Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль мембранных рецепторов лимфоцитов в патогенезе ВИЧ-1 в лимфатической ткани человека ex vivo

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль мембранных рецепторов лимфоцитов в патогенезе ВИЧ-1 в лимфатической ткани человека ex vivo"

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи

Малькевич Нина Владиславовна

Роль мембранных рецепторов лимфоцитов в патогенезе ВИЧ-1 в лимфатической ткани человека ex vivo.

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ и Национальном Институте Здоровья США

Научные руководители:

академик В. П. Скулачев доктор биологических наук Л. Б. Марголис

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Самуилов В. Д. доктор биологических наук член-корреспондент Зверев В.В.

Ведущая организация: Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МП. Чумакова РАМН.

Защита состоится «_» _2000 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д.053.05.32 по адресу: 119899 Москва, Воробьевы Горы, Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан_ноября 2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук ~ Медведева М. В.

1^14, п-/

[\

I

Актуальность темы. ВИЧ-инфекция, приводящая к СПИДу, представляет собой актуальную проблему для большинства стран мира. И несмотря на определенные успехи последних лет в изучении инфекции, диагностики и лечения болезни, вызванной ВИЧ, пандемия ВИЧ продолжает распространяться по планете. В некоторых развивающихся странах уже в настоящее время СПИД стал основной причиной смерти взрослого населения до 30 лет. Подсчитано, что каждые 13 минут в мире происходит новое заражение ВИЧ, а каждые 9 минут происходит смерть, вызванная ВИЧ инфекцией. Согласно прогнозу ВОЗ, к концу 2000 года число ВИЧ инфицированных может достичь 40 млн. человек, а число умерших 8 млн. человек. Полагают, что в ближайшее десятилетие 10-20 млн. детей останутся без родителей.

Проблеме ВИЧ-инфекции во всем мире уделяется огромное внимание. Одно из наиболее важных достижений в науке за последние 5 лет в области лечения ВИЧ-инфекции - это создание комплексной высокоактивной антиретровирусной терапии, которая продлевает жизнь ВИЧ больного на длительный срок. И тем не менее, фундаментальные проблемы ВИЧ-инфекции все еще остаются нерешенными. В первую очередь это относится к вопросам патогенеза в лимфатической ткани человека, где развиваются главные процессы, определяющие ход болезни Понимание этих процессов -одна из актуальных задач фундаментальной биологии и медицины.

Известно, что ВИЧ-1 отличает исключительно высокая генетическая изменчивость (Coffin et al., 1995). В зараженном организме происходит постепенная закономерная эволюция вируса. Это приводит к тому, что вирусы выделяемые на последних стадиях болезни отличаются от тех, которые доминировали в ее начале. Однако, не известно существует ли причинно-следственная связь между эволюцией вируса в организме больного и прогрессированием болезни. В нашем исследовании мы ставили перед собой цель - изучить механизм патогенеза в лимфатической ткани человека, зараженной вариантами ВИЧ-1, выделяемых на ранних и поздних стадиях болезни. Эта цель актуальна как для понимания фундаментальных биохимических и вирусологических проблем ВИЧ-1 инфекции, так и для практической разработки антивирусных препаратов и создания анти-ВИЧ вакцин.

Пелью настоящей работы явилось изучение патогенеза ВИЧ-1 в лимфатической ткани человека ex vivo. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Существует ли причинно-следственная связь между использованием определенного корецептора и гибелью CD4+ Т-клеток при ВИЧ-1-инфекции в лимфатической ткани человека ex vivo?

2. Меняется ли количество и функция CD8* Т-клеток лимфатической ткани, инфицированной ex vivo ВИЧ-1?

3. Вызывает ли ВИЧ-1-инфекция апоптоз Т-лимфоцитов в зараженной ткани?

Научная новизна работы. Продемонстрировано, что цитопатический эффект ВИЧ-1 в лимфатической ткани, инфицированной ex vivo, определяется использованием CXCR4-KopeuenTopa исключительно или комбинацией CXCR4 и CCR5-Kopeuerrropa в CD4* Т-лимфоцитах. Впервые показано, что использование Х4 и R5X4 вариантами ВИЧ-1 СХСК4-корецептора, но не CCR5 ведет к массовой гибели CD4* Т-лимфоцитов.

Впервые на лимфатической ткани проведено сравнительное исследование цитопатического воздействия ВИЧ-1 субтипов А, С, Е и субтипа В. Установлено, что использование СХСЯ4-корецептора является главным фактором в патогенезе ВИЧ-1 субтипов А, С, Е.

Показано, что варианты ВИЧ-1, обладающие двойным тропизмом (R5X4), т. е те, которые в трансформированных клетках используют оба корецептора (CXCR4 и CCR5), в лимфатической ткани могут использовать только один из двух корецептров. Использование CXCR4-KopeuenTopa, но не CCR5 ведет к массовой гибели CD4* Т-лимфоцитов.

Впервые на лимфатической ткани, инфицированной ex vivo R5 и Х4 ВИЧ-1, установлено, что вирусное размножение влияет на количество CD4* Т-клеток, но не влияет ни на количество CD8* Т-лимфоцитов, ни на их способность синтезировать цитокины в ответ на экзогенную стимуляцию.

Обнаружено значительное увеличение апоптоза в субпопуляциях CD4* Т- лимфоцитов в тканях зараженных Х4 и R5 ВИЧ-1.

На основании экспериментов с лимфатической тканью ex vivo, мы предполагаем, что использование СХСК4-корецептора является основным фактором, определяющим цитопатическое воздействие ВИЧ-1. Появление у пациентов Х4 вариантов ВИЧ-1 способствует прогрессированию болезни. Высказано предположение, согласно которому,

иммуностимуляция в сочетании с вирусным размножением является главным фактором, индуцирующим смерть CD8* Т-лимфоцитов при ВИЧ-1-инфекции у человека.

Практическая ценность работы. Полученные данные значительно расширяют знания о молекулярном механизме патогенеза ВИЧ-1, выделяемого на ранней и поздней стадиях болезни, в отношении лимфоцитов в лимфатической ткани. Наши результаты вносят вклад в решение фундаментальной проблемы - выяснение механизма гибели CD4* Т-клеток при инфекции ВИЧ-1. Проведенные впервые исследования цигопатического эффекта ВИЧ-1 субтипов А, С, Е могут служить основой для разработки лекарственных препаратов, направленных на лечение инфекции ВИЧ-1 в развивающихся странах, где наиболее высокое количество ВИЧ-инфицированных людей, и где распространены вирусы этих субтипов. Полученные результаты могут быть использованы при изучении патогенеза штаммов ВИЧ-1, устойчивых к лекарственным препаратам, а также будут способствовать более глубокому пониманию механизма патогенеза R5 вариантов ВИЧ-1, выделяемых на поздних стадиях болезни.

Лимфатическая ткань является перспективной моделью для тестировании эффективности новых анти-ВИЧ-1 лекарств. Наши исследования могут применяться при разработки анти-ВИЧ-1 вакцин и проверки восстановления клеточного и гуморального иммунного ответа.

Апробация работы. Результаты настоящей работы были представлены на ежегодной международной конференции по вопросам патогенеза ВИЧ-1 в Институте Вирусологии (Балтимор, США, 1999); на седьмой конференции ретровирусов и оппортунистических инфекций (Сан-Франциско, США, 1999); на симпозиуме в Кистоне по изучению новых подходов к ВИЧ-1-инфекции (Кястон, США, 2000); на восьмой международной конференции по проблемам СПИДа (Дурбан, Южная Африка, 2000); на первой международной конференции по проблеме разработки анти-ВИЧ вакцин и иммунотерапии (Палмбич, США, 2000); на фестивале молодых ученых в Национальном Институте Здоровья США (Бетезда, США 1999, 2000).

Публикации. По материалам работы опубликовано 5 тезизов и 3 статьи.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов и списка литературы.

Работа изложена на_ страницах машинописного текста, содержит _

рисунков и_таблиц. Список литературы включает_источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Метод гистокультур лимфатической ткани человека и их заражение ВПЧ-; Мы использовали миндалины детей, удаленные хирургическим путем. Миндалин: разрезали на кусочки размером 2-3 мм. 10 таких кусочков ткани, размером 2-Змь помещали на коллагеновые гели в культуральяые чашки с 4 мл культуральной сред: RPMI1640 и культивировали их в течении 12-14 дней, со сменой среды каждые 3 дня. работе были использованы лабораторные штаммы и первичные изоляты ВИЧ-1 субтипа I полученных из банха вирусов и реагентов Национальных институтов Здоровья СШ. (Bethesda, USA). Заражение тканей происходило путем нанесения вирус-содержащей сред: в объеме 3-5 мкл на поверхность каждого кусочка. Средняя инфекционная доза составлял 100-300 ТСГО50/кусочек.

Измерение вирусной репликации методом ELISA. Алихвоты культурально среды замораживали и в конце эксперимента тестировали на содержание вирусног капсидного белка р24, использовали коммерческие наборы ELISA (enzyme-linked-immunc assay) (Coulter, Miami, FL, USA).

Концентрацию р24 в среде анализировали с помощью компьютерной программ] DeltaSoft.

Метод проточной цитометрии. В конце эксперимента, клетки механическ изолировали из кусочков ткани и отмывали в фосфатном буфере центрифугирование;. Для определения отношения числа CD4* Т-клеток к числу CDS" Т-клеток, суспензт отмытых лимфоцитов окрашивали моноклональными антителами к следующи; поверхностным маркерам CD8, CD4, CD3 и затем фиксировали в 3.7% раствор параформальдегида. После этого, клетки анализировали методом проточной питометр tri на приборе FACSort (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), используя компьютерну! программу Cell Quest (Becton Dickinson).

Первоначально лимфоциты идентифицировали по светорассеянию, а зате: дополнительно по специфическим маркерам плазматической мембраны.

Метод подсчета абсолютного числа клеток «TRUCOUNT». 20-60 кусочко зараженной и контрольной лимфатической ткани взвешивали на аналитических веса>

После удаления избытка среды клетки механически изолировали из ткани, центрифугировали и ресуспендировали в 500 мкл фосфатного буфера. 80 мкл клеточной суспензии переносили в специальную пробирку с известным количеством флуоресцентных шариков (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), затем окрашивали антителами к CD3, CD4, и CD8 как описано выше и фиксировали в 400 мкл 3,7% параформальдегида. Клетки анализировали методом проточной цитометрии.

Число клеток расчитывали по формуле, предложенной в описании метода «TRUCOUNT» (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

Определение апоптоза. Адоптозные клетки выявляли с помощью окрашивания антителами АР02.7 к митохондриальному белку 7А6, который появляется на внешней мембране митохондрий при ранних стадиях апоптоза.

Изолированные из лимфатической ткани клетки были окрашены смесью моноклональных антител к поверхностным антигенам: aHni-CD3-FITC, amn-CD8-TC, анти-С04-АРС (Caltag, Immunotech, Marselle, France), aHra-CCR5-APC (BD Pharmingen), aHTH-CXCR4-Biotin (BD Pharmingen) с дальнейшей окраской стрептавидин-FITC (BD Pharmingen).

Окрашенные клетки отмывали в фосфатном буфере, фиксировали в 3.7% растворе парафармальдегида и затем пермеабилизовывали в растворе cytofix/cytowash (Pharmingen, San Diego, CA, USA). Лимфоциты анализировали методом проточной цитометрии.

Определение функциональной активности CD8* Т-лимфоцитов. Функциональная активность CD8' Т-клеток из ВИЧ-1 инфицированных и контрольных тканей оценивали по внутриклеточной продукции цитокинов (GFN-y, IL-2, TNF-a), синтезированных лимфоцитами в ответ на экзогенную активацию форболмиристатом (РМА) или анти-С03/анти-С028 антителами фирмы Sigma (Grand Island, NJ).

Определение генотипа A32CCR5 ткани. Клеточную ДНК изолировали из клеток пациентов с известным CCR5 генотипом и из фенотипически CCR5 отрицательной лимфатической ткани.

Примерно 200 нг ДНК была амплифицирована методом ПЦР в 50 мкл реакции с использованием Platinum Tag (Life Technologies, Rockville, MD, USA), 2 мМ MgC12, 175 мкл каждого dNTP и 15 пМ каждого праймера (5'-GTC TTC ATT АСА ССТ GCA СТС-3' 5 '-GGT ССА АСС TGT TAG AGC TAC TGC-3 ').

Продукты амплификации были разделены в 2% агарозном геле и окрашены этидиум бромидом.

Использование ингибиторов вирусного взаимодействия с клеткой. Мы использовали RANTES (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) в концентрации ЮОнМ для ингибирования CCR-5-корецеггтора. AMD3100 (любезно предоставленный профессором J. Moor, Aaron Diamond Center, NY, USA) был использован для блокировки CXCR4-корецептора в концентрации 1мкг/мл.

Анализ экспериментальных данных. Материал исследований был обработан методом вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Анализ абсолютного количества CD4* и CD8* Т-клеток в лимфатической ткани, инфицированной Х4 н R5 вариантами ВЕГЧ-1. Мы ставили перед собой задачу ответить на вопрос: как инфекция R5 и Х4 вариантов ВИЧ-1 влияет на количество CD4' и CDS* Т-лимфоцитов в лимфатической ткани человека, зараженной ex vivo.

Для того, чтобы ответить на поставленный вопрос, лимфатическая ткань была инфицирована Х4 изолятом LAV.04 и R5 изолятом SF162 ВИЧ-1. На рисунке 1 представлены типичные кривые репликации LAV.04 и SF162 в лимфатической ткани, инфицированной ex vivo. Вирусное размножение в ткани начинает детектироваться с шестого дня после инфицирования и достигает наиболее высоких значений на 12 день.

дни после заражения

Рисунок 1. Размножение LAV.04 и SF162 в лимфатической ткани человека ел vivo. Гистокультуры лимфатической ткани были инфицированы вирус-содержаиш" средой (см. главу Материалы и Методы). Вирусную репликацию оценивали по количеств) высвобожденного в среду капсидного вирусного белка р24.

Число клеток подсчитывали в контрольной и ВИЧ-1 зараженной ткани каждого донора в последний день после инфицирования методом TRUCOUNT. Мы обнаружили, что инфекция LAV.04 истощает популяцию CD4* Т-лимфоцитов на 80%, а инфекция SF162 истощает популяцию CD4* Т-лимфоцитов на 20-30% по сравнению с контролем. Количество CD8* Т-лимфоцитов было близко к контролю как при LAV.04 и так и при SF162 инфекции (рисунок 2а).

Мы измеряли динамику изменения числа CD4* и CD84 Т-лимфоцитов в разные дни после инфицирования LAV.04. Количество CD4+ Т-клеток начинало падать с шестого дня и продолжалось в последующие дни (рисунок 26). Начало вирусного размножения совпадает с началом падения числа CD4* Т-клеток.

I 125 н 8 *

| 5 юо Н I х

и 8 75 1

¡I »1

LAV.04 SF162

Вирусы

■ CD4+ □ CD8+

Дня посте заражения

Рисунок 2. Анализ количества CD4+ и CD8* Т-лиифоцитов в ВИЧ-1 инфицированной ткани. Кусочки одинакового размера и веса были инфицированы ех vivo ВИЧ-1 и культивированы 11-13 дней. Лимфоциты были механически изолированы и количественно определены в разные дни после заражения, (а) Количество CD4* и CDS'' Т-лимфоцитов в LAV.04 (п=13) и SF162 (п=3) инфицированной ткани на 12-13 день после заражения. Инфекция LAV.04 истощает количество CD4* Т-клеток на 80%, а инфекция SF162 истощает количество CD4* Т-клеток на 25%. Число CD8* Т-лимфоцитов в ВИЧ-1 зараженной ткани близко к контролю, (б) Динамика изменения CD4* и CD8* Т-лимфоцитов на разные дни после инфицирования LAV.04. Число CD4* Т-клеток начинало падать с шестого дня, а число CD8* Т-лимфоцитов во все дни после инфицирования стабильно.

Таким образом, инфекция ВИЧ-1 ex vivo лимфатической ткани человека вызывает гибель CD4* Т-лимфоцитов и не изменяет количество CD8* Т-лимфоцитов.

Увеличение апоптоза в CD4* Т-лимФоцитах в тканях, зараженных R5 и X-ВИЧ-1. Для того чтобы понять механизм уничтожения CD4* Т-клеток, мы выяснял! увеличивается ли апоптоз Т-клеток в лимфатической ткани зараженной ex vivo ВИЧ-1. Мь измеряли уровень апоптоза в CD4* и CDS' Т-лимфоцитах из Х4 и R5 ВИЧ- ] инфицированной и контрольной ткани. Клетки были окрашенные антителами АР02.7 t мигохондриальному белку 7А6 (ранний маркер апоптоза) (Metivier D., et al., 1998) i проанализированы методом проточной цитометрии.

« а

Рисунок 3. Индукция апоптоза в популяции CD4* Т-лимфоцитов в ткаш инфицированной LAV.Q4 и SF162. Клетки, механически изолированные из ВИЧ-1 зараженной и контрольной ткани, были окрашены антителами против CD3, CD4, CD8 i апоптозного маркера 7А6, и затем анализированы методом проточной цитометрии. (а) Апоптоз в CD4* и CD8* Т-лимфоцитах из LAV.04 и SF162 зараженных тканей. Уровеш апоптозных клеток в CD4* Т-лимфоцитах из LAV.04 инфицированной ткани (п=7) был i 3.8 раз выше по сравнению с контрольной и SF162 зараженной тканью (п=3). Уровен! апоптоза в CD8* Т-клетках в контрольной и ВИЧ-1 зараженной ткани одинаков, (б) Анали: апоптоза в субпопуляциях CXCR47CCR57CD4* и CXCR47CCR57CD4* Т-клеток и: LAV.04 и SF162 инфицированных тканей. Инфекция SF162 индуцирует апоптоз только : субпопуляции CXCR47CCR57CD4* Т-клеток (п=3). Инфекция LAV.04 индуцирует апопто: в субпопуляции CXCR47CCR57CD4* и CXCR47CCR57CD4* Т-клеток (п=3).

Мы обнаружили значительное увеличение апоптоза в CD4* Т-лимфоцитах из тканей, зараженных Х4 вариантом LAV.04 ВИЧ-1 (рисунок За). В частности, в тканях, зараженных LAV. 04, увеличение апоптоза в 4-5 раз наблюдали в субпопуляциях Т-лимфоцитов - CXCR47CCR57CD4* и CXCR4VCCR57CD4" Апоптоз, индуцируемый Х4 вариантом LAV.04, распространялся также на субпопуляцию CCR57CXCR47CD4* Т-клеток (рисунок 36). - Причина апоптоза CCR57CXCR47CD4* Т-лимфоцитов в тканях, зараженных LAV.04, не известна. Возможны следующие объяснения: I). LAV.04 индуцирует апоптоз в лимфоцитах, расположенных рядом с зараженными вирусом CD4* Т-лимфоцитами (bystander cell death effect). 2). CCR57CXCR47CD4* Т-лимфоциты на самом деле экспрессируют CXCR4-Kopeuerrrop, но на уровне, который ниже порога чувствительности метода проточной цигометрии, но достаточном для заражения LAV.04.

Апоптоз в общей популяции CD4* Т-клеток в ткани, зараженной R5 вариантом SF162, не отличался от контроля (рисунок За). Однако, в субпопуляции CCR57CXCR4" /CD4* Т-лимфоцитов, SF162 вызывал увеличение апоптоза в 4 раза (рисунок 36). Поскольку CCR57CXCR47CD4* Т-клетки составляют не более 10% от общего числа CD4* Т-клеток (Grivel J-C and Margolis L.B., 1999), то увеличение апоптоза в этой субпопуляции не приводило к заметному увеличению апоптоза во всей популяции CD4* Т-оегок.

Следовательно, что R5 варианты ВИЧ-1 индуцируют апоптоз селективно в CCR57CXCR47CD4' Т-клетках, т.е. в соответствии с их корецепторной утилизацией. Апоптоз является, по-видимому, ведущим механизмом гибели CD4+ Т-лимфоцитов под действием ВИЧ-1.

В 1999 г. в работе Grivel J-C. и Margolis L. была высказана гипотеза, согласно которой Х4 и R5 ВИЧ-1 одинаково патогенны для своих клеток-мишеней. Однако, R5 ВИЧ-1 (SF162) истощает селективно субпопуляцию CCR57CXCR47CD4*, а Х4 ВИЧ-1 (LAV.04) истощает субпопуляции CCR57CXCR47CD4* и CCR57CXCR47CD4* Т-клеток. В нашей работе результаты распределения апоптозных клеток между субпопуляциями CXCR47CCR57CD4* и CXCR47CCR57CD4* в тканях, зараженных Х4 и R5 ВИЧ-1, подтверждают эту гипотезу. Тот факт, что Х4 и R5 варианты индуцируют апоггтоз в разных субпопуляциях CD4* Т-лимфоцитов лимфатической ткани объясняет механизм сильной патогенности Х4 вариантов, которая была отмечена у ВИЧ-1 инфицированных больных.

Таким образом, появление Х4 вариантов ВИЧ-1 у пациентов является достаточным фактором способствующим прогрессированию болезни.

Анализ апоптоза в популяции CD8* Т-лимфоцитов в лимфатических тканях, зараженных Х4 и R5 вариантами ВЕГЧ-1. Ускорение болезни у ВИЧ-1 инфицированных пациентов также связывают с уменьшением числа CDS* Т-клеток и повышением уровня апоптоза в них (Walker B.D., et al., 1998). Поэтому на следующем этапе нашей работы мы измерили количество CDS'" Т-клеток в ВИЧ-1 инфицированной и контрольной ткани и оценили уровень апоптоза в этой популяции лимфоцитов.

Мы обнаружили, что в отличие от высокого уровня апоптоза в CD4* Т-клетках в тканях, инфицированных Х4 и R5 вариантами ВИЧ-1, уровень апоптоза в CD8* Т-клетках не отличался от контроля (рисунок 3), а число CD8* Т-лимфоцитов было стабильно (рисунок 2).

Мы не обнаружили гибели CD8+ Т-лимфоцитов и увеличения апоптоза в этой популяции клеток. Одна из возможных причин, которая могла бы объяснить стабильность количества CDS4' Т-клеток - это размножение, скорость которого компенсирует скорость гибели CD8* Т-клеток. Поэтому был измерен уровень размножения в лимфоцитах, изолированных из ВИЧ-1 инфицированных и контрольных гистокультур методом детекции Ki-67.

Мы обнаружили, что количество размножающихся CD8* Т-клеток составляет не более 1% от общего количества CD8* Т-лимфоцитов как в ВИЧ-1 зараженных, так и в контрольных тканях.

Таким образом, размножение ВИЧ-1, индуцирующее смерть CD4' Т-лимфоцитов в лимфатической ткани ex vivo не вызывало гибель CD8* Т-лимфоцитов. Однако, можно было предположить, что не вызывая гибели CD8* Т-леток, инфекция ВИЧ-1 влияет на их функциональное состояние. Мы проверили эту возможность в тканях, инфицированных LAV.04.

Проверка функциональности CD8* Т-лимфоцитов. Мы выясняли какое влияние оказывает вирусное размножение на функциональное состояние CDS* Т-лимфоцитов е тканях, инфицированных LAV.04.

Мы оценили способность CDS* Т-имфоцитов синтезировать цитокины в ответ на экзогенную стимуляцию РМА (форболмиристатом) или смесью антител к CD3/CD28. Оказалось, что уровень продукции TNF-a, EFN-y, IL-2 CD8+ Т-лимфоцитами из контрольных и зараженных тканей в обоих случаях не отличался (рисунок 4).

Рисунок 4. Продукция DL-2, TNF-a и IFN-y CD8* Т-клетками из контрольной и LAV.04 зараженной ткани в ответ на экзогенную стимуляцию.

Клетки были изолированы из контролной и LAV.04 зараженной ткани на 8-10 дни после инфицирования, активированы и окрашены антителами против CD3, CD4, CD8 и против L-2, TNF-a и EFN-y, а затем анализированы методом проточной цитометрии. (а) Лимфоциты были активированы РМА/иономицином в течении 4х часов в присутствии моненсина (ингибитор секреции) (п=3) (б) Клетки были активированы антителами против CD3/CD28 в течении 40 часов (п=3). В обоих случаях уровень продукции цигокинов CD8' Т-клетками из контрольной и LAV.04 зараженной ткани был одинаков.

Таким образом, в лимфатической ткани ex vivo инфекция ВИЧ-1 не только не влияла на жизнеспособность CDS* Т-клеток, но и не нарушала их способность синтезировать цитокины в ответ на экзогенную стимуляцию.

Наши результаты отличаются от опубликованных результатов, полученных с использованием периферической крови человека (Herbein et al., 1999). В этой работе Х4, но не R5 ВИЧ-1 индуцировали апоптоз в присутствии макрофагов в CD8* Т-лимфоцитах, изолированных из периферической крови человека. Одна из возможных причин гибели CD8* Т-клеток в такой системе может состоять в том, что периферическую кровь in vitro необходимо искусственно активировать добавлением РНА и IL-2 для поддержания

жизнеспособности клеток и продуктивной инфекции ВИЧ-1. Известно, что искусственная активация ведет к клеточной пролиферации и индукции апоптоза (Groux et al., 1992). В отличии от изолированных клеток гистокультуры не нуждаются в экзогенной активации ни для поддержания жизнеспособности, ни для вирусного размножения.

Мы полагаем, что в отличие от ситуации ex vivo и in vivo, хроническая активация иммунной системы может быть дополнительным фактором, который в комбинации с вирусным размножением приводит к гибели CDS* Т-лимфоцитов. В пользу этого предположения свидетельствует наблюдение, согласно которому вирионы, захваченные в терминальном- центре и экспрессированные на поверхности ФДК (Фоликулярные Дендритные клетки), приводят к непрерывной стимуляции иммунной системы человека. Вирионы, прикрепленные к поверхности ФДК, также являются потенциальным источником нового заражения и активации CD4+ Т-клеток, которые находятся рядом или мигрируют через лимфатический узел (Famularo et al., 1997).

Специфичность корецепторного использования RSX4 ВИЧ-1. Мы выясняли, используют ли R5X4 (дуалтропные) варианты ВИЧ-1 корецепторы CCR5 и CXCR4 для инфицирования CD4* Т-клеток в лимфатической ткани человека ex vivo и связано ли использование определенного корецеггтора с воздействием вируса на клетку.

Лимфатические ткани человека были инфицированы тремя клонированымн R5X4 вариантами и одним первичным R5X4 изолятом ВИЧ-1. Лимфатические ткани заражали первичными изолятами 93US151, 89.6, и 89-v345.SF, 89-V345.FL. Последние два вируса -это производные от 89.6, в которых V3-V5 области gpl20 были заменены соответствующими последовательностями от R5 вариантов SF162 и JR-FL. Все три варианта ВИЧ-1 эффективно используют CCR5- и СХСК4-корецепторы для заражения трансформированных CD4* Т-клеточных линий in vitro и являются, таким образом, R5X4, т.е. обладают двойным тропизмом. Предполагалось, что R5X4 ВИЧ-1, использующие CCR5 и CXCR4 корецепторы in vitro, будут также эффективно утилизировать оба корецепгора в лимфатической ткани ex vivo. Однако, наши опыты продемонстрировали, что это не так.

Для того чтобы понять какие ко-рецепторы используются R5X4 изолятами ВИЧ-1, мы заражали ткань в присутствии лигандов: AMD3100, специфическим лигандом к

СХСП4, и ЯАМТЕЗ, специфическим лигандом к ССК.5. Мы оценивали вирусную репликацию и истощение числа С04* Т-лимфоцитов в инфицированной и контрольной ткани в присутствии и отсутствии лигандов.

В наших экспериментах размножение 89.6 и 931/8151 было полностью блокировано в присутствии АМОЗЮО, но не ИАИТЕЗ, Инфекция 89.6 и 93113151 приводила к истощению количества С04* Т-клеток на 80%. При добавлении АМОЗЮО число С04* Т-клеток в 89.6 и 93118151 не отличалось от контроля (рисунок 5).

Следовательно, эти вирусы используют исключительно СХСК4-корецептор и при блокировании доступа к этому корецепгору не способны использовать ССЯ5. Аналогичные результаты мы получили в экспериментах с монотропным Х4 вариантом ЬАУ.04. Это означает, что 89.6 и 93115151 в лимфатической ткани ведут себя как мокотропные Х4 варианты ВИЧ-1.

Размножение 89-v345.PL в ткани в присутствии АМОЗЮО было ингибировано на 50% (рисунок 5). Аналогичные результаты были получены в эксперименте с использованием ЯЛЫТЕЭ: репликация 89-v345.PL в ткани была блокирована на 50%. Инфекция тканей 89-v345.PL приводила к массовой гибели С04*Т-лимфоцитов.

«

II

Я Ь: ад а 2

О I-££

100

Рисунок 5. Пнгибирование размножения Я5Х4, Х4, 115 вариантов ВИЧ-1 в лимфатической ткани в присутствии АМОЗЮО и ЯАМТЕЗ.

ЯАМТЕБ (ЮОнМ) и АМОЗЮО (1мг/мл) были добавлены в культуральную среду за три часа до инфицирования. Размножение LAV.04 и 89.6 полностью ингибировано в присутствии АМОЗЮО. Размножение вирусов 89.6-v345.SF и 5П62 ингибировано в присутствии 11АЖЕ5. ЯАМТЕБ и АМОЗ100 частично ингибировали 89.6-v345.FL.

Добавление литандов не оказывало влияния на количество С04* Т-клеток. Не исключено, что 89-v345.PL использует оба корецептора, поэтому при блокировании доступа к одному из них, эффективно использует другой. Можно было также предположить, что 89-v345.PL использует дополнительный корецептор для инфекции

89.6

89.6-v345.SF

89.6-345.FL

ВЦ 4-1+AMD3100+RANTES ВИЧ-1

6 9 12

Дни после инфекции

Рисунок 6. Смесь AMD3100 и RANTES ингибируют размножение R5X4 вариантов ВИЧ-1. Смесь ингибиторов добавляли за три часа до инфицирования ВИЧ-1. Вирусная репликация R5X4 вирусов 89.6, 89.6-v345.SF 89.6-v345.FL была полностью ингибирована в присутствии AMD3100 (1мг/мл) и RANTES (1нМ).

Для того, чтобы проверить корецепторное использование 89-v345.FL, в ткань добавляли смесь AMD3100 и RANTES и измеряли репликацию вируса. Мы обнаружили, что репликация 89-v345.FL была полностью ингибирована в присутствии смеси лигандое (рисунок 6). Следовательно, R5X4 вариант 89-v345.FL не использует третьего корецептора, а обладает двойным тропизмом, т.е. эффективно использует CXCR4- и ССЯ5-корецепторь для заражения CD4* Т-лимфоцитов.

Размножение вируса 89-v345.SF было ингибировано на 70-90% в присутсгвш RANTES, но не AMD3100 (рисунок 5). Инфекция S9-v345.SF приводила к гибели CD4" Т-клеток на 20-30%. При добавлении RANTES количество CD4" Т-клеток не отличалось от контроля. При заражении ткани монотропным R5 вариантом SF162 в присутствш RANTES, репликация вируса была ингибирована на 70-90%, а число CD4* Т-клеток н< отличалось от контроля. Это означает, что 89-v345.SF использует преимущественно CCR5 корецептор в лимфатической ткани и ведет себя как монотропный R5 ВИЧ-1. Однако

RANTES не полностью блокирует размножение R5 SF162 и R5X4 89-V345.SF, возможно из-за низкой специфичности к CCR5.

Для более полного анализа утилизации R5X4 вариантами ВИЧ-1 корецепторов в лимфатической ткани, мы использовали A32CCR5 ткань. Гомозиготная мутация Д32 в гене CCR5 обуславливает отсутствие CCRS-корецептора на клетке. Ткань инфицировали вирусами 89.6-v345.SF и SF162. Мы измерили вирусную репликацию и число CD4* Т-клеток в контрольной и зараженной ткани.

Оказалось, что размножение вирусов SF162 и 89-v.34S.SF в A32CCR5 ткани было полностью ингибировано (рисунок 7), а число CD4* Т-лимфоцитов не отличалось от контроля (рисунок 8).

Таким образом, R5X4 89.6-v345.SF в лимфатической ткани ведет себя как moho- R5

SF162.

Нормальная ткань <02ССК5пан|>

100 I"

й 03

1«

20 О

Рисунок 7. Вирусное размножение И5Х4 вариантов ВИЧ-1 в нормальной и Д32CCR5 лимфатической ткани. Нормальная и Д32ССЯ5 были инфицированы R5X4, R5, Х4 вариантами ВИЧ-1. Данные представлены как процент от максимального значения р24 в последний день эксперимента (п=7-25) для нормальной ткани. 89^345.БР и ЗП62 не размножались в Д32CCR5 ткани, количество р24 в каждом новом сборе среды было меньше по сравнению с предыдущим. Количество р24 в Д32ССК5 ткани, зараженной 89-у345.БР и ЭР162 представлен как процент от количества р24 на 12й день после заражения, производимого в нормальной ткани, инфицированной этими вирусами.

Дни после хнЬекцкн

i 120

ё «

Рисунок 8. Истощение популяции CD4+ Т-лимфоцитов в A32CCR5 лимфатической ткани.

Количество CD4* Т-лимфоцитов в контрольной и инфицированной 89.6-v345.SF и SF162 лимфатической ткани одинаково. Заражение 89.6, 89.6-v345.FL и LAV.04 привело к массовой гибели CD4* Т-лимфоцитов.

Цитопатический эффект R5 и Х4 ВИЧ-1 субтипов А. С. Е в лимфатической ткани. В зависимости от строения фрагментов генома env и gag, ВИЧ-1 разделен на 10 субтипов A-J (Meyers et al., 1993). В литературе мнения о патогенезе разных субтипов ВИЧ-1 противоречивы, а сведений об эффекте разных субтипов ВИЧ-1 на лимфоциты в лимфатической ткани весьма скудны. Мы ставили перед собой вопрос существует ли корреляция между использованием определенного корецептора и цитопатогенезом ВИЧ-1 разных субтипов в лимфатической ткани человека.

Лимфатическая ткань была заражена R5 и Х4 вариантами субтипов А, С, Е и В Мы установили, что аналогично тому, как это было показано для вариантов субтипа В, все R5 варианты слабо истощают популяцию CD4" Т-клеток. Напротив, все Х4 варианты сильно истощают популяцию CD4* Т-лимфоцитов (рисунок 9).

Мы полагаем, что для вирусов субтипов А, В, С, Е использование определенного корецептора, обуславливает способность ВИЧ-1 истощать популяцию CD4* Т лимфоцитов в лимфатической ткани, зараженной ex vivo. Цитопатическое воздействие ВИЧ-1 определяется экспрессией CXCR4-Kopeuenropa на CD4* Т-клетке.

Согласно нашим данным, появление Х4 вариантов достаточно для быстрого прогрессирования болезни, хотя оно не является необходимым. Полученные нами результаты не исключают возможности того, что цитопатогенные Я5 варианты могут эволюционировать во время прогрессирования болезни. КапИ е1 а1., 1999 показали, что варианты ВИЧ-1 субтипа С редко используют СХСК4-корецептор даже на последней стадии острого иммунного дефицита. У многих пациентов, чья болезнь перешла из хронической в острую фазу иммунодефицита, варианты ВИЧ-1 субтипа В также используют только ССК5-корецептор. Механизм, который бы объяснил развитие цитопатогенности В.5 вариантов ВИЧ-1 не понятен и нуждается в дальнейших исследованиях. По видимому неизвестные факторы иммунной системы вирусоносигеля и характеристики самого вируса играют большую роль в прогрессировании болезни. Можно надеяться, что подход разработанный нами для изучения патогенеза Х4 и Л5 ВИЧ-1 в лимфатической ткани позволит выявить и эти факторы.

та □

5 § юо с » * X

Я 0

О I.

и о ^ г ч- г а у

и 2

я| из

3 2

2 ► ? 0

80 -

40

20 -

гЬ

¿1

1

cyirTv.ii А субтип С субтип Е

1

«¡»931 1нма1 Штм

кит ениом

115 варианты

Х4 варианты

Рисунок 9. Истощение Т-лимфоцитов в ткани, инфицированной

субтипами А, С, Е. Заражение Х4 вариантами субтипов А и Е приводит к сильному истощению популяции СБ4* Т-лимфоцитов. Заражение Я5 вариантами приводит к слабому истощению С04* Т- лимфоцитов.

выводы

1. В инфицированных ex vivo лимфатических тканях человека варианты ВИЧ-1, которы используют для заражения CXCR4-Kopeueirrop (Х4 варианты) истощают популяцш CD4' Т-лимфоцитов на 80-90%. Варианты ВИЧ-1, которые используют CCR: корецептор (R5 варианты) ВИЧ-1 истощают популяцию CD4+ Т- лимфоцитов на 1С 30%.

2. Заражение ВИЧ-1 лимфатической ткани приводит к резкому увеличению апоптоз CD4* Т-лимфоцитов.

3. Инфекция ВИЧ-1 в лимфатической ткани человека ex vivo не влияет на количество функцию CD8* Т-лимфоцитов.

4. R5X4 варианты ВИЧ-1 не всегда используют оба корецептора (CXCR4 и CCR5) лимфатической ткани ex vivo. Использование CXCR4, но не CCR5, R5X4 вариантам ВИЧ-1 приводит к массовой гибели CD4* Т-лимфоцитов.

5. В лимфатической ткани человека заражение Х4, но не R5 изолятами субтипов А, С, ВИЧ-1 приводит к гибели CD4* Т-лимфоцитов.

Использование CXCR4-Kopeuerrropa определяет высокую цитопатогенность ВИЧ-разных субтипов. Результаты работы поддерживают гипотезу, согласно которой поязлен! ВИЧ-1 вариантов, использующих CXCR4-Kopeueirropbi является достаточным факторо для прогрессированйи болезни.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАДИИ.

1. Malkevitch N.V., Grivel J-C. "Apoptosis in HIV-l infected human lymphoid tissue. Abstracts of the International Meeting of the Institute of Human Virology, Baltimore, US/ September, 1999, p. 213.

2. Malkevitch N.V., Grivel J-C., Glushakova S., Collman R, Margolis L.B. "High pathogeneci of mono- and dualtropic HIV-l variants in human lymphoid tissue is associated with the use CXCR4." Abstracts of the 7th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Sa Francisco, USA, December, 1999, p. 231.

3. Malkevitch N.V., Grivei J-C., Margolis L.B. "HIV-1 induces apoptosis in C'D4+ T cells, but not in CD8+ T cells in human lymphoid tissue ex vivo." Abstracts of the Keystone symposia "Novel Biological Approaches to HIV-1 Infection Based on New Insights into HIV Biology", Keystone, USA April, 2000, p. 108.

4. Glusbakova S., Grivei J-C., Malkevitch N., Fitzgerald W„ Collman R., Margolis L. "HIV-1 immunopathogenesis in human lymphoid tissue correlates with co-receptor utilisation." Abstracts of "l" International Conference on Vaccine Development and Immunotherapy in HIV", Palm Beach, USA, June, 2000. Antiviral Therapy, v. 5, sup. 4, p.5.

5. Margolis L., Grivei J-C., Glushakova S., Malkevitch N., Collman R. "Preferential usage of CCR5 or CXCR4 co-receptors by dual-tropic HIV-1 in human lynphoid tissue ex vivo: consequences for cytopathicity." Abstracts of the XIII International AIDS Conference, Durban, South Africa, July, 2000, p. 47.

6. Grivei J-C., Malkevitch N.V., Margolis L.B. "HIV-1 induces apoptosis in CD4+ T cells but not in CD8+ T cells in ex vivo infected human lymphoid tissue." Journal of Virology, v. 74, 17, p. 8077-8084.

7. Malkevitch N.V., McDermont D.H., Yanjie Y, Grivei J-C., Murphy P.M, Glushakova S., Coilman R., Margolis LB. "Coreceptor choice and T cell depletion by

R5-, X4- and R5X4 HIV-1 variants in CCR5 deficient (CCR5A32) and normal human lymphoid tissue." Submitted for publication.

8. Nina Malkevitch, Chad Womack, Punita Pandya, Jean-Charles Grivei, and Anthony Fauci and Leonid Margolis. "HIV-1 non-B subtypes are similar to HIV-1 Subtype B: coreceptor specificity determines cytopathicity in human lymphoid tissue infected ex vivo ." Submitted for publication.

СОКРАЩЕНИЯ ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В РАБОТЕ:

ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека тип 1;

спид - синдром приобретенного иммунодефицита;

gp120 - гликопротеин 120;

РМА - форболмиристат;

TNF-a ■ ■ фактор некроза опухолей;

IFN-y - интерферон гамма;

IL-2 - интерлейхин 2;

ФДК • фолликулярные дендритные клетки.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малькевич, Нина Владиславовна

список: СОКРАЩЕН ИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. Обзор литературы

1.1. История открытия ВИЧ и гипотезы его происхождения

1.2. Глобальная пандемия ВИЧ

1.3. Классификация ВИЧ и распространение субтипов

1.4.Структурная и геномная организация ВИЧ

1.4.1. Структура ВИЧ

1.4.2. Геном ВИЧ

1.5. Сравнительная характеристика ВИЧ-1 и ВИЧ

1.6. Механизмы узнавания и проникновения в клетки -мишени.

1.7. Внутриклеточная трансфомация.

1.8. Способы передачи ВИЧ и клинические признаки болезни

1.8.1. Способы передачи ВИЧ

1.8.2. Клинические признаки болезни

1.8.2.а. Острая фаза инфекции.

1.8.2.6. Прогрессирование болезни

1.9. Цитопатический эффект ВИЧ-1 на клетки и ткани иммунной системы.

1.9.1. Лимфатическая ткань человека - это основное место размножения ВИЧ.

1.9.2. СБ4+ Т-лимфоциты - это клетки-мишени для ВИЧ

1.9.3. Роль СБ8+ Т-лимфоцитов в ВИЧ-1 инфекции

1.9.4. Влияние ВИЧ-1 -инфекции на В-лимфоциты

1.10. Программируемая смерть клетки (апоптоз) - как механизм гибели Т-лимфоцитов при ВИЧ-1-инфекции

1.10.1 Общая характеристика апоптоза и некроза

1.10.2. Роль апоптоза в инфекции ВИЧ

1.10.3. Проблематика изучения патогенеза ВИЧ

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. МАТЕРИАЛЫ.

2.2. МЕТОДЫ

2.2.1. Гистокультура лимфатической ткани человека

2.2.2. ВИЧ-1 и заражение ги сто культур вирусом.

2.2.3. Измерение вирусной репликации методом «ELISA».

2.2.4. Метод проточной цитометрии

2.2.5. Метод подсчета абсолютного числа клеток «TRUCOUNT».

2.2.6. Анализ размножения клеток

2.2.7. Определение апоптоза

2.2.8. Процедура стимуляции CD8+ Т-лимфоцитов.

2.2.9. Определение генотипа A32CCR5 лимфатической ткани.

2.2.10. Использование ингибиторов.

2.2.11. Анализ экспериментальных данных.

Глава 3. Результаты исследования

3.1. Вирус Иммунодефицита Человека вызывает апоптоз в CD4+, но не в CD8+ Т-лимфоцитах в лимфатической ткане инфицированной ex vivo.

3.1.1. Обоснование исследования

3.1.2.Анализ размножения ВИЧ-1 в гистокультурах

3.1.3.Анализ количества CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в тканях, инфицированных SF162 и LAY.

3.1.4.Динамика изменения числа CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в LAV.04-инфициpoвaнныx тканях

3.1.5.Анализ количества B-лимфоцитов в контрольных и

LAV. 04 - инфицированных тканях

3.1.6. Увеличение апоптоза в CD4+ Т-лимфоцитах в тканях, зараженных

ВИЧ-1.

3.1.7. Кинетика увеличения апоптоза в процессе инфекции

3.1.8. Анализ апоптоза в субпопуляциях CXCR4+/CD4+ и CCR5+/CD4+ лимфоцитов

3.1.9. Размножение CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов

3.1.10. Проверка функциональности CD8+ Т-лимфоцитов

3.2. Гибель CD4+ Т-лимфоцитов и использование корецепторов Х4, R5 и R5X4 вариантами ВИЧ

3.2.1. Обоснование исследования

3.2.2. Выявление A32CCR5 гомозиготной ткани

3.2.3. Специфичность корецепторного использования R5X4 вариантов ВИЧ-1 62 3.2.4 Чуствительность R5X4 вариантов ВИЧ-1 к ингибированию CCR5- и

CXCR4- корецепторов специфическими лигандами

3.2.5. Цитопатическое воздействие R5X4 ВИЧ-1 изолятов на CD4+ Т-лимфоциты в A32CCR5 и нормальной лимфатической ткани

3.3. Цитопатический эффект субтипов А, С, Е ВИЧ-1 в лимфатической ткани человека

3.3.1. Обоснование исследования.

3.3.2. Цитопатический эффект на CD4+ Т-лимфоциты Х4 и R5 вариантов

ВИЧ-1 субтипов А, С, Е в лимфатической ткани, инфицированной ex vivo

Глава 4. Обсуледение результатов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль мембранных рецепторов лимфоцитов в патогенезе ВИЧ-1 в лимфатической ткани человека ex vivo"

ВИЧ-инфекция, приводящая к СПИДу, представляет собой актуальную проблему дня большинства стран мира. И несмотря на определенные успехи последних лет в изучении инфекции, диагностики и лечения болезни, вызванной ВИЧ, пандемия ВИЧ продолжает распространяться по планете. В некоторых развивающихся странах уже в настоящее время СПИД стал основной причиной смерти взрослого населения до 30 лет. Подсчитано, что каждые 13 минут в мире происходит новое заражение ВИЧ, а каждые 9 минут происходит смерть, вызванная ВИЧ инфекцией.

Проблеме ВИЧ-инфекции во всем мире уделяется огромное внимание. Одно из наиболее важных достижений в науке за последние 5 лет в области лечения ВИЧ-инфекции - это создание комплексной высокоактивной антиретровирусной химиотерапии, которая продлевает жизнь ВИЧ больного на длительный срок. И тем не менее, фундаментальные проблемы ВИЧ-инфекции все еще остаются нерешенными. В первую очередь это относится к вопросам патогенеза в лимфатической ткани человека, где развиваются главные процессы, определяющие ход болезни. Понимание этих процессов -одна из актуальных задач фундаментальной биологии и медицины.

Известно, что ВИЧ-1 отличает исключительно высокая генетическая изменчивость (Coffin et al., 1995). В зараженном организме происходит постепенная закономерная эволюция вируса. Это приводит к тому, что вирусы выделяемые на последних стадиях болезни отличаются от тех, которые доминировали в ее начале. Однако, не известно существует ли причинно-следственная связь между эволюцией вируса в организме больного и прогрессированием болезни.

В нашем исследовании мы ставили перед собой цель - изучить механизм патогенеза в лимфатической ткани человека, зараженной вариантами ВИЧ-1, выделяемых на ранних и поздних стадиях болезни. Эта цель актуальна как для понимания фундаментальных биохимических и вирусологических проблем ВИЧ-1 инфекции, так и для практической разработки антивирусных препаратов и создания анти-ВИЧ вакцин.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Малькевич, Нина Владиславовна

Глава 6. ВЫВОДЫ

1. В инфицированных ex vivo лимфатических тканях человека варианты ВИЧ-1, которые используют для заражения СХСК4-корецептор (Х4 варианты), истощают популяцию CD4+ Т-лимфоцитов на 80-90%. Варианты ВИЧ-1, которые используют CCR5-корецептор (R5 варианты), истощают популяцию CD4+ Т- лимфоцитов на 10-30%.

2. Заражение ВИЧ-1 лимфатической ткани приводит к резкому увеличению апоптоза CD4+ Т-лимфоцитов.

3. Инфекция ВИЧ-1 в лимфатической ткани человека ex vivo не влияет на количество и функцию CD8+ Т-лимфоцитов.

4. R5X4 варианты ВИЧ-1 не всегда используют оба корецептора (CXCR4 и CCR5) в лимфатической ткани ex vivo. Использование CXCR4, но не CCR5, R5X4 вариантами ВИЧ-1 приводит к массовой гибели CD4+ Т-лимфоцитов.

5. В лимфатической ткани человека заражение Х4, но не Ы5 изолятами субтипов А, С, Е ВИЧ-1, приводит к гибели СБ4+ Т-лимфоцитов.

Использование СХСЯ4-корецептора определяет высокую цитопатогенность ВИЧ-1 разных субтипов. Результаты работы поддерживают гипотезу, согласно которой появление ВИЧ-1 вариантов, использующих СХС114-корецепторы, является достаточным фактором для прогрессировании болезни.

Глава 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Продемонстрировано, что цитопатический эффект ВИЧ-1 в лимфатической ткани, инфицированной ex vivo, определяется использованием СХС114-корецептора исключительно или комбинацией CXCR4 и CCR5-корецептора в CD4+ Т-лимфоцитах. Впервые показано, что использование Х4 и R5X4 вариантами ВИЧ-1 CXCR4-корецептора, но не CCR5 ведет к массовой гибели CD4+ Т-лимфоцитов.

Впервые на лимфатической ткани проведено сравнительное исследование цитопатического воздействия ВИЧ-1 субтипов А, С, Е и субтипа В. Установлено, что использование CXCR4-Kope4ептора является главным фактором в патогенезе ВИЧ-1 субтипов А, С, Е.

Показано, что варианты ВИЧ-1, обладающие двойным тропизмом (R5X4), т. е. те, которые в трансформированных клетках используют оба корецептора (CXCR4 и CCR5), в лимфатической ткани могут использовать только один из двух корецептров. Использование CXCR4-KopeuenTopa, но не CCR5 ведет к массовой гибели CD4+ Т-лимфоцитов.

Впервые на лимфатической ткани, инфицированной ex vivo R5 и Х4 ВИЧ-1, установлено, что вирусное размножение влияет на количество CD4+ Т-клеток, но не влияет ни на количество CD8+ Т-лимфоцитов, ни на их способность синтезировать цитокины в ответ на экзогенную стимуляцию.

Обнаружено значительное увеличение апоптоза в субпопуляциях CD4+ Т- лимфоцитов в тканях зараженных Х4 и R5 ВИЧ-1.

На основании экспериментов с лимфатической тканью ex vivo, мы предполагаем, что использование СХСК4-корецептора является основным фактором, определяющим цитопатическое воздействие ВИЧ-1. Появление у пациентов Х4 вариантов ВИЧ-1 способствует прогрессированию болезни. Высказано предположение, согласно которому, иммуностимуляция в сочетании с вирусным размножением является главным фактором, индуцирующим смерть CD8+ Т-лимфоцитов при ВИЧ-1-инфекции у человека.

Полученные данные значительно расширяют знания о молекулярном механизме патогенеза ВИЧ-1, выделяемого на ранней и поздней стадиях болезни, в отношении лимфоцитов в лимфатической ткани. Наши результаты вносят вклад в решение фундаментальной проблемы - выяснение механизма гибели CD4+ Т-клеток при инфекции ВИЧ-1. Проведенные впервые исследования цитопатического эффекта ВИЧ-1 субтипов А, С, Е могут служить основой для разработки лекарственных препаратов, направленных на лечение инфекции ВИЧ-1 в развивающихся странах, где наиболее высокое количество ВИЧ-инфицированных людей, и где распространены вирусы этих субтипов. Полученные результаты могут быть использованы при изучении патогенеза штаммов ВИЧ-1, устойчивых к лекарственным препаратам, а также будут способствовать более глубокому пониманию механизма патогенеза R5 вариантов ВИЧ-1, выделяемых на поздних стадиях болезни.

Лимфатическая ткань является перспективной моделью для тестированиия эффективности новых анти-ВИЧ-1 лекарств. Наши исследования могут применяться при разработки анти-ВИЧ-1 вакцин и проверки восстановления клеточного и гуморального иммунного ответа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малькевич, Нина Владиславовна, Москва

1. Змушко Е.И. и Белозеров Е.С. (2000) ВИЧ-инфекция. Санкт-Петербург, "Питер".

2. Новожилова А.П., Плужников Н.Н., Новиков B.C. (под. ред. B.C. Новикова), Москва, "Наука".

3. Покровский В.В. (1999) Эпидемиология и профилактика ВИЧ-инфекции и СПИД. т. 56, Москва, "Медицина".

4. Самуилов В.Д., Олескин А.В., Лагунова Е.М. (2000) Программируемая клеточная смерть. Биохимия, 65, 8, 1029-1046.

5. Скулачев В. П. (1996) В своем межмембранном пространстве митохондрия таит белок самоубийства, который, выйдя в цитозоль, вызывает апоптоз. Биохимия, 61, 11, 29602063.

6. Хаитов З.М., Игнатьева Г. А., Сидорович И.Г. (2000) Иммунология. Москва, "Медицина".

7. Шкарин В В., Соринсон С.Н. (1999) ВИЧ/СПИД-инфекция. Москва, "НГМА".

8. Albert J., Fenyo Е.М. (1990) Simple, sensitive and specific detection of HIV-1 in clinical specimens by PCR with nested primers. J. Clin. Microbiol. 28, 1560-1564.

9. Alkhatib G., Broder C.C., Feng Y., Kennedy P.E., Murhy P.M., Berger E.A. (1996) CC CRK5: a RANTES, МПМа, MlP-lb, receptor as a fusin cofactor for M-tropic HIV-l. Science 272, 19551958.

10. Ammann A., and Levy J.A.(1986) Laboratory investigation of pediatric AIDS. Clin. Immunol. Immunopathol. 40, 122-127.

11. Ameisen J.C., and Capron A. (1991) Cell dysfunction and depletion in AIDS: The programmed cell death hypothesis. Immunol. Today 12, 102-105.

12. Badley A.D., Dockrell D., Paya С. V. (1997) Apoptosis in AIDS. Adv. In Pharmacology 41, 271294.

13. Backer E., Bossart K.N., Levy J.A. (1997) CD28-costimulation increases the ability of CD8+ cells to supress HIV reolication. J. Immunol 7, 476-480.

14. Barre-Sinoussi F.,. Cherman J-C, Rey F., Nugeyre M.T., Rozenbaum W., and Montagnier L. (1983) Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 220, 868-871.

15. Berke G. (1991) Lymphocyte triggered internal target disintegration. Immunol. Today 12, 396403.

16. Bruno S., and Darzynkiewicz Z. (1992) Cell cycle dependent expression and stability of the nuclear protein detected by Ki-67 antibody in HL-60 cells. Cell. Prolif. 25, 31-40.

17. Bukrinsky M.I. and Haffar O.K. (1998) HTV-nuclear import: matrix protein is back on stage, this time together with Vpr. Mol. Med. 4, 138-143.

18. Casella C.R., and. Finkel T.H (1997) Mechanisms of lymphocyte killing by HIV. Curr. Opin. Hematol. 4, 24-31.

19. ChenZ. W., ShenKA., Reimann L.O., Letvin N.L. (1993) Conserved T-cell receptor repertoire in SIV-infected rhesus makaque. J. Immunol. 151, 2177-2187.

20. Choe H., Farzan M., Konkel M., Martin K, Sun Y., Marcon L., Berman A., Dorf E., Sodroski J. (1998) The orphan seven-transmembrane receptor apj supports the entry of primary T-cell-line-tropicand dualtropicHIV-1. J. Virol. 72, 6113-6118.

21. Clavel F., Guetard D., Chamaret S., Rey M-A., Laurent A.G., Katlama C., Klatzman D.E., and Montagnier L. (1986) Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science, 233, 343-346.

22. Clerici M., and Shearer G.M. (1993) A TH1 to TH2 switch is a critical step in the ethiology of HTV infection. Immunol. Today 14, 107-111.

23. Clerici M., and Shearer G.M (1994) The TH1-Th2 hypothesis of HTV infection: new insights. Immunol. Today 15, 575-581.

24. CocchiF., DeVico A.L., Garzino-Demo A., Arya A., Gallo R. C., Lusso P. (1995) Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-supressive factors produced by CD8 and T Cells. Science 270, 1811-1815.

25. Coffin J. M., Haase.A.W., Levy J. A., Montagnier L., OroszlanS., TeichN., TeminH., Toyoshima K., Varmus K., Vogt D. and Weiss R. (1986) Human immune deficiency virus. Science, 232, 697-700.

26. Cohen O.J., Pantaleo D.J., Fauci A S. (1995) Pathogenic insights from studies of lymphoid tissue from HIV-infected individuals. J AIDS Hum. Retrovirol. 10, 6-14.

27. Coffin J.M. (1995) HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis and therapy. Science 267, 483-489.

28. Coffin, J. A., Oroszlan S., Teich N. (1995). HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy. Science 267, 483-489.

29. Crise, B. andRose J.K. (1992) HIV -1 glycoprotein precursor retains a CD4-P50ICK comlpeke in the endoplasmic reticulum. Journal ol'Virology 66, 2296-2301.

30. Crise, B., L. Bounocore and Rose J.K. (1990) CD4 is retained in the endoplasmis reticulum be HIV-1 glycoprotein precursor. J. Virol. 64, 5585-5593.

31. Dalgeish A.G., Cohen O., Ross M (1984) The CD4 (T4) antigen is an essential component of receptor for AIDS retrovirus. Nature 312,763-767

32. Dean M., Carrington., Winkler C., and S. J. O'Brien. (1996) Genetic restriction of HTV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allel of the CCR5 structural gene. Science 273, 1856-1862.

33. Deiss L.P., Galinka H., Cohen O. (1 996) Cathepsin D protease mediates programmed cell death induced by interferon-gamma, Fas A/O and TNF-alpha. EMBO J. 15, 3861-3870.

34. Desrosiers R.C. (1990) Activation-induced cell death in lymphocytes isolated from SIV-infected macaques. Annu. Rev. Immunol. 8, 7-578.

35. De Wolf, C. Kuiren, M. Bakker, M. Moss, R Caitinho, F. Miedema, Goudsmit J. (1997) AIDS prognosis based on HIV RNA, CD4-1 Cell count and function: marrers for recpricol predictive value over time after seroconversion AIDS 2, 1798-1806.

36. Donzella G.A., Lin S., EsteW.S., IVk.ddon P., HensonT.P., De ClerqG., Moore J.P.(1998) AMD3100, a small molecule lmhibitor of HIV-1 entry via the CXCR4 co-receptor. Nature Medicine 4, 72-77.

37. Embretson J., zupanic M, Ribas I. '.urke A., Racz P., Haase A.T. (1993) Massive covert infection of helper T-lymphocyte and macrophages by HIV during the incubation perioud of AIDS. Nature 362, 359-362.

38. Fauci, A.S. (1993) Multifactorial nao.re of HIV disease: implications for therapy. Science 262, 1011-1018.

39. Fauci A.S. (1996) Immunopathogc; e ;:iechanisms of HIV infection. Ann Intern. Med. 124, 654-663.

40. Fauci A.S. (1996) Host factors and itie pathogenesis of HIV-induced disease. Nature 384, 529534.

41. Feinberg MB., JarrettRF., Aldovmi A., Gallo R.C., Wong-StaalF. (1986) HTLV-III expression and production involve complex rey ulation at the levels of splicing and translation of viral RNA. Cell 46, 807-817.

42. Fenyo E.M., Fiore J.R, Karlsson A : Albert J., Scarlatti G. (1994) Biological phenotypes of HIV-1 in pathogenesis and transmission J Virol. 62,4414-4419.

43. Feng, Y., Broder C.C., Kennedy P li., Berger E. A. (1996) HIV-1 entry cofactor: funcional cDNA cloning of a seven-transmen .brane, G-protein-coupled receptor. Science, 272: 872-877.

44. FinkellT.H., Banda N.K., Cotton MF, Curiel P.P., Kupfer A. (1995) Apoptosis occurs predominantly in bystander cells and not in productively infected cells of HIV- SIV- infected lymph nodes. Nat. Med. 1, 129-134

45. Gaines H., M Von Sydov, P.O. Pehrson, Lundbergh P. (1988). Clinical picture of primary HIV infection presenting as a glandular-i ever-live illness. Br. Med. J. 297, 1363-1368.

46. Gallay P., Hope T., Chin D., Trono ;). (1997) HIV-1 infection of non-dividing cells through recognition of integrase by the in:; .inkaryopherin pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9825-9830.

47. Gallo R.C., Sarin P.S., Gelmann E : , Robert-GuroffM., Richardson E., Mann D., Sidhu G.D., Zolla-Pazner S., and Popovic M. (1 v83) Isolation if human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 220, 865-867.

48. Gallo R.C. (1984). Frequent defec; ion and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS at risk for AIDS Science 224, 500-503

49. Gelderblom H.R., Ozel M., Pauli G f1989) Morphogenesis and morphology of HTV. Structure-Function relation. Micron. Microscop 19, 41-60.

50. Gao F.L., White A.T., Pappas P.G Hanson A P., Greene B.M., Sharp G.M., HahnB.H. (1992) Human infection by genetically dive, se SIV sm related HIV-2 in West Africa. Nature 358, 495499.

51. Gao F.L., Hanson A.P., Sharp G.N. Robertson M.M., Hahn B.H. (1994) Genetic diversity of HTV-2: evidence for distinct sequence subtypes with differences in virus biology. J.Virol. 86,7433.7447.

52. Glushakova S.E., J-C. Grivel, MeylanP., J.D. Lifson, R. Desrosiers, Margolis L. (1999) Nef enhances HIY-1 replication and responsivness to IL-2 in human lymphoid tissue ex vivo. J. Virol. 73, 3968-3974.

53. Glushakova S.E., J-C. Grivel, W. Fitzherald, A. Sylwester, J. Zimmerberg and Margolis L. (1998) Evidence for HIV phenotype switch as a causal factor in AIDS. Nature Medicine 4, 346-349.

54. Grivel J-C., and Margolis L.B. (1999) CCR5- and CXCR4-tropic HIV-1 are equally cytopathic for their T-cell targets in human lymphoid tissue. Nature Medicine 5, 344-346.

55. Goldberg B., andStricker RB. (1999) Apoptosis and HIV infection: T-cells fiddle while the immune systems burns. Immunol. Letters, 70, 5-8.

56. GuyaderM., EmermanP., Sonigo P., ClavelF., AlozonM. (1987) Genome organisation and transactivation of HTV-2. Nature 326, 662-669.

57. Hardwick J.M (1997) Virus-induced apoptosis. Adv. Pharmcol. 41, 295-336.

58. Herbein G., Batliwalla F., Gregersen G., Pappas P., J. Butler, Verdin E. (1998) Apoptosis of CD8+ T cells is mediated by macrophages through interaction of HIV gp 120 with chemokine receptor CXCR4. Nature 395, 189-194.

59. Hoxie J.A., Alpers A.D., Haggarty B.S., Reed J.C. (1986) Alterations in T4 (CD4) protein and mRNA synthesis in cells infected with HIV. Science 234, 1123-1127.

60. Hsia K., andSpector S.A. (1991) HIV DNA is present in a high percentage of CD4+ T-lymhocytes of seropositive individuals. J. Infect. Dis. 164, 470-475.

61. Huang Y., W.A. Paxton, Wolinsky S.M., L. Zhang and Komp RA. (1996) The role of mutant CCR5 allell in HIV-1 transmission and disease progression. Nat. Med. 2, 1240-1243.

62. Karlsson A., Parsmyr R., E. Sandstrom, E.M. Renyo, Albert J. (1994) MT-2 Cell tropism as prognostic marker for disease progression in HIV-1 infection. J. Clinical Microbiology 32, 364370.

63. Klatzman, D.E. (1984) T-lymphocyte T4 molecule behaves as the receptor for human retrovirae IAV. Nature 312: 767-768.

64. Klatzmann, D. (1984) Selective tropism of lymphadenopathy-associated virus (LAV) for helper-induced T-lymphocytes. Science 225: 59-62.

65. Koester S.K., Roth P., Mikulka W.R, Schlossman S.F., zhang C., Bolton W.E. (1997) Monitoring early cellular responses in apoptosis is aided by th mitochondrial membrane protein-specific monoclonal antobody AP02.7. Cytometry 29, 306-312.

66. Rundu C.H., and Merigan T.C. (1992) Equivalent recognition of HIV proteins, env, gag and RT by CD4+ and CD8+ cytotoxic T lymphocytes. AIDS 6, 643-649.

67. Nabel G., and D. Baltimore (1987) An inducible transcription factor activates expression of HIV in T Cells. Nature 32: 711-713.

68. Madolon, P.J. (1986) The T4 gene encodes the AIDS virus receptor and is expressed in the immune system and brain. Cell 47, 333-348.

69. Mariani R., and Skowronsky J. (1993) CD4 downregulation by nef allels isolated from HIV-1 infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5549-5553.

70. Margolick, J.B. (1995) Failure of T Cell homeostasis preceding AIDS in HIV-1 infection. The multicenter AIDS cohort study. Nat. Med. 1, 674-680.

71. Mar link R., P. Ranki, I. Thior, K. Travers, G. Eisen, T. Siby, I. Traore, J. Kellinger, Essex M. (1994) Reduce rate of disease development after HTV-2 infection as compared to HIV-1. Science 265, 1687-1590.

72. Mastro T.D., and KitayapornD.( 1998) HIV- type 1 transmission probabilities: estimates from epidemiological studies. AIDS research human retroviruses. Suppl. 3,5223-5227.

73. Mazlink R (1996) Lessons from the second AIDS virus, HIV-2. AIDS, 10, 689-699.

74. Meyard L., Otto S.A., Miedema F. (1994) Programmed cell death of T cells in HIV-infection. J.Clin. Invest. 93, 982-988.

75. Mellors J.W., Rinaldo C.R.J., Gupta P., White R.M., Todd J.A., Kingsley L.A. (1996) Diagnosis of HIV-1 infection predicted by the quantity of virus in plasma. Science 271, 1167-1170.

76. Michael N.L. G. Chang, L.G. Louie, J.R. Mascola, D. Dondero, SheppardH.W. (1997) The role of vital phono type and CCR5 gene defects in HIV-1 transmission and disease progression. Nat. Med. 3, 338-340.

77. Molina, J.M (1990) Lack of evidence for infection of or effect on growth of hematopoetic progenitor cells after invivo or invitro exposure to HIV. Blood, 76, 2476-2482.

78. Mohri H., Monard S., Perelson A., Ho D. (1998) Rapid turnover of T lymphocytes in SIV-infected rhesus macaques. Science 279, 1223-1227.

79. Moore J.P., Weiss R.A., Sattentau Q.J. (1990) Dissociation of gp 120 from HIV-1 virions induced by soluble CD4. Science 250, 1139-1142.

80. Myers TG. (1993) Assimilating HIV sequences. AIDS Res. Hum Retroviruses 9, 697-702.

81. Myers TG. (1994) HIV: between past and future. AIDS Res. Hum Retroviruses 10, 1317-1324.

82. Nahmias A. J., Weiss J., Yao X., Lee F., KodsiR., Matthews D., Durack D., Motulsky A. (1986) Evidence for human infection with an HTLV III/LAV-like virus in Central Africa. 1959. Lancet 1, 1279-1280.

83. O'Brien T.R, G. Winkler, M Dean, J.A. E. Nelson, M. Carrington, N.L. Michael, G.C. White II. (1997) HIV-1 infection in a man hmozygous for A32 CCR5. Lancet 349: 1219.

84. Ou S.H.I and Gaynor RB. (1995) Intracellular factors involved in gene expression of human retroviruses., p. 97, 187. In J.A Levy (ed.), The Retroviridae, vol., 4, Plenum Press, New York.

85. Pantaleo G., and Fauci A. S. (1995) Apoptosis in fflV-infection. Nature Medicine 1 (2), 118-119.

86. Pantaleo G., Graziozi C., Fauci A.S. (1993) Mechanisms of disease: the immunopathogenesis of fflV-infection. N Engl. J. Med. 328, 327-336.

87. Pantaleo G., Demarest J.F., ButiniL., Montroni L., Fox C.H., Orenstein J.M., Kotler D.P.,. Fauci A.S. (1993) HIV-infectection is active and progressive in lymphoid tissue during the clinically latent stage of disease. Nature 362, 355-358.

88. Papa S. and Skulachev V.P. (1997) Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging. Molecolar and Cellular Biochemistry 174, 305-319.

89. Patterson B.K., M. Till, P. Otto, Furtado M.R, McBnde L.J., Wolinsky S.M. (1993) Detection of HIV-1 DNA and messenger RNA in individual cells by PcR-driven in sity hibridization and flow cytometry. Science 260, 976-979.

90. PeterlinB.M. (1995) Molecular Biology of HIV, p. 185-238. In J.A. Levy (ed.), The Retrovidae, vol. 4, Plenum Press, New York.

91. Plata F. (1989) HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. Res. Immuno. 140, 89-91.

92. PomerantzRJ., D. Trom, M.B. Feinberg, andBaltimore D. (1990) Cell non-productively infected with H3V-1 exhibit and aberrant pattern of viral RNA expression: a molecular model for latevey. Cell 61, 1271-1276.

93. Poulin L., Evans S., Tang S., Barboza A., Legg H., Littman D., Levy J.A. (1991) Several CD4 domains can play a role in HIV infection of cells. J. Virol. 65, 4893-3901.

94. Rollins B.J. (1997) Chemokines. Blood. 90, 909-928.

95. Rosok B.I., Brincmann J.E., Stent G., Voltersvik J., Olofsson J., Asjo B. (1998) Correlates of apoptosis of CD4+ and CD8+ T cells in tonsillar tissue in HIV-1 infection. AIDS 14, 1635-1643.

96. Sachsenberg N.A., Perelson A.S., Yerly S., Leduc D., L. Perlin (1998) Turnover of CD4+ and CD8+ T lymphocytes in HIV-infection as measured by Ki-67 antigen. J. Exp. Med. 187, 12951303.

97. Schultz T.F., Jameson B.A., Lopalco L., Weiss R.A., Moore J.P. (1992) Conserved structural features in the interaction between retroviral surface and transmembrane glycoproteins. AIDS Res. Hum. Retro. 8, 1571-1580.

98. Silvestries F., Cafforio O., Tucci M., Nagata S. (1996) Overexpression of Fas antigen on T cells on advanced HIV-infection. AIDS 10, 313-141.

99. Simmonds P., Peutherer J.F., Ludlam C. A., Balfe P., Liegh Brown (1990) HIV-1 infected individuals contain provirus in small numbers of PBMC and at low copy numbers. J Virol. 64, 864-872.

100. Simon E.P., Roques P., Saragosti S., Barre-Sinoussi F., Brun-Vezinet F. (1998) Identification of a new human immunodefeciency virus type 1 distinct from group M and O. Nature Medicine 4, 1032-1037.

101. Skulachev V.P. (1999) Mitochondrial physiology and pathology; conceps of programmed death of organelles, cells and organisms. Molecular. Aspects of Medicine 20, 139-184.

102. Skulachev V.P. (2000) The dual role of oxygen in aerobick cells. Bioscience 1, 173-193.

103. Shahabuddin M.B., Volsky B., Hsu m.C., Volsky D.J. (1992) Restaration of cell surface CD4 expression in HIV-1 infected cells by treatment with Tat antagonist. J. Virol. 66, 6802-6805.

104. Sodrosky J.G., Goh W.C., Rosen C„ Dayton A, Haseltine W.A. (1986) A second posttranscriptional transactivator gene required for HTLV-III replication. Nature 321, 412-417.

105. Stanley S.K., Kessler S.W., Greenhouse J.J., Brown C.C., Musey K., Kapita B., Fauci A.S. (1992) CD34 bone marrow cells are infected with HIV in a subset of seropositive individuals. J. Immunol.149, 689-697.

106. Susin S.A., Lorenzo H., Zamzami H.K., Marzo N., Brenner C., Kroemer G. (1999) Mitochondrial relaese of caspase-2 and -9 during the apoptotic process. J. Exp. Med. 189, 381-393.

107. Sylwester A.W., J-C. Grivel, W. Fitzgerald, J.L. Rossio, J.D. Lifson, Margolis L B. (1998) CD4+ T-lymphocyte depletion in human lymphoid tissue ex vivo is not induced by noninfectious HIV-1 virions. J.Virol. 72, 9345-9347.

108. Steinberg, M.N. (1991) Invitro suppression of normal human bone marrow progenitor cells by HIV. Journal of Virology 65: 1765-1769.

109. Terai C., Pauza C.D., Carson D.A. (1991) Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T lymphoblasts acutely infected with HIV-1. J. Clin. Invest. 87, 1710-1715.

110. Tilley L.G., Racho M., Pinter A. (1992) Synergetic neutralization of HIV by human monoclonal antibodies against V3 loop and CD4 binding. AIDS 56, 889-910.

111. Tersmette M., A1 B.J., Winkel A., Graters H., Huisman M., Miedema F. (1988) Differential syncytium-inducing capacity of HIV-1 isolates: frequent detection of syncytium-inducing isolates in patients with AIDS. J. Virol. 62, 2026-2032.

112. Theodorou I., L. Meyer, C. Kotlama, Rouzioux C. (1997) HIV-1 infection in an indidual homozyglous for CCR5A32. Lancet 349, 1219-1220.

113. TristemM., Marshall M., Karpas A., Hill F. (1992) Evolution of primate lentiviruses: evidence from vpx to vpu. EMBO J.ll, 3405-3412.

114. Walker, B.D. (1998) Immune control of HIV-1 replication. Adv. Exp. Med. Biol. 452, 169-167.

115. Wain-Hobson S. (1993) The fastes evolution ever described: HIV variation in situ. Curr. Opm. Genet. Dev. 3, 162-168.

116. Weistermann, J., Pabst, R. (1990) Lymphocyte subsets in the blood: a dignostic window on the lymphoid system. Immunology Today 11: 406-410.

117. Wolhers K.C., Y. Schuitemaker, Miedema F. (1998) Rapid CD4+ cell turnover in HIV ibfection: a paradigm revisited. Immunol. Today 19, 44-48.

118. Woods, T.C., B.D., Roberts, Butera S. T., Folks T.M (1997) Loss of inducible virus in CD45PA naive cells after HIV-1 entry accounts for preferential viral replication in CD45PO memory cells. Blood 89, 1635-1641.

119. Whittle H., Morris J., Todd T., Corrah S., Sabally D., Rolfe W., Wilkins A. (1994) HIV-2 infected patients survive longer than HIV-1-infected patients. AIDS 8, 1617-1620.

120. Zauli, G.M., Gibellini D., Milani D., Mazzom M., Borgatti P., La Placa M., Capitani S. (1992) Inhibitory effec of INV-1 envelope gp/20 u gp/60 on the vitro growth of enriched (CD34+) hematopoetic progenitor cells. Arch. Virology 122, 271-280.

121. Zhang Z.Q., Zupanick M., Rogan M., Miller J., Wong J., Little S., Letvin N.L., Jordan H.L., Haase A T. (1999) Sexual transmission and propagation of SIV and HIV in resting and activated CD4 and T Cells. Science 286 (12), 1353-1357.

122. ValentinH, Nugeyre M.T., Vuillier F., BoumsellL., M A.Schmid (1994) Two subpopulations of human triple negative thymic cells are susceptible to infection by HIV-1 in vitro. Journal of Virology, 8: 3041-3050.

123. Viscidi R.D., Lederman H.M., Frankel A.D. (1989) Inhibition of antigen-induced lymphocyte proliferation by fat protein from HTV-1. Science 246: 1606-1608.

124. UN AIDS/WHO (1999) AIDS epidemic update: December 1999. www.address: http:// www. unaids. org/.