Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимический анализ структурно-функциональной гомологии аполипопротеина А-1 человека и поверхностных белков вируса иммунодефицита человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимический анализ структурно-функциональной гомологии аполипопротеина А-1 человека и поверхностных белков вируса иммунодефицита человека"

На правах рукописи

Костина Нина Егоровна

ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ гомологии АПОЛИПОПРОТЕИНА A-I ЧЕЛОВЕКА И ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2003

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биохимии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель: академик РАМН

доктор медицинских наук, профессор Л.Е.Панин

Научный консультант:

доктор медицинских наук Л.М. Поляков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.Н. Загребельный кандидат медицинских наук B.C. Караваев

Ведущая организация:

Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Защита состоится "_ "_ 2003года в 10 часов на заседании

Диссертационного Совета Д 001.37.01 в НИИ биохимии СО РАМН по адресу: 630017, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биохимии

СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан " 2003 г

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

-—f .С. Русских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основная функция липопротеинов крови связана с транспортом липидов от мест их синтеза (печень, кишечник) в другие органы и ткани, где липиды используются как энергетические субстраты и как материал для синтеза биологических мембран. Однако роль белкового компонента липопротеинов различного класса более многообразна. Аполипопротены выполняют в организме важнейшую регуляторную функцию. Так, аполипопротеин A-I (апоА-1) повышает активность J1XAT [Sparrow I., Gotto А., 1982], аполипопротеин С-П активирует липопротеиновую липазу. [Kinnunen P. et al., 1983; Connelly P. et al., 1987]. В последние годы было показано, что апоА-1 в комплексе с восстановленной формой стероидных гормонов принимает участие в регуляции экспрессии многих генов [Панин JI.E. и др., 19952002]. Взаимодействие комплекса с ДНК осуществляется в области повторов типа (GCC)n [Панин JI.E. и др. 2001, 2002]. В дальнейшем было показано, что этот комплекс играет важную роль в регуляции синтеза ДНК и белка в клетках лимфоидной ткани [Панин JI.E., Клейменова Е.Ю., 2002]. Более того, он имеет отношение к синтезу иммуноглобулинов.

Важным шагом в развитии этих исследований было установление высокой степени гомологии между апоА-1 и поверхностными белками ВИЧ-1 (envi) [Lukashev V.A. et al., 2000]. Благодаря исследователям из университета шт. Алабама (г. Бирмингем) стали известны антивирусные свойства синтетических пептидных аналогов апоА-1. Это касается вируса Herpes и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [Srinivas R.V. et al. 1990]. В то же время Оуенс с соавторами показали, что апоА-1 и его синтетические аналоги, представляющие собой амфипатные а-спиральные пептиды, эффективно ингибируют репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток и препятствуют образованию клеточного синцития [Owens B.J. et al. 1990]. Мартин с соавторами

fOС НАЩЮНЛЛWH4*

енмютод

1 CJhifr f > • л/

обнаружили, что ano A-I взаимодействует с трансмембранным белком ВИЧ-1 гликопротеином gp41 [Martin I. et al. 1992]. В работе американских исследователей из техасского университета сообщалось о том, что апоА-1, находясь в кровяном русле в составе ,ЛПВП, обладает широким спектром антивирусной активности [Singh I.P. et al., 1999].

Все это дало основание предположить, что между апоА-1 человека и оболочечными белками ВИЧ-1/2 существует структурно-функциональное соответствие, играющее важную роль в патогенезе ВИЧ-инфекции. Исследование механизма противовирусной активности апоА-1 человека по отношению к ВИЧ может оказаться перспективным при создании вакцин и эффективных профилактических средств.

Целью работы являлось исследовать структурно-функциональную гомологию между аполипопротеином A-I человека и оболочечными белками ВИЧ-1/2 и оценить ее вклад в развитие иммунодефицита.

Задачи исследования:

1. Исследовать иммунохимическое сродство между апоА-1 человека и поверхностными белками ВИЧ-1 /2. >

2. Изучить функциональную и структурную гомологию между рецептором CD4, апоА-1 человека и поверхностными белками ВИЧ-1/2.

3. Провести сравнительный анализ взаимодействия апоА-1 и поверхностных белков ВИЧ-1 с рецептором CD4 на поверхности Т-лимфоцитов человека.

4. Исследовать влияние апоА-1 человека и поверхностных белков ВИЧ-1 на скорость биосинтеза белка и ДНК Т-лимфоцитами человека.

5. Изучить влияние апоА-1 человека и поверхностных белков ВИЧ-1 на продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами человека.

,г» -, • 2

«г ,

Научная новизна работы. Впервые исследовано иммунохимическое сродство между апоА-1 человека и поверхностными белками ВИЧ-1/2. Показано перекрестное иммунохимическое взаимодействие антител к апоА-1 с оболочечными белками ВИЧ-1/2 и апоА-1 с антителами к ВИЧ-1/2.

Впервые исследовано взаимодействие апоА-1 человека с рецептором СБ4. Показано взаимодействие апоА-1 человека с рекомбинантным рецептором СБ4 и с рецептором С04 на поверхности Т-лимфоцитов человека.

Впервые исследовано влияние апоА-1 человека и поверхностных белков ВИЧ-1 на биосинтез белка и ДНК Т-лимфоцитами человека. Показано их взаимное влияние на этот процесс, основанное на конкурентных взаимоотношениях между апоА-1 человека й поверхностными белками ВИЧ-1.

Впервые показано влияние апоА-1 человека и поверхностных белков ВИЧ-1 на продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами человека.

Теоретическая и практическая значимость работы. В

результате проведенных исследований был описан новый механизм снижения продукции иммуноглобулинов с последующим развитием иммунодефицита у ВИЧ-инфицированных пациентов, основанный на конкурентных взаимоотношениях между апоА-1 человека и поверхностными белками ВИЧ-1. Конкурентные взаимоотношения играют также важную роль в подавлении функции апоА-1, связанной с регуляцией биосинтеза белка.

Положения, выносимые на защиту:

1. Аполипопротеин А-1 человека и поверхностные белки ВИЧ-1 имеют общие антигенные детерминанты.

2. Иммунохимическое и структурное сходство между апоА-1 человека, поверхностными белками ВИЧ-1 и рецептором СБ4

Т-лимфоцитов приводит к конкурентным взаимоотношениям между апоА-1 человека и поверхностными белками ВИЧ-1. .

3. Аполипопротеин А-1 блокирует цитопатическс|е действие поверхностных белков ВИЧ-1 на скорость биосинтеза ДНК.и белка Т-лимфоцитами. - ■

4. Конкурентные взаимоотношения между апоА-1 человека и оболочечными белками ВИЧ-1 способствуют снижению продукции антител B-лимфоцитами человека и развитию иммунодефициту,

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11. печатных работ: 9 статей и 2 тезисов. Материалы диссертации доложены на объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН ■ (24-25июня, Новосибирск, 2000г); на научной сессии Новосибирской государственной медицинской академии (19-20 декабря 2000г).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах, включая 15 рисунков и 8 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащей 35 отечественных и 87 иностранных источников.

Материалы и методы исследования

Используемые реактивы ,, •

Для иммуноферментного анализа использовали планшеты (Costar", США); коньюгат IgG козы против иммуноглобулинов кролика, меченный пероксидазой хрена, бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, США); о-фенилендиамин ("Merk", Германия); коньюгат IgG кролика против иммуноглобулинов человека, меченный пероксидазой хрена (Вектор-Бест, Новосибирск).

Лизат суммарных белков ВИЧ произведен в ГНЦ ВБ "Вектор"; рекомбинантные белки ВИЧ, сорбированные на 96-луночный планшет, из иммуноферментной тест-системы "Рекомбинант-ВИЧ-1,2 ДС/М" (НИКТИ БАВ, Бердск); поверхностные рекомбинантные белки envi и

env2 ("Капель", Москва) и поверхностные рекомбинантные белки envi и env2 ("Биосервис", Москва). В работе использовали сыворотки здоровых доноров и сыворотки от ВИЧ-инфицированных пациентов, имеющие полный набор антител к вирусным белкам (ГНЦ ВБ "Вектор"); ВИЧ-положительные и ВИЧ-отрицательные сыворотки из тест-системы "Рекомбинант-ВИЧ-1,2 ДС/М".

В исследованиях in vitro использовали специальную линию лимфоидных клеток МТ4 (Япония), предоставленную ГНЦ ВБ "Вектор", которые имеют маркеры-рецепторы CD4; моноклональные антитела к CD4 (MAT/CD4) и антитела к IgG мыши, меченые ФИТЦ ("Сорбент", Санкт-Петербург); меченые препараты: С14-лейцин (8880 мБк/мМоль, Чехия) и Н3-тимидин (6000 мБк/мМоль, НТЦ "Нуклон", Москва.).

Для выделения B-лимфоцитов крови человека использовали фиккол (Sigma) и урографин (Shering). Для культивирования

1 1 ч I

лимфоцитов крови человека использовали планшеты для культуральных работ (Orange, ICN), питательную среду RPMI-1640 (ГНЦ ВБ "Вектор") с добавлением 10% фетальной сыворотки (ICN), 600 мкг/мл L-глютамина (ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск), 30 мкг/мл линкомицина и 80 мкг/мл гентамицина (ФГУП НПО "Вирион", Томск).

Методы

1. Выделение апоА-1 из плазмы крови человека проводили с помощью изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе КВг [Hatch F.T. et al. 1968].

2. Количественное определение белка проводили по методу [Lowry О.Н. et al. 1951], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

3. Проверку чистоты апоА-1 осуществляли с помощью электрофореза в ПААГ с SDS-Na [Laemmli U.K. et al. 1970].

4. Метод получения специфических антител к апоА-1 [Поляков Л.М. и др. 1991].

5. Анализ апоА-I методом непрямого твердофазного иммунохимического анализа (ИФА) [Поляков J1.M. и др. 1991].

6. Иммуноблоттинг апоА-1 и белков ВИЧ проводили по методике [Tovey Е. et al. 1987.].

7. Дот-блоттинг [Hawkers, 1982].

8. Определение рецепторов CD4 проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Discinson, USA) по методике [Costiqliola P. et al. 1992].

9. Определение скорости биосинтеза белка в Т-лимфоцитах in vitro [Weigand К. et al. 1974].

10. Определение скорости биосинтеза ДНК в Т-лимфоцитах in vitro [Dicker P. et al., 1980].

11. Выделение В-лимфоцитов из периферической крови человека проводили по методике [Тотолян А.А и др., 1999].

12. Концентрацию иммуноглобулинов класса G, М, А в среде культивирования определяли в ИФА на тест-системах (Вектор-Бест, Новосибирск).

■ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование иммунохимического соответствия апоА-1 и антител к ВИЧ-1. Для того чтобы показать наличие общих антигенных детерминант между апоА-1 человека и поверхностными белками ВИЧ-1 исследовали взаимодействие между апоА-1 и антителами к ВИЧ-1 в ИФА.

В качестве положительного контроля проводили титрование апоА-1 человека антителами иммунизированного им кролика. На рис. 1 представлена кривая титрования апоА-1 специфическими антителами к нему. Выявлена линейная зависимость оптической плотности при 492 нм в интервале от 0,1 о.е. до 1,5 о.е. при изменении количества белка в лунке планшета от 1 нг до 100 нг. При титровании сывороткой нормального кролика такой зависимости не обнаружено.

D492,o е

1 10

Количество апоА-I, нг

О—антителами к апоА-1 А—нормальной кроличьей сывороткой

0,0 о

ч-

1/200 1/100 Разведения сыворотки -сыворотка ВИЧ-инфицированного пациента

■ сыворотка здорового донора

Рис.1. Титрование стандартного Рис.2. Зависимость оптической

д т плотности от разведения

раствора апоА-1 человека. 1 . °

сыворотки (антиген - апоА-1).

На первом этапе исследования изучали специфичность взаимодействия апоА-1 с антителами к суммарным белкам ВИЧ-1. С этой целью апоА-1 (антиген) сорбировали на планшет и титровали антителами к ВИЧ-1. Для этого использовали сыворотку от ВИЧ-инфицированного пациента. Сыворотку при последовательном двукратном разведении (с шаго\ 2) от 1:100 До 1:6400 наносили на планшет, на поверхности которого был предварительно сорбирован апоА-1 (антиген).

Результаты титрования представлены на рис.2. При разведении сыворотки от 1:3600 до 1:200 оптическая плотность иммуноферментной реакции увеличивалась от 0,02 до 1,1 o.e. Самое высокое показание оптической плотности отмечалось при разведении ВИЧ-позитивной сыворотки 1:200. Для кривой титрования сывороткой крови здорового человека эта величина составляла не более 0,2 o.e.

Поскольку разведение сыворотки 1:200 оказалось оптимальным, в дальнейшем проводили титрование апоА-1 (антиген) сыворотками

ВИЧ-инфицированных в этом разведении. Антиген наносили на

планшет по 100 мкл с разным содержанием белка в растворе от 0,33 нг

до 800 нг. На рис.3, представлены кривые титрования . апоА-1

сывороткой от двух ВИЧ-инфицированных пациентов.

В качестве контроля неспецифической сорбции на йланшет

наносили (БСА). На рис.3 видно, что обе ВИЧ-положительные

сыворотки с высокой специфичностью взаимодействовали с апоА-1

(антигеном). - {

V' ' —

Подобные результаты получены при использовании пяти других

сывороток от ВИЧ-инфицированных пациентов. Полученные данные

позволили предположить, что при высокой концентрации апоА-1 в

крови здоровых людей, может быть получен ложноположительный

ответнаВИЧ. " "

В следующих, экспериментах титровали сорбированноый на

планшете апоА-1 отрицательными сыворотками (донорские сыворотки

крови, не содержащие антител к ВИЧ). Ни одна из 20 отрицательных

сывороток не дала положительного результата.

Кроме ИФА, взаимодействие апоА-1 с сывороткой ВИЧ-

инфицированных пациентов было показано в дот-блоте (рис.4).

Наблюдается количественная зависимость интенсивности окраски от

содержания антигена в ячейке.

Таким образом, впервые установлено иммунохимическое

соответствие между апоА-1 и белками §р41, §р120. Показано, что

существует иммунохимическое сродство между апоА-1 и антителами к

ВИЧ-1, присутствующими в крови ВИЧ-инфицированных пациентов.

Это говорит о наличии общих антигенных детерминант у апоА-1

человека и поверхностных белков ВИЧ.

К 1 2 3 4 5

а л IV # #

с - тттфш

Рис.4. Выявление иммунореактив-ности между апоА-1 и антителами к ВИЧ (Ь) и между поверхностными белками ВИЧ и антителами к апоА-1 (с): а - контроль - 1,2,3,4,5, - апоА-1 в количестве: 5, 10, 20, 30, 50мкг, проявленный антителами к апоА-1; Ь - 1,2,3,4,5, -апоА-1 в количестве: 5, 10, 20, 30, 50мкг, проявленный антителами к ВИЧ в сыворотке крови больного СПИД; с - 1, 2, 3 ,4 -рекомбинантные поверхностные белки ВИЧ в количестве: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0мкг, проявленный антителами к апоА-1; К - отрицательный контроль, антиген-БСА.

Рис.3. Зависимость оптической плотности от концентрации апоА-1.

На следующем этапе для того, чтобы показать наличие общих антигенных детерминант между апоА-1 человека и поверхностными белками ВИЧ-1, мы исследовали взаимодействие между белками ВИЧ-1 и антителами к апоА-1.

На первом этапе использовали белки ВИЧ-1, представляющие собой лизат из суммарных нативных белков ВИЧ-1, причем, основное содержание (более 50%) было представлено белком р24. Лизат суммарных нативных белков ВИЧ-1 сорбировали на планшет, затем планшет обрабатывали по инструкции к тест-системе и добавляли антитела к апоА-1 в разведениях от 1:50 до 1:6400.

Зависимость оптической плотности от концентрации антител к апоА-1 в ИФА, где в качестве антигена использовался лизат ВИЧ-1,

0492,о е

Количество АГ, иг

СывороткаВИЧ-ифицир пациента! сыворотка ВИЧ-инфицир. пациента 2 контроль - ...

показана на рисунке 5. При разведении сыворотки от 1:3600 до 1:50 оптическая плотность иммуноферментной реакции увеличивалась от 0,1 до 0,9 о.е

Разведения сыворотки —□— антиген - лизат ВИЧ-1

—<3—антиген - рекомбинантные белки ВИЧ-1,2 из тест-системы —&—антиген - рекомбинантные белки епу1,2 "Капель" —ЭК—отрицательный контроль

Рис.5. Зависимость оптической плотности от разведения антител к апоА-1 человека.

Кроме лизата суммарных нативных белков ВИЧ, были использованы рекомбинантные белки ВИЧ-1 (р17, р24, gp 120, gp41) и ВИЧ-2 (gpllO, gp38), сорбированные на 96-луночный планшет из иммуноферментной тест-системы. Значение оптической плотности около 1,0 o.e. свидетельствует в пользу иммунохимического сродства белков ВИЧ и антител к апоА-I человека.

Рекомбинантные белки из тест-системы, кроме изучаемых оболочечных белков, содержали также коровые белки вируса ВИЧ (р17, р24), как было показано в иммуноблоте. Показания оптической плотности для рекомбинантных env белков ВИЧ-1/2 "Капель", которые в основном представлены оболочечными белками, в ИФА самые высокие (рис.5), поэтому их использовали в дальнейшем.

Кроме твердофазного ИФА, взаимодействие оболочечных рекомбинантных белков ВИЧ-1/2 с антителами к апоА-I было показано в иммуноблоте, представленном на рис.6. На дорожке 1 - апоА-I с молекулярной массой 28кОа, выявленный антителами к апоА-1 (положительный контроль). На дорожке 2 - рекомбинантные белки ВИЧ-1/2, к которым добавляли сыворотку нормального кролика (отрицательный контроль). На дорожке 3 - рекомбинантные белки ВИЧ-1/2, выявленные антителами к апоА-1.

Исследуемые белки выявлялись в виде четырех полос. На основании предыдущих данных было сделано заключение: эти полосы соответствуют оболочечным белкам ВИЧ-1 (gpl20 и gp41) и ВИЧ-2 (gpl05 и gp36).

Таким образом, впервые установлено иммунохимическое соответствие между белком gp41, gpl20 и апоА-I. Показано, что существует иммунохимическое сродство между антителами к апоА-I и оболочечными белками ВИЧ-1, а также существует иммунохимическое взаимодействие между апоА-I и антителами к ВИЧ-].

На следующем этапе исследования взаимодействие между рецептором CD4 и апоА-I человека изучалось с помощью ИФА с использованием индивидуальных и рекомбинантных белков. Зависимость оптической плотности ферментативной реакции от концентрации env белков и апоА-I человека представлена на рис.7. Показано, что при равных концентрациях оптическая плотность для envi выше, чем для апоА-I человека.

D492.0 е.

gp120 • gp105

gp41 gp36

-28kD

Рис.6. Выявление иммунореактив-ности между рекомбинактными белками ВИЧ-1/2 и антителами к апоА-1.

1 — положительный контроль (апоА-1)

2 — отрицательный контроль

3 — реко^бинантные белки ВИЧ-1/2

1,0

0,5

0,0

ХХ'ЯГ^.Г.' " "'Г \---

■ "

10

0 5 10 15

Концентра^ белка, мкг/мл -тшрование белками ВИЧ-1

- титрование апоА-1 человека

- отрицательный контроль —X— титрование белками ВИЧ-2

Рис.7. Титрование СВ4-рецентора апоА-1 человека и епу белками ВИЧ-1/2.

Это можно объяснить тем, что аффинитет апоА-1 человека к CD4-рецептору ниже, чем у envi белков. Несмотря на это, данный факт может лежать в основе конкурентных взаимоотношений между ВИЧ-1 и апоА-1 человека за СТМ-рецептор.

В литературе приводятся данные, что ВИЧ-1 или ВИЧ-2 равнозначно действуют на одни и те же клетки. Следовательно, взаимодействие между С04-рецептором и ВИЧ-1 и ВИЧ-2 должно осуществляться одинаково. Полученные нами результаты говорят о том, что взаимодействие ВИЧ-1 с лимфоцитами, несомненно, осуществляется через С04-рецептор. В отношении ВИЧ-2 нами не получено подтверждения этому факту. При титровании

фиксированного на планшете С04-рецептора рекомбинантными поверхностными белками ВИЧ-2 был получен результат на уровне отрицательного контроля (рис.7).

На следующем этапе было проведено исследование взаимодействия апоА-1 человека и поверхностных белков ВИЧ-1 (gpl20, gp41) с СБ4-рецептором в условиях in vitro. Исследование проводили методом проточной цитофлуориметрии на CD4+-лимфоцитах человека (МТ4-клетках). Результаты экспериментов in vitro представлены в таблице 1.

В зависимости от того, какой белок и в какой концентрации инкубировался с клетками МТ4, были получены различные величины средней интенсивности свечения (СИС). Максимальной величина СИС была, если клетки не инкубировали с env белками ВИЧ или апоА-I, т.е в положительном контроле.

Таблица 1. Результаты измерения средней интенсивности свечения (СИС) клеток МТ4, преинкубированных с апоА-1 и (или) белками ВИЧ

№ пробы envi Ю^М anoA-1 10'6М СИС (M±m) Д Д,%

положит.К 0 0 19,7±1,7 0 -

1 0,036 0 18,1±1,5 - 1,6 8,3

2 0,018 0 14,4±0,9 -5,3 26,9

3 0,009 0 11,8±0,8 -7,9 38,6

4 0,0045 0 18,3±1,9* -1,4 6,7

5 0 0,18 15,3±2,6 -4,4 22,5

6 0 0,072 15,0±2,6 -4,7 24,1

7 0 0,036 15,5±2,9* -4,2 21,5

8 0 0,018 19,3±2,1* -0,4 2,4

9 0,009 0,018 15,8±1,0 -3,9 20,2

10 0,009 0,072 15,4±2,8 -4,3 21,5

отрицат.К 0 0 19,6±1,9 0 0

Д - отклонение СИС образца от СИС контроля

А, % - отклонение СИС образца от СИС контроля, выраженное в %

* - коэффициент Стьюдента незначимо отличается от нуля

Минимальной эта величина оказалась для клеток, инкубированных с envi белками ВИЧ-1 при концентрации 0,009x10"бМ. Снижение СИС

при инкубации с env белками,ВИЧ составляет почти 40%, если считать СИС в положительном контроле за 100%. Для апоА-1 это снижение при концентрации 0,072x10'6М составляло 24%.

При рассмотрении результатов совместного воздействия апоА-1 человека и env белков ВИЧ-1 снижение СИС происходило на том же уровне, что и для апоА-1. Это можно объяснить тем, что хотя аффинитет к CD4 у gpl20 выше, чем у апоА-1 человека, конкуренция имеет место. Из таблицы 1 следует, что аффинитет к CD4 у gpl20 вдвое выше, чем у апоА-1 человека. Не исключено, что при определенных условиях апоА-1 может выступать в качестве блокирующего агента в процессе проникновения вируса в лимфоциты. Гипотетически этот механизм может объяснить антивирусную активность апоА-1 человека.

Обнаруженное иммунохимическое взаимодействие рецептора CD4 с апоА-1 человека и поверхностными белками ВИЧ-1 и наличие конкурентных взаимоотношений в реакции in vitro позволило провести поиск предполагаемых сайтов связывания этих белков с рецептором CD4. С помощью компьютерной программы "MOTIV" был проведен поиск потенциальных участков связывания рецептора CD4 с поверхностным белком gpl20 ВИЧ-1 и апоА-1 человека.'

Прогнозируемые, согласно расчетам, варианты области рецепции

!

белка CD4, gpl20 и апоА-1 человека представлены на рис. 8.

Один и тот же район CD4 имеет высокое пространственное сродство с апоА-1 человека и gpl20. Таким образом, впервые выявлены сегменты белков апоА-1 и gpl20, имеющие высокое пространственное сродство с рецептором CD4. Полученные результаты хорошо объясняют конкурентную борьбу за рецептор между этими белками.

Обращает на себя внимание тот факт, что направление эпитопа рецептора CD4 при взаимодействии с белком gpl20 ВИЧ-1 прямо противоположно направлению этого же эпитопа рецептора CD4 при взаимодействии с апоА-1 человека.

а)

451 436

§р120 К-Х-(2-в-8-1-Р-Р-А-У-М-А-К-С-У-Е-бе-Н-®5-<-

+ + + + ~ + + + + + + ~ +

С04 -»Ь-Н-О-К-А-О-З-Е-К-З-Ь-ет-Р-О-в-Н-Р-Р - ь

76 94

Ь)

110 128

ароА-1 -> Е-Е-М-Е-Ь-Т-К-О-К-У-Е-Р-Ь-К-А-Е-Ь-О-Е - + - + + + + ~ + + + ~ + ~ + ~

94 76

Рис. 8. Возможные области рецепции белка СБ4 с гликопротеином §р120 ВИЧ-1 (а) и апоА-1 человека (б). Обозначения: "+"- пространственно сопряженные; - нейтральные аминокислотные остатки.

Сегмент цепи ароА-1 49-73), гомологичный §р120, занимает

всю спираль 1 и первую часть спирали 2. Участок ароА-1 (Ш 110-128),

гомологичный рецептору С04, занимает последнюю часть спирали 4 и

первую часть спирали 5.

1 10 20 30 40 50

ОЕРРОвРгаЖ УКОЬАТ\ПГ\ГО УЪКОЗетгоГУ вОЕЕСЗАИЗК еьгокььош

<— неспиральный участок молекулы (1-43) —►<—линдя—><—

60 70 80 90 100

РЗУТЗТЕБК!. КЕд1,6РУТеЕ СТГОИЬЕКЕТЕ ЙЬКОЕМЗКРЬ ЕЕУКАКУОРУ

спираль 1 —>«— спираль 2 —►<— спираль 3 ><

' ' ' ПО 120 130 140 150

ЦЭРГОККУТОЕ ЕМЕЪгаОКУЕ Р1ДАЕЬС>6А ИдКЬНЕЬОЕК ЬвРЬвЕЕИЙР

спираль 4 —и— спираль 5 —н—

160 170 180 190 200

ЯЫШГТОАЬК ТНЬАРУББЕЬ КдКЬААКЪЕА ЬКЕЫССАКЬА ЕУНАКАТЕНЬ

спираль 6 • >< спираль 7 —><— спираль 8

. 210 220 230 240 243

вТЬЗЕКАКРА ЬЕОЬИОСЬЬР УБЕЗЕТОгеГС. ЗАЬЕЕУТККЬ №ГС

—►<— спираль 9 —><— спираль 10 —*

Рис. 9. Аминокислотная последовательность ароА-1. Вторичные структурные элементы обозначены ниже последовательности [ЯеэсЫу Е. й а1., 2002]. Сегмент цепи ароА-1, гомологичный £р120, выделен жирной чертой. Участок ароА-1, гомологичный рецептору С04, выделен двойной чертой.

Учитывая тот факт, что в составе частицы ЛПВП апоА-1 представлен тетрамером, в качестве рабочей гипотезы предполагается, что частица ЛПВП имеет 4 места связывания с рецептором CD4 и столько же мест связывания с антителами к env белкам ВИЧ-1. Т.е. в составе ЛПВП молекула апоА-1 имеет больше шансов как на связывание с антителами к env белкам ВИЧ-1, так и на взаимодействие с рецептором CD4, чем в свободном состоянии.

На основании предыдущих исследований было сделано предположение, что при определенных условиях апоА-1 может выступать в качестве блокирующего агента в процессе проникновения вируса в клетку. В равной степени можно говорить и о конкурентных взаимоотношениях между env белками ВИЧ-1 и апоА-1 в отношении рецептора аполипопротеина A-I, что может приводить к подавлению участия апоА-1 в регуляции экспрессии генов, описанной ранее [Панин Л.Е. и др. 2001, 2002]. В связи с этим была предпринята попытка показать конкурентные взаимоотношения между апоА-1 человека и поверхностными белками ВИЧ-1, связанные с биосинтезом белка и ДНК на Т-лимфоцитах.

Учитывая зависимость биосинтеза от фазы развития лимфоцита, исследования проводили на 2-х, 3-х и 4-х суточной культуре клеток.

Из таблицы 2 следует, что на 2-х суточной культуре перевиваемых Т-лимфоцитов человека проявляется ингибирующее действие envi на биосинтез ДНК (группа 3). Внесение в культуру клеток рекомбинантного белка envi снижало скорость биосинтеза ДНК в два раза. Аполипопротеин А-1 снимал ингибирующее действие envi (группа 4), что приводило к восстановлению скорости биосинтеза ДНК до уровня контрольной группы.

В 3-х суточной культуре Т-лимфоцитов показано стимулирующее действие апоА-1 на биосинтез ДНК. При этом скорость биосинтеза ДНК в контроле составила 255; при воздействии апоА-1 - 284 и при совместном воздействии апоА-1 и envi - 259 имп/мин на ЮООкл. Белки

епу2 не оказывали никакого действия на синтез ДНК. Стимулирующий эффект апоА-1 на культуру клеток проявлялся также в увеличении клеточности на третьи сутки культивирования (таблица 3).

Таблица 2. Влияние апоА-1 и поверхностных белков ВИЧ-1 на скорость биосинтеза ДНК в 2-х суточной культуре Т-лимфоцитов

№ группы Клетки + агент Скорость биосинтеза ДНК, имп/мин на ЮООкл

Конц-я агента, мкг/мл M ' ± m Д

апоА-1 envi

1 0 0 353 ±15 0

2 5,0 0 341 ±20 -11

3 0 2,0 178 ±18* -175

4 5,0 2,0 343 ± 29** -9

env2 0 0 346 ±17 -7

Д - отклонение опыта от контроля * - Р< 0,05 по сравнению с контролем ** - Р< 0,05 по сравнению с действием envi

Таблица 3. Влияние апоА-1 на пролиферативную активность перевиваемых Т-лимфоцитов (кол-во кл. х105)

Условия эксперимента Время инкубации, сутки

1 2 3

Контроль 4,13 ±0,33 3,55 ± 0,36 6,59 ± 0,82

апоА-1 3,67 ±0,31 3,3 ± 0,38 7,49 ±0,91*

* - Р< 0,05 по сравнению с контролем

При использовании 4-х суточной культуры Т-лимфоцитов проявлялось ингибирующее действие envi на биосинтез белка, табл.4 (группа 3). Аполипопротеин А-1 снимал действие envi (группа 4), что

приводило к восстановлению скорости биосинтеза белка практически до уровня контрольной группы (группа 1).

Таблица 4. Влияние апоА-1 и поверхностных белков ВИЧ-1/2 на скорость биосинтеза белка в 4-х суточной культуре Т-лимфоцитов_,

Клетки + агент Скорость биосинтеза белка, имп/мин

№ группы Конц-я агента, ' мкг/мл М±ш Д

апоА-1 envi

1 0 0 ■ 84,2 ± 2,4 0

2 10,0 0 82,3 ± 2,2 -1,9 .

3 0 5,0 76,2 ± 1,3* -8,0 '

4 10 5,0 82,5 ± 2,7** -1,7

env2 0 0 82,8 ± 1,9 -1,4

Д - отклонение опыта от контроля * - Р< 0,05 по сравнению с контролем ** - Р< 0,05 по сравнению с env2

Проведеные исследования взаимоотношений между апоА-I b поверхностными белками ВИЧ-1 на перевиваемых Т-лимфоцитах человека показали, что envi белки снижают скорость биосинтеза белка и ДНК в клетках, в то время как апоА-1 полностью снимает цитопатическое действие envi. Кроме того, показано усиление биосинтеза ДНК аполипопротеином А-1, которое ингибируется envi белками.

Эти результаты подтверждают наличие конкурентных взаимоотношений между апоА-1 и поверхностными белками ВИЧ-1 не только в-отношении рецептора CD4, но и в отношении рецептора к апоА-1.

На следующем этапе конкурентные взаимоотношения между апоА-1 и поверхностными белками ВИЧ-1 изучались на первичной культуре В-лимфоцитов из крови человека.

На модели В-лимфоцитов крови пациентов с бронхиальной астмой мы проследили продукцию иммуноглобулинов. В эксперимент брали кровь пациентов, у которых не наблюдали анемии и иммунопатологии.

Результаты эксперимента представлены в таблице 5.

Таблица 5. Влияние апоА-1 и envi на продукцию антител В-лимфоцитами человека (п=8)

№группы Конц-я агента, IgG, мкг/мл IgM, мкг/мл IgA, мкг/мл

мкг/мл

апоА-1 envi M ± m М±т М±т

1 0 0 125,7± 17,5 84,5 ¿ 13,1 97,7 ±14,5

2 5,0 0 256,6 ± 37,6 150,8 ± 21,4 150,6 ±22,9

3 0 2,0 105,6 ± 13,1 114,7 ±22,3 76,9 ±18,3

4 5,0 2,0 132,5 ± 17,9 92,6 ± 9,2 102 ±13,5

env2 0 0 132,9 ±21,7 110,7 ± 15,2 109,4 ± 16,2

ip 1-2 гр 1-2

р< 0,003 р< 0,05

Достоверность отличий гр 2-3 гр 2-3 гр 2-3

между группами р< 0,001 р<0,05 р< 0,05

i-p 1-3 гр 1-3

р< 0,005 р< 0,05

При введении в культуральную среду envi (группа 3) происходило ингибирование продукции иммуноглобулинов классов G и А. В то же время достоверного влияния envi на продукцию IgM не наблюдалось.

Введение сразу двух конкурирующих белков (envi и апоА-1) снимало индуцирующий эффект со стороны апоА-1 и ингибирующий эффект со стороны envi.

ВЫВОДЫ

1. Аполипопротеин A-I человека и оболочечные белки ВИЧ-1 имеют общие антигенные детерминанты. Для оболочечных белков ВИЧ-2 общих антигенных детерминант с апоА-1 не выявлено.

2. АпоА-1 человека связывается с рецептором CD4 Т-лимфоцитов. Это взаимодействие лежит в основе конкурентных взаимоотношений между апоА-1 и envi.

3. Сегменты апоА-I человека (NN 110-128) и gpl20 (NN 436-451) ВИЧ-1 имеют высокое структурное сродство с одним и тем же участком рецептора CD4 (NN 76-94).

4. Поверхностные белки ВИЧ-1 ингибируют биосинтез ДНК и белка Т-лимфоцитами. АпоА-1 человека подавляет цигопатическое' действие поверхностных белков ВИЧ-1.

5. АпоА-I человека усиливает продукцию иммуноглобулинов класса' G и А В-лимфоцитами человека. Поверхностные белки ВИЧ-1, ингибируют продукцию иммуноглобулинов класса G, М и А В-лимфоцитами человека, в то время как апоА-1 подавляет, цигопатическое действие env 1.

Список научных трудов, опубликованных по теме диссертации.

1. JI.E. Панин, Н.Е. Костина, О.Н. Потеряева, Н.В. Федюк, А.Г. Покровский. Иммуноферментный анализ гомологии белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 человека. //Иммунология. -№2. -2000. -С.6-8.

2. JI.E. Панин, Н.Е. Костина, О.Н. Потеряева, С.А. Федосов. Иммуноферментный анализ структурного соответствия рекомбинантных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 человека. //Иммунология. -№3. -2000. -С.4-6.

3. Панин Л.Е., Лукашев В.А., Костина Н.Е. Применение компьютерного и иммуноферментного анализа структурного соответствия env белков ВИЧ и аполипопротеина А-1 человека. //Тез." Докл. Объед. науч. сессия СО РАН и' СО РАМН, Новосибирск, 22-23 июня, 2000. -С. 14.

4. Л.Е. ,Данин, Н.Е. Костина, О.Н. Потеряева, В.А.Лукашев. Структурное и иммунохимическое соответствие оболочечных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1. // ДАН. -2001. -Т.377. -№2. -С.266-269.

5. Н.Е. Костина, О.Н. Потеряева, Л.Е. Панин, В.А Лукашев. Компьютерный и иммуноферментный анализ в изучении структурно-функционального подобия env белков- ,ВИЧ и аполипопротеина А-1 человека. Тез. Докл. научн. сессии Новосибирской государственной медицинской академии. Новосибирск, 19-20 декабря 2000. -С. 168.

6. Л.Е. Панин, Н.Е. Костина, О.Н. Потеряева, Н.В. Федюк. // Иммунохимическое соответствие оболочечных белков ВИЧ-1 и

аполипопротеина А-1 человека.// Вопросы вирусологии. - Т. 46, №5. —2001. -С.13-16.

7. JI.E. Панин, Н.Е. Костина, B.C. Кожевников, С.А Федосов, Н.В. Федюк, А.Г. Покровский. Оценка функциональной роли структурной гомологии поверхностных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 человека при взаимодействии их с лимфоцитами.// Иммунология -2002. -Т.23. -№5. -С.260-262.

8. JI.E. Панин, Н.Е. Костина. Взаимодействие рецептора rsCD4 с аполипопротеином А-1 человека.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2002. -Т. 133. -№4. -С.397-398.

9. JI.E. Панин, Н.Е. Костина В.А Лукашев. Роль структурно-функциональной гомологии оболочечных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 человека во взаимодействии с рецептором CD4. // ДАН. -2002. -Т.385. -№5. -С.1-4.

10. Л.Е. Панин, Н.Е. Костина. Взаимодействие аполипопротеина А-1 человека и оболочечных белков ВИЧ-1 с нативным и рекомбинантным рецептором-С04. // Вопросы вирусологии Т. 48, -№1.-2003.-С.24-26

11. Л.Е. Панин, Н.Е. Костина, Т.Р. Проняева. Взаимное влияние оболочечных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 на синтез белка и ДНК Т-лимфоцитами человека. // Иммунология. -2003. -Т.24. -№4. -С.203-204.

Соискатель

i

I

Тираж 100 экз. Заказ № 613

Отпечатано в Издательском центре ИВТ СО РАН, 630090, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 6

¡p 15 2 6 7

г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Костина, Нина Егоровна

j СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аполипопротеин A-I

1.1.1. Общая характеристика липопротеинов

1.1.2. Физико-химические свойства апо A-I

1.1.3. Гетерогенность апоА

1.1.4. Структура аполипопротеина A-I

1.1.5. Структура апоА-I в составе ЛПВП

1.1.6. Дифенсиновая функция аполипопротеинов

I • *

1.2. Вирус иммунодефицита человека 32 ( 1.2.1. История ВИЧ-инфекции

1.2.2. Характеристика и строение ВИЧ

1.2.3. Причины эпидемии СПИДа

1.2.4. Геном и жизненный цикл ВИЧ

1.2.5. Механизм цитопатогенного действия вируса

1.3. Рецептор CD

1.3.1 Общая характеристика С04-рецептора

1.3.2 Структура и функция С04-рецептора

1.3.3 Рекомбинантный CD

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 76 3.1. Иммунохимическое сродство оболочечных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина A-I человека 76 3.1.1. Иммунохимическое соответствие апоА-I и антител к ВИЧ-1 3.1.1.1. Иммуноферментный анализ гомологии апоАи антител к ВИЧ

3.1.1.2. Иммунохимическое соответствие апоА-I и антител к ВИЧ-1 в дот-блоте 3.1.2. Иммунохимическое соответствие белков ВИЧ-1 и антител к апоА

3.1.2.1. Иммунохимическое соответствие белков ВИЧ-1 и антител к апоА-I в ИФА

3.1.2.2. Взаимодействие обол очечных рекомбинантных белков ВИЧ с антителами к апоА-I в иммуноблоте

3.2. Взаимодействие между CD4 и апоА-1 в ИФА

3.3. Проявления конкурентных взаимоотношений между апоА-1 и envl за рецептор CD4 в реакции in vitro

3.4. Поиск сайтов связывания CD4 с апоА-I и gpl20 компьютерным методом

3.5. Влияние апоА-I и envl на синтез белка и ДНК Т-лимфоцитами

3.6. Влияние апоА-I и envl на продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами крови человека

ОБСУЖДЕНИЕ ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунохимический анализ структурно-функциональной гомологии аполипопротеина А-1 человека и поверхностных белков вируса иммунодефицита человека"

Актуальность темы. Основная функция липопротеинов крови связана с транспортом липидов от мест их синтеза (печень, кишечник) в другие органы и ткани, где липиды используются как энергетические субстраты и как материал для синтеза биологических мембран. Однако роль белкового компонента липопротеинов различного класса более многообразна. Аполипопротены выполняют в организме важнейшую регуляторную функцию. Так, аполипопротеин A-I (апоА-I) повышает активность ЛХАТ (Sparrow I., Gotto А., 1982), аполипопротеин C-II активирует липопротеиновую липазу (Kinnunen P. et al., 1983; Connelly P. et al., 1987). В последние годы было показано, что апоА-I в комплексе с восстановленной формой стероидных гормонов принимает участие в регуляции экспрессии многих генов (Панин JI.E. и соавт., 1995-2002). Взаимодействие комплекса с ДНК осуществляется в области повторов типа (GCC)n (Панин Л.Е. и соавт. 2001, 2002). В дальнейшем было показано, что этот комплекс играет важную роль в регуляции синтеза ДНК и белка в клетках лимфоидной ткани (Панин Л.Е., Клейменова Е.Ю., 2002). Более того, он имеет отношение к синтезу иммуноглобулинов.

Важным шагом в развитии этих исследований было установление высокой степени гомологии между апоА-I и поверхностными белками ВИЧ-1 (envl) (Lukashev V.A. et al., 2000). Благодаря исследователям из университета шт. Алабама (г. Бирмингем) стали известны антивирусные свойства синтетических пептидных аналогов апоА-I. Это касается вируса Herpes и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (Srinivas R.V. et al. 1990). Мартин с соавторами обнаружили, что апоА-I взаимодействует с трансмембранным белком ВИЧ-1 гликопротеином gp41 (Martin I. et al. 1992). В то же время Оуенс с соавторами показали, что апоА-I и его синтетические аналоги, представляющие собой амфипатные а-спиральные пептиды, эффективно ингибируют репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток и препятствуют образованию клеточного синцития (Owens B.J. et al. 1990). В работе американских исследователей из техасского университета I сообщалось о том, что апоА-I, находясь в кровяном русле в составе ЛПВП, обладает широким спектром антивирусной активности (Singh I.P. et al., 1999).

СПИД - одна из важнейших и трагических проблем, возникших перед всем человечеством в конце XX века. И дело не только в том, что в мире уже зарегистрированы многие миллионы инфицированных ВИЧ и более 200 тысяч уже погибло, что каждые пять минут на земном шаре происходит заражение одного человека. СПИД - это сложнейшая научная проблема. До сих пор неизвестны даже теоретические подходы к решению такой задачи, как очистка генетического аппарата клеток от чужеродной (в частности, вирусной) информации. Без решения этой проблемы не будет полной победы над СПИДом. А таких научных вопросов это заболевание поставило много. С каждым годом накапливается все больше данных, доказывающих, что возбудитель СПИДа поражает не только иммунную, но и нервную систему (Покровский В.В. и соавт., 2000)

СПИД представляет собой тяжелое инфекционное заболевание, возбудителем которого является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Наружная оболочка вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) содержит два белка, имеющих отношение к его рецепции на поверхности клеток-мишеней (макрофагов и лимфоцитов), это трансмембранный белок gp41 и внешний белок gpl20. Связывание вириона с мембраной клетки возможно t только при слиянии вирусного внешнего белка gpl20 со специфическим рецептором на мембране клетки хозяина (молекула CD4+) и трансмембранного белка gp41 с неспецифическим поверхностным связывающим пептидом" (fusion-peptid, F) (Bazan H. A. et al., 1998). Если белки вируса gpl20 и gp41 вступают во взаимодействие с антителами, то их последующий контакт с рецепторным белком становится невозможным и инфицирование не возникает. На этом основано действие одного из препаратов, используемых для лечения больных СПИДом. Это рекомбинантный белок CD4+ (Maddon P.J. et al., 1985). Однако трудности такого подхода к лечению могут быть связаны с наличием у человека белков гомологичных белкам ВИЧ. Аналогичные трудности могут также возникать при разработке соответствующих вакцин, при иммунизации которыми не должны образовываться антитела к собственным белкам.

Такое явление, как молекулярная мимикрия вирусных белков под клеточные рецепторы и природные лиганды достаточно распостранено (Kovalski М. et al., 1987). Сравнение первичных структур иммуноглобулиноподобных доменов Т4-рецептора и антигенов гистосовместимости второго класса (HLAII), с одной стороны, и белков ВИЧ, с другой, выявило высокую степень гомологии антигена гистосовместимости с СООН-концевым районом гликопротеина gpl20 и Т4-рецептора с КНг-концевым районом белка gp41. Показано, что пептидные аналоги Т4-рецептора и HLAII белки обладали противовирусным эффектом (Покровский А.Г. и соавт., 1990).

Наличие у человека белков гомологичных белкам ВИЧ, повидимому, не ограничивается только белками HLA II. На основании вышесказанного нами было выдвинуто предположение, что между апоА-1 человека и оболочечными белками ВИЧ-1/2 существует структурнофункциональное соответствие, играющее важную роль в патогенезе ВИЧt инфекции. Исследование механизма противовирусной активности апоА-Г человека по отношению к ВИЧ может оказаться перспективным при создании вакцин и эффективных профилактических средств.

Цель работы.

Исследовать структурно-функциональную гомологию между аполипопротеином A-I человека и оболочечными белками ВИЧ-1/2 и оценить ее вклад в развитие иммунодефицита.

Задачи исследования:

1. Исследовать иммунохимическое сродство между апоА-I человека и поверхностными белками ВИЧ-1/2.

2. Изучить функциональную и структурную гомологию между рецептором CD4, апоА-I человека и поверхностными белками ВИЧ-1/2.

3. Провести сравнительный анализ взаимодействия апоА-I и поверхностных белков ВИЧ-1 с рецептором CD4 на поверхности Т-лимфоцитов человека.

4. Исследовать влияние апоА-I человека и поверхностных белков ВИЧ-1 на скорость биосинтеза белка и ДНК Т-лимфоцитами человека.

5. Изучить влияние апоА-I человека и поверхностных белков ВИЧ-1 на продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами человека.

Научная новизна работы.

Впервые исследовано иммунохимическое сродство между апоА-1 человека и поверхностными белками ВИЧ-1/2. Показано перекрестное иммунохимическое взаимодействие антител к апоА-I с оболочечными белками ВИЧ-1/2 и апоА-I с антителами к ВИЧ-1/2.

Впервые исследовано взаимодействие апоА-I человека с рецептором CD4. Показано взаимодействие апоА-I человека с рекомбинантным I рецептором CD4 и с рецептором CD4 на поверхности Т-лимфоцитов человека.

Впервые исследовано влияние апоА-I человека и поверхностных белков ВИЧ-1 на биосинтез белка и ДНК Т-лимфоцитами человека. Показано их взаимное влияние на этот процесс, основанное на конкурентных взаимоотношениях между апоА-I человека и поверхностными белками ВИЧ-1.

Впервые показано влияние; апоА-I человека и поверхностных белков ВИЧ-1 на продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами человека.

Теоретическая и практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований был описан новый механизм снижения продукции иммуноглобулинов с последующим развитием иммунодефицита у ВИЧ-инфицированных пациентов, основанный на конкурентных взаимоотношениях между апоА-I человека и поверхностными белками ВИЧ-1. Конкурентные взаимоотношения играют также важную роль в подавлении функции апоА-I, связанной с регуляцией биосинтеза белка.

Положения, выносимые на защиту:

1. Аполипопротеин А-Г человека и поверхностные белки ВИЧ-1 имеют общие антигенные детерминанты.

2. Иммунохимическое и структурное сходство между апоА-I человека, поверхностными белками ВИЧ-1 и рецептором CD4 Т-лимфоцитов приводит к конкурентным взаимоотношениям между апоА-I человека и поверхностными белками ВИЧ-1.

3. Аполипопротеин A-I блокирует цитопатическое действие поверхностных белков ВИЧ-1 на скорость биосинтеза ДНК и белка Т-лимфоцитами.

4. Конкурентные взаимоотношения между апоА-I человека и оболочечными белками ВИЧ-1 способствуют снижению продукции антител В-лимфоцитами человека и развитию иммунодефицита.

Апробация результатов исследования.

Материалы диссертации доложены на объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (24-25июня, Новосибирск, 2000г); на научной сессии Новосибирской государственной медицинской академии (19-20 декабря 2000г).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе:

1. Панин Л.Е., Н.Е. Костина, О.Н. Потеряева, Н.В. Федюк, А.Г. Покровский. Иммуноферментный анализ гомологии белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 человека. //Иммунология. - 2000. - №2. - С.6-8.

2. Панин Л.Е., Н.Е. Костина, О.Н. Потеряева, С.А. Федосов. Иммуноферментный анализ структурного соответствия

- рекомбинантных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 человека. //Иммунология. - 2000. - №3. - С.4-6.

3. Панин Л.Е., Лукашев В.А., Костина Н.Е. Применение компьютерного и I иммуноферментного анализа структурного соответствия env белков • ВИЧ и аполипопротеина А-1 человека. //Тез. Докл. Объед. науч. сессия СО РАН и СО РАМН, Новосибирск, 22-23 июня, 2000. -С. 14.

4. Панин Л.Е., Н.Е. Костина, О.Н. Потеряева, В.А.Лукашев. Структурное и иммунохимическое соответствие оболочечных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1.//ДАН. - 2001.-Т.377. - №2. - С.266-269.

5. Костина Н.Е., О.Н. Потеряева, Л.Е. Панин, В.А Лукашев. Компьютерный и иммуноферментный анализ в изучении структурно-функционального подобия env белков ВИЧ и аполипопротеина А-1 человека. Тез. Докл. научн. сессии Новосибирской государственной медицинской академии. Новосибирск, 19-20 декабря 2000. -С.168.

6. Панин JI.E., Н.Е. Костина, О.Н. Потеряева, Н.В. Федюк. // Иммунохимическое соответствие оболочечных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 человека.// Вопросы вирусологии. - 2001. - Т. 46, -№5.-С.13-16.

7. Панин Л.Е., Н.Е. Костина, B.C. Кожевников, С.А Федосов, Н.В. Федюк, А.Г. Покровский. Оценка функциональной роли структурной гомологии поверхностных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 человека при взаимодействии их с лимфоцитами.// Иммунология. - 2002. — Т.23. -№5. - С.260-262.

8. Панин Л.Е., Н.Е. Костина. Взаимодействие рецептора rsCD4 с аполипопротеином А-1 человека.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2002. -Т.133. -№4. -С.397-398.

9. Панин Л.Е., Н.Е. Костина В.А Лукашев. Роль структурно-функциональной гомологии оболочечных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 человека во взаимодействии с рецептором CD4. //ДАН. - 2002. - Т.385. - №5. - С.1-4.

Ю.Панин Л.Е., Н.Е. Костина. Взаимодействие аполипопротеина А-1 человека и оболочечных белков ВИЧ-1 с нативным и рекомбинантным рецептором-СБ4. // Вопросы вирусологии. - 2003. - Т.48. - №1. -С.24-26.

П.Панин Л.Е., Н.Е. Костина, Т.Р. Проняева. Взаимное влияние оболочечных белков ВИЧ-1 и аполипопротеина А-1 на синтез белка и ДНК Т-лимфоцитами человека. // Иммунология. - 2003. - Т.24. - №4. -С.203-204.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю работы, академику РАМН, профессору, доктору медицинских наук Льву Евгеньевичу ПАНИНУ и научному консультанту доктору медицинских наук Льву Михайловичу Полякову за помощь и поддержку на всех этапах выполнения работы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Костина, Нина Егоровна

ВЫВОДЫ

1. Аполипопротеин A-I человека и оболочечные белки ВИЧ-1 имеют общие антигенные детерминанты. Для оболочечных белков ВИЧ-2 общих антигенных детерминант с апоА-I не выявлено.

2. АпоА-I человека связывается с рецептором CD4 Т-лимфоцитов. Это взаимодействие лежит в основе конкурентных взаимоотношений между апоА-I и envl.

3. Сегменты апоА-I человека (NN 110-128) и gpl20 (NN 436-451) ВИЧ-1 имеют высокое структурное сродство с одним и тем же участком рецептора CD4 (NN 51-69).

4. Поверхностные белки ВИЧ-1 ингибируют биосинтез ДНК и белка Т-лимфоцитами. АпоА-I человека подавляет цитопатическое действие поверхностных белков ВИЧ-1.

5. АпоА-I человека усиливает продукцию иммуноглобулинов класса G и А В-лимфоцитами человека. Поверхностные белки ВИЧ-1 ингибируют продукцию иммуноглобулинов класса G, М и А В-лимфоцитами человека, в то время как апоА-I подавляет цитопатическое действие envl. 109

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Костина, Нина Егоровна, Новосибирск

1. Бобков А.Ф., Зверев С.Я., Бобкова М.Р., Осташова В.Л., Покров ский

2. B.В. и др. Эпидемиологическая и генетическая характеристика первых 40 случаев ВИЧ-инфекции на территории Пермской области. //Вопр. вирусологии. 2000. - Т.45, - Р. - №4. - С. 18-21.

3. Бобкова М.Р. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции у детей первого года жизни. //Клинич лаб диагностика. -2001. Т. № 2. - С. 16-20.

4. Дубров К.Ф. // Диагностическое значение обнаружения антителообразующих клеток в крови, //в сб. Прикладная иммунология. Мат-лы всесоюзн институт.коцф. Л. 1971. ред. Г.И.Карпухин.1. C.206-215.

5. Журавкин И.Н., Лозовой В.П., Козлов В.А. Антителообразующая способность клеток селезенки мышей после гипоксической гипоксии и введения эритропоэтина. // Бюл.экспер.биол. 1978. - № 5. - С. 565-567.

6. Игнатьева Г.А., Фукс Б.Б., Сидорович И.Г Антиидиотипические моноклональные антитела в изучении механизмов инфекции HIV в культуре чувствительных клеток. // Журнал ВХО им. Д.И. Менделеева. -1988. № 5. - С.567-570.

7. Клейменова Е.Ю. Влияние стероидных гормонов и липопротеинов высокой плотности на иммунный ответ. Автореферат дис. Новосибирск. -2002.- 16с.

8. Климов А. и Петрова-Маслакова Л. Идентификация белка Машбефа как липопротеида. //Биохимия. 1976. - Т. 81. - С. 110-113.

9. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды. Липопротеины и атеросклероз, "Питер", С.-Петербург, 1995. — 359с.

10. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов иIего нарушения. С.-Петербург. "Питер". 1999. - 505с.

11. Лукашев В.А., Бачинский А.Г., Куличков В.А. Влияние пространственной сопряженности аминокислотных остатков на допустимость мутационных замен в глобулярных белках. // Мол. Биол. 1986. Т.20.-№ 5. - С.1192-1202.

12. Панин Л.Е. Лизосомы и обмен липопротеинов в печени. // Вопр.мед.хим. 1990. - Т. 36. - № 6. -С.2-4.

13. Панин Л.Е. Системные представления о гомеостазе. В кн.: Гомеостаз и регуляция гомеостатических систем организма. Новосибирск, СО Наука, 1992,-С.29-56.i

14. Панин Л.Е., Хощенко О.М., Усынин И.Ф. Роль аполипопротеина А-1 в активации биосинтеза белка и ДНК в гепатоцитах под влиянием стероидных гормонов. // Бюл.эксп.биол.и мед. 2001. - Т. 131. - №1. -С.63-65.

15. Панин Л.Е., Свечникова И.Г., Маянская Н.Н. Роль плазматических ЛПВП как модуляторов специфического гормонального эффекта гидрокортизона. // Вопр. мед. химии. 1990. - Т.36. - № 3. - С.60-62.

16. Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А., Харьковский А.В., Усынин И.Ф. Влияние комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин А-1 на биосинтез белка и на вторичную структуру эукариотической ДНК // Молекулярная биология. 1999. - Т.ЗЗ. - № 4. - С.673-678.

17. Панин Л.Е., Усынин И.Ф., Трубицина О.М., Харьковский А.В., Соколова Л.С. Роль гепатоцитов, купферовских клеток и эндотелиальных клеток печени в обмене липопротеинов крови. // Биохимия. 1994. -Т.59. -№3.-С.3 53-359.

18. Покровский А.Г., Блинов В.М., Ястребова О.Н., Чаплыгина С.Р.,

19. Егоричева И.Н., Сандахчиев JI.C., Кожич А.Т., Мошников С.А., Чикин

20. Л.Д., Иванов В.Т. Влияние пептидов-аналогов Т4-рецептора и HLA-II класса на репродукцию ВИЧ. //ДАН 1990. - Т. 313. -№ 3. - С.734-740.

21. Покровский А.Г., Мамаева О.А., Плясунова О.А., Киселев Н.Н., Куляндин С.А. Пат. № 1717631. РФ. Способ получения антигена вируса иммунодефицита человека 1-го типа.Бюл. Изобрет. — 1992. № 9. - С.94.

22. Покровский В.В. Эпидемиология и профилактика ВИЧ-инфекции и СПИД. М. Медицина. - 1996. - 248с.

23. Покровский В.В., Ермак Т.Н., Беляева В.В., Юрин О.Г. ВИЧ?

24. ИНФЕКЦИЯ: клиника, диагностика и лечение. М. "Медицина". — 2000. — 498с.

25. Поляков Л.М., Панин Л.Е. Липопротеиновая регуляция метаболических процессов. // Успехи соврем.биол. 2000. - Т. 120. — № 3. -С.265-272.

26. Поляков Л.М., Потеряева О.Н. Панин Л.Е. Определение аполипопротеина A-I методом иммуноферментного анализа. // Вопросы мед. химии. 1991. - Т. 37. -№ 1. - С.89-92.

27. Рахманова А.Г. ВИЧ-инфекция, клиника и лечение. С.-Петербург. ССЗ "СПИД, секс, здоровье". 2000. - 366с. .

28. Репин B.C. и Смирнов В.Н., Фундаментальные науки против атеросклероза М.: ВНИИМИ, —.1989. - 70с.

29. Титов В.Н. Конформация аполипопротеина В-100, структура и функциональная классификация липопротеидов низкой плотности. // Биохимия. 1996. - Т. 61. - №1. - С.3-23.

30. Титов В.Н. Липопротеииы высокой плотности: структура, функции и диагностическое значение. // Клинич.лаб.диагностика. 2000. - №2. -С.25-33.

31. Титов В.Н. Транспорт .холестерина липопротеинами высокой плотности с позиции биохимии белка. //Вопр. мед. химии. 1995. — № 3. — С.З 8.

32. Тузиков Ф.В., Панин Л.Е., Тузикова Н.А., Поляков Л М. Применение метода малоуглового рентгеновского рассеяния для оценки структурных изменений в липопротеинах высокой плотности. // Биол. Мембраны. -1996. Т. 13.-№1. - С.71-78.

33. Фукс Б.Б. и др. Система иммунитета в экстремальных условиях. — 1989. М. "Наука".- 193с.

34. Хаитов P.M. Из истории открытия ВИЧ. // Бюлл. Вакцинация. 2001.2. С.53-61.

35. Хаитов P.M., Вербицкий М.И. Онтогенез иммунной системы. — М. — 1986.-368с.

36. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А. СПИД. М. - 1992. "Народ, акад. культуры и общечел. ценностей". - 352с.I

37. Хаитов P.M., Пинегин Г.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М. 1995. - 417с.

38. Чернядьева И.Ф., Титов В.Н. Роль белок-липидного взаимодействия в формировании и метаболизме липопротеидов в сосудистом русле. //Успехи соврем, биол. 1987. - Т. 102. - С. 189-206.

39. Alaupovic P. David Rubinstein Memorial Lecture: The biochemical and clinical significance of the interrelationship between very low density and high density lipoproteins. // Can.J.Biochem. 1981. - V.59. - P.565-579.

40. Alaupovic P. The nomenclature of serum lipoproteins. //Amer.Assoc.Bioanalysis. 1978.V.4. - P. 1-3.

41. Anderson D. Nichols A.V., Pan S.S., Lindgren F.T. High density lipoprotein distribution. Resolution and determination of three major components in a normal population sample. //Atherosclerosis. 1978. - V.29. -№ 2. -P.161-79.

42. Arthos J., Deen K.C., Chaikin M.A. Fornwald JA, Sathe G, Sattentau QJ, Clapham PR, WeissRA, McDougal JS, Pietropaolo C.Identification of the residues in human CD4 critical for the binding of HIV // Cell. 1989. - V. 57. -№ 3. - P. 469-81.

43. Atlan H, Gersten MJ, Salk PL, Salk J. Can AIDS be prevented by T-cellivaccination? //Immunol Today. 1993. - V 14. - №5. - P. 200-2.

44. Bachelder R.E. and Letvin N.L. Postbinding function of CD4 in HIV infection. Rewiews. // Trends in Microbiology. 1996. - V. 4. - №9. - P. 359363.

45. Bahraoui E., Benjouad A., Guetard D., Kolbe H., Gluckman J.C., Montagnier L. Study of the interaction of HIV-1 and HIV-2 envelope glycoproteins with the CD4 receptor and role of N-glycans. // AIDS Res Hum Retroviruses. 1992 - V. 8. - №5. r P. 565-73.

46. Barabas R., Puchois P., Fruchart J.C., Ailhaud G. Cholesterol efflux froi cultured adipose cells is mediated by LpAl particles not by LpAl:Al 1 particles. //Biochim. Biophys. Res. Commun. 1987. -V. 142. - P. 63-69.

47. Barclay A.N., Brady R.L., Davis S.J., Lange G. CD4 and the immunoglobulin superfamily.// Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 1993. -V. 342(1299)-P. 7-12.

48. Barnaba V., Valesini G., Gattamelata G. et al. Increased number of CD4 cells able to bind to natural killer cell targets in the peripheral blood of AIDS related complex patients // Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 1988, - V. 24, -№3, -P. 369-376.

49. Bazan H. A., Alkhativ G., Broder C.C. et al. Pattern of CCR5, CXCR4, and CCR3 usage by envelope glycoprotein from human immunodeficiency virus typel primary isolates. // J. Virol. 1998. - V.72. - P.4485-4491.

50. Blackburn W.D., Dohlman J.D., Venkatachalapathi Y.V. Apolipoprotein A-I decreases neutrophil degranulation and superoxide production. //J.Lipid.Res.- 1991.-V. 32. — P.l911-8.

51. Boguski, M.S., Elshourbagy, N., Taylor, J.M., and Gordon, J.I. Comparative analysis of repeated sequences in rat apolipoproteins A-I, A-IV, and E. //Proc Nail Acud. Sci. USA, 1985. - V.82. - P.992-996.

52. Bojanovski D., Gregg R.E., Ghiselli G. et al. Human apolipoprotein A-I isoprotein metabolism: proapo A-I conversion to mature apo A-I. // J.Lipid.Res.- 1985. V.26. - №2. - P.l 85-193.

53. Bolognesi D.P. Do antibodies enhance the infection of cells by HIV? // Nature. 1989. -V. 340. - P.431-432.

54. Borhani D.W., Rogers D.P., Engler J.A., Brouillette C.G. Crystal structure of truncated human apolipoprotein A-I suggests a lipid-bound conformation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P.12291-12296.

55. Brewer H.B., Jr. Fairwell Т., LaRue A., Ronan R., Houser A., Bronzert T. J. The amino acid sequence of human apoA-I, an apolipoprotein isolated from high density lipoproteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. - V. 80. -P.623-630.

56. Brady R.L., Barclay A.N. The structure of CD4. // Curr Top Microbiol Immunol. 1996. - V. 205. - P.l-18.

57. Brouillette C.G. and Anantharamaiah G.M. Structural models of human apolipoprotein A-I. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V. 1256. - №2, -P.103-129.

58. Burton, D. R. and Montefiori D. C. The antibody response in HIV-1 infection. // AIDS 1997. - V. 11. - P.87-98.

59. Capon D.J., Chamow S.M., Mordenti J., Marsters SA, Gregory T, Mitsuya H, Bym RA, Lucas C, Wurm FM, Groopman JE, et al. Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy // Nature. 1989. - V. 337. 6207, -P.525-531.

60. Carson M. RIBBONS 2.0. //J. Appl. Crystallogr. 1991 - V.24. -P.958-961.

61. Cheing M C. Characterization and distribution of HDL subpopulations. // Proc. of Workshop on Lipoprotein Heterogeneity /Ed. by K. Lippel. Bethesda: NIH Publ. - 1987. - V. 2646. - №87. - P.341 -349.

62. Chersi A, Pugliese O, Federico A, Viora M. Short synthetic peptides derived from viral proteins compete with HIV gpl20 for the binding to CD4 receptors. //Virol Immunol. 2000. - V. 13. - №4. - P.547-54.

63. Clavel F., Guetard D., Brun-Vezinel F. ,Chamaret S., Rey MA, Santos-Ferreira MO, Laurent AG, Dauguest C, Katlama C, Rouzioux C. Isolation of a new Human Retravirus from African Patients wilh AIDS // Science. 1986. -V. 233. 91842,-P.343-346.

64. Costiqliola P., Tumietto F., Ricchi E. and Chiodo F. Detection of circulating p24 antigen-positive CD4+ cells during HIV infection by flow cytometry. //AIDS. 1992. - V. 6. - P.l 121 -1125.

65. Cue J.I., DiPiro J.T., Brunner L.J., Doran J.E., Blanken-ship M.E.,

66. Mansberqer A.R., Hawkins ML. Reconstituted high density lipoprotein inhibitsphysiologic and tumor necrosis factor alpha responses to lipopolysaccharide in rabbits.// Arch. Surg. 1994. - V. 129. - P. 193-7.

67. Deen K.C., McDougal J.S., Inacker R.,Folena-Wasserman G, Arthos A. soluble form of CD4 (T4) protein inhibits AIDS virus infection. // Nature. -1988.-V. 331. 6151,-P.82-84.

68. Dicker P., Rosengurt E. Phorbol esters and vasopressin stimulate DNA synthesis by a common mechanism. //Nature. 1980. - V. 287. - P.607-612.

69. Eisenberg D. and Wesson M. The most highly amphiphlic alpha-helices include two amino acid segments in human immunodeficiency virus glycoprotein 41. //Biopolimers. 1?90. - V. 29. - P.171-177.

70. Eisenberg S. High density lipoprotein metabolism.// J.Lipid.Res. 1984. -V.25. - P.l017-1058.

71. Engelman D.M., Henderson R., McLachland A.D., and Wallace В A. Path of the polypeptide in bacteriorhodopsin. // PNAS USA. 1980. - V. 77. -P.2023-2027.

72. Finberg R.W., Diamond D.C., Mitchell D.B., Rosenstein Y, Soman G, Norman TC, Schreiber SL, Barakcoff SJ. et al. Prevention of HIV-1 infection and preservation of CD4 function by the of CPFs to gpI20. // Science. 1990. -V. 249. - P.287-291.

73. Fisher A.G., Ensoli В., Looney D. , Rose A, Saag MS, Shaw GM, Hahn BH, Wong-Staal F. Biologically HIV-1 isolate. // Nature. 1988. - V. 334.4. P.444-447. •i

74. Fouts T. R., Binley J. M., Trkola A., Robinson J. E. and Moore J. P.

75. Neutralization of the human immunodeficiency virus type 1 primary isolate JR

76. FL by human monoclonal antibodies correlates with antibody binding to theoligomeric form of the envelope glycoprotein complex. //J.Virol. 1997. 1. V.71. P.2779-2785.

77. Frank P.G. and Marcel Y.L. Apolipoprotein A-I: structure;-function relationships. // Journal of Lipid Research. 2000. - V.41. - № 6. - P.853-872.

78. Fujii G., Horvath S., Woodward S., Eiserling F., Eisenberg D. A molecular model for membrane fusion based on solution studies of an amphiphilic peptide from HIV gp41. //Protein Sci. 1992. - V.l. - №11. -P. 1454-64.

79. Fuller T.C., Trevithick J.E., Fuller A.A. , Colvin RB, Cosimi AB, Kung PC. Antigenic polymorphism of the T4 differentiation antigen expressed on human T helper/inducer lymphocytes. // Human Immunology. 1984. - V. 9. — №2.-P.89-102.

80. Gallaher W.R.,Ball J.M., Carry R.F. Griffin MC, Montelaro RC. A.1general model for the transmembrane proteins of Hiv and other retroviruses. // AIDS Res. Hum. Retrovir. 1989. - V. 5. - № 4. - P.431-440.

81. Gallo R.C., Montagnier L. AIDS in 1988. // Sci. American, 1988. -V.259.-P.l-48.

82. Gelderblom H.R., Ozel M., Pauli G. Morphogenesis and morphology of HIV. Structure-function relations. // Arch.Virol. 1989. - V.106. - №1-2. -P.l-13.

83. Ghiselli G., Schaefer E.J., Light J.A., and Brewer H.B.Jr. Apolipoprotein A-I isoforms in human lymph: effect of fat absorption. //J Lipid Res. 1983. -V. 24. -P.731-736.

84. Green P., Glickman R. Intestinal lipoprotein metabolism. //J Lipid Res. -1981 V.22.-№ 8. - P.l 153-73.

85. Groopman J.E. Antiretroviral therapy and immunomodulalors in patients.

86. J.Med. 1991. - V.90. - P. 18-21.t

87. Hatch F.T., Lees R.S. Practical methods for plasma lipoprotein analysis. // Adv Lipid Res. 1968. - V.6. - P.2-68.

88. Helseth, E., M. Kowalski, D. Gabuzda, U. Olshevsky, W. Haseltine, and J. Sodroski. Rapid complementation assays measuring replicative potential of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein mutants. //J.Virol. 1990. - V 64. - P.2416-2420.

89. Hemming A., Lundberg L., Olofsson S. A stategy simplifying site-directed mulagenesis in the CD4-binding region of HIV gpI20 // Arch. Virol. -1989. 107. - №3-4. - P.301-305.

90. Jackson R.L., Morrisett J.D., Gotto A.M., Segrest J.P. The mechanism of lipid-binding by plasma lipoproteins. // Mol. Cell. Biochem. 1975. - V.6. -P.43-50.

91. James W., Weiss RA., Simon J.H. The receptor for HIV: dissection of CD4 and studies on putative accessory factors. // Curr Top Microbiol Immunol.- 1996. V.205. - P.l 37-58.

92. Jonas A., Krajnovich D. J., Patterson B. W. Physical properties of isolatedcomplexes of human and bovine A-I apolipoproteins with dimyristoylphosphatidylcholine. //J. Biol. Chem. 1977. - V.252. - P.2200-2205.

93. Jonas A., Steinmet: A., Churgay L. The number of amphipathic alpha--helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. // J. Biol. Chem.- 1993.-V.268.-P.1596.

94. Jones M.K., Anantharamaiah G.M. and Segrest J.P. Computer programs to identify and classify amphipathic alpha helical domains. //J Lipid Res. -1992. V.33. - P.287-296.

95. Kaiser E.T. and Kezdy F.J. Amphiphilic secondary structure: design of peptide hormones. //Science. 1984. - V. 223. - P.249 255.

96. Kretsinger R.H. Structure and evolution of calcium-modulated proteins.//CRC Grit Rev Biochem. 1980. - V 8. - № 2. - P.l 19-74.

97. Maddon J.P., Dalgleish A.G., McDougal J.S., Clapham PR, Weiss RA, Axel R. The T4 gene encodes the AIDS virus receptor and is expressed in the immune system and brain. // Cell. 1986. - V.47. - № 3. - P.333-348.

98. Maddon P.J., Littman G., Godfrey M., Maddon D.E., Chess L., Axel R.

99. The isolation and nucleotide sequence of a cDNA encoding the T cell surface protein T4: a new member of the immunoglobulin gene family. //Cell. 1985. -V.42 - № 1. - P.93-104.

100. Mahley R.W, Innerarity Th.L., Rail S.C., and Weisqraber K.H. Plasma lipoproteins: apolipoprotein structure and function. // J Lipid Res. 1984. -V.25. - P.l 277-1294.

101. Maiorano J.N. and Davidson W.S. The Orientation of Helix 4 in Apolipoprotein A-I-containing Reconstituted High Density Lipoproteins. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - №23. - P. 17374-17380.

102. Martin L.S., McDougal J.S., Loskoski J.L Desinfection and inactivation of HIV. // J.Infect.Dis. -1985. -V. 152, №2. - P.400-403.

103. Matsuda S., Gidlund M., Chiodi F. Enhancement of HIV replication inihuman monocytes by low litres of anti-HIV antibodies in vilro. // Scand. J. Immunol. 1989. - V. 30. - P.425-434.

104. Matsuda Z., Chou M.J., Matsuda M., Huang JH, Chen YM, Redfield R, Mayer K, Essex M, Lee TH. HIV-1 has an additional coding sequence in the central region of the genome. // PNAS USA. 1988. - V. 85. - №18. -P.6968-6972.

105. Matsushita S., Robert-Guroff M., Rusche J. Characlerizalion of a HIV neutralizing monoclonal antibody and mapping of the neutralizing epitope. // J. Virol. 1988. - V. 62. - №6. - P.2107-2114.

106. Mazerolles F., Durandy A., Piatier-Tonneau D., Charron D, Montagnieri1., Affray C, Fisher A. Immunosupressive properties of synthetic peptides derived from CD4 and HLA-DR antigens // Cell. 1988. - V. 55. - №4. -P.497-504.

107. Meng Q.H., Calabresi L., Fntchart J.C., Marcel Y.L. Apolipoprotein A-I domains involved in the activation of lecithinicholesterol acyltransferase. Importance of the central domain. // J Biol Chem. 1993. - V.268. -P. 16966-73.i

108. Montagnier L., Gougcon M.L., Olivier R. et al. Factors and mechanisms of AIDS pathogenesis. // Science challenging AIDS. Basel, Karger. 1992. -P.51-70.

109. Moore J.P., Morikawa Y. Rinding of recombinant HLV-1 and HIV-2 SU glycoproteins to sCD4. // J.AIDS. 1991. - V. 4. - №4. - P.442-443.

110. Morgan D.A., Ruscetti F.W., Gallo R.C., 1976. Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows. // Science. 1976. - V.' 193(4257) -P.1007-8.

111. Morgan R.A., Looney D.J., Muenchau D.D. et al. Retroviral vectors expressing soluble CD4: a potential gene therapy for AIDS. // AIDS Res. Hum. Retrovir. 1990. - V. 6. - №2. - РЛ 83-191.

112. Myszka DG, Sweet RW, Hensley P, Brigham-Burke M, Kwong PD, Hendrickson WA, Wyatt R, Sodroski J, Doyle ML. Energetics of the HIV gpl20-CD4 binding reaction. //PNAS USA. 2000.- V.97(16). - P.9026-31.

113. Nanjee M. and Miller N. The very-high-density lipoprotein fraction of rabbit plasma is rich in tissue-derived cholesterol. // Biochim Biophys Acta.1991.-V. 1086. № 2. - P.241 -4.

114. Nichols, A.V., Gong, E.L., Blanche P.J., Forte T.M. and Shore V.G. HDL population: origin and interconversion. • // Hihh Density. Lipoproteins and Aterosclerosis/Ed by N.E. Miller. Amsterdam: Elsevier. - 1989. - P.l59-171.

115. Nolle R.T., Atkinson D. Conformational analysis of apolipoprotein A-I and E-3 based on primary sequence and circular dichroism. // Biophys. J.1992. V.63. - P.1221-39.

116. Owens B.J., Anantharamaiah G.M., Kahlon J.B., Srinivas R.V., Compans R.W., Segrest J.P. Apo A-I and its: amphipathic helix peptide analogues inhibit human immunodeficiency virus induced syncytium formation. // J.Clin.Invest. - 1990. -V. 86. -P.l 142.

117. Ponsin G., Hester L., Gotto A.M Jr, Pownall H.J. and Sparrow J.T. Lipid-peptide association and activation of lecithin:cholesterol acyltransferase. Effect of alpha-helicity. // J.Biol.Chem. 1986. - V.261. - P.9201-9205.

118. Rail S.C., Weisgraber K.H., Mahley R. W. et al. Abnormal lecithin: sterol cholesterol acyltransferase activation by a human apolipoprotein A-I variant in wich a single lysine residue is deleted. // J. Biol. Chem. 1984. - V.259. -P. 10063-10070.

119. Ratner L. Haseltine W., Patarca R., Livak KJ, Starcich B, Joserps SF, Doran ER, Rafalski JA, Whitehorn EA, Baumeister K. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III // Nature. 1985. - V.313. - Jan24-31. -P.277-284.

120. Rensen P.C., van Berkel TJ. Apolipoprotein E effectively inhibits lipoprotein lipase-mediated lipolysis of chylomicron-like triglyceride-rich lipid emulsions in vitro and in vivo. // J Biol Chem. 1996: - V. 271. - P. 14791 -14.

121. Reschly E.J., Sorci-Thomas M.G., Davidson W.S., Meredith S.C., Reardon C.A., Getz G.S. Apolipoprotein A-I alpha -Helices 7 and 8 Modulate

122. High Density Lipoprotein Subclass Distribution. // J.Biol.Chem. 2002 -V.277. - №12. - P.9645 - 9654.

123. Robinson W.E. Antibody-dependent enhancement of HIV and SIV infection; domain mapping and vaccines. // Retroviruses of human AIDS and related animal dis. 1990. - P.l61-167.

124. Rogers M.F., Shaffer N. Reducing the risk of maternal-infant transmission of HIV by attacking the virus. //N.Engl.J.Med. 1999. - V.341. - №6. -P.441-3.

125. Rye K.A., Hime N.J. and Barter P. The influence of cholesteryl ester transfer protein on the composition, size, and structure of spherical, reconstituted high density lipoproteins.// J.Biol.Chem. 1995. - V.270. - №1. -P 189-96.

126. Sakaida H., Hori Т., Sato A., Nakajima Т., Shida H., Yoshie O.,

127. Uchiyama T. Delineation of CXCR-4 as an entry cofactor for T-tropic VIH-1 byimonoclonal antibodies. //Immunology Letters. 1997. - V. 56. - №5. -P. 15-27.

128. Sattentau Q.J., Dalgleish A.G., Weiss R.A., Beverley P.C. Epilopes of the CD4 antigen and HIV infection // Science. 1986. - V. 234. - P.l 120-1123.

129. Schaefer E.J., Zech L.A., Schwartz D.E., and Brewer H.B. Coronary heart disease prevalence and other clinical features in familial high-density lipoprotein, deficiency (Tangier disease)// Ann. Intern. Med. 1980. - V. 93. - №2. -P.261-266.

130. Schrier H.D., Gann J.W., Langlois A.J. B- and T-lymphocyte responsesto an immunodominant epitope of VIH. //J.Virol. 1988. - V. 62. - №8. —.i1. P.2531-2536.

131. Segrest J.P., Jones M.K., DeLoof H., Brouilleite Ch.G., Venkatachalapathi Y.V. and Anantharamaiah, G M. The amphipathic helix in the exchangeable apolipoproteins: a review of secondary structure and function. // Lipid Res. 1992. - V.33. - P.141-66.

132. Seigel LJ, Nash WG, Poiesz BJ, Moore JL, O'Brien SJ, R.C.Gallo et al., 1986. Dynamic and nonspecific dispersal of human T-cell leukemia/lymphoma virus type-I integration in cultured lymphoma cells. // Virology. 1986. — V.154. -№1. - P.67-75.

133. Shen X.Y., Angel A. Identification of high density lipoprotein binding proteins in mature adipocyte plasma membranes. //Biochem Cell Biol. 1993. — V. 71.-№7-8.-P.348-5.

134. Siliciano R.F., Lawton Т.,' KnaH C. et al. Analysis of host-virus interactions in AIDS with anti-gpl20 T cell clones: effect of HIV sequence variation and a mechanism for CD4+ cell depletion // Cell. 1988. - V. 54. — №4.-P.561-575.

135. Singh LP. Chopra A.K., Coppenhaver D.H., Ananatharamaiah G.M., Baron S. Lipoproteins account for part of the broad non-specific antiviral activity of human serum. // Antiviral Res. 1999. - V. 42. - №3. - P.211-8.

136. Sparrow J.T. and Gotto A.M. Phospholipid binding studies with synthetic apolipoprotein fragments. // Ann. N Y. Acad. Sci. 1980. - V. 348. -P.187-211.с

137. Sparrow, J.T., and Gotto A.M. Apolipoprotein-Iipid interactions: studies wich synthetic polypeptides. //CRC Crit. Rev. Biochem. 1982. - V. 13. -P.87-107.

138. SPSS Base 8,0 для Windows™. Руководство по применению. M. 1998. C.117-121.

139. Srinivas R.V., Birkedal В., Owens R.J., Anantharamaiah G.M., Segrest J.P., Compans R.W. Antiviral effects of apoA-I synthetic amphipathic peptide analogs // Virology. 1990. - V .17(5. - P.48.

140. Swaney J.B. Membrane cholesterol uptake by recombinant lipoproteins. // Chem Phys Lipids. 1985. - V.37. - P.317-327.

141. Tada N., Sakamoto Т., Kagami A., Mochizuki. K., Kurosaka K. Antimicrobial activity of lipoprotein particles containing apolipoprotein A-l. // Mol Cell Biochem. 1993. - V. 119. - P.171-8.

142. Talussot C., Ponsin G. The transformation of nascent disc shaped high density lipoproteins into mature spherical high density lipoproteins:, conformational analysis of apolipoprotein A-I in model intermediate particles.

143. J Theor Biol. 1994. - V. 169. № 2. - P.143-52.i t

144. Traunecker A., Luke W., Kaijalaincn K. Soluble CD4 molecules neutralise HI"V-l. //Nature. 1988. -V. 331, 6151, 84-86.

145. Veljkovic V., Metlas R. Sequence similarity between HIV-1 envelope protein (gpl20) and human proteins; a new hypothesis on protective antibody production // Immunol. Letters. 1990. - V. 26. - № 2. - P. 193-196.

146. Vitello L.B., Scanu A.M. Studies on human serum high density lipoproteins. Self-association of apolipoprotein A-I in aqueous solutions. // J. Biol. Chem. 1976. - V. 251. - P. 1131 -1136.

147. Weigand K., Otto I., Schopf R. Ficoll density separation of enzimatically.isolated rat liver cells. //Acta hepatp-gastroenterol. -1974. V. 21., - P.245-253 '

148. Weiss R.A. NIH severs ties with researcher who experimented on embryos. // Washington Post. 1997. Jan 9; - P.A6-7.

149. Wright S. Examining what residents look for in their role models. //Acad Med. 1996. - V 71. - №3. - P 290-2.

150. Wurfel M.M., Kunitake S.T., Lichtenstein H., Karre J.P., Wright S.D. Lipopolysaccharide (LPS)-binding protein is carried on lipoproteins and acts as a cofactor in the neutralization of LPS. // J Exp Med. 1994. - V. 180. -P.1025-35.

151. Zasloff M., Martin B. and Chen H.C. Antimicrobial activity of synthetic magainin peptides and several analogues. //PNAS USA. 1988. - V. 85. -P.910-913.

152. Zorich N.L., Kezdy K., Jonas A. Properties of discoidal complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines containing various fatty acid chains.//Biochim biophys acta. 1987. - V. 919. - P. 181-91.