Структура и анализ генома вируса Карши

Ляпина, Ольга Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура и анализ генома вируса Карши
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура и анализ генома вируса Карши"

На правах рукописи

Лялина Ольга Викторовна

СТРУКТУРА И АНАЗИЗ ГЕНОМА ВИРУСА КАРШИ

03.00.03.-молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в ГУ НИИ Вирусологии имени Д.И. Ивановского Российской Академии Медицинских наук

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Прилипов Алексей Геннадьевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук,профессор Гараев Мансур Мухамедович

Доктор биологических наук, Ляпустин Виктор Николаевич

Ведущая организация:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится « 22 » мая 2006 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

Автореферат разослан« 20 » апреля 2006 г.

Учёный секретарь диссертационного Совета

Доктор медицинских наук Н. П. Косякова

JMSA

T-U5~' 1

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.

Род Flavivirus включает в себя более 80 представителей, многие из которых вызывают опасные заболевания человека. Особый интерес для практической медицины и науки представляет группа вирусов этого рода, объединённых в антигенный комплекс клещевого энцефалита (ККЭ). За последние 30-40 лет в России и ряде стран мира был отмечен рост заболеваемости людей, связанный с вирусами данной антигенной группы. Для разработки адекватной стратегии борьбы с тяжёлыми инфекциями, вызванными этими вирусами, применения наиболее эффективных методов диагностики, профилактики и лечения необходимо правильно представлять всё многообразие вирусов антигенной группы клещевого энцефалита.

Современная классификация вирусов, входящих в антигенный комплекс клещевого энцефалита, далека от совершенной. По-прежнему ведутся дискуссии о величине различий в таксономических рангах внутри данной группы. Изучение иммунологических свойств вирусных антигенов с помощью современных методов позволило более точно определить таксономическое положение вирусов в пределах семейства и рода. Для детализации этого положения необходимо учитывать иммунологические и генетические свойства вируса, однако молекулярно-генетическое изучение генома вируса даёт наиболее адекватное представление.

В результате комплексного обследования, которое провели сотрудники Института вирусологии имени Д.И. Ивановского во главе с академиком Д.К. Львовым, в конце прошлого столетия на территории СССР была определена локализация природных очагов различных арбовирусных инфекций, в том числе для ранее неизвестных флавивирусов. Так, в 1972 г., из клещей Ornithodoros papillipes, собранных в окрестностях Каршинской степи Узбекистана, был выделен инфекционный агент, позднее идентифицированный как новый вирус Карши (KSIV или Karshi virus), отнесённый к роду Flavivirus (Lvov D.K. et al.,

1036).НАЦИОНАЛЬНАЯ ! БИБЛИОТЕКА /|

од жь^'Т ,

Вирус Карши является эндемичным для стран Средней Азии и Казахстана. Он является слабопатогенным для человека и вызывает заболевание под названием лихорадка Карши. Описаны случаи заболевания лихорадкой Карши людей в Казахстане (в других странах не проводились подобные исследования). Этиология заболевания изначально была определена не верно (Каримов С.К., Кирющенко Т.В., 1980), вследствие того, что диагностика и патология этого вируса для человека исследована не достаточно.

Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению представителей рода Flavivirus, по-прежнему отсутствуют данные о точном систематическом положении и структурных особенностях многих из них. Так, исследования вируса Карши, основанные только на биологических и иммунологических свойствах этого вируса, более 10 лет не приводили к точному установлению его положения внутри рода Flavivirus. С совершенствованием иммунологических методов исследования и появлением первых данных о первичной структуре небольшого участка гена NS5 вируса Карши, его отнесли к ККЭ (Calisher СН., 1988).

Остаётся нерешённым вопрос и о точном таксономическом положении вируса Карши среди представителей комплекса клещевого энцефалита, вследствие отсутствия данных о структуре его полного генома. Определение же таксономического положения малоизвестного вируса представляет собой непростую задачу, так как классификация, установленная Международным комитетом по таксономии вирусов, не является завершённой, и многие её положения оспариваются исследователями.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось определение первичной структуры полного генома вариантов вируса Карши (штаммы LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur), молекулярно-генетическая характеристика его генома и

определение систематического положения этого вируса среди представителей рода Flavivirus.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить первичную структуру полного генома штамма LEIV-2247 Uz вируса Карши, выделенного в Узбекистане.

2. Определить первичную структуру полного генома штамма LEIV-7192 Tur вируса Карши, изолированного в Туркмении.

3. Провести молекулярно-генетический анализ структуры полного генома, возможных структурных и неструктурных белков исследуемых штаммов вируса Карши, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными вирусами антигенного комплекса клещевого энцефалита.

4. Провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов Е, NS5 и полных геномов изолятов вируса Карши среди представителей рода Flavivirus.

5. Установить точное таксономическое положение штаммов LEJV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur вируса Карши внутри антигенного комплекса клещевого энцефалита, опираясь на данные о первичной структуре их полных геномов.

6. Разработать лабораторный вариант метода ОТ-ПЦР для избирательного выявления геномной РНК вируса Карши с использованием данных о нуклеотидных последовательностях известных штаммов.

Научная новизна и практическая значимость

Карши, и может быть использована в качестве эталонной для данного вируса при последующих анализах филогенетических взаимоотношений.

2. Определена полная первичная структура генома штамма LEIV-7192 Tur (10768 и.о.), изолированного в Туркмении и ранее отнесённого по иммунологическим свойствам к вирусу Карши.

3. Показано, что геном вируса Карши кодирует полипротеин, который впоследствии нарезается на 11 самостоятельных белков, так же как у остальных вирусов ККЭ. Предсказаны вероятные сайты N-гликозилирования, а также проанализированы функциональные сайты структурных белков.

4. В результате молекулярно-генетического анализа нуклеотидной и аминокислотной последовательностей белка Е нами были предсказаны нейротропные свойства исследуемых штаммов вируса Карши.

5. На основе определённой нуклеотидной последовательности была предсказана вторичная структура 5'-концевого нетранслируемого региона.

6. Молекулярно-генетическое сравнение вируса Карши с флавивирусами, для которых известны полноразмерные последовательности генома и гена NS5, позволяет нам утверждать, что вирус Карши равноудалён от всех представителей ККЭ и образует отдельный кластер внутри данной группы вирусов, к которому, по-видимому, принадлежит и вирус Royal Farm.

7. Установлено, на основании анализа нуклеотидной последовательности полного генома, что изученные штаммы LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur соответствуют разным генотипам одного вируса (значение дивергенции 5,5 %).

8. Создан лабораторный вариант ОТ-ПЦР, позволяющий специфично детектировать геномную РНК вируса Карши (на участке гена NS5) от других представителей комплекса клещевого энцефалита.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома вируса Карши штаммов LEIV-2247 Uz (10653 н.о.) и LEIV-7192 Тиг (10768 и.о.).

2. Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг вируса Карши позволяет использовать их в качестве эталонных представителей двух различных генотипов этой генетической линий. Сравнительный генетический анализ этих штаммов по нуклеотидным последовательностям полных геномов показал, что они различаются друг от друга на уровне характерном для разных субтипов вируса Tick-borne encephalitis virus.

3. Предсказаны сайты протеолитического расщепления полипротеина вируса Карши на 11 белков и проанализированы их важные функциональные сайты, в том числе jV-гликозилирования. Показано, что гликопротеин оболочки вириона вируса Карши наиболее похож на белок Е вирусов, вызывающих энцефалиты, к тому же в позиции 76 находится Thr, что ранее описано для нейротропных вирусов.

4. В ходе сравнительного анализа предсказанной вторичной структуры 5'-концевого нетранслируемого региона вируса Карши была показана его максимальная степень гомологии с аналогичным участком вируса Powassan, однако большая шпилечная структура имеет делецию протяжённостью 6 н.о.

5. Молекулярно-генетическое сравнение вируса Карши среди флавивирусов с известными полноразмерными последовательностями генома, а ткже генов Е и NS5 свидетельствует о том, что вирус Карши образует отдельный кластер внутри антигенного ККЭ, к которому, по-видимому, принадлежит вирус Royal Farm.

6. Сравнение результатов филогенетического анализа по нуклеотидной последовательности гена Е, гена NS5 и последовательности полного

генома вирусов, принадлежащих к комплексу клещевого энцефалита, показало, что эти данные хорошо коррелируют между собой. Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании любого из этих генов для установления филогенетических взаимоотношений штаммов вируса Карши в пределах антигенного ККЭ.

7. Создан вариант метода ОТ-ПЦР для выявления вируса Карши, позволяющий специфично детектировать различные варианты этого вируса от других представителей комплекса клещевого энцефалита. С помощью данной системы обнаружены варианты вируса Карши двух основных генетических линий, известных к настоящему времени.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 30 марта 2006 г.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (119 источников), содержит 9 таблиц и 22 рисунка.

По результатам работы опубликованы 3 печатные работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для определения нуклеотидной последовательности полного генома вируса Карши были использованы штаммы из коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН: LEIV-2247 Uz, выделенный из клещей Ornithodoros papillipes, собранных в Узбекистане, и LEIV-7192 Tur,

изолированного из клещей вида Ornithodoros caniceps, собранных в Туркмении. Эти штаммы были изолированы в период экспедиций 19691979 гг., когда было выделено более 500 изолятов, среди которых порядка 20 не были классифицированы.

Последовательность олигонуклеотидных прайм еров подбиралась с помощью программы Primer Premier 5.00 (Premier Biosoft International, США) с использованием нуклеотидных последовательностей различных изолятов ВБН, доступных в базе данных GeneBank. Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе (ABI PRISM 3100, США). Для построения алайментов использовали пакет программ DNASTAR V.3.12 (Lasergene, США). Построение филогенетических деревьев осуществляли на основе алгоритма "ближайшего соседа" в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 5000-кратным ресэмшшнгом (MEGA 3.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Определение первичной нуклеотидной последовательности генома вируса Карши (штамм LEIV-2247 Uz)

При амплификации первого фрагмента кДНК генома штамма LEIV-2247 Uz были использованы вырожденные олигонуклеотидные праймеры, подобранные для участка гена Е вируса Западного Нила. Для определения первичной структуры, ПЦР-фрагмент был клонирован в pGEM-T вектор и секвенирован с помощью универсальных праймеров M13F и M13R. В ходе филогенетического анализа по этому участку были определены ближайшие «родственники» вируса Карши (Tick-borne encephalitis virus, Powassan virus), нуклеотидные последовательности которых использовались при выборе универсальных праймеров.

Для подбора олигонуклеотидных праймеров мы также использовали данные из появившихся в момент проведения исследования работ [Кило,

1998] по структуре небольших участков генов NS5 (AF013381) и NS3 (AF297463) вируса Карши.

Впоследствии были отобраны 3 пары олигонуклеотидных праймеров, которые позволили амплифицировать практически полный геном исследуемого вируса в составе 3 перекрывающихся фрагментов ДНК размером 3-5 тыс. н.п. методом ОТ-ПЦР. Эти фрагменты ДНК были использованы для определения полной нуклеотидной последовательности генома исследуемого штамма.

2. Определение первичной нуклеотидной последовательности генома штамма LEIV-7192 Tur

В результате проведённых иммунологических исследований в лаборатории экологии вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского предполагалось, что штамм LEIV-7192 Tur является разновидностью вируса Карши. Поэтому на первом этапе работы по амплификации кДНК были использованы олигонуклеотидные праймеры, подобранные в результате анализа нуклеотидной последовательности штамма LEIV-2247 Uz. Географическая удалённость штаммов вируса Карши, выделенных в Узбекистане и Туркмении, предполагала различия в первичной структуре их геномной РНК. По этой причине для получения данных о полной первичной структуре штамма LEIV-7192 Tur использовались гетероспецифичные пары олигонуклеотидных праймеров для штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur, с помощью которых было получено несколько перекрывающихся фрагментов.

В ходе работы была определена нуклеотидная последовательность генома штамма LEIV-2247 Uz, составляющая 10653 н.о. и 10768 н.о. для изолята LEIV-7192 Tur (за исключением участка З'-нетранслируемых областей). Нуклеотидная последовательность генома вируса Карши 2-х штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur была депонирована в базу данных GenBank под номерами AY863002 (NC_006947) и DQ462443 соответственно.

Определённые нами нуклеотидные последовательности двух штаммов из Узбекистана и Туркмении являются первыми полноразмерными последовательностями генома вируса Карши и могут быть использованы в качестве эталонных для данного вируса при последующих анализах филогенетических взаимоотношений.

3. Анализ структуры полного генома вируса Карши

Анализ полученных нуклеотидных последовательностей полного генома (за исключением участка 3'-концевого нетранслируемого участка) этих штаммов и сопоставление с последовательностями других представителей ККЭ позволил обнаружить в их составе одну открытую рамку считывания, которая кодирует полипротеин протяжённостью 3416 а.о. В ходе исследования были предсказаны потенциальные сайты расщепления полипротеина вируса Карши на 3 структурных белка: С, ргМ, £ и 8 неструктурных: NSI, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5 и 2K (табл. 1). Подобное строение генома характерно для всех флавивирусов.

Таблица 1.

Структурная характеристика генома вируса Карши

Структурные элементы Положение в Положение Размер, Молекулярн

генома геноме, и.о. внутри полипротеина, а. к. а.к. ый вес, кДа

5 ИГР 1-127 - - -

Кодирующая область 128-10375 1-3416 3416 377,5

Прекапсидный (anchC) 128-463 1-112 112 12,5

Капсидный (С) 128-415 1-96 96 10,8

Премембранный (ргМ) 464-967 113-280 168 18,4

Мембранный (М) 743-967 206-280 75 8,3

Белок оболочки (Е) 968-2455 281-776 496 53,7

NS1 2456-3514 777-1129 353 39,0

NS2a 3515-4204 1130-1359 230 24,9

NS2b 4205-4597 1360-1490 131 14,3

NS3 4598-6457 1491-2110 620 69,1

NS4a 6458-6834 2111-2236 125 13,5

2К 6835-6904 2237-2259 23 2,3

NS4b 6905-7666 2260-2513 254 27,4

NS5 7667-10375 2514-3416 903 102,4

3UTP 10376- - - -

Продолжение таблицы 1.

Karshi virus LEIV-7192 Tur Karshi virus LEIV-2247 Uz

5'НТР/С * tgggg/MAGKA tgggg/MAGKA

С/ргМ RGKRR/LCLAI/ RGKRR/LCLA1

ргМ/Е APAYA/SRCVH APAYA/SRCVH

E/NS1 LGVGA/DQGCS LGVGA/DQGCS

NSl/NS2a STWA/SNVEL STWA/CNGEL

NS2a/NS2b HPKRR/SIGEP HPKRR/SIGEP

NS2b/NS3 TSARR/GELVF TSPRR/GELVF

NS3/NS4a ASSRR/GASEL ASCRR/GASEL

NS4a/2K PGKQR/SADDN PGKQR/SADDN

2K/NS4b GTVAA/NELGW GTVAA/NELGW

NS4b/NS5 SEPRR/GGGMG SEPRR/GGGAG

NS5/3'HTP** ESSII/taaga ESSII/taaga

А. Координаты расположения белков в полипротеина. Отсчёт положения в геноме ведвтся с 1 и.о. 5' не кодирующего основания. НТР - яетранслируемый регион

Б. Сайты протеолитического расщепления в полипротеине штаммов вируса Карши. (*) сайты инициации и (**) терминации трансляции вирусного полипротеина

3.1. Рассмотрение особенностей белков

Предшественник белка ргМ имеет лишь один потенциальный сайт N-гликозилирования в позиции 32 а.о. Asn-Gly-Ser и 7 цистеиновых остатков. Как и у всех представителей ККЭ, гликопротеин оболочки Е вируса Карши включает в себя 12 цистеиновых остатков (6 в домене I, 2 в домене II и 4 в остальных сегментах). Анализ аминокислотных последовательностей белка Е штаммов LEJV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur показал наличие трёх потенциальных сайтов N-гликозшшрования: в позиции 154 а.о. (с первого а.о. белка Е) Asn-Glu-Thr, 361 а.о. Asn-Pro-Thr и 473 а.о. Asn-Thr-Thr. Оказалось, что в позиции 76 домена II белка Е у обоих штаммов вируса Карши присутствует Thr-остаток. Некоторые исследователи полагают, что подобное расположение Thr характерно для вирусов, вызывающих энцефалиты, в отличие от вирусов, приводящих к различным формам геморрагических лихорадок, у которых в позиции 76 находится Ala (Lin D. et al., 2003).

Неструктурный белок вируса Карши NS1 содержит 4 возможных сайта N-гликозилирования: Asn-Leu-Thr (в положении 85 а.о. ), Asn-Pro-Ser (в позиции 94а.о.), Asn-Ala-Thr (в положении 208 а.о.) и Asn-Cys-Thr (в

положении 224 а.о.). Кроме того, в штамме LEIV-2247 Uz обнаружен дополнительный вероятный сайт N-гликозилирования в позиции 271 а.о. (Asn-Gly-Thr). Причём этот аминокислотный мотив не найден в белке NS1 штамма LEJV- 7192 Тиг.

Из анализа аминокислотных последовательностей геномов анализируемых штаммов длиной 3427 а.о. (начиная с ATG, до стоп-кодона, табл. 2) видно, что максимальная степень гомологии исследуемого штамма LEIV-2247 Uz вируса Карши наблюдалась со штаммами Vasilchenko восточносибирского субтипа и Soflin-HO дальневосточного

Таблица 2.

Степень гомологии по различным участкам генома штамма вируса Карши ЬЕТУ-224711г с другими штаммами вирусов, принадлежащих к антигенному комплексу клещевого энцефалита.

Название вируса

Степень гомологии со штаммом LEIV-2247 Uz вируса Карши (%)

(штамма) С preM E NSI NS NS NS3 NS 2K NS NS5 Поли

2a 2b 4a 4b про

теин

TBEV (Vasilchenko) 55,2 63,1 71,0 68,8 53,5 64,9 76,3 66,4 56,5 63,5 80,0 71,2

TBEV (Soflin-HO) 58,3 63,1 70,8 67,3 54,8 65,6 76,1 65,6 56,5 61,5* 80,2 71,2

TBEV (Senzhang) 57,3 63,7 70,8 67,3 54,3 65,6 76,0 66,4 56,5 61,5* 80,0 71,0

TBEV (0shima5-10) 57,3 63,7 71,0 67,6 54,3 65,6 76,0 66,4 56,5 61,5* 80,1 71,1

TBEV (Zausaev) 54,2 61,9 71,4 68,5 53,5 64,9 76,5 65,6 56,5 63,1 80,2 71,1

TBEV (Neudoerfl) 53,1 61,3 71,0 67,9 52,2 66,4 76,9 64,8 56,5 61,9 80,3 70,9

TBEV (263) 53,1 61,3 71,0 67,9 51,7 66,4 76,6 64,8 56,5 61,9 79,8 70,8

Powassan (LB) 52,1 55,4* 71,4 69,1 50,9 67,9 74,7 63,2 65,2 63,1 80,8 70,5

Alkhurma(1176) 55,2 62,5 67,9 68,3 44,8* 66,4 74,8 62,4 56,5 63,1 81,3 69,9

Deer tick (ctb30) 51,1 56,0 70,2 67,1* 49,1 67,9 74,0* 61,6* 65,2 63,1 80,6 69,8*

Langat (TP21) 53,1 60,7 69,6 67,3 50,4 64,9 75,8 64,8 56,5 63,5 80,3 70,3

Langat (E5) 53,1 60,7 69,4* 67,3 50,4 64,9 75,5 64,8 ? 63,5 80,2 70,2

Louping ill (369/T2) 51,0* 60,7 70,6 67,9 50,4 61,8* 76,0 65,6 ? 62,3 78,3* 69,8*

OHFV (Kubrin) 59,4 64,3 71,0 66,8 51,7 63,4 74,5 66,4 56,5 63,5 80,1 70,7

OHFV(Bogoluvovska) 59,4 64,3 70,8 66,8 51,7 63,4 74,5 66,4 56,5 633 80.1 70,7

Дивергенция (%) 49,0 44,6 30,6 32,9 55,2 38,2 26,0 38,4 38,5 21,7 30,2

OHFV - Omsk hemorrhagic fever virus TBEV - Tick-borne encephalitis virus

* - штаммы вирусов, которые с вирусом Карши имеют максимальный процент дивергенции. Жирным шрифтом выделены максимальные значения гомологии

субтипа вируса TBE (71,2%), а минимальная (69,8 %) с вирусом Deer tick (штамм ctb30) и Louping ill (штамм 369/Т2). Учитывая, что разница степени гомологии по полному полипротеину составила всего лишь 1,4%, а по отдельным белкам вирус Карши гомологичен почти с каждым представителем ККЭ, можно предположить, что анализируемый вирус равноудалён от всех рассмотренных представителей комплекса. Стоит отметить, что рекомбинация для генома вируса Карши с проанализированными вирусами ККЭ не установлена вследствие незначительной разницы значений гомологии (1,6-10%). В пользу этого свидетельствует проведённый нами анализ процента дивергенции по различным белкам и по полному полипротеину среди представителей группы клещевого энцефалита.

3.2.5'-концевая нетранслируемая область генома

Размер 5 '-нетранслируемого региона (НТР) вируса Карши составляет 127 н.о. В ходе работы была предсказана вторичная структура этого региона с применением программного обеспечения Gene Quest из пакета программ DNA STAR (рис. 1) и сопоставлена с аналогичными последовательностями других вирусов ККЭ.

Вторичная структура этого участка имеет элементы сходства со структурой нетранслируемых областей представителей ККЭ, близких к данному вирусу.

Самая маленькая шпилька содержит внутри себя консервативную последовательность. Внутри большой шпилечной структуры находится регион (позиции 58 - 82 н.о.), нуклеотидная последовательность которого весьма отличается от аналогичных структур близкородственных вирусов. У вируса Карши этот участок имеет в своём составе делецию в 6 н.о. В ходе анализа выровненных нуклеотидных последовательностей основных представителей ККЭ оказалось, что 5'НТР генома вируса Карши

демонстрирует наибольшую степень гомологии с аналогичным участком вируса Роыаазап (83,8 %).

Рисунок 1 Предсказанная вторичная структура 5ИТР РНК вируса Карши (штамм ЬЕТУ-7192 Тиг). Буквами А, Б и В отмечены основные шпилечные структуры.

4. Филогенетические взаимоотношения вируса Карши и других

Большинство исследователей рассматривают филогенетические взаимоотношения вирусов внутри рода Flavivirus по последовательности консервативного гена NS5, кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу. Поэтому для проведения аналогичного анализа по установлению филогенетических связей вируса Карши с различными представителями рода Flavivirus были взяты 82 штамма, для которых известна первичная структура полного генома или нуклеотидная последовательность участка гена,

представителей рода Flavivirus

кодирующая белок №5. В результате филогенетического анализа по участку гена ЛГ55 (рис. 2) можно утверждать, что вирус Карши принадлежит к антигенному комплексу клещевого энцефалита (Кипо еЛ. а!., 1998).

Рисунок 2. Филогенетическое древо рода Flavivirus по участку reHaNS5.

Филогенетический анализ с использованием аминокислотных последовательностей длиной 331 ак проводили на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 5000-кратным ресэмплингом (MEGA 3.1).

PPBV - Phnom Penh bat virus, CIV - Carey Island virus, DBV - Dakar bat virus, RBV - Rio Bravo virus, BBV - Bukalasa bat virus, SW - Sal Vieja virus, CRV - Cowbone Ridge virus, WNV - West Nile virus, TBEV - Tick-borne encephalitis virus, OHFV - Omsk hemorrhagic fever, EHV - Edge Hill virus, YFV - Yellow fever virus, ITMV - Israel turicey meoingoencephalitis virus, MVEV - Murray Valley encephalitis virus, JEV - Japanese encephalitis virus

a - группа вирусов, переносимые комарами (mosquite-borne virus)

б - группа вирусов, переносимые клещами (tick-bome virus)

в - группа вирусов, для которых не известен переносчик (no known vector virus)

Оказалось, что изучаемые штаммы вируса Карши наиболее близки к малоизученному вирусу Royal Farm. Вероятно, вместе они образуют отдельный кластер внутри антигенного ККЭ. Основываясь на филогенетическом анализе можно предположить, что рассматриваемые вирусы генетически удалены друг от друга на расстояния, превышающие межштаммовые различия. Так, генетическое расстояние по участку гена NS5 между вирусом Royal Farm и Карши составила 13,6-13,9 %, а между двумя предполагаемыми штаммами LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur - 3,0 %.

Представляет интерес уточнение филогенетического положения вируса Карши внутри группы клещевого энцефалита. Стоит заметить, что вопрос об уровне различий антигенных вариантов вирусов комплекса клещевого энцефалита неоднократно дискутировался и до сих пор остаётся открытым. С этой целью мы проанализировали максимальное количество разнообразных штаммов и вирусов, известных на сегодняшний день.

Было проведено филогенетическое сравнение штаммов по полным нуклеотидным последовательностям генома представителей комплекса ККЭ, известных на сегодняшний день (17 вирусов) со штаммами вируса Карши (рис. 3).

Оказалось, что штамм LEIV-2247 Uz имеет максимальную степень гомологии со штаммами Vasilchenko восточносибирского субтипа и Sojjin-НО дальневосточного субтипа вируса TBE (71,2 %) и минимальную (69,8 %) с вирусом Deer tick (штамм ctb30) и Louping ill (штамм 369/Т2). Максимальная степень гомологии штамма LEIV-7192 Tur была со штаммом Vasilchenko вируса TBE (71,0 %), а минимальная с вирусом Deer tick (69,5 %). Можно предположить, что анализируемый вирус достаточно удалён от всех представителей своего серокомплекса и образует отдельную генетическую ветвь. К сожалению, из-за отсутствия знаний о структуре полного генома вируса Royal Farm мы не можем оценить его степень гомологии со штаммами вируса Карши.

16 Штаммы Нозологическая единица

wo г loo Г

100

00|— £

100

Osbima 5-10-1 TBE Sofjin-HO [(дальневосточный Senzhang J сУб™п) Уяпяяв I TBE

г (восточносибирский Vasilchenko J субгип)

369/T2

- Hypr ~ Neudoerfl

г 263 BogoJuvovska Kubrin TP21 E5 1176 ctb30 LB

Louping ill v

"] TBE г (западный субгип)

]■ OHFV

Langat v.

Alkhurma v. Deer tick v. Powassan v.

LETV-2247 Uz 1 LEIV-7192 Tur J Ast04-2-824A

Karshiv. WNV

Рисунок 3. Филогенетическое древо для вирусов, принадлежащих к антигенному комплексу клещевого энцефалита с известным полным геномом.

Филогенетический анализ с использованием аминокислотных последовательностей длиной 3421 ак проводили на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 5000-кратным ресэмшшнгом (MEGA 3.1). В качестве аутгруппы был взят штамм вируса Западного Нила (WNV)

OHFV - Omsk hemorrhagic fever TBEV - Tick-borne encephalitis vims

Географическая удалённость штаммов вируса Карши, выделенных в Узбекистане и Туркмении, позволила предположить о различиях в первичной структуре их геномной РНК. Учитывая противоречия, которые возникли по вопросу классификации представителей данного комплекса, важно оценить являются ли изоляты LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur генетическими разновидностями одного вируса Карши или же разными вирусами. Генетическое расстояние, оцененное на основании полной первичной структуры генома (рис.3), между штаммами вируса Карши (дивергенция 5,5 %) сопоставимо с различиями между субтипами TBEV

(дивергенция 4,9-7,1 %). Следовательно, изоляты анализируемого вируса следует рассматривать как различные генотипы вируса Карши.

К сожалению, не для всех представителей анализируемой нами антигенной группы известна структура полного генома, поэтому многими исследователями для установления положения вирусов внутри антигенного комплекса клещевого энцефалита использовались аминокислотные или нуклеотидные последовательности генов Е и NS5 или даже их участков.

Для того чтобы ответить на вопрос о правомерности использования участка гена Е и NS5 для филогении, были сопоставлены данные филогенетических анализов по перечисленным генам с данными по полному геному. При сравнении дендрограмм оказалось, что они хорошо коррелируют между собой, при этом топология всех ветвей была аналогичной, менялись лишь относительные величины длин филогенетических ветвей. Следовательно, можно говорить о правомерности использования нуклеотидных последовательностей генов Е и NSS для естественной классификации вирусов ККЭ.

В международной базе данных Gen Bank по гену, кодирующему гликопротеин оболочки вириона (Е), опубликовано максимальное количество нуклеотидных и аминокислотных последовательностей различных штаммов и вирусов рассматриваемого комплекса. Филогенетический анализ с использованием нуклеотидных последовательностей всех известных представителей комплекса клещевого энцефалита (рис. 4) достоверно подтвердил ранее продемонстрированные в данной работе представления о положении внутри него вируса Карши. Топология распределения основных генетических кластеров аналогична предыдущим исследованиям. Исследуемые изоляты вируса Карши отличаются от других представителей антигенного комплекса. Минимальное значение дивергенции, определённое по участку гена Е, штаммов вируса Карши оказалось со штаммом 1467 TBEV 30,4 %, отнесённого к восточносибирскому субтипу, а максимальное - со штаммом N132 дальневосточного субтипа TBEV(38,9 %).

Greek goat

TBEV (восточносибирский субтвп)

Negisiii v.

TBEV \ly (дальневосточный"""^ cytfrnm)

Powassan v. Deer tick v.

LEIV-2247 Uz LETV-7192 Tnr .

Karskl vurtes

Gully v.

Рисунок 4. Филогенетическое древо для штаммов вирусов комплекса клещевого энцефалита по участку белка Б.

Филогенетический анализ с использованием аминокислотных последовательностей длиной 126 ах проводили на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 5000-кратным ресэмплингом (MEGA 3.1).

TBEV - Tick-borne encephalitis virus

Если мы рассмотрим неоднородный кластер вируса Рстазяап, то значения дивергенции вируса Карши относительно этой группы находятся в диапазоне 31,5 - 38,6%. Это снова подтверждает предположение о том, что он равноудалён относительно всех известных представителей ККЭ.

Не так давно вирус Карши наряду с вирусом Gadgets Gully был относён к различным субтипам вируса Royal Farm [Gritsun T.S., 2003]. Мы оценили генетические расстояния между этими вирусами и сопоставили их с показателями дивергенции между различными вирусами, а также между субтипами и генотипами одной генетической ветви среди представителей ККЭ. Сравнительный анализ был проведён по участку гена NS5 (1000 и.о.), так как по нему известны последовательности всех трёх анализируемых вирусов (рис 2.).

Оказалось, что значения дивергенции между вирусами Gadgets Gully и Карши (14,8-16 %), Gadgets Gully и Royal Farm (16,3 %), а также между Royal Farm и Карши (13-13,3 %) значительно превышают показатели дивергенции между различными субтипами TBEV (2,7-7 %) и сопоставимы с генетическими расстояниями между различными вирусами в пределах ККЭ. Следовательно, все три вируса не являются субтипами одного вируса, каждый из них представляет собой отдельную генетическую ветвь. Тем не менее, к вирусу Карши наиболее близок вирус Royal Farm, выделенный в Афганистане.

5. Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР для специфичной

детекции геномной РНК вируса Карши

С использованием данных о структуре геномов различных генотипов вирусов Карши был создан лабораторный вариант ОТ-ПЦР для выявления геномной РНК вируса Карши (рис. 5). Условия данного метода были оптимизированы, а система ОТ-ПЦР проверена на специфичность с различными представителями ККЭ.

С помощью данной системы обнаружены варианты вируса Карши двух основных генетических линий, известных к настоящему времени.

А.

.7667

, Ген N55

10375

кДНК синтез

»1011»

1 раунд ПЦР ШЩ*_т™_

2раундПЦР ВД--^

КЭГУ (1,Е1У-2247 иг) КБ1У (ЬЕ1У-7192 Тиг) Langat V. (ТР21) Ьоирл-пд 111 V. (396/Т2) ОНГУ (КиЬг1п) Рсжаээап V. (ЬВ) Оеег Ыск V. (с1:Ь30) ТВЕУ (гепЬага) ТВЕУ (Кеис1оег£1) А1кЬигта V. (1176)

8281К

8275К 5,-ТТСТССА6СААСТСААСССАТ-3' 5'- ААССССТТСТССАССААСТС -3' еОТСАСАААСССТТТСТССАСАААСТСОАСССАТСАС АСТТАЗАААССССТТСТССАСОААСТСААСССАТСАС

Т-----в-СА—-Т--Т---С-А—Т—С--------А

А-----З-СТ--------А-----------Т—С---

А---С-С-СТ--------А—А—Т------------

Т------вТ---Т-----АС----Т—С--------А

Т------СТ—Т-----АС----Т—С—А------

С-----в-С---Т-----в-----Т-----------А

с-----с-С—Т—Т—А--------С---------

А—СС-СвТ------Т—С-С--Т--С—в------

8971К

5'- (ЗСТСТСССТСТТСАТСААСС -3' ААССТ(МТТ(аТСАА(»АС<3®5АССТС ААССТвСТТОАТСААСАвССАСАеСТС

-СТ—Т-----С-СТ---А------С-

ес---С—в-----в-Т-А-----Авв

С-Т-----в—С------А----ААвв

—АТ----в-----------СТССАвА

--------с-----------СТСТАбА

С_С—С„(3---------А-----АБА

Св---С—в---------А----ДАОй

-06—Т------------А-----АБА

910111

У-ССАвССААСЗАТАСТТ-З' СТТСЙАСТАТСТТСбСТСССТТТТС ССТСААСТАТСТТС(ЗСТ<ЗССТТСТС

-С-С-----С—й—й----А-Т—

-Т-А-----С—С—Т----АСС-С

ТС-С-----С—в—в----А-Т—

ТС-С--------Б--------БС-А

-с-с-----------т—т-ес-с

-т-в~т—с—в------ТАСС-С

-т-в-----с—в-------АСС-С

ТС-С-----С—в—А----АСТ—

Рисунок 5. Схематическое изображение ОТ-ПЦР тест-системы для детекции вируса Карши (А.). Стрелками обозначены направления олигонуклеотидных праймеров. Цифровые обозначения праймеров не точно соответствуют их координатам на вирусном геноме. В 1-ми 2-м раундах ПЦР указывалась длина получаемого ампликона. Б. Алаймент нуклеотидных последовательностей вирусов ККЭ участка отжига олигонуклеотидных праймеров.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлена первичная структура практически полного генома вируса Карши штамма LEIV-2247 Uz (10653 и.о.), выделенного в Узбекистане, и штамма LEIV-7192 Tur (10768 и.о.), изолированного в Туркмении. Проведено сравнительное изучение функциональных сайтов структурных и неструктурных белков и сайтов нарезания полипротеина между двумя штаммами вируса Карши и другими представителями комплекса клещевого энцефалита.

2. Определена первичная и предсказана вторичная структуры 5'-нетранслируемого региона вируса Карши. Сравнительный анализ этого участка генома вирусов комплекса клещевого энцефалита показал, что последовательность, образующая большую шпилечную структуру является вариабельной и несёт в своём составе делецию протяженностью 6 н.о.

3. Показано, что у изученных штаммов вируса Карши гликопротеин оболочки вириона Е имеет максимальное сходство с белками вирусов, вызывающих энцефалиты. Установлено, что оба штамма в позиции 76 белка Е имеют замену с Ala на Thr, что характерно для нейротропных вирусов комплекса клещевого энцефалита.

4. На основе полученных данных филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей генов Е и NS5, которые хорошо коррелируют с результатами филогенетического анализа полного генома, установлено, что вирус Карши равноудалён от всех представителей комплекса клещевого энцефалита и образует отдельный генетический кластер, к которому, по-видимому, принадлежит и вирус Royal Farm.

5. Сравнительный генетический анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur относительно других представителей комплекса клещевого

энцефалита позволил установить, что они принадлежат к разным генотипам вируса Карши.

6. На основе гена NS5 разработан лабораторный вариант ОТ-ПЦР для детекции геномной РНК вируса Карши, позволяющий специфично выявлять этот вирус среди других представителей комплекса клещевого энцефалита.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Lyapina O.V.,Prilipov A.G.,Gromashevsky V.L.Analysis of the complete genome sequence of Karshi virus. // Poster on the 2nd. European Congress of Virology (EuroVirology-2004). - Madrid, September 5-9.

2. Ляпина O.B., Громашевский В.Л., Прилипов А.Г. Организация генома вируса Карши (штамм LEIV-2247 Uz) и его филогенетические взаимоотношения с представителями рода Flavivirus. // Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. - 2006. - № 4. - стр. 28-32. (в печати)

3. Ляпина О.В. Структура и анализ генома вируса Карши. // Тезисы на 9-ую Международную Пущинскую школу-конференцию молодых ученых"Биология - наука XXI века". -18-22 апреля 2005.

4. Ляпина О.В., Прилипов А.Г., Громашевский В.Л. Полная нуклеотидная последовательность генома штамма LEIV-2247 Uz, депонированная в международную базу данных GenBank - AY863002 (NC_006947).

5. Ляпина О.В., Прилипов А.Г., Громашевский В.Л. Полная нуклеотидная последовательность генома штамма LEIV-7192 Тиг, депонированная в международную базу данных GenBank - DQ462443.

¿¿¿¿А

»-7925

Заказ№638. Объем! п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палта-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ra

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ляпина, Ольга Викторовна

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Экология вируса Карши и его географическое распространение.

1.2. Биологические свойства вируса Карши.

1.2.1. Патогенные свойства вируса.

1.2.2. Роль вируса Карши в патологии человека.

1.3. Иммунохимические характеристики вируса.

1.4. Таксономическое положение вируса Карши.

1.5. Молекулярно-биологические характеристики флавивирусов.

1.5.1. Структура генома флавивирусов.

1.5.2. Вирусные белки.

1.5.3. Репродуктивный цикл флавивирусов.

1.6. Филогенетические взаимоотношения представителей рода Flavivirus.

1.7. Проблемы классификации вирусов комплекса клещевого энцефалита.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Исследуемые штаммы.

2.2. Использованные олигонуклеотидные праймеры.

2.3. Выделение вирусной РНК.

2.4. Реакция обратной транскрипции.

2.5. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.6. Определение 5'-концевой последовательности геномной

2.7. Электрофорез ДНК.

2.8. Подготовка ДНК для секвенирования.

2.9. Секвенирование ДНК.

2.10. Построение алайментов и филогенетический анализ.

2.11. Клонирование ПЦР-фрагментов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Определение первичной нуклеотидной последовательности генома вируса Карши (штамм LEIV-2247 Uz).

3.2. Определение первичной нуклеотидной последовательности генома штамма LEIV-7192 Tur.

3.3. Анализ структуры полноразмерного генома вируса Карши.

3.3.1. Особенности организации белков вируса Карши.

3.3.2. 5'-нетранслируемая область генома.

3.4. Филогенетические взаимоотношения вируса Карши и других представителей рода Flavivirus.

3.5. Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР для детекции вируса Карши.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура и анализ генома вируса Карши"

Около ста лет назад Вальтер Рид описал патогенный для человека вирус жёлтой лихорадки, ставший типовым представителем рода Flavivirus семейства Flaviviridae. С тех пор были идентифицированы более 80 представителей этого рода, большинство из которых переносят комары или клещи. Представители этой группы вызывают опасные заболевания для человека и животных. Вирус Денге (.Denge virus), вирус Западного Нила (WNV), вирус японского (,JEV) и клещевого энцефалитов (TBEV) являются возбудителями тяжёлых заболеваний человека, нередко заканчивающихся летальным исходом [18].

Вопросы дифференциации и классификации вирусов рода Flavivirus и входящих в него вирусов комплекса клещевого энцефалита (ККЭ) являются важнейшими и имеют не только теоретический интерес, но и практическое значение, так как с ними связаны возможности усовершенствования диагностики и профилактики заболеваний, вызываемых этими вирусами. До настоящего времени эволюционные и генетические взаимоотношения между флавивирусами ясны не в полной мере, вследствие чего их таксономическое положение и классификация нуждаются в дальнейшем осмыслении и уточнении.

Актуальность проблемы

Особый интерес для практической медицины и науки представляет группа вирусов рода Flavivirus, объединённых в антигенный комплекс клещевого энцефалита. За последние 30-40 лет в России и ряде стран мира был отмечен рост заболеваемости людей, связанный с вирусами данной антигенной группы. Для разработки адекватной стратегии борьбы с тяжёлыми инфекциями, вызванными этими вирусами, применения наиболее эффективных методов диагностики, профилактики и лечения необходимо исчерпывающе представлять всё многообразие вирусов антигенной группы клещевого энцефалита.

Современная классификация вирусов, входящих в антигенный комплекс клещевого энцефалита, далека от совершенной. По-прежнему ведутся дискуссии о величине различий в таксономических рангах внутри данной группы. Изучение иммунохимических свойств вирусных антигенов с помощью современных методов позволило более точно определить таксономическое положение вирусов в пределах семейства и рода. Для детализации этого положения необходимо учитывать иммунологические и генетические свойства вируса, однако молекулярно-генетическое изучение генома вируса даёт наиболее адекватное представление.

В результате комплексного обследования, которое провели сотрудники Института вирусологии имени Д.И. Ивановского во главе с академиком Д.К. Львовым, в конце прошлого столетия на территории СССР была определена локализация природных очагов различных арбовирусных инфекций, в том числе для ранее неизвестных флавивирусов [10]. Так, в 1972 г., из клещей Ornithodoros papillipes, собранных в окрестностях Каршинской степи Узбекистана, был выделен инфекционный агент, позднее идентифицированный как новый вирус Карши (KSIV или Karshi virus), отнесённый к роду Flavivirus [73].

Вирус Карши является эндемичным для стран Средней Азии и Казахстана. Он является слабопатогенным для человека и вызывает лихорадочное заболевание. Описаны случаи заболевания лихорадкой Карши людей в Казахстане. Больным, инфицированным вирусом Карши через укус клеща, был поставлен диагноз острое респираторное заболевание. Последующие исследования иммунологических свойств антигена позволили идентифицировать вирус Карши как возбудителя [5]. Этиология заболевания изначально была определена не верно, вследствие того, что диагностика и патология этого вируса для человека исследована не достаточно. Для дальнейшего изучения экологии вируса и его роли в патологии человека большое значение имеет мониторинг с помощью специфичной детекции его геномной РНК.

Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению представителей рода Flavivirus, по-прежнему отсутствуют данные о точном систематическом положении и структурных особенностях многих из них. Так, исследования вируса Карши, основанные только на биологических и иммунологических свойствах этого вируса, в течение 10 лет не приводили к точному установлению его положения внутри рода Flavivirus. С совершенствованием иммунохимических методов диагностики и появлением первых данных о первичной структуре небольшого участка гена NS5 вируса Карши, его отнесли к ККЭ [20].

Оставался нерешённым вопрос и о таксономическом положении вируса Карши среди представителей комплекса клещевого энцефалита, вследствие отсутствия данных о структуре его полного генома. Определение же таксономического положения малоизвестного вируса представляет собой непростую задачу, так как классификация, установленная Международным комитетом по таксономии вирусов, не является завершённой, и многие её положения развиваются исследователями.

Для исчерпывающей характеристики штаммов вируса, необходимо знать полную нуклеотидную последовательность их геномов. К началу настоящих исследований данные о структуре полноразмерного генома вируса Карши отсутствовали.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось определение первичной структуры полного генома вариантов вируса Карши (штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг), молекулярно-генетическая характеристика его генома и определение систематического положения этого вируса среди представителей рода Flavivirus.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить первичную структуру полного генома штамма LEIV-2247 Uz вируса Карши, выделенного в Узбекистане.

2. Определить первичную структуру полного генома штамма LEIV-7192 Tur вируса Карши, изолированного в Туркмении.

3. Провести молекулярно-генетический анализ структуры полноразмерного генома, возможных структурных и неструктурных белков исследуемых штаммов вируса Карши, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными вирусами антигенного комплекса клещевого энцефалита.

4. Провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов Е, NS5 и полноразмерныхных геномов изолятов вируса Карши среди представителей рода Flavivirus.

5. Установить точное таксономическое положение штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг вируса Карши внутри антигенного комплекса клещевого энцефалита, опираясь на данные о первичной структуре их полноразмерных геномов.

Научная новизна и практическая значимость

1. Генетически охарактеризован, на основе определённой нами первичной структуры генома, штамм вируса Карши LEIV-2247 Uz (10653 и.о.), выделенный в Узбекистане. Последовательность генома этого штамма является первой полноразмерной последовательностью генома вируса Карши, и может быть использована в качестве эталонной для данного вируса при последующих анализах филогенетических взаимоотношений.

2. Определена полная первичная структура генома штамма LEIV-7192 Тиг (10768 и.о.), изолированного в Туркмении и ранее отнесённого по иммунохимическим свойствам к вирусу Карши.

3. Показано, что геном вируса Карши кодирует полипротеин, который впоследствии нарезается на 11 белков, так же как у остальных вирусов ККЭ. Предсказаны вероятные сайты vV-гликозилирования, а также проанализированы функциональные сайты структурных белков.

5. На основе определённой нуклеотидной последовательности была предсказана вторичная структура 5-концевого нетранслируемого региона.

7. ,На основании анализа полной нуклеотидной последовательности генома установлено, что изученные штаммы LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг соответствуют разным генотипам одного вируса (значение дивергенции 5,5 %).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома вируса Карши штаммов LEIV-2247 Uz (10653 н.о.) и LEIV-7192Tur (10768 н.о.).

2. Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг вируса Карши позволяет использовать их в качестве эталонных представителей двух различных генотипов этой генетической линий. Сравнительный генетический анализ этих штаммов по нуклеотидным последовательностям полных геномов показал, что они различаются друг от друга на уровне, характерном для разных субтипов вируса Tick-borne encephalitis.

3. Предсказаны сайты протеолитического расщепления полипротеина вируса Карши на 11 белков и проанализированы их важные функциональные сайты, в том числе iV-гликозилирования. Показано, что гликопротеин оболочки вириона вируса Карши наиболее похож на белок Е вирусов, вызывающих энцефалиты, кроме того, в позиции 76 находится Thr, что ранее описано для нейротропных вирусов.

4. В ходе сравнительного анализа предсказанной вторичной структуры 5'-концевого нетранслируемого региона вируса Карши была показана его наибольшая степень гомологии с аналогичным участком вируса Powassan. Большая шпилечная структура 5'-нетранслируемой области имеет делецию протяжённостью 6 н.о.

5. Молекулярно-генетическое сравнение вируса Карши среди флавивирусов с известными полноразмерными последовательностями генома, а также генов Е и NS5 свидетельствует о том, что вирус Карши образует отдельный кластер внутри антигенного ККЭ, к которому, по-видимому, принадлежит вирус Royal Farm.

6. Сравнение результатов филогенетического анализа по нуклеотидным последовательностям генов Е, NS5 и по полным последовательностям геномов вирусов, принадлежащих к комплексу клещевого энцефалита, показало, что эти данные хорошо коррелируют между собой. Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании любого из этих генов для установления филогенетических взаимоотношений штаммов вируса Карши в пределах антигенного ККЭ.

7. Создан вариант метода ОТ-ПЦР для выявления вируса Карши, позволяющий специфично детектировать варианты этого вируса от других представителей комплекса клещевого энцефалита. С помощью данной системы обнаружены варианты вируса Карши двух основных генетических линий, известных к настоящему времени.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ляпина, Ольга Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлена первичная структура практически полного генома вируса Карши штамма LEIV-2247 Uz (10653 и.о.), выделенного в Узбекистане, и штамма LEIV-7192 Тиг (10768 и.о.), изолированного в Туркмении. Проведено сравнительное изучение функциональных сайтов структурных и неструктурных белков и сайтов нарезания полипротеина между двумя штаммами вируса Карши и другими представителями комплекса клещевого энцефалита.

5. Сравнительный генетический анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг относительно других представителей комплекса клещевого энцефалита позволил установить, что они принадлежат к разным генотипам вируса Карши.

106

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Род Flavivirus включает в себя более 80 представителей, многие из которых вызывают опасные заболевания человека. Особый интерес для практической медицины и науки представляет группа вирусов этого рода, объединённая, в антигенный комплекс клещевого энцефалита. В последнюю четверть XX века в ряде стран мира был отмечен рост заболеваемости людей, связанных с вирусами данной антигенной группы (Omsk hemorrhagic fever virus, Tick-borne encephalitis virus, Powassan virus и Kyasanur forest disease virus). Для разработки адекватной стратегии борьбы с тяжёлыми инфекциями, вызванных этими вирусами, применения наиболее эффективных методов диагностики, профилактики и лечения необходимо правильно представлять всё многообразие вирусов антигенной группы клещевого энцефалита.

Одним из важнейших аспектов анализа эпидемиологической ситуации является объективная характеристика этиологического фактора заболевания, а именно: оценка генетической вариабельности вирусов, определение числа генотипов каждой генетической линии, уровней дивергенции вирусов и их генотипов, их географического распространения, связи с антигенными вариантами, патогенности, эволюционных взаимосвязей с родственными флавивирусами антигенного комплекса и, несомненно, таксономическое положение.

Существование различных методических подходов, оценочных критериев разных исследователей создаёт дополнительные трудности в классификации вирусов комплекса клещевого энцефалита. По мнению Дж. Р. Стефенсона, современная номенклатура вирусов данного рода несовершенна, и поэтому необходимо принять новую номенклатуру, согласованную на международном уровне [11]. Несомненно, устранению недостатков в классификации будет способствовать использование данных, полученных молекулярно-биологическими методами исследования. Повидимому, новая классификация флавивирусов будет построена по принципу сравнения гомологии геномов для установления характера филогенетических взаимоотношений.

Вирус Карши является представителем комплекса клещевого энцефалита. Этот вирус является эндемичным для стран Средней Азии и Казахстана. Он является слабопатогенным для человека и вызывает заболевание под названием лихорадка Карши. Патология этого вируса для человека так до конца и не исследована. Это объясняется тем, что долгое время диагностика этого заболевания была ошибочной.

Остаётся нерешённым вопрос и о точном таксономическом положении вируса Карши среди представителей комплекса клещевого энцефалита, вследствие отсутствия каких-либо знаний о полной структуре его генома. В связи с этим, была предпринята попытка изучить структуру полного генома вируса Карши. К моменту выполнения данной работы в базе данных GenBank была представлена только нуклеотидная последовательность небольшого участка гена NS5 (AF013381) вируса Карши. Для определения нуклеотидной последовательности полного генома вируса Карши были использованы штаммы из коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН: LEIV-2247 Uz, выделенный из клещей Ornithodoros papillipes, собранных в Узбекистане, и LEIV-7192 Тиг, изолированного из клещей вида Ornithodoros caniceps, собранных в Туркмении. В ходе работы была определена нуклеотидная последовательность генома штамма LEIV-2247 Uz, составляющая 10653 н.о. и 10768 н.о. для изолята LEIV-7192 Тиг (за исключением участка З'-нетранслируемых областей). Нуклеотидная последовательность генома вируса Карши 2-х штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг была депонирована в базу данных GenBank под номерами AY863002 (NC006947) и (DQ462443) соответственно.

Анализ и сопоставление полученных нуклеотидных последовательностей полного генома этих штаммов позволил обнаружить в их составе одну открытую рамку считывания, которая кодирует полипротеин протяжённостью 3416 а.о. Исходя из этого анализа, можно предположить, что полипротеин вируса Карши расщепляется на 3 структурных белка: С, prM, Е и 8 неструктурных: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5 и 2K. Подобное строение генома характерно для всех флавивирусов.

Анализ аминокислотной последовательности белка С вируса Карши показал, что он содержит регионы, похожие на сайты ядерной локализации На основании структурных особенностей С-концевого участка этого белка вируса Карши можно предположить, что этот белок может локализироваться в ядре инфицированной клетки.

Аминокислотная последовательность вируса Карши была выровнена с аминокислотными последовательностями других представителей комплекса клещевого энцефалита, как по полному полипротеину, так и по отдельным белкам, что позволило установить гомологию с белками вирусов антигенного комплекса. Можно предположить, опираясь на данные максимальной степени гомологии, что структура главного антигена вируса Карши наиболее похожа на белок Е вирусов TBEV и Powassan и составила 71,4 %. Наиболее отдалён вирус Карши по этому показателю от вируса Alkhurma (степень гомологии 67,9 %). Это хорошо согласуется с тем, что в позиции 76 домена II белка Е у обоих штаммов вируса Карши присутствует 77гг-остаток, характерный для нейротропных вирусов ККЭ.

Из анализа нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипротеин, следует, что максимальная степень гомологии исследуемого штамма LEIV-2247 Uz вируса Карши наблюдалась со штаммами Vasilchenko восточносибирского субтипа и Sojjin-HO дальневосточного субтипа вируса ТВЕ (71,2%), а минимальная (69,8 %) с вирусом Deer tick (штамм ctb30) и

Louping ill (штамм 369/T2). Разница степени гомологии по полному полипротеину составила всего лишь 1,4 %, по различным белкам вируса Карши максимальное сходство наблюдалось со всеми представителями комплекса клещевого энцефалита, кроме белков Louping ill virus.

Большинство исследователей рассматривают филогенетические взаимоотношения вирусов внутри рода Flavivirus по последовательности консервативного гена NS5 (РНК-зависимая РНК-полимераза). Поэтому для проведения аналогичного анализа по установлению филогенетических связей вируса Карши с различными представителями рода Flavivirus были взяты 82 штамма, для которых известна первичная структура полного генома или нуклеотидная последовательность участка гена, кодирующая белок NS5, отнесённых в настоящий момент к данному роду. В результате филогенетического анализа по участку гена NS5 можно утверждать, что вирус Карши принадлежит к антигенному комплексу клещевого энцефалита [58]. Оказалось, что изучаемые штаммы вируса Карши наиболее близки к малоизученному вирусу Royal Farm. Вероятно, вместе они образуют отдельный кластер внутри антигенного комплекса клещевого энцефалита. Основываясь на филогенетическом анализе участка белка NS5, можно предположить, что рассматриваемые вирусы генетически удалены друг от друга на расстояния, превышающие межштаммовые различия. Так генетическое расстояние по этому участку между вирусом Royal Farm и Карши составила 13,6-13,9%, а между двумя предполагаемыми штаммами LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг 3,0 %.

Представляет интерес уточнение филогенетического положения вируса Карши внутри группы клещевого энцефалита. Вопрос об уровне различий антигенных вариантов вирусов ККЭ неоднократно дискутировался и до сих пор остаётся открытым. С этой целью мы проанализировали максимальное количество разнообразных штаммов и вирусов, известных на сегодняшний день. Оказалось, что штамм LEIV-2247 Uz имеет максимальную степень гомологии со штаммами Vasilchenko восточносибирского субтипа и Sofjin

НО дальневосточного субтипа вируса ТВЕ (71,2 %) и минимальную (69,8 %) с вирусом Deer tick (штамм ctb30) и Louping ill (штамм 369/Т2). Максимальная степень гомологии штамма LEIV-7192 Tur была со штаммом Vasilchenko вируса ТВЕ (71,0 %), а минимальная с вирусом Deer tick (69,5 %). Разница значений гомологии вируса Карши с представителями антигенного комплекса, к которому он отнесён, составила 1,4-1,5 %. Следовательно, можно предположить, что анализируемый вирус достаточно удалён от всех представителей своего серокомплекса и образует отдельную генетическую группу.

Не так давно вирус Карши наряду с вирусом Gadgets Gully был относён к различным субтипам вируса Royal Farm [44]. В результате филогенетического анализа оказалось, что значения дивергенции между вирусами Gadgets Gully и Карши (14,8-16 %), Gadgets Gully и Royal Farm (16,3 %), а также между Royal Farm и Карши (13-13,3 %) значительно превышают показатели дивергенции между различными субтипами TBEV (2,7-7 %) и сопоставимы с генетическими расстояниями между различными генетическими линиями в пределах ККЭ. Следовательно, все три вируса не являются субтипами одного вируса, каждый из них представляет собой отдельную генетическую линию. Тем не менее, к вирусу Карши наиболее близок вирус Royal Farm, выделенный в Афганистане.

Географическая удалённость штаммов вируса Карши, выделенных в Узбекистане и Туркмении, предполагала их различия в первичной структуре геномной РНК. Учитывая противоречия, которые возникли по вопросу классификации представителей данного комплекса, трудно оценить, основываясь лишь на иммунологических исследованиях, являются ли изоляты LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur генетическими разновидностями одного вируса Карши или же разными генетическими линиями. Генетическое расстояние, оцененное по полной первичной структуре генома, между штаммами вируса Карши (дивергенция 5,5 %) сопоставимо с различиями между субтипами TBEV (дивергенция 4,9 - 7,1 %). Следовательно, изоляты анализируемого вируса следует рассматривать как различные генотипы вируса Карши.

Для того чтобы ответить на вопрос о правомерности использования участка гена Е и NS5 для филогении, были сопоставлены данные филогенетических анализов по перечисленным генам с данными по полноразмерному геному. Корреляция между значениями дивергенции оказалась высокая, следовательно, эти данные позволяют с уверенностью говорить о правомерности использования нуклеотидных последовательностей генов Е и NS5 для естественной классификации вирусов комплекса клещевого энцефалита.

В международной базе данных Gen Bank по гену, кодирующему поверхностный гликопротеин (Е), опубликовано максимальное количество нуклеотидных и аминокислотных последовательностей различных штаммов и вирусов рассматриваемого комплекса. Филогенетический анализ с использованием нуклеотидных последовательностей всех известных представителей комплекса клещевого энцефалита достоверно подтвердил ранее изложенные в работе представления о положении внутри него вируса Карши.

С использованием данных о структуре геномов различных генотипов вирусов Карши был создан лабораторный вариант ОТ-ПЦР для выявления геномной РНК вируса Карши. Условия данного метода были оптимизированы, а система ОТ-ПЦР проверена на специфичность с различными представителями комплекса клещевого энцефалита.

104

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ляпина, Ольга Викторовна, Москва

1. Дробищенко Н.И., Львов Д.К., Кирющенко Т.В., Каримов С.К. и Роговая С.Г. Результаты серологических и вирусологических исследований птиц и млекопитающих на территории Южного Прибайкалья. // Медицинская паразитология. 1980. - Т.49. - №2. -Стр. 27-29.

2. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П., Демина Т.В., Козлова И.В. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита. Иркутск: РИО ВСНЦ СО РАМН, 2003. 272с.

3. Каримов С.К., Кирющенко Т.В. К экологии вируса Карши и роли его в инфекционной патологии человека. // Экология вирусов. М. - 1980. -Стр 114-117.

4. Клонирование ДНК. Методы. / Под редакцией Д.М. Гловера. М.: Мир, 1988, 538с.

5. Львов Д.К., Логинова Н.В., Лебедева Г.А., Дерябин П.Г., Парыгина М.М., Буйницкая О.Б. Биологические свойства и антигенные взаимосвязи флавивирусов Тюлений и Карши. // Вопросы вирусологии. 1994. - Т.39. - №5. Стр. 205-208.

6. Морозова О.В., Бахвалова В.Н., Добрикова Е.Ю., Максимова Т.Г. клеточные белки взаимодействуют с РНК вируса клещевого энцефалита. // Журнал инфекционной патологии. 1996. - Т. 3. - № 4. -С. 382-383.

7. Ю.Сидорова Г.А., Андреев В.П. Некоторые черты экологии новых арбовирусов, выделенных в Узбекистане и Туркмении. // Медицинская паразитология. 1978. - №3. - Стр. 108-114.

8. Стефенсон Дж.Р. (Stephenson J.R.) Классификация флавивирусов, передающихся клещами. // Acta virology. 1989. - V. 33. - P. 471.

9. Терских И.И., Абрамова Л.Н., Савосина Н.С., Громашевский В.Л., Львов Д.К. Результаты заражения лабораторных животных и обезьян вирусом Карши. // Медицинская паразитология. 1989. - №1. - Стр. 7174.

10. Allison S.L., SchalichJ., StiasnyK., Mandl C.W., Heinz F.X. Mutational evidence for an internal fision peptide in flavivirus envelope protein E. // Journal of Virology. 2001. - V. 75. - P. 4268-4275.

11. Allison S.L., StiasnyK., StadlerK., Mandl C.W. and Heinz F.X. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E. // Journal of Virology. 1999. - V. 73. - P. 56055612.

12. Amberg S.M., Nestorowicz A., McCourtD.W., Rice C. NS2B-3 proteinase-mediated processing in the yellow fever virus structural region: In vitro and in vivo studies. // Journal of Virology. 1994. - V. 68. - P. 3794-3802.

13. Bazan J.F., Fletterick R.J. Detection of a trypsin-like serine protease domain in flaviviruses and pestiviruses. // Virology. 1989.-V. 171.-P. 637-639.

14. Burke D.S., Monath T.P., Flaviviruses. In: Knipe, D.M., Howley, P.M. (Eds.), Fields' Virology, 4th ed. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia. 2001. - Vol. 1. - P. 1043-1125-1041.

15. CahourA., PletnevA., Vazielle-Falcoz M., Rosen L, Lai C.J. Growth-restricted dengue virus mutants containing deletions in the 5' noncoding region of the RNA genome. // Virology. 1995. - V. 207. - P. 68-76.

16. Calisher CH. Antigenic classification and taxonomy of flaviviruses (family Flaviviridae) emphasizing a universal system for the taxonomy of viruses causing tick-borne encephalitis. // Acta Virology. 1988. - V. 32. - P. 69478.

17. Cauchi M.R., Henchal E.A., Wright P.J. The sensitivity of cell-associated dengue virus proteins to trypsin and the detection of trypsin-resistant fragments of the nonstructural protein NS1. // Virology. 1991. - V. 180/ -P. 659-667.

18. Cecilia D. and Gould E.A. Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutrolization-resistant mutants.//Virology.- 1991.-V. 181.-P. 70-77.

19. Chambers T.J., Nestorowicz A., Amberg S.M., Rice C.M. Mutagenesis of the yellow fever virus NS2B protein: Effects on proteolytic processing, NS2B-NS3 complex formation, and viral replication. // Journal General Virology. 1993. - V. 67. - P. 6797-6807.

20. Charrel, R. N.de Lamballerie, X. The Alkhurma virus (family Flaviviridae, genus Flavivirus): an emerging pathogen responsible for hemorrhage fever in the Middle East. // Med Trop (Mars). 2003. - V. 63. - P. 296-299.

21. Chen C.J., Kuo M.D., Chien L.J., Hsu S.L., Wang Y.M. and Lin J.H. RNA-protein interactions: involvment of NS3, MS5 and З'-noncoding regions of Japanese encephalitis virus genomic RNA. // Journal of Virology. 1997. -V. 71.-P. 3466-3473.

22. Chen Woan-Ru, Tesh Robert B. and Rico-Henesse Rebecca. Genetic variation of Japanese encephalitis virus in nature. // Journal General Virology. 1990. - V. 71. - P. 2915-2922.

23. Chomzcynski P., Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal Biochem. -1987. V.162. - P.156-159.

24. Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W. Genetic relatedness among structural protein genes of denge 1 virus strains. // Journal General Virology. 1989. -V. 70.-P. 1701-1712.

25. Droll D.A., Kirishna Murthy H.M., Chambers T.J. Yellow fever virus NS2B-3 protease: Charged-to-alanine mutagenesis and deletion analysis define regions important for protease complex formation and function. // Virology. 2000. - V. 275. - P. 335-347.

26. Falgout В., MarkoffL. Evidence that flavivirus NS1-NS2A cleavage is mediated by a membrane-bound host protease in the endoplasmic reticulum. // Journal of Virology. 1995. - V. 69. - P. 7232-7243.

27. Ескег M., Allison S.L., Meixner Т., Heinz F.X. Sequence analisis andgenetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia. // Journal General Virology. 1999. - V. 80. - P. 179-185.

28. Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. Classification and nomenclature of viruses: Fifth report of the international committee on taxonomy of viruses. // Archives of Virology Suppl. 1991. - V. 2. - P. 223.

29. Gaidamovich S.Y., Melnicova Y.E., GresikovaM. et al. Two kind of monoclonalantibodies to tick-borne encephalitis virus. // Acta virology. -1986.-V. 30.-P. 206-212.

30. Gresikova M., CalisherC.H. Tick-borne encephalitis. // The arboviruses: epidemiology and ecology. 1989. - V. 4. - P. 177-202.

31. Gresikova M., SelkeyovaM. К антигенной классификации некоторых вирусов из комплекса клещевого энцефалита, исследованных с помощью моноклональных антител. // Acta virology. 1990. - V. 34. -P. 89-92.

32. Gritsun T.S., Gould E.A. Infectious transcripts of tick-borne encephalitis virus, generated in days by RT-PCR. // Virology. 1995. - V. 214. - P. 611618.

33. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis. // Antiviral Research. 2003. - V. 57. - P. 129-146.

34. Gritsun T.S., Lashkevich V.A. and Could E.A., Nucleotide and deduced ammoacid sequence of the envelope glycoprotein of Omsk hemorrhagic fever virus comparison with other flaviviruses. // Journal of Virology. -1993.-V. 74.-P. 287-291.

35. Hahn C.S., HahnY.S., Rice C.M., LeeE., Dalgarno L., Strauss E.G., Strauss J.H. Conserved elements in the 3' untranslated region of flavivirus RNAs and potential cyclization sequences. // Journal Molecular Biology. -1987.-V. 198.-P. 33-41.

36. Heinz F.X., Berger R., Tuma W. and Kunz C. A topological and functional of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. // Virology. 1983. - V. 126. - P. 525537.

37. HeinzF.X. Epitope mapping of Flavivirus glycoproteins. // Adv. Virus Research. 1986. - V. 31. - P. 103-168.

38. Heinz F.X., Allison S. The machinery for Flavivirus fusion with host cell membranes. // Current Opinion in Microbiology. 2001. - V. 4. - P.450-455.

39. JanL.R., YangC.S., Trent D.W., FalgoutB. and Lai C.J. Processing of Japanese encephalitis virus non-structural proteins: NS2B-NS3 complex and heterologous proteases. // Journal of General Virology. 1995. - V. 76. -P. 573-580.

40. Khromykh A.A., Westaway E.G. Subgenomic replicons of the flavivirus Kunjin: Construction and applications. // Journal of Virology. 1997. -V.71.-P. 1497-1505.

41. Kimura-Kuroda J. and Yasui K. Antigenic comparison of envelope protein E between Japanese encephalitis virus and some other flaviviruses using monoclonal antibodies. // Journal of General Virology. 1986. - V. 67. -P. 2663-2672.

42. Koonin E.V. Computer-assisted identification of a putative methyltransferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2protein of reovirus. // Journal of General Virology. 1993. - V. 74. -P. 733-740.

43. Kuno G, Artsob H., Karabatsos N., Tsuchiya K.R. and Chang J.J. Genomic sequencing of Deer tick virus and phylogeny of Powassan-related viruses of North America. // The American journal of tropical medicine and hygiene. -2001.-V. 65. P. 671-676.

44. Kuno G, Chang GJ, Tsuchiya KR, Karabatsos N., Cropp C.B. Phylogeny of the genus Flavivirus. // Journal of Virology. 1998. - V. 72. - P. 73-83.

45. Lamballerie X., Crochu S., Billoir F., neyts J., Micco P., Holmes E.C. and Dould E.A. Genome sequence analysis of Tamana bat virus and its relationship with the genus Flavivirus. // Journal General Virology. 2002. -V. 83.-P. 2443-2454.

46. Lanciotti R.S., Gubler D.J., Trent D.W. Molecular evolution and phylogeny of denge-4 viruses. // Journal of Virology. 1997. - V. 78. - P. 2279-2286.

47. Lanciotti R.S., Kerst A.J. Nucleic acid sequence-based amplification assays for rapid detection of West Nile and St. Louis encephalitis viruses // Journal of Clinical Microbiology. 2001. - Vol. 39. - № 12. - P. 4506-4513.

48. Lanciotti R.S., Lewis J.A., Gubler D.J., Trent D.W. Molecular evolution and epidemiology of denge-3 viruses. // Journal of Virology. 1994. - V. 75. -P. 65-75.

49. Lee E., Stocks C.E., Amberg S.M., Rice C.M., LobigsM. Mutagenesis of the signal sequence of yellow fever virus prM protein: Enhancement of signalase cleavage in vitro is lethal for virus production. // Journal Virology. -2000.— V. 74.-P. 24-32.

50. Lewis J.A., Chang G.-J., Lanciotti R.S. Kinney R.M., Mayer L.W. Trent, D. W. Philogenetic relationships of denge-2 viruses. // Virology. 1993. - V. 197.-P. 216-224.

51. Li Li, Rolin Pierre E., Nichol Stuart Т., Shope Robert E., Barrett Alan D.T. and Holbrook Michael R. Molecular determinants of the tick-borne flavivirus Omsk hemorrhagic fever virus. // Journal General Virology. -2004.-V. 85.-P. 1619-1624.

52. Lin Di, Li Li, Dick Daryl, Shope Robert E., Feldmann Heinz, Barrett Alan D.T. and Holbrook Michael R. Analysis of the complete genome of the tick-borne flavivirus Omsk hemorrhagic fever virus. // Virology. 2003. - V. 313. - P. 81-90.

53. Lindenbach B.D, Rice C.M. Flaviviridae: The Viruses and Their Replication. In: Knipe D.M., Howley P.M. (Eds.), Fields' Virology, 4th ed. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia. 2001. - Vol.1. - P. 9911041.

54. Lindenbach B.D, Rice C.M. Trans-complementation of yellow fever virus NS1 reveals a role in early RNA replication. // Journal of Virology. 1997. -V. 71.-P. 9608-9617.

55. Lindenbach B.D, Rice C.M. Genetic interaction of flavivirus nonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function. // Journal of Virology. 1999. - V. 73. - P. 4611-4621.

56. LvovD.K., NeronovV.M., Gromashevsky V.L., Skvortsova T.M., Berezina L.K., Sidorova G.A., Zhmaeva Z.M., Gofman Yu.A.,

57. Klimenko S.M., Fomina K.B. "Karshi" virus, a new Flavivirus (Togaviridae) isolated from Ornithodoros papillipes (Birula, 1895) ticks in Uzbek S.S.R. // Archives of Virology. 1976. - V. 50. - P. 29-36.

58. Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G., Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kujin nonstructural proteins NS2A and NS4A. // Virology. 1998. - V. 245. -№2.-P. 203-215.

59. Mandl C.W, Guirakhoo F., Holzman H., Heinz F.X. and Kunz C. Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model. // Journal Virology. 1989. - V. 63.-P. 564-571.

60. Mandl C.W, Heinz F.X., Stockl E, Kunz C. Genome sequence of tick-borne encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis of nonstructural proteins with other flaviviruses. // Virology. 1989. - V. 173. -P. 291-301.

61. Mandl C.W, Holzmann H, Kunz C. and Heinz F.X. Complete gemomic sequence of Powassan virus: evaluation of genetic elements in tick-borne versus mosquito-borne flaviviruses. // Virology. 1993. - V. 194. - P. 173184.

62. Mandl C.W., Iacono-Connoris L., Wallner G. et al. Sequence of the genes encoding the structural proteins of the low-virulence tick-borne flaviviruses Langat TP21 and Yelantsev. // Virology. 1998. - V. 72. - P. 2132-2140.

63. Marin M.S., Mandl C.W., Kunz C. and Heinz F.X. The flavivirus 3'-noncoding region extensive size heterogeneity independent of evolutionaryrelationships among strains of tike-borne encephalitis virus. // Virology. -1995.-V. 213.-P. 160-178.

64. Marin M.S., McKenzie J., Gao G.F., Antoniadis A. and Gould E.A. The virus causing encephalitis group. // Research Vet. Sci. 1995. - V. 58. - P. 11-13.

65. Markoff L., Falgout В., Chang A. A conserved internal hydrophobic domain mediates the stable membrane integration of the dengue virus capsid protein. // Virology. 1997. - V. 233. - P. 105-117.

66. Mc Minn P.C., Marshall I.D., Dalgorno L. Neurovirulence and neuroinvasivenes of Murrey Valley encephalitis virus mutants selected by passage in a monkey kidney cell line. // Journal General Virology. 1995. -V. 76.-P. 865-872.

67. Mc Minn P.C., Weir R.S. and Dalgarno L. A mouse attenuated envelope protein variant of Murray Valley encephalitis virus with altered fusion activity. // Journal of General Virology. - 1996. - V. 77. - P. 2085-2088.

68. Modis Y., Ogata S., Clements D. and Harrison S.C. Variable surface epitopes in the crystal structure of Denge virus type 3 envelope glycoprotein. // Journal of Virology. 2005. - V. 79. - № 6. - P. 3448-3458.

69. Nam J.H., Chung Y.J., Ban S.J., KimE.J., ParkY.K., Cho H.W. Envelope gene sequence variation among Japanese encephalitis virus isolated in Korea. // Acta virology. 1996. - V. 40. - P. 303-309.

70. Ni H., Barret A.D.T. Nucleotide and deduced amino acid sequence the structural proteins genes of Japanese encephalitis virus from different geographic location. // Journal General Virology. 1995. - V. 76. - P. 401407.

71. NowakT., Wengler G. Analysis of disulphides present in the membrane proteins of the West Nile Flavivirus. // Virology. 1987. - V. 156. - P. 127137.

72. Proutski V, Gould EA, Holmes EC. Secondary structure of the 3' untranslated region of flaviviruses: Similarities and differences. // Nucleic Acids Research. 1997. -V. 25. - P. 1194-1202.

73. Rauscher S, FlammC, Mandl C.W., Heinz F.X., StadlerP.F. Secondary structure of the З'-noncoding region of flavivirus genomes: Comparative analysis of base pairing probabilities. // RNA. 1997. - V. 3. - P. 779-791.

74. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C.W., Kunz C., Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution. // Nature. -1995.-V. 375.-P. 291-298.

75. Rice C.M., benches E.M., Eddy S.R., Shin S.J., Sheets R.L., Strauss J.H. Nucleotide sequence of yellow fever virus: Implications for flavivirus gene expression and evolution. // Science. 1985. - V. 229. - P. 726-733.

76. Robbins J., Dilworth S. M., Laskey R. A., Dingwall C. Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence. // Cell. 1991. - V.64. -P.615-623.

77. Roehrig J.T., Mathews J.H. and Trent D.W. Identification of epitopes on the E glycoprotein of Saint Louis encephalitis virus using monoclonal antibodies. // Virology. 1983.-V. 128.-P. 118-126.

78. Shamanin V.A., PletnevA.G., Rubin S.G., ZlobinV.I. Differentiation of strains of tick-borne encephalitis virus by means of RNA-DNA hybridization. // Journal General Virology. 1990. - V. 71. - P. 1505-1515.

79. Shju S.Y.W., Aires M.D. and Gould F.A. Genomic sequence of the structural proteins of Louping ill virus: comparative analysis with tick-borne encephalitis virus. // Virology. 1991. - V. 180. - P. 411-415.

80. SimmondsP., Smith D.B., McOmishF., Yap P.L., KolbergJ., Urdea M.S. and Holmes E.C. Identification of genotypes of hepatitis С virus by sequence comparison in the core, El, and NS5 regions. // Journal General Virology. 1994.-V. 75.-P. 1075-1061.

81. Stadler K., Allison S.L., Schalich J., Heinz F.X. Proteolytic activation of tick-borne encephalitis virus by fiirin. // Journal Virology. 1997. -V. 71.-P. 8475-8481.

82. Telford S., Armstrong P.M., Katavolos P., FoppaL, Olmrda Garcia A.S., Wilson M.L. and Spielman A. A new tick-borne encephalitis-like virus infecting New England deer ticks, Ixodes dammini. // Emerging Infection Disease. 1997. - V. 3. - P. 165-170.

83. Twiddy Susanna S. and Holmes Edward C. The extent of homologous recombination in members of the genus Flavivirus. // Journal General Virology. 2003. - V. 84. - P. 429-440.

84. Van Regenmorel M.H.V. Virus species, a much overlooked but essential concept in virus classification. // Intervirology. 1990. - V. 31. — P. 241-254.

85. VenugopalK., Buckley A., ReidH.W. and Gould E.A. Nucleotide sequence of the envelope glycoprotein of Negishi virus shows a close homology to Louping ill virus. // Virology. 1992. - V. 190. - P. 515-521.

86. WenglerG., WenglerG. The NS 3 nonstructural protein of flaviviruses contains an RNA triphosphatase activity. // Virology. 1993. -V. 197.-P. 265-273.

87. Wengler G., Wengler G., Gross H.J. Studies on virus-specific nucleic acids synthesized in vertebrate and mosquito cells infected with flaviviruses. // Virology. 1978. - V. 89. - P. 423-437.

88. Westaway E.G., BrintonM.A., Gaidamovich S.Y., Horzinek M.C., Igarashi A., Kaariainen L., Lvov D.K., Porterfield J.S., Russell P.K., Trent D.W. Flaviviridae. // Intervirology. 1985. - V. 24. - P. 183-192.

89. Westaway E.G., Khromykh A.A., KenneyM.T., Mackenzie J.M., Jones M.K. Proteins С and NS4B of the flavivirus Kunjin translocate independently into the nucleus. // Virology. 1997. - V. 234. - P. 31-41.

90. Winkler G., Randolph V.B., Cleaves G.R., Ryan Т.Е., StollarV. Evidence that the mature from of the Flavivirus nonstructural protein NS1 is a dimmer.//Virology. 1988.-V. 162.-P. 187-196.

91. Yamshchikov V.F., Trent D.W., Compans R.W. Upregulation of signalase processing and induction of prM-E secretion by the flavivirus NS2B-NS3 protease: Roles of protease components. // Journal Virology. -1997.-V. 71.-P. 4364-4371.

92. ZengL, FalgoutB, MarkoffL. Identification of specific nucleotide sequences within the conserved З'-SL in the dengue type 2 virus genome required for replication. // Journal Virology. 1998. - V. 72. - P. 7510— 7522.

Информация о работе

Ляпина, Ольга Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Структура и анализ генома вируса Карши - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы