Роль нарушений энергетического метаболизма в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при гиперстимуляции глутаматных рецепторов

Михайлова, Мария Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль нарушений энергетического метаболизма в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при гиперстимуляции глутаматных рецепторов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль нарушений энергетического метаболизма в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при гиперстимуляции глутаматных рецепторов"

На правах рукописи УДК 577.3

□03052107

Михайлова Мария Михайловна

Роль нарушений энергетического метаболизма в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при гиперстимуляции глутаматиых рецепторов

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2007

003052107

Работа выполнена на кафедре молекулярной биофизики Московского Физико-Технического Института (ГУ), Научно-исследовательском Институте Патологии и Патофизиологии РАМН, лаборатории мембранологии с группой генетических исследований Научного центра здоровья детей РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Борис Израилевич Ходоров доктор медицинских наук, профессор Пинелис Всеволод Григорьевич

Официальные оппоненты: кандидат физико-математических наук,

Перевозчиков Николай Филиппович

доктор биологических наук, Хаспеков Леонид Георгиевич

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. Ломоносова

Защита диссертации состоится <1/2» 2007 г. в _10_ часов на заседании

диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте по адресу:

141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., д. 9, МФТИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан

2007 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.03 кандидат физико-математических наук

Брагин В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

В настоящее время считается установленным, что возбуждающие аминокислоты глутамат и аспартат играют важную роль в гибели нейронов при острых поражениях головного мозга, таких как инсульт, ишемия/гипоксия, а также различных нейродегенеративных процессах (Rothman and Olney, 1986; Lipton, 1999). Избыточное выделение и накопление глутамата во внеклеточном пространстве приводит к гиперстимуляции глутаматных рецепторов, открыванию >1-метил-П-аспартат-управляемых каналов и мощному потоку ионов Са2+ внутрь клетки. Основной моделью для изучения глутаматной нейротоксичности являются первичные культуры нервных клеток из различных областей мозга крыс или мышей. Показано, что глутаматная нейротоксичность опосредуется кальциевой перегрузкой нейронов (Hartley et al., 1993). Более детальное изучение изменений концентрации внутриклеточного Са2+ ([Са2+]0 при глутаматном воздействии привело к открытию явления, названного отсроченной кальциевой дизрегуляцией (ОКД). Оказалось, что первичный сравнительно небольшой подъем [Са2+]ь вызванный глутаматом в нейронах, через некоторое время сменяется сильньм необратимым увеличением [Са2+]; - ОКД (Tymianski et al., 1993; Vergun et al., 1999; Nicholls and Budd, 2000). Дальнейшие исследования показали, что культивируемые нейроны различного возраста по-разному отвечают на одно и тоже глутаматное воздействие. Так, молодые нейроны (6-10 дней в культуре) в ответ на 10-15 мин глутаматный удар отвечают небольшим обратимым подъемом [Ca2+]j, который сопровождается слабой митохондриальной деполяризацией (МД). В зрелых нейронах, содержащихся в культуре более 11 дней, в ответ на такое же воздействие глутамата развивается ОКД (Adamec et al., 1998) и сильная МД (Vergun et al, 1999). Причины возрастного различия в поведении нейронов при глутаматном воздействии и механизмы ОКД до сих пор остаются невыясненными.

Данная работа направлена на изучение зависимости устойчивости нейронов к гиперстимуляции глутаматных рецепторов от состояния их энергетического метаболизма. Исследование показало, что гликолиз играет ведущую роль в противодействии нейронов мозга нарушению кальциевого гомеостаза и дисфункции митохондрий, вызываемых глутаматом. Цели работы.

1. Исследовать роль энергетического метаболизма в регуляции внутриклеточной концентрации Са2+ и митохондриального потенциала нейронов в состоянии физиологического покоя.

2. Исследовать роль энергетического метаболизма в механизмах защиты нейронов от нарушений кальциевого гомеостаза и коллапса митохондриального потенциала, вызываемых глутаматом.

Задачи исследования.

1. В опытах на молодых нейронах мозжечка исследовать роль наружного Са2+, блокаторов глутаматных каналов и ингибитора АТФ-синтазы олигомицина в развитии митохондриальной деполяризации, возникающей в нейронах при замене глюкозы на 2-деокси-Б-глюкозу.

2. Исследовать роль митохондриальной поры в развитии отсроченной кальциевой дизрегуляции и митохондриальной деполяризации, вызванных токсическим глутаматным воздействием на нейроны, лишенные глюкозы.

3. Исследовать вклад реактивных форм кислорода в нарушение кальциевого гомеостаза и коллапс митохондриального потенциала, вызванных токсическим глутаматным воздействием на молодые нейроны, лишенные глюкозы.

4. Изучить влияние пирувата на развитие митохондриальной деполяризации, возникающей в нейронах в отсутствии глюкозы.

5. Изучить влияние пирувата на развитие отсроченной кальциевой дизрегуляции и митохондриальной деполяризации, вызванных токсическим воздействием глутамата на лишенные глюкозы нейроны.

6. Изучить вклад Ка+/Са2+-обменника и Ка+/К+-АТФазы в нарушение кальциевого гомеостаза и митохондриальную дисфункцию, вызванные глутаматным воздействием в молодых нейронах в отсутствии глюкозы.

7. Исследовать изменения содержания АТФ при воздействиях глутамата, 2-деокси-D-глюкозы и пирувата в гранулярных нейронах мозжечка, а также изменения уровня цитоплазматического и митохондриального АТФ в трансфецированных кортикальных нейронах, подвергнутых глутаматному воздействию.

Научная новизна.

В опытах на молодых культивируемых нейронах мозжечка впервые изучен механизм возникновения медленной деполяризации митохондрий, вызываемой длительной гшокозной депривацией (замены глюкозы на ее неметаболизируемый аналог 2-деокси-В-глюкозу). Показано, что эта митохондриальная деполяризация (МД) устойчива к удалению наружного Са2+ или антагонистов глутаматных рецепторов, но быстро подавляется блокатором АТФ-синтазы олигомицином и предотвращается пируватом.

Впервые показано, что глкжозная депривация значительно ускоряет развитие ОКД и сопровождающей ее сильной МД в молодых нейронах, подвергнутых глутаматному воздействию.

Впервые установлено, что ускорение развития ОКД в условиях гшокозной депривации нельзя объяснить ускорением открывания митохондриальной поры, поскольку блокада митохондриальной поры путем замены Са2+ на Sr2+ не изменяет латентного периода между первой и второй фазами подъема внутриклеточной концентрации Sr2+ (по сравнению с Са2+ -содержащей средой).

Впервые показано, что обработка культуры антиоксидантом МпТВАР или блокатором NO-синтазы L-NAME не оказывают заметного влияния на развитие ОКД и сильной митохондриальной деполяризации во время глутаматного воздействия в молодых нейронах, лишенных глюкозы. Сделано заключение, что ускорение развития ОКД и сильной митохондриальной деполяризации нельзя объяснить усилением синтеза реактивных форм кислорода и моноокиси азота при глюкозной депривации во время глутаматного воздействия в отсутствии глюкозы.

Впервые установлено, что добавление пирувата в безглюкозную среду предотвращает развитие ОКД и сильной митохондриальной деполяризации, вызванных глутаматом. Исходя из полученных данных сделано заключение, что основной причиной ускорения развития ОКД при глюкозной депривации является прекращение гликолитической продукции пирувата, ведущее к коллапсу митохондриального потенциала и торможению синтеза АТФ.

Научно-практическая значимость.

Полученные данные вносят существенный вклад в понимание клеточных процессов, позволяющих молодым нейронам длительное время противостоять токсическому воздействию нейромедиатора глутамата. Эти результаты могут помочь в разрешении медико-биологической проблемы возрастных различий в чувствительности нейронов к токсическому воздействию глутамата.

Показано, что захват Са2+ митохондриями играет ключевую роль в противостоянии нейронов токсическому глутаматному воздействию в условиях блокады гликолиза. Полученные результаты говорят о том, что разработка препаратов, направленных на повышение выживаемости нейронов головного мозга после ишемического инсульта, должна быть нацелена на восстановление и стабилизацию их гликолиза путем усиленной доставки нейронам мозга глюкозы и пирувата.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на конференциях: Съезд физиологического общества Великобритании (Лондон, 2002), III Съезд Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002), III Российский Конгресс по Патофизиологии, 48-ой Съезд Биофизического Общества (Балтимор, США, 2004), 34-ый Съезд Общества Нейронаук (Сан-Диего, США,

2004), конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва,

2005), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 9 тезисных сообщений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на культивируемых зернистых нейронах мозжечка и кортикальных нейронах крыс (6-10 дней в культуре, ДВК).

Для измерения [Ca2+]¡ нейроны нагружались Са2+-чуствительными зондами Fura-2(АМ) или Fura-2FF(AM). Для измерения митохондриального потенциала (Д*Рм) нейроны нагружались потенциал-чувствительным зондом родамин-123 (3.5 мкг/мл, 15 мин, Rh-123).

Измерения [Ca2+]¡ и проводились на инвертированном флуоресцентном

микроскопе Axiovert-200 ("Zeiss", Германия), оборудованном CCD камерой CoolSnap-fx ("Roper Scientific", США). Флуоресценция зондов возбуждалась светом от ксеноновой лампы, пропускаемым последовательно через светофильтры: 340 и 380 нм для Fura-2 (Fura-2FF) и 490 нм для Rh-123.

Данные, полученные с помощью Са2+-чувствительных зондов представлены как отношение флуоресценции, возбуждаемой светом с длинами волн 340 и 380 нм (РзадЯ^о)-Сигналы Rh-123 нормировались на базальный уровень флуоресценции.

Измерения уровня АТФ в культивируемых нейронах мозжечка проводились в лизатах клеток с помощью люциферин-люциферазной системы.

Для измерений уровня АТФ в митохондриях и цитозоле культивируемые нейроны коры головного мозга крыс трансфецировали с помощью реагента Lipofectaraine 2000 плазмидами, кодирующими изоформы люциферазы, селективно экспрессирующейся в митохондриях (mtLuc) и цитозоле (cytLuc), соответственно. Культуры перфузировались раствором, содержащим люциферин (20 мкМ). Измерения проводились с помощью счетчика квантов.

В экспериментах со Sr2*, ионы Са2+ полностью заменялись на ионы Sr2+ во внеклеточной среде. В экспериментах с циклоспорином А (ЦсА), ингибитор в концентрации 1мкМ или 0.5 мкМ добавлялся к клеткам вместе с флуоресцентными красителями и далее присутствовал во всех растворах, в которых содержалась 2-деокси-О-глюкоза. В экспериментах с антиоксидантом МпТВАР до начала эксперимента нейроны 30 мин инкубировали в буфере, содержащем глюкозу и антиоксидант МпТВАР (200 мкМ). МпТВАР присутствовал далее во всех растворах за исключением калибровочных: FCCP и Iono.

Плазмиды белков любезно предоставлены проф. Р. Рицугго (R. Rizutto, Университет Феррары, Италия).

Все полученные результаты являются статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние глюкозной деиривации и блокады Fj/Fo-АТФсиптазы па кальциевый гомеостаз и митохондриальный потенциал нейронов в состоянии покоя.

Прежде всего, мы изучили, как влияет на митохондриальный потенциал (ДЧ^) и внутриклеточную концентрацию Са2+ ([Ca2+]¡) блокада митохондриального синтеза АТФ олигомицином. Олигомицин не повлиял на [Ca2+]¡, но вызвал гиперполяризацию митохондрий, которая являлась следствием прекращения потока протонов через Fo-канал митохондриальной АТФ-синтазы (не показано, см. также Duchen and Biscoe, 1992).

Далее мы исследовали, как влияет на Д^щ и [Ca2+]¡ замена глюкозы на 2-деокси-О-глюкозу (глюкозная депривация). 2-деокси-0-глюкоза (ДГ) приводит к торможению гликолиза в клетках, поскольку она конкурирует с глюкозой за захват нейронами, а также за фосфорилирование ферментом гексокиназой. Образующийся в результате фосфорилирования 2-ДГ-6-фосфат далее не метаболизируется, подавляя гликолитический синтез как АТФ, так и пирувата, необходимого для поддержания Д*Рт (Chi et al., 1987). В нашей работе инкубация молодых (6-10 дней в культуре, ДВК) гранулярных нейронов мозжечка в течение 20-60 мин в безглюкозном растворе, содержащем ДГ (ЮмМ), приводила к постепенной деполяризации митохондрий (24 эксперимента, Рис 1 А, В).

Ранее в экспериментах, проведенных на смешаных нейронально-глиальных культурах, было показано, что замена глюкозы на ДГ приводит к увеличению [Ca2+]¡ (Silver et al., 1997). В опытах на гиппокампальных срезах также было обнаружено, что лишение

О 10 20 30 40 50 60 70 80 Время (мин)

Рис 1. Изменения ДЧ'п, нейронов, вызываемые заменой глюкозы на ДГ и добавлением пирувата в безглюкозную среду. Замена глюкозы на ДГ (ЮмМ) приводит к развитию МД (А). Присутствие в безглюкозной среде пирувата (5мМ) предотвращает МД, вызываемую заменой глюкозы на ДГ (Б), а добавление пирувата в безглюкозную среду способствует восстановлению ASPm (В). Кривые являются результатом усреднения по 8 (А), 52 (Б) и 6 (В) клеткам.

клеток глюкозы и кислорода (Zhang and Lipton, 1999) или замена глюкозы на ДГ (Tekkok et а]., 1999) увеличивает [Ca2+]i в нервных клетках. Это увеличение [Са2+]| предотвращалось блокаторами М-метил-Б-аспартат-управляемых каналов, поэтому было сделано предположение о действии эндогенного глутамата (Глу) в данных экспериментальных условиях. Основываясь на этих результатах, можно было бы предположить, что в наших экспериментах митохондриальная деполяризация (МД), развивающаяся в результате замены глюкозы на ДГ, является следствием действия эндогенного глутамата. Однако мы не наблюдали увеличения [Са2+]; во время инкубации клеток с ДГ, независимо от того, проводились ли измерения [Ca2+]i с помощью высокоаффинного красителя Fura-2 или низкоаффинного Fura-2FF. Кроме того, добавление в наружный раствор, содержащий ДГ, блокатора Ы-метил-Б-аспартат-управляемых каналов мемантина (50мкМ; 5 экспериментов) или же уборка Са2+ из инкубационного раствора (4 эксперимента) не только не предотвратили, но даже не ослабили развития МД (не показано). Полученные данные говорят о том, что МД, развивающаяся в нейронах в отсутствии глюкозы, не может быть объяснена действием эндогенного Глу.

Известно, что ингибирование гликолиза, наряду с истощением внутриклеточного АТФ, приводит к прекращению синтеза одного из основных митохондриальных субстратов-пирувата (Ленинджер, 1976). Следовательно, одной из причин развития МД в отсутствии глюкозы может являться нарушение работы дыхательной цепи митохондрий в результате прекращения синтеза пирувата. Наши дальнейшие эксперименты (3 эксперимента) показали, что добавление к клеткам пирувата (5мМ) за 5 мин до замены глюкозы на ДГ предотвращает развитие МД (Рис. 1Б). Добавление пирувата в наружный раствор через 30 мин после замены глюкозы на ДГ приводило к восстановлению ДЧ^ (2 эксперимента, Рис. 1В).

Известно, что прекращение гликолитического синтеза АТФ приводит к накоплению АДФ в клетке, что, в свою очередь, может способствовать усилению митохондриального синтеза АТФ. Митохондриальный синтез АТФ сопряжен с потоком протонов через Fo-канал

20 40 60 Время (мин)

ж.

FCCP

20 30 40 Время, мин

АТФсинтазы внутрь митохондрий, следовательно, еще одной причиной МД, развивающейся в результате замены глюкозы на ДГ, может быть деполяризующий поток протонов через

FCCP олигомицин

30 45 60 Время (мин)

Рис.2. Влияние олигомицина на МД, вызываемую заменой глюкозы на ДГ. Олигомицин (2,5 мкг/мл) способствует восстановлению ДЧ'щ после 60 мин инкубации нейронов с ДГ (ЮмМ). Кривая является усреднением по 52 клеткам.

митохондриальную мембрану в результате усиления митохондриального синтеза АТФ. Действительно, мы обнаружили, что добавление в наружный раствор блокатора F0 субъединцы митохондриальной АТФ-синтазы олигомицина (2,5 мкг/мл) через 20 мин после удаления глюкозы из раствора приводит к восстановлению митохондриального потенциала во всех нейронах (8 экспериментов, не показано). Особенно впечатляющим оказался тот факт, что добавление олигомицина даже через 60 мин после замены глюкозы на ДГ также приводило к восстановлению потенциала митохондрий (3 эксперимента, Рис. 2). В покоящихся клетках, в которых идет митохондриальный синтез АТФ, олигомицин вызывает гяперполяризацию (см. выше). Восстановление ДЧ'м при действии олигомицина в наших экспериментах указывает на то, что, несмотря на блокаду гликолиза и, следовательно, прекращение синтеза пирувата, нейроны сохраняют способность продолжать митохондриальный синтез АТФ.

Таким образом, мы пришли к заключению, что МД, развивающаяся во время глюкозной депривации, может являться следствием ослабления дыхания из-за торможения синтеза пирувата, а также увеличения деполяризующего потока протонов через митохондриальную АТФ-синтазу в результате АДФ-зависимого усиления митохондриального синтеза АТФ.

2. Роль энергетического метаболизма в противодействии молодых нейронов глутаматному воздействию,

В соответствии с ранее полученными данными (см обзор Khodorov, 2004) мы обнаружили, что 15-мин воздействие Глу (ЮОмкМ, 10 мкМ глицина в отсутствии ионов Mg2+) в большинстве молодых гранулярных нейронов мозжечка вызывает небольшой подъем [Ca2+]i, который сопровождается слабой МД (6 экспериментов, Рис. ЗА). Отмывка Глу бескальциевым раствором (в присутствии ЮОмкМ EGTA) в этих клетках приводила к восстановлению как [Са2+]ь так и ДЧ'т- Однако в некоторых клетках (Рис. 11Б) такое же Глу воздействие приводило к развитию вторичного подъема [Са2+]| (отсроченная кальциевая дизрегуляция, ОКД), который сопровождался сильной МД (Рис. ЗА). В этих нейронах после удаления Глу [Ca2+]j и МД по-прежнему держались на высоком уровне, наблюдалось постглутаматное кальциевое плато. В целом ряде работ показано, что в молодых нейронах мозжечка развитие второй фазы подъема [Са2т]| в большинстве клеток происходит только после 20-60 мин Глу воздействия (Nicholls and Budd, 1996; Вабниц и др., 2006).

Прежде всего, мы исследовали влияние ингибитора митохондриальной Fj/F0-АТФсинтазы олигомицина на изменения [Са2+], и ДТ™, вызываемые Глу в молодых нейронах в присутствии глюкозы (3 эксперимента, рис. ЗБ). В покоящихся клетках олигомицин вызывал слабую гиперполяризацию митохондрий. Па фоне олигомицина Глу воздействие

5 10 15 20 Время (мин)

10 15 20 Время (мин)

вТА

10 20 30 Время (мин)

_ 2.9

и.

2.4

и.

а.

1.4

Э-Е 0.9

0.4

ОЛИГОМИЦИН

Глу

10 20 30 Время (мин)

РССР

0Са2++ЕбТА

10 15 20 Время (мин)

рсёр

5 10 15 Время (мин)

Рис.3 Изменения [Са2+]( и ДТщ, вызываемые Глу в молодых нейронах в присутствии метаболических ингибиторов. (А) В отсутствии ингибиторов Глу воздействие (0,1 мМ) в большинстве клеток приводит к небольшим обратимым подъемам [Са2+]| и слабой МД. (Б) Добавление олигомицина (2,5мкг/мл) в среду, содержащую глюкозу не влияет на изменения [Са2+]; и Д^Рт, вызываемые Глу. (В) В отсутствии глюкозы (60 мин предварительная инкубация с ДГ (10 мМ)) в ответ на Глу в клетках развивается ОКД, сопровождаемая сильной МД, и формируется кальциевое плато. Пунктиром выделены кривые, соответствующие изменениям [Са2"]| и ДЧ'т в одной клетке.

приводило к небольшому подъему [Са2+]ь который сопровождался очень слабой МД, причем после удаления Глу нейроны восстанавливали как [Са2+];, так и ДЧ'щ. Таким образом, блокада

10 20 30 Время (мин)

5 10 15 20 25 Время (мин)

Рис.4 Изменения [Са +]j и ДЧ^, вызываемые Глу (0,1 мМ) в молодых нейронах в безглюкозной среде. Предварительная инкубация с ДГ (ЮмМ) в течение 20 мин (А) и 90мин (Б). Во время фазы кратковременной реполяризации и восстановления [Са ]( ДТщ восстанавливается до уровня ниже, чем A4\n до Глу воздействия (А, Б).

митохондриального синтеза АТФ не повлияла на изменения [Ca2+]j, и АЧ^, вызываемые Глу в молодых нейронах в присутствии глюкозы (сравнить Рис. ЗА и Б). Эти данные согласуются с данными Budd and Nicholls (1996). Авторы показали, что олигомицин не влияет на время наступления ОКД в молодых гранулярных нейронах мозжечка крыс, подвергнутых длительному воздействию 100 мкМ Глу (Budd and Nicholls, 1996). Наши данные свидетельствует в пользу того, что в гранулярных нейронах мозжечка сильно развит гликолиз, который в отсутствии митохондриального синтеза АТФ может обеспечивать клетку АТФ, необходимым для поддержания кальциевого гомеостаза.

Инкубация молодых гранулярных нейронов в безглюкозной среде, содержащей ДГ (ЮмМ, 20-60 мин), привела к тому, что 15-мин воздействие Глу (ЮОмкМ) вызывало в большинстве клеток двухфазный подъем [Ca2+]i, который сопровождался сильной двухфазной МД (37 экспериментов, рис. ЗВ, рис. 11Б). Наряду с нейронами, в которых наблюдались двухфазные изменения [Ca2+]j и ДЧ*,,,, были также клетки с монофазными ответами, в которых МД и [Са2+]| сразу же поднимались до высокого уровня.

FQCP Ca2++EGTA

10 15 20 25 Время (мин)

Рис.5 Зависимость [Са^ и ДЧ'т от уборки ионов Са из внешнего раствора во время Глу воздействия. Уборка ионов Са во время Глу воздействия (0,1 мМ) приводит к

"2+ в среду наблюдаются

восстановлению „2+-

[Са2+];

и ДЧ'т. После возвращения Са

подъемы [Са ]; и ДЧ*,,,. Пунктиром выделены кривые, соответствующие изменениям [Са2"1"]; и ЛЧ'т в одной клетке.

В 50% нейронов с сильной МД между первичными и вторичными подъемами [Са2+]; и МД наблюдалось временное восстановление как [Са2+]ь так и Д*Рга (Рис. ЗВ). Следует отметить, что в 20-29% нейронов (в зависимости от времени инкубации клеток в безглюкозной среде до Глу воздействия) восстановление ДЧ^, происходило до уровня, который был ниже, чем уровень ДЧ'щ, наблюдаемый непосредственно перед Глу воздействием (Рис. ЗВ, рис. 4). Этот олигомицин-подобный эффект Глу (сравнить рис. 2 и рис. 4) можно было бы назвать гиперполяризацией, однако, учитывая тот факт, что сама инкубация нейронов в безглюкозной среде приводит к снижению Д%1, можно говорить лишь о частичном восстановлении ДЧ'щ. Действительно, проследив, как меняется во времени ДЧ'т после удаления глюкозы, и как впоследствии на него влияет Глу, мы обнаружили, что так называемая гиперполяризация является ни чем иным, как частичным восстановлением ДЧ'п, (Рис. 4А). В большинстве клеток с двухфазными изменениями [Са2+}| и АЧт восстановление Д"Рт между первой и второй фазой МД не было таким сильньм, и ДЧ'щ не достигал даже уровня, на котором он был до Глу воздействия (не показано).

Удаление из внешнего раствора ионов Са2+ (при продолжающемся действии Глу) через 3-5 мин после развития ОКД приводило к восстановлению как [Са2+]|, так и ДТт (Рис. 5). После возвращения ионов Са + во внешнюю среду наблюдалось сильное повышение [Са2+]; и развитие МД (3 эксперимента). Подобная зависимость [Са2+]| и ДЧ'п, от уборки ионов Са2+ (или блокады ИМОА-каналов) в начале второй фазы подъема [Са2+]| характерна для зрелых (>11 ДВК) нейронов гиппокампа (Уе^ип е1 а1., 2001), а также для молодых нейронов мозжечка при 40-60 мин воздействии Глу (Вабниц и др., 2006). Необходимо отметить, что чувствительность вторичных подъемов [Са2+]] и МД к удалению наружного Са2+ (или блокаде NMDA-кaнaлoв) не зависела от величины латентных периодов между первичными и вторичными подъемами [Са2+]| и МД. Решающим фактором здесь являлась продолжительность высокого кальциевого плато, т.е. длительность кальциевой перегрузки нейрона перед удалением наружного Са2+. Так, в работе Вабниц и др. (2006) ОКД и сильная МД, развивающиеся через 20 мин Глу воздействия, были чувствительны к уборке наружного Са2+ из Глу-содержащего раствора также, как и вторичные подъемы [Са2+][ и МД, развивающиеся в наших экспериментах в безглюкозной среде через 5 мин после добавления к клеткам Глу.

Однако через 15 мин после добавления к клеткам Глу вторичный подъем [Са2+]; и сильная МД были уже нечувствительны к уборке Глу и ионов Са2+ из безглюкозного раствора. После удаления Глу большинство нейронов (Рис. 11 Б) не могли восстановить ни ДТт, ни [Са2+]| - формировалось стойкое постглутаматное кальциевое плато. Устойчивость постглутаматного [Са2+]| шгато к удалению ионов Са2+ указывает на то, что кальциевая перегрузка происходит, в основном, из-за ингибирования механизмов, выводящих Са2+ из клетки (КЬос1огоу е1 а!., 1993).

Таким образом, в условиях глюкозной депривации в молодых клетках значительно ускоряется развитие ОВД и сильной МД в ответ на длительное Глу воздействие.

3. Влияние антиоксидапта МпТВАР на вызванные Глу нарушения кальциевого гомеостаза и митохондриальную дисфункцию нейронов, лишенных глюкозы.

В настоящее время широко распространено мнение, что реактивные формы кислорода (РФК) играют центральную роль в механизмах Глу нейротоксичности (см обзор КЬос1огоу, 2004). Однако в различных моделях нейротоксичности на разных типах нейронов результаты действия одного и того же антиоксиданта МпТВАР были различны. Так, в работе Уе^ип е1 а1. (2001) было показано, что МпТВАР не оказывает существенного влияния на развитие в зрелых гиппокампальных нейронах постглутаматного кальциевого плато и сильной МД в ответ на гиперстимуляцию Глу рецепторов. В то же время, СавШЬо е1 а1. (1999) в экспериментах на молодых гранулярных' нейронах мозжечка обнаружили, что МпТВАР задерживает наступление ОКД, вызванной длительным Глу воздействием. Учитывая эти противоречия, нами были проведены эксперименты с применением антиоксиданта МпТВАР (200мкМ). В наших опытах добавление в безглюкозную среду антиоксиданта не повлияло на развитие МД, вызываемой заменой глюкозы на ДГ (2

Время (мин) Время (мин)

Рис.6 Влияние антиоксиданта МпТВАР (200мкМ) на изменения [Ca2+]i и АхРт, вызываемые воздействием Глу (0,1мМ) на молодые нейроны в безглюкозной среде. (А) Присутствие МпТВАР в безглюкозной среде не предотвратило развития сильной МД, индуцированной Глу и формирования постглутаматного кальциевого плато. *-постепенное снижение флуоресценции Rh-123 во время и после Глу воздействия отражает вытекание зонда из клеток (Ward et al., 2000), а не реполяризацию митохондрий.

эксперимента). МпТВАР также не оказал влияния на изменения [Ca2+]i и ДЧ'т, вызываемые Глу воздействием - наблюдались двухфазные подъемы [Ca2+]i и МД, причем после удаления Глу [Ca2+]i и МД оставались на высоком уровне (Рис. 6). Таким образом, можно предположить, что ускорение развития Глу-индуцированной ОКД во время глюкозной депривации не связано с гиперпродукцией РФК.

4. Влияние ингибитора NO-сннтазы L-NAME на изменения [CaJ+]i и Д*Рт, вызванные гиперстимуляцией глутаматных рецепторов в нейронах, лишенных глюкозы.

Наряду с генерацией РФК, гиперстимуляция Глу рецепторов приводит также к генерации NO-, который в результате взаимодействия с супероксид анионом превращается в пероксинитрит ONOO (Sattler et al., 1999; обзор Khodorov, 2004). В работе Keelan et al. (1999) было показано, что ингибирование NO-синтазы с помощью L-NAME значительно уменьшает долю зрелых гиппокампальных нейронов, в которых в ответ на Глу развивается сильная МД

Время (мин) Время (мин)

Рис.7 Влияние игибитора >10-синтазы Ь^АМЕ (1мМ) на изменения [Са2+]| и ДЧ^, вызываемые воздействием Глу (0,1 мМ) на молодые нейроны в безглюкозной среде. Присутствие ЫМАМЕ в безглюкозной среде не предотвратило развития сильной МД, индуцированной Глу и формирования постглутаматного кальциевого плато.

(Keelan et al., 1999). Учитывая эти данные, мы провели серию экспериментов, в которых все растворы наряду с ДГ содержали L-NAME (1мМ). Однако в отличие от Keelan (1999), мы не увидели влияния L-NAME на нарушение [Са2+], гомеостаза и митохондриальную дисфункцию нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов в условиях блокады гликолиза (6 экспериментов). Ингибитор NO-синтазы не предотвратил МД, вызываемой глюкозной депривацией, и не оказал заметного влияния на изменения [Ca2+]j и АЧ'т, вызываемые гиперстимуляцией Глу рецепторов (Рис. 7). По-прежнему во всех клетках в ответ на Глу развивались двухфазные подъемы [Ca2+]i и МД, а после удаления Глу наблюдалось постглутаматное [Ca2+]i - плато.

5. Влияние ингибиторов митохондриальной поры, циклоспорина А (ЦсА) и ионов на нарушение [Са ], гомеостаза и митохондриальную дисфункцию

нейронов, подвергнутых воздействию Глу в отсутствии глюкозы.

Одной из наиболее вероятных причин возникновения постглутаматного кальциевого плато и сильной МД в нейронах при гиперстимуляции Глу рецепторов считается открывание митохондриальной поры (МТП) (Vergun et al., 1999; см. обзор Khodorov, 2004). Связывание АТФ с транслокатором адениновых нуклеотидов со стороны цитозоля способствует стабилизации поры в закрытом состоянии (Kristian et al., 2000), поэтому сильное падение АТФ в цитозоле при действии Глу в безглюкозной среде (см. рис. 12) будет облегчать открывание поры. Мы предположили, что глюкозная депривация ускоряет открывание МТП, и таким образом, ускоряет развитие ОКД в молодых нейронах. Доказательства участия поры в нарушениях кальциевого гомеостаза в основном базируются на эффекте неспецифических блокаторов порообразования - ЦсА и его аналога метил-валин-ЦсА. Однако данные, полученные с помощью этих веществ, противоречивы. Так, Vergun et al. (1999) показали, что применение блокаторов МТП ЦсА и метил-валин-ЦсА значительно замедляет или предотвращает развитие ОКД и сильной МД в зрелых гиппокампальных нейронах, подвергнутых длительному Глу воздействию. На основании этих данных авторами было высказано предположение, что открывание митохондриальной поры является, по крайней мере, одной из причин нарушения нейроналыюго кальциевого гомеостаза при гиперстимуляции Глу рецепторов (см. также Alano et al., 2002). Однако в ряде работ защитный эффект ЦсА отсутствовал (Castilho et al., 1998; Pivovarova et al., 2004; Chinopoulos et al., 2004). Поэтому чтобы прояснить роль митохондриальной поры в нарушении кальциевого гомеостаза, вызванного Глу в молодых нейронах, лишенных глюкозы, наряду с ЦсА в наших экспериментах был использован также другой ингибитор поры - ионы Sr2+ (Hunter et al., 1976; Bernardi et al., 1992). Ионы Sr2* транспортируются в клетку теми же системами, что и

в частности, NMDA-каналами, Са2+/Н+-АТФазой и Na+/Ca2+-обменником (Tsuzuki et al, 1994; Bernardi, 1999; Blaustein and Lederer, 1999). Накопление ионов Sr2+ в матриксе митохондрий не приводит к открыванию митохондриальной поры, более того, ионы Sr2+ в концентрациях, в 20 раз превышающих концентрацию Са2+, ингибируют открывание поры, вызванное ионами Са2+ (Hunter et al., 1976; Bernaidi et al., 1992).

Сначала мы исследовали, как в условиях глюкозной депривации влияет на развитие вызванных Глу ОКД и сильной МД ЦсА. Присутствие в безппокозном растворе ЦсА (1мкМ или 0,5мкМ) не предотвратило развития МД после замены глюкозы на ДГ (Рис. 8А). ЦсА также не оказал никакого влияния на изменения [Са2+], и АЧ'т, вызываемые в клетках длительным Глу воздействием. Эффект ЦсА не наблюдался ни в экспериментах с 20 мин инкубацией нейронов с ДГ до Глу воздействия (Рис. 8А), ни в экспериментах с 60 мин инкубацией нейронов с ДГ (Рис. 8Б). Как и в контрольных экспериментах в большинстве нейронов (80%, $2 клетки) наблюдалось посглутаматное кальциевое плато, устойчивое к уборке ионов Са2+ и Глу, которое сопровождалось сильной МД (4 эксперимента, рис. 8). Как известно, защитный эффект ЦсА связан с увеличение:м пороговой концентрации Са2+, необходимой для открывания митохондриальной поры (Chalmers and Nicholls, 2003). Поэтому можно предположить, что в наших экспериментах концентрация Са2+, накопленного в митохондриях во время Глу воздействия, превышала пороговое значение, необходимое для открывания поры, даже в присутствии ЦсА. Этому могло способствовать и то

ГССР

20 30 Время (мин)

10 15 20 25 Время (мин)

ИССР

Н- 1.8

10 15 20 25 Время (мин)

Рис.8 Влияние ингибитора митохондриалыюй поры ЦсА на изменения [Са и ДЧ'щ, вызываемые Глу в молодых нейронах в безглюкозной среде. Присутствие в безглюкозной среде ЦсА (1мкМ) не влияет на изменения [Са2^], и ДЧ'т, вызываемые Глу в молодых нейронах. До добавления Глу нейроны инкубировали в безглюкозной среде, содержащей ДГ(ЮмМ) и ЦсА, в течение 20 мин (А) или 60 мин (Б).

обстоятельство, что в отсутствии гликолиза снижается количество АТФ, необходимое для работы плазматической Са2+/Н+-АТФазы, а следовательно, насос выкачивает меньше Са2+ из цитозоля, и большее количество Са2+ захватывается митохондриями во время Глу воздействия. Другим возможным объяснением отсутствия эффекта ЦсА может являться открывание ионами Са2+ пор, нечувствительных к ЦсА. В этом случае, если большая часть пор, открываемых Са2+, является не чувствительной к ЦсА, то мы не будем наблюдать эффект ингибитора (см. обзор КЪос1огоу, 2004).

Далее мы исследовали влияние замены Са2+/3г2+ на развитие ОКД и МД при Глу воздействии в условиях глюкозной депривации. Замена ионов Са2+ на ионы Бг24" не повлияла на МД, которая развивалась после замены глюкозы на ДГ (Рис. 9). В присутствии ионов Бг + в безглюкозной среде, как и в Са2+-содержащей среде (Рис. ЗВ), 15 мин Глу воздействие вызывало в большинстве клеток (80%, 109 клеток) двухфазный подъем [8г2+^ несильную МД (3 эксперимента, рис. 9). Таким образом, присутствие в безглюкозной среде Эг +, который не открывает пору, не предотвращало ускорения развития ОКД в молодых нейронах. Недавно было показано, что изменения [Бг^ и ДЧ'т, вызываемые Глу в молодых^гранулярных нейронах мозжечка в присутствии глюкозы не отличаются от изменений в Са -содержащей среде (ЭДаЬпкг ег а1, 2005). Поскольку Эг2+ не открывает поры (ВешагсИ е1 а1., 1992), авторы заключили, что в молодых гранулярных нейронах в присутствии глюкозы в Са ""-содержащей среде открывание МТП не является обязательным условием развития ОКД и сильной МД, вызываемой Глу. 2+

Мы показали, что замена глюкозы на ДГ даже в присутствии ионов 8г ускоряет развитие вторичных подъемов [Бг24} и сильной МД, вызываемых Глу воздействием (Рис. 9).

FCCP

20 30 -u "u 0 10 20 30 -u =u

Время<мин) Время (мин)

Рис.9 Изменения [Sr2^ и ДЧ^, вызываемые Глу (0,1мМ) в молодых нейронах в безглюкозной среде при замене ионов Са2+ на ионы Sr2*. Замена Ca2+/Sr2+ не предотвратила ускорения в развитии вторичного подъема [Sr2*], и сильной МД в нейронах, подвергнутых Глу воздействию.

Поскольку Sr2+ не открывает пору, то эффект ДГ в присутствии Sr2"1" (т.е. уменьшение латентных периодов мевду первой и второй фазами клеточного ответа при Глу воздействии в безглкжозной среде по сравнению со средой, содержащей глюкозу) нельзя объяснить ускорением открывания поры из-за падения АТФ.

6. Влияние Na+/Li+ замены на глутаматные ответы нейронов, находящихся в безглюкозной среде.

Глу воздействие на нейроны приводит не только к увеличению [Са2+]ь но и к увеличению внутриклеточной концентрации Na+ (Pinelis et al., 1994; Kiedrowski, 1994). Основным механизмом, восстанавливающим концентрацию Na+ в клетке в нормальных условиях является №+/К+-АТФаза. Однако в условиях глюкозной депривации происходит сильное падение АТФ в клетке, и это может привести к нарушению работы насоса. В этом случае можно ожидать, что удаление ионов Na+ из клетки будет осуществляться Na+/Ca2+ обменником плазматической мембраны, что может привести к дополнительному входу Са2+ в нейроны, и таким образом, ускорить развитие ОКД при Глу воздействии. Чтобы выяснить, какую роль играет Na+/Ca2+ обменник в развитии ОКД и сильной МД, вызываемых воздействием Глу на молодые нейроны в безглюкозной среде, мы заблокировали обменник, заменив во всех растворах ионы Na+ на ионы Li+. Необходимо отметить, что Na+/Li+ замена производилась еще до Глу воздействия, ионы Li* присутствовали в безглюкозной растворе, в котором клетки инкубировались до добавления Глу. При такой постановке экспериментов по Глу каналам в клетку поступал Li+, а не Na+, поэтому Na+/Li+ замена ингибировала оба режима работы Ыа+/Са2+-обменника.

На рис. 10А представлены изменения [Са2+]| и ДЧ'щ в ответ на применение Глу в безглюкозной среде, содержащей ионы Li+ вместо ионов Na+. В присутствии Li+ значительно уменьшилось количество вторичных подъемов [Ca2+]i в ответ на 15-мин аппликацию Глу. Так, в контроле в присутствии Na+ вторые фазы развивались в 88% клеток (п=3 эксперимента, 87 клеток), в то время как в безглюкозной среде, содержащей Li+, количество вторичных подъемов [Ca2+]i в ответ на Глу уменьшилось до 14% (п=3 эксперимента, 64 клетки) (Рис. 10Б). Исходя из полученных данных, можно предположить, что во время Глу воздействия в безглюкозной среде Na+/Ca2+ обменник работает в реверсивном режиме и вносит вклад в развитие ОКД и сильной МД.

Защитный эффект Li можно объяснить тем, что он уменьшает накопление Са2+, вызванное воздействием на нейроны N-Memn-D-acnapTaTOM (Kiedrowski, 1999; Czyz and Kiedrowski, 2002). Так, Li+ может уменьшать количество Са2+, входящего в клетку, путем непосредственного влияния на ионные токи через К-метил-Б-аспартат-управляемые каналы (Tsuzuki et al., 1994; Karkanias and Parke, 1999). Однако в работе Khodorov et al. (1999) 1 мин

воздействие 100 мкМ Глу на гранулярные нейроны мозжечка в ЬГ-содержащей среде приводило к такому же подъему [Са +]i как и в №+-содержащей среде, что свидетельствует против предположения о том, что в гранулярных нейронах мозжечка Na+/Li+ замена существенно уменьшает ток Са2+через М-метил-О-аспартат-управляемые каналы. В наших экспериментах мы также не наблюдали уменьшения первичного подъема [Ca2+]j в ответ на Глу в Li*-содержащей безглюкозной среде по сравнению с №+-содержащей безглюкозной средой (сравнить рис. ЗВ и рис. 10А).

Второй механизм, посредством которого ионы Li+ могут уменьшать количество Са2+, входящего в клетку при Глу воздействии, это влияние ионов Li+ на работу Na+/Ca2+ обменника плазматической мембраны. Как уже говорилось выше, в №+-содержащем растворе воздействие Глу повышает концентрацию Na+ в цитозоле (Pinelis et al, 1994; Kiedrowski, 1994). В отсутствии глюкозы накоплению Na+ может способствовать также снижение активности Na+/K+-AT®a3bi из-за остановки гликолитического синтеза АТФ. Накопление Na в цитозоле и деполяризация мембраны способствуют реверсии Na+/Ca2+ обменника: удалению ионов Na+ и транспорту ионов Са2+ в клетку (Blaustein and Lederer, 1999). Следовательно, во время глутаматного воздействия помимо NMDA-каналов появляется еще один источник Са2+, что должно способствовать возникновению вторичных кальциевых подъемов в нейронах (Tymianski et а)., 1993). Ионы Li+ не транспортируются Na+/Ca2+ обменником, поэтому замена ионов Na+ на Li+ может уменьшать количество Са2+, поступающего в клетку, и следовательно уменьшать вероятность развития ОКД, что мы и наблюдали в наших экспериментах. В пользу нашего предположения об уменьшении ионами Li+ входящего потока Са2+ через Na+/Ca2+ обменник, а не на Ы-метил-Б-аспартат-управляемые каналы, говорят также данные полученные в группе Kiedrowski. Авторы показали, что к уменьшению накопления 45Са2+ во время действия К-метил-О-аспартата приводит замена ионов Na+ на ионы Cs+, которые, в отличие, от Li+ не влияют на ионные

А Б

Время (мин)

90 80

о 60

Na+-содержащая 1_Г-содержащая

среда среда

Рис. 10 Влияние замены Ка+/1л+ на изменения [Са2+]| и ДЧ'щ, вызываемые 15-мин воздействием Глу (0,1 мМ) в молодых нейронах в безглюкозной среде. (А) Замена Ка+/1л+ в большинстве клеток предотвратила вызванное Глу развитие сильной МД и формирование кальциевого плато в молодых нейронах, лишенных глюкозы. (Б) Процент клеток, в которых в ответ на Глу в безглюкозной ЬГ-содержащей среде развивались ОКД и сильная МД.

токи через 1Ч-метил-0-аспартат-управляемые каналы, но, как и 1л+, не транспортируются №+/Са2+ обменником (Сгуг й а1., 2002).

Защитный эффект 1л+, обнаруженный в наших экспериментах, может быть также обусловлен тем, что литий сохраняет уровень АТФ при Глу воздействии в безглкжозной среде. Так, в 1л+-содержащей среде уровень АТФ после 20-мин инкубации нейронов с ДГ и последующего 10-мин воздействия Глу был в 2 раза выше, чем в Ка+-содержащей среде (не показано).

Таким образом, мы предположили, что наблюдаемый нами защитный эффект 1л+ обусловлен способностью ЬГ сохранять уровень АТФ и уменьшать количество Са2+, входящего в клетку во время воздействия Глу. Последнее, однако, происходит не в результате уменьшения ионных токов через Н-метил-В-аспартат-управляемые каналы каналы (хотя нельзя полностью исключить, что это тоже вносит свой вклад в эффект 1л+), а вследствие влияния На+/1л+ замены на работу Ка+/Са2+ обменника. Необходимо отметить, что наши данные находятся в противоречии с данными, полученными Ваш а1. (2005). Авторы обнаружили, что расщепление 1Ча+/Са2+ обменника протеазами является основной причиной нарушения кальциевого гомеостаза нейронов мозжечка при гиперстимуляции Глу рецепторов. В отличие от этой работы, мы показали, что в условиях глюкозной депривации блокада Ка+/Са2+ обменника предотвращает развитие ОКД и сильной МД, вызванных Глу.

А Б

Время (мин)

Рис. 11 Влияние пирувата на изменения [Са2+]| и Дот, вызываемые Глу в молодых нейронах в безглюкозной среде. До добавления Глу (0,1 мМ) нейроны инкубировали в течение 60 мин в безглюкозной среде, содержащей ДГ (ЮмМ) и пируват (5мМ). (А) Присутствие пирувата в безглюкозной среде предотвращает индуцированное Глу развитие сильной МД и формирование кальциевого плато в молодых нейронах. (Б) Процент клеток, в которых в ответ на Глу наблюдались кальциевое плато и сильная МД в контроле, в безглюкозной среде, содержащей ДГ (ЮмМ, инкубация 60 мин), и в присутствии пирувата в безглюкозной среде (инкубация с ДГ+пируват 60 мин).

7. Влияние пиру вата на вызываемые Глу изменения [Са2г]| и ДЧ'т в молодых нейронах, лишенных глюкозы.

Как уже говорилось выше, наряду с истощением АТФ, блокада гликолиза приводит к прекращению синтеза пирувата, который является одним из основных субстратов для митохондрий. В этой серии экспериментов была предпринята попытка поддержать нормальное функционирование клеток в отсутствии глюкозы путем добавления к ним пирувата. Наличие в безглюкозной среде пирувата значительно повлияло на вызываемые Глу изменения [Са2+], и Д%, (Рис. 11), однако эффект пирувата сильно зависел от времени инкубации клеток с ДГ и пируватом.

Так, в серии экспериментов, где до Глу воздействия нейроны находились 20 мин в безглюкозной среде, содержащей пируват, лишь 52% нейронов (6 экспериментов) смогли восстановить [Са2+]( после 15-мин Глу воздействия, т.е. вели себя как молодые клетки, находящиеся в среде с глюкозой. В остальных 48% нейронов в ответ на Глу развивались

8 а а зга а а

А * « А ^ ^ •• т

5 "

о о

2 2

* §

§ £ х

СО

3. +

от

X +

Рис. 12. Влияние ингибиторов энергетического метаболизма на уровень АТФ в покое и после воздействия Глу. Олигомицин-[АТФ], измеренное после 10 мин воздействия олигомицина (2,5 мкг/мл). ДГ(30мин)-[АТФ], измеренное после ЗОмин инкубации нейронов с ДГ(ЮмМ). ДГ(60мин)-[АТФ], измеренное после бОмин инкубации нейронов с ДГ(ЮмМ). Глу-[АТФ], измеренное после 10 мин воздействия Глу (ОДмМ). Олигомицин+Глу-[АТФ], измеренное после 10 мин воздействия олигомицина и Глу(ОДмМ). ДГ(30мин)+Глу-[АТФ], измеренное после 20мин инкубации нейронов с ДГ(10мМ) и последующего добавления на 10 мин в безпгюкозную среду Глу. ДГ(б0мин)+Глу-[АТФ], измеренное после 50мин инкубации нейронов с ДГ(ЮмМ) и последующего добавления на 10 мин в безглюкозную среду Глу.

двухфазные изменения [Са2+], и ДЧ'т и наблюдалось постглутаматное кальциевое плато, как в контрольных экспериментах в безглюкозной среде (не показано).

Однако, в экспериментах (4 эксперимента), в которых предварительная инкубация нейронов в безглюкозной среде, содержащей пируват (5мМ), длилась 60 мин, в ответ на последующее 15-мин Глу воздействие в большинстве клеток наблюдались лишь небольшие подъемы [Са2+]|, которые сопровождались слабой МД. После удаления Глу [Са2+]| и ДЧ'щ возвращались к базальному уровню (Рис. НА). Таким образом, в присутствии пирувата в безглюкозной среде длительное Глу воздействие приводило к изменениям [Са2+], и ДЧ'т, характерным для молодых клеток, находящихся в среде с глюкозой (сравнить рис. 11А и рис.

ЗА).

Защитный эффект пирувата может быть обусловлен (1) поддержанием ДЧ^ на высоком уровне, необходимом для осуществления электрофоретического захвата ионов Са2+ митохондриями, (2) поддержанием митохондриального синтеза АТФ и (3) способностью пирувата взаимодействовать с перекисью водорода.

Ранее было показано, что пируват защищает нейроны от гибели, вызванной перекисью водорода (Desagher et al., 1997; Nakamichi et al., 2005). Известно, что Глу воздействие приводит к производству реактивных форм кислорода (Dugan et al., 1995; Atlante et al., 2000). Однако в наших экспериментах защитный эффект пирувата, по-видимому, не был связан с его антиоксидантными свойствами, поскольку антиоксидант МпТВАР, который защищает клетки от перекиси, не оказал влияния на нарушение кальциевого гомеостаза при Глу воздействии в безглюкозной среде (Рис. 6).

В ряде работ защитный эффект пирувата был объяснен его способностью поддерживать уровень АТФ в нейронах (Maus et al., 1999; Vergun et al., 2003). Поэтому в следующей серии экспериментов мы провели измерения внутриклеточного содержания АТФ в нейронах при воздействии Глу, ДГ, олигомицина и пирувата.

8. Изменения внутриклеточного содержания АТФ при воздействии на нейроны ДГ, олигомицина, Глу и пирувата.

Параллельно с исследованием изменений [Ca2+]¡ и Д^щ при Глу воздействии в условиях глюкозной депривации, были проведены измерения внутриклеточного содержания АТФ ([АТФ]) при воздействии Глу, олигомицина, ДГ, и пирувата. Измерения проводились с помощью двух методов: на гранулярных нейронах мозжечка было измерено [АТФ] в клеточных лизатах с помощью люциферин-люциферазной системы, а на кортикальных нейронах, трансфецированных люциферазой, была прослежена динамика изменения содержания АТФ отдельно в цитозоле (АТФц) и митохондриях (АТФм).

8.1 Изменения [АТФ] и АТФц при воздействии олигомицина и ДГ.

Прежде всего, мы исследовали, как изменяется [АТФ] при воздействии на нейроны ингибиторов синтеза АТФ: олигомицина и ДГ. Как видно из рисунка 12, 10-мин воздействие на нейроны олигомицина не изменило [АТФ] (3 эксперимента). Основываясь на этих данных, можно сделать предположение о том, что гликолиз в молодых нейронах мозжечка способен полностью компенсировать недостаток АТФ, вызванный ингибированием митохондриального синтеза АТФ. В отличие от блокады митохондриального синтеза АТФ инкубация клеток в безглюкозной среде, содержащей ДГ, в течение 30 мин и 60 мин уменьшила [АТФ] до 55±8% и 32±5% от [АТФ] в покоящихся клетках, соответственно (4 эксперимента) (Рис. 12). Необходимо отметить, что инкубация нейронов с ДГ не сопровождалась увеличением [Ca2+]¡ (Рис. 4А), поэтому падение [АТФ], вызванное ДГ, нельзя объяснить увеличением [Ca2+]¡. По всей видимости, это падение [АТФ] обусловлено потреблением АТФ различными внутриклеточными процессами в условиях блокады гликолитического синтеза АТФ.

Чтобы проследить, как изменяется уровень АТФ в цитозоле в первые минуты воздействия ДГ, мы использовали кортикальные нейроны, трансфецированные люциферазой. Как видно из рисунка 13, падение АТФ в цитозоле начинается сразу же после замены глюкозы на ДГ. Первое резкое увеличение люминесценции на графике соответствует моменту добавления в систему люциферина (20 мкМ).

8.2 Изменения [АТФ], АТФц и АТФм при Глу воздействии.

Далее мы исследовали, как изменяется при воздействии Глу [АТФ] в гранулярных нейронах мозжечка, а также АТФц и АТФм в кортикальных нейронах. В соответствии с ранее полученными данными (см. обзор Khodorov, 2004), воздействие на гранулярные нейроны мозжечка Глу в течение 10 мин приводило к падению [АТФ] до 61±3% от контрольной величины. Мы также провели серию опытов на кортикальных нейронах, трансфецированных люциферазой, экспрессированной в цитозоле (cytoLuc) и в митохондриях (mitoLuc). Это позволило нам проследить динамику изменения АТФ при Глу воздействии отдельно в цитозоле (АТФц) и в митохондриях (АТФм). Кортикальные нейроны

10 15 20 25 30 ^ Время (мин)

Рис. 13 Изменения АТФц при действии ДГ (ЮмМ) и Глу (0,1мМ). Замена глюкозы на ДГ приводит к снижению АТФц, которое усиливается при последующем добавлении Глу. СуШЬис - люцифераза, экспрессируемая в цитозоле.

были выбраны из-за технических трудностей, связанных с трансфекцией гранулярных нейронов мозжечка.

На рисунке 14 представлены изменения АТФц и АТФм, вызванные добавлением к клеткам Глу. Первое резкое увеличение люминесценции на графиках соответствует моменту

А Б

4 6 8 10 Время (мин)

10 15 20 Время (мин)

Рис. 14 Изменения внутриклеточного АТФ. Глу воздействие (0,1 мМ) приводит к падению АТФ как в цитозоле (А), так и в митохондриальном матриксе (Б). В присутствии олигомицина (2,5мкг/мл) Глу вызывает падение АТФ в митохондриях (В). с)4о1д1с - люцифераза, экспрессируемая в цитозоле. т^оЬис -люцифераза, экспрессируемая в митохондриальном матриксе.

добавления в систему люциферина (20 мкМ). Добавление Глу к клеткам вызывало снижение АТФц до 67±5% от уровня АТФц в контроле (9 экспериментов) и падение АТФм до 50±8% (8 экспериментов) (рис. 14А, Б). Как видно из рисунка, падение АТФц и АТФм происходило уже в течение первых 2 мин с момента попадания Глу к клеткам. Отмывка Глу бескальциевым раствором, содержащим ЕйТА (0,25 мМ), привела к слабому восстановлению как АТФц, так и АТФм (Рис. 14А, Б).

Уменьшение АТФм в результате Глу воздействия может быть связано с активацией Са^/ЬГ-АТФазы и Ка+/К+-АТФазы плазматической мембраны и последующим перераспределением АТФ между цитозолем и митохондриями, или с блокадой ионами Са2+ митохондриального синтеза АТФ. Чтобы выяснить причину падения АТФм при Глу воздействии, нейроны до добавления Глу 20 мин инкубировались с олигомицином, блокирующим митохондриальную АТФсинтазу. Однако ингибирование этого фермента не предотвратило падения АТФм, возникающего после добавления к клеткам Глу (Рис. 14В). Следовательно, падение АТФм при Глу воздействии нельзя объяснить блокадой митохондриального синтеза АТФ ионами Са2г. На основании полученных данных мы заключили, что падение АТФм во время Глу воздействия является отражением падения АТФц.

8.3 Изменения [АТФ] при воздействии Глу в присутствии олигомицина и ДГ.

Далее мы исследовали, как меняется [АТФ] в гранулярных нейронах мозжечка при одновременном воздействии на клетки олигомицина и Глу, а также ДГ (30- и 60-мин инкубация) и Глу. Мы обнаружили, что блокада митохондриального синтеза АТФ олигомицином не влияет на падение [АТФ], вызываемое Глу (2 эксперимента). Так, после 5-мин инкубации нейронов с олигомицином последующее добавление Глу снижало [АТФ] до б5±5% от [АТФ] в. покоящихся клетках, что не составляет достоверного различия с [АТФ] после Глу воздействия в отсутствии олигомицина (Рис. 12). Таким образом, блокада митохондриального синтеза АТФ в молодых нейронах мозжечка не влияет на падение [АТФ], вызываемое Глу, а также на изменения [Са2+]| и ДЧ'щ, происходящие при гиперстимуляции Глу рецепторов. На основании этих данных можно заключить, что гликолиз в молодых клетках способен полностью компенсировать недостаток [АТФ], возникающий при блокаде митохондриального синтеза АТФ и последующем Глу воздействии.

В отличие от олигомицина, ДГ значительно усиливала падение [АТФ], вызываемое Глу. На рисунке 12 представлены данные по измерению [АТФ] после инкубации клеток с ДГ и последующего добавления Глу. Как видно из рисунка, падение [АТФ] после 20-мин инкубации нейронов с ДГ и последующего 10-мин Глу воздействия в безглюкозной среде составляло 34±10% от [АТФ] в покоящихся клетках. Эта величина достоверно отличается от [АТФ], измеренного после Глу воздействия в присутствии глюкозы. После 50-мин инкубации клеток с ДГ и последующего 10-мин Глу воздействия [АТФ] составляло 11±2% от [АТФ] в покое.

Необходимо отметить, что в цитозоле замена глюкозы на ДГ также усиливала падение АТФ, вызываемое Глу (Рис. 13).

8.4 Влияние пирувата на изменения [АТФ], вызываемые Глу в условиях глюкозной депривации.

Наконец, последняя серия экспериментов по измерению [АТФ] при Глу воздействии в безглюкозной среде была проведена в присутствии пирувата (4 эксперимента). Как говорилось выше, после 60-мин инкубации нейронов в буфере, содержащем ДГ, [АТФ] составлял 32+5% от [АТФ] в покоящихся клетках. Такое низкое [АТФ] уменьшалось еще в большей мере при последующем 10-мин воздействии Глу (100 мкМ, 10 мин) и составляло всего 11±2% от контрольной величины (Рис.12, 15). Если во время 60-мин инкубации нейронов с ДГ в растворе присутствовал пируват, то [АТФ], измеренное после добавления к этим клеткам Глу, было выше, чем в отсутствии пирувата, и составляло 18±2% от [АТФ] в контроле (р<0.05) (Рис. 15). Это повышение [АТФ] (ДГ+пируват+Глу) по сравнению с [АТФ] (ДГ+Глу) может быть связано с тем, что после 60 мин инкубации клеток в безглюкозной среде, содержащей пируват, [АТФ] было почти в 2 раза выше, чем после инкубации

нейронов с ДГ в отсутствии пирувата (Рис. 15). Таким образом, [АТФ] к моменту добавления к клеткам Глу был выше в присутствии пирувата, и поэтому после Глу воздействия в присутствии пирувата [АТФ] был выше.

Как говорилось ранее, даже 20-30 мин инкубация гранулярных нейронов с ДГ приводила к ускорению нарушения кальциевого гомеостаза и сильной МД при Глу воздействии. Мы обнаружили, что [АТФ] после 20 мин инкубации нейронов с ДГ и последующего 10-мин воздействия Глу (ДГ(30 мин)+Глу) не отличается (р>0,05) от [АТФ], которое мы наблюдали после 50мин инкубации клеток с ДГ и пируватом и последующего воздействия на клетки Глу (ДГ(60мин)+Глу+пируват) (Рис. 15). Таким образом, при достоверно не отличающемся уровне [АТФ] в нейронах, мы наблюдали различные изменения [Са2+]| и АЧ'щ при Глу воздействии - постглутаматное [Са2+]]-плато и сильную МД после воздействия ДГ (20 мин)+Глу, и небольшой обратимый подъем [Са2+], после воздействия ДГ(60мин)+пируват +Глу (сравните рис. 4А и рис. 11 А). Это свидетельствует в пользу того, что защитный эффект пирувата не может быть объяснен только поддержанием митохондриального синтеза АТФ, а, по всей видимости, обусловлен поддержанием высокого

р>0,05

Р<0.05

р<0.01!

9 В

О)

СТ) О

з.

I § §1

* £

+ □

Рис. 15. Изменения [АТФ], вызванные действием Глу (0,1мМ) в безглюкозной среде, содержащей ДГ (ЮмМ), а также одновременно ДГ и пируват (5мМ). Контроль - [АТФ], измеренное после 60 мин инкубации нейронов в буфере, содержащем глюкозу. Глу -[АТФ], измеренное после 10 мин воздействия Глу в присутствии глюкозы. ДГ(бОмин) -[АТФ], измеренное после 60 мин инкубации нейронов с ДГ. ДГ(60мин)+Глу - [АТФ], измеренное после 50 мин инкубации нейронов с ДГ и последующего добавления в безглюкозную среду на 10 мин Глу. ДГ(60мин)+Глу+пируват - [АТФ], измеренное после 50 мин инкубации нейронов с ДГ и пируватом с последующим добавлением в безглюкозную среду, содержащую пируват, Глу на 10 мин. ДГ(30мин)+Глу - [АТФ], измеренное после 20 мин инкубации нейронов с ДГ и последующего добавления в безглюкозную среду на 10 мин Глу. ДГ+пируват - [АТФ], измерешюе после 60 мин инкубации нейронов в безглюкозной среде, содержащей ДГ и пируват. На рисунке представлены усредненные данные по 4 экспериментам.

Д*Рт и, соответственно, электрофоретического захвата Са2+ митохондриями.

На основании полученных нами данных были сформулированы следующие выводы. ВЫВОДЫ

1. В молодых гранулярных нейронах мозжечка ингибирование гликолиза путем замены глюкозы на 2-деокси-0-глюкозу (глкжозная депривация), вызывает медленно

развивающуюся митохондриальную деполяризацию (МД), которая устойчива к удалению наружного Са2+ и блокаде глутамат-активируемых каналов. На Основании этих данных сделано заключение, что наблюдаемая МД не является следствием выделения эндогенного глутамата из нейронов или глиальных клеток.

2. МД, вызываемая глюкозной депривацией, подавляется олигомицином и предотвращается добавлением в безглюкозную среду пирувата. Следовательно, МД обусловлена АДФ-зависимым усилением потока протонов через митохондриальную АТФ-синтазу на фоне ослабления дыхания.

3. Блокада митохондриального синтеза АТФ олигомицином не ускоряет развития отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД) и сильной МД, возникающих при глутаматном воздействии, а также не усиливает падения внутриклеточного АТФ, вызванного глутаматом. На основании этих данных сделано заключение, что в молодых нейронах нормального функционирования гликолиза достаточно для противодействия клетки нарушениям кальциевого гомеостаза при глутаматном воздействии.

4. В условиях глюкозной депривации в молодых нейронах значительно ускоряется развитие ОКД и сильной МД в ответ на глутаматное воздействие: МД и ОКД возникают в первые минуты Глу воздействия, как это происходит в зрелых клетках.

5. Антиоксидант МпТВАР и блокатор NO-синтазы L-NAME не оказывают заметного влияния на индуцированные глутаматом изменения [Ca2+]i и митохондриального потенциала в молодых нейронах, лишенных глюкозы. Следовательно, эффекты глюкозной депривации (ускорение развития ОКД и сильной МД во время Глу воздействия) не могут быть объяснены гиперпродукцией реактивных форм кислорода и N0- во время глутаматного воздействия.

6. Замена Са на антагонист митохондриальной поры - ионы Sr2* - не предотвращает быстрого развития вторичной МД, вызванной Глу воздействием в безглюкозной среде. На основании этих данных сделано заключение, что ускорение развития ОКД и сильной МД во время Глу воздействия не может быть объяснено ускорением открывания митохондриальной поры вследствие быстрого падения АТФ во время глюкозной депривации.

7. Ингибирование №+/Са2+-обменника с помощью замены ионов Na+ на ионы Li+ в безглюкозном растворе резко уменьшает число нейронов, в которых в ответ на 15-мин глутаматное воздействие возникает ОКД и сильная МД. Следовательно, в условиях глюкозной депривации реверсия Ыа+/Са2+-обмена во время глутаматного воздействия вносит существенный вклад в нарушение кальциевого гомеостаза, вызываемое глутаматом.

8. Добавление пирувата в безглюкозную среду резко уменьшает или полностью устраняет ускорение развития ОКД и сильной МД во время глутаматного воздействия. Пируват не способен сильно увеличить уровень АТФ при действии глутамата в безглюкозной среде.

9. Сопоставление влияния пирувата на вызванные глутаматом изменения кальциевого гомеостаза и внутриклеточного АТФ в безглюкозной среде позволяет заключить, что защитный эффект пирувата обусловлен его способностью поддерживать генерацию митохондриального потенциала, необходимого как для электрофоретического захвата Са2+ митохондриями, так и для синтеза АТФ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Михайлова М.М.. Большаков А.П., Сурин А.М., Пинелис В.Г. Ходоров Б.И. (2003). Снижение устойчивости нейронов к токсическому воздействию глутамата в отсутствии глюкозы. Биологические Мембраны, 20: 446-448.

2. Bolshakov А.Р., Mikhailova М.М.. Jurevicius A., Surin А.М., Pinelis V.G., Khodorov B.I. (2003). Contribution of Ca2+ and Na+ to glutamate-induced mitochondrial depolarization in cerebellar granule cells. Биологические Мембраны, 20: 443-445.

3. Сурин A.M., Большаков Л.П., Михайлова М.М.. Сорокина Е.Г., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. (2006). Арахидоновая кислота усиливает рост концентрации Са2+ и митохондриальную деполяризацию, вызванные глутаматом в гранулярных нейронах мозжечка. Биохимия, 71(8): 1066-73.

4. Сурин A.M., Сторожевых Т.П., Сорокина Е.Г., Юрявичюс А.И., Большаков А.П., Михайлова М.М., Винская Н.П., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Исследование механизмов митохондриальной деполяризации нейрона при действии глутамата. Тезисы научных докладов III Съезда Биохимического Общества. Санкт-Петербург, 26 июня - 01 июля 2002, с.267-268.

5. Khodorov В., Sunn A., Bolshakov A., Mikhailova М.. Storozhevykh Т., Jurevicius А., Sorokina Е., Vinskaya N., Pinelis V. Prolonged glucose deprivation causes dramatic changes in [Ca2+]i and mitochondrial responses to a toxic Glu challenge in young cerebellar granule cells (CGC). The Physiological Society Meeting, London-2002. J. Physiology 547P: PC23.

6. Ходоров Б.И., Вабниц A.B., Михайлова M.M.. Большаков А.П., Сорокина Е.Г., Сурин

A.M., Пинелис В.Г. О природе отсроченных нарушений кальциевого гомеостаза нейрона при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Третий Российский Конгресс по патофизиологии. Москва 9-12 ноября 2004. Тезисы докладов, стр. 146.

7. Pinelis V., Storozhevykh Т., Sorokina Е., Mikhailova М.. Bolshakov A., Surin A., Khodorov

B. Oligomycin as a tool for the study of Ca2+ homeostasis deterioration in glutamate-treated cultured neurons. 48th Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, February 2004, 1401-pos/B386.

8. Пинелис В.Г., Сторожевых Т.П., Сурин A.M., Сенилова Я. Е., Михайлова М.М., Вабниц А.В., Ходоров Б.И. Механизмы стойкого повышения [Ca2+1i в нейронах, вызванного разобщителем митохондрий в постглутаматный период. Третий Российский Конгресс по патофизиологии. Москва 9-12 ноября 2004. Тезисы докладов, стр. 141.

9. Сурин A.M., Большаков А.П., Михайлова М.М.. Сенилова Я. Е., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г. Влияние арахидоновой кислоты на индуцированные глутаматом изменения Са2+ и митохондриального потенциала в культивируемых нейронах. Третий Российский Конгресс по патофизиологии. Москва 9-12 ноября 2004. Тезисы докладов, стр. 144.

10. Khodorov B.I., Bolshakov А.Р., Mikhailova М.М., Vabnitz A.V., Surin A.M., Storozhevykh T.P., Sorokina E.G., Senilova Y.E., Pinelis V.G. A difference in the mechanisms of mitochondrial depolarization induced by cyanides, glucose deprivation or glutamate exposure in cerebellar granule cells. 34th Annual Meeting of Society for Neuroscience, San Diego 2004, Itinerary viewer 795.5.

И. Большаков А.П., Михайлова M.M., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Влияние глутаматного воздействия на митохондриальный рН в кортикальных нейронах. Конференция «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты». Москва 14-16 марта 2005. Тезисы докладов, стр. 135.

12. Сурин A.M., Большаков А.П., Михайлова М.М., Сорокина Е.Г., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г. Роль арахидоновой кислоты в нарушениях Са2+ гомеостаза, вызванных глутаматом в культивируемых нейронах. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 6-8 июня 2005.

Принято к исполнению 19/02/2007 Исполнено 20/02/2007

Заказ № 122 Тираж: 75 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 \vwyv .autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Михайлова, Мария Михайловна

Введение

Обзор литературы

Цели и задачи исследования

Материалы и методы исследования

Результаты

Обсуждение результатов

Выводы

Благодарности

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Михайлова, Мария Михайловна

Выводы.

1. В молодых гранулярных нейронах мозжечка ингибирование гликолиза путем замены глюкозы на 2-деокси-0-глюкозу (глюкозная депривация), вызывает медленно развивающуюся митохондриальную деполяризацию (МД), которая устойчива к

9+ удалению наружного Са и блокаде глутамат-активируемых каналов. На основании этих данных сделано заключение, что наблюдаемая МД не является следствием выделения эндогенного глутамата из нейронов или глиальных клеток.

5. Антиоксидант МпТВАР и блокатор NO-синтазы L-NAME не оказывают заметного влияния на индуцированные глутаматом изменения [Са ]i и митохондриального потенциала в молодых нейронах, лишенных глюкозы. Следовательно, эффекты глюкозной депривации (ускорение развития ОКД и сильной

МД во время Глу воздействия) не могут быть объяснены гиперпродукцией реактивных форм кислорода и N0- во время глутаматного воздействия.

6. Замена Са2+ на антагонист митохондриальной поры - ионы Sr2* - не предотвращает быстрого развития вторичной МД, вызванной Глу воздействием в безглюкозной среде. На основании этих данных сделано заключение, что ускорение развития ОКД и сильной МД во время Глу воздействия не может быть объяснено ускорением открывания митохондриальной поры вследствие быстрого падения АТФ во время глюкозной депривации.

7. Ингибирование Ка+/Са2+-обменника с помощью замены ионов Na+ на ионы Li+ в безглюкозном растворе резко уменьшает число нейронов, в которых в ответ на 15-мин глутаматное воздействие возникает ОКД и сильная МД. Следовательно, в условиях глюкозной депривации реверсия Ыа+/Са2+-обмена во время глутаматного воздействия вносит существенный вклад в нарушение кальциевого гомеостаза, вызываемое глутаматом.

Благодарности.

Автор сердечно благодарит своего руководителя Бориса Израилевича Ходорова за чуткое руководство, терпение и понимание, без которых выполнение этой работы было бы невозможно.

Автор благодарен руководителю Всеволоду Григорьевичу Пинелису за руководство, внимание, проявленное к выполнению работы, за ценные советы и помощь в постановке экспериментов.

Отдельное большое спасибо преподавателям Московского Физико-технического института за полученные знания, а также за то, что они научили думать.

Автор очень благодарен Александру Михайловичу Сурину за помощь в освоении методов исследований, за возможность в любое время обсудить данные и за ценные замечания.

Также хотелось бы поблагодарить коллектив лаборатории мембранологии Научного Центра Здоровья Детей РАМН за помощь в постановке экспериментов и постоянную поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Михайлова, Мария Михайловна, Долгопрудный

1. Ашмарина А.П., Стукалова П.В., Ещенко Н.Д., Изд. С.-Петербургского университета, 328 е., 1999.

2. Болдырев АА (2001) Окислительный стресс и мозг. Соросовский образовательный журнал 7(4): 21-28.

3. Большаков АП, Михайлова ММ, Пинелис ВГ, Ходоров БИ (2005) Влияние глутаматного воздействия на митохондриальный рН в кортикальных нейронах. Тезисы докладов конференции "Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты", ст. 135.

4. Вабниц АВ, Сенилова ЯЕ, Колесникова ТВ, Сурин AM, Пинелис ВГ, Ходоров БИ (2006) Отсроченная Са2+ диерегуляция в молодых нейронах мозжечка при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Роль NMDA каналов. Биологические мембраны 23(4): 311-319.

5. Виноградов АД (1999) Митохондриальная АТР-синтезирующая машина: пятнадцать лет спустя. Биохимия, 64(11): 1443-1456.

6. Евтодиенко ЮВ, Азарашвили ТС, Теплова ВВ, Одинокова ИВ, Сарис Н-Э (2000) Регуляция ионами кальция окислительного фосфорилирования во внутренней мембране митохондрий печени крысы. Биохимия, 65(9): 1210-1214.

7. Лейкин ЮН и Виноградов АД (1971) Взаимоотношение процессов окислительного фосфорилирования и транспорта ионов Са в митохондриях. Укр. Биохим. Журнал 43: 88-97.

8. Ленинджер А. Биохимия, Изд. "Мир", 1976.

9. Холмухамедов ЭЛ, Теплова ВВ, Чухлова ЭЛ (1991) Возбудимость внутренней мембраны митохондрий. Обратимый Si* -индуцированныи выход Sr2"1" из митохондрий. Биол. Мембр. 8(6): 612-620.

10. Abad MF, DiBenedetto G, Magalhaes PJ, Filippin L, Pozzan T (2004) Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J. Biol. Chem. 279(12): 11521-11529.

11. Adamec E, Didier M, Nixon RA (1998) Developmental regulation of the recovery process following glutamate-induced calcium rise in rodent primary neuronal cultures. Dev. Brain Res. 108(1-2): 101-110.

12. Agranoff BW (1999) Basic Neurochemistry

13. Alano CC, Beutner G, Dirksen RT, Gross RA, Sheu SS (2002) Mitochondrial permeability transition and calcium dynamics in striatal neurons upon intense NMDA receptor activation. J. Neurochem. 80(3): 531-538.

14. Almeida A, Bolanos JP, Medina JM (1999) Nitric oxide mediates glutamate-induced mitochondrial depolarization in rat cortical neurons. Brain Res. 816:580-586.

15. Almeida A and Bolanos JP (2001) A transient inhibition of mitochondrial ATP synthesis by nitric oxide synthase activation triggered apoptosis in primary cortical neurons. J. Neurochem. 77:676-690.

16. Ames A (2000) CNS energy metabolism as related to function. Brain research rev. 34: 42-68.

17. Ankarcrona M, Dypbukt JM, Orrenius S, and Nicotera P (1996) Calcineurin and mitochondrial function in glutamate-induced neuronal cell death. FEBS Lett. 394: 321324.

18. Bano D, Young KW, Guerin CJ, LeFeuvre R, Rothwell N, Naldini L, Rizzuto R, Carafoli E, Nicotera P (2005): Cleavage of the plasma membrane Na+/Ca2+ exchanger in excitotoxicity. Cell 120:275-285.

19. Bernardi P, Vassanelli S, Veronese P, Colonna R, Szabo I, Zoratti M (1992) Modulation of the mitochondrial permeability transition pore. Effect of protons and divalent cations. J. Biol. Chem. 267(5): 2934-2939.

20. Bernardi P (1999) Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, and permeability transition. Physiol. Rev. 79(4): 1127-1155.

21. Blaustein MP, Lederer WJ (1999) Sodium/Calcium exchange: its physiological implications. Physiol. Rev. 79(3): 763-854.

22. Brookes PS, Yoon Y, Robotham JL, Anders MW, Sheu S-S (2004) Calcium, ATP and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. AJP-Cell Physiol. 287: 817-833.

23. Brustovetsky N and Dubinsky J (2000a) Dual responses of CNS mitochondria to elevated calcium. J. Neurosci. 20(1): 103-113.

24. Brustovetsky N and Dubinsky J (20006) Limitations of Cyclosporin A inhibition of the permeability transition in CNS mitochondria. J. Neurosci. 20(22): 8229-8237.

25. Budd SL and Nicholls DG (1996) Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. J. Neurochem. 67: 22822291.

26. Castilho RF, Hansson 0, Ward MW, Budd SL, Nicholls DG (1998) Mitochondrial control of acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. J. Neurosci. 18(24): 10277-10286.

27. Castilho RF, Ward MW, Nicholls DG (1999) Oxidative stress, mitochondrial function, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. J. Neurochem. 72(4): 1394-1401.

28. Chalmers S and Nicholls DG (2003) The relationship between free and total calcium concentrations in the matrix of liver and brain mitochondria. J. Biol. Chem. 278(21): 19062-19070.

29. Chi MM, Pusateri ME, Carter JG, Norris BJ, McDougal DB Jr, Lowry OH (1987) Enzymatic assays for 2-deoxyglucose and 2-deoxyglucose 6-phosphate. Anal. Biochem. 161(2): 508-513.

30. Chinopoulos C, Gerencser A, Doczi J, Fiskum G, Adam-Vizi V (2004) Inhibition of glutamate-induced delayed calcium deregulation by 2-APB and La in cultured cortical neurons. J. Neurochem. 91:471-483.

31. Choi DW (1988) Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron 1(8): 623-634.

32. Choi DW and Rothman SM (1990) The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annu. Rev. Neurosci. 13:171-182.

33. Crompton M (1999) The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. Biochem. J. 341:233-249.

34. Czyz A, Baranauskas G, Kiedrowski L (2002) Instrumental role of Na+ in NMDA excitotoxicity in glucose-deprived and depolarized cerebellar granule cells. J. Neurochem. 81: 379-389.

35. Czyz A and Kiedrowski L. (2002) In depolarized and glucose-deprived neurons, Na+ influx reverses plasmalemmal K+-dependent and K+-independent Na+/Ca2+ exchangers and contributes to NMDA excitotoxicity. J. Neurochem. 83:1321-1328.

36. Danbolt NC (2001) Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65: 1-105.

37. Danysz W and Parsons CG (1998) Glycine and N-methyl-D-aspartat receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharm. Rev. 50 (4): 597-664.

38. Deitmer JW (2000) Glial strategy for metabolic shuttling and neuronal function. BioEssays 22: 747-752.

39. Delgado-Esteban M, Almeida A, Bolanos JP (2000) D-Glucose prevents glutathione oxidation and mitochondrial damage after glutamate receptor stimulation in rat cortical primary neurons. J. Neurochem. 75: 1618-1624.

40. Desagher S, Glowinsky J, Premont J (1997) Pyruvate protects neurons against hydrogen peroxide-induced toxicity. J. Neurosci. 17: 9060-9067

41. Dipolo R, Beauge L (2006) Sodium/Calcium exchanger: influence of metabolic regulation on ion carrier interactions. Physiol. Rev. 86: 155-203.

42. Dringen R, Hamprecht В (1993) Inhibition by 2-deoxyglucose and 1,5-gluconolactone of glycogen mobilization in astroglia-rich primary cultures. J Neurochem. 60(4): 1498504.

43. Duchen MR and Biscoe TJ (1992) Mitochondrial function in type I cells isolated from rabbit arterial chemoreceptors. J.Physiol. 450:13-31.

44. Duchen MR (2004) Mitochondria in health and disease: perspectives on a new mitochondrial biology. Mol. Asp. Med. 25: 365-451.

45. Dugan LL, Sensi SL, Canzoniero LM, Handran SD, Rothman SM, Lin TS, Goldberg MP, Choi DW (1995) Mitochondrial production of reactive oxygen species in cortical neurons following exposure to N-methyl-D-aspartate. J. Neurosci. 15(10): 6377-6388.

46. Eirmel S and Shramm M (1994) The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. J.Neurochem. 62:1223-1226

47. Eimerl S and Schramm M (1995) Resuscitation of brain neurons in the presence of Ca after toxic NMDA-receptor activity. J. Neurochem. 65: 739-743.

48. Erecinska M, Deas J, Silver IA (1995) The effect of pH on glycolysis and phosphofructokinase activity in cultured cells and synaptosomes. J. Neurochem. 65: 2765-2772.

49. Erecinska M, Nelson D, Silver IA (1996) Metabolic and energetic properties of isolated nerve ending particles (synaptosomes). Biochim. Biophys. Acta 1277: 13-34.

50. Filippin L, Magalhaes PJ, DiBenedetto G, Colella M, Pozzan T (2003) Stable interactions between mitochondria and endoplasmic reticulum allow rapid accumulation of calcium in a subpopulation of mitochondria. J. Biol. Chem. 278(40): 39224-39234.

51. Fontaine E, Eriksson O, Ichas F, Bernardi P (1998) Regulation of the permeability transition pore in skeletal muscle mitochondria. Modulation By electron flow through the respiratory chain complex i. J. Biol. Chem. 273(20): 12662-12668.

52. Hagen T, Lagace CJ, Modica-Napolitano JS, Aprille JR(2003) Permeability transition in rat liver mitochondria is modulated by the ATP-Mg/Pi carrier. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 285:274-281.

53. Hansson MJ, Mansson R, Mattiasson G, Ohlsson J, Karlsson J, Keep MF and Elmer E (2004) Brain-derived respiring mitochondria exhibit homogeneous, complete and cyclosporine-sensitive permeability transition. J. Neurochem. 89: 715-729.

54. Hardingham GE, Fukunaga Y, Bading H (2002) Extrasynaptic NMDARs oppose synaptic NMDARs by triggering CREB shut-off and cell death pathways. Nat. Neurosci. 5(5): 405-414.

55. Hartley DM, Kurth MC, Bjerkness L, Weiss JH, and Choi DW (1993) Glutamate receptor-induced 45Ca2+ accumulation in cortical cell culture correlates with subsequent neuronal degeneration. J. Neurosci. 13(5): 1993-2000.

56. Hermans AN, Glitsch HG, Verdonck F (1997) Activation of the Na+/K+ pump current by intra- and extracellular Li ions in single guinea-pig cardiac cells. Biochim. Biophys. Acta. 1330(1): 83-93.

57. Hoyt KR, Arden SR, Aizenman E, Reynolds IJ (1998) Reverse Na+/Ca2+ exchange contributes to glutamate-induced intracellular Ca2+ concentration increases in cultured rat forebrain neurons. Mol. Pharmacol. 53: 742-749.

58. Hunter DR, Haworth RA and Southard JH (1976) Relationship between configuration, function, and permeability in calcium-treated mitochondria. J. Biol. Chem. 251(16): 5069-5077.

59. Ichas F and Mazat JP (1998) From calcium signaling to cell death: two conformations for the mitochondrial permeability transition pore. Switching from low- to high-conductance state. Biochim Biophys Acta 1366: 33-50

60. Jouaville LS, Pinton P, Bastianutto C, Rutter GA and Rizzuto R (1999) Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. PNAS 96(24): 13807-13812.

61. Karkanias NB, Parke RL (1999) Subtype-specific effects of lithium on glutamate receptor function. J. Neurophysiol. 81: 1506-1512.

62. Keelan J, Vergun 0, Duchen MR (1999) Excitotoxic mitochondrial depolarization requires both calcium and nitric oxide in rat hippocampal neurons. J. Phys. 520(3): 797813.

63. Khodorov B, Pinelis V, Vergun 0, Storozhevykh T, Vinskaya N (1996) Mitochondrial deenergization underlies neuronal calcium overload following a prolonged glutamate challenge. FEBS Lett. 397:230-234.

64. Khodorov BI (2004) Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurons. Prog Biophys. Mol. Biol. 86: 279-351.

65. Kiedrowski L, Wroblewski JT, Costa E (1994) Intracellular sodium concentration in cultured cerebellar granule cells challenged with glutamate. Mol. Farmacol. 45:10501054.

66. Kiedrowki L and Costa E (1995) Glutamate-induced destabilization of intracellular calcium concentration homeostasis in cultured cerebellar granule cells: role of mitochondria in calcium buffering. Mol. Pharmacol. 47(1): 140-147

67. Kiedrowski L (1999) N-methyl-D-aspartate excitotoxicity: relationships among plasma membrane potential, Na(+)/Ca(2+) exchange, mitochondrial Ca(2+) overload, and cytoplasmic concentrations of Ca(2+), H(+), and K(+). Mol. Pharmacol. 56(3): 619632.

68. Klingenberg M and Rottenberg H (1977) Relation between the gradient of the ATP/ADP ratio and the membrane potential across the mitochondrial membrane. Eur. J. Biochem. 73:125-130.

69. Koch RA and Barish ME (1994) Perturbation of intracellular calcium and hydrogen ion regulation in cultured mouse hippocampal neurons by reduction of the sodium ion concentration gradient. J. Neurosci 14(5): 2585-2593.

70. Kristian T, Gertsch J, Bates ТЕ, Siesjo BK (2000) Characteristics of the calcium-triggered mitochondrial permeability transition in nonsynaptic brain mitochondria: effect of cyclosporin A and ubiquinone O. J. Neurochem. 74(5): 1999-2009.

71. Kristian T, Bernardi P, Siesjo BK (2001) Acidosis promotes the permeability transition in energized mitochondria: implications for reperfusion injury. J. Neurotrauma 18(10): 1059-1074.

72. Kristian T, Weatherby TM, Bates ТЕ, Fiskum G (2002) Heterogeneity of the calcium-induced permeability transition in isolated non-synaptic brain mitochondria. J. Neurochem. 83(6): 1297-1308.

73. Kristian T (2004) Metabolic stages, mitochondria and calcium in hypoxic/ischemic brain damage. Cell Cal. 36:221-233.

74. Kushnareva YE, Wiley SE, Ward MW, Andreev AY, Murphy AN (2005) Excitotoxic injury to mitochondria isolated from cultured neurons. J. Biol. Chem. 280(32): 2889428902.

75. Lee J-Y, Kim Y-H and Koh J-Y (2001) Protection by pyruvate against transient forebrain ischemia in rats. J. Neurosci. 21: RC 171.

76. Limbrick DD, Sombati Jr.S, DeLorenzo RJ (2003) Calcium influx constitutes the ionic basis for maintenance of glutamate-induced extended neuronal depolarization associated with hippocampal neuronal death. Cell Calcium 33: 69-81.

77. Lin MT and Beal MF (2006) Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature 443: 787-795.

78. Lipton P (1999) Ischemic cell death in brain neurons. Physiol. Rev. 79(4): 1431-1568.

79. Marcaida G, Minana MD, Grisolia S, Felipo V (1995) Lack of correlation between glutamate-induced depletion of ATP and neuronal death in primary cultures of cerebellum. Brain.Res. 695(2): 146-150.

80. Marks JD, Bindokas VP, Zhang XM (2000) Maturation of vulnerability to excitotoxicity: intracellular mechanisms in cultured postnatal hippocampal neurons. Brain. Res. Dev. Brain Res. 124:101-116

81. Mattson MP, Guthrie PB, Kater SB (1989) A role for Na+-dependent Ca2+ extrusion in protection against neuronal excitotoxicity. FASEB J. 3: 2519-2526

82. Mattson MP, Zhang Y, Bose S (1993) Growth factors prevent mitochondrial dysfunction, loss of calcium homeostasis, and cell injury, but not ATP depletion in hippocampalneurons deprived of glucose. Exp. Neurol. 121(1): 1-13.

83. Maus M, Marin P, Glowinski J and Premont J (1999) Pyruvate and lactate protect striatal neurons against N-methyl-D-aspartat-induced neurotoxocoty. Europ. J. Neurosci. 11:3215-3224.

84. McCormack JG, Halestrap AP, Denton RM (1990) Role of calcium ions in regulation of mammalian intramitochondrial metabolism. Physiol. Rev. 70(2): 391-425.

85. Moncada S, Erusalimsky JD (2002) Does nitric oxide modulate mitochondrial energy generation and apoptpsis? Nat Rev Mol Cell Biol. 3(3): 214-220.

86. Nakamoto RK (1999) Molecular features of energy coupling in the F0Fi ATP synthase. News Physiol. Sci. 14:40-46.

87. Nicholls DJ and Budd SL (2000) Mitochondria and neuronal survival. Physiol. Rev. 80: 315-360.

Информация о работе

Михайлова, Мария Михайловна
кандидата физико-математических наук
Долгопрудный, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Роль нарушений энергетического метаболизма в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при гиперстимуляции глутаматных рецепторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы