

РрЛ

РрВ

РрВ

20 30 40 мин

Рис. 2. Хроматографічний розподіл суміші фибринопсптидів через три години реакції фібриногену з тромбіном:

а - при відсутності монАТ 2с1-2а; б - в присутності монАТ 2с1-2а.

20 ЗО 40 мий

04

2 0.3

0.2

0.1

0.1

а

0

Рис. 2а. Залежність кількості

від-деплюємого КрВ від

концентрації монЛТ 2сі-2а.

(Зррв/^ррА " величина, характеризуюча кількість РрВ, відщеплю-ємих при взаємодії фібриногену з тромбіном)

Оскільки в димерній молекулі фібриногену знаходяться два ештони до монАТ 2(1-2а, то було зроблено висновок, що одна молекула з молекулярною масою 150 кДа з'єднувалась з одним зі своїх епі-топів та блокувала один пептидний зв'язок (314-15. Другий зв'язок залишався доступним дії тромбіну, що обумовлювало відщеплення одного моля РрВ від одного моля субстрату.

Присутність РаЬ-фрагментів монАТ 2с1-2а у кількості, яка перебільшувала два молі на один моль фібриногену, призводила майже до повного інгібування полімеризації фібрину. При такій концентрації РаЬ-фрагментів швидкість латеральної асоціації протофібрил була близькою до нуля (Рис. 3).

Рис. 3. Залежність швидкості лагге-ральноТ асоціації від концентрації РаЬ-фрагментів монДТ 2сі-2а

М р'аЬ Мр

На Рисунку 4 видно, що коли у реакційній суміші знаходився подвійний молярний надлишок РаЬ-фрагментів монАТ 2с1-2а, РрВ майже не відщеплювалися. '

0 і •

РрВ

РрБ

Рис. 4. Хроматографічний розподіл суміші фибринопсптилш через три години реакції фібриногену з тромбіном:

а - при відсутності НаЬ-фрагментів монАТ 2сі-2а;

б - в присутності РаЬ-фрагментів монЛТ 2<І-2а.

Такі дані свідчи ли про тс, що дві молекули РаЬ-фрагаелтів монАТ 2сі-2а з'єднувались з обома псптидними зв'язками Р14-15 молекули фібриногену. Отже, з молекулою фібрин(оген)у мали можливість одночасно взаємодіяти або одна молекула монАТ 2с1-2а, або дві молекули РаЬ-фрагментів. Виходячи з цього факту, можна зробити висновок про те, що відстань між двома пеитидними зв'язками рі4-15 менша, ніж два діаметри молекули ^С, але більша, ніж два діаметри РаЬ-фрагменту.

З літературних даних відомо, шо N-кінцевий фрагмент )3-ланщога фібрину містить функціонально важливі ділянки, які забезпечують нормальну полімеризацію фібрину. Відомо і те, що фібрин, в якому ці ділянки пошкоджені генетично (Liu C.Y., et al., 1985) чи модифіковані хімічно (Pandya B.V. et al., 1985, Shimizu A., 1986), має ослаблені полімеризаційні властивості. Наші результати показали, що взаємодія молекули монАТ 2d-2a з одним із пептидних зв'язків Р14-15, призводила до зменшення швидкості полімеризації вдвічі. Приєднання до обох цих енітопів Fab-фрагментів монАТ 2d-2a повністю подавляло процес латеральної асоціації протофібрил фібрину. Виходячи з цього, ми зробили висновок, що один з центрів латеральної асоціації протофібрил фібрину розташований в центральному Е-домені молекули, а саме в N-кінцевому фрагменті ланцюга Вр.

роботи містить результати детального вивчення взаємодії ланцюга р 15-118 з плазміновими О- та О-О-фрагментами фібрину.

Було встановлено, що при 37°С поліпептидний ланцюг р15-118 навіть в десятикратному молярному надлишку не гальмував полімеризації ні fmdes-AABB1 ні і^еяАА (Рис. 5).

Рис. 5. Вплив Р15-118 на полімеризацію фібрину при 'Л7°С а - полімеризація ^гіевЛАВВ; б -полімеризація £ті1сйААВВ в присутності р15-118; в - полімеризація ^„(ісйАА; 6 - полімеризація

^¿еяАА в присутності (И 5-118;

Однак яри зниженні температури до 12°С було виявлено гальмування полімеризації, як ід^ехААВВ, так і ї^евАА (Рис 6).

Рис. 6. Вплив {¡15-118 на полімеризацію фібрину при 12°С а - полімеризація І"п)(к'яАЛІШ; б -полімеризація ^(іеяЛЛВИ в присутності (315-118; в - полімеризація іт(іе5АА; б - полімеризація ^¿свЛА в присутності Р15-118;

час.с

Це погоджується з даними Шайнова і Дардік, які визначили, що взаємодія центрів “В” - ”Ь” збільшується при низьких температурах (Shainoff J.R., Dardik B.N., 1979).

Так як у D- та D-D-фрагментах знаходились центри полімеризації “Ь”, то при зниженні температури можна було очікувати пряму взаємодію пептиду (315-118 з D- та D-D-фрагментами, яка моделювала б взаємодію центрів “Ті” - ”Ь”.

Дійсно, якщо попередня інкубація D-D з [315-118 при 37°С практично не порушувала гальмуючої дії D-D-фрагмелту (Рис. 7),

Рис. 7. Вплив Р15-118 інкубова-ііого з D-D-фрагмсіггом при 37°С та 12°С на полімеризацію fmdesAAHH

а - полімеризація fmdesAABB; б -полімеризація fmdesAABB у присутності Р15-118 інкубованого з D-D-фрагментом при 12°С; в -полімеризація fmdcsAA в присутності Р15-118 інкубованего з D-D-фрагментом при 37°С: г - полімеризація £mdesAABB у присутності D-D-фрагмента

то інкубація десятикратного молярного надлишку пептиду ¡315-118 з D-D при 12°С суттєво послаблювала його гальмівну дію (Рис. 8).

час,с

0,15

Рис. 8. Вплив Р15-118 інкубован-ної з В-фрагментом при 12°С на полімеризацію ^сісь'ЛАВВ

а - полімеризація £т(іе8АЛВВ; б -полімеризація Гтс1е$ААВВ в присутності р15-118 інкубованого з О-фрагментом; в - полімеризація {тс1езАА в присутності Е)-фраг-мснта

иГ

о

1Л

0,05

ОДО

о М

40

60

80

100

час,с

Це свідчило про специфічну взаємодію Р15-118 з О-О-фрагментом, в результаті якої утворювався комплекс 0-Г)*р15-118 без гальмівних властивостей. Очевидно, зв'язування комплементарних центрів полімеризації “В” та “Ь” призводило до взаємного блокування. Попередня інкубація фрагменту ланцюга р 15-118 з Б-фрагментом не впливала на гальмівну властивість останнього при утворенні комплексу.

Взаємодію р 15-118 з Б- та Б-Б-фрагмептами, внаслідок якої утворювались комплекси, було підтверджено методом “нативного” електрофорезу в ПАЛГ. Але дані, отримані вкачаним методом, вірогідно вказували тільки на зміну заряду. Цього було недостатньо для повної характеристики комплексів. Перш за все, необхідно було порівняти молекулярну масу комплексів, що утворювались. Для цього застосовували метод гельфільтрації

Е280 0.03:

0.02

Рис. 9. Хроматографічний розподіл суміші О-О-димеру та комплексу 0-0»рі5-118 при 12°С

0.01-

ф-Ці—і------- ■ і--------------,-------------1*

10 15 20 25

час.хб

Хроматографічний аналіз суміші показав, що комплекс В-[>р15-!18 при 12°С елтогавався одним гомогенним піком, час елюції якого відповідав часу елюції В-Б-фрагменту (Рис. 9).

Цс значило, що зміна рухомості комплексу 0-П*|315-118 при електрофорезі не була пов'язана з збільшенням його молекулярної маси, а визначалася, перш за все, зміною заряду за рахунок низькомолекулярного фрагменту рі5-118.

При гельфільтрації попередньо інкубошшої при 12°С, суміші 0-мономерів з (І15-118 було виявлено два піки (Рис. 10). При цьому положення піку 2 відповідало часу елюції О-фрагменту, а положення піку 1 - часу елюції І>О-фрагменту. Таким чином, в піці

2 елюювався вільний Б-фрагмент, який знаходився в суміші поза комплексом, а виявлення піку з подвоєною молекулярною масою було обумовлено димеризацією І)-фрагменту після його взаємодії з Р15-118.

Таким чином, Б-В-фрагмент після взаємодії з 315-118 повністю втрачав здатність гальмувати полімеризацію фібрину, а Г)-фрагмснт виявляв тенденцію до димеризації.

Ег?о

0.03^

0.02

0.01

10

15 20

час.хЬ

Рис. 10. Хроматографічний розподіл суміші О-фраімеїпу га димерного комплексу 0»р 15-118

при 12°С

1 - димгртшіі комплекс 0»р15-118;

2 - Б-фрагмент

25

Третя ^частина роботи включає результати, які були отримані при вивченні впливу Са2+ на процес полімеризації {ті1е«АА та 1шс1ез-ААВВ. З експериментальних даних, поданих на Рисунку 11, видно, що швидкість утворення протофібрил з мономерів сіеяААВВ та сієбАА залежить від концентрації Са2+.

Рис. 11. Залежність (оберненої величини швидкості) формування протофібрил ^(ІезЛАВВ (а) та

¡щЛеяАА (б) від концентрації Са2+

Вона значно зростає (т - змсньшується) зі збільшенням концентрації цього іону; За всіх концентрацій Са2+ швидкість утворення протофібрил з {щСІевААВВ була вищою, ніж для ^сІезАА. Вплив Са2+ особливо виражений за низьких концентрацій. В зоні фізіологічних концентрацій Са2+(1 х 10'3 М) вплив цього іону на даний процес знижується. Щодо двох форм мономерного фібрину, то вплив Са2+ на швидкість формування протофібрил з ^пс1е$АА значно сильніший, ніж для ^(ІєїААВВ, що особливо виражено для низьких концентрацій цього іону. Тобто, поява центру “В” (в ^(ІевААВВ) призводить до зростання швидкості утворення протофібрил та до зниження впливу іонів кальцію на цей процес. Принципово іншим виявився вилив Са2+ на швидкість латеральної асоціації протофібрил (Рис. 12), які утворювались з мономерів £т<1е8АА та ^сІсяААВВ.

1-Ю''

1-Ю-

Рис. 12. Залежність швидкості латеральної асоціації протофібрил з ЇщСіііААВВ (а) та протофібрил

з ІщСієїЛА (б) від концентрації Са2+

1-го'

Са*+,М

1-Ю'"

і-іог-1

Сі тостері гагться різке збільшення швидкості цього процесу для

ґшс1е$АЛВВ та значна сильніший вплив іонів кальцію для цієї форми мономеру особливо в зоні концентрацій, близьких до фізіологічних.

Даний феномен пов'язаний ні з чим іншим, як з появою “В” центру полімеризації, який формується в результаті відщеплення їїрВ, тобто при переході фібрин-мономеру ІЗ форми ІщСІезЛЛ в форму (п^еэААВВ. -

Як виявилося, і властивості гелів, сформованих з ^НеяАА чи {ліСІевААВВ, теж відрізняються за наявності іоиіп кальцію. На Рисунку 13 показана залежність світлорозсіювання (щільності) гелів з {щСІезЛА від концентрації Са2+.

Рис. 13. Залежність світлорозсіювання гелів з fmdesAABB (а) іа з fmdesAA (б) від концентрації Са2+

1-Ю ^ н,0‘5 МО'4 МС'З 1-Ю’2

Са*\М

Гак, кінцева щільність гелю з fmdesAA значно нижча, ніж для гелю

з fmdesAABB. Це, перш за все, також зумовлюється появою “В’1 центрів полімеризації. Однако, залежність кінцевої мутності гелів

від іонів Са2"'' для обох форм мономеру абсолютно однакова. Результати повністю погоджуються з даними, які були отримані

раніше іншими авторами. Наприклад, за даними Лаудано та

Дулітла, взаємодія фібриногену з тетрагіептндом Giy-His-Arg-Pro,

який і7 М-кінцевим фрагментом (3-лаішюга, значно збільшується в присутності Са2г в концентрації 2 х 10'3 М (Laudano А.Р., Doolittle R.F., 1981). Міхалі було встановлено, що кінетика вивільнення FpB корелювала з вмістом вільного кальцію в середовищі для полімеризації фібрину (Mihalyi Е., 1988). Наші результати виявили суттєвий вилив саме Са2+ на латеральну асоціацію протофібрил, яка різко збільшується при відщепленні FpB.

На підставі експериментальних та літературних даних послідовність подій, які мають місце при полімеризації фібрину, можна подати таким чином: після відщеплення від фібриногену тромбіном фібринпептидів А утворюється моиомерний фібрин сієїАА. В результаті спонтанного зв'язування центрів полімеризації “А” - ”а” утворюються,протофібрили, в яких надалі відбувається відщеплення РрВ з наступним зв'язуванням центрів “В” - ”Ь” типу. Цей процес супроводжується поглинанням іонів Са2+ з реакційної суміші і зміною конформації домену О, що призводить до знайденого нами експериментально збільшення взаємної спорідненості цих доменів, яке передбачали і інші автори раніше. Результати, які ми отримали при вивченні впливу іонів Са2+ на швидкість латеральної асоціації протофібрил фібрину, дозволяють припустити, що в зоні фізіологічних концентрацій Са2+ суттєву залежність від концентрації катіону проявляють центри, що формуються при відщепленні РрВ. На.нашу думку, вказані центри латеральної асоціації розташовані саме в зоні М-кінцсвої послідовності Вр-ланцюга фібрину.

ВИСНОВКИ:

1. Розроблено метод одержання поліпептидних ланцюгів - фрагментів фібрин(оген)у: Аа1-51, а17-51, Вр1-118, (315-118, у178.

2. Одержано моноклональні антитіла 2d-2a та їх Fab-фрагменти, які виявились високоспецифічними та ефективними інгібіторами полімеризації фібрину. За допомогою цих моноклональпих антитіл показана участь N-кінцевого фрагменту р-ланцюга фібрину в процесі латеральної асоціації протофібрнл.

3. Одержано високоактивні плазмінові фрагмент (D та D-D) фібрину людини. Показано, що в молярному відношенні D-D-фраг-мент вдвічі сильніший інгібітор полімеризації фібрину ніж D-фрагмент.

4. Показано комнлексоутворення Р15-118 з D- та D-D-фрагментами

фібрину при низькій температурі, яке моделює складання центрів “В” - ”Ь” в процесі полімеризації. При цьому фрагмент D-D втрачав властивості інгібітор» полімеризації фібрину. •

5. Знайдено, що при комплексоутворенні з Р15-118 D-фрагмент набував здатності до утворення димерін, що свідчило про збільшення взаємної спорідненості D-доменів фібрину, її процсссі полімеризації після зв'язування центрів “В” - '’І)” типу.

6. Підтверджено, що відщеплення FpB призводить до посилення латеральної асоціації нротофібрил та показана залежність цього процесу від концентрації Са2 ь.

7. На підставі експериментальних та літературних даних подана доповнена та детальніша схема послідовних подій, які мають місце в процесі полімеризації фібрину.

СІШСОК ОПУБЛІКОВАНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Колесникова И.Н., Буханевич А.М., Ситак И.Н., Ляшко Е.Д., Лу-говской Э.В., Макогоненко Е.М., Чудновец B.C., Гоголинская Г.К., Дсрзская Г.К., Комиссаренко С.В. Определение специфичности моноклональных антител к МН2-концсным дисульфидным узлам фибриногена и фибрина // Докл. АН Украины, 1991, №12,6 С. 101-103.

2. Луговской Э.В., Макогоненко Е.М., Чудновец B.C., Гоголинская Г.К., Колесникова И.Н., Буханевич А.М., Ситак И.Н., Ляшко Е.Д., Дерзская Г.К., Комиссаренко С.В. Исследование процессов ассоциации фибрина с помощью моноклональных антител // Биохим. Животных и человека, 1991, 15, С. 77-86.

3. Чудновец B.C., Луговской Э.В., Гоголинская Г.К., Дерзская Г.К., Назимов И.В., Комиссаренко С.В. Получение и использование по-липептидных цепей составляющих NH2-K<mценой дисульфидный узел фибриногена и фибрина // Всесоюзный симпозиум по химии пептидов, Рига, 1990, С. 49.

4. Чудновец B.C., Луговской Э.В., Гоголинская Г.К., Дерзская Г.К., Назимов И.В., Комиссаренко С.В. Выделение ЫН2-концевых дисуль-фидных узлов фибриногена и фибрина человека и фрагментов по-липептидных цепей, входящих в их состав // Докл. АН СССР, 1991, 317, №6 С. 1496-1499.

5. Lugovskoy E.V., Makogonenko Е.М., Chudnovets V.S., Derskaja S.G., Gogolinskaja G.K., Kolesnikova I.N., Buchancvich A.M., Sitak I.N., Ljashko E.D., Komissarenko S.V. The study of fibrin polymerization with monoklonal antibodies // Biomed. Sei., 1991, 2, P. 249-256.

6. Lugovskoy E.V., Chudnovets V.S., Derskaja S.G., Gogolinskaja G.K., Kolesnikova I.N., Komissarenko S.V. The study of fibrin polymerization with monoclonal antibodies. 8-th Symposium on chemistry of peptides and proteins. FRG-USSR, Aachen, 1991.

7. Lugovskoy E.V., Chudnovets V.S., Derskaja S.G., Gogolinskaja G.K., Kolesnikova I.N., Komissarenko S.V. The study of fibrin polymerization with monoclonal antibodies. Il-nd Simposium on peptides and proteins Russia-Israel, Moscow, 1992.

8. Lugovskoy E.V., Chudnovets V.S., Derskaja S.G., Gogolinskaja G.K., Kolesnikova I.N., Komissarenko S.V. Fibrin fragment ßl5-118. Its inhibitory and complex formation properties. XIII Int. Fibrinogen Workshop, Machester, September 14-16, 1994.

9. Луговской Э.В., Макогоненко Е.М., Чуднопец B.C., Дерзская Г.К., Гоголи некая Г.К., Колесникова И.П., Михаловская Л.И., Комисса-ренко С.В. Исследование полимеризации фибрина с помощью моноклональных антител 2d-2a и их Fab-фрагментов // Укр. Bsoxîm. журн., 1995, №1, С. 64-70.

10. Луговской Э.В., Макогоненко Б.М., Чудновец B.C., Дерзская Г.К., Гоголинская Г.К., Михаловская Л.И., Комиссаренко С.В. Фибриновый фрагмент [315-118. Ингибиторные и комплексообразующие свойства // Укр. EioxiM. журн., 1995, №4, С. 57-64.

Чудновец B.C. Роль ЫН2-концевого участка цепи Вр в процессе самосборки фибрина.

Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биохимии им. Л.В. Палладина НАН Украины, Киев, 1995.

Представленная работа содержит результаты изучения роли NH2-концсвого участка цепи Вр в процессе самосборки фибрина. Установлено участие фрагмента 15-53 p-цени фибрина, что означает участие центрального Е-домена молекулы в процессе латеральной ассоциации протофибрилл. Показано комплексообразование р15-118 с D- и D-D-фрагментами фибрина при низкой температуре. Найдено, что при образовании комплекса фрагмент D-D утрачивал свойства ингибитора полимеризации фибрина, тогда как D-фрагмент их сохранял. При этом было обнаружено, что D-фрагмент приобретал способность к образованию димеров. Полученные данные подтвердили, что отщепление FpB приводит к усилению латеральной ассоциации протофибрилл фибрина и показали зависимость этого процесса от концентрации Са2+.

Chudnovets V.S. Role of NII2-terminal part of Bp-chain in the process of fibrin assotiation.

The Dissertation Thesis for Obtaining a Scientific Degree of Phylosophy Doctor (Biology) in the Speciality 03.00.04 - Biochemistry. A.V. Palladin Institute of Ukraine National Academy of Science. Kiev. Ukraine.

This work contains study results of the role of NI12- terminal part of Bp chain in the process of fibrin assotiation. The participation of 15-53 fragment of fibrin p-chain is ascertained, which proved molecule central E-domain participation in the process of protofibrils lateral association. A complex formation of P15-118 with fibrin D- and DD-fragments under low temperature is proved. It is specified, that in the process of complex formation D-D-fragment lost its properties of fibrin polymerization inhibitor, while D-fragment preserved them. Notwithstanding, it was found out, that D-fragment obtained dimer formation ability. Data obtained have proved, that FpB splitting off can cause strengthening of protofibrils lateral association of fibrin and have explained the relation of the process and Ca2+ concentration.

Ключові слова; фібриноген, фібрин, моноклональні антитіла, D- та DD-фрагменти.